特許 7560898 細胞の凍結保存装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-09-25

(45)【発行日】2024-10-03

(54)【発明の名称】細胞の凍結保存装置

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20240926BHJP

   C12N 1/04 20060101ALN20240926BHJP

   C12N 5/00 20060101ALN20240926BHJP

   A01N 1/02 20060101ALN20240926BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 Z

C12N1/04

C12N5/00

A01N1/02

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2022578759

(86)(22)【出願日】2021-06-14

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-14

(86)【国際出願番号】 KR2021007391

(87)【国際公開番号】W WO2021256801

(87)【国際公開日】2021-12-23

【審査請求日】2023-02-16

(31)【優先権主張番号】10-2020-0074697

(32)【優先日】2020-06-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2021-0076299

(32)【優先日】2021-06-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】517082560

【氏名又は名称】セフォ カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002860

【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】パク，ヒョンスク

(72)【発明者】

【氏名】リー，サンレイ

【審査官】村松 宏紀

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１９／００３１４２１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】中国特許出願公開第１０７７５１１８４（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国実用新案第２０７２０８８４０（ＣＮ，Ｕ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｍ、Ｃ１２Ｎ、Ａ０１Ｎ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

多数の試験管を収容する第１ハウジングと、
前記第１ハウジングを覆う第２ハウジングと、
前記第１ハウジングの内底面から上向きに延設し、周辺の前記試験管の側面に当接して支持する中央支持リブと、
前記第１ハウジングの底面において前記試験管が収容される位置の中央に形成された第１底面通孔と、
前記第１ハウジングの内壁面から第１ハウジングの内側に向かって延設し、前記試験管の側面に当接して、前記試験管を支持する側面支持リブと、を含み、
前記側面支持リブは、
一端が前記第１ハウジングの内壁面に固定され、内壁面と垂直な方向または角部では対角線方向である４５度傾斜した方向に突出する突出部と、
前記突出部の突出した先端から当該突出部に対して垂直な両方向に突出する接触部と、を含む、細胞の凍結保存装置。

【請求項2】

前記第１底面通孔の間に位置する第２底面通孔をさらに含む、請求項１に記載の細胞の凍結保存装置。

【請求項3】

前記第１底面通孔と第２底面通孔の直径は、
３～６ｍｍであることを特徴とする請求項２に記載の細胞の凍結保存装置。

【請求項4】

前記中央支持リブの中央を上下に貫通する通孔をさらに含む、請求項１に記載の細胞の凍結保存装置。

【請求項5】

前記通孔の直径は、１．５～３ｍｍであることを特徴とする請求項４に記載の細胞の凍結保存装置。

【請求項6】

前記中央支持リブは、
前記第１ハウジングの底面から上部に延設する軸部と、
前記軸部の側面から相互垂直となるように四方に突出した突出部と、
前記突出部の先端から突出部とは平面上垂直である両方向に突出する接触部と、を含む
、請求項１に記載の細胞の凍結保存装置。

【請求項7】

前記試験管は、
上部の一部および下部の一部の側面が前記中央支持リブまたは前記側面支持リブに当接して固定されることを特徴とする請求項１に記載の細胞の凍結保存装置。

【請求項8】

前記試験管は、
透明な材質の試験管本体と、
前記試験管本体の下部に嵌着し、試験管本体に比べて直径がさらに大きい下部リングと、
前記試験管本体の上部に結合し、試験管本体に比べて直径がさらに大きい上部カバーと、を含む、請求項７に記載の細胞の凍結保存装置。

【請求項9】

前記第２ハウジングは、
上面に第１上面通孔が形成され、
前記第１上面通孔は、前記第１ハウジングの第１底面通孔および第２底面通孔の上部側に位置する、請求項２に記載の細胞の凍結保存装置。

【請求項10】

前記第１上面通孔の直径は、３～６ｍｍであることを特徴とする請求項９に記載の細胞の凍結保存装置。

【請求項11】

前記第２ハウジングは、
上面の４個の辺と隣接する位置に各辺と並ぶ方向に形成された第２上面通孔をさらに含む、請求項９に記載の細胞の凍結保存装置。

【請求項12】

前記第２ハウジングは、
前記第２上面通孔それぞれを挟んで一対ずつ位置する第３上面通孔をさらに含み、
前記第３上面通孔は、上面の一部および側面の一部に達するように位置する、請求項１１に記載の細胞の凍結保存装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞の凍結保存装置に関し、より詳細には、温度平衡の迅速な到達に有利になるように構造が改善された細胞の凍結保存装置に関する。

【背景技術】

【0002】

本発明は、次のように韓国再生医療基金（ＫＦＲＭ）、科学技術情報通信部、保健福祉部の支援によって出願されたものである。
［課題固有番号］２２Ｄ０８０１Ｌ１
［課題番号］２２Ｄ０８０１Ｌ１
［部署名］科学技術情報通信部，保健福祉部
［課題管理（専門）機関名］韓国再生医療基金（ＫＦＲＭ）
［研究事業名］韓国政府の再生医療技術開発事業
［研究課題名］大腿骨頭骨壊死患者におけるヒト臍帯由来の骨芽細胞ベースの細胞療法ＣＦ－Ｍ８０１の安全性と探索的有効性を評価する第１相臨床試験
［寄与率］５０／１００
［課題実行機関名］株式会社細胞バイオ
［研究期間］２０２２．０４．０１～２０２４．１２．３１

［課題固有番号］２２Ｃ０６０４Ｌ１
［課題番号］２２Ｃ０６０４Ｌ１
［部署名］科学技術情報通信部，保健福祉部
［課題管理（専門）機関名］韓国再生医療基金（ＫＦＲＭ）
［研究事業名］韓国政府の再生医療技術開発事業
［研究課題名］骨粗鬆症性骨折の治療のための臍帯由来骨芽細胞に基づく高度なバイオ収束医療製品の開発
［寄与率］５０／１００
［課題実行機関名］株式会社細胞バイオ
［研究期間］２０２２．０４．０１～２０２４．１２．３１

【0003】

最近、細胞基盤治療剤の開発および商用化が活発に行われている。治療剤の生産後、市中に流通するまで最小１ヶ月から最大６ヶ月まで冷凍保存を経る。冷凍保存を通じて新陳代謝を超低温で停止させて細胞を長期間保管することができる。

【0004】

細胞が保管される温度が低いほど、特に水のガラス転移温度である－１３０℃以下で保管するほど、細胞の生長率が増加することがすでに様々な研究を通じて糾明された。

【0005】

したがって、産学研がいずれも細胞の冷凍・凍結保管のために主にＤｉｍｅｔｈｌｙ Ｓｕｌｆｏｘｉｄ（ＤＭＳＯ）のように凍結防止剤が含まれた凍結保存溶液を保管しようとする細胞とともにバイアル（Ｖｉａｌ）に混入し、バイアルを含む保管容器を液体窒素タンク内に設置して細胞を保管する方法を採択している。

【0006】

しかしながら、液体窒素の流動によって交差汚染が発生する確率が高いという短所があるため、最近、先進国を中心に細胞が注入されたバイアル－保管容器を、液体窒素タンクでなく、気体窒素の対流循環を通した－１８０℃以下の極低温維持システム（以下では「ｖａｐｏｒ－ｔｙｐｅ ｔａｎｋ」）に適用する事例が増加している。

【0007】

従来、液体窒素タンク用に使用された保管容器の場合、極低温環境下における液体窒素の直接接触による機械的破損を防止するために、液体窒素貫通ホールが最小化した構造を有しているが、液体窒素より熱伝導率の低い気体窒素を流動させてバイアル内の細胞温度を急速に低下させることができないという短所を有する。

【0008】

一方、気体窒素の保管容器内に迅速な流動を保証するために、貫通ホールの面積を過度に増加させる場合、冷却中に収縮応力により保管容器の機械的破損が発生し、細胞を安全に保管することができない。

【0009】

韓国公開実用新案第２０－２００９－００１１４４３号公報（発明の名称：試験管の冷凍保管用コンテナボックス）が掲載されている。

【0010】

従来による細胞の凍結保存装置は、上記した従来技術のように通常下部コンテナボックス（ボディ、Ｂｏｄｙ）と上部コンテナボックス（カバー、Ｃｏｖｅｒ）が１つの収容空間を形成し、前記下部コンテナボックスに格子構造体が一体型に形成されたり、別々に製作されて収容されて、複数個の試験管を個別的に配置できる構造を有している。

【0011】

しかしながら、このような従来による細胞の凍結保存装置を使用する場合は、次のような問題がある。

【0012】

一旦、試験管が収容された細胞の凍結保存装置を液体窒素に貯蔵した場合、内部に収容された試験管が液体窒素の温度まで急激に低下して迅速に温度平衡を成す場合にのみ細胞貯蔵の効果を保証することができるが、従来の細胞の凍結保存装置は、これを妨害する問題がある。

【0013】

また、液体窒素から細胞の凍結保存装置を取り出すとき、前記細胞の凍結保存装置の内部または試験管に浸透した液体窒素が常温で急激に膨張して、上部コンテナボックスが分離したり試験管が破裂する問題が頻繁に発生しているので、凍結保存装置内の液化窒素を迅速に除去することは、ユーザ安全の観点から必要である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

本発明は、前述のような問題点を解決するためになされたものであって、本発明が解決
しようとする課題は、凍結保存装置の貫通口を介した気体および液体の流れを最大化することによって、温度平衡に迅速に到達させ、機械的強度を十分に維持できる凍結保存装置を提供することにある。

【0015】

すなわち、本発明の目的は、試験管内の細胞を窒素タンク内に保管するにあたって、凍結保存装置内の－１９０℃以下の温度を維持する液化あるいは気化した窒素の流れを最大化することによって、凍結保存装置内温度平衡に迅速に到達させ、試験管または細胞の凍結保存装置自体の破損を防止できる細胞の凍結保存装置を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0016】

上記目的を達成するために、本発明の細胞の凍結保存装置は、多数の試験管を収容する第１ハウジングと、前記第１ハウジングを覆う第２ハウジングと、前記第１ハウジングの内底面から上向きに延設し、周辺の前記試験管の側面に当接して支持する中央支持リブと、前記第１ハウジングの底面において前記試験管が収容される位置の中央に形成された第１底面通孔と、を含んでもよい。

【0017】

本発明の実施形態において、前記第１底面通孔の間に位置する第２底面通孔をさらに含んでもよい。

【0018】

本発明の実施形態において、前記第１ハウジングの内壁面から第１ハウジングの内側に向かって延設し、前記試験管の側面に当接し前記試験管を支持する側面支持リブをさらに含んでもよい。

【0019】

本発明の実施形態において、前記側面支持リブは、一端が前記第１ハウジングの内壁面に固定され、内壁面と垂直な方向または角部では、対角線方向である４５度傾斜した方向に突出する突出部と、前記突出部の突出した先端から当該突出部に対して垂直な両方向に突出する接触部と、を含んでもよい。

【0020】

本発明の実施形態において、前記第１底面通孔と第２底面通孔の直径は、３～６ｍｍであってもよい。

【0021】

本発明の実施形態において、前記中央支持リブの中央を上下に貫通する通孔をさらに含んでもよい。

【0022】

本発明の実施形態において、前記通孔の直径は、機械的破損の危険のないサイズである１．５～３ｍｍであってもよく、より正確には、空気の流れが有利な３ｍｍであってもよい。

【0023】

本発明の実施形態において、前記中央支持リブは、前記第１ハウジングの底面から上部に延設する軸部と、前記軸部の側面から相互垂直となるように四方に突出した突出部と、前記突出部の先端から突出部とは平面上垂直である両方向に突出する接触部と、を含んでもよい。

【0024】

本発明の実施形態において、前記試験管は、上部の一部および下部の一部の側面が前記中央支持リブまたは前記側面支持リブに当接して固定されてもよい。

【0025】

本発明の実施形態において、前記試験管は、透明な材質の試験管本体と、前記試験管本体の下部に嵌着し、試験管本体に比べて直径がさらに大きい下部リングと、前記試験管本体の上部に結合し、試験管本体に比べて直径がさらに大きい上部カバーと、を含んでもよい。

【0026】

本発明の実施形態において、前記第２ハウジングは、上面に第１上面通孔が形成され、前記第１上面通孔は、前記第１ハウジングの第１底面通孔および第２底面通孔の上部側に位置していてもよい。

【0027】

本発明の実施形態において、前記第１上面通孔の直径は、機械的破損の危険がない１．５～６ｍｍであってもよく、正確には、空気の流れが有利な３～６ｍｍであってもよく、より正確には、機械的破損の危険がなく、流量と流速の流れが最も有利で、迅速な温度平衡に到達させることができる６ｍｍであってもよい。

【0028】

本発明の実施形態において、前記第２ハウジングは、上面の４個の辺と隣接する位置に各辺と並ぶ方向に形成された第２上面通孔をさらに含んでもよい。

【0029】

本発明の実施形態において、前記第２ハウジングは、前記第２上面通孔のそれぞれを挟んで一対ずつ位置する第３上面通孔をさらに含み、前記第３上面通孔は、上面の一部および側面の一部に達することができる。

【発明の効果】

【0030】

本発明は、極低温定常状態での貯蔵容器内窒素ガスの流れに対して流動解析を行うことによって、液体型タンク（Ｌｉｑｕｉｄ ｔｙｐｅ ｔａｎｋ）だけでなく、蒸気型タンク（Ｖａｐｏｒ ｔｙｐｅ ｔａｎｋ）の迅速な温度平衡の到達に有利な細胞の凍結保存装置を提供できる効果がある。

【0031】

また、本発明は、細胞が収容された試験管とハウジングの接触部分を最小化して、試験管を取り出すときに破損することを防止できる効果がある。

【0032】

また、流体解析を通じて液化窒素の流入および排出が容易な通孔の配置を提供して、試験管内の細胞培養液を急速に冷却させることができ、冷却による応力によりハウジングが破損することを防止できる効果がある。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】図１は、本発明の好ましい実施形態による５ｘ５細胞凍結保存装置の分解斜視図である。

【図2】図２は、第１ハウジングの一実施平面図である。

【図3】図３は、中央支持リブの平面図である。

【図4】図４は、側面支持リブの平面図である。

【図5】図５は、本発明の他の実施形態による９ｘ９細胞凍結保存装置の第１ハウジングの平面図である。

【図6】図６は、本発明の試作品の製作写真である。

【図7】図７は、本発明の温度相平衡時間の実験グラフである。

【図8】図８は、本発明の流体解析結果図である。

【図9】図９は、第１ハウジングの応力分析図である。

【図10】図１０は、通孔のサイズが異なる場合、応力分析図である。

【図11】図１１は、本発明の性能試験結果図である。

【図12】図１２は、本発明の性能試験結果図である。

【発明を実施するための形態】

【0034】

以下、本発明の好ましい実施形態を添付の図面を参照して詳細に説明する。

【0035】

別段の定めがない限り、本明細書のすべての用語は、当業者が理解する用語の一般的な
意味と同一であり、もし本明細書において使用された用語が当該用語の一般的な意味と衝突する場合には、本明細書に使用された定義に従う。

【0036】

ただし、以下に記述される発明は、本発明の実施形態を説明するためのものであり、本発明の権利範囲を限定するためのものではなく、明細書全般にわたって同一に使用された参照番号は同じ構成要素を示す。

【0037】

図１は、本発明の好ましい実施による５Ｘ５細胞の凍結保存装置の分解斜視図であり、図２は、図１の第１ハウジングの平面構成図である。

【0038】

図１および図２をそれぞれ参照すると、本発明の他の実施形態による細胞の凍結保存装置は、底面に多数の通孔１１０が形成され、上面が開放され、底面から上向きに突出する中央支持リブ１２０および内側面から当該側面に対して垂直方向に突出する側面支持リブ１３０を含む第１ハウジング１００と、細胞を収容し、前記第１ハウジング１００の中央支持リブ１２０の間または中央支持リブ１２０と側面支持リブ１３０の間に設置される試験管３００と、前記第１ハウジング１００の上部を覆い、上面に多数の第１上面通孔２１０が形成され、上面と側面の境界部分に設けられた第２上面通孔２２０および第３上面通孔２３０が形成された第２ハウジング２００と、を含んで構成される。

【0039】

以下、上記のように構成される本発明の好ましい実施形態による細胞の凍結保存装置の構成と作用についてさらに詳細に説明する。

【0040】

まず、第１ハウジング１００は、上面が開放され、中空の六面体構造であり、４個の角部の１つには、折曲面１４０が形成されることによって、前記第２ハウジング２００との結合方向を特定することができる。

【0041】

すなわち、第１ハウジング１００および第２ハウジング２００は、第１ハウジング１００が第２ハウジング２００の内に挿入されるように結合し、この際、第１ハウジング１００および第２ハウジング２００それぞれの一方の角部は、平坦面である折曲面１４０、２４０が形成されていて、常に２つの折曲面１４０、２４０が一致する方向に結合する。

【0042】

前記第１ハウジング１００の底面には、多数の通孔１１０が配置されており、通孔１１０が形成されていない第１ハウジング１００の底面から上向きに突出する中央支持リブ１２０が位置する。

【0043】

前記中央支持リブ１２０は、第１ハウジング１００と一体に成形されるものとする。

【0044】

また、第１ハウジング１００の内側面部には、側面支持リブ１３０が当該側面に垂直な方向である前記中央支持リブ１２０に向かって突出するように位置する。

【0045】

前記中央支持リブ１２０と側面支持リブ１３０は、試験管３００を安定的に支持するためのものであり、試験管３００の損傷を最大限防止できる構成を有する。

【0046】

前記中央支持リブ１２０は、四方に突出したリブを含み、側面支持リブ１３０は、一方向に突出したリブを含むものであり、試験管３００は、装着位置によって４個の中央支持リブ１２０に側面が当接して固定されたり、２個の中央支持リブ１２０と２個の側面支持リブ１３０により側面が当接して固定されてもよい。

【0047】

この際、試験管３００は、側面の全体が前記中央支持リブ１２０または側面支持リブ１３０に当接せず、上部と下部の一部のみが接触し、したがって、凍結状態で試験管３００
を取り出すとき、試験管３００が破損することを防止することができる。

【0048】

前記試験管３００は、ガラスなどの透明な材質の試験管本体３１０と、前記試験管本体３１０の下部に結合し、試験管本体３１０に比べて直径がさらに大きい下部リング３３０と、前記試験管本体３１０の上部に結合し、試験管本体３１０を覆い、当該試験管本体３１０に比べて直径がさらに大きい上部カバー３２０とからなってもよい。

【0049】

前記上部カバー３２０と下部リング３３０は、材質が前記第１ハウジング１００と同じポリカーボネートを使用することが好ましい。

【0050】

前記試験管３００が第１ハウジング１００内に収容されるとき、試験管本体３１０は、前記中央支持リブ１２０または側面支持リブ１３０に接触しない。

【0051】

直径がさらに大きい下部リング３３０と上部カバー３２０が中央支持リブ１２０または側面支持リブ１３０の側面に当接して固定された状態で支持される。

【0052】

前記第１ハウジング１００と第２ハウジング２００は、相互結合し、内部に空間を形成する六面体構造からなり、前述したように、結合の方向を一致させるために、第１ハウジング１００と第２ハウジング２００の一方の角部は、それぞれ、折曲面１４０、２４０が形成されている。

【0053】

図３は、中央支持リブ１２０の平面図である。

【0054】

中央支持リブ１２０は、中央の軸部１２１と、前記軸部１２１の側面から相互垂直となるように四方に突出した突出部１２２と、前記突出部１２２の先端から突出部１２２に対して平面上垂直である両方向に突出する接触部１２３と、を含む。

【0055】

前記接触部１２３は、突出した両端の先端部が試験管３００の上部カバー３２０と下部リング３３０の一部に接触し、試験管３００が流動しないように支持する。

【0056】

前記中央支持リブ１２０は、第１ハウジング１００と一体に形成され、材質も、ポリカーボネート材質であって、同じものとし、第１ハウジング１００と一体に射出成形されたものであってもよい。

【0057】

図４は、側面支持リブ１３０の平面図であり、側面支持リブ１３０は、一端が前記第１ハウジング１００の内壁面に固定され、内壁面と垂直な方向または角部では対角線方向である４５度傾斜した方向に突出する突出部１３１と、突出部１３１の突出した先端から当該突出部１３１に対して垂直である両方向に突出する接触部１３２と、を含む。

【0058】

この際、接触部１３２は、突出した両端の先端部がそれぞれ隣接する２つの試験管３００の上部カバー３２０および下部リング３３０の側面の一部に当接することもでき、角部から突出した側面支持リブ１３０の場合、接触部１２３の外側面が１つの試験管３００の上部カバー３２０と下部リング３３０の側面に当接することもできる。

【0059】

本発明は、試験管３００を収容した状態で液化窒素に投入されて冷凍される構造であり、試験管３００内の細胞冷凍を円滑にするために、第１ハウジング１００と第２ハウジング２００に液化窒素が流動しうる多数の通孔が設けられている。

【0060】

第１ハウジング１００の底面には、多数の通孔１１０が設けられており、通孔１１０は、位置によって第１底面通孔１１１と第２底面通孔１１２とに区分することができる。

【0061】

前記第１底面通孔１１１の場合、前記第１ハウジング１００の試験管３００装着位置の中央に形成され、第２底面通孔１１２は、実装した試験管３００の間の領域を露出させるように形成されている。

【0062】

これは、後述する流体解析の結果によって液体窒素が試験管３００に効果的に伝達されるためのものであり、全体的に均一に液化窒素が流入し、装着位置に関係なく、すべての試験管３００の細胞を均一に冷凍させるためである。

【0063】

第１底面通孔１１１は、形成位置によって、４個の中央支持リブ１２０が成す領域の第１ハウジング１００の底面の中央に形成されたり、２個の中央支持リブ１２０と２個の側面支持リブ１３０との成す領域の第１ハウジング１００の底面の中央に形成されたり、１個の中央支持リブ１２０と３個の側面支持リブ１３０との成す領域の第１ハウジング１００の底面の中央に形成されてもよい。

【0064】

第２底面通孔１１２は、第１底面通孔１１１の間の中央に配置されるものとする。第２底面通孔１１２は、対向する２つの接触部１２３、１３２の間の中央に配置される。

【0065】

前記第２ハウジング２００に形成される第１上面通孔２１０は、前記第１ハウジング１００の通孔１１０の上部に位置するように配置される。

【0066】

前述したように、第１ハウジング１００の第１底面通孔１１１と第２底面通孔１１２の配置および第２ハウジング２００の第１上面通孔２１０の配置は、流体の流動に有利であり、均一な冷凍を可能にする構造である。

【0067】

この際、第１ハウジング１００の通孔１１０と第２ハウジング２００の第１上面通孔２１０の配置において考慮される点は、機械的な強度と流体の流動であり、本発明では、第１ハウジング１００の通孔１１０と第２ハウジング２００の第１上面通孔２１０のサイズと配置を適切に調節して、機械的強度と流体の流動性を全部満たす構造を提案する。

【0068】

前記第２ハウジング２００には、第１上面通孔２１０以外に、第２上面通孔２２０および第３上面通孔２３０をさらに含み、第２上面通孔２２０は、第２ハウジング２００の上面において当該上面を成す４個の辺と並ぶ方向に隣接して形成される長孔である。

【0069】

また、第３上面通孔２３０は、前記第２上面通孔２２０の両端から所定距離離隔した位置において第２ハウジング２００の上面だけでなく、側面まで形成される、すなわち角部部分を除去して形成した通孔である。

【0070】

このような構造によって第１ハウジング１００と第２ハウジング２００が結合した状態で液化窒素が当該結合したボックスの内部に均一に供給され得るようにする。

【0071】

前記通孔の配置は、徹底して流体解析によって行われたものであり、通孔の当業者レベルで単純な配置によるものではない。

【0072】

このような理由は、第１ハウジング１００と第２ハウジング２００の設計は、流体の解析だけでなく、冷凍時に作用する応力を考慮した設計であるためである。

【0073】

本発明によって試験管３００に収容された試料である細胞を冷凍させるとき、冷凍による応力が第１ハウジング１００と第２ハウジング２００に作用することとなる。

【0074】

すなわち、本発明を１気圧常温（２２℃）で極低温環境である１気圧－１９６℃まで冷却させるとき、収縮応力が作用し、収縮応力により第１ハウジング１００と第２ハウジング２００が破損することがあり、試験管３００を安全に収容しない場合が発生することがある。

【0075】

図５は、本発明の他の実施形態による第１ハウジングの平面図である。

【0076】

前述した本発明の実施形態は、横方向に試験管３００を５個、縦方向に試験管３００を５個収容できる５ｘ５構造であり、図５には、横方向に９個の試験管、縦方向に９個の試験管を配置できる９ｘ９構造の例を挙げた。

【0077】

すなわち、第１ハウジング１００には、必要に応じて試験管３００の配置数を調節することができ、必要に応じて側面支持リブ１３０を省略することもできる。

【0078】

また、中央支持リブ１２０には、上下に貫通する通孔１２４が形成されており、通孔１２４に冷却ガスが流入し、試験管３００の温度を低減することができる構造を提供することができる。

【0079】

この通孔１２４は、前述した５ｘ５構造だけでなく、配置できる試験管の個数がさらに減少した構造やさらに増加した構造にも適用することができる。

【0080】

この際、第２ハウジング２００にも、通孔１２４に対応する通孔が形成されてもよい。

【0081】

下記の表１は、本発明の第１ハウジング１００と第２ハウジング２００の材質であるポリカーボネート（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ）の物性表である。

【0082】

【表1】

【0083】

本発明の性能評価のために、熱解析、熱－構造連成解析および流動解析を行い、解析対象と解析結果を説明すれば、次のとおりである。

【0084】

下記の表２は、本発明の５ｘ５モデルの解析モデルである。

【0085】

【表2】

【0086】

表２において、モデル１－１は、試験管３００の下部に位置する直径が６ｍｍの第１底面通孔１１１のみを含む５ｘ５構造であり、モデル１－２は、前述した本発明のように直径が６ｍｍの第１底面通孔１１１と第２底面通孔１１２を含む構造であり、モデル１－３および１－４は、それぞれ、直径が１２ｍｍおよび１５ｍｍの第１底面通孔１１１を有する５ｘ５構造の例である。

【0087】

【表3】

【0088】

上記の表３には、上記で図５を参照して説明した９ｘ９モデルの解析モデルを羅列した。９ｘ９モデルは、ｍｏｄｅｌ ２と命名して説明し、通孔１２４を有するものと、第１底面通孔を有するものを区分した。

【0089】

モデルの設定時に、底面の通孔のサイズは、１．５ｍｍから３ｍｍ、６ｍｍ、１２ｍｍ、１５ｍｍまで設定し、これらのうち、極低温環境の影響によって機械的破損が予想される１２ｍｍと１５ｍｍを優先的に排除し、次に、流速と流量にメリットが大きくない１．５ｍｍを排除した。

【0090】

モデル２－１およびモデル２－２は、保存容器内部のそれぞれリブの通孔１２４の直径が１．５ｍｍおよび３ｍｍであり、モデル２－３およびモデル２－４は、それぞれ、第１底面通孔１１１の直径が３ｍｍおよび６ｍｍであり、通孔１２４の直径が３ｍｍであると特定した。

【0091】

イ．熱解析
上記のモデル１およびモデル２に対して熱解析を行った。

【0092】

メッシュアプリケーション（Ｍｅｓｈ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）は、ＣＡＤモデルを節点（ｎｏｄｅ）と要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）で構成した解析モデルであり、それぞれの要素は、解析する物理系の方程式を構成する媒介体の役割をするので、解析環境によって要求される要素を設定しなければならない。

【0093】

本発明においてメッシュは、四面体タイプ（ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ｔｙｐｅ）と定義し、メッシュ密度の調整値を３段階のうち最も緻密な段階に設定して、メッシュ粒子の平均のサイズが０．２８ｍｍとなるように設定した。

【0094】

各モデル１に対する節点および要素の数は、下記の表４のとおりである。

【0095】

【表4】

【0096】

第１ハウジング１００と第２ハウジング２００は、３Ｄモデリング上で１つの剛体で結合し、外部環境は、初期に２５℃に設定し、対流条件（ｆｉｌｍ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ １．８Ｗ／ｍ^２℃）を設定する。

【0097】

また、第１ハウジング１００の底面が４時間以内に２５℃から－１９６℃まで減温されるように設定した。

【0098】

このような条件における熱解析結果を下記の表５に記載した。

【0099】

【表5】

【0100】

熱流速（ｔｏｔａｌ ｈｅａｔ ｆｌｕｘ）は、保管容器が極低温保管タンクの温度と同じ正常状態（－１９６℃）に到達するとき、単位面積当たり交換されるエネルギー量を意味する。５ｘ５保管容器（ｍｏｄｅｌ １）の場合、モデル別の熱流速（ｔｏｔａｌ ｈｅａｔ ｆｌｕｘ）は、モデルの種類と関係なく、液体窒素あるいは液体窒素から気化した窒素と最初に接触する底部で最大値が観察された。５ｘ５保管容器の場合、ホール個数が最も多いモデル１－２における最大熱流速値が７，１０２５Ｗ／ｍ^２であることが確認された。

【0101】

また、９ｘ９保管容器（ｍｏｄｅｌ ２）は、モデル２－２における最大熱流速値が８，０７２１Ｗ／ｍ^２と最も高く計算された。また、モデル内配置されたホール個数および面積と熱流速とは大きい関係がないことが示された。これは、熱流速は、本発明が極低温まで熱平衡を成す速度であり、内部の熱平衡程度を示す指標ではないことを意味する。

【0102】

ロ．熱－構造連成解析
上記の熱解析結果を基に熱－構造連成解析を行う。熱－構造連成解析は、本発明の安定性を評価する手段である。

【0103】

熱解析結果で導き出された温度分布および熱流速分布の結果を荷重に作用させた。解析結果、モデル別の等価応力値は、下記の表６のとおりである。本発明に分布する等価応力の最大値が材質の降伏強度（ｔｅｎｓｉｌｅ ｙｉｅｌｄまたはｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｙｉｅｌｄ ｓｔｒｅｎｇｔｈ）より小さければ、荷重条件に対して安全であると見ることができる。

【0104】

貫通ホールを中心に材料の収縮による応力が発生するが、５ｘ５モデルの場合、モデル１－１からモデル１－３までは貫通ホール周辺の等価応力が材料の降伏強度（１８５ＭＰａ）より小さいので、極低温環境による機械的破断の可能性が低い。

【0105】

一方、モデル１－４は、貫通ホールの周辺で等価応力がそれぞれ１９７ＭＰａであるから、液体型タンク（ｌｉｑｕｉｄ ｔｙｐｅ ｔａｎｋ）または蒸気型タンク（ｖａｐｏｒ ｔｙｐｅ ｔａｎｋ）で極低温環境による機械的あるいは物理的に破損する確率が高いと判断される。

【0106】

なお、９ｘ９モデルの場合、モデル２－１からモデル２－４まで貫通ホールの周辺に形成された等価応力が材料の降伏強度より小さいので、液体型タンクだけでなく、気体型タンク内で破断しないと判断された。

【0107】

【表6】

【0108】

ハ．流動解析
－モデリングおよび境界条件の設定
汎用の流動解析プログラムであるＡＮＳＹＳ Ｆｌｕｅｎｔを用いて本発明を解析した。本発明は、汎用の液体型タンクはもちろん、蒸気型タンクに保管用に使用されるものであり、蒸気型タンクの下端に－１９４℃の液体窒素が充填されており、気化した（ｖａｐｏｒｉｚｅｄ）窒素ガスがタンクの内部を循環しつつ平均－１８４℃を維持する。

【0109】

気化した窒素ガス量分だけ０．４２３ｍｍ／ｈｒの速度で液体窒素を充填しており、これを通じて、１時間当たり気化した窒素ガスの流量を計算すると、１７７，５７２２４ｍｍ^３／ｈｒである。

【0110】

－１９４℃、１２２ｂａｒで液体窒素の密度は、７９８．６ｋｇ／ｍ^３であるのに対し、同一条件の気体窒素の密度は、５．４９４ｋｇ／ｍ^３であって、約１４５倍膨張する。

【0111】

したがって、直径７３１ｍｍの蒸気型タンク内に流入して循環する気体窒素の体積は、２５，８０５，１０６．２７ｍｍ^３／ｈｒ、気体窒素の流速は、０．０１７ｍｍ／ｓである。また、極低温保管容器を通過する気体窒素のレイノルズ数（Ｒｅ）は、１．０３であり、気体窒素は、蒸気型タンク内で層流流動の挙動を示す。

【0112】

したがって、層流モデル（ｖｉｓｃｏｕｓ ｌａｍｉｎａｒ ｍｏｄｅｌ）を適用して、本発明の内部体積を気体窒素が流動する体積にモデリングし、１／４モデルで構成した。保管容器の内部に構成された通孔のうち第１ハウジングの底面に配置された第１底面通孔１１１、第２底面通孔１１２または通孔１２４をインレットに設定し、第２ハウジング２００に形成された上面通孔をアウトレットに設定した。

【0113】

この際、入口境界の条件は、－１８０℃で気体窒素が０．０１７ｍｍ／ｓの速度（ｖｅｌｏｃｉｔｙ－ｉｎｌｅｔ）で本発明の内部に流入するものと設定し、出口境界の条件は、圧力（ｐｒｅｓｓｕｒｅ－ｏｕｔｌｅｔ、１ ａｔｍ）である。

【0114】

５ｘ５および９ｘ９モデルそれぞれに対してｉｎｌｅｔ－ｏｕｔｌｅｔを設定した構成は、下記の表７のとおりである。流動解析も、格子（ｍｅｓｈ）の個数によって解析結果が異なっているので、格子依存性（ｍｅｓｈ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ）テストを通じて格子を最適化した。

【0115】

５ｘ５モデルの場合、先行した熱－構造連成解析の結果に基づいて材料の降伏強度を超過するモデル１－４は、流動解析検討モデルから除外した。９ｘ９モデルの場合、モデル２－３およびモデル２－４にそれぞれ直径１．５ｍｍ、３ｍｍの通孔１２４を追加した。モデル別のノードおよび格子の数は、表８のとおりである。

【0116】

【表7】

【0117】

【表8】

【0118】

－流動解析結果
本発明の細胞の凍結保存装置の内部を流れる気体窒素の出口流速は、モデル１がモデル２より最大２倍以上高い傾向を示した。これは、入水口１個あたりの面積（直径）がモデル２よりモデル１がさらに大きいためと判断される。

【0119】

モデル１－１、２－１、２－２、２－３は、入水部、出水部を除いた全区域で気体窒素が３．２４×１０^－３ｍｍ／ｓ以下で流動するので、気体窒素による対流熱交換がほとんどないと判断される。モデル１－２、１－３は、入水部－出水部をつなぐ流路では、気体窒素が流動するが、入水部－出水部をつなぐ区間以外の他の区域（赤色の点線表示部分）は、他のモデルと同様に、気体窒素がほとんど流動しない結果が計算された。

【0120】

モデル２－４の場合、気体窒素の最大流速が０．０３１ｍｍ／ｓであり、モデル１－２やモデル１－３に比べて半分レベルの最大流速を示すが、入水部－出水部をつなぐ区間外の他の区域、特に中央支持リブ１２０の上側の部分（赤色の点線表示部分）においても気体窒素の流れが観察される傾向を示した。

【0121】

流動解析の結果だけでは、５ｘ５モデルのうちモデル１－３が最も適しているが、極低
温環境で保管容器の等価応力が材料の降参応力値と似ているので、極低温環境の原因で機械的あるいは物理的に破損する恐れを考慮して、モデル１－２を最終モデルに選定することができる。

【0122】

すなわち、５ｘ５モデルでは、直径が６ｍｍの第１底面通孔１１１と第２底面通孔１１２を含む構造が最も優れた特性を示す。

【0123】

９ｘ９モデルの場合、本発明内の多くの領域で気体窒素の流動が現れるモデル２－４が最も適していることが確認された。

【0124】

すなわち、９ｘ９モデルでは、第１底面通孔１１１の直径が３～６ｍｍ、通孔１２４の直径が１．５～３ｍｍであることが最も好ましい特性を示す。

【0125】

－性能評価
５ｘ５モデルは、直径６ｍｍの第１底面通孔１１１および第２底面通孔１１２が配置されたモデル１－２、９ｘ９モデルは、直径６ｍｍの第１底面通孔１１１および直径３ｍｍの通孔１２４が配置されたモデル２－４を蒸気型タンク用極低温保管容器として採択し、製作した。

【0126】

製作写真は、図６に示した。

【0127】

蒸気型タンク（ＭＶＥ ８００ ｓｅｒｉｅｓ－１９０）の内部にモデル１－２とモデル２－４の試作品それぞれに温度センサーを付着したバイアルを挿入し、タンクの上側部分と下側部分に設置して、常温から温度平衡を成すときまでの温度変化を観察した。また、紙素材の試作品を共に実験した。

【0128】

その結果、上側に設置された保管容器の場合、－８０℃に到達するのにかかる時間が、９ｘ９製品は８分、５ｘ５は１１分、紙素材の試作品は１０分がかかるのに対し、－１３０℃に到達するのにかかる時間は、９ｘ９は１４分、５ｘ５は１６分、紙素材の試作品は１５分であることが示された。予想外に、紙素材の試作品が５ｘ５より温度下降速度が速い理由は、２つの試作品の厚さは３２ｍｍであるのに対し、紙素材の試作品の厚さは２ｍｍ以下と薄く、温度測定のために製品になかったホールを加工したので、気体窒素が５ｘ５より迅速に流入すると同時に、伝導による外部温度の伝達も迅速な温度降下の原因と判断される。同様の理由で、下側に設置された保管容器が－８０℃に到達するのにかかる時間が９ｘ９は５分、５ｘ５は９分、紙素材の試作品は８分がかかるのに対し、－１３０℃に到達するのにかかる時間は、９ｘ９は８分、５ｘ５は１２分、紙素材の試作品は１１分がかかる。５Ｘ５と同じ３２ｍｍの厚さであるが、９Ｘ９の迅速な温度降下は、リブ内の貫通口を通じて極低温の窒素気体が通過しつつ、保管容器の内外に空気循環をさらに自由にすることによって、迅速な温度平衡に到達すると判断される。

【0129】

このような結果は、図７のグラフから確認することができる。図７で、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）は、紙素材の試作品を示す。

【0130】

以下では、流体解析結果をさらに詳細に説明する。

【0131】

図８は、本発明の流体解析結果である。

【0132】

図８の流体解析結果は、第１ハウジング１００の流体解析結果であるが、第２ハウジング２００の流体解析結果も同一に現れることができる。

【0133】

前記第１ハウジング１００の第１底面通孔１１１および第２底面通孔１１２の配置と、第２ハウジング２００の第１上面通孔２１０、第２上面通孔２２０および第３上面通孔２３０の配置によって非常に均一な温度分布の冷却が可能となる。

【0134】

また、第１ハウジング１００の第１底面通孔１１１および第２底面通孔１１２の配置と、第２ハウジング２００の第１上面通孔２１０、第２上面通孔２２０および第３上面通孔２３０の配置は、冷却による応力を解消できる構造であり、特に前記通孔１１１、１１２、２１０、２２０、２３０の直径は６ｍｍとする。

【0135】

前記第１ハウジング１００の通孔１１０の数は、全て６５個であり、通孔１１０の面積は、１８３６．９ｍｍ^２となる。

【0136】

これは、通孔の直径によって通孔に作用する応力に差異があるので、流体の流動が円滑ながらも、応力による第１ハウジング１００と第２ハウジング２００の損傷を防止できる最適な直径および数である。

【0137】

すなわち、第１ハウジング１００と第２ハウジング２００の最大引張強度の範囲内の値で応力が作用すると、機械的破断が発生しないが、最大引張強度の範囲から外れる場合、通孔の周辺で極低温環境の影響による機械的破断が発生することがある。

【0138】

図９は、通孔の直径が６ｍｍの第１ハウジング１００の応力試験結果を示す。

【0139】

同図に示されたように、前記第１ハウジング１００と第２ハウジング２００の結合部分で最大応力が作用し、ＰＣ素材の第１ハウジング１００と第２ハウジング２００の最大引張強度より小さい値となり、通孔の周辺に作用する応力も、ＰＣの最大引張強度より小さい値であるから、機械的または物理的破断が発生しない。

【0140】

しかしながら、図１０のように、通孔の直径を１２ｍｍとしたとき、通孔の周辺の応力が増加し、ＰＣ素材の最大引張強度の範囲から外れて、通孔の周辺が極低温環境に起因して破断する可能性が非常に高くなる。

【0141】

したがって、本発明に適用される第１ハウジング１００の通孔１１０と第２ハウジング２００の第１上面通孔２１０の直径は、いずれも３～６ｍｍとする。３ｍｍ未満の場合、流体の流動に問題があり、６ｍｍを超過する場合、応力が増加して破断可能性があるためである。

【0142】

このように、本発明は、通孔の配置とサイズを提案して、急激な冷却時にも機械的あるいは物理的破断または変形が発生せず、全体的に均一な冷凍を可能にした。

【0143】

－細胞培養を介した本発明の性能評価
本発明の性能評価のために、細胞株（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）１種（Ｃ２Ｃ１２）とヒト成体幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）１種（ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ（ｈＡＤＭＳＣ）Ｐ８）に対して紙材質の試作品、９ｘ９、５ｘ５モデル内に細胞（ｃｅｌｌ）が注入されたバイアルチューブ（ｖｉａｌ ｔｕｂｅ）を１つのグループは－８０℃に維持される超低温冷凍庫（ｄｅｅｐ ｆｒｅｅｚｅｒ）に２４時間保管した後、常温に解凍させ、他の１つのグループは－１９６℃を維持する気体型タンク（ｖａｐｏｒ ｔｙｐｅ ｔａｎｋ）に４８時間凍結した。

【0144】

２つのグループは、いずれも常温で解凍後、各バイアルチューブに注入されている細胞
の生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を評価し、６時間経過後の付着率（ａｄｈｅｓｉｏｎ ｒａｔｅ）、１日／３日／５日後の細胞の生長率（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を比較した。

【0145】

細胞凍結保存液は、Ｍｅｄｉａ：ＦＢＳ：ＤＭＳＯを７：２：１の割合で混合して使用し、Ｃ２Ｃ１２とｈＡＤＭＳＣ細胞数は、それぞれ、１ｘ１０^６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ個に同一に設定して凍結し、解凍後、細胞は、６０ｍｍの培養容器に４ｘ１０^４ ｃｅｌｌｓを接種した。

【0146】

生存率および付着率を評価するために、ＬＵＮＡ－ＦＬ^ＴＭ Ｄｕａｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｌｏｇｏｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて細胞数をカウントした。成長率を評価するために、凍結してから解凍したＣ２Ｃ１２細胞は、ＤＭＥＭ Ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｔｈｅｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）＋１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）＋１％Ｐ／Ｓ（Ｔｈｅｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、ｈＡＤＭＳＣ Ｐ８は、ＣＥＦＯｇｒｏ^ＴＭＭＳＣＧＭで培養させ、ＭＴＳ（３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－５－（３－ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－２－（４－ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）－２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ，ＵＳＡ）で分析した。

【0147】

細胞培養結果を見ると、Ｃ２Ｃ１２は、ｈＡＤＭＳＣ Ｐ８に比べて温度変化に対する細胞生長感度がさらに高いことが確認された。本発明の温度測定結果と同様に、－８０℃および－１９６℃に細胞保管後に解凍して生長させた場合、５ｘ５の細胞生長指標（生存率、付着率、生長率）は、紙材質の試作品の細胞成長指標と同様または少し低い性能を示すためである。これは、紙材質の試作品の場合、２ｍｍと薄い厚さで構成されていて、流量と流速の影響もあるが、材質面を介した温度伝達が速いためと認められ、５Ｘ５と９Ｘ９の場合は、厚さが３２ｍｍで、紙材質の試作品に比べて材質面を介した温度伝達よりも、通気管を介した流速と流量による温度平衡にさらに影響を受けると判断される。したがって、凍結保存容器の底面に位置する通気管だけでなく、柱タイプで設置されたリブ構造内の通気管が空気の流れをさらに自由にして、細胞の保管安定性を高めると見られる。生長率の場合、流量と流速がさらに自由に開発された保管容器は、いずれも、紙材質の試作品より最大１３０％改善された。将来、蒸気型タンク上で開発容器内に細胞を１ヶ月以上長期保管後に解凍成長させた場合には、機械的破断を防止するために、通気管が最小化された従来製品より良好な細胞生長指標を示すと判断される。なお、３種の極低温保管容器のうち内部温度が最も速く低下する９ｘ９におけるＣ２Ｃ１２細胞株に対する細胞成長指標は、温度と関係なく最も高いレベルであり、特に、付着率は、約９０％以上であり、米国ＦＤＡ細胞ベースの治療剤の保管および運送要件に適合する。

【0148】

ｈＡＤＭＳＣ Ｐ８も、同様に、－８０℃保管後、細胞を生存させた場合にのみ、５ｘ５の細胞生存率が最も低く、残りの温度条件における細胞成長指標は、紙材質の試作品よりも５ｘ５、９ｘ９がさらに大きい細胞生長指標を示した。特に９ｘ９は、紙材質の試作品および５ｘ５に比べて、生存率が９０％以上、６時間培養後の付着率が８０％以上と良好に現れて、最も良い性能を示した。

【0149】

このような試験結果を図１１と図１２にそれぞれ示した。

【0150】

このように本発明は、極低温環境でも破断が発生せず、蒸気型タンク（ｖａｐｏｒ ｔｙｐｅ ｔａｎｋ）に適用できる細胞の凍結保存装置を提供することができ、細胞の保管安定性を高めて、先端再生医療用細胞保管を有利にすることが期待される。

【0151】

以上、前記説明によって当業者なら本発明の技術的思想を逸脱しない範囲で多様な変更および修正が可能であることが分かり、本発明の技術的範囲は、実施形態に記載された内容に限定されるものではなく、特許請求範囲およびそれと均等な範囲によって定められなければならない。

【産業上の利用可能性】

【0152】

本発明は、機械的強度を高め、熱力学的な温度平衡に迅速に到達できる装置の構造に関し、産業上の利用可能性がある。

【符号の説明】

【0153】

１００：第１ハウジング
１１０：通孔
１２０：中央支持リブ
１３０：側面支持リブ
２００：第２ハウジング
２１０：第１上面通孔
２２０：第２上面通孔
２３０：第３上面通孔
３００：試験管

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】