特許 7561134 合成腫瘍溶解性ＬＮＰレプリコンＲＮＡおよびがん免疫治療のための使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-09-25

(45)【発行日】2024-10-03

(54)【発明の名称】合成腫瘍溶解性ＬＮＰレプリコンＲＮＡおよびがん免疫治療のための使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/01 20060101AFI20240926BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240926BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20240926BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240926BHJP

   A61K 31/166 20060101ALI20240926BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20240926BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20240926BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20240926BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20240926BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240926BHJP

   C12N 15/24 20060101ALN20240926BHJP

【ＦＩ】

C12N7/01 ZNA

A61K48/00

A61K38/20

A61P35/00

A61K31/166

A61K9/127

A61K47/24

A61K47/34

A61K47/28

A61P43/00 121

C12N15/24

【請求項の数】 18

(21)【出願番号】P 2021553767

(86)(22)【出願日】2020-01-10

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-05-02

(86)【国際出願番号】 US2020013069

(87)【国際公開番号】W WO2020185293

(87)【国際公開日】2020-09-17

【審査請求日】2023-01-10

(31)【優先権主張番号】62/815,611

(32)【優先日】2019-03-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】596060697

【氏名又は名称】マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー

(73)【特許権者】

【識別番号】514137997

【氏名又は名称】オハイオ・ステイト・イノベーション・ファウンデーション

(74)【代理人】

【識別番号】100102842

【弁理士】

【氏名又は名称】葛和 清司

(72)【発明者】

【氏名】アーバイン，ダレル，ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】ウィトラップ，カール，デーン

(72)【発明者】

【氏名】ワイス，ロン

(72)【発明者】

【氏名】リー，インジョン

(72)【発明者】

【氏名】ムミン，ノア

(72)【発明者】

【氏名】ドン，イージョウ

【審査官】上村 直子

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１８／０１４７１６６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】Vaccines，2016年，4(4):39，pp.1-23

【文献】Nano Letters，2017年，17(3），pp.1326-1335

【文献】Cellular and Molecular Bioengineering，2018年，11(5)，pp.397-406

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ ７／０１

Ａ６１Ｋ

Ａ６１Ｐ

Ｃ１２Ｎ １５／２４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）Ｎ１，Ｎ３，Ｎ５－トリス（３－（ジドデシルアミノ）プロピル）ベンゼン－１，３，５－トリカルボキサミド（ＴＴ３）を含む脂質ナノ粒子；および
（ｉｉ）インターロイキン（ＩＬ）－１２分子をコードする配列を含む自己増幅（self-amplifying）レプリコンＲＮＡ
を含む、合成腫瘍溶解性ウイルスであって、
ここで、ＩＬ－１２分子は、自己増幅レプリコンＲＮＡにより発現される、
前記合成腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項2】

脂質ナノ粒子が、１以上のタイプの脂質をさらに含み、１以上のタイプの脂質が、カチオン性脂質を含む、請求項１に記載の合成腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項3】

脂質ナノ粒子が、ＴＴ３、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、およびコレステロールを含む、請求項１に記載の合成腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項4】

脂質ナノ粒子が、ＴＴ３、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール、およびＣ１４－ＰＥＧ２０００を含む、請求項１に記載の合成腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項5】

自己増幅レプリコンＲＮＡが、アルファウイルス、またはＣ型肝炎ウイルスに由来する、請求項１～４のいずれか一項に記載の合成腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項6】

アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、セムリキ森林ウイルス、またはシンドビスウイルスである、請求項５に記載の合成腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項7】

ＩＬ－１２分子をコードする配列が、自己増幅レプリコンＲＮＡのサブゲノム領域中に位置づけられる、請求項１～６のいずれか一項に記載の合成腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項8】

自己増幅レプリコンＲＮＡが、配列番号１に対して少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の合成腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項9】

レプリコンＲＮＡが、配列番号１のＧ３９３６Ｃおよび／またはＡ４７５８Ｇの点突然変異を含む、請求項８に記載の合成腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項10】

ＩＬ－１２分子が、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２サブユニット、または免疫調節性機能を保持する突然変異体ＩＬ－１２分子である、請求項１～９のいずれか一項に記載の合成腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項11】

ＩＬ－１２分子が、ＩＬ－１２αおよび／またはＩＬ－１２βサブユニットを含む、請求項１０に記載の合成腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項12】

脂質ナノ粒子が、約１００～１２０ｎｍの直径および／または約３～６ｍｖのゼータ電位を有する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の合成腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項13】

請求項１～１２のいずれか一項に記載の合成腫瘍溶解性ウイルスおよび薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。

【請求項14】

脂質ナノ粒子が、ＴＴ３、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、およびコレステロールを含む、請求項１３に記載の医薬組成物。

【請求項15】

Ｃ１４－ＰＥＧ２０００をさらに含む、請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項16】

合成腫瘍溶解性ウイルスおよび薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物であって、
合成腫瘍溶解性ウイルスが、
（ｉ）ＴＴ３、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、およびコレステロールを含む脂質ナノ粒子；および
（ｉｉ）インターロイキン（ＩＬ）－１２分子をコードする配列を含む自己増幅（self-amplifying）レプリコンＲＮＡ
を含み、
ここで、自己増幅レプリコンＲＮＡは、配列番号１に対して少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含み、
ここで、脂質ナノ粒子は、免疫原性細胞死を引き起こすことができ、
ここで、ＩＬ－１２分子は、自己増幅レプリコンＲＮＡにより発現され、および
ここで、医薬組成物は、さらにＣ１４－ＰＥＧ２０００を含む、
前記医薬組成物。

【請求項17】

有効量の合成腫瘍溶解性ウイルスまたは医薬組成物を対象へ投与することを含む、これを必要とする対象においてがんを処置するための請求項１～１２のいずれか一項に記載の合成腫瘍溶解性ウイルスまたは請求項１３～１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項18】

対象が、がんを有するかまたはがんを有すると疑われるヒト患者であり、ここで、がんは、黒色腫、乳がん、結腸がん、扁平上皮細胞がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜のがん、肝細胞がん、胃腸がん、膵臓がん、膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝がん、大腸がん、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌、胃がん、扁平細胞頭頸部がん（squamous cell head and neck cancer）、腎細胞がん、尿路上皮癌、またはホジキンリンパ腫である、請求項１７に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１９年３月８日に出願された、米国仮特許出願第６２／８１５，６１１号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下での優先権を主張し、その内容全体は、本明細書において参照として組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

背景
本開示は、１以上のタイプの脂質を含む脂質ナノ粒子および免疫調節性分子をコードする配列を含む自己増幅（self-amplifying）レプリコンＲＮＡを含む合成腫瘍溶解性ウイルスに関する。

【発明の概要】

【0003】

概要
本開示は、合成腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍部位での注射の際に、成功裏に局所腫瘍の抗がん免疫応答を引き起こし、および末梢の腫瘍に対して全身性免疫を可能にするという、予想外の発見に、少なくとも一部において基づく。
結果的に、本開示の一側面は、１以上のタイプの脂質を含む脂質ナノ粒子およびインターロイキン（ＩＬ）－１２分子をコードする配列を含む自己増幅レプリコンＲＮＡを含む合成腫瘍溶解性ウイルスを提供する。脂質ナノ粒子は、免疫原性細胞死を引き起こすことができる。ＩＬ－１２分子は、自己増幅レプリコンＲＮＡによって発現される。

【0004】

合成腫瘍溶解性ウイルスは、脂質ナノ粒子を含む。脂質ナノ粒子は、１以上のタイプの脂質を含む。いくつかの態様において、１以上のタイプの脂質は、カチオン性脂質を含む。いくつかの態様において、カチオン性脂質は、Ｎ１，Ｎ３，Ｎ５－トリス（３－（ジドデシルアミノ）プロピル）ベンゼン－１，３，５－トリカルボキサミド（ＴＴ３）である。いくつかの態様において、脂質ナノ粒子は、ＴＴ３、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール、およびＣ１４－ＰＥＧ２０００を含む。
さらに、合成腫瘍溶解性ウイルスは、自己増幅レプリコンＲＮＡを含む。いくつかの態様において、自己アンプリコンＲＮＡ（self-amplicon RNA）は、アルファウイルスまたは他のグループＩＶウイルス（Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）などの正の一本鎖ＲＮＡウイルス）に由来する。いくつかの態様において、アルファウイルスは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、セムリキ森林ウイルス、またはシンドビスウイルスであり得る。

【0005】

いくつかの態様において、自己増幅レプリコンＲＮＡは、ＩＬ－１２分子をコードする配列を含む。いくつかの態様において、ＩＬ－１２分子をコードする配列は、自己増幅レプリコンＲＮＡのサブゲノム領域に位置付けられる。
いくつかの態様において、自己増幅レプリコンＲＮＡは、配列番号１の配列を有する野生型（ＷＴ）レプリコンＲＮＡと少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、自己増幅レプリコンＲＮＡは、配列番号１と同一ではなく、かつ配列番号１を含む自己増幅レプリコンＲＮＡを比較してより高いレベルでＩＬ－１２分子を発現することができる。いくつかの態様において、より高いレベルでＩＬ－１２分子を発現することができるレプリコンＲＮＡは、配列番号１のＧ３９３６Ｃおよび／またはＡ４７５８Ｇの点突然変異を含む。

【0006】

いくつかの態様において、自己増幅レプリコンＲＮＡは、血清アルブミンコード配列をさらに含む。いくつかの態様において、自己増幅レプリコンＲＮＡは、ルミカンコード配列をさらに含む。
いくつかの側面において、自己増幅レプリコンＲＮＡは、ＩＬ－１２分子をコードする配列を含む。いくつかの態様において、ＩＬ－１２分子は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２サブユニット、または免疫調節性機能を保持する突然変異体ＩＬ－１２分子からなる群から選択される。いくつかのさらなる態様において、ＩＬ－１２分子は、ＩＬ１２αおよび／またはＩＬ１２βサブユニットを含む。

【0007】

いくつかの態様において、脂質ナノ粒子は、約１００～１２０ｎｍの直径を有する。いくつかの態様において、脂質ナノ粒子は、約３～６ｍｖのゼータ電位を有する。
いくつかの態様において、脂質および自己増幅レプリコンＲＮＡは、約１：２～２：１の質量比を有する。

【0008】

本開示は、少なくとも一部において、合成腫瘍溶解性ウイルスおよび薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物に関する。
いくつかの態様において、医薬組成物は、腫瘍内注射のために処方される。

【0009】

本開示は、少なくとも一部において、有効量のいずれかの合成腫瘍溶解性ウイルスまたは合成腫瘍溶解性ウイルスを含有する医薬組成物を対象へ投与することを含む、これを必要とする対象においてがんを処置するための方法に関する。
いくつかの態様において、対象は、がんを有するかまたは有すると疑われるヒト患者である。例示の標的のがんは、これらに限定されないが、黒色腫、乳がんおよび結腸がんを包含する。
いくつかの態様において、医薬組成物は、単回用量で対象に投与される。いくつかの態様において、医薬組成物は、腫瘍内注射によって対象に投与される。

【0010】

本明細書に開示の標的の疾患のいずれか（例として、がん）の処置における使用のための本明細書に記載のいずれかの合成腫瘍溶解性ウイルスを含有する医薬組成物、ならびにがんの処置のための医薬の製造における使用のための合成腫瘍溶解性オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物もまた、本開示の範囲内である。
本発明の１以上の態様の詳細は、以下の記載で表される。本発明の他の特色または利点は、以下の図面およびいくつかの態様の詳細な記載から、および添付の特許請求の範囲からもまた明白であるだろう。

【図面の簡単な説明】

【0011】

図面の簡単な記載

【図1】図１Ａ～１Ｈは、ＤＯＴＡＰ、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏ）、ＴＴ３ナノ粒子（ＴＴ３）、突然変異体レプリコンＲＮＡ（ＲＮＡ）、突然変異体レプリコンＲＮＡをカプセル封入したＤＯＴＡＰ、Ｌｉｐｏ、およびＴＴ３ナノ粒子（ＤＯＴＡＰ－ｍｔＲｅｐ、Ｌｉｐｏ－ｍｔＲｅｐ、およびＴＴ３－ｍｔＲｅｐ）、電気穿孔（Ｅｌｅｃｔｒｏ）、および突然変異体レプリコンＲＮＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏ－ｍｔＲｅｐ）を用いた電気穿孔、でトランスフェクトされたＢ１６Ｆ１０細胞の効果を示すチャートである。図１Ａは、Ｂ１６Ｆ１０細胞のトランスフェクション３日後の生存率を示すグラフである。図１Ｂは、突然変異体または不活性型（ｄｅａｄ）レプリコンＲＮＡ（ｄｅＲｅｐ）を用いてカプセル封入した脂質ナノ粒子でトランスフェクトされたＢ１６Ｆ１０細胞におけるＧＦＰ発現を示すグラフである。図１Ｃは、ＰＩ＋アネキシンＶ＋トランスフェクトされた脂質ナノ粒子またはレプリコンＲＮＡを用いてカプセル封入された脂質ナノ粒子でトランスフェクトされたＢ１６Ｆ１０死細胞のパーセンテージを示すグラフである。脂質ナノ粒子またはレプリコンＲＮＡを用いてカプセル封入された脂質ナノ粒子によって誘導された免疫原性細胞死は、カルレティキュリン＋（ＣＲＴ＋）細胞（図１Ｄ）、細胞外ＡＴＰ（図１Ｅ）およびＨＭＧＢ１放出（図１Ｆ）のパーセントによって示された。図１Ｇは、脂質ナノ粒子および突然変異体レプリコンＲＮＡを積載した脂質ナノ粒子の直径を示す。図１Ｈは、脂質ナノ粒子および突然変異体レプリコンＲＮＡを積載した脂質ナノ粒子のゼータ電位を示す。

【0012】

【図2】図２Ａ～２Ｊは、ｍｔＲｅｐおよびｄｅＲｅｐが、ＴＬＲ３シグナル伝達を引き起こし、および壊死性細胞死へのＩＳＧＦ３複合体を誘導することを示すチャートである。ＬＮＰ－レプリコンＲＮＡは、ＴＬＲ３シグナル伝達を引き起こし（図２Ｂおよび図２Ｅ）、およびインターフェロン刺激遺伝子Ｓｔａｔ１、Ｓｔａｔ２、ＩＲＦ９、ＩＲＦ３およびｃＧＡＳの発現を活性化する（図２Ｆ－２Ｊ）が、ＴＬＲ２（図２Ａ）、ＴＬＲ７（図２Ｃ）またはＴＬＲ９を活性化しない（図２Ｄ）。

【0013】

【図3】図３Ａ～３Ｋは、ＴＴ３－ｍｔＲｅｐが、免疫細胞をリクルートし、および腫瘍成長を消失させることを示すチャートである。図３Ａは、ｍｔＲｅｐが、注射後３日目により多くのＬｙ６ｃｌｏＬｙ６Ｇ＋顆粒球をリクルートすることを示す。図３Ｂは、ＴＴ３－ｍｔＲｅｐを注射された腫瘍中の注射後３日目でのＣＤ４５＋およびＣＤ４５－細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞のパーセンテージを示す。図３Ｃは、ＴＴ３－ｍｔＲｅｐの注射後１日目でのＩＳＧＦ３複合体（Ｓｔａｔ１／Ｓｔａｔ２／ＩＲＦ９）ならびにＩＲＦ３およびｃＧＡＳの発現を示す。図３Ｄ～３Ｆは、ＴＴ３－ｍｔＲｅｐの注射後１日目（図３Ｄ）、および注射後３日目（図３Ｅ）、ならびに３回の逐次的な注射の注射後１日目（図３Ｆ）での腫瘍内への免疫細胞浸潤（顆粒球、Ｍ－ＭＤＳＣ、単球、マクロファージ、ＣＤ４ Ｔ、ＣＤ８ Ｔ、ＮＫ、ＮＫＴ、従来型ＤＣ１（ｃＤＣ１）、および従来型ＤＣ２（ｃＤＣ２））を示す。図３Ｇ～３Ｈは、ＴＴ３－ｍｔＲｅｐの３回の逐次的な注射の１日後で、ＴＴ３－ｍｔＲｅｐが、より多くの細胞死（図３Ｇ）、より多くの免疫細胞浸潤（図３Ｈ）、低減された腫瘍重量（図３Ｉ）、腫瘍面積（図３Ｊ）および増大したＣＣＬ５の発現（図３Ｋ）を誘導することを示す。

【0014】

【図4】図４Ａ～４Ｇは、ＩＬ１２－ＭＳＡまたはＩＬ１２－ＭＳＡ－ルミカンをコードするＴＴ３－ｍｔＲｅｐが、腫瘍微小環境および免疫細胞浸潤を有効に調節することを示すチャートである。図４Ａおよび４Ｂは、ＴＴ３－ｍｔＲｅｐの注射後１日目および３日目での腫瘍中（図４Ａ）および血清中（図４Ｂ）のＥＬＩＳＡによるＩＦＮα２の定量化を示す。図４Ｃは、ｍｔＲｅｐ－ＩＬ１２－ＭＳＡおよびｍｔＲｅｐ－ＩＬ１２－ＭＳＡ－ルミカンでトランスフェクトされたＢ１６Ｆ１０細胞が、ＩＬ－１２を産生し得ることを示す。図４Ｄは、ＴＴ３－ｍｔＲｅｐ、ＴＴ３－ｍｔＲｅｐ－ＩＬ１２－ＭＳＡ、またはＴＴ３－ｍｔＲｅｐ－ＩＬ１２－ＭＳＡ－ルミカンの単回の注射１日後および３日後での腫瘍中のＩＬ－１２レベルを示す。図４Ｅ－４Ｆは、ＴＴ３－ｍｔＲｅｐ、ＴＴ３－ｍｔＲｅｐ－ＩＬ１２－ＭＳＡ、またはＴＴ３－ｍｔＲｅｐ－ＩＬ１２－ＭＳＡ－ルミカンの単回の注射の注射後１日目（図４Ｅ）および３日目（図４Ｆ）での腫瘍における免疫細胞浸潤を示す。図４Ｇは、ＴＴ３－ｍｔＲｅｐ、ＴＴ３－ｍｔＲｅｐ－ＩＬ１２－ＭＳＡ、またはＴＴ３－ｍｔＲｅｐ－ＩＬ１２－ＭＳＡ－ルミカンの単回の注射の注射後１日目および３日目での腫瘍排出リンパ節における従来型ＤＣ１（ｃＤＣ１）の数を示す。

【0015】

【図5】図５Ａ～５Ｅは、免疫調節性ＩＬ１２およびＴＴ３－ｍｔＲｅｐにより誘導された免疫原性細胞死のｉｎ ｖｉｖｏでの相乗的な抗がん効果を示すチャートである。相乗的な抗がん効果は、体重の変化（図５Ａ）、血清中のＩＦＮｒ（図５Ｂ）、腫瘍面積（図５Ｃ）、および生存曲線（図５Ｄ）によって評価された。図５Ｅは、ＴＴ３－ｍｔＲｅｐ－ＩＬ１２処置が、治療されたマウスにおける腫瘍の再発を予防し得ることを示す。

【0016】

詳細な記載
本開示は、少なくとも一部において、腫瘍部位での注射の際に、１以上のタイプの脂質を含む脂質ナノ粒子およびＩＬ－１２分子をコードする配列を含む自己増幅レプリコンＲＮＡを含む合成腫瘍溶解性ウイルスが、局所腫瘍の抗がん免疫応答を成功裏に引き起こし、および末梢の腫瘍に対する全身性免疫を可能とするという予想外の発見に基づく。

【0017】

Ｉ．合成腫瘍溶解性ウイルス
本開示は、少なくとも一部において、合成腫瘍溶解性ウイルスに関する。本明細書に使用されるとき、用語「合成」は、非天然の、または改変された本明細書に開示のとおりの腫瘍溶解性ウイルスを指し、それは脂質ナノ粒子およびＩＬ－１２分子をコードする配列を含む自己増幅レプリコンＲＮＡを包含する。
いくつかの側面において、本開示は、自身によって免疫原性細胞死を誘導することができる、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を利用し、腫瘍細胞内への生物学的に活性な剤（例として、ＩＬ－１２分子をコードする自己増幅レプリコンＲＮＡ）の送達を促進することに関する。

【0018】

（ｉ）脂質ナノ粒子
本開示は、少なくとも一部において、脂質ナノ粒子を使用した生物学的に活性な分子の細胞への送達に関する。具体的に言うと、本発明は、脂質ナノ粒子によってカプセル封入されたＩＬ－１２を発現する自己増幅レプリコンＲＮＡを含む合成腫瘍溶解性ウイルス、その組成物、およびがんを有するかまたはがんを有すると疑われる対象を処置するために、合成腫瘍溶解性ウイルスおよびその組成物を使用する方法に関する。
本明細書に使用されるとき、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、連続した脂質二重層を有する球状のベシクルなどのベシクルを指す。脂質ナノ粒子は、それによって医薬療法が、標的とされる場所へ送達される方法において使用され得る。ＬＮＰの非限定例は、リポソーム、双頭型両親媒性化合物、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）、ナノ構造脂質キャリア（ＮＬＣ）、および単層膜構造（例として、アルケオソーム（archaeosome）およびミセル）を包含する。

【0019】

本明細書に使用されるとき、脂質ナノ粒子は、１以上のタイプの脂質を含む。本明細書に使用されるとき、脂質は、これらに限定されないが、脂肪酸のエステルを包含する一群の有機化合物を指し、およびいくつかの態様においては、水に不溶であるが、多くの有機溶媒に可溶であることよって特徴付けられている。それらは、大抵少なくとも３つのクラスに区分される：（１）脂肪および油ならびに蝋を包含する「単純な脂質」；（２）リン脂質および糖脂質を包含する「化合物脂質」；（３）ステロイドなどの「由来脂質」。脂質の非限定例は、トリグリセリド（例として、トリステアリン）、ジグリセリド（例として、グリセロールベヘネート（bahenate））、モノグリセリド（例として、グリセロールモノステアラート）、脂肪酸（例として、ステアリン酸）、ステロイド（例として、コレステロール）、および蝋（例として、パルミチン酸セチル）を包含する。いくつかの態様において、ＬＮＰにおける１以上のタイプの脂質は、カチオン性脂質を含む。

【0020】

本明細書に使用されるとき、カチオン性脂質は、生理学的ｐＨなどの選択されるｐＨで、正味の正電荷を運ぶ数多の脂質の種のいずれかを指す。このような脂質は、これらに限定されないが、Ｎ１，Ｎ３，Ｎ５－トリス（３－（ジドデシルアミノ）プロピル）ベンゼン－１，３，５－トリカルボキサミド（ＴＴ３）、Ｎ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＡＰ）；リポフェクタミン；１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレンイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、ジオクタデシルジメチルアンモニウム（ＤＯＤＭＡ）、ジステアリルジメチルアンモニウム（ＤＳＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）；３－（Ｎ－（Ｎ′，Ｎ′－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）およびＮ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウム臭化物（ＤＭＲＩＥ）を包含する。

【0021】

いくつかの態様において、カチオン性脂質は、ＴＴ３である。本明細書に使用されるとき、ＴＴ３は、様々な生物学的活性剤の細胞内への送達のための脂質ナノ粒子を形成することができる。加えて、本開示はまた、無積載のＴＴ３－ＬＮＰが、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでがん細胞において免疫原性細胞死（ＩＣＤ）を誘導し得ることを実証する。本明細書に記載のとおり、免疫原性細胞死は、樹状細胞（ＤＣ）の活性化およびその結果生じる特定のＴ細胞応答の活性化を通して有効な免疫応答を誘導し得る細胞死の形態を指す。いくつかの態様において、免疫原性細胞死（ＩＣＤ）を受ける細胞は、腫瘍細胞である。免疫原性腫瘍細胞死は、有効な抗腫瘍免疫応答を引き起こし得る。いくつかの態様において、合成腫瘍溶解性ウイルスは、レポーター遺伝子のみをコードする自己増幅レプリコン（ＴＴ３－ＬＮＰ－レプリコンＲＮＡ）をカプセル封入するＴＴ３－ＬＮＰを含む。自己増幅レプリコンＲＮＡは、ＴＴ３－ＬＮＰと相乗的に働いて、ＴＴ３－ＬＮＰ単独と比較して、腫瘍細胞におけるより高いレベルのＩＣＤを誘導し得る。他の態様において、合成腫瘍溶解性ウイルスは、ＩＬ－１２分子をコードする自己増幅レプリコンＲＮＡをカプセル封入するＴＴ３－ＬＮＰを含む。免疫調節性サイトカインであるＩＬ－１２は、局所腫瘍に対する強力な免疫応答を引き出す。その上、ＴＴ３－ＬＮＰ、自己増幅レプリコンＲＮＡおよびＩＬ－１２発現の組み合わせは、その場での腫瘍細胞の相乗的な阻害に有効であるだけでなく、全身性の抗腫瘍免疫応答をも引き出し、末梢の腫瘍細胞を殺傷し、および腫瘍の再発を予防する。

【0022】

いくつかの態様において、カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰである。本明細書に使用されるとき、ＤＯＴＡＰは、脂質ナノ粒子を形成することもまたできる。ＤＯＴＡＰは、一過的または安定した遺伝子発現のための酵母人工染色体（ＹＡＣ）を包含するＤＮＡの真核細胞内への高度に効率的なトランスフェクションのために使用され得、およびＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、リボヌクレオ－タンパク質（ＲＮＰ）複合体、およびタンパク質などの他の負に帯電した分子の哺乳動物の細胞の調査試料内への効率的な移動にもまた好適である。

【0023】

他の態様において、カチオン性脂質は、リポフェクタミンである。本明細書に使用されるとき、リポフェクタミンは、Invitrogenによって生産および販売されており、分子生物学および細胞生物学において使用される、一般的なトランスフェクション試薬である。それは、リポフェクションによって、ＲＮＡ（ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを包含する）またはプラスミドＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞培養物内へのトランスフェクション効率の増加のために使用される。リポフェクタミンは、水性の環境において、トランスフェクションペイロード、例として、自己増幅レプリコンＲＮＡを捕捉する、リポソームまたは脂質ナノ粒子を形成することのできる脂質サブユニットを含有する。ＲＮＡを含有するリポソーム（それらの表面は正に帯電している）は、細胞膜とリポソームの中性共脂質を媒介する融合に起因して、負に帯電した生細胞の原形質膜と融合することができる、核酸カーゴ分子が複製または発現のために細胞質内へと渡ることを可能とする。

【0024】

いくつかの態様において、ＬＮＰは、主にカチオン性脂質と共に他の脂質成分からなる。これらは、典型的には、これらに限定されないが、ホスファチジルコリン（ＰＣ）クラス（例として、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、および１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ステロール（例として、コレステロール）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質抱合体（例として、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［フォレート（ポリエチレングリコール）－２０００（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）および１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００（Ｃ１４－ＰＥＧ２０００）に属する他の脂質分子を包含する。表１は、を２つのＬＮＰ、ＴＴ３－ＬＮＰおよびＤＯＴＡＰ－ＬＮＰの製剤を示す。

【表1】

【0025】

脂質ナノ粒子の粒子サイズは、薬物の放出速度、体内分布、粘膜付着、水の細胞への取り込みおよびナノ粒子の内部へのバッファーの交換、ならびにタンパク質拡散に影響し得る。いくつかの態様において、ＬＮＰの直径は、３０～１５０ｎｍの範囲をとる。いくつかの態様において、ＬＮＰの直径は、１００～１２０ｎｍの範囲をとる。いくつかの態様において、ＬＮＰの直径は、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１０１ｎｍ、１０２ｎｍ、１０３ｎｍ、１０４ｎｍ、１０５ｎｍ、１０６ｎｍ、１０７ｎｍ、１０８ｎｍ、１０９ｎｍ、１１０ｎｍ、１１１ｎｍ、１１２ｎｍ、１１３ｎｍ、１１４ｎｍ、１１５ｎｍ、１１６ｎｍ、１１７ｎｍ、１１８ｎｍ、１１９ｎｍ、または１２０ｎｍであり得る。

【0026】

ゼータ電位は、脂質ナノ粒子の表面上の有効な電荷の尺度である。ゼータ電位の大きさは、粒子の安定性についての情報を提供する。いくつかの態様において、ＬＮＰのゼータ電位は、－１０ミリボルト（ｍｖ）～２５ｍｖの範囲をとる。いくつかの態様において、ＬＮＰのゼータ電位は、３～６ｍｖの範囲をとる。いくつかの態様において、ＬＮＰのゼータ電位は、３ｍｖ、３．１ｍｖ、３．２ｍｖ、３．３ｍｖ、３．４ｍｖ、３．５ｍｖ、３．６ｍｖ、３．７ｍｖ、３．８ｍｖ、３．９ｍｖ、４ｍｖ、４．１ｍｖ、４．２ｍｖ、４．３ｍｖ、４．４ｍｖ、４．５ｍｖ、４．６ｍｖ、４．７ｍｖ、４．８ｍｖ、４．９ｍｖ、５ｍｖ、５．１ｍｖ、５．２ｍｖ、５．３ｍｖ、５．４ｍｖ、５．５ｍｖ、５．６ｍｖ、５．７ｍｖ、５．８ｍｖ、５．９ｍｖ、および６ｍｖであり得る。

【0027】

本開示は、少なくとも一部において、レプリコンＲＮＡを脂質ナノ粒子でカプセル封入することに関する。いくつかの態様において、ＬＮＰとレプリコンＲＮＡの間の質量比は、１：２～２：１の範囲をとる。いくつかの態様において、ＬＮＰとレプリコンＲＮＡの間の質量比は、１：２、１：１．５、１：１．２、１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１および２：１であり得る。いくつかの態様において、ＬＮＰとレプリコンＲＮＡの間の質量比は、１：１であり得る。

【0028】

（ｉｉ）自己増幅レプリコンＲＮＡ
本開示において、ウイルス複製のために必要とされる構造タンパク質の代わりである、サブゲノムのプロモーター下のＩＬ－１２分子をコードする自己増幅レプリコンＲＮＡは、がん免疫治療における実質的な目的である。本明細書に使用されるとき、用語「自己増幅レプリコンＲＮＡ」は、１つの複製起点から複製するＲＮＡを含む自己増幅遺伝要素を指す。用語「レプリコンＲＮＡ」および「自己増幅レプリコンＲＮＡ」は、本明細書において互換的に使用される。いくつかの態様において、自己増幅レプリコンＲＮＡは、ウイルスのレプリコンである。

【0029】

ウイルスは、生きている宿主細胞（例として、原核生物のおよび真核細胞）の内部でのみ複製することのできる小さな病原体である。生細胞の外側では、ウイルスは、ＤＮＡまたはＲＮＡ（後者は、一本鎖または二本鎖であり得る）の形態における遺伝材料を含む、独立した粒子（例として、ウイルスの粒子またはビリオン）として存在する。ＤＮＡを有するウイルスは、ＤＮＡウイルスと称され、およびＲＮＡを有するウイルスは、ＲＮＡウイルスと称される。いくつかのケースにおいて、ウイルスは、核酸関連タンパク質を含み、およびウイルスと核酸関連タンパク質との組み合わせは、ヌクレオタンパク質と称される。遺伝材料に加えて、ウイルスは、カプシドとしてもまた知られている、感染の間、生きている宿主細胞の受容体へのウイルスの付着を促進し酵素分解からウイルスの遺伝材料を保護する、単一または二重のタンパク質コートを有する。ヌクレオタンパク質とカプシドとの組み合わせは、ヌクレオカプシドと称される。いくつかのケースにおいて、ウイルスは、ウイルスにコードされた、グリコシル化された（トランス－）膜関連タンパク質が点在する、脂質二重層のエンベロープを有する。ウイルスは、いったん生きている宿主細胞に感染すると、ウイルスは、その複製、およびその後の増殖のための仕組みを供給することを生きている宿主細胞に依存する。ウイルスのゲノムは、いくつかの構造タンパク質および非構造調節性タンパク質についてコードする。

【0030】

本明細書に使用されるとき、用語「サブゲノム」または「サブゲノムの」は、全レプリコンゲノムのより小さな切片を指す。結果的に、本明細書に使用されるとき、サブゲノムの転写は、レプリコンゲノムを構成するすべての遺伝子ではなく、レプリコンゲノム中の１以上の遺伝子の転写を指す。一態様において、サブゲノムの転写は、本明細書の他に記載されている、実験的または治療的な目的の遺伝子の転写を指す。
本明細書におけるウイルスの文脈において使用されるような用語「構造タンパク質」は、成熟し、構築されたウイルス粒子またはビリオンの構造上の構成要素を構成するタンパク質を指す。このような構造タンパク質の非限定例は、ヌクレオカプシドコアタンパク質（例として、ｇａｇタンパク質）、ウイルス粒子内にパッケージングされた酵素（例として、ｐｏｌタンパク質）、および膜構成要素（例として、ｅｎｖタンパク質）を包含する。対照的に、本明細書におけるウイルスの文脈において使用されるような用語「非構造タンパク質」は、ウイルス粒子またはビリオンの構造上の構成要素を構成しないが、宿主細胞内で発現されるタンパク質を指す。非構造タンパク質の役割のいくつかは、これらに限定されないが、レプリコン形成、免疫調節、および構造タンパク質遺伝子のトランス活性化を包含する。

【0031】

いくつかの態様において、自己増幅レプリコンＲＮＡは、アルファウイルスに由来する。宿主ｍＲＮＡとは性質が異なり、アルファウイルスレプリコンＲＮＡは、ゲノム複製と、ＩＬ－１２分子などの非ウイルス産物をコードする遺伝子を包含するよう改変されたときは、サブゲノムのプロモーター下でこのような非ウイルス産物の転写を提供することの両方を担当する、４つの非構造タンパク質（ｎｓＰｓ１～４）の一式をコードする。アルファウイルスは、グループＩＶトガウイルス科ファミリーのウイルスの一部であり、陽方向の、一本鎖ＲＮＡゲノムを所有し、および正二十面体のヌクレオカプシドによって特徴付けられる。他のグループＩＶウイルスの非限定例は、アストロウイルス科、カリシウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、ピコルナウイルス科、アルテリウイルス科、およびトガウイルス科であり得る。アルファウイルス属は、真核生物に感染する２６のエンベロープウイルスを包含する。アルファウイルスは、広い宿主の範囲を有し、および蚊および吸血性の節足動物によって送り届けられる。

【0032】

アルファウイルスの非限定例は、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥ）、エバーグレーズウイルス（Everglades virus）（ＥＶＥ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦ）、ミデルブルグウイルス（Middelburg virus）（ＭＩＤ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮ）、ロスリバーウイルス（ＲＲ）、バーマフォレストウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（Sagiyama virus）（ＳＡＧ）、ベバルウイルス（ＢＥＢ）、マヤロウイルス（ＭＡＹ）、ウナウイルス（ＵＮＡ）、アウラウイルス（ＡＵＲＡ）、ババンキウイルス（Babanki virus）（ＢＡＢ）、ハイランズＪウイルス（ＨＪ）、およびフォートモーガンウイルス（Fort Morgan virus）（ＦＭ）を包含する。

【0033】

本開示中、少なくとも一部において、アルファウイルスレプリコンは、ＶＥＥアルファウイルスレプリコンである。ＶＥＥウイルスは、主にウマ科の種においてＶＥＥまたは脳脊髄炎を引き起こす蚊によって典型的に運ばれる、ウイルス病原体である。しかしながら、ヒトもまた、ＶＥＥにかかる可能性があり、および免疫系の弱まった人々は、ＶＥＥに感染した場合に、とくに重度の合併症をゆするリスクにある。ＶＥＥのビリオンは、球状であり、および外表面の周囲に広がった糖タンパク質の表面タンパク質を伴う脂質膜を所有する。典型的には、ＶＥＥは、５’末端キャップおよび３’末端ポリ（Ａ）トラクトを除いておよそ１１．４５ｋｂのゲノムを有し、４つの非構造タンパク質（ｎｓＰｓ）および５つの構造タンパク質を含む。非構造タンパク質は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４を包含し、一方で構造領域は、タンパク質Ｃ、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、およびＥ１をコードする。いくつかの場合において、自己増幅レプリコンＲＮＡは、ＶＥＥに由来するＷＴレプリコンＲＮＡである。ＶＥＥウイルスＷＴレプリコンＲＮＡの配列は、配列番号１で表される：
ATGGGCGGCGCATGAGAGAAGCCCAGACCAATTACCTACCCAAAATGGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAAGTGCGCCCGCCCGCAGAATGTATTCTAAGCACAAGTATCATTGTATCTGTCCGATGAGATGTGCGGAAGATCCGGACAGATTGTATAAGTATGCAACTAAGCTGAAGAAAAACTGTAAGGAAATAACTGATAAGGAATTGGACAAGAAAATGAAGGAGCTGGCCGCCGTCATGAGCGACCCTGACCTGGAAACTGAGACTATGTGCCTCCACGACGACGAGTCGTGTCGCTACGAAGGGCAAGTCGCTGTTTACCAGGATGTATACGCGGTTGACGGACCGACAAGTCTCTATCACCAAGCCAATAAGGGAGTTAGAGTCGCCTACTGGATAGGCTTTGACACCACCCCTTTTATGTTTAAGAACTTGGCTGGAGCATATCCATCATACTCTACCAACTGGGCCGACGAAACCGTGTTAACGGCTCGTAACATAGGCCTATGCAGCTCTGACGTTATGGAGCGGTCACGTAGAGGGATGTCCATTCTTAGAAAGAAGTATTTGAAACCATCCAACAATGTTCTATTCTCTGTTGGCTCGACCATCTACCACGAGAAGAGGGACTTACTGAGGAGCTGGCACCTGCCGTCTGTATTTCACTTACGTGGCAAGCAAAATTACACATGTCGGTGTGAGACTATAGTTAGTTGCGACGGGTACGTCGTTAAAAGAATAGCTATCAGTCCAGGCCTGTATGGGAAGCCTTCAGGCTATGCTGCTACGATGCACCGCGAGGGATTCTTGTGCTGCAAAGTGACAGACACATTGAACGGGGAGAGGGTCTCTTTTCCCGTGTGCACGTATGTGCCAGCTACATTGTGTGACCAAATGACTGGCATACTGGCAACAGATGTCAGTGCGGACGACGCGCAAAAACTGCTGGTTGGGCTCAACCAGCGTATAGTCGTCAACGGTCGCACCCAGAGAAACACCAATACCATGAAAAATTACCTTTTGCCCGTAGTGGCCCAGGCATTTGCTAGGTGGGCAAAGGAATATAAGGAAGATCAAGAAGATGAAAGGCCACTAGGACTACGAGATAGACAGTTAGTCATGGGGTGTTGTTGGGCTTTTAGAAGGCACAAGATAACATCTATTTATAAGCGCCCGGATACCCAAACCATCATCAAAGTGAACAGCGATTTCCACTCATTCGTGCTGCCCAGGATAGGCAGTAACACATTGGAGATCGGGCTGAGAACAAGAATCAGGAAAATGTTAGAGGAGCACAAGGAGCCGTCACCTCTCATTACCGCCGAGGACGTACAAGAAGCTAAGTGCGCAGCCGATGAGGCTAAGGAGGTGCGTGAAGCCGAGGAGTTGCGCGCAGCTCTACCACCTTTGGCAGCTGATGTTGAGGAGCCCACTCTGGAGGCAGACGTCGACTTGATGTTACAAGAGGCTGGGGCCGGCTCAGTGGAGACACCTCGTGGCTTGATAAAGGTTACCAGCTACGATGGCGAGGACAAGATCGGCTCTTACGCTGTGCTTTCTCCGCAGGCTGTACTCAAGAGTGAAAAATTATCTTGCATCCACCCTCTCGCTGAACAAGTCATAGTGATAACACACTCTGGCCGAAAAGGGCGTTATGCCGTGGAACCATACCATGGTAAAGTAGTGGTGCCAGAGGGACATGCAATACCCGTCCAGGACTTTCAAGCTCTGAGTGAAAGTGCCACCATTGTGTACAACGAACGTGAGTTCGTAAACAGGTACCTGCACCATATTGCCACACATGGAGGAGCGCTGAACACTGATGAAGAATATTACAAAACTGTCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAATACCTGTACGACATCGACAGGAAACAGTGCGTCAAGAAAGAACTAGTCACTGGGCTAGGGCTCACAGGCGAGCTGGTGGATCCTCCCTTCCATGAATTCGCCTACGAGAGTCTGAGAACACGACCAGCCGCTCCTTACCAAGTACCAACCATAGGGGTGTATGGCGTGCCAGGATCAGGCAAGTCTGGCATCATTAAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCCAAGAAAGAAAACTGTGCAGAAATTATAAGGGACGTCAAGAAAATGAAAGGGCTGGACGTCAATGCCAGAACTGTGGACTCAGTGCTCTTGAATGGATGCAAACACCCCGTAGAGACCCTGTATATTGACGAAGCTTTTGCTTGTCATGCAGGTACTCTCAGAGCGCTCATAGCCATTATAAGACCTAAAAAGGCAGTGCTCTGCGGGGATCCCAAACAGTGCGGTTTTTTTAACATGATGTGCCTGAAAGTGCATTTTAACCACGAGATTTGCACACAAGTCTTCCACAAAAGCATCTCTCGCCGTTGCACTAAATCTGTGACTTCGGTCGTCTCAACCTTGTTTTACGACAAAAAAATGAGAACGACGAATCCGAAAGAGACTAAGATTGTGATTGACACTACCGGCAGTACCAAACCTAAGCAGGACGATCTCATTCTCACTTGTTTCAGAGGGTGGGTGAAGCAGTTGCAAATAGATTACAAAGGCAACGAAATAATGACGGCAGCTGCCTCTCAAGGGCTGACCCGTAAAGGTGTGTATGCCGTTCGGTACAAGGTGAATGAAAATCCTCTGTACGCACCCACCTCAGAACATGTGAACGTCCTACTGACCCGCACGGAGGACCGCATCGTGTGGAAAACACTAGCCGGCGACCCATGGATAAAAACACTGACTGCCAAGTACCCTGGGAATTTCACTGCCACGATAGAGGAGTGGCAAGCAGAGCATGATGCCATCATGAGGCACATCTTGGAGAGACCGGACCCTACCGACGTCTTCCAGAATAAGGCAAACGTGTGTTGGGCCAAGGCTTTAGTGCCGGTGCTGAAGACCGCTGGCATAGACATGACCACTGAACAATGGAACACTGTGGATTATTTTGAAACGGACAAAGCTCACTCAGCAGAGATAGTATTGAACCAACTATGCGTGAGGTTCTTTGGACTCGATCTGGACTCCGGTCTATTTTCTGCACCCACTGTTCCGTTATCCATTAGGAATAATCACTGGGATAACTCCCCGTCGCCTAACATGTACGGGCTGAATAAAGAAGTGGTCCGTCAGCTCTCTCGCAGGTACCCACAACTGCCTCGGGCAGTTGCCACTGGAAGAGTCTATGACATGAACACTGGTACACTGCGCAATTATGATCCGCGCATAAACCTAGTACCTGTAAACAGAAGACTGCCTCATGCTTTAGTCCTCCACCATAATGAACACCCACAGAGTGACTTTTCTTCATTCGTCAGCAAATTGAAGGGCAGAACTGTCCTGGTGGTCGGGGAAAAGTTGTCCGTCCCAGGCAAAATGGTTGACTGGTTGTCAGACCGGCCTGAGGCTACCTTCAGAGCTCGGCTGGATTTAGGCATCCCAGGTGATGTGCCCAAATATGACATAATATTTGTTAATGTGAGGACCCCATATAAATACCATCACTATCAGCAGTGTGAAGACCATGCCATTAAGCTTAGCATGTTGACCAAGAAAGCTTGTCTGCATCTGAATCCCGGCGGAACCTGTGTCAGCATAGGTTATGGTTACGCTGACAGGGCCAGCGAAAGCATCATTGGTGCTATAGCGCGGCAGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAACCGAAATCCTCACTTGAAGAGACGGAAGTTCTGTTTGTATTCATTGGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATTCTTACAAGCTTTCATCAACCTTGACCAACATTTATACAGGTTCCAGACTCCACGAAGCCGGATGTGCACCCTCATATCATGTGGTGCGAGGGGATATTGCCACGGCCACCGAAGGAGTGATTATAAATGCTGCTAACAGCAAAGGACAACCTGGCGGAGGGGTGTGCGGAGCGCTGTATAAGAAATTCCCGGAAAGCTTCGATTTACAGCCGATCGAAGTAGGAAAAGCGCGACTGGTCAAAGGTGCAGCTAAACATATCATTCATGCCGTAGGACCAAACTTCAACAAAGTTTCGGAGGTTGAAGGTGACAAACAGTTGGCAGAGGCTTATGAGTCCATCGCTAAGATTGTCAACGATAACAATTACAAGTCAGTAGCGATTCCACTGTTGTCCACCGGCATCTTTTCCGGGAACAAAGATCGACTAACCCAATCATTGAACCATTTGCTGACAGCTTTAGACACCACTGATGCAGATGTAGCCATATACTGCAGGGACAAGAAATGGGAAATGACTCTCAAGGAAGCAGTGGCTAGGAGAGAAGCAGTGGAGGAGATATGCATATCCGACGACTCTTCAGTGACAGAACCTGATGCAGAGCTGGTGAGGGTGCATCCGAAGAGTTCTTTGGCTGGAAGGAAGGGCTACAGCACAAGCGATGGCAAAACTTTCTCATATTTGGAAGGGACCAAGTTTCACCAGGCGGCCAAGGATATAGCAGAAATTAATGCCATGTGGCCCGTTGCAACGGAGGCCAATGAGCAGGTATGCATGTATATCCTCGGAGAAAGCATGAGCAGTATTAGGTCGAAATGCCCCGTCGAAGAGTCGGAAGCCTCCACACCACCTAGCACGCTGCCTTGCTTGTGCATCCATGCCATGACTCCAGAAAGAGTACAGCGCCTAAAAGCCTCACGTCCAGAACAAATTACTGTGTGCTCATCCTTTCCATTGCCGAAGTATAGAATCACTGGTGTGCAGAAGATCCAATGCTCCCAGCCTATATTGTTCTCACCGAAAGTGCCTGCGTATATTCATCCAAGGAAGTATCTCGTGGAAACACCACCGGTAGACGAGACTCCGGAGCCATCGGCAGAGAACCAATCCACAGAGGGGACACCTGAACAACCACCACTTATAACCGAGGATGAGACCAGGACTAGAACGCCTGAGCCGATCATCATCGAAGAGGAAGAAGAGGATAGCATAAGTTTGCTGTCAGATGGCCCGACCCACCAGGTGCTGCAAGTCGAGGCAGACATTCACGGGCCGCCCTCTGTATCTAGCTCATCCTGGTCCATTCCTCATGCATCCGACTTTGATGTGGACAGTTTATCCATACTTGACACCCTGGAGGGAGCTAGCGTGACCAGCGGGGCAACGTCAGCCGAGACTAACTCTTACTTCGCAAAGAGTATGGAGTTTCTGGCGCGACCGGTGCCTGCGCCTCGAACAGTATTCAGGAACCCTCCACATCCCGCTCCGCGCACAAGAACACCGTCACTTGCACCCAGCAGGGCCTGCTCGAGAACCAGCCTAGTTTCCACCCCGCCAGGCGTGAATAGGGTGATCACTAGAGAGGAGCTCGAGGCGCTTACCCCGTCACGCACTCCTAGCAGGTCGGTCTCGAGAACCAGCCTGGTCTCCAACCCGCCAGGCGTAAATAGGGTGATTACAAGAGAGGAGTTTGAGGCGTTCGTAGCACAACAACAATGACGGTTTGATGCGGGTGCATACATCTTTTCCTCCGACACCGGTCAAGGGCATTTACAACAAAAATCAGTAAGGCAAACGGTGCTATCCGAAGTGGTGTTGGAGAGGACCGAATTGGAGATTTCGTATGCCCCGCGCCTCGACCAAGAAAAAGAAGAATTACTACGCAAGAAATTACAGTTAAATCCCACACCTGCTAACAGAAGCAGATACCAGTCCAGGAAGGTGGAGAACATGAAAGCCATAACAGCTAGACGTATTCTGCAAGGCCTAGGGCATTATTTGAAGGCAGAAGGAAAAGTGGAGTGCTACCGAACCCTGCATCCTGTTCCTTTGTATTCATCTAGTGTGAACCGTGCCTTTTCAAGCCCCAAGGTCGCAGTGGAAGCCTGTAACGCCATGTTGAAAGAGAACTTTCCGACTGTGGCTTCTTACTGTATTATTCCAGAGTACGATGCCTATTTGGACATGGTTGACGGAGCTTCATGCTGCTTAGACACTGCCAGTTTTTGCCCTGCAAAGCTGCGCAGCTTTCCAAAGAAACACTCCTATTTGGAACCCACAATACGATCGGCAGTGCCTTCAGCGATCCAGAACACGCTCCAGAACGTCCTGGCAGCTGCCACAAAAAGAAATTGCAATGTCACGCAAATGAGAGAATTGCCCGTATTGGATTCGGCGGCCTTTAATGTGGAATGCTTCAAGAAATATGCGTGTAATAATGAATATTGGGAAACGTTTAAAGAAAACCCCATCAGGCTTACTGAAGAAAACGTGGTAAATTACATTACCAAATTAAAAGGACCAAAAGCTGCTGCTCTTTTTGCGAAGACACATAATTTGAATATGTTGCAGGACATACCAATGGACAGGTTTGTAATGGACTTAAAGAGAGACGTGAAAGTGACTCCAGGAACAAAACATACTGAAGAACGGCCCAAGGTACAGGTGATCCAGGCTGCCGATCCGCTAGCAACAGCGTATCTGTGCGGAATCCACCGAGAGCTGGTTAGGAGATTAAATGCGGTCCTGCTTCCGAACATTCATACACTGTTTGATATGTCGGCTGAAGACTTTGACGCTATTATAGCCGAGCACTTCCAGCCTGGGGATTGTGTTCTGGAAACTGACATCGCGTCGTTTGATAAAAGTGAGGACGACGCCATGGCTCTGACCGCGTTAATGATTCTGGAAGACTTAGGTGTGGACGCAGAGCTGTTGACGCTGATTGAGGCGGCTTTCGGCGAAATTTCATCAATACATTTGCCCACTAAAACTAAATTTAAATTCGGAGCCATGATGAAATCTGGAATGTTCCTCACACTGTTTGTGAACACAGTCATTAACATTGTAATCGCAAGCAGAGTGTTGAGAGAACGGCTAACCGGATCACCATGTGCAGCATTCATTGGAGATGACAATATCGTGAAAGGAGTCAAATCGGACAAATTAATGGCAGACAGGTGCGCCACCTGGTTGAATATGGAAGTCAAGATTATAGATGCTGTGGTGGGCGAGAAAGCGCCTTATTTCTGTGGAGGGTTTATTTTGTGTGACTCCGTGACCGGCACAGCGTGCCGTGTGGCAGACCCCCTAAAAAGGCTGTTTAAGCTTGGCAAACCTCTGGCAGCAGACGATGAACATGATGATGACAGGAGAAGGGCATTGCATGAAGAGTCAACACGCTGGAACCGAGTGGGTATTCTTTCAGAGCTGTGCAAGGCAGTAGAATCAAGGTATGAAACCGTAGGAACTTCCATCATAGTTATGGCCATGACTACTCTAGCTAGCAGTGTTAAATCATTCAGCTACCTGAGAGGGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAGTCTAGCATATGGGCGCGCCCTCAGCATCGATTGAATTGGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAGGAATTGGCAAGCTGCTTACATAGAACTCGCGGCGATTGGCATGCCGCCTTAAAATTTTTATTTTATTTTTCTTTTCTTTTCCGAATCGGATTTTGTTTTTAATATTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGCGTCGAGGGGAATTAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAAC
GCCAGCAACGCGAGCTCTAATACGACTCACTATAG（配列番号１）

【0034】

本明細書に記載のとおりの、自己増幅レプリコンＲＮＡは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上配列番号１と同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、自己増幅レプリコンＲＮＡは、少なくとも９０％配列番号１と同一である。
自己増幅ＲＮＡ（レプリコン）は、遺伝子治療のための有望で新しいプラットフォームであるが、適用は、いくつかの細胞型における発現の短い存続および低レベルのｉｎ ｖｉｖｏでの導入遺伝子発現によっていまだ制限されている。合成レプリコンＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏでの進化は、レプリコンの発現をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で変更および増強するための潜在的に強力なストラテジーを提供する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの進化の方法を使用して、突然変異は、ヒト細胞においてサブゲノムの発現を促進した、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）レプリコンのｎｓＰ２およびｎｓＰ３において同定された。

【0035】

いくつかの態様において、自己増幅レプリコンＲＮＡは、レプリコンＲＮＡが、配列番号１を含むレプリコンＲＮＡと比較して、より高いレベルでＩＬ－１２分子を発現することができるようにする突然変異を含む。いくつかの態様において、自己増幅レプリコンＲＮＡは、配列番号１のＷＴレプリコンの核酸位置３９３６および／または４７５８において少なくとも１つの点突然変異を含む。いくつかの態様において、自己増幅レプリコンＲＮＡは、以下の点突然変異の少なくとも１つを含む：配列番号１のＷＴレプリコン配列の位置３９３６でのグアニン→シトシン（Ｇ３９３６Ｃ）および配列番号１のＷＴレプリコン配列の位置４７５８でアデニン→グアニン（Ａ４７５８Ｇ）。Ｇ３９３６Ｃ突然変異は、アミノ酸残基１３０９でのグリシンからアルギニンへの変更（Ｇ１３０９Ｒ）をもたらすであろう。Ａ４７５８Ｇ突然変異は、アミノ酸残基１５８３でのセリンからグリシンへの変更（Ｓ１５８３Ｇ）をもたらすであろう。いくつかの態様において、突然変異体自己増幅レプリコンＲＮＡ（ｍｔレプリコンＲＮＡ）の配列は、配列番号２で表される（突然変異を強調した（太字、下線の文字））：

【化1-1】

【化1-2】

【化1-3】

【化1-4】

【0036】

他の態様において、自己増幅レプリコンＲＮＡは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に由来する。ＨＣＶは、グループＩＶフラビウイルス科ファミリーのウイルスの一部であり、長さ９．６～１２．３キロベースの正極性の単節型、線状、一本鎖ＲＮＡゲノムを所有する。フラビウイルスの５’末端は、メチル化されたヌクレオチドキャップを有する一方で、このファミリーの他のメンバーは、キャップされておらず、および配列内リポソーム進入部位をコードする。

【0037】

他の態様において、アルファウイルスは、ＳＦウイルスである。ＳＦウイルスは、脳炎を引き起こす蚊によって典型的に運ばれるウイルス病原体である。セムリキ森林ウイルスは、９つのタンパク質をコードするおよそ１３，０００塩基対のゲノムを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスである。ゲノムの５’側の３分の２は、ＲＮＡ合成に関係する４つの非構造タンパク質をコードし、および構造タンパク質は、３’側の３分の１でコードされる。構造タンパク質のうち、Ｃタンパク質は、宿主細胞に由来する脂質二重層に包まれた正二十面体のカプシドを構成する。ウイルスの最も外側の表面は、外殻を形成する、相互に連結した三量体で並ぶ、糖タンパク質Ｅ１およびＥ２のヘテロ二量体によってほとんど全面的に覆われる。三量体は、ヌクレオカプシドと関連するＥ２細胞質ドメインによって膜に固定されている。

【0038】

他の態様において、アルファウイルスは、ＳＩＮウイルスである。ウイルスは、蚊によって送り届けられる。ＳＩＮウイルスは、ヒトにおいてシンドビス熱引き起こし、および症状は、関節痛、発疹および不快感を包含する。シンドビスウイルスは、正二十面体のカプシドを有する包まれた粒子である。そのゲノムは、およそ１１．７ｋｂ長の一本鎖ＲＮＡである。それは、５’キャップおよび３’ポリアデニル化テールを有し、したがって宿主細胞内で直接メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として役立つ。ゲノムは、５’末端で４つの非構造タンパク質を、および３’末端でカプシドおよび２つのエンベロープタンパク質をコードする。このことは、すべてのトガウイルスの特徴である。複製は、細胞質内であり、および迅速である。ゲノムＲＮＡは、部分的に５’末端で部分的に翻訳されて、次いでゲノム複製ならびに新しいゲノムＲＮＡおよびより短いサブゲノムＲＮＡ鎖の産生に関わる、非構造タンパク質を産生する。このサブゲノム鎖は、構造タンパク質に翻訳される。ウイルスは、宿主細胞の表面で組み立てられ、および出芽を通してそれらのエンベロープを獲得する。ノンコーディングＲＮＡ要素は、シンドビスウイルスのゲノム複製のために不可欠であることが見出された。

【0039】

ウイルスのレプリコンＲＮＡは、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を介して免疫応答を刺激することができるＴＬＲｓ、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７／８、およびＴＬＲ９のサブセットは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）などの抗ウイルス性サイトカインの産生を引き起こすことによって抗ウイルス応答に関わる。ＴＬＲ３は、多くのウイルスについて複製の中間状態である二本鎖ＲＮＡに反応する。ＴＬＲ７／８は、ウイルスの一本鎖ＲＮＡを認識する一方で、ＴＬＲ９は、ウイルスのＤＮＡ内の非メチル化ＣｐＧモチーフを認識する。ウイルス認識に関わるＴＬＲは、エンドソーム膜上に発現し、およびアダプタータンパク質ＭｙＤ８８についてそれらの要件に従って分離され得る：ＴＬＲ３活性は、ＭｙＤ８８に依存しないが、ＴＬＲ７／８／９は、ＭｙＤ８８に依存する。ＴＬＲ３の活性化は、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を導く。ＩＳＧＦ３（ＳＴＡＴ１／ＳＴＡＴ２／ＩＲＦ９）複合体を通したＩ型インターフェロンのシグナル伝達は、持続したＲｉｐ３の活性化およびネクロトーシスに必要である。

【0040】

いくつかの態様において、ＬＮＰ－レプリコンＲＮＡは、腫瘍細胞において腫瘍細胞の壊死性細胞死を導く、ＴＬＲ３シグナル伝達を刺激することができる。いくつかの態様において、ＬＮＰ－レプリコンＲＮＡは、ＬＮＰによって誘導される免疫原性細胞死（ＩＣＤ）を増強し得る。いくつかの態様において、ＴＴ３－ＬＮＰ－レプリコンＲＮＡは、腫瘍細胞において相乗的に誘導されたＩＣＤによって腫瘍阻害を発揮し、および抗腫瘍免疫応答（例として、顆粒球、単球、マクロファージ、骨髄由来抑制性細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞などの免疫細胞のリクルート）を引き起こし得る。いくつかの態様において、合成腫瘍溶解性ウイルスは、ＴＴ３－ＬＮＰ－ｍｔレプリコンＲＮＡを含む。

【0041】

いくつかの態様において、レプリコンＲＮＡは、サブゲノム領域において検出可能な分子のためのコード配列を含む。いくつかの態様において、検出可能な分子は、核酸またはポリペプチドである。いくつかの態様において、ポリペプチドは、蛍光タンパク質である。蛍光タンパク質は、当該技術分野において知られており、およびフルオロフォアのサブクラスであって、それは励起の際に光を再放射する能力を有する蛍光化学化合物である。フルオロフォアは、第１の特定の波長の励起光エネルギーを吸収し、および次いで第２の、より長い特定の波長で光エネルギーを再放射するだろう。各タイプのフルオロフォアは、その化学的構造の性質および環境に応じて、異なる波長の光に反応し、および放出する。

【0042】

いくつかの態様において、蛍光タンパク質は、これらに限定されないが、ｗｔ－ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質（例として、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ｍＷａｓａｂｉ、ＴａｇＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、等々）、青色蛍光タンパク質（例として、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＴａｇＢＦＰ、等々）、青緑色蛍光タンパク質（例として、ＥＣＦＰ、ｍＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉ－Ｉｓｈｉ Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴＦＰ１（Ｔｅａｌ）、等々）、黄色蛍光タンパク質（例として、ＥＹＦＰ、Ｔｏｐａｚ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＹＰｅｔ、ＴａｇＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ｍＢａｎａｎａ、等々）、オレンジ色蛍光タンパク質（例として、Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ、Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｄＴｏｍａｔｏ、ｄＴｏｍａｔｏ－Ｔａｎｄｅｍ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ－Ｔ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔ１）、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、等々）、または赤色蛍光タンパク質（例として、ｍＲｕｂｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｄＫｅｉｍａ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ｍＰｌｕｍ、ＡＱ１４３、等々）を包含する。

【0043】

いくつかの側面において、本明細書に記載のとおり、自己増幅レプリコンＲＮＡは、サブゲノム領域内にＩＬ－１２の発現のためのコード配列を含む。ＩＬ－１２のための例示のコード配列は、配列番号３で表される：
ATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCACGATGTGCCATGTGGGAGCTGGAGAAAGACGTTTATGTTGTAGAGGTGGACTGGACTCCCGATGCCCCTGGAGAAACAGTGAACCTCACCTGTGACACGCCTGAAGAAGATGACATCACCTGGACCTCAGACCAGAGACATGGAGTCATAGGCTCTGGAAAGACCCTGACCATCACTGTCAAAGAGTTTCTAGATGCTGGCCAGTACACCTGCCACAAAGGAGGCGAGACTCTGAGCCACTCACATCTGCTGCTCCACAAGAAGGAAAATGGAATTTGGTCCACTGAAATTTTAAAAAATTTCAAAAACAAGACTTTCCTGAAGTGTGAAGCACCAAATTACTCCGGACGGTTCACGTGCTCATGGCTGGTGCAAAGAAACATGGACTTGAAGTTCAACATCAAGAGCAGTAGCAGTTCCCCTGACTCTCGGGCAGTGACATGTGGAATGGCGTCTCTGTCTGCAGAGAAGGTCACACTGGACCAAAGGGACTATGAGAAGTATTCAGTGTCCTGCCAGGAGGATGTCACCTGCCCAACTGCCGAGGAGACCCTGCCCATTGAACTGGCGTTGGAAGCACGGCAGCAGAATAAATATGAGAACTACAGCACCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCAGACCCGCCCAAGAACTTGCAGATGAAGCCTTTGAAGAACTCACAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACTCCTGGAGCACTCCCCATTCCTACTTCTCCCTCAAGTTCTTTGTTCGAATCCAGCGCAAGAAAGAAAAGATGAAGGAGACAGAGGAGGGGTGTAACCAGAAAGGTGCGTTCCTCGTAGAGAAGACATCTACCGAAGTCCAATGCAAAGGCGGGAATGTCTGCGTGCAAGCTCAGGATCGCTATTACAATTCCTCATGCAGCAAGTGGGCATGTGTTCCCTGCAGGGTCCGATCCGGAGGTTCCGGTGGTGGATCCGGAGGTGGCTCCGGCGGCGGATCCAGGGTCATTCCAGTCTCTGGACCTGCCAGGTGTCTTAGCCAGTCCCGAAACCTGCTGAAGACCACAGATGACATGGTGAAGACGGCCAGAGAAAAACTGAAACATTATTCCTGCACTGCTGAAGACATCGATCATGAAGACATCACACGGGACCAAACCAGCACATTGAAGACCTGTTTACCACTGGAACTACACAAGAACGAGAGTTGCCTGGCTACTAGAGAGACTTCTTCCACAACAAGAGGGAGCTGCCTGCCCCCACAGAAGACGTCTTTGATGATGACCCTGTGCCTTGGTAGCATCTATGAGGACTTGAAGATGTACCAGACAGAGTTCCAGGCCATCAACGCAGCACTTCAGAATCACAACCATCAGCAGATCATTCTAGACAAGGGCATGCTGGTGGCCATCGATGAGCTGATGCAGTCTCTGAATCATAATGGCGAGACTCTGCGCCAGAAACCTCCTGTGGGAGAAGCAGACCCTTACAGAGTGAAAATGAAGCTCTGCATCCTGCTTCACGCCTTCAGCACCCGCGTCGTGACCATCAACAGGGTGATGGGCTATCTGAGCTCCGCCTGA（配列番号３）

【0044】

構造的に、ＩＬ－１２は、Ｉ型サイトカインに属し、および４つのαヘリックスバンドル（α-helical bundle）構造を有する。ＩＬ－１２は、共有結合的に結びついた２つのｐ３０およびｐ４０サブユニットからなる、ヘテロ二量体タンパク質（ＩＬ－１２－ｐ７０；ＩＬ－１２－ｐ３０／ｐ４０）の形態で作用する。ヘテロ二量体形態とは逆に、ＩＬ－１２－ｐ４０／ｐ４０ホモ二量体は、主にＩＬ－１２－ｐ７０作用の拮抗的抑制剤として作用する。ＩＬ－１２は、多面的なサイトカイン、その作用は、自然免疫と適応免疫との間の相互接続を作り出す。ＩＬ－１２は、ＰＭＡ誘導ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株から分泌された因子として最初に説明された。その作用に基づくと、ＩＬ－１２は、当初は「細胞傷害性リンパ球成熟因子」および「ナチュラルキラー細胞刺激性因子」と呼ばれていた。自然免疫と適応免疫とを橋渡しすること、および強抗がん防御の自然の機構を整合させるサイトカインである、ＩＦＮ－γの産生を強力に刺激することに起因して、ＩＬ－１２は、ヒトにおける腫瘍免疫治療のための申し分のない候補と思われていた。しかしながら、臨床調査におけるＩＬ－１２の全身投与に関連する重度の副作用およびこのサイトカインの非常に狭い治療指数は、がん患者におけるこのサイトカインの使用について熱烈な興味を著しくやわらげた。

【0045】

ＩＬ－１２の発見に続いて、３つの他のメンバー（ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、およびＩＬ－３５）が、ＩＬ－１２ファミリーに加えられ、およびＴｈ１細胞の機能において重大な役割を担うことが示された。ＩＬ－１２は、ＩＬ－１２Ｒ－β１およびＩＬ－１２Ｒ－β２の２つのアミノ酸鎖から構成される受容体のリガンドである。ＩＬ－１２受容体は、ＮＫ細胞、Ｔ、およびＢリンパ球を包含する様々な免疫細胞において、構成的（例として、Ｂ細胞におけるＩＬ－１２Ｒ－β１）または誘導的（ＩＬ－１２Ｒ－β２）なやり方で発現される。リガンド結合ＩＬ－１２Ｒ－β２は、チロシンにおいてリン酸化され、そのことは、ＪＡＫ２およびＴＹＫ２の２つのキナーゼのための部位を内包することを提供する。ＳＴＡＴファミリーの転写因子の中で、ＳＴＡＴ４は、ＩＬ－１２によって引き出される細胞応答の最も特異的なメディエーターであると考えられる。

【0046】

ＩＬ－１２の作用の主な要素は、以下のとおりである：ＩＬ－１２の作用の最も強力なメディエーターであるＩＦＮ－γのＮＫおよびＴ細胞からの産生を増加すること；活性化されたＮＫ細胞であるＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の成長および細胞障害性を刺激し、Ｔｈ１表現型に向けてＣＤ４＋Ｔｈ０細胞の分化をシフトさせる；腫瘍細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増強；およびＢ細胞からのＩｇＧの誘導およびＩｇＥ産生の抑制。ヒトにおけるＩＬ－１２の主な供給源は、樹状細胞、とくにＣＤ１ｃ＋表現型のものなどの、ならびに造血食細胞（単球、マクロファージ、および好中球もまた）などの活性化された抗原提示細胞であるが、ＩＬ－１２は、他の細胞型によってもまた産生され得る。ＩＬ－１２は、様々な免疫細胞上で作用する一方で、ＩＬ－１２についての全体的な生理学的役割は、ある病原体に対するＴｈ１型免疫応答を統合することであると思われる。

【0047】

いくつかの側面において、本開示は、そのサブゲノム領域でＩＬ－１２をコードするウイルスのレプリコンＲＮＡをカプセル封入したＬＮＰによるＩＬ－１２の局所送達を説明する。ＬＮＰ－レプリコンＲＮＡによって誘導される相乗的な腫瘍細胞免疫原性細胞死（ＩＣＤ）に加えて、いくつかの態様において、腫瘍微小環境におけるＩＬ１２の発現は、さらなる免疫賦活に繋がり、および抗腫瘍免疫応答の増強をもたらし得る。いくつかの態様において、腫瘍微小環境におけるＬＮＰ－レプリコンＲＮＡ－ＩＬ－１２の組み合わせは、全身性の抗腫瘍免疫応答を誘導することができる。他の態様において、腫瘍微小環境におけるＬＮＰ－レプリコンＲＮＡ－ＩＬ－１２の組み合わせは、腫瘍細胞を根絶し、および腫瘍の再発を予防することができる。いくつかの態様において、合成腫瘍溶解性ウイルスは、ＴＴ３－ＬＮＰ－ｍｔレプリコンＲＮＡ－ＩＬ１２を含む。

【0048】

いくつかの態様において、レプリコンＲＮＡ－ＩＬ１２は、血清アルブミンのためのコード配列をさらに含む。ペプチドの半減期および生物学的環境（例として、血清、腫瘍微小環境）中のタンパク質（例として、サイトカイン）は、サイズ、電荷、タンパク質分解の感度、それらの生物学的性質、それらの結合するタンパク質の代謝回転速度、および他の因子を包含する様々な因子によって影響される。いくつかのケースにおいて、生物学的環境におけるタンパク質の半減期は、それらのサイズと大まかに相関し得る。およそ７０ｋＤａよりも小さなペプチドおよびタンパク質（例として、サイトカイン）は、腎臓濾過を介して除去され得、そのためそれらは一般に極めて短い半減期を所有する。しかしながら、より大きなタンパク質は、数日間存続するであろう。ＩｇＧ、血清アルブミン、およびトランスフェリンの３つのタイプのタンパク質は、それらのサイズによって当然に予測されるよりもはるかに長い間存続する。いくつかの態様において、血清アルブミンは、ヒト血清アルブミンである。いくつかの態様において、血清アルブミンは、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）である。

【0049】

レプリコンＲＮＡ－ＩＬ１２－ＭＳＡのための例示のコード配列は、配列番号４で表される：
ATGGGCGGCGCATGAGAGAAGCCCAGACCAATTACCTACCCAAAATGGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAAGTGCGCCCGCCCGCAGAATGTATTCTAAGCACAAGTATCATTGTATCTGTCCGATGAGATGTGCGGAAGATCCGGACAGATTGTATAAGTATGCAACTAAGCTGAAGAAAAACTGTAAGGAAATAACTGATAAGGAATTGGACAAGAAAATGAAGGAGCTGGCCGCCGTCATGAGCGACCCTGACCTGGAAACTGAGACTATGTGCCTCCACGACGACGAGTCGTGTCGCTACGAAGGGCAAGTCGCTGTTTACCAGGATGTATACGCGGTTGACGGACCGACAAGTCTCTATCACCAAGCCAATAAGGGAGTTAGAGTCGCCTACTGGATAGGCTTTGACACCACCCCTTTTATGTTTAAGAACTTGGCTGGAGCATATCCATCATACTCTACCAACTGGGCCGACGAAACCGTGTTAACGGCTCGTAACATAGGCCTATGCAGCTCTGACGTTATGGAGCGGTCACGTAGAGGGATGTCCATTCTTAGAAAGAAGTATTTGAAACCATCCAACAATGTTCTATTCTCTGTTGGCTCGACCATCTACCACGAGAAGAGGGACTTACTGAGGAGCTGGCACCTGCCGTCTGTATTTCACTTACGTGGCAAGCAAAATTACACATGTCGGTGTGAGACTATAGTTAGTTGCGACGGGTACGTCGTTAAAAGAATAGCTATCAGTCCAGGCCTGTATGGGAAGCCTTCAGGCTATGCTGCTACGATGCACCGCGAGGGATTCTTGTGCTGCAAAGTGACAGACACATTGAACGGGGAGAGGGTCTCTTTTCCCGTGTGCACGTATGTGCCAGCTACATTGTGTGACCAAATGACTGGCATACTGGCAACAGATGTCAGTGCGGACGACGCGCAAAAACTGCTGGTTGGGCTCAACCAGCGTATAGTCGTCAACGGTCGCACCCAGAGAAACACCAATACCATGAAAAATTACCTTTTGCCCGTAGTGGCCCAGGCATTTGCTAGGTGGGCAAAGGAATATAAGGAAGATCAAGAAGATGAAAGGCCACTAGGACTACGAGATAGACAGTTAGTCATGGGGTGTTGTTGGGCTTTTAGAAGGCACAAGATAACATCTATTTATAAGCGCCCGGATACCCAAACCATCATCAAAGTGAACAGCGATTTCCACTCATTCGTGCTGCCCAGGATAGGCAGTAACACATTGGAGATCGGGCTGAGAACAAGAATCAGGAAAATGTTAGAGGAGCACAAGGAGCCGTCACCTCTCATTACCGCCGAGGACGTACAAGAAGCTAAGTGCGCAGCCGATGAGGCTAAGGAGGTGCGTGAAGCCGAGGAGTTGCGCGCAGCTCTACCACCTTTGGCAGCTGATGTTGAGGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACTTGATGTTACAAGAGGCTGGGGCCGGCTCAGTGGAGACACCTCGTGGCTTGATAAAGGTTACCAGCTACGATGGCGAGGACAAGATCGGCTCTTACGCTGTGCTTTCTCCGCAGGCTGTACTCAAGAGTGAAAAATTATCTTGCATCCACCCTCTCGCTGAACAAGTCATAGTGATAACACACTCTGGCCGAAAAGGGCGTTATGCCGTGGAACCATACCATGGTAAAGTAGTGGTGCCAGAGGGACATGCAATACCCGTCCAGGACTTTCAAGCTCTGAGTGAAAGTGCCACCATTGTGTACAACGAACGTGAGTTCGTAAACAGGTACCTGCACCATATTGCCACACATGGAGGAGCGCTGAACACTGATGAAGAATATTACAAAACTGTCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAATACCTGTACGACATCGACAGGAAACAGTGCGTCAAGAAAGAACTAGTCACTGGGCTAGGGCTCACAGGCGAGCTGGTGGATCCTCCCTTCCATGAATTCGCCTACGAGAGTCTGAGAACACGACCAGCCGCTCCTTACCAAGTACCAACCATAGGGGTGTATGGCGTGCCAGGATCAGGCAAGTCTGGCATCATTAAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCCAAGAAAGAAAACTGTGCAGAAATTATAAGGGACGTCAAGAAAATGAAAGGGCTGGACGTCAATGCCAGAACTGTGGACTCAGTGCTCTTGAATGGATGCAAACACCCCGTAGAGACCCTGTATATTGACGAAGCTTTTGCTTGTCATGCAGGTACTCTCAGAGCGCTCATAGCCATTATAAGACCTAAAAAGGCAGTGCTCTGCGGGGATCCCAAACAGTGCGGTTTTTTTAACATGATGTGCCTGAAAGTGCATTTTAACCACGAGATTTGCACACAAGTCTTCCACAAAAGCATCTCTCGCCGTTGCACTAAATCTGTGACTTCGGTCGTCTCAACCTTGTTTTACGACAAAAAAATGAGAACGACGAATCCGAAAGAGACTAAGATTGTGATTGACACTACCGGCAGTACCAAACCTAAGCAGGACGATCTCATTCTCACTTGTTTCAGAGGGTGGGTGAAGCAGTTGCAAATAGATTACAAAGGCAACGAAATAATGACGGCAGCTGCCTCTCAAGGGCTGACCCGTAAAGGTGTGTATGCCGTTCGGTACAAGGTGAATGAAAATCCTCTGTACGCACCCACCTCAGAACATGTGAACGTCCTACTGACCCGCACGGAGGACCGCATCGTGTGGAAAACACTAGCCGGCGACCCATGGATAAAAACACTGACTGCCAAGTACCCTGGGAATTTCACTGCCACGATAGAGGAGTGGCAAGCAGAGCATGATGCCATCATGAGGCACATCTTGGAGAGACCGGACCCTACCGACGTCTTCCAGAATAAGGCAAACGTGTGTTGGGCCAAGGCTTTAGTGCCGGTGCTGAAGACCGCTGGCATAGACATGACCACTGAACAATGGAACACTGTGGATTATTTTGAAACGGACAAAGCTCACTCAGCAGAGATAGTATTGAACCAACTATGCGTGAGGTTCTTTGGACTCGATCTGGACTCCGGTCTATTTTCTGCACCCACTGTTCCGTTATCCATTAGGAATAATCACTGGGATAACTCCCCGTCGCCTAACATGTACGGGCTGAATAAAGAAGTGGTCCGTCAGCTCTCTCGCAGGTACCCACAACTGCCTCGGGCAGTTGCCACTGGAAGAGTCTATGACATGAACACTGGTACACTGCGCAATTATGATCCGCGCATAAACCTAGTACCTGTAAACAGAAGACTGCCTCATGCTTTAGTCCTCCACCATAATGAACACCCACAGAGTGACTTTTCTTCATTCGTCAGCAAATTGAAGGGCAGAACTGTCCTGGTGGTCGGGGAAAAGTTGTCCGTCCCAGGCAAAATGGTTGACTGGTTGTCAGACCGGCCTGAGGCTACCTTCAGAGCTCGGCTGGATTTAGGCATCCCAGGTGATGTGCCCAAATATGACATAATATTTGTTAATGTGAGGACCCCATATAAATACCATCACTATCAGCAGTGTGAAGACCATGCCATTAAGCTTAGCATGTTGACCAAGAAAGCTTGTCTGCATCTGAATCCCGGCGGAACCTGTGTCAGCATAGGTTATGGTTACGCTGACAGGGCCAGCGAAAGCATCATTGGTGCTATAGCGCGGCAGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAACCGAAATCCTCACTTGAAGAGACGGAAGTTCTGTTTGTATTCATTCGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATTCTTACAAGCTTTCATCAACCTTGACCAACATTTATACAGGTTCCAGACTCCACGAAGCCGGATGTGCACCCTCATATCATGTGGTGCGAGGGGATATTGCCACGGCCACCGAAGGAGTGATTATAAATGCTGCTAACAGCAAAGGACAACCTGGCGGAGGGGTGTGCGGAGCGCTGTATAAGAAATTCCCGGAAAGCTTCGATTTACAGCCGATCGAAGTAGGAAAAGCGCGACTGGTCAAAGGTGCAGCTAAACATATCATTCATGCCGTAGGACCAAACTTCAACAAAGTTTCGGAGGTTGAAGGTGACAAACAGTTGGCAGAGGCTTATGAGTCCATCGCTAAGATTGTCAACGATAACAATTACAAGTCAGTAGCGATTCCACTGTTGTCCACCGGCATCTTTTCCGGGAACAAAGATCGACTAACCCAATCATTGAACCATTTGCTGACAGCTTTAGACACCACTGATGCAGATGTAGCCATATACTGCAGGGACAAGAAATGGGAAATGACTCTCAAGGAAGCAGTGGCTAGGAGAGAAGCAGTGGAGGAGATATGCATATCCGACGACTCTTCAGTGACAGAACCTGATGCAGAGCTGGTGAGGGTGCATCCGAAGAGTTCTTTGGCTGGAAGGAAGGGCTACAGCACAAGCGATGGCAAAACTTTCTCATATTTGGAAGGGACCAAGTTTCACCAGGCGGCCAAGGATATAGCAGAAATTAATGCCATGTGGCCCGTTGCAACGGAGGCCAATGAGCAGGTATGCATGTATATCCTCGGAGAAGGCATGAGCAGTATTAGGTCGAAATGCCCCGTCGAAGAGTCGGAAGCCTCCACACCACCTAGCACGCTGCCTTGCTTGTGCATCCATGCCATGACTCCAGAAAGAGTACAGCGCCTAAAAGCCTCACGTCCAGAACAAATTACTGTGTGCTCATCCTTTCCATTGCCGAAGTATAGAATCACTGGTGTGCAGAAGATCCAATGCTCCCAGCCTATATTGTTCTCACCGAAAGTGCCTGCGTATATTCATCCAAGGAAGTATCTCGTGGAAACACCACCGGTAGACGAGACTCCGGAGCCATCGGCAGAGAACCAATCCACAGAGGGGACACCTGAACAACCACCACTTATAACCGAGGATGAGACCAGGACTAGAACGCCTGAGCCGATCATCATCGAAGAGGAAGAAGAGGATAGCATAAGTTTGCTGTCAGATGGCCCGACCCACCAGGTGCTGCAAGTCGAGGCAGACATTCACGGGCCGCCCTCTGTATCTAGCTCATCCTGGTCCATTCCTCATGCATCCGACTTTGATGTGGACAGTTTATCCATACTTGACACCCTGGAGGGAGCTAGCGTGACCAGCGGGGCAACGTCAGCCGAGACTAACTCTTACTTCGCAAAGAGTATGGAGTTTCTGGCGCGACCGGTGCCTGCGCCTCGAACAGTATTCAGGAACCCTCCACATCCCGCTCCGCGCACAAGAACACCGTCACTTGCACCCAGCAGGGCCTGCTCGAGAACCAGCCTAGTTTCCACCCCGCCAGGCGTGAATAGGGTGATCACTAGAGAGGAGCTCGAGGCGCTTACCCCGTCACGCACTCCTAGCAGGTCGGTCTCGAGAACCAGCCTGGTCTCCAACCCGCCAGGCGTAAATAGGGTGATTACAAGAGAGGAGTTTGAGGCGTTCGTAGCACAACAACAATGACGGTTTGATGCGGGTGCATACATCTTTTCCTCCGACACCGGTCAAGGGCATTTACAACAAAAATCAGTAAGGCAAACGGTGCTATCCGAAGTGGTGTTGGAGAGGACCGAATTGGAGATTTCGTATGCCCCGCGCCTCGACCAAGAAAAAGAAGAATTACTACGCAAGAAATTACAGTTAAATCCCACACCTGCTAACAGAAGCAGATACCAGTCCAGGAAGGTGGAGAACATGAAAGCCATAACAGCTAGACGTATTCTGCAAGGCCTAGGGCATTATTTGAAGGCAGAAGGAAAAGTGGAGTGCTACCGAACCCTGCATCCTGTTCCTTTGTATTCATCTAGTGTGAACCGTGCCTTTTCAAGCCCCAAGGTCGCAGTGGAAGCCTGTAACGCCATGTTGAAAGAGAACTTTCCGACTGTGGCTTCTTACTGTATTATTCCAGAGTACGATGCCTATTTGGACATGGTTGACGGAGCTTCATGCTGCTTAGACACTGCCAGTTTTTGCCCTGCAAAGCTGCGCAGCTTTCCAAAGAAACACTCCTATTTGGAACCCACAATACGATCGGCAGTGCCTTCAGCGATCCAGAACACGCTCCAGAACGTCCTGGCAGCTGCCACAAAAAGAAATTGCAATGTCACGCAAATGAGAGAATTGCCCGTATTGGATTCGGCGGCCTTTAATGTGGAATGCTTCAAGAAATATGCGTGTAATAATGAATATTGGGAAACGTTTAAAGAAAACCCCATCAGGCTTACTGAAGAAAACGTGGTAAATTACATTACCAAATTAAAAGGACCAAAAGCTGCTGCTCTTTTTGCGAAGACACATAATTTGAATATGTTGCAGGACATACCAATGGACAGGTTTGTAATGGACTTAAAGAGAGACGTGAAAGTGACTCCAGGAACAAAACATACTGAAGAACGGCCCAAGGTACAGGTGATCCAGGCTGCCGATCCGCTAGCAACAGCGTATCTGTGCGGAATCCACCGAGAGCTGGTTAGGAGATTAAATGCGGTCCTGCTTCCGAACATTCATACACTGTTTGATATGTCGGCTGAAGACTTTGACGCTATTATAGCCGAGCACTTCCAGCCTGGGGATTGTGTTCTGGAAACTGACATCGCGTCGTTTGATAAAAGTGAGGACGACGCCATGGCTCTGACCGCGTTAATGATTCTGGAAGACTTAGGTGTGGACGCAGAGCTGTTGACGCTGATTGAGGCGGCTTTCGGCGAAATTTCATCAATACATTTGCCCACTAAAACTAAATTTAAATTCGGAGCCATGATGAAATCTGGAATGTTCCTCACACTGTTTGTGAACACAGTCATTAACATTGTAATCGCAAGCAGAGTGTTGAGAGAACGGCTAACCGGATCACCATGTGCAGCATTCATTGGAGATGACAATATCGTGAAAGGAGTCAAATCGGACAAATTAATGGCAGACAGGTGCGCCACCTGGTTGAATATGGAAGTCAAGATTATAGATGCTGTGGTGGGCGAGAAAGCGCCTTATTTCTGTGGAGGGTTTATTTTGTGTGACTCCGTGACCGGCACAGCGTGCCGTGTGGCAGACCCCCTAAAAAGGCTGTTTAAGCTTGGCAAACCTCTGGCAGCAGACGATGAACATGATGATGACAGGAGAAGGGCATTGCATGAAGAGTCAACACGCTGGAACCGAGTGGGTATTCTTTCAGAGCTGTGCAAGGCAGTAGAATCAAGGTATGAAACCGTAGGAACTTCCATCATAGTTATGGCCATGACTACTCTAGCTAGCAGTGTTAAATCATTCAGCTACCTGAGAGGGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAGTCTAGCATATGGGCGCGCCCTCAGCATCGATTTGAATTGGCCACCATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCACGATGTGCCATGTGGGAGCTGGAGAAAGACGTTTATGTTGTAGAGGTGGACTGGACTCCCGATGCCCCTGGAGAAACAGTGAACCTCACCTGTGACACGCCTGAAGAAGATGACATCACCTGGACCTCAGACCAGAGACATGGAGTCATAGGCTCTGGAAAGACCCTGACCATCACTGTCAAAGAGTTTCTAGATGCTGGCCAGTACACCTGCCACAAAGGAGGCGAGACTCTGAGCCACTCACATCTGCTGCTCCACAAGAAGGAAAATGGAATTTGGTCCACTGAAATTTTAAAAAATTTCAAAAACAAGACTTTCCTGAAGTGTGAAGCACCAAATTACTCCGGACGGTTCACGTGCTCATGGCTGGTGCAAAGAAACATGGACTTGAAGTTCAACATCAAGAGCAGTAGCAGTTCCCCTGACTCTCGGGCAGTGACATGTGGAATGGCGTCTCTGTCTGCAGAGAAGGTCACACTGGACCAAAGGGACTATGAGAAGTATTCAGTGTCCTGCCAGGAGGATGTCACCTGCCCAACTGCCGAGGAGACCCTGCCCATTGAACTGGCGTTGGAAGCACGGCAGCAGAATAAATATGAGAACTACAGCACCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCAGACCCGCCCAAGAACTTGCAGATGAAGCCTTTGAAGAACTCACAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACTCCTGGAGCACTCCCCATTCCTACTTCTCCCTCAAGTTCTTTGTTCGAATCCAGCGCAAGAAAGAAAAGATGAAGGAGACAGAGGAGGGGTGTAACCAGAAAGGTGCGTTCCTCGTAGAGAAGACATCTACCGAAGTCCAATGCAAAGGCGGGAATGTCTGCGTGCAAGCTCAGGATCGCTATTACAATTCCTCATGCAGCAAGTGGGCATGTGTTCCCTGCAGGGTCCGATCCGGAGGTTCCGGTGGTGGATCCGGAGGTGGCTCCGGCGGCGGATCCAGGGTCATTCCAGTCTCTGGACCTGCCAGGTGTCTTAGCCAGTCCCGAAACCTGCTGAAGACCACAGATGACATGGTGAAGACGGCCAGAGAAAAACTGAAACATTATTCCTGCACTGCTGAAGACATCGATCATGAAGACATCACACGGGACCAAACCAGCACATTGAAGACCTGTTTACCACTGGAACTACACAAGAACGAGAGTTGCCTGGCTACTAGAGAGACTTCTTCCACAACAAGAGGGAGCTGCCTGCCCCCACAGAAGACGTCTTTGATGATGACCCTGTGCCTTGGTAGCATCTATGAGGACTTGAAGATGTACCAGACAGAGTTCCAGGCCATCAACGCAGCACTTCAGAATCACAACCATCAGCAGATCATTCTAGACAAGGGCATGCTGGTGGCCATCGATGAGCTGATGCAGTCTCTGAATCATAATGGCGAGACTCTGCGCCAGAAACCTCCTGTGGGAGAAGCAGACCCTTACAGAGTGAAAATGAAGCTCTGCATCCTGCTTCACGCCTTCAGCACCCGCGTCGTGACCATCAACAGGGTGATGGGCTATCTGAGCTCCGCCGGTTCCGGTGGCGGATCCGAAGCACACAAGAGTGAGATCGCCCATCGGTATAATGATTTGGGAGAACAACATTTCAAAGGCCTAGTCCTGATTGCCTTTTCCCAGTATCTCCAGAAATGCTCATACGATGAGCATGCCAAATTAGTGCAGGAAGTAACAGACTTTGCAAAGACGTGTGTTGCCGATGAGTCTGCCGCCAACTGTGACAAATCCCTTCACACTCTTTTTGGAGATAAGTTGTGTGCCATTCCAAACCTCCGTGAAAACTATGGTGAACTGGCTGACTGCTGTACAAAACAAGAGCCCGAAAGAAACGAATGTTTCCTGCAACACAAAGATGACAACCCCAGCCTGCCACCATTTGAAAGGCCAGAGGCTGAGGCCATGTGCACCTCCTTTAAGGAAAACCCAACCACCTTTATGGGACACTATTTGCATGAAGTTGCCAGAAGACATCCTTATTTCTATGCCCCAGAACTTCTTTACTATGCTGAGCAGTACAATGAGATTCTGACCCAGTGTTGTGCAGAGGCTGACAAGGAAAGCTGCCTGACCCCGAAGCTTGATGGTGTGAAGGAGAAAGCATTGGTCTCATCTGTCCGTCAGAGAATGAAGTGCTCCAGTATGCAGAAGTTTGGAGAGAGAGCTTTTAAAGCATGGGCAGTAGCTCGTCTGAGCCAGACATTCCCCAATGCTGACTTTGCAGAAATCACCAAATTGGCAACAGACCTGACCAAAGTCAACAAGGAGTGCTGCCATGGTGACCTGCTGGAATGCGCAGATGACAGGGCGGAACTTGCCAAGTACATGTGTGAAAACCAGGCGACTATCTCCAGCAAACTGCAGACTTGCTGCGATAAACCACTGTTGAAGAAAGCCCACTGTCTTAGTGAGGTGGAGCATGACACCATGCCTGCTGATCTGCCTGCCATTGCTGCTGATTTTGTTGAGGACCAGGAAGTGTGCAAGAACTATGCTGAGGCCAAGGATGTCTTCCTGGGCACGTTCT
TGTATGAATATTCAAGAAGACACCCTGATTACTCTGTATCCCTGTTGCTGAGACTTGCTAAGAAATATGAAGCCACTCTGGAAAAGTGCTGCGCTGAAGCCAATCCTCCCGCATGCTACGGCACAGTGCTTGCTGAATTTCAGCCTCTTGTAGAAGAGCCTAAGAACTTGGTCAAAACCAACTGTGATCTTTACGAGAAGCTTGGAGAATATGGATTCCAAAATGCCATTCTAGTTCGCTACACCCAGAAAGCACCTCAGGTGTCAACCCCAACTCTCGTGGAGGCTGCAAGAAACCTAGGAAGAGTGGGCACCAAGTGTTGTACACTTCCTGAAGATCAGAGACTGCCTTGTGTGGAAGACTATCTGTCTGCAATCCTGAACCGTGTGTGTCTGCTGCATGAGAAGACCCCAGTGAGTGAGCATGTTACCAAGTGCTGTAGTGGATCCCTGGTGGAAAGGCGGCCATGCTTCTCTGCTCTGACAGTTGATGAAACATATGTCCCCAAAGAGTTTAAAGCTGAGACCTTCACCTTCCACTCTGATATCTGCACACTTCCAGAGAAGGAGAAGCAGATTAAGAAACAAACGGCTCTTGCTGAGCTGGTGAAGCACAAGCCCAAGGCTACAGCGGAGCAACTGAAGACTGTCATGGATGACTTTGCACAGTTCCTGGATACATGTTGCAAGGCTGCTGACAAGGACACCTGCTTCTCGACTGAGGGTCCAAACCTTGTCACTAGATGCAAAGACGCCTTAGCCTGAGCGATCGCTAAATACAGCAGCAATTGGCAAGCTGCTTACATAGAACTCGCGGCGATTGGCATGCCGCCTTAAAATTTTTATTTTATTTTTCTTTTCTTTTCCGAATCGGATTTTGTTTTTAATATTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGCGTCGAGGGGAATTAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGAGCTCTAATACGACTCACTATAG（配列番号４）

【0050】

いくつかの態様において、レプリコンＲＮＡ－ＩＬ－１２は、血清アルブミンコード配列と融合している。いくつかの態様において、ＩＬ－１２－アルブミン融合分子は、腫瘍微小環境においてより長い半減期を有する。いくつかの態様において、ＩＬ－１２－アルブミン融合タンパク質は、腫瘍微小環境において少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、またはそれより長い間存続し得る。
いくつかの態様において、合成腫瘍溶解性ウイルスは、ＬＮＰ－レプリコンＲＮＡ－ＩＬ－１２－血清アルブミンを含む。他の態様において、合成腫瘍溶解性ウイルスは、ＴＴ３－ＬＮＰ－レプリコンＲＮＡ－ＩＬ－１２－血清アルブミンを含む。他の態様において、合成腫瘍溶解性ウイルスは、ＴＴ３－ＬＮＰ－ｍｔレプリコンＲＮＡ－ＩＬ－１２－血清アルブミンを含む。腫瘍微小環境におけるＩＬ－１２の持続した存在は、合成腫瘍溶解性ウイルスによって発揮される抗腫瘍免疫応答を延長するであろう。

【0051】

いくつかの態様において、レプリコンＲＮＡ－ＩＬ１２－血清アルブミンは、ルミカンのためのコード配列をさらに含む。ルミカンは、皮膚、角膜実質、強膜、大動脈、筋肉、肺、腎臓、骨、軟骨および椎間板の間質性細胞外マトリックス（ＥＣＭ）における主要な細胞外タンパク質の１つである。それは、シグナルペプチド、負に帯電したＮ末端ドメイン、高度に保存されたロイシンリッチ内部ドメインおよびカルボキシル末端ドメインを含む、３０～５０ｋＤａのコアタンパク質を有する、小ロイシンリッチプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）のファミリーの一員である。ルミカンのタンパク質のコアおよびグリカン鎖は、サイトカイン、成長因子および細胞表面受容体を包含する、様々な細胞のエフェクターと相互作用し、細胞接着、増殖および遊走を調節し得る。内在性のコラーゲン結合タンパク質として、腫瘍微小環境におけるルミカンの存在は、本明細書に記載されるとおり、ＩＬ－１２の局所での保持を促進し、腫瘍免疫治療の有効性および安全性を増強するだろう。いくつかの態様において、レプリコンＲＮＡ－ＩＬ－１２－ＭＳＡは、ルミカンのためのコード配列を含む。他の態様において、ｍｔレプリコンＲＮＡ－ＩＬ－１２－ＭＳＡ（ｍｔＲｅｐ－ＩＬ１２－ＭＳＡ）は、ルミカンのためのコード配列を含む。

【0052】

ｍｔレプリコンＲＮＡ－ＩＬ－１２－ＭＳＡ－ルミカン（ｍｔＲｅｐ－ＩＬ１２－ＭＳＡ－ルミカン）のための例示のコード配列は、配列番号５で表される：
ATGGGCGGCGCATGAGAGAAGCCCAGACCAATTACCTACCCAAAATGGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAAGTGCGCCCGCCCGCAGAATGTATTCTAAGCACAAGTATCATTGTATCTGTCCGATGAGATGTGCGGAAGATCCGGACAGATTGTATAAGTATGCAACTAAGCTGAAGAAAAACTGTAAGGAAATAACTGATAAGGAATTGGACAAGAAAATGAAGGAGCTGGCCGCCGTCATGAGCGACCCTGACCTGGAAACTGAGACTATGTGCCTCCACGACGACGAGTCGTGTCGCTACGAAGGGCAAGTCGCTGTTTACCAGGATGTATACGCGGTTGACGGACCGACAAGTCTCTATCACCAAGCCAATAAGGGAGTTAGAGTCGCCTACTGGATAGGCTTTGACACCACCCCTTTTATGTTTAAGAACTTGGCTGGAGCATATCCATCATACTCTACCAACTGGGCCGACGAAACCGTGTTAACGGCTCGTAACATAGGCCTATGCAGCTCTGACGTTATGGAGCGGTCACGTAGAGGGATGTCCATTCTTAGAAAGAAGTATTTGAAACCATCCAACAATGTTCTATTCTCTGTTGGCTCGACCATCTACCACGAGAAGAGGGACTTACTGAGGAGCTGGCACCTGCCGTCTGTATTTCACTTACGTGGCAAGCAAAATTACACATGTCGGTGTGAGACTATAGTTAGTTGCGACGGGTACGTCGTTAAAAGAATAGCTATCAGTCCAGGCCTGTATGGGAAGCCTTCAGGCTATGCTGCTACGATGCACCGCGAGGGATTCTTGTGCTGCAAAGTGACAGACACATTGAACGGGGAGAGGGTCTCTTTTCCCGTGTGCACGTATGTGCCAGCTACATTGTGTGACCAAATGACTGGCATACTGGCAACAGATGTCAGTGCGGACGACGCGCAAAAACTGCTGGTTGGGCTCAACCAGCGTATAGTCGTCAACGGTCGCACCCAGAGAAACACCAATACCATGAAAAATTACCTTTTGCCCGTAGTGGCCCAGGCATTTGCTAGGTGGGCAAAGGAATATAAGGAAGATCAAGAAGATGAAAGGCCACTAGGACTACGAGATAGACAGTTAGTCATGGGGTGTTGTTGGGCTTTTAGAAGGCACAAGATAACATCTATTTATAAGCGCCCGGATACCCAAACCATCATCAAAGTGAACAGCGATTTCCACTCATTCGTGCTGCCCAGGATAGGCAGTAACACATTGGAGATCGGGCTGAGAACAAGAATCAGGAAAATGTTAGAGGAGCACAAGGAGCCGTCACCTCTCATTACCGCCGAGGACGTACAAGAAGCTAAGTGCGCAGCCGATGAGGCTAAGGAGGTGCGTGAAGCCGAGGAGTTGCGCGCAGCTCTACCACCTTTGGCAGCTGATGTTGAGGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACTTGATGTTACAAGAGGCTGGGGCCGGCTCAGTGGAGACACCTCGTGGCTTGATAAAGGTTACCAGCTACGATGGCGAGGACAAGATCGGCTCTTACGCTGTGCTTTCTCCGCAGGCTGTACTCAAGAGTGAAAAATTATCTTGCATCCACCCTCTCGCTGAACAAGTCATAGTGATAACACACTCTGGCCGAAAAGGGCGTTATGCCGTGGAACCATACCATGGTAAAGTAGTGGTGCCAGAGGGACATGCAATACCCGTCCAGGACTTTCAAGCTCTGAGTGAAAGTGCCACCATTGTGTACAACGAACGTGAGTTCGTAAACAGGTACCTGCACCATATTGCCACACATGGAGGAGCGCTGAACACTGATGAAGAATATTACAAAACTGTCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAATACCTGTACGACATCGACAGGAAACAGTGCGTCAAGAAAGAACTAGTCACTGGGCTAGGGCTCACAGGCGAGCTGGTGGATCCTCCCTTCCATGAATTCGCCTACGAGAGTCTGAGAACACGACCAGCCGCTCCTTACCAAGTACCAACCATAGGGGTGTATGGCGTGCCAGGATCAGGCAAGTCTGGCATCATTAAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCCAAGAAAGAAAACTGTGCAGAAATTATAAGGGACGTCAAGAAAATGAAAGGGCTGGACGTCAATGCCAGAACTGTGGACTCAGTGCTCTTGAATGGATGCAAACACCCCGTAGAGACCCTGTATATTGACGAAGCTTTTGCTTGTCATGCAGGTACTCTCAGAGCGCTCATAGCCATTATAAGACCTAAAAAGGCAGTGCTCTGCGGGGATCCCAAACAGTGCGGTTTTTTTAACATGATGTGCCTGAAAGTGCATTTTAACCACGAGATTTGCACACAAGTCTTCCACAAAAGCATCTCTCGCCGTTGCACTAAATCTGTGACTTCGGTCGTCTCAACCTTGTTTTACGACAAAAAAATGAGAACGACGAATCCGAAAGAGACTAAGATTGTGATTGACACTACCGGCAGTACCAAACCTAAGCAGGACGATCTCATTCTCACTTGTTTCAGAGGGTGGGTGAAGCAGTTGCAAATAGATTACAAAGGCAACGAAATAATGACGGCAGCTGCCTCTCAAGGGCTGACCCGTAAAGGTGTGTATGCCGTTCGGTACAAGGTGAATGAAAATCCTCTGTACGCACCCACCTCAGAACATGTGAACGTCCTACTGACCCGCACGGAGGACCGCATCGTGTGGAAAACACTAGCCGGCGACCCATGGATAAAAACACTGACTGCCAAGTACCCTGGGAATTTCACTGCCACGATAGAGGAGTGGCAAGCAGAGCATGATGCCATCATGAGGCACATCTTGGAGAGACCGGACCCTACCGACGTCTTCCAGAATAAGGCAAACGTGTGTTGGGCCAAGGCTTTAGTGCCGGTGCTGAAGACCGCTGGCATAGACATGACCACTGAACAATGGAACACTGTGGATTATTTTGAAACGGACAAAGCTCACTCAGCAGAGATAGTATTGAACCAACTATGCGTGAGGTTCTTTGGACTCGATCTGGACTCCGGTCTATTTTCTGCACCCACTGTTCCGTTATCCATTAGGAATAATCACTGGGATAACTCCCCGTCGCCTAACATGTACGGGCTGAATAAAGAAGTGGTCCGTCAGCTCTCTCGCAGGTACCCACAACTGCCTCGGGCAGTTGCCACTGGAAGAGTCTATGACATGAACACTGGTACACTGCGCAATTATGATCCGCGCATAAACCTAGTACCTGTAAACAGAAGACTGCCTCATGCTTTAGTCCTCCACCATAATGAACACCCACAGAGTGACTTTTCTTCATTCGTCAGCAAATTGAAGGGCAGAACTGTCCTGGTGGTCGGGGAAAAGTTGTCCGTCCCAGGCAAAATGGTTGACTGGTTGTCAGACCGGCCTGAGGCTACCTTCAGAGCTCGGCTGGATTTAGGCATCCCAGGTGATGTGCCCAAATATGACATAATATTTGTTAATGTGAGGACCCCATATAAATACCATCACTATCAGCAGTGTGAAGACCATGCCATTAAGCTTAGCATGTTGACCAAGAAAGCTTGTCTGCATCTGAATCCCGGCGGAACCTGTGTCAGCATAGGTTATGGTTACGCTGACAGGGCCAGCGAAAGCATCATTGGTGCTATAGCGCGGCAGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAACCGAAATCCTCACTTGAAGAGACGGAAGTTCTGTTTGTATTCATTCGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATTCTTACAAGCTTTCATCAACCTTGACCAACATTTATACAGGTTCCAGACTCCACGAAGCCGGATGTGCACCCTCATATCATGTGGTGCGAGGGGATATTGCCACGGCCACCGAAGGAGTGATTATAAATGCTGCTAACAGCAAAGGACAACCTGGCGGAGGGGTGTGCGGAGCGCTGTATAAGAAATTCCCGGAAAGCTTCGATTTACAGCCGATCGAAGTAGGAAAAGCGCGACTGGTCAAAGGTGCAGCTAAACATATCATTCATGCCGTAGGACCAAACTTCAACAAAGTTTCGGAGGTTGAAGGTGACAAACAGTTGGCAGAGGCTTATGAGTCCATCGCTAAGATTGTCAACGATAACAATTACAAGTCAGTAGCGATTCCACTGTTGTCCACCGGCATCTTTTCCGGGAACAAAGATCGACTAACCCAATCATTGAACCATTTGCTGACAGCTTTAGACACCACTGATGCAGATGTAGCCATATACTGCAGGGACAAGAAATGGGAAATGACTCTCAAGGAAGCAGTGGCTAGGAGAGAAGCAGTGGAGGAGATATGCATATCCGACGACTCTTCAGTGACAGAACCTGATGCAGAGCTGGTGAGGGTGCATCCGAAGAGTTCTTTGGCTGGAAGGAAGGGCTACAGCACAAGCGATGGCAAAACTTTCTCATATTTGGAAGGGACCAAGTTTCACCAGGCGGCCAAGGATATAGCAGAAATTAATGCCATGTGGCCCGTTGCAACGGAGGCCAATGAGCAGGTATGCATGTATATCCTCGGAGAAGGCATGAGCAGTATTAGGTCGAAATGCCCCGTCGAAGAGTCGGAAGCCTCCACACCACCTAGCACGCTGCCTTGCTTGTGCATCCATGCCATGACTCCAGAAAGAGTACAGCGCCTAAAAGCCTCACGTCCAGAACAAATTACTGTGTGCTCATCCTTTCCATTGCCGAAGTATAGAATCACTGGTGTGCAGAAGATCCAATGCTCCCAGCCTATATTGTTCTCACCGAAAGTGCCTGCGTATATTCATCCAAGGAAGTATCTCGTGGAAACACCACCGGTAGACGAGACTCCGGAGCCATCGGCAGAGAACCAATCCACAGAGGGGACACCTGAACAACCACCACTTATAACCGAGGATGAGACCAGGACTAGAACGCCTGAGCCGATCATCATCGAAGAGGAAGAAGAGGATAGCATAAGTTTGCTGTCAGATGGCCCGACCCACCAGGTGCTGCAAGTCGAGGCAGACATTCACGGGCCGCCCTCTGTATCTAGCTCATCCTGGTCCATTCCTCATGCATCCGACTTTGATGTGGACAGTTTATCCATACTTGACACCCTGGAGGGAGCTAGCGTGACCAGCGGGGCAACGTCAGCCGAGACTAACTCTTACTTCGCAAAGAGTATGGAGTTTCTGGCGCGACCGGTGCCTGCGCCTCGAACAGTATTCAGGAACCCTCCACATCCCGCTCCGCGCACAAGAACACCGTCACTTGCACCCAGCAGGGCCTGCTCGAGAACCAGCCTAGTTTCCACCCCGCCAGGCGTGAATAGGGTGATCACTAGAGAGGAGCTCGAGGCGCTTACCCCGTCACGCACTCCTAGCAGGTCGGTCTCGAGAACCAGCCTGGTCTCCAACCCGCCAGGCGTAAATAGGGTGATTACAAGAGAGGAGTTTGAGGCGTTCGTAGCACAACAACAATGACGGTTTGATGCGGGTGCATACATCTTTTCCTCCGACACCGGTCAAGGGCATTTACAACAAAAATCAGTAAGGCAAACGGTGCTATCCGAAGTGGTGTTGGAGAGGACCGAATTGGAGATTTCGTATGCCCCGCGCCTCGACCAAGAAAAAGAAGAATTACTACGCAAGAAATTACAGTTAAATCCCACACCTGCTAACAGAAGCAGATACCAGTCCAGGAAGGTGGAGAACATGAAAGCCATAACAGCTAGACGTATTCTGCAAGGCCTAGGGCATTATTTGAAGGCAGAAGGAAAAGTGGAGTGCTACCGAACCCTGCATCCTGTTCCTTTGTATTCATCTAGTGTGAACCGTGCCTTTTCAAGCCCCAAGGTCGCAGTGGAAGCCTGTAACGCCATGTTGAAAGAGAACTTTCCGACTGTGGCTTCTTACTGTATTATTCCAGAGTACGATGCCTATTTGGACATGGTTGACGGAGCTTCATGCTGCTTAGACACTGCCAGTTTTTGCCCTGCAAAGCTGCGCAGCTTTCCAAAGAAACACTCCTATTTGGAACCCACAATACGATCGGCAGTGCCTTCAGCGATCCAGAACACGCTCCAGAACGTCCTGGCAGCTGCCACAAAAAGAAATTGCAATGTCACGCAAATGAGAGAATTGCCCGTATTGGATTCGGCGGCCTTTAATGTGGAATGCTTCAAGAAATATGCGTGTAATAATGAATATTGGGAAACGTTTAAAGAAAACCCCATCAGGCTTACTGAAGAAAACGTGGTAAATTACATTACCAAATTAAAAGGACCAAAAGCTGCTGCTCTTTTTGCGAAGACACATAATTTGAATATGTTGCAGGACATACCAATGGACAGGTTTGTAATGGACTTAAAGAGAGACGTGAAAGTGACTCCAGGAACAAAACATACTGAAGAACGGCCCAAGGTACAGGTGATCCAGGCTGCCGATCCGCTAGCAACAGCGTATCTGTGCGGAATCCACCGAGAGCTGGTTAGGAGATTAAATGCGGTCCTGCTTCCGAACATTCATACACTGTTTGATATGTCGGCTGAAGACTTTGACGCTATTATAGCCGAGCACTTCCAGCCTGGGGATTGTGTTCTGGAAACTGACATCGCGTCGTTTGATAAAAGTGAGGACGACGCCATGGCTCTGACCGCGTTAATGATTCTGGAAGACTTAGGTGTGGACGCAGAGCTGTTGACGCTGATTGAGGCGGCTTTCGGCGAAATTTCATCAATACATTTGCCCACTAAAACTAAATTTAAATTCGGAGCCATGATGAAATCTGGAATGTTCCTCACACTGTTTGTGAACACAGTCATTAACATTGTAATCGCAAGCAGAGTGTTGAGAGAACGGCTAACCGGATCACCATGTGCAGCATTCATTGGAGATGACAATATCGTGAAAGGAGTCAAATCGGACAAATTAATGGCAGACAGGTGCGCCACCTGGTTGAATATGGAAGTCAAGATTATAGATGCTGTGGTGGGCGAGAAAGCGCCTTATTTCTGTGGAGGGTTTATTTTGTGTGACTCCGTGACCGGCACAGCGTGCCGTGTGGCAGACCCCCTAAAAAGGCTGTTTAAGCTTGGCAAACCTCTGGCAGCAGACGATGAACATGATGATGACAGGAGAAGGGCATTGCATGAAGAGTCAACACGCTGGAACCGAGTGGGTATTCTTTCAGAGCTGTGCAAGGCAGTAGAATCAAGGTATGAAACCGTAGGAACTTCCATCATAGTTATGGCCATGACTACTCTAGCTAGCAGTGTTAAATCATTCAGCTACCTGAGAGGGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAGTCTAGCATATGGGCGCGCCCTCAGCATCGATTTGAATTGGCCACCATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCACGATGTGCCATGTGGGAGCTGGAGAAAGACGTTTATGTTGTAGAGGTGGACTGGACTCCCGATGCCCCTGGAGAAACAGTGAACCTCACCTGTGACACGCCTGAAGAAGATGACATCACCTGGACCTCAGACCAGAGACATGGAGTCATAGGCTCTGGAAAGACCCTGACCATCACTGTCAAAGAGTTTCTAGATGCTGGCCAGTACACCTGCCACAAAGGAGGCGAGACTCTGAGCCACTCACATCTGCTGCTCCACAAGAAGGAAAATGGAATTTGGTCCACTGAAATTTTAAAAAATTTCAAAAACAAGACTTTCCTGAAGTGTGAAGCACCAAATTACTCCGGACGGTTCACGTGCTCATGGCTGGTGCAAAGAAACATGGACTTGAAGTTCAACATCAAGAGCAGTAGCAGTTCCCCTGACTCTCGGGCAGTGACATGTGGAATGGCGTCTCTGTCTGCAGAGAAGGTCACACTGGACCAAAGGGACTATGAGAAGTATTCAGTGTCCTGCCAGGAGGATGTCACCTGCCCAACTGCCGAGGAGACCCTGCCCATTGAACTGGCGTTGGAAGCACGGCAGCAGAATAAATATGAGAACTACAGCACCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCAGACCCGCCCAAGAACTTGCAGATGAAGCCTTTGAAGAACTCACAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACTCCTGGAGCACTCCCCATTCCTACTTCTCCCTCAAGTTCTTTGTTCGAATCCAGCGCAAGAAAGAAAAGATGAAGGAGACAGAGGAGGGGTGTAACCAGAAAGGTGCGTTCCTCGTAGAGAAGACATCTACCGAAGTCCAATGCAAAGGCGGGAATGTCTGCGTGCAAGCTCAGGATCGCTATTACAATTCCTCATGCAGCAAGTGGGCATGTGTTCCCTGCAGGGTCCGATCCGGAGGTTCCGGTGGTGGATCCGGAGGTGGCTCCGGCGGCGGATCCAGGGTCATTCCAGTCTCTGGACCTGCCAGGTGTCTTAGCCAGTCCCGAAACCTGCTGAAGACCACAGATGACATGGTGAAGACGGCCAGAGAAAAACTGAAACATTATTCCTGCACTGCTGAAGACATCGATCATGAAGACATCACACGGGACCAAACCAGCACATTGAAGACCTGTTTACCACTGGAACTACACAAGAACGAGAGTTGCCTGGCTACTAGAGAGACTTCTTCCACAACAAGAGGGAGCTGCCTGCCCCCACAGAAGACGTCTTTGATGATGACCCTGTGCCTTGGTAGCATCTATGAGGACTTGAAGATGTACCAGACAGAGTTCCAGGCCATCAACGCAGCACTTCAGAATCACAACCATCAGCAGATCATTCTAGACAAGGGCATGCTGGTGGCCATCGATGAGCTGATGCAGTCTCTGAATCATAATGGCGAGACTCTGCGCCAGAAACCTCCTGTGGGAGAAGCAGACCCTTACAGAGTGAAAATGAAGCTCTGCATCCTGCTTCACGCCTTCAGCACCCGCGTCGTGACCATCAACAGGGTGATGGGCTATCTGAGCTCCGCCGGTTCCGGTGGCGGATCCGAAGCACACAAGAGTGAGATCGCCCATCGGTATAATGATTTGGGAGAACAACATTTCAAAGGCCTAGTCCTGATTGCCTTTTCCCAGTATCTCCAGAAATGCTCATACGATGAGCATGCCAAATTAGTGCAGGAAGTAACAGACTTTGCAAAGACGTGTGTTGCCGATGAGTCTGCCGCCAACTGTGACAAATCCCTTCACACTCTTTTTGGAGATAAGTTGTGTGCCATTCCAAACCTCCGTGAAAACTATGGTGAACTGGCTGACTGCTGTACAAAACAAGAGCCCGAAAGAAACGAATGTTTCCTGCAACACAAAGATGACAACCCCAGCCTGCCACCATTTGAAAGGCCAGAGGCTGAGGCCATGTGCACCTCCTTTAAGGAAAACCCAACCACCTTTATGGGACACTATTTGCATGAAGTTGCCAGAAGACATCCTTATTTCTATGCCCCAGAACTTCTTTACTATGCTGAGCAGTACAATGAGATTCTGACCCAGTGTTGTGCAGAGGCTGACAAGGAAAGCTGCCTGACCCCGAAGCTTGATGGTGTGAAGGAGAAAGCATTGGTCTCATCTGTCCGTCAGAGAATGAAGTGCTCCAGTATGCAGAAGTTTGGAGAGAGAGCTTTTAAAGCATGGGCAGTAGCTCGTCTGAGCCAGACATTCCCCAATGCTGACTTTGCAGAAATCACCAAATTGGCAACAGACCTGACCAAAGTCAACAAGGAGTGCTGCCATGGTGACCTGCTGGAATGCGCAGATGACAGGGCGGAACTTGCCAAGTACATGTGTGAAAACCAGGCGACTATCTCCAGCAAACTGCAGACTTGCTGCGATAAACCACTGTTGAAGAAAGCCCACTGTCTTAGTGAGGTGGAGCATGACACCATGCCTGCTGATCTGCCTGCCATTGCTGCTGATTTTGTTGAGGACCAGGAAGTGTGCAAGAACTATGCTGAGGCCAAGGATGTCTTCCTGGGCACGTTCT
TGTATGAATATTCAAGAAGACACCCTGATTACTCTGTATCCCTGTTGCTGAGACTTGCTAAGAAATATGAAGCCACTCTGGAAAAGTGCTGCGCTGAAGCCAATCCTCCCGCATGCTACGGCACAGTGCTTGCTGAATTTCAGCCTCTTGTAGAAGAGCCTAAGAACTTGGTCAAAACCAACTGTGATCTTTACGAGAAGCTTGGAGAATATGGATTCCAAAATGCCATTCTAGTTCGCTACACCCAGAAAGCACCTCAGGTGTCAACCCCAACTCTCGTGGAGGCTGCAAGAAACCTAGGAAGAGTGGGCACCAAGTGTTGTACACTTCCTGAAGATCAGAGACTGCCTTGTGTGGAAGACTATCTGTCTGCAATCCTGAACCGTGTGTGTCTGCTGCATGAGAAGACCCCAGTGAGTGAGCATGTTACCAAGTGCTGTAGTGGATCCCTGGTGGAAAGGCGGCCATGCTTCTCTGCTCTGACAGTTGATGAAACATATGTCCCCAAAGAGTTTAAAGCTGAGACCTTCACCTTCCACTCTGATATCTGCACACTTCCAGAGAAGGAGAAGCAGATTAAGAAACAAACGGCTCTTGCTGAGCTGGTGAAGCACAAGCCCAAGGCTACAGCGGAGCAACTGAAGACTGTCATGGATGACTTTGCACAGTTCCTGGATACATGTTGCAAGGCTGCTGACAAGGACACCTGCTTCTCGACTGAGGGTCCAAACCTTGTCACTAGATGCAAAGACGCCTTAGCCGGCGGAGGTTCCGGTGGCGGATCCCAATACTATGACTACGATATACCCCTGTTCATGTACGGGCAAATATCTCCAAACTGTGCACCAGAATGTAACTGCCCTCACTCATACCCCACTGCAATGTACTGTGACGACCTGAAGTTGAAATCCGTGCCAATGGTGCCTCCTGGGATTAAGTACCTGTACCTCCGCAACAATCAGATCGACCATATTGACGAGAAGGCTTTTGAAAACGTCACAGACCTCCAGTGGCTTATCCTGGACCATAACCTGCTTGAAAATAGTAAGATAAAGGGCAAAGTATTTTCCAAACTTAAACAGCTTAAAAAACTCCACATCAACTACAATAACCTTACTGAATCCGTGGGACCATTGCCAAAATCTCTCCAAGATTTGCAGTTGACTAACAACAAGATATCCAAACTCGGCTCCTTCGATGGGCTGGTTAATCTGACTTTCATCTACTTGCAACACAACCAATTGAAGGAGGATGCAGTTTCAGCTAGTCTTAAAGGTCTGAAAAGCCTTGAGTATCTTGATCTGTCATTTAATCAAATGTCCAAGCTCCCTGCTGGGCTCCCAACAAGTCTGCTGACACTCTATCTCGACAATAACAAGATAAGTAACATTCCCGATGAGTACTTTAAAAGATTTACCGGCCTCCAATACTTGCGGCTTTCTCACAACGAGTTGGCAGACTCTGGTGTACCCGGCAACTCCTTTAATATAAGTTCTCTTCTCGAGCTTGATTTGTCCTATAACAAACTGAAGAGTATCCCTACTGTCAATGAAAATTTGGAGAATTACTACCTCGAAGTCAATGAGCTTGAGAAGTTCGATGTTAAGTCTTTCTGTAAGATACTGGGTCCATTGTCATACAGCAAGATTAAACATCTTCGCTTGGATGGGAATCCCTTGACTCAAAGCTCACTTCCCCCCGACATGTACGAATGCCTGAGGGTAGCCAACGAAATCACAGTAAACGGAGGTGGCTCCTGAGCGATCGCTAAATACAGCAGCAATTGGCAAGCTGCTTACATAGAACTCGCGGCGATTGGCATGCCGCCTTAAAATTTTTATTTTATTTTTCTTTTCTTTTCCGAATCGGATTTTGTTTTTAATATTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGCGTCGAGGGGAATTAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGAGCTCTAATACGACTCACTATAG（配列番号５）

【0053】

いくつかの態様において、合成腫瘍溶解性ウイルスは、ＬＮＰ－レプリコンＲＮＡ－ＩＬ－１２－血清アルブミン－ルミカンを含む。他の態様において、合成腫瘍溶解性ウイルスは、ＴＴ３－ＬＮＰ－レプリコンＲＮＡ－ＩＬ－１２－血清アルブミン－ルミカンを含む。他の態様において、合成腫瘍溶解性ウイルスは、ＴＴ３－ＬＮＰ－ｍｔレプリコンＲＮＡ－ＩＬ－１２－血清アルブミン－ルミカンを含む。腫瘍微小環境におけるＩＬ－１２の保持は、合成腫瘍溶解性ウイルスの有効性および安全性を改善するであろう。

【0054】

いくつかの場合において、レプリコンＲＮＡは、実験的または治療的に関心のある１以上の遺伝子（単数または複数）を含んでいてもよい。いくつかの態様において、実験的または治療的に関心のある遺伝子（単数または複数）は、サイトカイン、ケモカイン、またはＩＬ－１２以外の成長因子をコードする。サイトカインは、当該技術分野において知られており、および用語自体は、免疫系内のある細胞によって分泌され、および他の細胞に対して効果を有する、小さなタンパク質の一般化されたグループ分けを指す。サイトカインは、細胞の免疫応答を増強することが知られており、および本明細書に使用されるときは、これらに限定されないが、ＴＮＦα、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－α、ＴＧＦ－β、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、およびケモカインを包含し得る。

【0055】

ケモカインは、他の適用の中でも、感染に対する応答、免疫応答、炎症、外傷、敗血症、がん、および生殖を調査する研究に有用である。ケモカインは、当該技術分野において知られており、および感染の部位のすぐ近くの応答細胞で、典型的には白血球の走化性を誘導するサイトカインの一種である。ケモカインの非限定例は、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２７、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ－８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１１、およびＣＸＣＬ１０を包含する。成長因子は、当該技術分野において知られており、および用語自体は、時折用語サイトカインと交換可能である。本明細書に使用されるとき、用語「成長因子」は、細胞間のシグナル伝達および細胞の増殖を刺激することのできる天然に存在する物質を指す。サイトカインは、成長因子であってもよい一方で、あるタイプのサイトカインはまた、細胞成長に対して阻害効果を有していてもよく、よって２つの用語を区別している。

【0056】

成長因子の非限定例は、アドレノメデュリン（ＡＭ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、自己分泌型細胞運動刺激因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、マクロファージコロニー刺激因子（ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、エフリンＡ１、エフリンＡ２、エフリンＡ３、エフリンＡ４、エフリンＡ５、エフリンＢ１、エフリンＢ２、エフリンＢ３、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ１）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、線維芽細胞成長因子３（ＦＧＦ３）、線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）、線維芽細胞成長因子５（ＦＧＦ５）、線維芽細胞成長因子６（ＦＧＦ６）、線維芽細胞成長因子７（ＦＧＦ７）、線維芽細胞成長因子８（ＦＧＦ８）、線維芽細胞成長因子９（ＦＧＦ９）、線維芽細胞成長因子１０（ＦＧＦ１０）、線維芽細胞成長因子１１（ＦＧＦ１１）、線維芽細胞成長因子１２（ＦＧＦ１２）、線維芽細胞成長因子１３（ＦＧＦ１３）、線維芽細胞成長因子１４（ＦＧＦ１４）、線維芽細胞成長因子１５（ＦＧＦ１５）、線維芽細胞成長因子１６（ＦＧＦ１６）、線維芽細胞成長因子１７（ＦＧＦ１７）、線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ１８）、線維芽細胞成長因子１９（ＦＧＦ１９）、線維芽細胞成長因子２０（ＦＧＦ２０）、線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）、線維芽細胞成長因子２２（ＦＧＦ２２）、線維芽細胞成長因子２３（ＦＧＦ２３）、ウシ胎仔成長ホルモン（Fetal Bovine Somatotrophin）（ＦＢＳ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、パーセフィン、アルテミン、増殖分化因子－９（ＧＤＦ９）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、肝がん由来成長因子（ＨＤＧＦ）、インスリン、インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）、インスリン様成長因子－２（ＩＧＦ－２）、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、角化細胞成長因子（ＫＧＦ）、遊走刺激因子（Migration-stimulating factor）（ＭＳＦ）、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）、ミオスタチン（ＧＤＦ－８）、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）、ニューレグリン２（ＮＲＧ２）、ニューレグリン３（ＮＲＧ３）、ニューレグリン４（ＮＲＧ４）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、ニューロトロフィン－４（ＮＴ－４）、胎盤成長因子（ＰＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、レナラーゼ（ＲＮＬＳ）、Ｔ細胞成長因子（ＴＣＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦ－α）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を包含する。

【0057】

ＩＩ．医薬組成物
いくつかの側面において、本開示は、少なくとも一部において、本明細書に記載のとおりの合成腫瘍溶解性ウイルスを含む医薬組成物に関する。本明細書に記載の医薬組成物は、薬学的に許容し得る担体（賦形剤）をさらに含み、標的の疾患を処置する使用のための医薬組成物を形成してもよい。「許容し得る」は、担体が、組成物の活性成分に適合し（および好ましくは、活性成分を安定化させることができ）、および処置されるべき対象に有害であってはならないことを意味する。バッファーを包含する薬学的に許容し得る賦形剤（担体）、それは、当該技術分野において周知である。例として、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hooverを参照されたい。

【0058】

ｉｎ ｖｉｖｏでの投与のために使用される医薬組成物は、滅菌されなければならない。このことは、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過によって、容易に成し遂げられる。合成腫瘍溶解性ウイルスを含有する組成物は、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通することができる（pierceable）ストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアル内に置かれてもよい。
いくつかの態様において、本明細書に使用される医薬組成物は、腫瘍内注射のために処方され得る。本明細書に使用されるとき、腫瘍内注射は、抗腫瘍組成物（例として免疫賦活性合成腫瘍溶解性ウイルス）の腫瘍内への直接注射を指す。少量の薬物を使用しながら、高濃度の組成物は、ｉｎ ｓｉｔｕで達成され得る。免疫療法の局所送達は、全身性の曝露およびオフターゲットの毒性を有意に予防しながら、複数の併用治療を可能にする。

【0059】

他の態様において、医薬組成物は、筋肉内注射、静脈内注射、または皮下注射のために処方され得る。
本方法において使用される医薬組成物は、凍結乾燥された製剤または水性溶液の形態で、薬学的に許容し得る担体、緩衝剤、賦形剤、塩、または安定剤を含み得る。例として、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hooverを参照されたい。許容し得る担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、およびホスファート、シトラート、および他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを包含する抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム塩化物；ヘキサメトニウム塩化物；塩化ベンザルコニウム、ベンズエトニウム塩化物；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストランを包含する他の炭化水素；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例として、Ｚｎ－タンパク質複合体）；および／またはTWEEN（商標）、PLURONICS（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性の界面活性剤を含んでもよい。

【0060】

いくつかの例において、本明細書に記載の医薬組成物は、Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)；Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号に記載されているものなどの、当該技術分野において知られている方法によって調製され得る、脂質ナノ粒子を含む。増強された循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示される。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）を含む脂質組成物と共に、逆相蒸発法によって生成され得る。リポソームは、規定の孔径のフィルターを通して押し出され、所望される直径を有するリポソームが生産される。

【0061】

他の例において、本明細書に記載の医薬組成物は、持続放出の形式で処方され得る。持続放出調製物の好適な例は、合成腫瘍溶解性ウイルスを包含する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスであり、そのマトリックスは、成形された物品、例として、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリラート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ－グルタミン酸および７ エチル－Ｌ－グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン－酢酸ビニル、LUPRON DEPOT（商標）（乳酸－グリコール酸コポリマーおよびリュープロリドアセタートから構成される注射可能なミクロスフィア）などの分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、スクロースアセタートイソブチラート、およびポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸を包含する。

【0062】

好適な表面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン（例として、TWEEN（商標）２０、４０、６０、８０または８５）および他のソルビタン（例として、SPAN（商標）２０、４０、６０、８０または８５）などの非イオン性の剤をとりわけ包含する。表面活性剤を有する組成物は、都合の良いことに０．０５～５％の間の表面活性剤を含み、および０．１～２．５％の間であり得る。必要ならば、他の成分、例えば、マンニトールまたは他の薬学的に許容し得るビヒクルが添加されてもよいことが理解されるだろう。
本明細書に記載の医薬組成物は、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、顆粒、溶液または懸濁液、または坐薬などの単位剤形において、経口、非経口または直腸投与、または吸入または吹送による投与のためのものであり得る。

【0063】

錠剤などの固体組成物を調製するために、第一の活性成分は、医薬担体、例として、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはゴムなどの従来の錠剤化成分、および他の医薬希釈剤、例として、水と混合され得、本発明の化合物の均一な混合物を含有する固体の予備処方組成物、または非毒性のその薬学的に許容し得る塩を形成する。これらの予備処方組成物を均一であると呼ぶとき、組成物が、等しく有効である、錠剤、丸薬およびカプセルなどの単位剤形内に容易に小分けできるように、活性成分は、組成物のあらゆる場所で均等に分散されることを意味する。次いで、この固体の予備処方組成物は、０．１から約５００ｍｇまでの本発明の活性成分を含有する上に記載のタイプの単位剤形内に小分けされる。新規組成物の錠剤または丸薬は、コーティングされるかまたはさもなければ合成されて、持続的な作用の利点を与える剤形を提供し得る。例えば、錠剤または丸薬は、内側の投薬量および外側の投薬量の構成要素を含み得、後者はエンベロープの形態で前者を覆っている。２つの構成要素は、胃における崩壊に抵抗する役割を果たし、および内側の構成要素が、十二指腸内を無傷で通過するか、または放出を遅延させるのを可能にする、腸溶性の層によって分離され得る。様々な材料が、このような腸溶性の層またはコーティングのために使用され得、かかる材料は、数多のポリマー酸およびポリマー酸とシェラック、セチルアルコールおよびセルロースアセタートなどの材料との混合物を包含する。

【0064】

好適なエマルションは、INTRALIPID（商標）、LIPOSYN（商標）、INFONUTROL（商標）、LIPOFUNDIN（商標）およびLIPIPHYSAN（商標）などの市販の脂肪エマルションを使用して調製されてもよい。活性成分は、予め混合されたエマルション組成物に溶解するか、または代替的に油（例として、大豆油、紅花油、綿実油、ゴマ油、トウモロコシ油または扁桃油）に溶解して、およびリン脂質（例として、タマゴリン脂質、大豆リン脂質または大豆レシチン）および水と混合してエマルションを形成するかのいずれかであってもよい。他の成分、例えば、グリセロールまたはグルコースを添加して、エマルションの張度を調整してもよいことが理解されるだろう。好適なエマルションは、典型的には、最大２０％までの油、例えば、５～２０％の間の油を含有するだろう。脂肪エマルションは、好適なサイズを有する脂肪液滴を含み得、および５．５～８．０の範囲にあるｐＨを有し得る。

【0065】

吸入または吹送のための医薬組成物は、溶液および薬学的に許容し得る、水性または有機溶媒中の懸濁液、またはそれらの混合物、および粉末を包含する。液体または固体組成物は、上に提示されるような好適な薬学的に許容し得る賦形剤を含有してもよい。いくつかの態様において、組成物は、局所または全身性効果のために経口または経鼻の呼吸ルートによって投与される。
好ましくは滅菌された薬学的に許容し得る溶媒中の組成物は、ガスの使用により噴霧されてもよい。噴霧された溶液は、噴霧デバイスから直接的に呼吸されても、または噴霧デバイスがフェイスマスク、テント状のもの、または間欠的陽圧呼吸の機械に取り付けられてもよい。溶液、懸濁液または粉末組成物は、適切なやり方で製剤を送達するデバイスから、好ましくは、経口的にまたは経鼻的に投与されてもよい。

【0066】

ＩＩＩ．治療への応用
合成腫瘍溶解性ウイルスを含む、本明細書に開示の医薬組成物は、がんの処置、例えば、がん免疫治療に使用され得る。
本明細書に開示の方法を実践するために、本明細書に記載の医薬組成物のいずれかの有効量が、静脈内投与、例として、ボーラスとして、またはある期間にわたる連続的な注入による、静脈内投与による、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内（intracerebrospinal）、皮下、関節内、滑液嚢内、髄腔内、経口、吸入または局所のルートによる、腫瘍内投与などの好適なルートを介して、処置を必要とする対象（例として、ヒト）に投与され得る。ジェット噴霧器および超音波噴霧器を包含する、液体製剤のための市販の噴霧器は、投与に有用である。液体製剤は、直接噴霧され得、および凍結乾燥された粉末は、再構成後に噴霧され得る。代替的に、合成腫瘍溶解性ウイルスを含有する医薬組成物は、フッ化炭素製剤および定量吸入器を使用してエアロゾル化され得るか、または凍結乾燥されたおよび製粉された粉末として吸入され得る。いくつかの例において、本明細書に記載の医薬組成物は、腫瘍内注射のために処方される。特定の例において、医薬組成物は、局所ルート、例えば、腫瘍部位または感染部位などの局所部位へ注射することを介して、対象（例として、ヒト患者）に投与されてもよい。

【0067】

本明細書に使用されるとき、「有効量」は、単独で、または１以上の他の活性剤と組み合わせてのいずれかで、対象に治療効果を与えるに必要とされる各活性剤の量を指す。いくつかの態様において、治療効果は、低減した腫瘍負荷、がん細胞の低減、または増大した免疫活性化である。合成腫瘍溶解性ウイルスの量が、治療効果を達成したか否かの決定は、当業者にとって明らかであるだろう。有効量は、当業者に認識されるとおり、処置される具体的な疾病、疾病の重症度、年齢、体調、サイズ、性別および重量を包含する個々の患者のパラメータ、処置の期間、併用治療の性質（もしあれば）、特定の投与ルートおよび健康実践者の知識および専門的技術内の同様の因子に応じて変更される。これらの因子は、当業者に周知であり、およびただのルーチンにすぎない実験法で取り組まれ得る。それは、使用される個人の構成要素またはそれらの組み合わせの最大限の用量、すなわち、妥当な医学的判断に従った最も高い安全な用量であることが、一般に好ましい。

【0068】

半減期などの経験的考察は、一般に投薬量の決定に寄与するだろう。投与の頻度は、治療の最中にわたって決定および調節されてもよく、および一般に、標的の疾患／障害の処置および／または抑制および／または寛解および／または遅延に基づくが、必ずしもそうではない。代替的に、合成腫瘍溶解性ウイルスの持続的な連続放出製剤は、適切であるであろう。持続放出を達成するための様々な製剤およびデバイスは、当該技術分野において知られている。
いくつかの態様において、処置は、合成腫瘍溶解性ウイルスを含有する医薬組成物の単回の注射である。いくつかの態様において、単回の注射は、これを必要とする対象に、腫瘍内に投与される。

【0069】

いくつかの例において、本明細書に記載のとおりの合成腫瘍溶解性ウイルスについての投薬量は、合成腫瘍溶解性の１以上の投与（単数または複数）を与えられる個体において経験的に決定されてもよい。個体は、合成腫瘍溶解性を含有する組成物の徐々に増加する投薬量を与えられる。合成腫瘍溶解性ウイルスの有効性を査定するために、疾患／障害の指針が、追及され得る。数日間またはそれより長くにわたる反復投与について、疾病に応じて、処置は、所望される症状の抑制が生じるか、または充分な治療レベルが達成されて、標的の疾患または障害、またはその症状を緩和するまで持続される。

【0070】

いくつかの態様において、投薬頻度は、週に１回、２週に１回、４週に１回、５週に１回、６週に１回、７週に１回、８週に１回、９週に１回、または１０週に１回；または月に１回、２月に１回、または３月に１回、またはそれより長くに１回である。この治療の進捗は、従来の技法およびアッセイによって容易にモニターされる。使用される合成腫瘍溶解性ウイルスの投薬レジメンは、経時的に変更され得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、処置を必要とする対象（例として、ヒト患者）に、１回または複数回用量の合成腫瘍溶解性ウイルスを含有する医薬組成物を投与することを含む。

【0071】

本開示の目的について、本明細書に記載のとおりの合成腫瘍溶解性ウイルスの適切な投薬量は、特定の合成腫瘍溶解性ウイルス、疾患／障害のタイプおよび重症度、合成腫瘍溶解性ウイルスが、予防または治療目的のために投与されること、先の治療、患者の臨床歴および合成腫瘍溶解性ウイルスに対する応答、および主治医の裁量に依存するであろう。臨床医は、投薬量が、所望される結果を達成することに到達するまで、合成腫瘍溶解性ウイルスを投与してもよい。いくつかの態様において、所望される結果は、腫瘍負荷における減少、がん細胞における減少、または増大した免疫活性化である。投薬量が所望される結果をもたらしたか否かを決定する方法は、当業者にとって明らかだろう。１以上の合成腫瘍溶解性ウイルスの投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与の目的が、治療的であるかまたは予防的であるか、および技能を有する実践者に既知の他の因子に応じて、連続的または断続的であり得る。合成腫瘍溶解性ウイルスの投与は、本質的に、予め選択された期間にわたって連続的であってもよく、または例として、標的の疾患または障害の発生前、発生中、または発生後のいずれかでの、一連の間隔をあけた用量においてであってもよい。

【0072】

本明細書に使用されるとき、用語「処置する」は、標的の疾患または障害、疾患／障害の症状、または疾患／障害にかかりやすい体質を有する対象への、障害、疾患の症状、または疾患または障害にかかりやすい体質を治療する、治癒する、緩和する、軽減する、変更する、共生する、寛解させる、改善する、または影響を与えることを目的とした、１以上の活性剤を包含する組成物の適用または投与を指す。

【0073】

標的の疾患／障害を緩和することは、疾患の発症または進行を遅延させること、または疾患の重症度を低減することを包含する。疾患を緩和することは、必ずしも治療結果を必要とするわけではない。その中で使用されるように、標的の疾患または障害の発症を「遅延させること」は、疾患の進行を、先送りすること、妨げること、遅くすること、遅らせること、一定に保つこと、および／または延期することを意味する。この遅延は、疾患の歴史および／または治療されるべき個体に応じて、様々な時間の長さであり得る。疾患の発症を「遅延させる」または緩和する、もしくは疾患の発病を遅延させる方法は、方法を使用しないものと比較して、所与の時間枠内での疾患の１以上の症状を発症する確率を低減する、および／または所与の時間枠内での症状の広がりを低減する方法である。このような比較は、典型的には、統計的に有意な結果を与えるのに充分な数の対象を使用した、臨床研究に基づく。

【0074】

疾患の「発症」または「進行」は、疾患の最初の兆候および／または続いて起こる進行を意味する。疾患の発症は、検出可能であり、および当該技術分野において周知である標準的な臨床技術を使用して査定され得る。しかしながら、発症はまた、検出不可能であるだろう進行をも指す。本開示の目的について、発症または進行は、症状の生物学的経過を指す。「発症」は、発生、再発、および発病を包含する。本明細書に使用されるとき、標的の疾患または障害の「発病」または「発生」は、最初の発病および／または再発を包含する。

【0075】

いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりの合成腫瘍溶解性ウイルスを含有する医薬組成物は、腫瘍負荷またはがん細胞の成長をｉｎ ｖｉｖｏで、少なくとも５％（例として、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより大きく）低減させるのに充分な量で、処置を必要とする対象に投与される。他の態様において、本明細書に記載のとおりの合成腫瘍溶解性ウイルスを含有する医薬組成物は、免疫活性を、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより大きく増大させるのに有効な量で投与され得る。

【0076】

本明細書に記載の方法によって処置されるべき対象は、ヒト、家畜、競技用動物（sport animals）、ペット、霊長目の動物、ウマ、イヌ、ネコ、マウスおよびラットなどの哺乳動物であり得る。一態様において、対象は、ヒトである。本明細書に記載のとおりの合成腫瘍溶解性ウイルスを含有する組成物は、処置の必要である対象において、免疫活性、例えば、Ｔ細胞活性を増強するために使用されてもよい。
いくつかの態様において、対象は、がんを有する、がんを有すると疑われる、またはがんのリスクのあるヒト患者であってもよい。がんの非限定例は、黒色腫、扁平上皮細胞がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜のがん、肝細胞がん、胃腸がん、膵臓がん、膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝がん、乳がん、結腸がん、大腸がん、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌、胃がん、および扁平細胞頭頸部がん（squamous cell head and neck cancer）を包含する様々なタイプの頭頚部がんを包含する。いくつかの態様において、がんは、黒色腫、肺がん、大腸がん、腎細胞がん、尿路上皮癌、またはホジキンリンパ腫であり得る。

【0077】

標的の疾患または障害（例として、がん）を有する対象は、ルーチンの診察、例として、臨床検査、臓器機能検査、ＣＴスキャン、または超音波によって同定され得る。このような標的の疾患／障害のいずれかを有すると疑われる対象は、疾患／障害の１以上の症状を示すであろう。疾患／障害のリスクのある対象は、その疾患／障害に関連する１以上のリスク因子を有する対象であり得る。このような対象はまた、ルーチンの医療行為によって同定され得る。

【0078】

いくつかの態様において、合成腫瘍溶解性ウイルスを含有する医薬組成物は、別の好適な治療剤（例として、抗がん剤、抗ウイルス剤、または抗細菌剤）および／または合成腫瘍溶解性ウイルスの免疫賦活性効果を増強させる、および／または補完するのに役立つ他の剤と共に使用されてもよい。このような併用療法において、合成腫瘍溶解性ウイルスを含有する組成物および追加の治療剤（例として、抗がん治療剤または本明細書に記載の他のもの）は、逐次的なやり方（すなわち、各治療剤が異なる時間で投与される）で、処置を必要とする対象に投与されてもよい。代替的に、これらの治療剤、または剤のうち少なくとも２つは、実質的に同時であるやり方で対象に投与される。

【0079】

併用療法は、明細書に記載の剤（例として、合成腫瘍溶解性ウイルスを含有する医薬組成物および抗がん剤）の投与を、他の生物学的に活性な成分（例として、種々の抗がん剤）および非薬物療法（例として、外科手術）とさらに併用することをもまた包含し得る。

【0080】

合成腫瘍溶解性ウイルスを含有する組成物および別の抗がん剤（例として、化学治療剤）のいずれかの組み合わせは、がんを処置するためのいずれかのシーケンスにおいて使用されてもよいと理解すべきである。本明細書に記載の組み合わせは、これらに限定されないが、腫瘍形成または腫瘍成長を低減すること、がん細胞を低減すること、免疫活性化を増大すること、および／またはがんに関連する少なくとも１つの症状を緩和することの有効性、または組み合わせの別の剤の副作用を軽減することについての有効性を包含する、数多の因子に基づいて選択されてもよい。例えば、本明細書に記載の併用療法は、組み合わせの個々のメンバー夫々に関連する副作用、例えば、抗がん剤に関連する副作用のいずれかを低減してもよい。

【0081】

いくつかの態様において、別の抗がん治療剤は、化学療法、放射線療法、外科療法および／または免疫療法である。化学療法剤の例は、これらに限定されないが、カルボプラチンまたはシスプラチン、ドセタキセル、ゲムシタビン、Ｎａｂ－パクリタキセル、パクリタキセル、ペメトレキセド、およびビノレルビンを包含する。放射線療法の例は、これらに限定されないが、電離放射線、ガンマ放射線、中性子線放射線治療、電子線放射線治療、陽子線治療、小線源治療、全身性の放射性同位体（systemic radioactive isotopes）および放射線増感剤を包含する。外科療法の例は、これらに限定されないが、治癒的外科手術（例として、腫瘍除去外科手術）、予防的外科手術、腹腔鏡下外科手術、およびレーザー外科手術を包含する。免疫療法の例は、これらに限定されないが、養子細胞移植および治療的がんワクチンを包含する。

【0082】

化学療法の追加の例は、これらに限定されないが、以下を包含する；カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、ネダプラチン、サトラプラチン、ロバプラチン、トリプラチン、テトラニトラート、ピコプラチン、プロリンダック（Prolindac）、アロプラチンおよび他の誘導体などの白金製剤；カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン／ＳＮ３８、ルビテカン、ベロテカン、および他の誘導体などのトポイソメラーゼＩインヒビター；エトポシド（ＶＰ－１６）、ダウノルビシン、ドキソルビシン製剤（例として、ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌ、ドキソルビシン類似体、またはリポソーム中のドキソルビシンおよびその塩または類似体）、ミトキサントロン、アクラルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アムルビシン、アムサクリン、ピラルビシン、バルルビシン、ゾルビシン、テニポシドおよび他の誘導体などのトポイソメラーゼＩＩインヒビター；葉酸ファミリー（Folic family）（メトトレキサート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、アミノプテリン、および類縁体）などの代謝拮抗薬；プリンアンタゴニスト（チオグアニン、フルダラビン、クラドリビン、６－メルカプトプリン、ペントスタチン、クロファラビンおよび類縁体）およびピリミジンアンタゴニスト（シタラビン、フロクスウリジン、アザシチジン、テガフール、カルモフール、カペシタビン、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、５－フルオロウラシル（５ＦＵ）、および類縁体）；ナイトロジェンマスタード（例として、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、メクロレタミン、イホスファミド、トロホスファミド、プレドニムスチン、ベンダムスチン、ウラムスチン、エストラムスチン、および類縁体）などのアルキル化剤；ニトロソ尿素（例として、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ホテムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、ストレプトゾシン、および類縁体）；トリアゼン（例として、ダカルバジン、アルトレタミン、テモゾロミド、および類縁体）；スルホン酸アルキル（例として、ブスルファン、マンノスルファン、トレオスルファン、および類縁体）；プロカルバジン；ミトブロニトール、およびアジリジン（例として、カルボコン、トリアジコン、チオＴＥＰＡ、トリエチレンメラミン、および類縁体）；ヒドロキシ尿素、アントラサイクリン（例として、ドキソルビシン製剤、ダウノルビシン、エピルビシンおよび他の誘導体）などの抗生物質；アントラセンジオン（例として、ミトキサントロンおよび類縁体）；ストレプトマイセスファミリー（例として、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシン、プリカマイシン）；および紫外線光。

【0083】

ＩＩＩ．治療における使用のためのキット
本開示はまた、がん（例として、黒色腫、肺がん、大腸がん、または腎細胞がん）に対する免疫療法における使用のための、および／またはがんを処置するもしくはがんのリスクを低減するためのキットを提供する。このようなキットは合成腫瘍溶解性ウイルスを含有する医薬組成物、例として、本明細書に記載のそれらのうちのいずれかを含む１以上の容器を包含し得る。
いくつかの態様において、キットは、本明細書に記載の方法のいずれかに従った使用のための指示を含み得る。例えば、包含される指示は、本明細書に記載のそれらのような標的の疾患の処置のための、発病を遅延させるための、または緩和するための合成腫瘍溶解性ウイルスを含有する組成物の投与の記載を含み得る。キットは、処置に好適な個体を、個体が標的の疾患を有するかどうかを同定することに基づき選択する記載をさらに含んでいてもよい。さらなる他の態様において、指示は、合成腫瘍溶解性ウイルスを含有する組成物を標的の疾患を有するリスクにある個体に投与する記載を含む。

【0084】

合成腫瘍溶解性ウイルスを含有する組成物の使用に関する指示は、一般には、意図される処置についての投薬量、投薬スケジュール、および投与のルートに関する情報を包含する。容器は、単位用量、大量包装（例として、複数回用量の包装）またはサブユニット用量であってもよい。本発明のキットに供給される指示は、典型的には、ラベルまたは添付文書（例として、キット中に包含される紙シート）上に書かれた指示であるが、コンピュータで読み取ることのできる指示（例として、磁気または光学記憶ディスク上に保持された（carried）指示）もまた許容される。
ラベルまたは添付文書は、組成物が、本明細書に記載のそれらなどのがんに関連する疾患または障害を処置するため、発病を遅延させるため、および／または緩和するために使用されることを指し示す。指示は、本明細書に記載の方法のいずれかを実行するために提供されてもよい。

【0085】

本明細書に記載のとおりのキットは、好適なパッケージング中にある。好適なパッケージングは、これらに限定されないが、バイアル、瓶、広口瓶、可撓性パッケージング（例として、密封されたＭｙｌａｒまたはプラスチックバッグ）等を包含する。企図されるものはまた、吸入器、経鼻投与デバイス（例として、アトマイザー）またはミニポンプなどの注入デバイスなどの特定のデバイスと組み合わせた使用のための包装である。キットは、滅菌されたアクセスポート（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通することができるストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってもよい）を有していてもよい。容器はまた、滅菌されたアクセスポート（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通することができるストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってもよい）を有していてもよい。組成物中の少なくとも１の活性剤は、本明細書に記載のそれらのような合成腫瘍溶解性ウイルスを含有する組成物である。
キットは、任意にバッファーなどの追加の構成要素および判断情報を提供してもよい。通常キットは、容器および容器上のまたは容器に伴うラベルまたは添付文書（単数または複数）を含む。いくつかの態様において、本発明は、上に記載のキットの内容物を含む製造の物品を提供する。

【0086】

ＩＶ．一般的な技法
本発明の実施は、他に指し示されない限りは、分子生物学（組換え技法を包含する）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技法を用い、それらは、当該技術分野の技能の範囲内であるだろう。Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)。さらなる詳細化なしに、当業者が、上の記載に基づき、本発明をその最大限に利用することができるということが考えられる。したがって、以下の特定の態様は、単なる実例として解釈されるべきであり、および本開示の残りの部分を何であれ限定するものではない。本明細書に引用されるすべての刊行物は、本明細書に言及される目的または主題のために参照により組み込まれる。

【0087】

さらなる詳細化なしに当業者が、上の記載に基づき、本発明をその最大限に利用することができるということが考えられる。したがって、以下の特定の態様は、単なる実例として解釈されるべきであり、および本開示の残りの部分を何であれ限定するものではない。本明細書に引用されるすべての刊行物は、本明細書に言及される目的または主題のために参照により組み込まれる。

【0088】

例
材料および方法
細胞株および動物
細胞株Ｂ１６Ｆ１０（ATCC（登録商標）CRL-6475（商標））、ＨＥＫ－ｂｌｕｅ－ＴＬＲ２（Invivogen）、ＨＥＫ－ｂｌｕｅ－ＴＬＲ３（Invivogen）、ＨＥＫ－ｂｌｕｅ－ＴＬＲ７（Invivogen）、ＨＥＫ－ｂｌｕｅ－ＴＬＲ９（Invivogen）、およびＲａｗ－Ｌｕｃｉａ ＩＳＧ（Invivogen）を、業者の指示（３７℃、５％ＣＯ_２）に従って培養した。６～８週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ＪＡＸ品番０００６６４）マウスを購入し、マサチューセッツ工科大学（ＭＩＴ）の動物施設において維持した。すべての動物研究および手順を、ＭＩＴの動物保護の委員会（Committee of Animal Care）によるＩＡＣＵＣ承認の動物プロトコル下の連邦、州、地域のガイドラインに従って実行した。

【0089】

抗体、染色、およびＦＡＣＳ分析
マウスＬｙ６ｃ（ＨＫ１．４）、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）、Ｆ４／８０（ＢＭ８）、ＭＨＣ－ＩＩ（Ｍ５／１１４．１５．２）、ＣＤ４５（３０－Ｆ１１）、ＣＤ３（１７Ａ２）、ＣＤ４（ＧＫ１．５）、ＣＤ８（５３－６．７）、ＮＫ１．１（ＰＫ１３６）、ＣＤ４５．２（１０４）、ＣＤ２４（３０－Ｆ１）、ＸＣＲ１（ＺＥＴ）、ＣＤ６４（Ｘ５４－５／７．１）に対する抗体は、Biolegendからのものであった。マウスＬｙ６Ｇ（１Ａ８）、ＣＤ１６／３２（２．４Ｇ２）およびＣＤ１０３（Ｍ２９０）に対する抗体は、BD Biosciencesからのものであった。マウスカルレティキュリン（ａｂ２９０７）に対する抗体は、Abcamからのものであった。live/dead色素（Ｌ３４９６６）は、ThermoFisherからのものであった。

【0090】

Ｂ１６Ｆ１０黒色腫担癌マウスを、ＭＩＴの動物保護の委員会によるＩＡＣＵＣ承認の動物プロトコル下の連邦、州、地域のガイドラインに従って屠殺し、および剖検した。次いで、腫瘍排出リンパ節を細かく砕き、および腫瘍を薄く切り、ならびに単細胞懸濁液のためにコラゲナーゼＩＶによって（１ｍｇ／ｍｌ）１時間消化した。単細胞懸濁液を、７０μｍのナイロンコンストレイナー（nylon constrainer）により濾過し、および記載されるとおりに染色した¹⁰。
染色した試料を、BD BiosciencesからのＦＡＣＳアナライザー（LSR-IIまたはLSR-II-Fortessa）にて分析した。BD-LSRII Fortessaアナライザー上で分析した。すべてのフローサイトメトリーのデータを、FlowJo（Flowjo LLC）にて分析し、およびGraphPad Prismを使用してプロットを用意した。

【0091】

コンストラクト、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ転写、レプリコンＲＮＡについてのキャッピング／メチル化、およびＮｅｏｎトランスフェクション
突然変異体レプリコンコンストラクトの主鎖は、先の研究（改訂中）におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでの進展からのものであった。IL12-MSAおよびIL12-MSA-ルミカンを、Prof. Dane Wittrup Labからのプラスミドから増幅し、および突然変異体レプリコンのサブゲノム領域において改変した。
レプリコンＲＮＡを、製造業者の指示に従ってMEGAscript（商標） T7 Transcription Kit（ThermoFisher）を使用して、上記の直線化されたＶＥＥコンストラクトの鋳型からｉｎ ｖｉｔｒｏで転写した（ＩＶＴ）。結果として得られたレプリコンＲＮＡを、ScriptCap（商標） m7G Capping SystemおよびScriptCap（商標）2'-O-Methyltransferase Kit（Cellscript）を製造業者の指示に従って使用して、キャッピングおよびメチル化した。ＲＮＡ純度を、ゲル電気泳動によって査定した。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションを、ＮＥＯＮエレクトロポレーションキット（ThermoFisher）のＲバッファー１００μｌ中５００，０００細胞あたり５μｇのＲＮＡを使用して、１２００ボルト数、２０ミリ秒、および１パルスの条件で実行した。

【0092】

脂質ナノ粒子の製剤化およびレプリコンＲＮＡのカプセル封入
ＤＯＴＡＰナノ粒子内に１０μｇのレプリコンＲＮＡをカプセル封入するために、４０：１０：４８：２のモル比における１６．９３７５μｌのＤＯＴＡＰ（Avanti、Cat#890890、１０ｍｇ／ｍｌ）、１５．９６５μｌのＤＳＰＣ（Avanti、Cat#850365、３ｍｇ／ｍｌ）、１８．７６７５μｌのコレステロール（Sigma-Aldrich、Cat#C8667、６ｍｇ／ｍｌ）、１３．６μｌのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００（Avanti Cat#880128、２．５ｍｇ／ｍｌ）から構成される脂質混合物を、エタノール中で調製し、およびＮ_２下で初期の総体積の３分の１が残存するまで蒸発させた。次いで１１．８μｌの０．１Ｍクエン酸塩バッファー（ＰＨ６．０）中の１０μｇのレプリコンＲＮＡ（１ｍｇ／ｍｌ）を、ピペッティングで添加し、これに続きピペッティングで追加の２２μｌの０．１Ｍクエン酸塩バッファー（ＰＨ６．０）で第２の添加を行った。混合物を、１時間振とうし、および次いで３，５００ＭＷＣＯ透析カセットにおいて２５℃でさらに１時間ＰＢＳに対して透析した。

【0093】

リポフェクタミンナノ粒子内へのレプリコンＲＮＡのカプセル封入は、Lipofectamine（商標） MessengerMAX（商標）トランスフェクション試薬(thermofisher.com/order/catalog/product/LMRNA008)の指示に従った。
ＴＴ３ナノ粒子内に１０μｇのレプリコンＲＮＡをカプセル封入するために、２０：３０：４０：０．７５のモル比における１０μｌのＴＴ３（１０ｍｇ／ｍｌ）^１１、８．０４μｌのＤＯＰＥ（Avanti、Cat#850725、１０ｍｇ／ｍｌ）、５．５７２μｌのコレステロール（Sigma-Aldrich、Cat#C8667、１０ｍｇ／ｍｌ）、３．４５２μｌのＣ１４－ＰＥＧ２０００（Avanti Cat# 880150、２ｍｇ／ｍｌ）から構成される脂質混合物を、１０．４３７μｌのエタノール中で調製した。混合物に４．１６７μｌのクエン酸塩バッファー（ＰＨ３．０、１０ｍＭ）を添加した。次いで３１．６６７μｌのクエン酸塩バッファー（ＰＨ３．０、１０ｍＭ）中の１０μｇのレプリコンＲＮＡ（１ｍｇ／ｍｌ）を、ピペッティングで添加した。混合物を、３，５００ＭＷＣＯ透析カセットにおいて、２５℃で８０分間ＰＢＳに対して透析した。
その結果得られるレプリコンを積載した脂質ナノ粒子を、腫瘍内注射についての適切な投薬量（１０μｇ／マウス）で、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのトランスフェクションのために（５００μｌの培地中で５μｇ／５０万細胞）画分した。

【0094】

アネキシンＶ／ＰＩ染色、ＡＴＰアッセイ、およびＥｌｉｓａ
アネキシンＶ／ＰＩ染色は、Biolegendからのキット（Cat#640932）の指示に従う。細胞外ＡＴＰを、ENLITEN（登録商標） ATP Assay System（Promega）によってアッセイした。ＨＭＧＢ１、ＣＣＬ５、ＩＦＮα２、ＩＬ１２、ＩＦＮγを、Chondrex （Cat#6010、ＨＭＧＢ１）、R & D System（Cat#DY478、ＣＣＬ５）、Abcam （Cat#ab215409、ＩＦＮα２）、およびBiolegend（Cat#88-7121-88、ＩＬ１２、Cat#88-7314-88、ＩＦＮγ）からのＥＬＩＳＡキットによって測定し、およびそれらの取扱説明書に従った。

【0095】

ＲＮＡ抽出および定量的ＰＣＲ分析
ＲＮＡ転写産物のレベルを定量するために、全ＲＮＡを、指し示されるようにＬＮＰ－レプリコンＲＮＡでトランスフェクトした細胞又は腫瘍から抽出し、およびTaqMan（商標）Reverse Transcription Reagents Kit（ABI Catalog No. N8080234）によって逆転写し、Sybr Green Master Mix（Roche）およびＳｔａｔ１（Cat#MP215434）、Ｓｔａｔ２（Cat#MP215434）、ＩＲＦ９（Cat#MP206708）、ＩＲＦ３（Cat#MP206702）、ｃＧＡＳ（Cat#MP214711）についての特異的プライマーを用いての増幅が続き、およびRoche LightCycler 480によって検出された。Ｃｔ値を、比較のためにハウスキープイング遺伝子マウスアクチンＢを用いて正規化した。

【0096】

例１：がん免疫治療のための合成オールインワン（All in One）ＬＮＰレプリコンＲＮＡ
脂質およびＲＮＡ構成要素の夫々が、以下の複数の役割を果たす、レプリコンＲＮＡをカプセル封入した合成多機能脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）によって、治療プロセスを単純化し、および治療効果を増幅し得る：ＲＮＡの細胞取り込み／細胞質ゾルの送達の両方を促進する一方で、免疫原性細胞死を直接引き起こすこともまたする脂質製剤。並行して、このＬＮＰは、免疫調節性治療用タンパク質をコードし、および免疫賦活の増幅とこれに続く免疫応答を直接提供する自己増幅レプリコンＲＮＡを送達する。機能的には、この合成ＬＮＰレプリコンＲＮＡは、腫瘍における局所の免疫原性細胞死を誘導し、およびトランスフェクトされた細胞において免疫調節性もまた当然に発現させる。免疫原性細胞死は、免疫細胞による腫瘍浸潤を増強し、および交差提示されることで新たなＴ細胞応答を準備し得る腫瘍特異的抗原のリザーバを提供し得る。カチオン性脂質ＴＴ３を含有するＬＮＰ製剤は、これらの目標にとくに適しているものとして同定された：ＤＯＴＡＰ、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏ）またはＴＴ３の鍵となるカチオン性脂質を夫々含む、３つのカチオン性脂質ナノ粒子を比較した。ＲＮＡカーゴとして、構造タンパク質が、サブゲノムのプロモーター下に挿入された目的のカーゴ遺伝子によって置き換えられた、ベネズエラウマ脳炎ウイルスに由来するアルファウイルスレプリコンを用いた。この自己増幅レプリコンＲＮＡ（ＬＮＰ－ｍｔＲｅｐ）と共に製剤化するとき、ＤＯＴＡＰ、ｌｉｐｏ、およびＴＴ３脂質製剤は、夫々９７、４６、および１０５ｎｍのナノ粒子の平均直径を有し、＋２２．９、－６．７、および＋４．３ｍｖのゼータ電位を有する粒子を形成した（図１Ｇ～１Ｈ）。

【0097】

「空の」対ＲＮＡを積載した（ｍｔＲｅｐ）ＬＮＰの毒性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの各製剤とＢ１６Ｆ１０黒色腫の腫瘍細胞をインキュベートすることによって査定した。このアッセイは、ＴＴ３ ＬＮＰで処置した細胞について生存率が有意に減少し、およびｍｔＲｅｐが、ＴＴ３に相乗効果を与え、トランスフェクション３日後にさらに腫瘍細胞を殺傷するのを促進することを明らかにした（図１Ａ）。ＴＴ３ ＬＮＰは、腫瘍細胞死を促進することにおいて、ＤＯＴＡＰまたはＬｉｐｏよりも効果的であった。注目すべきことに、レプリコンの腫瘍細胞内への直接的な電気穿孔は、相対的に非毒性であり、ＬＮＰ送達によって細胞を殺傷することが促進されたことが指し示された。ＴＴ３ ＬＮＰで送達されたレプリコンが、細胞死に先立ちカーゴ遺伝子の発現を駆動し得るか否かを決定するために、我々はＬＮＰ（ｍｔＲｅｐ）処置に続く、レポーター遺伝子ＧＦＰの発現を評価した。ＴＴ３－ｍｔＲｅｐ処置は、約３５．４％のＢ１６Ｆ１０細胞がトランスフェクションの１２時間後にＧＦＰを発現するのを導き、このことは電気穿孔（約９０％）よりも低かったが、ＤＯＴＡＰ－ｍｔＲｅｐ（約０．０５％）またはＬｉｐｏ－ｍｔＲｅｐ（約７．６％）の処置よりも有意によかった（図１Ｂ）。図１Ａと一致して、ＴＴ３ナノ粒子でトランスフェクトされた細胞は、アネキシンＶ＋／ＰＩ＋死細胞の大集団を示し、およびｍｔＲｅｐは再びこの細胞死に相乗効果を与えた（図１Ｃ）。

【0098】

ＴＴ３（ｍｔＲｅｐ）によって引き起こされる細胞死が、免疫原性細胞死（ＩＣＤ）の一種であるかどうかを決定するために、一般に小胞体（ＥＲ）上にとどまり、およびＩＣＤ１の間にイートミー（eat-me）シグナルとして細胞表面に輸送される、カルレティキュリン（ＣＲＴ）を測定した。ＴＴ３およびｍｔＲｅｐは、相乗効果を与えて、ＣＲＴが細胞表面へ輸送されるのを促進した（図１Ｄ）。細胞外ＡＴＰは、ＮＬＲＰ３インフラマソーム２を活性化し、および細胞外ＨＭＧＢ１は、ＩＣＤの間の炎症３を媒介する。ＴＴ３、ＴＴ３－ｍｔＲｅｐ、およびＴＴ３－ｄｅＲｅｐは、ＡＴＰおよびＨＭＧＢ１の放出を効果的に誘導した。（図１Ｅおよび１Ｆ）。それをまとめると、ＴＴ３－ｍｔＲｅｐＲＮＡは、免疫原性細胞死を誘導しながら、レプリコンによってコードされるカーゴ遺伝子の一過的な発現もまた導き得る、有望な腫瘍溶解性製剤である。

【0099】

例２：レプリコンＲＮＡは、ＴＬＲ３シグナル伝達を引き起こし、および壊死性細胞死に関係するＩＳＧＦ３複合体を誘導する
レプリコンおよびＴＴ３ＬＮＰによる細胞死の相乗作用に内在する機序を決定するために、レポーター遺伝子をコードするカプセル封入されたｍｔＲｅｐの有無にかかわらず（または機能的遺伝子の発現を欠く突然変異体「不活性型」レプリコン（ｄｅＲｅｐ）をカプセル封入した）、ＤＯＴＡＰ、Ｌｉｐｏ、またはＴＴ３ナノ粒子を、レポーター細胞ＨＥＫ－ＴＬＲ２、ＨＥＫ－ＴＬＲ３、ＨＥＫ－ＴＬＲ７、またはＨＥＫ－ＴＬＲ９（invivogen.com）内にトランスフェクトした。ｍｔＲｅｐまたはｄｅＲｅｐを保有するＬｉｐｏおよびＴＴ３の両方のＬＮＰがＴＬＲ３シグナル伝達を活性化したが、他のいずれの試験されたＴＬＲも刺激しなかった（図２Ａ～Ｄ）。Raw-Lucia-ISGレポーター細胞（invivogen.com）上で試験したとき、インターフェロン刺激遺伝子（interferon stimulated gene）を、これらの同じLNP製剤によって有意に誘導した（図２Ｅ）。これらのデータは、ＴＬＲ３が、レプリコンＲＮＡを認識し、およびＬＮＰ媒介性送達に応じてインターフェロン応答を誘導することを示唆する。

【0100】

レプリコンＲＮＡが、壊死性細胞死のためのＩＳＧＦ３（Ｓｔａｔ１／Ｓｔａｔ２／ＩＲＦ９）複合体の活性化^５を導く、Ｉ型インターフェロン産生についてのＴＲＩＦを通してＴＬＲ３シグナル伝達を活性化する^４ために、我々は、ＩＳＧＦ３複合体の構成要素である、Ｓｔａｔ１、Ｓｔａｔ２、およびＩＲＦ９、ならびにＳＴＩＮＧ経路遺伝子である、ＩＲＦ３およびｃＧＡＳのｍＲＮＡ転写産物レベルをｑＰＣＲによりアッセイした。ｍｔＲｅｐまたはｄｅＲｅｐをカプセル封入したＴＴ３ナノ粒子は、非処置の対照に対して、Ｓｔａｔ１、Ｓｔａｔ２、ＩＲＦ９のレベルを、夫々約６倍、約１６倍、約３倍増大させた（図２Ｆ－Ｈ）。対照的に、ＩＲＦ３またはｃＧＡＳの転写に対しては効果を有さなかった（図２Ｉ－Ｊ）。ＤＯＴＡＰおよびＬｉｐｏ製剤は、おそらくはこれらのナノ粒子によるレプリコンＲＮＡの低いトランスフェクション効率のために、ＩＳＧＦ３複合体を誘導し損なった（図１Ｂ）。これらのデータは、ｍｔＲｅｐおよびｄｅＲｅｐがおそらくはＴＬＲ３シグナル伝達を活性化させ、およびＩＳＧＦ３複合体を誘導し、免疫原性細胞死の一種である、壊死性細胞死を促進することを示唆した。

【0101】

例３：ＴＴ３－ｍｔＲｅｐは、免疫細胞をリクルートし、および確立した腫瘍を消失させる
ＴＴ３－ｍｔＲｅｐが、免疫原性細胞死およびカーゴ遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏでの発現に対する効果を有するか否かが目的となった。壊死性細胞死に対する応答に関連する^６、Ｌｙ６ｃ^ｌｏＬｙ６Ｇ^＋顆粒球の集団の絶対数を、野生型レプリコンＲＮＡ（ｗｔＲｅｐ）、別の突然変異体レプリコンＲＮＡ（ｍｔ２Ｒｅｐ）、および上で使用した突然変異体レプリコン（ｍｔＲｅｐ）をカプセル封入したＴＴ３ナノ粒子の腫瘍内注射３日後の腫瘍において測定した。予想外のことに、ｍｔＲｅｐは、この顆粒球の集団の腫瘍への有意に大きな動員（約２倍高く）（図３Ａ）、およびサブゲノムのプロモーターによってコードされるよりよい発現（図３Ｂ）を示した。よって、ＴＴ３－ｍｔＲｅｐは、適切なカーゴ遺伝子の発現と共に免疫原性細胞死をを誘導する。ＴＴ３－ｍｔＲｅｐを使用したｉｎ ｖｉｖｏでの研究が、続いて実行された。

【0102】

レプリコンの腫瘍内ＬＮＰ送達に続く、Ｓｔａｔ１／Ｓｔａｔ２／ＩＲＦ９ならびにＳＴＩＮＧシグナル伝達遺伝子ＩＲＦ３およびｃＧＡＳのｉｎ ｖｉｖｏでの発現レベルを測定した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの図２Ｆ～Ｊと一致して、ＴＴ３－ｍｔＲｅｐを注入した腫瘍は、Ｓｔａｔ１／Ｓｔａｔ２／ＩＲＦ９（ＩＳＧＦ３複合体）を有意に高く発現したが、ＩＲＦ３およびｃＧＡＳは同等のレベルの発現であり（図３Ｃ）、このことはＴＴ３－ｍｔＲｅｐの投与がまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの壊死性細胞死を開始したことを示唆した。

【0103】

腫瘍中の免疫組成物へのＴＴ３－ｍｔＲｅｐの効果をよりよく理解するために、顆粒球（ＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６ｃ^ｌｏＬｙ６Ｇ^＋）、Ｍ－ＭＤＳＣ（ＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６ｃ^ｈｉＬｙ６Ｇ^＋）、単球（Ｄ４５^＋ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６ｃ^ｌｏＬｙ６Ｇ^－）、マクロファージ（ＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６ｃ^－Ｌｙ６Ｇ^－Ｆ４／８０^＋）、ＣＤ４ Ｔ（ＣＤ４５^＋ＣＤ３ε^＋ＣＤ４^＋）、ＣＤ８ Ｔ（ＣＤ４５^＋ＣＤ３ε^＋ＣＤ８^＋）、ＮＫ（ＣＤ４５^＋ＣＤ３ε^－ＮＫ１．１^＋）、ＮＫＴ（ＣＤ４５^＋ＣＤ３ε^＋ＮＫ１．１^＋）、従来型ＤＣ１（ｃＤＣ１、ＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＭＨＣ－ＩＩ^＋ＣＤ２４^＋ＣＤ６４^－ＣＤ１０３^＋ＣＤ１１ｂ^－ＸＣＲ１^ｈｉ）、および従来型ＤＣ２（ｃＤＣ２、ＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＭＨＣ－ＩＩ^＋ＣＤ２４^＋ＣＤ６４^－ＣＤ１０３^＋ＣＤ１１ｂ^＋ＸＣＲ１^ｌｏ）などの免疫細胞をマッピングして、およびＬＮＰ－レプリコンＲＮＡの１回の注射後１日目（図３Ｄ）および３日目（図３Ｅ）の、ならびに３回の逐次的な注射後１日目（図３Ｆ）の腫瘍において定量化した。腫瘍中の免疫組成物のこの動的分析において、顆粒球およびｃＤＣ１は、レプリコンＲＮＡの注射後１日目に夫々急速にリクルートされ、減少し（図３Ｃ）、このことは顆粒球が、初期の事象であり、およびｃＤＣ１がＬＮＰ－レプリコンＲＮＡに応じて腫瘍排出リンパ節への輸送をおそらく始めるであろうことを示唆した。レプリコンＲＮＡの注射後３日目で、ＣＤ４ Ｔ、ＣＤ８ Ｔ、ＮＫ、およびＮＫＴ細胞をまた、リクルートした（図３Ｄ）。

【0104】

ＬＮＰ－レプリコンＲＮＡの３回の逐次的な注射を投与したとき、単球は増大し、およびマクロファージは減少したが、ＣＤ４ Ｔ、ＮＫ、およびＮＫＴ細胞などのリンパ球様細胞において有意な変化はそれほど観察されなかった（図３Ｅ）。これらの約３回の逐次的な注射の効果として、ＴＴ３－ｍｔＲｅｐ群の試料における、約１０％多い細胞死（図３Ｆ）、約４倍高い腫瘍に浸潤する免疫細胞（図３Ｇ）、および腫瘍重量における２倍の低減（図３Ｈ）があり、腫瘍成長の有意な退行を結果としてもたらした（図３Ｉ）。ＮＫ、およびＮＫＴ細胞がＴＴ３－ｍｔＲｅｐの処置と連動して上昇するのと一致して、ＣＣＬ５の発現が、有意に誘導され（図３Ｉ）、それは、主にＮＫによって分泌され^７、およびＣＤ８ Ｔ細胞を活性化した（rstats.immgen.org/Skyline/skyline.html）。これらのデータは、ＴＴ３－ｍｔＲｅｐが、図１および図２のｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて観察されるように、カーゴ遺伝子の発現と共に腫瘍における免疫原性細胞死を誘導したことを指し示す。最も重要なことに、ＴＴ３－ｍｔＲｅｐは、腫瘍微小環境を有意に調節し、およびＣＤ８ Ｔ細胞およびＮＫ細胞の腫瘍動員につながった。

【0105】

例４：ＩＬ１２－ＭＳＡまたはＩＬ１２－ＭＳＡ－ルミカンと共にコードするＴＴ３－ｍｔＲｅｐは、腫瘍微小環境および免疫組成を効果的に調節する
レポーター遺伝子をコードするＴＴ３（ｍｔＲｅｐ）の腫瘍内注射は、腫瘍成長の遅延につながった一方で、レプリコン中に免疫調節性タンパク質をコードすることは、さらなる免疫賦活および抗腫瘍免疫の増強へつながり得る。魅力的な候補は、ＣＤ４ ＴヘルパーをＴｈ１に分化させ、およびＮＫおよびＣＤ８Ｔ細胞の細胞障害性効果を増強させ得る、ＩＬ－１２である^８。ＩＬ１２ｂまたはＩＬ１２ｐ４０としてもまた名付けられた、ＩＬ１２のサブユニットの１つは、主に抗原提示細胞（ＣＤ８^＋ ＤＣ）から分泌され（rstats.immgen.org/Skyline/skyline.html）、それはＩ型インターフェロンによって機能的に活性化され得る^９。しかしながら、Ｉ型インターフェロンの主な形態である、インターフェロンα２（ＩＦＮα２）は、ＴＴ３－ｍｔＲｅｐ注射後１日目および３日目で、血清中（図４Ａ）または腫瘍中（図４Ｂ）のいずれかで低く、このことはＤＣによって分泌されたＩＬ－１２が、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）中で低いままであるだろうことを示唆している。よって、ＩＬ１２α（Ｐ３０）、ＩＬ１２β（Ｐ４０）とマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）、またはＭＳＡおよびルミカンを融合させた、ＩＬ１２－ＭＳＡまたはＩＬ１２－ＭＳＡ－ルミカンを設計した。ルミカンは、内在性のコラーゲン結合タンパク質であり、我々は、それについて発現したＩＬ－１２のＴＭＥ中での保持を促進し、レプリコン療法の有効性および安全性を増強すると推論した。レプリコンコンストラクトを、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＮＥＯＮトランスフェクションによってＢ１６Ｆ１０細胞内にトランスフェクトし、および我々は、これらのトランスフェクトされた細胞におけるＩＬ－１２の分泌を、ＥＬＩＳＡによって確証した（図４Ｃ）。

【0106】

一貫して、ＩＬ１２－ＭＳＡ（ＴＴ３－ｍｔＲｅｐ－ＩＬ１２－ＭＳＡ）またはＩＬ１２－ＭＳＡ－ルミカン（ＴＴ３－ｍｔＲｅｐ－ＩＬ１２－ＭＳＡ－ルミカン）をコードするＴＴ３－ｍｔＲｅｐで注射した腫瘍は、高いレベルのＩＬ１２をｉｎ ｖｉｖｏで発現し、腫瘍において４０ｎｇ／ｍｇに到達した（図４Ｄ）。注射１日後の腫瘍における免疫組成を比較して、顆粒球は、レポーター遺伝子ｍＣｈｅｒｒｙでコードするＴＴ３－ｍｔＲｅｐで処置した群とは対照的に、ＩＬ１２－ＭＳＡおよびＩＬ１２－ＭＳＡ－ルミカンを発現するＴＴ３－ｍｔＲｅｐで処置した腫瘍において１．５～３倍増大した（図４Ｅ）。３日目に、ＩＬ１２－ＭＳＡおよびＩＬ１２－ＭＳＡ－ルミカン群は、無関係のレポーター遺伝子をコードするレプリコンと比較して、約２～３倍高い顆粒球、ＣＤ８ Ｔ細胞、およびｃＤＣ２細胞を腫瘍にリクルートした（図４Ｆ）。興味深いことに、レポーター遺伝子、ＩＬ１２－ＭＳＡ、またはＩＬ１２－ＭＳＡ－ルミカンをコードするＴＴ３－ｍｔＲｅｐで処置された腫瘍すべてにおいて、非処置群と比較してｃＤＣ１細胞の減少を示した（図４Ｅ～４Ｆ）。ｃＤＣ１が、ＴＤＬＮに輸送されるかを決定するために、我々は、それにおけるｃＤＣ１細胞を数えて、およびたとえどのカーゴ遺伝子をエンコードしていても、ＴＴ３－ｍｔＲｅｐ処置後にリンパ節中のｃＤＣ１細胞が有意に増加したことを示した（図４Ｇ）。ｃＤＣ１細胞の増加は、ＩＬ１２－ＭＳＡ群において継続した（図４Ｇ）。

【0107】

例５：ＴＴ３－ｍｔＲｅｐによって誘導された免疫調節性ＩＬ１２およびＩＣＤは、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を効果的に根絶する
ＩＬ１２タンパク質を投与することが、臨床研究において、重度の副作用を有するために、レプリコンにコードされたＩＬ－１２で処置した腫瘍を有するマウスの体重変化を測定した。ｍｔＲｅｐ－ＩＬ１２－ＭＳＡ群は、一週間続いた約５％の身体の喪失を有した。対照的に、ｍｔＲｅｐおよびｍｔＲｅｐ－ＩＬ１２－ＭＳＡ－ルミカン群は、約２％の身体の喪失のみ有し、および数日中に回復した（図５Ａ）。一貫して、我々は、ｍｔＲｅｐ－ＩＬ１２－ＭＳＡまたはｍｔＲｅｐ－ＩＬ１２－ＭＳＡ－ルミカンの注射後１日目または３日目の血清中のＩＬ－６またはＴＮＦαを測定しそこなった（データを示さず）。しかし、我々は、ｍｔＲｅｐ－ＩＬ１２－ＭＳＡの群においては血清中のＩＦＮ－γの有意な増加を観察し（図５Ｂ）、図５Ａにおける身体の喪失と一致した。興味深いことに、ＩＬ１２－ＭＳＡまたはＩＬ１２－ＭＳＡ－ルミカンを発現するレプリコンは、処置時のサイズで５０ｍｍ^２ある大きく確立した腫瘍であっても、劇的に腫瘍退縮を示した（図５Ｃ）。ＩＬ１２－ＭＳＡおよびＩＬ１２－ＭＳＡ－ルミカンをコードするＴＴ３－ｍｔＲｅｐで処置された腫瘍を有するマウスは、Ｂ１６Ｆ１０の注射後７５日で、夫々６０％および８０％腫瘍がなくなった。これらの治療されたマウスが、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍の再発を予防する全身性の免疫応答を引き出すかを決定するために、これらのマウスには、反対側の脇腹に１０万個のＢ１６Ｆ１０細胞で免疫付与した。予想どおり、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を急速に発生させたナイーブマウスと比較して、治療されたマウスはすべて、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を拒絶した。これらのデータは、免疫調節性ＩＬ１２とＩＣＤ（免疫原性細胞死）との相乗作用が、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を効果的に根絶し、および全身性の免疫応答を誘導して、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍の再発を予防し得ることを指し示す。

【0108】

参照文献：

【表2-1】

【表2-2】

【0109】

他の態様
本明細書に開示されているすべての特色は、任意の組み合わせにおいて組み合わされてもよい。本明細書に開示されている各特色は、同じ、同等の、または同様の目的を果たす代替の特色によって置き換えられてもよい。よって、特に明記しない限り、開示されている各特色は、同等または同様の特色の一般的なシリーズの例に過ぎない。
上記の説明からは、当業者は、本発明の不可欠な特徴を容易に確認することができ、およびその趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な使用法および条件に適合させるために、本発明の様々な変更および改変を行うことができる。よって、他の態様もまた、特許請求の範囲内にある。

【0110】

均等物
いくつかの発明の態様を本明細書において、説明し、例証したが、当業者は、本明細書において説明した機能を実施するための、および／または本明細書において説明した結果および／または１以上の利点を得るための様々な他の手段および／または構造を容易に想起し、およびこのような変化および／または改変の各々は、本明細書に記載の発明の態様の範囲内にあるとみなされるであろう。より一般的に、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成は、例示であることを意味し、および実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成は、本発明の教示が使用される特定の適用（単数または複数）に依存するだろうことを、当業者は容易に理解するだろう。当業者は、わずかルーチンの実験法を使用するだけで、本明細書に記載の特定の発明の態様に対する多くの均等物を認識し、または確認することができるだろう。したがって、上記の態様は、ほんの一例として提示されており、および添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、発明の態様は、具体的に記載され、および請求されたものとは別の方法で実践されてもよいことを理解されるべきである。本開示の発明の態様は、本明細書に記載の個々の特色、システム、物品、材料、キット、および／または方法のそれぞれに向けられている。加えて、２以上のこのような特色、システム、物品、材料、キット、および／または方法の２以上のいずれかの組み合わせ、このような特色、システム、物品、材料、キット、および／または方法が、相互に矛盾しない場合は、本開示の発明の範囲内に包含される。

【0111】

本明細書において定義され、および使用されるすべての定義は、辞書の定義、参照によって組み込まれる文書における定義、および／または定義される用語の通常の意味の上位として支配することを理解されるべきである。
本明細書に開示の全ての参照文献、特許および特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して参照により組み込まれ、いくつかのケースにおいては、文書の全体が包含されていてもよい。

【0112】

本明細書および特許請求の範囲において使用されるとき、不定冠詞「a」および「an」は、明確に反対の指示がない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解されるべきである。
本明細書および特許請求の範囲において使用されるとき、句「and/or」は、そのように結合された要素の「いずれかまたは両方」を意味する、すなわち、要素は、あるケースにおいては結合的に存在し、および他のケースにおいては離接的に存在することを理解されるべきである。「and/or」で列挙された複数の要素は、同じ様式で、すなわち、そのように結合された要素の「１以上」と解釈されるべきである。他の要素として、「and/or」節によって具体的に特定された要素以外が、具体的に特定されたそれらの要素に関係するか、または無関係であるかに関わらず、任意に存在していてもよい。よって、非限定例として、「含む（comprising）」などのオープンエンド（open-ended）の語と併せて使用されるとき、「Aおよび／またはB」という言及は、一態様において、Ａのみ（任意にＢ以外の要素を包含する）を；別の態様においては、Ｂのみ（任意にＡ以外の要素を包含する）を；さらに別の態様においては、ＡおよびＢの両方（任意に他の要素を包含する）；等々を指し得る。

【0113】

本明細書および特許請求の範囲に使用されるとき、「or」は、上に定義されるとおりの「and/or」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト中の項目が分けられているとき、「or」または「and/or」は、包括的である、すなわち、数またはリストの要素のうち、少なくとも１つの包含のみでなく、１より多くを包含し、および、任意に、追加のリストされていない項目も包含すると解釈されるべきである。「１つのみの（only one of）」または「正確に１つの（exactly one of）」または、特許請求の範囲で使用されるときに、「からなる（consisting of）」など、それとは反対を明確に指し示す用語のみが、数あまたはリストの要素のうち、正確に１つの要素を包含することを指すだろう。一般に、本明細書に使用される用語「or」は、「いずれか（either）」、「のうちの１つ（one of）」、「のうちの１つのみ（only one of）」または「のうちの正確に１つ（exactly one of）」などの排他的な用語によって前置きされるときのみ、排他的な代替手段（すなわち、「一方または他方であり、両方ではない」）を指し示すと解釈されるべきである。特許請求の範囲において使用されるとき、「本質的にからなる（Consisting essentially of）」は、特許法の分野において使用される通常の意味を有するべきである。

【0114】

本明細書および特許請求の範囲において使用されるとき、１以上の要素のリストと関連した句「少なくとも１つの（at least one）」は、リストの要素におけるいずれか１以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、必ずしも要素のリスト内に具体的に列挙されたそれぞれの、およびすべての要素の少なくとも１つを包含するのではなく、および要素のリスト中の要素のいずれかの組み合わせを除外するものではないことを理解されるべきである。この定義はまた、句「少なくとも１つ（at least one）」が指す、要素のリスト内に具体的に特定された要素以外の要素が、具体的に特定されたそれらの要素に関係するか、または無関係であるかに関わらず、任意に存在させることができる。よって、非限定例として、「ＡおよびＢのうち少なくとも１つ」（または同等に、「ＡまたはＢのうち少なくとも１つ」もしくは同等に、「Ａおよび／またはＢのうち少なくとも１つ」）は、一態様において、Ｂが存在せず、任意に１より多くのＡを包含するうちの少なくとも１つ（および任意にＢ以外の要素を包含する）；別の態様において、Ａが存在せず、少なくとも１の、任意に１より多くのＢを包含するうちの少なくとも１つ（および任意にＡ以外の要素を包含する）；さらに別の態様において、任意に１より多くのＡを包含するうちの少なくとも１つ、および任意に１より多くのＢを包含するうちの少なくとも１つ（および任意に他の要素を包含する）；等々を指し得る。

【0115】

明確に反対の指示がない限り、１より多いステップまたは行為を包含する、本明細書において請求されたいずれかの方法において、方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも方法のステップまたは行為が、列挙される順序に限定されるものではないことを理解されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

0007561134000001.app