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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-25
(45)【発行日】2024-10-03
(54)【発明の名称】ＦＬＴ３に対するキメラ受容体及びその使用方法
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20240926BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240926BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240926BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240926BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20240926BHJP
C07K 14/725 20060101ALI20240926BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240926BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240926BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240926BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240926BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240926BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
C07K16/28
C12P21/08
C12N15/13
C07K14/705
C07K14/725
C12N15/12
C12N15/62 Z
A61P35/02
A61K47/68
A61K39/395 D
A61K39/395 N
【請求項の数】
15
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022035975
(22)【出願日】2022-03-09
(62)【分割の表示】P 2018551409の分割
【原出願日】2017-03-31
(65)【公開番号】P2022091793
(43)【公開日】2022-06-21
【審査請求日】2022-04-07
(31)【優先権主張番号】62/317,219
(32)【優先日】2016-04-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】500049716
【氏名又は名称】アムジエン・インコーポレーテツド
(73)【特許権者】
【識別番号】514266932
【氏名又は名称】カイト ファーマ インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｋｉｔｅ Ｐｈａｒｍａ， Ｉｎｃ
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】アリス・バッカー
(72)【発明者】
【氏名】ローレン・ウー
(72)【発明者】
【氏名】タラ・アルベドソン
(72)【発明者】
【氏名】ジェッド・ジェイ・ウィルツィウス
(72)【発明者】
【氏名】ルーベン・アルバレス・ロドリゲス
【審査官】福澤 洋光
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／０１６８５９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１５／１４２６７５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２００４／００４３４０１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Blood，2004年，Vol.104, No.4，pp.1137-1144
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（Ｉ）ＦＬＴ３に特異的に結合する抗原結合分子、ここで、前記抗原結合分子は、（ｉ）（ａ）それぞれ、配列番号１７、１８及び１９のアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ１～３、並びに配列番号２２、２３及び２４のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ１～３、
（ｂ）それぞれ、配列番号９７、３５及び３６のアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ１～３、並びに配列番号３８、３９及び４０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ１～３、
（ｃ）それぞれ、配列番号１７、２６及び２７のアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ１～３、並びに配列番号３０、３１及び３２のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ１～３、
（ｄ）それぞれ、配列番号４３、４４及び４５のアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ１～３、並びに配列番号４８、４９及び５０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ１～３、若しくは
（ｅ）それぞれ、配列番号５３、５４及び５５のアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ１～３、並びに配列番号５８、５９及び６０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ１～３、
又は
（ｉｉ）（ａ)配列番号１６のＶＨ領域及び配列番号２１のＶＬ領域、
（ｂ）配列番号３４のＶＨ領域及び配列番号４１のＶＬ領域、
（ｃ）配列番号９９のＶＨ領域及び配列番号２９のＶＬ領域、
（ｄ）配列番号４２のＶＨ領域及び配列番号４７のＶＬ領域、及び
（ｅ）配列番号５２のＶＨ領域及び配列番号５７のＶＬ領域、
のいずれか一つと、
ここで、ＶＨ領域及びＶＬ領域は、少なくとも一つのリンカーで連結されている、
（ＩＩ）少なくとも１つの共刺激ドメインと、ここで、前記共刺激ドメインは、配列番号２を含むＣＤ２８共刺激ドメインである、
（ＩＩＩ）ＣＤ３ゼータを含む少なくとも１つの活性化ドメインと
を含む、キメラ抗原受容体。
【請求項2】
前記ＣＤ３ゼータは、配列番号１０の配列とは多くて１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、もしくは０個のアミノ酸残基が異なる配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項3】
前記共刺激ドメインが、配列番号２の配列とは多くて１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、又は０個のアミノ酸残基が異なる配列を含み、前記活性化ドメインが、配列番号１０の配列とは多くて１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、又は０個のアミノ酸残基が異なる配列を含む請求項２に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項4】
前記リンカーが、ｓｃＦｖ Ｇ４Ｓリンカー又はｓｃＦｖ Ｗｈｉｔｌｏｗリンカーを含む請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項6】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項7】
レンチウイルスベクター、ＤＮＡベクター、プラスミド、ＲＮＡベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス随伴ベクター、レンチウイルスベクター、又はそれらの組み合わせである請求項６に記載のベクター。
【請求項8】
レンチウイルスベクターが、配列番号９５を有するｐＧＡＲベクターである、請求項７に記載のベクター。
【請求項9】
請求項６～８のいずれか一項に記載のベクターを含む単離された免疫細胞であって、任意選択的に、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＮＫ細胞、ＴＣＲ発現細胞、樹状細胞又はＮＫ－Ｔ細胞である、免疫細胞。
【請求項10】
自己Ｔ細胞又は同種Ｔ細胞である請求項９に記載の免疫細胞。
【請求項11】
ベクターが、患者の体から単離された細胞、ドナーの体から単離された細胞、又は、患者の体から採取された試料から増殖された細胞に導入される、請求項９に記載の免疫細胞。
【請求項12】
請求項１～４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項５に記載のポリヌクレオチド、又は請求項９～１１のいずれか一項に記載の細胞を含む、疾患又は障害を治療するための医薬組成物。
【請求項13】
前記疾患又は障害は、がんであり、前記がんは、白血病、リンパ腫又は骨髄腫である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項14】
前記疾患又は障害は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病、異型慢性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、急性単芽球性白血病、急性赤白血病、急性巨核芽球性白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性疾患、骨髄腫瘍、骨髄肉腫、及び炎症性疾患又は自己免疫性疾患の少なくとも一である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記炎症性疾患又は自己免疫性疾患が、関節リウマチ、乾癬、アレルギー、喘息、クローン病、ＩＢＤ、ＩＢＳ、線維筋痛、肥満細胞症、及びセリアック病の少なくとも一である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、成人で診断される急性白血病の最も一般的な型である不均一な血液悪性腫瘍である。ＡＭＬは大まかに白血病すべての３分の１を占め、米国だけでも２０１３年には推定１４，５００の新しい症例が報告され、全生存率は不良である。過去３０年間にわたってＡＭＬ患者のケアの標準はほとんど改善されていない。しかしながら、分子生物学及び細胞生物学の最近の進歩は、正常状態及び病的状態の双方でのヒトの造血についての我々の理解を革命的に変化させている。
【0002】
疾患の病態形成に関与する幾つかの重要なプレーヤーが特定されており、使用可能な標的として照合することができる。ＡＭＬのおよそ３０％で最も共通して変異しているそのような活性化している「ドライバー」遺伝子の１つがＦＬＴ３である。
【0003】
胎児肝臓キナーゼ２（ＦＬＫ－２）、ヒト幹細胞キナーゼ１（ＳＣＫ－１）又は分化抗原のクラスター（ＣＤ１３５）としても知られるＦｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）は、１９９０年代に２つの独立したグループによってクローニングされた造血受容体チロシンキナーゼである。ヒトにおいて染色体１３ｑ１２に位置するＦＬＴ３遺伝子は、幹細胞因子受容体（ｃ－ＫＩＴ）、マクロファージコロニー刺激因子受容体（ＦＭＳ）及び血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）を含む他のクラスＩＩＩファミリーメンバーと相同性を共有するクラスＩＩＩ受容体チロシンキナーゼタンパク質をコードする。
【0004】
ＦＬＴ３リガンドとの結合の際、ＦＬＴ３受容体はホモ二量体化を受け、それによって膜近傍ドメインにおける特定のチロシン残基の自己リン酸化ならびにＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ、ＭＡＰＫ及びＳＴＡＴ５の経路を介した下流の活性化を可能にする。従って、ＦＬＴ３は正常な造血細胞の増殖、生存及び分化を制御することにおいて重要な役割を担っている。
【0005】
ヒトＦＬＴ３はＣＤ３４＋ＣＤ３８－造血幹細胞（ＨＳＣ）と同様に樹状前駆細胞のサブセットにて発現されている。ＦＬＴ３の発現はまた、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ１２３低骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１２３低顆粒球単球前駆細胞（ＧＭＰ）、及びＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１０＋ＣＤ１９－リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）のような多能性前駆細胞でも検出することができる。興味深いことに、ＦＬＴ３の発現はＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ１２３－巨核球赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）ではほぼ存在しない。従って、ＦＬＴ３の発現は、さらに成熟した単球系列の細胞における一部の発現を伴って、主として早期の骨髄系及びリンパ系の前駆細胞に限定されている。ＦＬＴ３のこの限定された発現パターンは、ほとんどの造血組織及び前立腺、腎臓、肺、結腸及び心臓で発現されているＦＬＴ３リガンドのそれと著しい対照を成す。そのＦＬＴ３の発現のようなこれらの変化した発現パターンはＦＬＴ３のシグナル伝達経路の組織特異性を決定することにおける律速段階である。
【0006】
ＡＭＬにおける最も一般的なＦＬＴ３の変異は細胞遺伝学的に正常なＡＭＬ患者の２０～３８％に見いだされるＦＬＴ３内部縦列重複（ＦＬＴ３－ＩＴＤ）である。ＦＬＴ３－ＩＴＤは、膜近傍ドメインのコーディング配列の一部が重複し、高い方向に対して先端に挿入されると形成される。ＦＬＴ３の変異が、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、非ホジキンリンパ腫及び多発性骨髄腫の患者で特定されていないということは、ＡＭＬについての強い疾患特異性を示唆している。変異体ＦＬＴ３の活性化は一般にＦＡＢ亜型のすべてで観察されるが、それはＦＡＢ Ｍ５（単球性白血病）のＡＭＬ患者で有意に上昇する一方で、ＦＡＢ亜型Ｍ２及びＭ６（顆粒球性白血病又は赤白血病）は、ＦＬＴ３の正常な発現パターンに従って、ＦＬＴ３の活性化に関連することが有意に少ない。少ない比率のＡＭＬ患者（５～７％）は、最も一般的にはＤ８３５にて又は場合によってはＴ８４２もしくはＩ８３６にてＦＬＴ３チロシンキナーゼドメイン（ＦＬＴ３ ＴＫＤ）での単一アミノ酸変異を示す一方で、さらに少ない患者（約１％）は残基５７９、５９０、５９１及び５９４を含むＦＬＴ３の膜近傍ドメインにて変異を有する。ＦＬＴ３－ＩＴＤ変異のＡＭＬ患者は、早期の再発と乏しい生存率を特徴とする侵攻型の疾患を有する一方で、全生存及び無症候生存はＦＬＴ３－ＴＫＤの変異の存在によって有意には影響を受けない。さらに、ＴＥＴ２又はＤＮＭＴ３Ａの変異と同時にＦＬＴ３－ＩＴＤの変異を持つＡＭＬ患者は、野生型のＴＥＴ２又はＤＮＭＴ３Ａを持つＦＬＴ３－ＩＴＤ変異のＡＭＬ患者に比べて望ましくない全リスクのプロファイルを有し、ＡＭＬの臨床上及び生物学的な不均一性を強調している。
【0007】
ＦＬＴ３－ＩＴＤ及びＦＬＴ３－ＴＫＤの変異は双方とも、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路及びＰ１３Ｋ／Ａｋｔの経路の下流の活性化をもたらすＦＬＴ３のリガンドに関係ない活性化を誘導する。しかしながら、いずれかの変異に関連する下流のシグナル伝達経路は、ＦＬＴ－ＩＴＤによるＳＴＡＴ５の優先的な活性化で元々異なっており、それによって増殖能の上昇及びＤＮＡ修復経路の異常調節をもたらす。
【0008】
ＦＬＴ３の変異の状況とは無関係に、ＦＬＴ３のリン酸化はＡＭＬ患者の３分の２を超えて明らかであり、ＦＬＴ３はＡＭＬ芽の＞８０％及びＡＭＬ患者の約９０％にて発現されており、大きな試料サイズにてそれは疾患の病態形成に関連する魅力的な治療標的になっている。
【0009】
幾つかの小分子阻害剤がＦＬＴ３変異を持つＡＭＬ患者のための魅力的な治療選択肢として出現している。第１世代のＦＬＴ３チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）は選択性の欠如、効能及び望ましくない薬物動態特性を特徴とした。この問題点と闘うためのさらに新しい且つさらに選択性である作用物質が開発されているが、その有効性は続発性の耐性の出現によって限定されている。
【0010】
幾つかの早期のＦＬＴ３ ＴＫＩには、とりわけ、ミドスタウリン（ＰＫＣ４１２）、レスタウルチニブ（ＣＥＰ－７０１）、スニチニブ（ＳＵＩ１２４８）及びソラフィニブ（ＢＡＹ ４３－９００６）が挙げられた。おそらく用量限定毒性なしで有効なＦＬＴ３阻害を達成することができないために、再発性又は難治性のＡＭＬ患者におけるこれらのマルチキナーゼ標的剤によるフェーズＩ及びフェーズＩＩにおける奏効率は限定されている。キザルチニブ（ＡＣ２２０）は、ＦＬＴ３野生型とＦＬＴ３－ＩＴＤに対する高い選択性を持つ第２世代のＦＬＴ３ ＴＫＩとして開発されており、若いコホートの患者にて移植周辺の状況で特に利益を示している。しかしながら、キザルチニブを投与された再発患者で特定されたＦＬＴ３における二次変異は、治療剤としての妥当性を強調する一方で、ＡＭＬ患者にとってよりよい治療戦略を開発する必要性を際立たせている。
【0011】
新たな、再発性／難治性又は二次疾患のＡＭＬ患者にて幾つかの標的化された作用物質が調べられている。腫瘍抑制遺伝子のエピジェネティックサイレンシングはＡＭＬ疾患の病態形成に重要な役割を担っており、アザシタジン及びデシタビンのようなＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）阻害剤は幾つかの臨床的な成功を達成している。さらに、ＡＭＬ患者のサブセットにおけるヒストンの翻訳後修飾（たとえば、ＥＺＨ２及びＡＳＸＬ１変異）又はＤＮＡメチル化（たとえば、ＤＮＭＴ３Ａ、ＴＥＴ２、ＩＤＨ１／２）に影響を及ぼす変異の最近の特定は、ＨＤＡＣ及びプロテアソーム阻害剤と共にＥＺＨ２、ＤＯＴ１Ｌ、ＩＤＨ１／２の阻害剤を含む種々の治療選択肢の開発をもたらしている。しかしながら、ＡＭＬ細胞におけるこれら化合物の多くの前臨床試験は、これらの阻害剤がＡＭＬ芽の直接細胞傷害を引き起こすのではなく造血分化の表現型及び遺伝子発現の特徴を変えている可能性があることを示唆している。従って、ＡＭＬと闘い、ＡＭＬ芽細胞の標的化された溶解を引き起こす新規の標的／モダリティを特定する強いアンメットメディカルニーズが残ったままである。ＡＭＬの他の治療候補には、ＡＭＧ９００を含むオーロラキナーゼ阻害剤、細胞周期の進行で重要な役割を担うポロ様キナーゼの阻害剤が挙げられる。
【0012】
ＡＭＬ患者のケアの標準は、可能ならば幹細胞移植を伴った化学療法のままである。しかしながら、治療した患者の大半における再発性／難治性症例の出現は追加の治療モダリティを正当化している。免疫が介在する移植片対白血病効果のさらに明瞭な理解と併せて幾つかの白血病特異抗原の特定及び記載は、幾つかの論文で概説された、血液悪性腫瘍と闘うための免疫調節戦略の開発への道を開いた。
【0013】
操作された免疫細胞は治療上の処置、特に腫瘍学にて所望の品質を持つことが示されている。操作された免疫細胞の２つの主な型は、キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」又は「ＣＡＲ－Ｔ」と呼ばれる）及びＴ細胞受容体（「ＴＣＲ」）を含有するものである。これらの操作された細胞は、標的細胞を認識し、殺傷するそれらの能力を保持し、又は向上させながら、それらに抗原特異性を与えるように操作される。キメラ抗原受容体は、たとえば、（ｉ）抗原特異的成分（「抗原結合分子」）と、（ｉｉ）１以上の共刺激ドメインと、（ｉｉｉ）１以上の活性化ドメインとを含んでもよい。各ドメインは異種であってもよく、すなわち、異なるタンパク質鎖に由来する配列で構成されてもよい。キメラ抗原受容体を発現している免疫細胞（たとえば、Ｔ細胞）は、がんの治療法を含む種々の治療法で使用されてもよい。本明細書で定義されるような共刺激するポリペプチドを用いて標的抗原に対するＣＡＲ発現細胞の活性化を高めてもよいので、養子免疫療法の効能を増してもよいことが十分に理解されるであろう。
【0014】
１以上の所望の標的に対する特異性を持つようにＴ細胞を操作することができる。たとえば、１以上のシグナル伝達分子、及び／又はＣＤ３ゼータのような１以上の活性化ドメインと併せて抗体の１以上の単鎖可変断片（「ｓｃＦｖ」）のような抗原結合分子をコードするＤＮＡ又は他の遺伝物質でＴ細胞に形質導入することができる。
【0015】
標的細胞を認識し、破壊するＣＡＲ－Ｔ細胞の能力に加えて、成功したＴ細胞療法は、抗原に応答して増殖する能力を持続し、維持するＣＡＲ－Ｔ細胞の能力から利益を得る。
【0016】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合するペプチドとしての抗原断片を認識するのに関与するＴ細胞の表面上で見いだされる分子である。ＴＣＲは２つの異なるタンパク質鎖で構成され、ヒトＴＣＲのおよそ９５％では、ＴＣＲはアルファ（α）鎖とベータ（β）鎖とから成る。ヒトＴ細胞のおよそ５％では、ＴＣＲはガンマ及びデルタ（γ／δ）鎖から成る。各鎖は２つの細胞外ドメイン：双方とも免疫グロブリンのスーパーファミリーの可変（Ｖ）領域及び定常（Ｃ）領域で構成される。他の免疫グロブリンのように、ＴＣＲα鎖及びβ鎖（又はガンマ及びデルタ（γ／δ）鎖）の可変ドメインはそれぞれ、３つの超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。ＴＣＲが抗原ペプチドとＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ）を結合すると、Ｔ細胞は活性化し、それが標的細胞を攻撃し、破壊するのを可能にする。
【0017】
しかしながら、現在の治療法は望ましくない副作用を伴って様々なレベルの有効性を示している。従って、ＦＬＴ３に関連する疾患及び障害を治療するための新規の及び改善された治療法を特定するニーズが存在する。
【発明の概要】
【0018】
本発明は、操作された免疫細胞（たとえば、ＣＡＲ又はＴＣＲ）、ＦＬＴ３に対する特異性を持つ抗原結合分子（抗体、これら抗原結合分子のｓｃＦｖ、重鎖及び／又は軽鎖、及びＣＤＲを含むが、これらに限定されない）に関する。
【0019】
本発明はさらに、これらの細胞にて共刺激ドメインとして有用な新規のＣＤ２８の配列に関する。
【0020】
本発明のキメラ抗原受容体は通常、（ｉ）ＦＬＴ３に特異的な抗原結合分子と、（ｉｉ）１以上の共刺激ドメインと、（ｉｉｉ）１以上の活性化ドメインとを含む。各ドメインは異種であってもよいので、異なるタンパク質鎖に由来する配列で構成されてもよいことが十分に理解されるであろう。
【0021】
一部の実施形態では、本発明は、ＦＬＴ３に特異的に結合する抗原結合分子を含むキメラ抗原受容体に関するものであり、その際、抗原結合分子は、（ａ）多くて３、２、１又は０個のアミノ酸残基が配列番号１７のものとは異なるアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ１；（ｂ）多くて３、２、１又は０個のアミノ酸残基が配列番号１８又は配列番号２６のものとは異なるアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ２；（ｃ）多くて３、２、１又は０個のアミノ酸残基が配列番号１９又は配列番号２７のものとは異なるアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ３；（ｄ）多くて３、２、１又は０個のアミノ酸残基が配列番号２２又は配列番号３０のものとは異なるアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ１；（ｅ）多くて３、２、１又は０個のアミノ酸残基が配列番号２３又は３１のものとは異なるアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ２；（ｆ）多くて３、２、１又は０個のアミノ酸残基が配列番号２４又は配列番号３２のものとは異なるアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ３の少なくとも１つを含む。
【0022】
他の実施形態では、キメラ抗原受容体はさらに少なくとも１つの共刺激ドメインを含む。さらなる実施形態では、キメラ抗原受容体はさらに少なくとも１つの活性化ドメインを含む。
【0023】
特定の実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｔ、ＯＸ－４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、プログラム死－１（ＰＤ－１）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１、ＣＤｌ－ｌａ／ＣＤ１８）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ、（ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ－１０、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラス１分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＩＣＡＭ－１、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤｌｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤｌ ｌａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌ ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌ ｌｃ、ＩＴＧＢｌ、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、又はそれらの任意の組み合わせのシグナル伝達領域である。
【0024】
一部の実施形態では、共刺激ドメインは４－１ＢＢに由来する。他の実施形態では、共刺激ドメインはＯＸ４０に由来する。Ｈｏｍｂａｃｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１２，Ｊｕｌ．１；１（４）：４５８－４６６も参照のこと。さらに他の実施形態では、共刺激ドメインは、Ｇｕｅｄａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ａｕｇｕｓｔ，１４，２０１４；Ｂｌｏｏｄ：１２４（７）及びＳｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ＆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，（２０１３），６：３３に記載されたようなＩＣＯＳを含む。さらに他の実施形態では、共刺激ドメインは、Ｓｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１２，Ｊｕｌ．１；１（４）：５４７－５４９に記載されたようなＣＤ２７を含む。
【0025】
特定の実施形態では、ＣＤ２８共刺激ドメインは配列番号２、配列番号４、配列番号６又は配列番号８を含む。追加の実施形態では、ＣＤ８共刺激ドメインは配列番号１４を含む。さらなる実施形態では、活性化ドメインはＣＤ３、ＣＤ３ゼータ又は配列番号１０に記述されている配列を有するＣＤ３ゼータを含む。
【0026】
他の実施形態では、本発明は共刺激ドメインが配列番号２を含み、且つ活性化ドメインが配列番号１０を含むキメラ抗原受容体に関する。
【0027】
本発明はさらに、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。ベクターは、たとえば、レトロウイルスベクター、ＤＮＡベクター、プラスミド、ＲＮＡベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス随伴ベクター、レンチウイルスベクター、又はそれらの任意の組み合わせであることができる。本発明はさらに、ベクターを含む免疫細胞に関する。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターはｐＧＡＲベクターである。
【0028】
例となる免疫細胞には、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＮＫ細胞、ＴＣＲ発現細胞、樹状細胞又はＮＫ－Ｔ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。Ｔ細胞は自己、同種又は異種であることができる。他の実施形態では、本発明は本明細書に記載されている免疫細胞を含む医薬組成物に関する。
【0029】
特定の実施形態では、本発明は、
（ａ）多くて１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０個のアミノ酸残基が１０Ｅ３のＶＨ領域のアミノ酸配列とは異なるＶＨ領域と多くて１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０個のアミノ酸残基が１０Ｅ３のＶＬ領域のアミノ酸配列とは異なるＶＬ領域；
（ｂ）多くて１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０個のアミノ酸残基が２Ｅ７のＶＨ領域のアミノ酸配列とは異なるＶＨ領域と多くて１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０個のアミノ酸残基が２Ｅ７のＶＬ領域のアミノ酸配列とは異なるＶＬ領域；
（ｃ）多くて１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０個のアミノ酸残基が８Ｂ５のＶＨ領域のアミノ酸配列とは異なるＶＨ領域と多くて１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０個のアミノ酸残基が８Ｂ５のＶＬ領域のアミノ酸配列とは異なるＶＬ領域；
（ｄ）多くて１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０個のアミノ酸残基が４Ｅ９のＶＨ領域のアミノ酸配列とは異なるＶＨ領域と多くて１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０個のアミノ酸残基が４Ｅ９のＶＬ領域のアミノ酸配列とは異なるＶＬ領域；及び
（ｅ）多くて１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個又は０のアミノ酸残基が１１Ｆ１１のＶＨ領域のアミノ酸配列とは異なるＶＨ領域と多くて１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０個のアミノ酸残基が１０Ｅ３のＶＬ領域のアミノ酸配列とは異なるＶＬ領域；
の少なくとも１つ含む抗原結合分子（及びこれらの分子を含むキメラ抗原受容体）に関するものであり、ＶＨ及びＶＬの領域（単数）又は領域（複数）は少なくとも１つのリンカーによって連結される。
（ａ）多くて１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０個のアミノ酸残基が１０Ｅ３のＶＨ領域のアミノ酸配列とは異なるＶＨ領域と多くて１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０個のアミノ酸残基が１０Ｅ３のＶＬ領域のアミノ酸配列とは異なるＶＬ領域；
（ｂ）多くて１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０個のアミノ酸残基が２Ｅ７のＶＨ領域のアミノ酸配列とは異なるＶＨ領域と多くて１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０個のアミノ酸残基が２Ｅ７のＶＬ領域のアミノ酸配列とは異なるＶＬ領域；
（ｃ）多くて１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０個のアミノ酸残基が８Ｂ５のＶＨ領域のアミノ酸配列とは異なるＶＨ領域と多くて１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０個のアミノ酸残基が８Ｂ５のＶＬ領域のアミノ酸配列とは異なるＶＬ領域；
（ｄ）多くて１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０個のアミノ酸残基が４Ｅ９のＶＨ領域のアミノ酸配列とは異なるＶＨ領域と多くて１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０個のアミノ酸残基が４Ｅ９のＶＬ領域のアミノ酸配列とは異なるＶＬ領域；及び
（ｅ）多くて１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個又は０のアミノ酸残基が１１Ｆ１１のＶＨ領域のアミノ酸配列とは異なるＶＨ領域と多くて１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０個のアミノ酸残基が１０Ｅ３のＶＬ領域のアミノ酸配列とは異なるＶＬ領域；
の少なくとも１つ含む抗原結合分子（及びこれらの分子を含むキメラ抗原受容体）に関するものであり、ＶＨ及びＶＬの領域（単数）又は領域（複数）は少なくとも１つのリンカーによって連結される。
【0030】
他の実施形態では、本発明は、リンカーがｓｃＦｖ Ｇ４Ｓリンカー及びｓｃＦｖ Ｗｈｉｔｌｏｗリンカーの少なくとも１つを含む抗原結合分子（及びこれらの分子を含むキメラ抗原受容体）に関する。
【0031】
他の実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするベクター及びこれらのポリペプチドを含む免疫細胞に関する。好まれる免疫細胞には、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＮＫ細胞、ＴＣＲ発現細胞、樹状細胞又はＮＫ－Ｔ細胞が挙げられる。Ｔ細胞は自己、同種又は異種であってもよい。
【0032】
他の実施形態では、本発明は、ＦＬＴ３に特異的に結合する抗原結合分子を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする単離されたポリヌクレオチドに関するものであり、抗原結合分子は配列番号１９又は配列番号２７のアミノ酸配列を含む可変重（ＶＨ）鎖のＣＤＲ３を含む。ポリヌクレオチドはさらに活性化ドメインを含む。好まれる実施形態では、活性化ドメインはＣＤ３、さらに好ましくはＣＤ３ゼータ、さらに好ましくは配列番号９に記述されたアミノ酸配列である。
【0033】
他の実施形態では、本発明は、たとえば、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｔ、ＯＸ４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ３（アルファ、ベータ、デルタ、イプシロン、ガンマ、ゼータ）、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１（ＣＤｌ ｌａ／ＣＤ１８）、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ（腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４；ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ－１０、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ、ＴＮＦｒ、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＩＣＡＭ－１、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤｌ－ｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤｌ－ｌａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌ－ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌ－ｌｃ、ＩＴＧＢｌ、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３リガンド、又はそれらの断片もしくは組み合わせのような共刺激ドメインを含む。好まれる共刺激ドメインは以下に引用されている。
【0034】
さらなる実施形態では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする単離されたポリヌクレオチドに関するものであり、その際、ＣＡＲ又はＴＣＲはＦＬＴ３に特異的に結合する抗原結合分子を含み、抗原結合分子は配列番号２４及び配列番号３２から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖ＣＤＲ３を含む。ポリヌクレオチドはさらに活性化ドメインを含むことができる。ポリヌクレオチドはさらに共刺激ドメインを含むことができる。
【0035】
他の実施形態では、本発明は、ＦＬＴ３に特異的に結合する抗原結合分子を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする単離されたポリヌクレオチドに関するものであり、抗原結合分子の重鎖はＣＤＲ１（配列番号１７）、ＣＤＲ２（配列番号１８）、及びＣＤＲ３（配列番号１９）を含み、且つ抗原結合分子の軽鎖はＣＤＲ１（配列番号２２）、ＣＤＲ２（配列番号２３）、及びＣＤＲ３（配列番号２４）を含む。
【0036】
他の実施形態では、本発明は、ＦＬＴ３に特異的に結合する抗原結合分子を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする単離されたポリヌクレオチドに関するものであり、抗原結合分子の重鎖はＣＤＲ１（配列番号１７）、ＣＤＲ２（配列番号２６）、及びＣＤＲ３（配列番号２７）を含み、且つ抗原結合分子の軽鎖はＣＤＲ１（配列番号３０）、ＣＤＲ２（配列番号３１）、及びＣＤＲ３（配列番号３２）を含む。
【0037】
本発明はさらに、本明細書に記述されているような少なくとも１つの可変重鎖ＣＤＲ３又は可変軽鎖ＣＤＲ３の配列を含むＦＬＴ３への抗原結合分子に関する。本発明はさらに、本明細書に記載されているような少なくとも１つの可変重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＦＬＴ３への抗原結合分子に関する。本発明はさらに、本明細書に記載されているような少なくとも１つの可変軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含むＦＬＴ３への抗原結合分子に関する。本発明はさらに、本明細書に記載されているような可変重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３及び可変軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列の双方を含むＦＬＴ３への抗原結合分子に関する。
【0038】
本発明に係るＦＬＴ３に結合する分子にて使用するのに好適な追加の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン及びＣＤＲのポリヌクレオチド及びアミノ酸配列は２０１５年７月３１日に出願された米国仮特許出願番号６２／１９９，９４４にて見いだされる。
【0039】
本発明はさらに、本発明に係る抗原結合分子、ＣＡＲ、ＴＣＲ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞又は組成物を対象に投与することを含む、疾患又は障害の治療を必要とする対象にて疾患又は障害を治療する方法に関する。治療に好適な疾患には、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病、異型慢性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、急性単芽球性白血病、急性赤白血病、急性巨核芽球性白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性疾患、骨髄腫瘍、骨髄肉腫、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。追加の疾患には、たとえば、関節リウマチ、乾癬、アレルギー、喘息、クローン病、ＩＢＤ、ＩＢＳ、線維筋痛、肥満細胞症、及びセリアック病のような炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【0040】
【図1】ヒト細胞株におけるＦＬＴ３の細胞表面発現についてのフローサイトメトリー解析を示す図である。
【図2】種々のＣＡＲをコードするｍＲＮＡと共にエレクトロポレーションした初代Ｔ細胞におけるＣＡＲの発現を示す図である。
【図3】共培養の１６時間後、複数の細胞株に対するエレクトロポレーションしたＣＡＲ Ｔ細胞の細胞溶解活性を示す図である。
【図5】２人の健常ドナーに由来するレンチウイルスで形質導入した初代Ｔ細胞におけるＣＡＲの発現を示す図である。
【図6】種々の標的細胞株と共に共培養した、示されたＣＡＲを発現している２人の健常ドナーに由来する経時的な平均細胞溶解活性を示す図である。
【図7】図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃを含み、示された標的細胞株との共培養の１６時間後、２人の健常ドナーに由来するレンチウイルスで形質導入したＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＦＮγ、ＴＮＦα及びＩＬ－２の産生を示す図である。
【図8】ＣＤ３－ＣＤ２８ビーズ又は示された標的細胞株との共培養の５日後、２人の健常ドナーに由来するＣＦＳＥ標識したレンチウイルスで形質導入したＣＡＲ Ｔ細胞の増殖を示す図である。
【図9】生体内試験に使用されたレンチウイルスで形質導入した初代ヒトＴ細胞におけるＣＡＲの発現を示す図である。
【図10】異種モデルにおけるＣＡＲ Ｔ細胞の静脈内注射に続く標識した急性骨髄性白血病細胞の生物発光の画像化を示す図である。
【図11】ＣＡＲ Ｔ細胞を注射したマウスの生存曲線を示す図である。
【図12】ｐＧＡＲのベクターマップを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0041】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ又はＣＡＲ－Ｔ）及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は遺伝的に操作された受容体であることが十分に理解されるであろう。これらの操作された受容体は、当該技術で既知の技法に従ってＴ細胞を含む免疫細胞に容易に挿入することができ、その免疫細胞によって容易に発現されることができる。ＣＡＲと共に、特定の抗原を認識し、且つその抗原に結合したとき、その抗原を持つ細胞を攻撃し、破壊するように免疫細胞を活性化するように単一の受容体をプログラムすることができる。これらの抗原が腫瘍細胞に存在すると、ＣＡＲを発現している免疫細胞はその腫瘍細胞を標的とし、殺傷することができる。
【0042】
ＣＡＲは、抗原（たとえば、細胞表面抗原）と相互作用する抗原結合分子を組み込むことによってその標的とされる抗原に結合するように操作することができる。好ましくは、抗原結合分子はその抗体断片、さらに好ましくは１以上の単鎖抗体断片（「ｓｃＦｖ」）である。ｓｃＦｖは、一緒に連結された抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域を有する単鎖抗体断片である。米国特許第７，７４１，４６５号及び同第６，３１９，４９４号と同様にＥｓｈｈａｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，（１９９７），４５：１３１－１３６を参照のこと。ｓｃＦｖは、標的抗原と特異的に相互作用する親抗体の能力を保持する。ｓｃＦｖは他のＣＡＲ成分と併せて単鎖の一部として発現されるように操作することができるので、キメラ抗原受容体での使用に好まれる。同上、またＫｒａｕｓｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌｕｍｅ，１８８，Ｎｏ．４，１９９８（６１９－６２６）；Ｆｉｎｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９８，１６１：２７９１－２７９７も参照のこと。抗原結合分子は通常、それが対象とする抗原を認識し、抗原に結合することができるようにＣＡＲの細胞外部分内に含有されることが十分に理解されるであろう。１を超える対象とする抗原に対する特異性を持つ二重特異性及び多重特異性のＣＡＲは本発明の範囲内で熟考される。
【0043】
共刺激ドメイン
キメラ抗原受容体は共刺激（シグナル伝達）ドメインを組み込んでその効能を高めてもよい。米国特許第７，７４１，４６５号及び同第６，３１９，４９４号、同様にＫｒａｕｓｅ，ｅｔ ａｌ．及びＦｉｎｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．（上記），Ｓｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１９：６９６－７０６（２０１２）；Ｋａｌｏｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．３：９５（２０１１）；Ｐｏｒｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５：７２５－３３（２０１１），及びＧｒｏｓｓ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．５６：５９－８３（２０１６）を参照のこと。たとえば、ＣＤ２８はＴ細胞上で天然に見いだされる共刺激タンパク質である。ＣＤ２８の完全なネイティブのアミノ酸配列はＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００６１３０．１に記載されている。完全なネイティブのＣＤ２８の核酸配列はＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００６１３９.１に記載されている。
キメラ抗原受容体は共刺激（シグナル伝達）ドメインを組み込んでその効能を高めてもよい。米国特許第７，７４１，４６５号及び同第６，３１９，４９４号、同様にＫｒａｕｓｅ，ｅｔ ａｌ．及びＦｉｎｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．（上記），Ｓｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１９：６９６－７０６（２０１２）；Ｋａｌｏｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．３：９５（２０１１）；Ｐｏｒｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５：７２５－３３（２０１１），及びＧｒｏｓｓ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．５６：５９－８３（２０１６）を参照のこと。たとえば、ＣＤ２８はＴ細胞上で天然に見いだされる共刺激タンパク質である。ＣＤ２８の完全なネイティブのアミノ酸配列はＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００６１３０．１に記載されている。完全なネイティブのＣＤ２８の核酸配列はＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００６１３９.１に記載されている。
【0044】
特定のＣＤ２８のドメインがキメラ抗原受容体で使用されている。本発明によれば、「ＣＤ２８Ｔ」と呼ばれる新規のＣＤ２８細胞外ドメインはＣＡＲ構築物で利用されると予想外に特定の利益を提供することが見いだされている。
【0045】
細胞外ＣＤ２８Ｔドメイン、及びＣＤ２８膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含むＣＤ２８Ｔ分子のヌクレオチド配列は配列番号１に記述されている：
【0046】
ＣＴＴＧＡＴＡＡＴＧＡＡＡＡＧＴＣＡＡＡＣＧＧＡＡＣＡＡＴＣＡＴＴＣＡＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＴＣＣＧＴＣＡＣＣＣＴＴＧＴＴＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＴＣＣＡＡＧＣＣＡＴＴＣＴＧＧＧＴＧＴＴＧＧＴＣＧＴＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＣＧＣＴＴＧＴＴＡＣＴＣＴＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＣＣＧＴＧＧＣＴＴＴＴＡＴＡＡＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＴＡＧＡＴＣＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣＣＧＣＣＴＧＣＴＣＣＡＴＡＧＣＧＡＴＴＡＣＡＴＧＡＡＴＡＴＧＡＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＡＣＡＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＣＴＴＡＣＧＣＡＣＣＡＣＣＴＡＧＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＣＣＴＡＴＣＧＧＡＧＣ
【0047】
対応するアミノ酸配列は配列番号２に記述されている：
【0048】
ＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫ ＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭ ＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴ ＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰ ＲＤＦＡＡＹＲＳ
【0049】
ＣＤ２８Ｔの細胞外部分のヌクレオチド配列は配列番号３に記述されている：
【0050】
ＣＴＴＧＡＴＡＡＴＧＡＡＡＡＧＴＣＡＡＡＣＧＧＡＡＣＡＡＴＣＡＴＴＣＡＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＴＣＣＧＴＣＡＣＣＣＴＴＧＴＴＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＴＣＣＡＡＧＣＣＡ
【0051】
ＣＤ２８Ｔの細胞外ドメインの対応するアミノ酸配列は配列番号４に記述されている：ＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩ ＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰ ＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ
【0052】
ＣＤ２８の膜貫通ドメインのヌクレオチド配列は配列番号５に記述されている：
【0053】
ＴＴＣＴＧＧＧＴＧＴＴＧＧＴＣＧＴＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＣＧＣＴＴＧＴＴＡＣＴＣＴＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＣＣＧＴＧＧＣＴＴＴＴＡＴＡＡＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＴ
【0054】
ＣＤ２８の膜貫通ドメインのアミノ酸配列は配列番号６に記述されている：
【0055】
ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶ ＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶ ＡＦＩＩＦＷＶ
【0056】
ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインのヌクレオチド配列は配列番号７に記述されている：
【0057】
ＡＧＡＴＣＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣＣＧＣＣＴＧＣＴＣＣＡＴＡＧＣＧＡＴＴＡＣＡＴＧＡＡＴＡＴＧＡＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＡＣＡＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＣＴＴＡＣＧＣＡＣＣＡＣＣＴＡＧＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＣＣＴＡＴＣＧＧＡＧＣ
【0058】
ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列は配列番号８に記述されている：ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ
【0059】
本発明で使用するのに好適な追加のＣＤ２８配列には、配列番号１１に記述されているＣＤ２８のヌクレオチド配列が挙げられる：
【0060】
ＡＴＴＧＡＧＧＴＧＡＴＧＴＡＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＴＡＣＣＴＧＧＡＴＡＡＣＧＡＡＡＡＧＡＧＴＡＡＣＧＧＴＡＣＣＡＴＣＡＴＴＣＡＣＧＴＧＡＡＡＧＧＴＡＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＴＣＣＴＴＣＴＣＣＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＧＧＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＣＣＣ
【0061】
対応するアミノ酸配列は配列番号１２に記述されている：
【0062】
ＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ
【0063】
他の好適な細胞外又は膜貫通の配列はＣＤ８に由来することができる。好適なＣＤ８の細胞外及び膜貫通のドメインのヌクレオチド配列は配列番号１３に記述されている：
【0064】
ＧＣＴＧＣＡＧＣＡＴＴＧＡＧＣＡＡＣＴＣＡＡＴＡＡＴＧＴＡＴＴＴＴＡＧＴＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＴＴＣＴＴＧＣＣＧＧＣＴＡＡＧＣＣＴＡＣＴＡＣＣＡＣＡＣＣＣＧＣＴＣＣＡＣＧＧＣＣＡＣＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＴＡＣＣＡＴＣＧＣＴＴＣＡＣＡＧＣＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＴＴＧＣＣＧＡＣＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＧＧＧＣＧＣＴＧＴＴＣＡＴＡＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＧＧＡＴＴＴＣＧＣＣＴＧＣＧＡＴＡＴＣＴＡＴＡＴＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＣＴＧＧＣＣＧＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧＣＧＴＡＣＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＴＣＡＴＣＡＣＧＣＴＣＴＡＴＴＧＴＡＡＴＣＡＣＡＧＧＡＡＣ
【0065】
対応するアミノ酸配列は配列番号１４に記述されている：
【0066】
ＡＡＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮ
【0067】
本発明の範囲内での好適な共刺激ドメインは、他の供給源の中で特に、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｔ、ＯＸ４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ３（アルファ、ベータ、デルタ、イプシロン、ガンマ、ゼータ）、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１（ＣＤｌ ｌａ／ＣＤ１８）、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ（腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４；ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ－１０、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ、ＴＮＦｒ、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＩＣＡＭ－１、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤｌ－ｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤｌ－ｌａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌ－ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌ－ｌｃ、ＩＴＧＢｌ、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３リガンド、又はそれらの断片もしくは組み合わせに由来することができる。
【0068】
活性化ドメイン
【0069】
ＣＤ３はネイティブＴ細胞上のＴ細胞受容体の要素であり、ＣＡＲにおいて重要な細胞内活性化要素であることが示されている。好まれる実施形態では、ＣＤ３はＣＤ３ゼータであり、そのヌクレオチド配列は配列番号９に記述されている：
【0070】
ＡＧＧＧＴＧＡＡＧＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＣＡＣＣＡＧＣＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＣＴＧＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＣＣＴＧＧＧＡＣＧＣＡＧＧＧＡＡＧＡＧＴＡＴＧＡＣＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＣＡＧＡＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＡＣＣＡＡＧＡＣＧＡＡＡＡＡＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＡＴＡＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＡＡＧＣＣＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＴＡＧＧＣＡＴＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＣＡＣＧＡＣＧＧＴＴＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＡＣＴＣＡＧＣＡＣＴＧＣＴＡＣＧＡＡＧＧＡＴＡＣＴＴＡＴＧＡＣＧＣＴＣＴＣＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣＴＡＧＧ
【0071】
細胞内ＣＤ３ゼータの対応するアミノ酸は配列番号１０に記述されている：
【0072】
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲ ＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
【0073】
ドメイン配向
構造的に、これらのドメインは免疫細胞と比べた配置に対応することが十分に理解されるであろう。従って、これらのドメインは、（ｉ）「ヒンジ」ドメイン又は細胞外（ＥＣ）ドメイン（ＥＣ）、（ｉｉ）膜貫通（ＴＭ）ドメイン、及び／又は（ｉｉｉ）細胞内（細胞質）ドメイン（ＩＣ）の一部であることができる。細胞内成分はある程度、ＣＤ３ファミリーのメンバー、好ましくはＣＤ３ゼータを含むことが多く、それは抗原結合分子のその標的への結合の際、Ｔ細胞を活性化することができる。一実施形態では、ヒンジドメインは通常、本明細書で定義されるような少なくとも１つの共刺激ドメインで構成される。
構造的に、これらのドメインは免疫細胞と比べた配置に対応することが十分に理解されるであろう。従って、これらのドメインは、（ｉ）「ヒンジ」ドメイン又は細胞外（ＥＣ）ドメイン（ＥＣ）、（ｉｉ）膜貫通（ＴＭ）ドメイン、及び／又は（ｉｉｉ）細胞内（細胞質）ドメイン（ＩＣ）の一部であることができる。細胞内成分はある程度、ＣＤ３ファミリーのメンバー、好ましくはＣＤ３ゼータを含むことが多く、それは抗原結合分子のその標的への結合の際、Ｔ細胞を活性化することができる。一実施形態では、ヒンジドメインは通常、本明細書で定義されるような少なくとも１つの共刺激ドメインで構成される。
【0074】
ヒンジ領域が、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭのような免疫グロブリンファミリーのメンバー又はそれらの断片の一部又は全部を含有してもよいことも十分に理解されるであろう。
【0075】
本発明に係る例となるＣＡＲ構築物は表１に記述されている。
【表1】
【0076】
細胞と比べたドメイン
受容体を持つ細胞に比べて、本発明の操作されたＴ細胞は、抗原結合分子（たとえば、ｓｃＦｖ）、細胞外ドメイン（「ヒンジ」ドメインを含んでもよい）、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含むことが十分に理解されるであろう。細胞内ドメインは少なくともある程度、活性化ドメインを含み、好ましくは、たとえば、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ又はそれらの一部のようなＣＤ３ファミリーメンバーで構成される。抗原結合分子（たとえば、１以上のｓｃＦｖ）は、それが分子／構築物の細胞外部分に位置付けられるように操作されるのでそれがその標的（単数）又は標的（複数）を認識し、結合することができることがさらに十分に理解されるであろう。
受容体を持つ細胞に比べて、本発明の操作されたＴ細胞は、抗原結合分子（たとえば、ｓｃＦｖ）、細胞外ドメイン（「ヒンジ」ドメインを含んでもよい）、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含むことが十分に理解されるであろう。細胞内ドメインは少なくともある程度、活性化ドメインを含み、好ましくは、たとえば、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ又はそれらの一部のようなＣＤ３ファミリーメンバーで構成される。抗原結合分子（たとえば、１以上のｓｃＦｖ）は、それが分子／構築物の細胞外部分に位置付けられるように操作されるのでそれがその標的（単数）又は標的（複数）を認識し、結合することができることがさらに十分に理解されるであろう。
【0077】
細胞外ドメイン
細胞外ドメインは、シグナル伝達にとって及びリンパ球の抗原への効率的な応答にとって有益である。本発明の特定の使用についての細胞外ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｔ、ＯＸ－４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、プログラム死－１（ＰＤ－１）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１、ＣＤｌ－ｌａ／ＣＤ１８）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ、（ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ－１０、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラス１分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＩＣＡＭ－１、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤｌ ｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤｌ ｌａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌ ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌ ｌｃ、ＩＴＧＢｌ、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、又はそれらの任意の組み合わせに由来してもよい（すなわち、これらを含んでもよい）。細胞外ドメインは天然の供給源又は合成の供給源のいずれかに由来してもよい。
細胞外ドメインは、シグナル伝達にとって及びリンパ球の抗原への効率的な応答にとって有益である。本発明の特定の使用についての細胞外ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｔ、ＯＸ－４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、プログラム死－１（ＰＤ－１）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１、ＣＤｌ－ｌａ／ＣＤ１８）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ、（ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ－１０、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラス１分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＩＣＡＭ－１、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤｌ ｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤｌ ｌａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌ ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌ ｌｃ、ＩＴＧＢｌ、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、又はそれらの任意の組み合わせに由来してもよい（すなわち、これらを含んでもよい）。細胞外ドメインは天然の供給源又は合成の供給源のいずれかに由来してもよい。
【0078】
本明細書に記載されているように、細胞外ドメインはヒンジ部分を含むことが多い。これは、時には「スペーサー」領域と呼ばれる細胞外ドメインの一部である。上記で議論したような共刺激分子、同様に免疫グロブリン（Ｉｇ）配列又は他の好適な分子を含む種々のヒンジを本発明に従って採用し、標的細胞からの所望の特定の距離を達成することができる。一部の実施形態では、細胞外ドメイン全体がヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、ヒンジ領域はＣＤ２８Ｔ、又はＣＤ２８のＥＣドメインを含む。
【0079】
膜貫通ドメイン
ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合される膜貫通ドメインを含むように設計することができる。それは同様にＣＡＲの細胞内ドメインに融合することができる。一実施形態では、ＣＡＲにおけるドメインの１つに天然に会合する膜貫通ドメインが使用される。場合によっては、アミノ酸置換によって膜貫通ドメインを選択し、又は修飾し、同一の又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を回避して受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を出来るだけ減らすことができる。膜貫通ドメインは天然の供給源又は合成の供給源のいずれかに由来してもよい。供給源が天然である場合、ドメインは任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来してもよい。本発明における特定の使用についての膜貫通領域は、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｔ、ＯＸ－４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、プログラム死－１（ＰＤ－１）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１、ＣＤｌ－ｌａ／ＣＤ１８）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ、（ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ－１０、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラス１分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＩＣＡＭ－１、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤｌ ｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤｌ ｌａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌ ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌ ｌｃ、ＩＴＧＢｌ、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、又はそれらの任意の組み合わせに由来してもよい（すなわち、これらを含んでもよい）。
ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合される膜貫通ドメインを含むように設計することができる。それは同様にＣＡＲの細胞内ドメインに融合することができる。一実施形態では、ＣＡＲにおけるドメインの１つに天然に会合する膜貫通ドメインが使用される。場合によっては、アミノ酸置換によって膜貫通ドメインを選択し、又は修飾し、同一の又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を回避して受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を出来るだけ減らすことができる。膜貫通ドメインは天然の供給源又は合成の供給源のいずれかに由来してもよい。供給源が天然である場合、ドメインは任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来してもよい。本発明における特定の使用についての膜貫通領域は、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｔ、ＯＸ－４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、プログラム死－１（ＰＤ－１）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１、ＣＤｌ－ｌａ／ＣＤ１８）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ、（ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ－１０、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラス１分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＩＣＡＭ－１、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤｌ ｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤｌ ｌａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌ ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌ ｌｃ、ＩＴＧＢｌ、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、又はそれらの任意の組み合わせに由来してもよい（すなわち、これらを含んでもよい）。
【0080】
任意で、短いリンカーがＣＡＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインのいずれか又は幾つかの間で結合を形成してもよい。
【0081】
一実施形態では、本発明のＣＡＲにおける膜貫通ドメインはＣＤ８の膜貫通ドメインである。一実施形態では、ＣＤ８の膜貫通ドメインは配列番号１３の核酸配列の膜貫通部分を含む。別の実施形態では、ＣＤ８の膜貫通ドメインは配列番号１４の中に含有される膜貫通アミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
【0082】
特定の実施形態では、本発明のＣＡＲにおける膜貫通ドメインはＣＤ２８の膜貫通ドメインである。一実施形態では、ＣＤ２８の膜貫通ドメインは配列番号５の核酸配列を含む。一実施形態では、ＣＤ２８の膜貫通ドメインは配列番号６のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、ＣＤ２８の膜貫通ドメインは配列番号６のアミノ酸配列を含む。
【0083】
細胞内（細胞質）ドメイン
本発明の操作されたＴ細胞の細胞内（細胞質）ドメインは免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化を提供することができる。Ｔ細胞のエフェクター機能は、たとえば、細胞溶解活性、又はサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であってもよい。
本発明の操作されたＴ細胞の細胞内（細胞質）ドメインは免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化を提供することができる。Ｔ細胞のエフェクター機能は、たとえば、細胞溶解活性、又はサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であってもよい。
【0084】
好適な細胞内分子には、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｔ、ＯＸ－４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、プログラム死－１（ＰＤ－１）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１、ＣＤｌ－ｌａ／ＣＤ１８）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ、（ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ－１０、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラス１分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＩＣＡＭ－１、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤｌ ｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤｌ ｌａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌ ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌ ｌｃ、ＩＴＧＢｌ、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる（すなわち、これらを含む）が、これらに限定されないことが十分に理解されるであろう。
【0085】
好まれる実施形態では、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインをそれだけで、又は本発明のＣＡＲとの関連で有用な任意の他の所望の細胞質ドメイン（複数可）との組み合わせで含むように設計することができる。たとえば、ＣＡＲの細胞質ドメインはＣＤ３ゼータ鎖部分及び共刺激シグナル伝達領域を含むことができる。
【0086】
本発明のＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は互いに無作為に又は特定の順序で連結されてもよい。
【0087】
好まれる一実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインとＣＤ２８のシグナル伝達ドメインとを含むように設計される。別の実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインと４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインとを含むように設計される。別の実施形態では、本発明のＣＡＲにおける細胞質ドメインはＣＤ２８の一部とＣＤ３ゼータを含むように設計され、その際、細胞質ＣＤ２８は配列番号７に記述された核酸配列と配列番号８に記述されたアミノ酸配列を含む。ＣＤ３ゼータの核酸配列は配列番号９に記述されており、アミノ酸配列は配列番号８に記述されている。
【0088】
本発明に係るＣＡＲの好まれる配向の１つは、共刺激ドメイン及び活性化ドメインと縦列で抗原結合分子（たとえば、ｓｃＦｖ）を含むことが十分に理解されるであろう。共刺激ドメインは、細胞外部分、膜貫通部分及び細胞内部分の１以上を含むことができる。複数の共刺激ドメインを縦列で利用できることがさらに十分に理解されるであろう。
【0089】
一部の実施形態では、抗原結合分子と少なくとも１つの共刺激ドメインと活性化ドメインとをコードする第１のポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモータを含む核酸が提供される。
【0090】
一部の実施形態では、核酸構築物はウイルスベクター内に含有される。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、マウス白血病ウイルスベクター、ＳＦＧベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、及びワクシニアウイルスベクターから成る群から選択される。一部の実施形態では、核酸はプラスミド内に含有される。
【0091】
本発明はさらに、キメラ抗原受容体をコードする単離されたポリヌクレオチド及び該ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。当該技術で既知の任意のベクターが本発明に好適であることができる。一部の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター（たとえば、ｐＭＳＶＧ１）、ＤＮＡベクター、マウス白血病ウイルスベクター、ＳＦＧベクター、プラスミド、ＲＮＡベクター、アデノウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプスタインバーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純性ヘルペスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター（たとえば、ｐＧＡＲ）又はそれらの任意の組み合わせである。ｐＧＡＲのベクターマップは図１２に示す。ｐＧＡＲの配列は以下のとおりである。
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【0092】
好適な追加の例となるベクターには、たとえば、ｐＢＡＢＥ－ｐｕｒｏ、ｐＢＡＢＥ－ネオラージＴｃＤＮＡ、ｐＢＡＢＥ－ハイグロ－ｈＴＥＲＴ、ｐＭＫＯ．１ＧＦＰ、ＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ、ｐＭＳＣＶ ＰＩＧ（Ｐｕｒｏ ＩＲＥＳ ＧＦＰ空プラスミド）、ｐＭＳＣＶ－ｌｏｘｐ－ｄｓＲｅｄ－ｌｏｘｐ－ｅＧＦＰ－Ｐｕｒｏ－ＷＰＲＥ、ＭＳＣＶ ＩＲＥＳルシフェラーゼ、ｐＭＩＧ、ＭＤＨ１－ＰＧＫ－ＧＦＰ＿２．０、ＴｔＲＭＰＶＩＲ、ｐＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ ＦＰ、ｐＲｅｔｒｏＸ ＧＦＰ Ｔ２Ａ Ｃｒｅ、ｐＲＸＴＮ、ｐＬｎｃＥＸＰ、及びｐＬＸＩＮ－Ｌｕｃが挙げられる。
【0093】
一部の実施形態では、操作される免疫細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＮＫ細胞、ＴＣＲ発現細胞、樹状細胞、又はＮＫ－Ｔ細胞である。一部の実施形態では、細胞は末梢血から得られる、又は調製される。一部の実施形態では、細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得られる、又は調製される。一部の実施形態では、細胞は骨髄から得られる、又は調製される。一部の実施形態では、細胞は臍帯血から得られる、又は調製される。一部の実施形態では、細胞はヒトの細胞である。一部の実施形態では、細胞は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、微粒子銃（たとえば、遺伝子銃）、脂質形質移入、ポリマー形質移入、ナノ粒子、又はポリプレックスから成る群から選択される方法を用いて核酸ベクターによって形質移入される、又は形質導入される。
【0094】
一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は本出願の核酸を含む操作された免疫細胞で発現される。本出願のこれらのキメラ抗原受容体は、一部の実施形態では、（ｉ）抗原結合分子（たとえば、ｓｃＦｖ）と、（ｉｉ）膜貫通領域と、（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化の分子又は領域とを含んでもよい。
【0095】
抗原結合分子
抗原結合分子は本発明の範囲の中にある。
抗原結合分子は本発明の範囲の中にある。
【0096】
「抗原結合分子」は本明細書で使用されるとき、特定の標的抗原を結合する任意のタンパク質を意味する。本出願では、特定の標的抗原はＦＬＴ３タンパク質又はその断片である。抗原結合分子には、抗体、及び、たとえば、免疫機能性の断片のようなその結合部分が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチボディ（すなわち、ペプチド結合ドメインを含むＦｃ融合分子）は好適な抗原結合分子のもう１つの例である。
【0097】
一部の実施形態では、抗原結合分子は腫瘍細胞上の抗原に結合する。一部の実施形態では、抗原結合分子は、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原又はウイルスもしくは細菌の抗原に結合する。特定の実施形態では、抗原結合分子はＦＬＴ３に結合する。さらなる実施形態では、抗原結合分子は、その相補性決定領域（ＣＤＲ）の１以上を含む、その断片の抗体である。さらなる実施形態では、抗原結合分子は単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。
【0098】
抗原結合分子の、用語「免疫機能性の断片」（又は「断片」）は、完全長の鎖に存在するアミノ酸の少なくとも一部を欠いているが、依然として抗原に特異的に結合することができる抗体の一部（その部分がどのように得られるか又は合成されるかにかかわりなく）を含む抗原結合分子の種である。そのような断片は、それが標的抗原に結合し、且つ所与のエピトープへの結合についてインタクトな抗体を含む他の抗原結合分子と競合することができるという点で生物学的に活性がある。一部の実施形態では、断片は中和断片である。一部の実施形態では、断片はＦＬＴ３の活性を阻止する又は低減することができる。態様の１つでは、そのような断片は完全長の軽鎖又は重鎖に存在する少なくとも１つのＣＤＲを保持し、一部の実施形態では、単一の重鎖及び／又は軽鎖又はその一部を含むであろう。これらの断片は、組換えＤＮＡ法によって作製することができ、又はインタクトな抗体を含む抗原結合分子の酵素的又は化学的な切断によって作製することができる。
【0099】
免疫機能性の免疫グロブリンの断片には、ｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片（Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等）、１以上のＣＤＲ、ダイアボディ（同一鎖における２つのドメイン間で対合できるには短すぎる短いペプチドリンカーを介して接続された軽鎖可変ドメインと同じポリペプチドにおける重鎖可変ドメイン）、ドメイン抗体、及び単鎖抗体が挙げられるが、これらに限定されない。これらの断片は、ヒト、マウス、ラット、ラクダ又はウサギを含むが、これらに限定されない任意の哺乳類供給源に由来することができる。当業者によって十分に理解されるように、抗原結合分子は非タンパク質成分を含むことができる。
【0100】
抗原結合分子の変異体、たとえば、本明細書に記載されている配列のアミノ酸配列に対して、それぞれ少なくとも７０～８０％、８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～９７％、９７～９９％又は９９％を超える同一性を有する可変軽鎖及び／又は可変重鎖も本発明の範囲内にある。一部の例では、そのような分子は少なくとも１つの重鎖と１つの軽鎖を含むのに対して、他の例では、変異体形態は２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖（又はその下位区分）を含有する。当業者は周知の技法を用いて本明細書に記述されている抗原結合分子の好適な変異体を決定することができるであろう。特定の実施形態では、当業者は、活性に重要ではないと考えられる領域を標的にすることによって活性を破壊することなく変化させてもよい分子の好適な領域を特定することができる。
【0101】
特定の実施形態では、抗原結合分子のポリペプチド構造は、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では「抗体模倣体」と呼ばれることがある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合物（本明細書では「抗体コンジュゲート」と呼ばれることがある）、及びそれぞれその断片を含むが、これらに限定されない抗体に基づく。一部の実施形態では、抗原結合分子はアビマーを含む、又はアビマーから成る。
【0102】
一部の実施形態では、ＦＬＴ３に対する抗原結合分子は単独で投与される。他の実施形態では、ＦＬＴ３に対する抗原結合分子はＣＡＲ、ＴＣＲ又は他の免疫細胞の一部として投与される。そのような免疫細胞では、ＦＬＴ３に対する抗原結合分子は同じプロモータ領域又は別々のプロモータの制御下にあることができる。特定の実施形態では、ＦＬＴ３に対するタンパク質作用物質及び／又は抗原結合分子をコードする遺伝子は別々のベクターにあることができる。
【0103】
本発明はさらに、薬学上許容できる希釈剤、キャリア、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又は補助剤と一緒にＦＬＴ３に対する抗原結合分子を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、医薬組成物はＦＬＴ３に対する１を超える異なる抗原結合分子を含むであろう。特定の実施形態では、医薬組成物は、ＦＬＴ３に対する抗原結合分子が１を超えるエピトープを結合する、ＦＬＴ３に対する１を超える抗原結合分子を含むであろう。一部の実施形態では、種々の抗原結合分子はＦＬＴ３への結合について互いに競合しないであろう。
【0104】
他の実施形態では、医薬組成物は、非経口送達について、吸入について、又は経口のような消化管を介した送達について選択されることができる。そのような薬学上許容できる組成物の調製は当業者の能力の範囲内である。特定の実施形態では、緩衝液を用いて生理的なｐＨ又はやや低いｐＨ、通常、約５から約８に及ぶｐＨ範囲の中で組成物を維持する。特定の実施形態では、非経口投与が熟考される場合、治療用組成物は、追加の治療剤の有無にかかわりなく、薬学上許容できる溶剤にてＦＬＴ３に対する所望の抗原結合分子を含む、発熱物質を含まない、非経口で許容できる水溶液の形態であることができる。特定の実施形態では、非経口注入のための溶剤は、少なくとも１つの追加の治療剤の有無にかかわりなくＦＬＴ３に対する抗原結合分子が適正に保存された無菌の等張溶液として製剤化されている無菌の蒸留水である。特定の実施形態では、製剤には、所望の分子の、デポー注射を介して送達することができる製品の制御放出又は持続放出を提供することができるポリマー化合物（ポリ乳酸又はポリグリコール酸など）、ビーズ、又はリポソームとの製剤化が関与することができる。特定の実施形態では、埋め込みできる薬剤送達用具を用いて所望の分子を導入することができる。
【0105】
一部の実施形態では、抗原結合分子は診断ツール又は検証ツールとして使用される。抗原結合分子を用いて試料及び／又は対象に存在するＦＬＴ３の量をアッセイすることができる。一部の実施形態では、診断用の抗原結合分子は中和性ではない。一部の実施形態では、本明細書で開示されている抗原結合分子は、ＦＬＴ３のレベルの変化に関連する疾患又は障害をスクリーニング／診断するために、哺乳類の組織又は細胞でＦＬＴ３を検出するためのアッセイキット及び／又は方法で使用される又は提供される。キットは、存在するならばＦＬＴ３との抗原結合分子の結合、及び任意でＦＬＴ３タンパク質のレベルを示す手段と共にＦＬＴ３を結合する抗原結合分子を含むことができる。
【0106】
抗原結合分子は以下の定義及び記載を考慮してさらに理解されるであろう。
【0107】
「Ｆｃ」領域は抗体のＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメインを含む２つの重鎖断片を含む。２つの重鎖断片は２以上のジスルフィド結合によって及びＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって一緒に保持される。
【0108】
「Ｆａｂ」断片は１つの軽鎖と１つの重鎖のＣＨ１領域と可変領域とを含む。Ｆａｂ分子の重鎖は別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。「Ｆａｂ’断片」は１つの軽鎖と、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン及びＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の領域も含有する１つの重鎖の一部とを含むので、２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成されてＦ（ａｂ’）２分子を形成することができる。「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つの軽鎖とＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の定常領域の一部を含有する２つの重鎖を含有するので、２つの重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成される。従って、Ｆ（ａｂ’）２断片は２つの重鎖間のジスルフィド結合によって一緒に保持される２つのＦａｂ’断片で構成される。
【0109】
「Ｆｖ領域」は重鎖及び軽鎖の双方に由来する可変領域を含むが、定常領域を欠いている。
【0110】
「単鎖可変断片」（「ｓｃＦｖ」、「単鎖抗体」とも呼ばれる）は、重鎖及び軽鎖の可変領域が柔軟なリンカーで接続されて、抗原結合領域を形成する単一のポリペプチド鎖を形成するＦｖ分子を指す。その開示が全体で参照によって組み入れられるＰＣＴ出願ＷＯ８８／０１６４９及び米国特許第４，９４６，７７８号及び同第５，２６０，２０３号を参照のこと。
【0111】
「二価の抗原結合分子」は２つの抗原結合部位を含む。場合によっては、２つの結合部位は同一の抗原特異性を有する。二価の抗原結合分子は二重特異性であることができる。「多重特異的な抗原結合分子」は１を超える抗原又はエピトープを標的とするものである。「二重特異性」、「二重の特異性」又は「二官能性」の抗原結合分子は、２つの異なる抗原結合部位を有する、それぞれハイブリッドの抗原結合分子又は抗体である。二重特異性抗原結合分子の２つの結合部位は、同一の又は異なるタンパク質標的に存在することができる２つの異なるエピトープに結合するであろう。
【0112】
抗原結合分子は、解離定数（Ｋｄ）が約１×１０－７Ｍである場合、その標的抗原を「特異的に結合する」と言われる。抗原結合分子は、Ｋｄが１～５×１０－９Ｍである場合、「高親和性」で、及びＫｄが１～５×１０－１０Ｍである場合、「非常に高い親和性」で抗原を特異的に結合する。一実施形態では、抗原結合分子は１０－９ＭのＫｄを有する。一実施形態では、オフ速度は＜１×１０－５である。他の実施形態では、抗原結合分子は約１０－７Ｍ～１０－１３Ｍの間のＫｄでヒトＦＬＴ３に結合するであろうし、さらに別の実施形態では、抗原結合分子はＫｄ１．０～５×１０－１０で結合するであろう。
【0113】
抗原結合分子は、それが第２の標的に結合するよりも強固に１つの標的に結合する場合、「選択的」であると言われる。
【0114】
用語「抗体」は、任意のアイソタイプのインタクトな免疫グロブリン、又は標的抗原との特異的な結合についてインタクトな抗体と競合することができるその断片を指し、それには、たとえば、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全にヒト抗体、及び二重特異性抗体が含まれる。「抗体」は本明細書で定義されているような抗原結合分子の一種である。インタクトな抗体は一般に少なくとも２つの完全長の重鎖と２つの完全長の軽鎖とを含むであろうが、場合によっては、重鎖しか含むことができないラクダにおいて天然に存在する抗体のような少ない鎖を含むことができる。抗体は、単に単一の供給源に由来することができ、又はキメラであることができ、すなわち、抗体の異なる部分が以下でさらに記載されているように２つの異なる抗体に由来することができる。抗原結合分子、抗体、又は結合断片は、ハイブリドーマにて、組換えＤＮＡ法によって、又はインタクトな抗体の酵素切断もしくは化学切断によって作製することができる。指示されない限り、用語「抗体」には、２つの完全長の重鎖と２つの完全長の軽鎖とを含む抗体に加えて、その例が以下に記載されている、その誘導体、変異体、断片及び突然変異タンパク質が含まれる。さらに、明白に除外されない限り、抗体には、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では「抗体模倣体」と呼ばれることがある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合物（本明細書では「抗体コンジュゲート」と呼ばれることがある）及びそれぞれそれらの断片が含まれる。
【0115】
可変領域は通常、３つの超可変領域（すなわち、ＣＤＲ）によって接合された相対的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。各対の２つの鎖に由来するＣＤＲは通常、フレームワーク領域によって並べられ、特異的なエピトープへの結合を可能にすることができる。Ｎ末端からＣ末端に、軽鎖及び重鎖の可変領域は双方とも、通常、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。慣例により、重鎖におけるＣＤＲは通常、ＨＣ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と呼ばれる。軽鎖におけるＣＤＲは通常、ＬＣ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と呼ばれる。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては通常Ｋａｂａｔ（Ｓｅｑｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９８７及び１９９１））、又はＣｈｏｔｈｉａ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１－９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７８－８８３（１９８９））の定義に従う。Ｋａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａだけでなく、ＡｂＭの定義も含めて種々の解析方法を採用してＣＤＲ領域を特定する又は概算することができる。
【0116】
用語「軽鎖」には、完全長の軽鎖及び結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するその断片が含まれる。完全長の軽鎖には、可変領域ドメイン、ＶＬと定常領域ドメイン、ＣＬとが含まれる。軽鎖の可変領域ドメインはポリペプチドのアミノ末端である。軽鎖にはカッパ鎖及びラムダ鎖が含まれる。
【0117】
用語「重鎖」には、完全長の重鎖及び結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するその断片が含まれる。完全長の重鎖には、可変領域ドメイン、ＶＨと３つの定常領域ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３とが含まれる。ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨドメインはカルボキシル末端にあり、ＣＨ３がポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４亜型を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２亜型を含む）、ＩｇＭ及びＩｇＥを含む任意のアイソタイプのものであることができる。
【0118】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、通常、重鎖におけるアミノ末端のおよそ１２０～１３０アミノ酸及び軽鎖における約１００～１１０のアミノ末端のアミノ酸を含む抗体の軽鎖及び／又は重鎖の一部を指す。抗体の可変領域は通常、その標的に対する特定の抗体の特異性を決定する。
【0119】
可変性は抗体の可変ドメイン全体にわたって均一に分布するわけではなく；それは重鎖及び軽鎖の可変領域のそれぞれのサブドメインにて集中する。これらのサブドメインは「超可変領域」又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変ドメインのさらに保存された（すなわち、超可変ではない）部分は「フレームワーク」領域（ＦＲＭ又はＦＲ）と呼ばれ、三次元空間で６つのＣＤＲのために足場を提供して抗原結合面を形成する。天然に存在する重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、ループ接続を形成する、場合によっては、ある程度βシート構造を形成する３つの超可変領域によって接続され、大部分βシート構造を採用する４つのＦＲＭ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）を含む。各鎖における超可変領域はＦＲＭによってごく接近して一緒に保持され、他の鎖に由来する超可変領域とともに抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，ｌｏｃ．ｃｉｔ．を参照のこと）。
【0120】
用語「ＣＤＲ」及びその複数形「ＣＤＲｓ」は、その３つが軽鎖可変領域の結合特性を作り出し（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３）、且つその３つが重鎖可変領域の結合特性を作り出す（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３）相補性決定領域を指す。ＣＤＲは抗体の抗原との特異的な相互作用に関与する残基のほとんどを含有するので、抗体分子の機能的な活性に寄与し；それらは抗原特異性の主要な決定基である。
【0121】
正確な定義のＣＤＲの境界及び長さは様々な分類及び番号付け方式の影響下にある。従って、ＣＤＲは、本明細書に記載されている番号付け方式を含めて、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ｃｏｎｔａｃｔ又は他の任意の境界の定義によって言及されてもよい。異なる境界にもかかわらず、これらの方式のそれぞれは、可変配列の範囲内でいわゆる「超可変領域」を構成するものにおいてある程度の重複を有する。従って、これらの方式に係るＣＤＲの定義は隣接するフレームワーク領域に関して長さ及び境界で異なってもよい。たとえば、Ｋａｂａｔ（異種間の配列可変性に基づくアプローチ）、Ｃｈｏｔｈｉａ（抗原・抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ）、及び／又はＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，ｌｏｃ．ｃｉｔ．；Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９８７，１９６：９０１－９１７；及びＭａｃＣａｌｌｕｍ,ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６２：７３２）を参照のこと。抗原結合部位を特徴付けるためのさらに別の基準はＯｘｆｏｒｄの分子のＡｂＭ抗体モデル化ソフトウエアによって使用されるＡｂＭ定義である。たとえば、抗体可変ドメインのタンパク質配列及び構造解析Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄ．：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．及びＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を参照のこと。２つの残基の特定法が、重複するが、同一領域ではない領域を定義する程度に、それらを組み合わせてハイブリッドＣＤＲを定義することができる。しかしながら、いわゆるＫａｂａｔ方式に従った番号付けが好まれる。
【0122】
通常、ＣＤＲはカノニカル構造として分類することができるループ構造を形成する。用語「カノニカル構造」は抗原結合（ＣＤＲ）ループによって導入される主要な鎖構造を指す。比較構造試験から、６つの抗原結合ループのうち５つは利用できる構造の限定されたレパトアしか有さないことが見いだされている。各カノニカル構造はポリペプチド主鎖のねじれ角を特徴とすることができる。従って、ループのほとんどの部分における高度なアミノ酸配列可変性にもかかわらず、抗体間の対応するループは非常に類似する三次元構造を有してもよい（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，１９８７，１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４２：８７７；Ｍａｒｔｉｎ及びＴｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６３：８００）。さらに、導入されたループ構造とそれを取り囲むアミノ酸配列との間には関係性がある。特定のカノニカルクラスの構造は、ループの長さ、ならびにループ内の、及び保存されたフレームワーク内の（すなわち、ループの外側の）重要な位置に存在するアミノ酸残基によって決定される。従って、特定のカノニカルクラスへの割り当てはこれらの重要なアミノ酸残基の存在に基づいて行うことができる。
【0123】
用語「カノニカル構造」は、たとえば、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，ｌｏｃ．ｃｉｔ）によって分類されたように、抗体の線形構造に関する考慮も含んでもよい。Ｋａｂａｔの番号付けスキーム（方式）は、一貫した方法で抗体可変ドメインのアミノ酸残基に番号付けする広く導入されている標準であり、本明細書のどこかでも言及されているように本発明に適用される好まれるスキームである。追加の構造的な考慮を用いて抗体のカノニカル構造を決定することもできる。たとえば、Ｋａｂａｔの番号付けによって完全には反映されないそれらの差異はＣｈｏｔｈｉａらの番号付け方式によって記載され、及び／又は、他の技術、たとえば、結晶学及び二次元もしくは三次元のコンピュータモデル化によって明らかにすることができる。従って、所与の抗体配列は、とりわけ、適当なシャーシ配列を特定するのを可能にするカノニカルクラスに入れられてもよい（たとえば、ライブラリにて種々のカノニカル構造を含む願望に基づいて）。抗体のアミノ酸配列のＫａｂａｔの番号付け及びＣｈｏｔｈｉａら、ｌｏｃ．ｃｉｔ．によって記載されたような構造的な考慮、及び抗体構造のカノニカル態様を解釈するためのそれらの関連事項は文献に記載されている。免疫グロブリンの様々なクラスのサブユニット構造及び三次元構造は当該技術で周知である。抗体構造の概説については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，１９８８を参照のこと。
【0124】
軽鎖のＣＤＲ３及び特に重鎖のＣＤＲ３は、軽鎖及び重鎖の可変領域内での抗原結合における最も重要な決定基を構成することができる。一部の抗体構築物では、重鎖ＣＤＲ３は抗原と抗体との間での接触の主要な領域を構成すると思われる。ＣＤＲ３のみが変化する試験管内の選択スキームを用いて抗体の結合特性を変える、又はどの残基が抗原の結合に寄与するのかを決定することができる。従って、ＣＤＲ３は通常、抗体結合部位内での分子多様性の最大の供給源である。Ｈ３は、たとえば、２つのアミノ酸残基くらい短い、又は２６を超えるアミノ酸であることができる。
【0125】
用語「中和」は、抗原結合分子、ｓｃＦｖ、又は抗体がそれぞれ、リガンドに結合し、そのリガンドの生物効果を妨げる又は低下させることを指す。これは、たとえば、リガンド上の結合部位を直接遮断すること、又はリガンドに結合し、間接的な手段（たとえば、リガンドにおける構造的な又はエネルギー的な変化）を介して結合するリガンドの能力を変えることによって行うことができる。一部の実施形態では、用語は、それが結合するタンパク質が生物機能を実施するのを妨げる抗原結合分子も意味することができる。
【0126】
用語「標的」又は「抗原」は、抗原結合分子が結合することができる分子又は分子の一部を指す。特定の実施形態では、標的は１以上のエピトープを有することができる。
【0127】
用語「競合する」は同一エピトープについて競合する抗原結合分子の文脈で使用されるとき、調べられている抗原結合分子（たとえば、抗体、又は免疫機能性のその断片）が参照の抗原結合分子の抗原への特異的な結合を妨げる又は阻害する（たとえば、減らす）アッセイによって判定されるような抗原結合分子間の競合を意味する。多数の種類の競合結合アッセイ、たとえば、固相直接又は間接放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）、固相直接又は間接酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，９：２４２－２５３）；固相直接ビオチン・アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４－３６１９）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）；１－１２５標識用いた固相直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌ，ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７－１５）；固相直接ビオチン・アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７６：５４６－５５２）；ならびに直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７－８２）を用いて一方の抗原結合分子がもう１つの抗原結合分子と競合するかどうかを判定することができる。用語「エピトープ」には、たとえば、本発明のｓｃＦｖ、抗体又は免疫細胞のような抗原結合分子が結合することができる任意の決定基が含まれる。エピトープは、抗原を標的とする抗原結合分子によって結合されるその抗原の領域であり、抗原がタンパク質である場合、抗原結合分子と直接接触する特定のアミノ酸を含む。
【0128】
本明細書で使用されるとき、用語「標識」又は「標識される」は、たとえば、放射性標識されたアミノ酸の組込みによる、又は印を付けたアビジン（たとえば、光学法又は比色法によって検出することができる蛍光マーカー又は酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出することができるビオチン部分のポリペプチドの連結による検出可能なマーカーの組込みを指す。特定の実施形態では、標識又はマーカーは治療用であることもできる。ポリペプチド及び糖タンパク質を標識する種々の方法は当該技術で既知であり、使用することができる。
【0129】
本発明によれば、オン・オフ型又は他の型の制御スイッチ法が本明細書に組み込まれてもよい。これらの技法は二量体化ドメイン及びそのようなドメイン二量体化の任意の活性化剤の使用を採用してもよい。これらの技法には、たとえば、その内容が全体で参照によって本明細書に組み入れられる、特定の細胞にてＦＫＢＰ／ラパログ二量体化系を利用するＷｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１４，３５０（６２５８）によって記載されたものが挙げられる。追加の二量体化技術は、たとえば、その内容が全体で参照によって本明細書に組み入れられる、Ｆｅｇａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１０，１１０，３３１５－３３３６と同様に米国特許第５，８３０,４６２号、同第５，８３４，２６６号、同第５，８６９，３３７号、及び同第６，１６５，７８７号に記載されている。追加の二量体化ペアには、シクロスポリンＡ／サイクロフィリン、受容体、エストロゲン／エストロゲン受容体（任意でタモキシフェンを用いた）、グルココルチコイド／グルココルチコイド受容体、テトラサイクリン／テトラサイクリン受容体、ビタミンＤ／ビタミンＤ受容体が挙げられてもよい。二量体化技術のさらなる例は、たとえば、その内容が全体で参照によって本明細書にさらに組み入れられるＷＯ２０１４／１２７２６１、ＷＯ２０１５／０９０２２９、ＵＳ２０１４／０２８６９８７、ＵＳ２０１５／０２６６９７３、ＵＳ２０１６／００４６７００、米国特許第８，４８６，６９３号、ＵＳ２０１４／０１７１６４９、及びＵＳ２０１２／０１３００７６にて見いだすことができる。
【0130】
治療の方法
養子免疫療法を用いて、ネイティブのＴ細胞を（ｉ）患者から取り出し、（ｉｉ）少なくとも１つの腫瘍抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝的に操作し、（ｉｉｉ）操作されたＴ細胞の大きな集団に生体外で増殖させ、（ｉｖ）患者に再導入することができる。たとえば、米国特許第７，７４１，４６５号及び同第６，３１９，４９４号、Ｅｓｈｈａｒ，ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ，上記）；Ｋｒａｕｓｅ，ｅｔ ａｌ．（上記）；Ｆｉｎｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．（上記）を参照のこと。操作されたＴ細胞が患者に再導入された後、それらは腫瘍抗原を発現している細胞に対する免疫応答に介在する。たとえば、Ｋｒａｕｓｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌｕｍｅ，１８８，Ｎｏ．４，１９９８（６１９－６２６）を参照のこと。この免疫応答には、Ｔ細胞によるＩＬ－２及び他のサイトカインの分泌、腫瘍抗原を認識するＴ細胞のクローン増殖、及び標的－陽性細胞のＴ細胞が介在する特異的な殺傷が挙げられる。Ｈｏｍｂａｃｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎ．１６７：６１２３－６１３１（２００１）を参照のこと。
養子免疫療法を用いて、ネイティブのＴ細胞を（ｉ）患者から取り出し、（ｉｉ）少なくとも１つの腫瘍抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝的に操作し、（ｉｉｉ）操作されたＴ細胞の大きな集団に生体外で増殖させ、（ｉｖ）患者に再導入することができる。たとえば、米国特許第７，７４１，４６５号及び同第６，３１９，４９４号、Ｅｓｈｈａｒ，ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ，上記）；Ｋｒａｕｓｅ，ｅｔ ａｌ．（上記）；Ｆｉｎｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．（上記）を参照のこと。操作されたＴ細胞が患者に再導入された後、それらは腫瘍抗原を発現している細胞に対する免疫応答に介在する。たとえば、Ｋｒａｕｓｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌｕｍｅ，１８８，Ｎｏ．４，１９９８（６１９－６２６）を参照のこと。この免疫応答には、Ｔ細胞によるＩＬ－２及び他のサイトカインの分泌、腫瘍抗原を認識するＴ細胞のクローン増殖、及び標的－陽性細胞のＴ細胞が介在する特異的な殺傷が挙げられる。Ｈｏｍｂａｃｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎ．１６７：６１２３－６１３１（２００１）を参照のこと。
【0131】
一部の態様では、従って、本発明は、望ましくない及び／又は上昇したＦＬＴ３レベルに関連する状態の治療又は予防を必要とする患者に本明細書で開示されている有効量の少なくとも１つの単離された抗原結合分子、ＣＡＲ又はＴＣＲを投与することを含む、患者にて望ましくない及び／又は上昇したＦＬＴ３レベルに関連する状態を治療する又は予防する方法を含む。
【0132】
がんを含む疾患又は障害を治療するために方法が提供される。一部の実施形態では、本発明は、本出願の有効量の操作された免疫細胞を対象に投与することを含む、対象にてＴ細胞が介在する免疫応答を作り出すことに関する。一部の実施形態では、Ｔ細胞が介在する免疫応答は標的細胞（単数）又は標的細胞（複数）に向けられる。一部の実施形態では、操作された免疫細胞はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む。一部の実施形態では、標的細胞は腫瘍細胞である。一部の態様では、本発明は悪性腫瘍を治療する又は予防する方法を含み、前記方法は悪性腫瘍の治療又は予防を必要とする対象に本明細書で記載されている有効量の少なくとも１つの単離された抗原結合分子を投与することを含む。一部の態様では、本発明は悪性腫瘍を治療する又は予防する方法を含み、前記方法は悪性腫瘍の治療又は予防を必要とする対象に有効量の少なくとも１つの免疫細胞を投与することを含み、その際、免疫細胞は、本明細書に記載されているような少なくとも１つのキメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体、及び／又は単離された抗原結合分子を含む。
【0133】
一部の態様では、本発明は、本明細書に記載されているような少なくとも１つの抗原結合分子と薬学上許容できる賦形剤とを含む医薬組成物を含む。一部の実施形態では、医薬組成物はさらに追加の活性剤を含む。
【0134】
本発明の抗原結合分子、ＣＡＲ、ＴＣＲ、免疫細胞等は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病、異型慢性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、急性単芽球性白血病、急性赤白血病、急性巨核球芽性白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性疾患、骨髄性腫瘍、骨髄性肉腫、又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない骨髄性疾患を治療するのに使用することができる。追加の疾患には、たとえば、関節リウマチ、乾癬、アレルギー、喘息、クローン病、ＩＢＤ、ＩＢＳ、線維筋痛、肥満細胞症及びセリアック病のような炎症性疾患及び／又は自己免疫性疾患が挙げられる。
【0135】
ＣＡＲ＋／ＣＡＲ－Ｔ＋／ＴＣＲ＋細胞についての標的用量は好ましくは１×１０６～２×１０１０個の細胞／ｋｇ、さらに好ましくは２×１０６個の細胞／ｋｇに及び得ることが十分に理解されるであろう。この範囲を上回る及び下回る用量が特定の対象に適当であってもよいことが十分に理解されるであろうし、適当な用量レベルは必要に応じて医療介護提供者によって決定され得る。さらに、本発明に従って細胞の複数回用量を提供することができる。
【0136】
提供されるのはまた、対象に本発明の操作された細胞を投与することを含む、対象にて腫瘍のサイズを小さくする方法であり、その際、細胞はキメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体を含み、又は抗原結合分子を含むキメラ抗原受容体に基づくＴ細胞受容体は腫瘍上の抗原に結合する。一部の実施形態では、対象は固形腫瘍、又はリンパ腫もしくは白血病のような血液悪性腫瘍を有する。一部の実施形態では、操作された細胞は腫瘍床に送達される。一部の実施形態では、がんは対象の骨髄に存在する。
【0137】
一部の実施形態では、操作された細胞は自己Ｔ細胞である。一部の実施形態では、操作された細胞は同種Ｔ細胞である。一部の実施形態では、操作された細胞は異種Ｔ細胞である。一部の実施形態では、本出願の操作された細胞は生体内で形質移入される又は形質導入される。他の実施形態では、操作された細胞は生体外で形質移入される又は形質導入される。
【0138】
方法はさらに１以上の化学療法剤を投与することを含む。特定の実施形態では、化学療法剤はリンパ球枯渇（条件付け）化学療法剤である。相関関係にある有益な生体マーカーと共に有益な前条件付け治療計画は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国仮特許出願６２／２６２，１４３及び６２／１６７，７５０に記載されている。これらは、たとえば、患者に特定の有益な用量のサイクロホスファミド（２００ｍｇ／ｍ２／日～２０００ｍｇ／ｍ２／日の間）及び特定の用量のフルダラビン（２０ｍｇ／ｍ２／日～９００ｍｇ／ｍ２／日）を投与することを含むＴ細胞療法を必要とする患者を適当な状態にする方法を記載している。好まれる投薬計画には、治療上有効な量の操作されたＴ細胞の患者への投与に先立って、約５００ｍｇ／ｍ２／日のサイクロホスファミドと約６０ｍｇ／ｍ２／日のフルダラビンを毎日３日間患者に投与することを含む患者を治療することが関与する。
【0139】
他の実施形態では、抗原結合分子、形質導入した（又はさもなければ、操作した）細胞（たとえば、ＣＡＲ又はＴＣＲ）及び化学療法剤をそれぞれ有効量で投与して対象における疾患又は状態を治療する。
【0140】
特定の実施形態では、本明細書で開示されているＣＡＲを発現している免疫エフェクター細胞を含む組成物は任意の数の化学療法剤との併用で投与されてもよい。化学療法剤の例には、たとえば、チオテパ及びサイクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））のようなアルキル化剤；たとえば、ブスルファン、イムプロスルファン及びピポスルファンのようなアルキルスルホネート；たとえば、ベンゾドパ、カルボクオン、メツレドパ、及びウレドパのようなアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド及びトリメチルオロメラミンレジュメを含むエチレンイミン及びメチラメラミン；たとえば、クロラムブシル、クロロナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、酸化メクロレタミン塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタード；たとえば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンのようなニトロソウレア；たとえば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアミシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、プロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシンのような抗生剤；たとえば、メソトレキセート及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）のような代謝拮抗剤；たとえば、デノプテリン、メソトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートのような葉酸類似体；たとえば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；たとえば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５－ＦＵのようなピリミジン類似体；たとえば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンのようなアンドロゲン；たとえば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；たとえば、フォリン酸のような葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；サイクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、たとえば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）及びドキセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メソトレキセート；たとえば、シスプラチン及びカルボプラチンのような白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロミチン（ＤＭＦＯ）；たとえば、Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）、（アリトレチノイン）；ＯＮＴＡＫ（商標）（デニロイキンディフティトックス）のようなレチノイン酸誘導体；エスペラミシン；カペシタビン；ならびに上記のいずれかの薬学上許容できる塩、酸又は誘導体が挙げられる。この定義に含められるのはまた、たとえば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む抗エストロゲン；ならびに、たとえば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、及びゴセレリンのような抗アンドロゲン；ならびに上記のいずれかの薬学上許容できる塩、酸又は誘導体のような腫瘍に対するホルモン作用を調節する又は阻害するように作用する抗ホルモン剤である。ＣＨＯＰ、すなわち、サイクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標））、ドキソルビシン（ヒドロキシドキソルビシン）、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、及びプレドニゾンを含むが、これらに限定されない化学療法剤の併用も適宜投与される。
【0141】
一部の実施形態では、化学療法剤は操作された細胞もしくは核酸の投与と同時に、又はその後１週間以内に投与される。他の実施形態では、化学療法剤は、操作された細胞もしくは核酸の投与の後、１～４週間又は１週間～１ヵ月、１週間～２ヵ月、１週間～３ヵ月、１週間～６ヵ月、１週間～９ヵ月、又は１週間～１２ヵ月に投与される。他の実施形態では、化学療法剤は細胞又は核酸の投与の少なくとも１ヵ月前に投与される。一部の実施形態では、方法はさらに２以上の化学療法剤を投与することを含む。
【0142】
本明細書に記載されている組成物と併せて種々の追加の治療剤が使用されてもよい。たとえば、潜在的に有用な追加の治療剤には、たとえば、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ及びアテゾリズマブのようなＰＤ－１阻害剤が挙げられる。
【0143】
本発明との併用で使用するのに好適な追加の治療剤には、イブルチニブ（Ｉｍｂｒｕｖｉｃａ（登録商標））、オファツムマブ（Ａｒｚｅｒｒａ（登録商標））、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、トラスツズマブエムタンシン（ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標））、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標））、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））、カツマキソマブ、イブリツモマブ、オファツムマブ、トシツモマブ、ブレンツキシマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、バンデタニブ、アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、アキシチニブ、マシチニブ、パゾパニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、トセラニブ、レスタウルチニブ、アキシチニブ、セジラニブ、レンバチニブ、ニンテダニブ、パゾパニブ、レゴラフェニブ、セマクサニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、チボザニブ、トセラニブ、バンデタニブ、エントレクチニブ、カボザンチニブ、イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ポナチニブ、ラドチニブ、ボスチニブ、レスタウルチニブ、ルキソリチニブ、パクリチニブ、コビメチニブ、セルメチニブ、トラメチニブ、ビニメチニブ、アレクチニブ、セリチニブ、クリゾチニブ、アフリベルセプト、アジポチド、デニロイキンディフティトックス、たとえば、エベロリムス及びテムシロリムスのようなｍＴＯＲ阻害剤、たとえば、ソニデジブ及びビスモデジブのようなヘッジホッグ阻害剤、たとえば、ＣＤＫ阻害剤（パルボシクリブ）のようなＣＤＫ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【0144】
追加の実施形態では、ＣＡＲ含有免疫を含む組成物を抗炎症剤と共に投与することができる。抗炎症剤又は抗炎症薬には、ステロイド及びグルココルチコイド（ベタメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、ハイドロコルチゾン酢酸塩、ハイドロコルチゾン、ハイドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロンを含む）、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、メソトレキセート、スルファサラジン、レフルノミド、抗ＴＮＦ薬物、サイクロホスファミド及びミコフェノレートを含む非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。例となるＮＳＡＩＤには、イブプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、Ｃｏｘ－２阻害剤、及びシアル酸塩が挙げられる。例となる鎮静剤には、アセトアミノフェン、オキシコドン、塩酸プロポルキシフェンのトラマドールが挙げられる。例となるグルココルチコイドには、コルチゾン、デキサメタゾン、ハイドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、又はプレドニゾンが挙げられる。例となる生物反応調節剤には、細胞表面マーカー（たとえば、ＣＤ４、ＣＤ５等）に向けられた分子、たとえば、ＴＮＦ拮抗剤（たとえば、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））及びインフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））のようなサイトカイン阻害剤、ケモカイン阻害剤及び接着分子阻害剤が挙げられる。生物反応調節剤には、モノクローナル抗体、同様に分子の組換え形態が挙げられる。例となるＤＭＡＲＤには、アザチオプリン、サイクロホスファミド、シクロスポリン、メソトレキセート、ペニシラミン、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、ゴールド（経口（アウラノフィン）及び筋肉内）及びミノサイクリンが挙げられる。
【0145】
特定の実施形態では、本明細書に記載されている組成物はサイトカインと併せて投与される。「サイトカイン」は本明細書で使用されるとき、細胞内メディエータとして別の細胞に作用する１つの細胞集団によって放出されるタンパク質を指すことにする。サイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン及び従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインに含められるのは、たとえば、ヒト成長ホルモン、Ｎ－メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモンのような成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；たとえば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）のような糖タンパク質ホルモン；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）；線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；ミュラー管抑制物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンポポエチン（ＴＰＯ）；たとえば、ＮＧＦ－ベータのような神経増殖因子（ＮＧＦ）；血小板－増殖因子；たとえば、ＴＧＦ－アルファ及びＴＧＦ－ベータのような形質転換増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン－様増殖因子－Ｉ及び－ＩＩ；エリスロポイエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；たとえば、インターフェロン－アルファ、ベータ、及び－ガンマのようなインターフェロン；たとえば、マクロファージ－ＣＳＦ（Ｍ－ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球－マクロファージ－ＣＳＦ（ＧＭ－ＣＳＦ）；及び顆粒球－ＣＳＦ（Ｇ－ＣＳＦ）；たとえば、ＩＬ－１、ＩＬ－１アルファ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２のようなインターロイキン（ＩＬ）；ＩＬ－１５、たとえば、ＴＮＦ－アルファ又はＴＮＦ－ベータのような腫瘍壊死因子；ならびにＬＩＦ及びｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。本明細書で使用されるとき、用語サイトカインには、ネイティブ配列のサイトカインの天然供給源に由来するタンパク質、組換え細胞培養に由来するタンパク質及び生物学的に活性がある同等物が含まれる。
【0146】
一部の態様では、本発明は１００ｐＭより小さいＫｄでＦＬＴ３に結合する抗原結合分子を含む。一部の実施形態では、抗原結合分子は１０ｐＭより小さいＫｄで結合する。他の実施形態では、抗原結合分子は５ｐＭより小さいＫｄで結合する。
【0147】
作製方法
本発明に従ってポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、抗原結合分子、免疫細胞、組成物等を作製するのに種々の既知の技法を利用することができる。
本発明に従ってポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、抗原結合分子、免疫細胞、組成物等を作製するのに種々の既知の技法を利用することができる。
【0148】
本明細書に記載されている免疫細胞の試験管内の操作又は遺伝子操作に先立って、細胞が対象から得られてもよい。一部の実施形態では、免疫細胞はＴ細胞を含む。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染の部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍を含む多数の供給源から得ることができる。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、たとえば、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離のような当業者に既知の幾つもの技法を用いて対象から採取した血液の単位から得ることができる。細胞は好ましくは、アフェレーシスによって個人の循環血から得られてもよい。アフェレーシス産物は通常、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞を含むリンパ球、他の有核白血球、赤血球及び血小板を含有する。特定の実施形態では、アフェレーシスによって回収された細胞は洗浄して血漿分画を取り除き、その後の処理のために適当な緩衝液又は培地に入れてもよい。細胞はＰＢＳで洗浄してもよい。十分に理解されるように、たとえば、半自動化されたフロースルー遠心機、たとえば、Ｃｏｂｅ（商標）２９９１細胞処理機、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ（商標）等を使用することによって洗浄工程が使用されてもよい。洗浄の後、細胞は種々の生体適合性の緩衝液、又は緩衝液の有無にかかわりなく他の生理食塩水溶液に再浮遊させてもよい。特定の実施形態では、アフェレーシス試料の望ましくない成分が取り除かれてもよい。
【0149】
特定の実施形態では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、たとえば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を介した遠心分離を用いて単球を激減させることによってＰＢＭＣから単離される。たとえば、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、及びＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞のようなＴ細胞の特定の亜集団は当該技術で既知の正の選択又は負の選択の技術によってさらに単離することができる。たとえば、負の選択によるＴ細胞集団の濃縮は、負の選択が行われる細胞に独特の表面マーカーに向けられた抗体の組み合わせによって達成することができる。本明細書で使用するための方法の１つは、負の選択が行われる細胞に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを使用する負の磁気免疫接着又はフローサイトメトリーを介した細胞選別及び／又は細胞選択である。たとえば、負の選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮するには、モノクローナル抗体のカクテルには通常、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＣＤ８に対する抗体が含まれる。フローサイトメトリー及び細胞選別を用いて本発明で使用するための対象とする細胞集団を単離することができる。
【0150】
ＰＢＭＣは、本明細書に記載されているような方法を用いた免疫細胞（たとえば、ＣＡＲ又はＴＣＲ）による遺伝子操作に直接使用されてもよい。特定の実施形態では、ＰＢＭＣを単離した後、Ｔリンパ球をさらに単離し、細胞傷害性Ｔリンパ球及びヘルパーＴリンパ球の双方を、遺伝子操作及び／又は増殖の前に又は後でナイーブ、メモリー及びエフェクターのＴ細胞亜集団に選別することができる。
【0151】
一部の実施形態では、ＣＤ８＋細胞のナイーブ、セントラルメモリー及びエフェクターの型のそれぞれに関連する細胞表面抗原を特定することによってＣＤ８＋細胞はこれらの型にさらに選別される。一部の実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞の表現型マーカーの発現には、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、及びＣＤ１２７が含まれ、グランザイムＢについては陰性である。一部の実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞はＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、エフェクターＴ細胞はＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、及びＣＤ１２７について陰性であり、グランザイムＢ及びパーフォリンについては陽性である。特定の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は亜集団にさらに選別される。たとえば、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を特定することによってナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞及びエフェクター細胞に選別することができる。
【0152】
たとえば、Ｔ細胞のような免疫細胞を既知の方法を用いた単離に続いて遺伝子操作することができ、又は遺伝子操作されるのに先立って試験管内で免疫細胞を活性化する又は増殖させる（又は前駆細胞の場合は分化させる）ことができる。別の実施形態では、Ｔ細胞のような免疫細胞を本明細書に記載されているキメラ抗原受容体によって遺伝子操作し（たとえば、ＣＡＲをコードする１以上のヌクレオチド配列を含むウイルスベクターで形質導入し）、次いで試験管内で活性化し、及び／又は増殖させる。Ｔ細胞を活性化し、増殖させる方法は当該技術で既知であり、たとえば、その内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６，９０５，８７４号；米国特許第６，８６７，０４１号；米国特許第６，７９７，５１４号；及びＰＣＴＷＯ２０１２／０７９０００に記載されている。一般に、そのような方法には、ＩＬ－２のような適当なサイトカインを伴った培養培地にてビーズ又は他の表面に一般に付着させた抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体のような刺激剤及び共刺激剤にＰＢＭＣ又は単離されたＴ細胞を接触させることが含まれる。同じビーズに付着させた抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体は「代理」の抗原提示細胞（ＡＰＣ）として役立つ。一例は、ヒトＴ細胞の生理的な活性化のためのＣＤ３／ＣＤ２８活性化剤／刺激剤システムであるＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）システムである。
【0153】
他の実施形態では、その内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６，０４０，１７７号；米国特許第５，８２７，６４２号；及びＷＯ２０１２１２９５１４に記載されたもののような方法を用いてフィーダー細胞及び適当な抗体及びサイトカインによってT細胞を活性化し、刺激して増殖させてもよい。
【0154】
本発明の構築物及び操作された免疫細胞を作製する特定の方法は、その内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ１５／１４５２０に記載されている。構築物及び細胞を作製する追加の方法は、その内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国仮特許出願番号６２／２４４０３６にて見いだすことができる。
【0155】
ＰＢＭＣはさらに、たとえば、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞のような他の細胞傷害性リンパ球を含むことができることが十分に理解されるであろう。本明細書で開示されているようなキメラ受容体のコーディング配列を運ぶ発現ベクターをヒトドナーのＴ細胞、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞の集団に導入することができる。発現ベクターを運ぶ上手く形質導入されたＴ細胞をフローサイトメトリーを用いて選別してＣＤ３陽性Ｔ細胞を単離することができ、次いでさらに増殖させて、本発明のどこかに記載されているような当該技術で既知の抗ＣＤ３とＩＬ－２又は他の方法を用いた細胞の活性化に加えて、これらＣＡＲを発現しているＴ細胞の数を増やすことができる。ヒト対象にて使用するための保存及び／又は調製のためにＣＡＲを発現するＴ細胞を凍結保存するのに標準の手順が使用される。一実施形態では、Ｔ細胞の試験管内での形質導入、培養及び／又は増殖は、たとえば、仔ウシ胎児血清及びウシ胎児血清のような非ヒト動物に由来する産物の非存在下で実施される。
【0156】
ポリヌクレオチドのクローニングについては、ベクターを宿主細胞（単離された宿主細胞）に導入し、ベクター自体の複製を可能にし、それによってその中に含有されるポリヌクレオチドのコピーを増幅してもよい。クローニングベクターは、一般に限定しないで、複製開始点、プロモータ配列、転写開始配列、エンハンサ配列、及び選択可能なマーカーを含む配列成分を含有してもよい。これらの要素は当業者によって適宜選択されてもよい。たとえば、複製開始点を選択して宿主細胞におけるベクターの自己複製を促進してもよい。
【0157】
特定の実施形態では、本開示は本明細書で提供されているベクターを含有する単離された宿主細胞を提供する。ベクターを含有する宿主細胞はベクターに含有されるポリヌクレオチドの発現又はクローニングに有用であってもよい。好適な宿主細胞には、限定しないで原核細胞、真菌細胞、酵母細胞、又は哺乳類細胞のような高等な真核細胞を挙げることができる。この目的に好適な原核細胞には、限定しないで、たとえば、グラム陰性又はグラム陽性の生物のような真性細菌、たとえば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉのようなＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｈａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、たとえば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、たとえば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、及びＳｈｉｇｅｌｌａ、同様にたとえば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのようなＢａｃｉｌｌｉ、たとえば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのようなＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。
【0158】
限定しないで、ＤＥＡＥ－デキストラン介在の送達、リン酸カルシウム沈殿法、カチオン性脂質介在の送達、リポソーム介在の形質移入、エレクトロポレーション、粒子衝突、受容体が介在する遺伝子送達、ポリリシン、ヒストン、キトサン及びペプチドが介在する送達を含む当該技術で既知の任意の好適な方法を用いてベクターを宿主細胞に導入することができる。対象とするベクターの発現のための細胞の形質移入及び形質転換についての常法は当該技術で周知である。さらなる実施形態では、免疫エフェクター細胞のドナー集団を遺伝子操作するのに様々な発現ベクターの混合物を使用することができ、各ベクターは本明細書で開示されているような異なるＣＡＲをコードする。得られる形質導入された免疫エフェクター細胞は操作された細胞の混合集団を形成し、操作された細胞の一部は１を超える異なるＣＡＲを発現する。
【0159】
一実施形態では、本発明はＦＬＴ３タンパク質を標的とするＣＡＲ又はＴＣＲを発現している遺伝的に操作された細胞を保存する方法を提供する。これには解凍の際、細胞が生きたままであるように免疫細胞を凍結保存することが関与する。ＣＡＲを発現している免疫細胞の画分を当該技術で既知の方法によって凍結保存し、悪性腫瘍に冒された患者の将来の治療のためにこのような細胞の永続的な供給源を提供することができる。必要に応じて、凍結保存した形質転換された免疫細胞を解凍し、増殖させ、さらに多くのそのような細胞に増やすことができる。
【0160】
本明細書で使用されるとき、「凍結保存する」は、たとえば（通常）、７７ケルビン又は１９６℃（液体窒素の沸点）のような氷点下の温度に冷却することによる細胞の保存を指す。氷点下の温度では凍結保護剤を使用して低温での凍結又は室温への温めによる損傷から保存された細胞を保護することが多い。凍結保護剤及び最適な冷却速度によって細胞の損傷に対して保護することができる。本発明に従って使用することができる凍結保護剤には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｌｏｖｅｌｏｃｋ及びＢｉｓｈｏｐ，Ｎａｔｕｒｅ，（１９５９）；１８３：１３９４－１３９５；Ａｓｈｗｏｏｄ－Ｓｍｉｔｈ，Ｎａｔｕｒｅ，（１９６１）；１９０：１２０４－１２０５）、グリセロール、ポリビニルピロリドン（Ｒｉｎｆｒｅｔ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９６０）；８５：５７６）、及びポリエチレングリコール（Ｓｌｏｖｉｔｅｒ及びＲａｖｄｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，（１９６２）；１９６：４８）が挙げられるが、これらに限定されない。好まれる冷却速度は１℃～３℃／分である。
【0161】
用語「実質的に純粋な」は所与の成分が高レベルで存在することを示すのに使用される。成分は望ましくは組成物に存在する主要な成分である。好ましくは、それは、３０％を超える、５０％を超える、７５％を超える、９０％を超える、又はさらに９５％を超えるレベルで存在し、前記レベルは検討中の全組成物に関して乾燥重量／乾燥重量基準で決定される。非常に高いレベル（たとえば、９０％を超える、９５％を超える、又は９９％を超えるレベル）では、組成物は「純粋形態」であると見なすことができる。本発明の生物学的に活性がある物質（ポリペプチド、核酸分子、抗原結合分子、部分を含む）は、さもなければ物質が会合されてもよい１以上の混入物を実質的に含まない形態で提供することができる。組成物が所与の混入物を実質的に含まない場合、混入物は低レベル（たとえば、上記で設定した乾燥重量／乾燥重量基準で１０％未満、５％未満、又は１％未満のレベル）であろう。
【0162】
一部の実施形態では、細胞は、先ず培養培地からそれらを回収し、次いで洗浄し、治療に有効な量にて投与に好適な培地及び容器システム（「薬学上許容できる」キャリア）で細胞を濃縮することによって製剤化される。好適な点滴媒体は、任意の等張媒体製剤、通常正常な生理食塩水、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ（商標）Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ）又はＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ（商標）Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）であることができるが、５％デキストロース水溶液又は乳酸リンゲル液も利用することができる。点滴媒体にはヒト血清アルブミンを補完することができる。
【0163】
組成物における細胞の所望の治療量は一般に少なくとも２細胞（たとえば、少なくとも１個のＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞と少なくとも１個のＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のサブセット）であり、又はさらに通常では１０２個を超える細胞から１０６個まで及び１０８又は１０９個の細胞を含むまでであり、１０１０個を超える細胞であることができる。細胞の数は組成物が意図される所望の使用及びそれに含まれる細胞の種類に左右されるであろう。所望の細胞の密度は通常、１０６個の細胞／ｍｌを超え、一般に１０７個の細胞／ｍｌを超え、一般に１０８個の細胞／ｍｌ以上である。免疫細胞の臨床的に関連する数は、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、又は１０１２個の細胞に累積的に等しい又はそれを超える複数回の点滴に分配することができる。本発明の一部の態様では、特に、点滴される細胞すべてが特定の標的抗原（ＦＬＴ３）に向け直されるので、１０６／キログラム（患者当たり１０６～１０１１）の範囲での少ない数の細胞が投与されてもよい。ＣＡＲ治療はこれらの範囲内での投与量で複数回投与されてもよい。細胞は治療を受ける患者に対して自己、同種、又は異種であってもよい。
【0164】
本発明のＣＡＲを発現している細胞集団は単独で投与されてもよく、又は希釈剤との併用で、及び／又はＩＬ－２もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団のような他の成分との併用で医薬組成物として投与されてもよい。本発明の医薬組成物は、１以上の薬学上又は生理的に許容できるキャリア、希釈剤又は賦形剤との組み合わせで本明細書に記載されているようなＴ細胞のようなＣＡＲ又はＴＣＲを発現している細胞集団を含んでもよい。そのような組成物は、たとえば、中性の緩衝化生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水等のような緩衝液；たとえば、グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトールのような炭水化物；タンパク質；ポリペプチド又はグリシンのようなアミノ酸；抗酸化剤；たとえば、ＥＤＴＡ又はグルタチオンのようなキレート剤；アジュバント（たとえば、水酸化アルミニウム）及び保存剤を含んでもよい。本発明の組成物は好ましくは静脈内投与用に製剤化される。
【0165】
医薬組成物（溶液、懸濁液等）は、以下：たとえば、注射用水、生理食塩水溶液、好ましくは生理的な生理食塩水、リンゲル溶液、等張の塩化ナトリウムのような無菌の希釈剤、たとえば、溶媒又は懸濁媒として役立ってもよい合成のモノグリセリド又はジグリセリドのような固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の溶媒；たとえば、ベンジルアルコール又はメチルパラベンのような抗菌剤；たとえば、アスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤；たとえば、エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；たとえば、酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩のような緩衝液、及びたとえば、塩化ナトリウム又はデキストロースのような浸透圧の調整のための作用物質の１以上を含んでもよい。非経口製剤は、ガラス又はプラスチックで作られているアンプル、使い捨て注射器又は複数用量バイアルに封入することができる。注射用の医薬組成物は好ましくは無菌である。
【0166】
有害事象は自殺遺伝子で免疫細胞（１以上のＣＡＲ又はＴＣＲを含有する）に形質導入することによって最少化されてもよいことが十分に理解されるであろう。誘導性の「オン」スイッチ又は「アクセル」スイッチを免疫細胞に組み込むことも望まれてもよい。好適な技法には、本発明のＣＡＲ構築物で細胞に形質導入される前に、後で、又はそれと同時に誘導性のカスパーゼ－９（米国特許出願２０１１／０２８６９８０）又はチミジンキナーゼを使用することが含まれる。自殺遺伝子及び／又は「オン」スイッチを導入する追加の方法には、ＴＡＬＥＮＳ、亜鉛フィンガー、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス法、及び他の当該技術で既知の技法が含まれる。
【0167】
本明細書の記載は例示であり、且つ説明的であるのみであり、請求されるような本発明の制約ではないことが理解されるであろう。本出願では、具体的に述べられない限り、単数の使用には複数が含まれる。
【0168】
本明細書で使用されているセクションの見出しは構成上の目的のみのためものであり、記載されている主題の制約として解釈されるべきではない。特許、特許出願、論文、書籍及び条約を含むが、これらに限定されない、本出願で引用されている文書すべて又は文書の一部はあらゆる目的でその全体が参照によって本明細書に明白に組み入れられる。本開示に従って利用されるように、以下の用語は、指示されない限り、以下の意味を有するように理解されるべきである。
【0169】
本出願では、「又は」の使用は、言及されない限り、「及び／又は」を意味する。さらに、用語「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含んでいる）」、同様にたとえば、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（含む）」及び「ｉｎｃｌｕｄｅｄ（含まれる）」のような他の形態の使用は、限定することではない。また、「要素」又は「成分」のような用語は、具体的に言及されない限り、１つのユニットを含む要素及び成分ならびに１を超えるサブユニットを含む要素及び成分の双方を包含する。
【0170】
用語「ＦＬＴ３活性」には、ＦＬＴ３の任意の生物効果が含まれる。特定の実施形態では、ＦＬＴ３活性には、基質又は受容体と相互作用する又は結合するＦＬＴ３の能力が含まれる。
【0171】
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」又は「核酸」には一本鎖及び二本鎖のヌクレオチドポリマーの両方が含まれる。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドはリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド又はヌクレオチドのいずれかの型の修飾された形態であることができる。前記修飾には、ブロモウリジン及びイノシン誘導体のような塩基の修飾、たとえば、２’，３’－ジデオキシリボースのようなリボースの修飾、ならびに、たとえば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロ－ジセレノエート、ホスホロ－アニロチオエート、ホスホルアニラデート及びホスホロアミデートのようなヌクレオチド間結合の修飾が挙げられる。
【0172】
用語「オリゴヌクレオチド」は２００以下のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチドは、たとえば、変異体遺伝子の構築における使用のために一本鎖又は二本鎖であることができる。オリゴヌクレオチドはセンス又はアンチセンスのオリゴヌクレオチドであることができる。オリゴヌクレオチドは、検出アッセイ用の放射性標識、蛍光標識、ハプテン又は抗原性標識を含む標識を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、たとえば、ＰＣＲプライマー、クローニングプライマー又はハイブリッド形成プローブとして使用することができる。
【0173】
用語「制御配列」は、それが連結されるコーディング配列の発現及びプロセッシングに影響を及ぼすことができるポリヌクレオチド配列を指す。そのような制御配列の性質は宿主生物に依存することができる。特定の実施形態では、原核細胞の制御配列はプロモータ、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含むことができる。たとえば、真核細胞の制御配列は、転写因子についての１又は複数の認識部位を含むプロモータ、転写増強配列及び転写終結配列を含むことができる。「制御配列」はリーダー配列（シグナルペプチド）及び／又は融合パートナーの配列を含むことができる。
【0174】
本明細書で使用されるとき、「操作可能に連結される」は、用語が適用される成分が好適な条件下でそれらがその固有の機能を実施できる関係にあることを意味する。
【0175】
用語「ベクター」は、タンパク質をコードする情報を宿主細胞に移動させるのに使用される任意の分子又は実体（たとえば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ又はウイルス）を意味する。用語「発現ベクター」又は「発現構築物」は宿主細胞の形質転換に好適であり、且つそれに操作可能に連結された１以上の異種のコーディング領域の発現を指示する及び／又は制御する（宿主細胞と併せて）核酸配列を含有するベクターを指す。発現構築物には、転写、翻訳に影響を及ぼす又はそれを制御する、且つイントロンが存在するならば、それに操作可能に連結されたコーディング領域のＲＮＡスプライシングに影響を及ぼす配列が含まれ得るが、これらに限定されない。
【0176】
用語「宿主細胞」は、核酸配列によって形質転換されている、又は形質転換することができ、それによって対象とする遺伝子を発現する細胞を指す。その用語には、対象とする遺伝子が存在する限り、子孫が形態又は遺伝的構成で元々の親細胞と同一であろうとなかろうと親細胞の子孫が含まれる。
【0177】
用語「形質転換」は、細胞の遺伝的特徴における変化を指し、細胞が新しいＤＮＡ又はＲＮＡを含有するように修飾されていると細胞は形質転換されている。たとえば、形質移入、形質導入又は他の技法を介して新しい遺伝物質を導入することによって細胞がネイティブな状態から遺伝子操作される場合、細胞は形質転換される。形質移入又は形質導入に続いて、形質転換しているＤＮＡは、細胞の染色体に物理的に組み込むことによって細胞のＤＮＡと組み換えることができ、又はエピソーム要素として複製することなく一時的に維持されることができ、又はプラスミドとして独立して複製することができる。形質転換しているＤＮＡが細胞の分裂と共に複製する場合、細胞は「安定して形質転換」されていると見なされる。
【0178】
用語「形質移入」は外来性又は外因性のＤＮＡの細胞による取り込みを指す。多数の形質移入の技法が当該技術で周知であり、本明細書で開示されている。たとえば、Ｇｒａｈａｍ，ｅｔ ａｌ．，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｕｐｒａ；Ｄａｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｃｈｕ，ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｇｅｎｅ，１３：１９７を参照のこと。
【0179】
用語「形質導入」はそれによってウイルスベクターを介して外来性ＤＮＡを細胞に導入する過程を指す。Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．，（１９９８）．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｂｏｓｔｏｎ：Ｊｏｎｅｓ ＆ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌを参照のこと。
【0180】
用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、ネイティブ配列の１以上のアミノ酸からの欠失、それへの付加及び／又はその置換を含む、タンパク質のアミノ酸配列を有する高分子を指す。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は具体的には、ＦＬＴ３抗原結合分子、抗体、又は抗原結合タンパク質の１以上のアミノ酸からの欠失、それへの付加及び／又はその置換を有する配列を包含する。用語「ポリペプチド断片」は、完全長のネイティブのタンパク質に比べてアミノ末端の欠失、カルボキシル末端の欠失及び／又は内部欠失を有するポリペプチドを指す。そのような断片はネイティブのタンパク質に比べて修飾されたアミノ酸も含有することができる。有用なポリペプチド断片には、抗原結合分子の免疫機能性の断片が挙げられる。有用な断片には、重鎖及び／又は軽鎖の１以上のＣＤＲ領域、可変ドメイン、抗体鎖の他の部分の一部等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0181】
用語「単離された」は、（ｉ）正常で一緒に見いだされる少なくとも幾つかの他のタンパク質を含まない、（ｉｉ）同一供給源、たとえば、同一種に由来する他のタンパク質を本質的に含まない、（ｉｉｉ）自然界で一緒に会合するポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、又は他の物質の少なくとも約５０パーセントから分離される、（ｉｖ）自然界では一緒に会合していないポリペプチドと操作可能に会合する（共有結合又は非共有結合の相互作用によって）、又は（ｖ）自然界では存在しないことを意味する。
【0182】
ポリペプチド（たとえば、抗原結合分子又は抗体）の「変異体」は、別のポリペプチド配列に比べて１以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列に挿入される、それから欠失させる及び／又はそれにて置換されるアミノ酸配列を含む。変異体には融合タンパク質が含まれる。
【0183】
用語「同一性」は、配列を並べ、比較することによって決定されるような、２以上のポリペプチド分子又は２以上の核酸分子の配列間での関係を指す。「パーセント同一性」は、比較される分子におけるアミノ酸又はヌクレオチドの間での同一の残基のパーセントを意味し、比較される分子の最小のサイズに基づいて算出される。これらの算出については、配列比較におけるギャップ（あるとすれば）は好ましくは、特定の数学的モデル又はコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処される。
【0184】
パーセント同一性を算出するには、比較される配列を通常、配列間で最大の一致が得られるような方法で並べる。パーセント同一性を決定するのに使用することができるコンピュータプログラムの一例は、ＧＡＰを含むＧＣＧプログラムパッケージである（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ）。コンピュータアルゴリズムＧＡＰを用いてパーセント配列同一性が決定されるべきである２つのポリペプチド又はポリヌクレオチドを並べる。それぞれのアミノ酸又はヌクレオチドの最適の一致のために配列を並べる（アルゴリズムによって決定されるような「一致した長さ」）。特定の実施形態では、標準の比較マトリクス（ＰＡＭ２５０比較マトリクスについてはＤａｙｈｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ５：３４５－３５２；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリクスについてはＨｅｎｉｋｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５－１０９１９）もアルゴリズムによって使用される。
【0185】
本明細書で使用されるとき、２０の従来の（たとえば、天然に存在する）アミノ酸及びそれらの略記は慣例的な使い方に従う。任意の目的で参照によって本明細書に組み入れられるＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ―Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｏｌｕｂ ａｎｄ Ｇｒｅｎ，Ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照のこと。２０の従来のアミノ酸の立体異性体（たとえば、Ｄ－アミノ酸）、たとえば、アルファ－アミノ酸、アルファ－二置換アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸のような非天然のアミノ酸、乳酸、及び他の従来のものではないアミノ酸も本発明のポリペプチドにとって好適な成分であることができる。従来のものではないアミノ酸の例には、４－ヒドロキシプロリン、.ガンマ．－カルボキシグルタメート、イプシロン－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルリシン、ｅ－Ｎ－アセチルリシン、Ｏ－ホスホセリン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－ホルミルメチオニン、３－メチルヒスチジン、５－ヒドロキシリシン、．シグマ．－Ｎ－メチルアルギニン、及び他の類似のアミノ酸及びイミノ酸（たとえば、４－ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書に使用されているペプチド表記法では、標準的用法及び慣例に従って、左側方向がアミノ末端方向であり、右側方向がカルボキシ末端方向である。
【0186】
保存的なアミノ酸置換は、通常、生物系における合成ではなく化学的なペプチド合成によって組み込まれる天然に存在しないアミノ酸残基を包含することができる。これらには、ペプチド模倣体及びアミノ酸部分の他の逆の又は逆転した形態が含まれる。天然に存在する残基は共通する側鎖の特性に基づいてクラスに分けることができる：
ａ）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
ｂ）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
ｃ）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
ｄ）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
ｅ）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
ｆ）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
ａ）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
ｂ）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
ｃ）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
ｄ）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
ｅ）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
ｆ）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【0187】
たとえば、保存的ではない置換には、これらのクラスの１つのメンバーの別のクラスのメンバーとの交換が関与することができる。そのような置換された残基は、たとえば、非ヒト抗体と相同であるヒト抗体の領域に、又は分子の非相同領域に導入することができる。
【0188】
特定の実施形態に係る、操作されたＴ細胞の抗原結合分子、共刺激ドメイン又は活性化ドメインに変化を加えることにおいて、アミノ酸の疎水性指標を考慮することができる。各アミノ酸は、その疎水性及び電荷の特徴に基づいて疎水性指標を割り当てられている。それらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；スレオニン（－０．７）；セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）；プロリン（－１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタミン酸塩（－３．５）；グルタミン（－３．５）；アスパラギン酸塩（－３．５）；アスパラギン（－３．５）；リシン（－３．９）；及びアルギニン（－４．５）である。Ｋｙｔｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５－１３１（１９８２）を参照のこと。特定のアミノ酸が類似の疎水性指標又は疎水性スコアを有する他のアミノ酸と置換され、それでもやはり類似の生物活性を保持することができることは知られている。類似のアミノ酸の置換は親水性に基づいて効果的に行われ得ることも当該技術で理解されており、特にその際、それによって作り出された生物学的に機能的なタンパク質又はペプチドは本場合のように免疫的な実施形態での使用向けである。例となるアミノ酸置換を表２に記述する。
【表2】
【0189】
用語「誘導体」は、アミノ酸（又は核酸）の挿入、欠失又は置換以外の化学修飾を含む分子を指す。特定の実施形態では、誘導体は、ポリマー、脂質、又は他の有機もしくは無機の部分との化学結合を含むが、これらに限定されない共有結合の修飾を含む。特定の実施形態では、化学的に修飾された抗原結合分子は、化学的に修飾されていない抗原結合分子よりも長い循環半減期を有することができる。一部の実施形態では、誘導体の抗原結合分子は、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール又はポリプロピレングリコールを含むが、これらに限定されない１以上の水溶性ポリマーの連結を含むように共有結合で修飾される。
【0190】
ペプチド類似体は、鋳型ペプチドの特性に類似する特性を持つ非ペプチド薬剤として製薬業界で一般に使用されている。非ペプチド化合物のこれらの型は「ペプチド模倣体」又は「ペプチド模倣物」と呼ばれる。任意の目的で参照によって本明細書に組み入れられるＦａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．，１５：２９（１９８６）；Ｖｅｂｅｒ及びＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，ＴＩＮＳ，ｐ．３９２（１９８５）；ならびにＥｖａｎｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３０：１２２９（１９８７）。
【0191】
用語「治療上有効な量」は、哺乳類において治療上の反応を生じると決定されたＦＬＴ３抗原結合分子の量を指す。そのような治療上有効な量は当業者によって容易に確かめられる。
【0192】
用語「患者」及び「対象」は相互交換可能に使用され、それには、ヒト及び非ヒト動物対象、同様に正式に診断された疾病を持つ者、正式に認識された疾病を持たない者、治療を受けている者、疾病の発症のリスクがある者等が含まれる。
【0193】
用語「治療する」及び「治療」には、治療上の処置、予防上の処置、及び対象が疾病を発症するリスク又は他のリスク因子を低減する適用が含まれる。治療は、疾病の完全な治癒を必要とせず、症状又は根底にあるリスク因子を軽減する実施形態を包含する。用語「予防する」は事象の可能性の１００％の除去を必要としない。むしろ、それは事象の発生の可能性が化合物又は方法の存在下で低減されていることを意味する。
【0194】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチドの合成、及び組織培養及び形質転換（たとえば、エレクトロポレーション、リポフェクチン）には標準の技法を使用することができる。酵素反応及び精製法は、製造元の仕様書に従って、当該技術で一般に達成されるように、又は本明細書に記載されているように実施することができる。前述の技法及び手順は一般に、当該技術で周知の従来の方法に従って、及び本明細書の全体にわたって引用され、議論されている種々の一般的な及びさらに具体的な参考文献に記載されているように実施することができる。たとえば、任意の目的で参照によって本明細書に組み入れられるＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照のこと。
【0195】
以下の配列は本発明をさらに例示するであろう。
【0196】
ＣＤ２８Ｔ ＤＮＡ細胞外、膜貫通、細胞内
ＣＴＴＧＡＴＡＡＴＧＡＡＡＡＧＴＣ ＡＡＡＣＧＧＡＡＣＡＡＴＣＡＴＴＣＡＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＴＣＣＧＴＣＡＣＣＣＴＴＧＴＴＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＴＣＣＡＡＧＣＣＡＴＴＣＴＧＧＧＴＧＴＴＧＧＴＣＧＴＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＣＧＣＴＴＧＴＴＡＣＴＣＴＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＣＣＧＴＧＧＣＴＴＴＴＡＴＡＡＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＴＡＧＡＴＣＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣＣＧＣＣＴＧＣＴＣＣＡＴＡＧＣＧＡＴＴＡＣＡＴＧＡＡＴＡＴＧＡＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＡＣＡＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＣＴＴＡＣＧＣＡＣＣＡＣＣＴＡＧＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＣＣＴＡＴＣＧＧＡＧＣ（配列番号１）
ＣＴＴＧＡＴＡＡＴＧＡＡＡＡＧＴＣ ＡＡＡＣＧＧＡＡＣＡＡＴＣＡＴＴＣＡＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＴＣＣＧＴＣＡＣＣＣＴＴＧＴＴＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＴＣＣＡＡＧＣＣＡＴＴＣＴＧＧＧＴＧＴＴＧＧＴＣＧＴＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＣＧＣＴＴＧＴＴＡＣＴＣＴＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＣＣＧＴＧＧＣＴＴＴＴＡＴＡＡＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＴＡＧＡＴＣＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣＣＧＣＣＴＧＣＴＣＣＡＴＡＧＣＧＡＴＴＡＣＡＴＧＡＡＴＡＴＧＡＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＡＣＡＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＣＴＴＡＣＧＣＡＣＣＡＣＣＴＡＧＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＣＣＴＡＴＣＧＧＡＧＣ（配列番号１）
【0197】
ＣＤ２８Ｔ 細胞外、膜貫通、細胞内ＡＡ
ＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩ ＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰ ＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶ ＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶ ＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫ ＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭ ＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴ ＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰ ＲＤＦＡＡＹＲＳ （配列番号２）
ＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩ ＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰ ＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶ ＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶ ＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫ ＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭ ＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴ ＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰ ＲＤＦＡＡＹＲＳ （配列番号２）
【0198】
ＣＤ２８Ｔ ＤＮＡ－細胞外
ＣＴＴＧＡＴＡＡＴＧＡＡＡＡＧＴＣＡＡＡＣＧＧＡＡＣＡＡＴＣＡＴＴＣＡＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＴＣＣＧＴＣＡＣＣＣＴＴＧＴＴＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＴＣＣＡＡＧＣＣＡ（配列番号３）
ＣＴＴＧＡＴＡＡＴＧＡＡＡＡＧＴＣＡＡＡＣＧＧＡＡＣＡＡＴＣＡＴＴＣＡＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＴＣＣＧＴＣＡＣＣＣＴＴＧＴＴＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＴＣＣＡＡＧＣＣＡ（配列番号３）
【0199】
ＣＤ２８Ｔ ＡＡ－細胞外
ＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩ ＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰ ＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号４）
ＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩ ＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰ ＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号４）
【0200】
ＣＤ２８ ＤＮＡ膜貫通ドメイン
ＴＴＣＴＧＧＧＴＧＴＴＧＧＴＣＧＴＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＣＧＣＴＴＧＴＴＡＣＴＣＴＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＣＣＧＴＧＧＣＴＴＴＴＡＴＡＡＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＴ（配列番号５）
ＴＴＣＴＧＧＧＴＧＴＴＧＧＴＣＧＴＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＣＧＣＴＴＧＴＴＡＣＴＣＴＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＣＣＧＴＧＧＣＴＴＴＴＡＴＡＡＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＴ（配列番号５）
【0201】
ＣＤ２８ ＡＡ膜貫通ドメイン
ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶ ＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶ ＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号６）
ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶ ＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶ ＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号６）
【0202】
ＣＤ２８ ＤＮＡ細胞内ドメイン
ＡＧＡＴＣＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣＣＧＣＣＴＧＣＴＣＣＡＴＡＧＣＧＡＴＴＡＣＡＴＧＡＡＴＡＴＧＡＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＡＣＡＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＣＴＴＡＣＧＣＡＣＣＡＣＣＴＡＧＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＣＣＴＡＴＣＧＧＡＧＣ（配列番号７）
ＡＧＡＴＣＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣＣＧＣＣＴＧＣＴＣＣＡＴＡＧＣＧＡＴＴＡＣＡＴＧＡＡＴＡＴＧＡＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＡＣＡＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＣＴＴＡＣＧＣＡＣＣＡＣＣＴＡＧＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＧＣＣＴＡＴＣＧＧＡＧＣ（配列番号７）
【0203】
ＣＤ２８ ＡＡ細胞内ドメイン
ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号８）
ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号８）
【0204】
ＣＤ３ゼータＤＮＡ
ＡＧＧＧＴＧＡＡＧＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＣＡＣＣＡＧＣＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＣＴＧＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＣＣＴＧＧＧＡＣＧＣＡＧＧＧＡＡＧＡＧＴＡＴＧＡＣＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＣＡＧＡＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＡＣＣＡＡＧＡＣＧＡＡＡＡＡＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＡＴＡＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＡＡＧＣＣＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＴＡＧＧＣＡＴＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＣＡＣＧＡＣＧＧＴＴＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＡＣＴＣＡＧＣＡＣＴＧＣＴＡＣＧＡＡＧＧＡＴＡＣＴＴＡＴＧＡＣＧＣＴＣＴＣＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣＴＡＧＧ（配列番号９）
ＡＧＧＧＴＧＡＡＧＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＣＡＣＣＡＧＣＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＣＴＧＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＣＣＴＧＧＧＡＣＧＣＡＧＧＧＡＡＧＡＧＴＡＴＧＡＣＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＣＡＧＡＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＡＣＣＡＡＧＡＣＧＡＡＡＡＡＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＡＴＡＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＡＡＧＣＣＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＴＡＧＧＣＡＴＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＣＡＣＧＡＣＧＧＴＴＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＡＣＴＣＡＧＣＡＣＴＧＣＴＡＣＧＡＡＧＧＡＴＡＣＴＴＡＴＧＡＣＧＣＴＣＴＣＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣＴＡＧＧ（配列番号９）
【0205】
ＣＤ３ゼータＡＡ
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１０）
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１０）
【0206】
ＣＤ２８ ＤＮＡ
ＡＴＴＧＡＧＧＴＧＡＴＧＴＡＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＴＡＣＣＴＧＧＡＴＡＡＣＧＡＡＡＡＧＡＧＴＡＡＣＧＧＴＡＣＣＡＴＣＡＴＴＣＡＣＧＴＧＡＡＡＧＧＴＡＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＴＣＣＴＴＣＴＣＣＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＧＧＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＣＣＣ（配列番号１１）
ＡＴＴＧＡＧＧＴＧＡＴＧＴＡＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＴＡＣＣＴＧＧＡＴＡＡＣＧＡＡＡＡＧＡＧＴＡＡＣＧＧＴＡＣＣＡＴＣＡＴＴＣＡＣＧＴＧＡＡＡＧＧＴＡＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＴＣＣＴＴＣＴＣＣＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＧＧＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＣＣＣ（配列番号１１）
【0207】
ＣＤ２８ ＡＡ
ＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬ ＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩ ＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳ ＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号１２）
ＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬ ＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩ ＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳ ＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号１２）
【0208】
ＣＤ８ ＤＮＡ細胞外及び膜貫通ドメイン
ＧＣＴＧＣＡＧＣＡＴＴＧＡＧＣＡＡＣＴＣＡＡＴＡＡＴＧＴＡＴＴＴＴＡＧＴＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＴＴＣＴＴＧＣＣＧＧＣＴＡＡＧＣＣＴＡＣＴＡＣＣＡＣＡＣＣＣＧＣＴＣＣＡＣＧＧＣＣＡＣＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＴＡＣＣＡＴＣＧＣＴＴＣＡＣＡＧＣＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＴＴＧＣＣＧＡＣＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＧＧＧＣＧＣＴＧＴＴＣＡＴＡＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＧＧＡＴＴＴＣＧＣＣＴＧＣＧＡＴＡＴＣＴＡＴＡＴＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＣＴＧＧＣＣＧＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧＣＧＴＡＣＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＴＣＡＴＣＡＣＧＣＴＣＴＡＴＴＧＴＡＡＴＣＡＣＡＧＧＡＡＣ（配列番号１３）
ＧＣＴＧＣＡＧＣＡＴＴＧＡＧＣＡＡＣＴＣＡＡＴＡＡＴＧＴＡＴＴＴＴＡＧＴＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＴＴＣＴＴＧＣＣＧＧＣＴＡＡＧＣＣＴＡＣＴＡＣＣＡＣＡＣＣＣＧＣＴＣＣＡＣＧＧＣＣＡＣＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＴＡＣＣＡＴＣＧＣＴＴＣＡＣＡＧＣＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＴＴＧＣＣＧＡＣＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＧＧＧＣＧＣＴＧＴＴＣＡＴＡＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＧＧＡＴＴＴＣＧＣＣＴＧＣＧＡＴＡＴＣＴＡＴＡＴＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＣＴＧＧＣＣＧＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧＣＧＴＡＣＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＴＣＡＴＣＡＣＧＣＴＣＴＡＴＴＧＴＡＡＴＣＡＣＡＧＧＡＡＣ（配列番号１３）
【0209】
ＣＤ８ ＡＡ細胞外及び膜貫通ドメイン
ＡＡＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮ（配列番号１４）
ＡＡＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮ（配列番号１４）
【0210】
クローン１０Ｅ３のＨＣ ＤＮＡ
ＣＡＧＧＴＣＡＣＣＴＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＣＡＣＡＧＡＧＡＣＣＣＴＣＡＣＧＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＣＣＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＴＣＡＣＴＣＡＴＣＡＡＴＧＣＴＡＧＡＡＴＧＧＧＴＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＧＣＣＣＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＴＧＣＡＣＡＣＡＴＴＴＴＴＴＣＧＡＡＴＧＣＣＧＡＡＡＡＡＴＣＧＴＡＣＡＧＧＡＣＡＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＣＣＡＡＡＡＧＣＣＡＧＧＴＧＧＴＣＣＴＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＡＣＡＴＧＧＡＣＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＣＧＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＴＡＣＧＧＴＧＧＴＡＡＣＧＧＧＧＡＣＴＡＣＣＡＣＴＡＣＴＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号１５）
ＣＡＧＧＴＣＡＣＣＴＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＣＡＣＡＧＡＧＡＣＣＣＴＣＡＣＧＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＣＣＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＴＣＡＣＴＣＡＴＣＡＡＴＧＣＴＡＧＡＡＴＧＧＧＴＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＧＣＣＣＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＴＧＣＡＣＡＣＡＴＴＴＴＴＴＣＧＡＡＴＧＣＣＧＡＡＡＡＡＴＣＧＴＡＣＡＧＧＡＣＡＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＣＣＡＡＡＡＧＣＣＡＧＧＴＧＧＴＣＣＴＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＡＣＡＴＧＧＡＣＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＣＧＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＴＡＣＧＧＴＧＧＴＡＡＣＧＧＧＧＡＣＴＡＣＣＡＣＴＡＣＴＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号１５）
【0211】
クローン１０Ｅ３のＨＣ ＡＡ－下線を引いたＣＤＲ
ＱＶＴＬＫＥＳＧＰＶＬＶＫＰＴＥＴＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＩＮＡＲＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＦＳＮＡＥＫＳＹＲＴＳＬＫＳＲＬＴＩＳＫＤＴＳＫＳＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＩＰＧＹＧＧＮＧＤＹＨＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１６）
ＱＶＴＬＫＥＳＧＰＶＬＶＫＰＴＥＴＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＩＮＡＲＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＦＳＮＡＥＫＳＹＲＴＳＬＫＳＲＬＴＩＳＫＤＴＳＫＳＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＩＰＧＹＧＧＮＧＤＹＨＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１６）
【0212】
クローン１０Ｅ３のＨＣ ＡＡ ＣＤＲ１：
ＮＡＲＭＧＶＳ（配列番号１７）
ＮＡＲＭＧＶＳ（配列番号１７）
【0213】
クローン１０Ｅ３のＨＣ ＡＡ ＣＤＲ２：
ＨＩＦＳＮＡＥＫＳＹＲＴＳＬＫＳ（配列番号１８）
ＨＩＦＳＮＡＥＫＳＹＲＴＳＬＫＳ（配列番号１８）
【0214】
クローン１０Ｅ３のＨＣ ＡＡ ＣＤＲ３：
ＩＰＧＹＧＧＮＧＤＹＨＹＹＧＭＤＶ（配列番号１９）
ＩＰＧＹＧＧＮＧＤＹＨＹＹＧＭＤＶ（配列番号１９）
【0215】
クローン１０Ｅ３のＬＣ ＤＮＡ
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＡＧＡＡＡＴＧＡＴＴＴＡＧＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＧＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＧＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＧＣＡＴＡＡＴＡＡＴＴＴＣＣＣＧＴＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＡ（配列番号２０）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＡＧＡＡＡＴＧＡＴＴＴＡＧＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＧＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＧＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＧＣＡＴＡＡＴＡＡＴＴＴＣＣＣＧＴＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＡ（配列番号２０）
【0216】
クローン１０Ｅ３のＬＣ ＡＡ（下線を引いたＣＤＲ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＳＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＮＮＦＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号２１）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＳＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＮＮＦＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号２１）
【0217】
クローン１０Ｅ３のＬＣ ＣＤＲ１ ＡＡ：
ＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧ（配列番号２２）
ＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧ（配列番号２２）
【0218】
クローン１０Ｅ３のＬＣ ＣＤＲ２ ＡＡ：
ＡＳＳＴＬＱＳ（配列番号２３）
ＡＳＳＴＬＱＳ（配列番号２３）
【0219】
クローン１０Ｅ３のＬＣ ＣＤＲ３ ＡＡ：
ＬＱＨＮＮＦＰＷＴ（配列番号２４）
ＬＱＨＮＮＦＰＷＴ（配列番号２４）
【0220】
クローン２Ｅ７のＨＣ ＤＮＡ
ＣＡＧＧＴＣＡＣＣＴＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＣＡＣＡＧＡＧＡＣＣＣＴＣＡＣＧＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＣＣＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＴＣＡＣＴＣＡＧＧＡＡＴＧＣＴＡＧＡＡＴＧＧＧＴＧＴＡＡＧＣＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＧＧＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＴＧＣＡＣＡＣＡＴＴＴＴＴＴＣＧＡＡＴＧＡＣＧＡＡＡＡＡＡＣＣＴＡＣＡＧＣＡＣＡＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＣＴＣＣＡＡＡＧＧＣＣＡＧＧＴＧＧＴＣＣＴＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＴＧＧＡＣＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＣＧＧＡＴＡＣＣＣＴＡＣＴＡＴＧＧＴＴＣＧＧＧＧＡＧＴＣＡＴＡＡＣＴＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号２５）
ＣＡＧＧＴＣＡＣＣＴＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＣＡＣＡＧＡＧＡＣＣＣＴＣＡＣＧＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＣＣＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＴＣＡＣＴＣＡＧＧＡＡＴＧＣＴＡＧＡＡＴＧＧＧＴＧＴＡＡＧＣＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＧＧＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＴＧＣＡＣＡＣＡＴＴＴＴＴＴＣＧＡＡＴＧＡＣＧＡＡＡＡＡＡＣＣＴＡＣＡＧＣＡＣＡＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＣＴＣＣＡＡＡＧＧＣＣＡＧＧＴＧＧＴＣＣＴＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＴＧＧＡＣＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＣＧＧＡＴＡＣＣＣＴＡＣＴＡＴＧＧＴＴＣＧＧＧＧＡＧＴＣＡＴＡＡＣＴＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号２５）
【0221】
クローン２Ｅ７のＨＣ ＡＡ（下線を引いたＣＤＲ）
ＱＶＴＬＫＥＳＧＰＶＬＶＫＰＴＥＴＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＲＮＡＲＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＦＳＮＤＥＫＴＹＳＴＳＬＫＳＲＬＴＩＳＲＤＴＳＫＧＱＶＶＬＴＭＴＫＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＩＰＹＹＧＳＧＳＨＮＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号９９）
ＱＶＴＬＫＥＳＧＰＶＬＶＫＰＴＥＴＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＲＮＡＲＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＦＳＮＤＥＫＴＹＳＴＳＬＫＳＲＬＴＩＳＲＤＴＳＫＧＱＶＶＬＴＭＴＫＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＩＰＹＹＧＳＧＳＨＮＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号９９）
【0222】
クローン２Ｅ７のＨＣ ＡＡ ＣＤＲ１：
ＮＡＲＭＧＶＳ（配列番号１７）
ＮＡＲＭＧＶＳ（配列番号１７）
【0223】
クローン２Ｅ７のＨＣ ＡＡ ＣＤＲ２：
ＨＩＦＳＮＤＥＫＴＹＳＴＳＬＫＳ（配列番号２６）
ＨＩＦＳＮＤＥＫＴＹＳＴＳＬＫＳ（配列番号２６）
【0224】
クローン２Ｅ７のＨＣ ＡＡ ＣＤＲ３：
ＩＰＹＹＧＳＧＳＨＮＹＧＭＤＶ（配列番号２７）
ＩＰＹＹＧＳＧＳＨＮＹＧＭＤＶ（配列番号２７）
【0225】
クローン２Ｅ７のＬＣ ＤＮＡ
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＧＡＣＡＴＴＡＧＡＡＡＴＧＡＴＴＴＣＧＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＣＡＧＣＧＣＣＴＧＣＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＧＴＡＴＡＡＴＡＣＴＴＡＣＣＣＧＴＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＡ（配列番号２８）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＧＡＣＡＴＴＡＧＡＡＡＴＧＡＴＴＴＣＧＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＣＡＧＣＧＣＣＴＧＣＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＧＴＡＴＡＡＴＡＣＴＴＡＣＣＣＧＴＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＡ（配列番号２８）
【0226】
クローン２Ｅ７のＬＣ ＡＡ（下線を引いたＣＤＲ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＲＮＤＦＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＱＲＬＬＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＹＮＴＹＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号２９）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＲＮＤＦＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＱＲＬＬＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＹＮＴＹＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号２９）
【0227】
クローン２Ｅ７のＬＣ ＡＡ ＣＤＲ１：
ＲＡＳＱＤＩＲＮＤＦＧ（配列番号３０）
ＲＡＳＱＤＩＲＮＤＦＧ（配列番号３０）
【0228】
クローン２Ｅ７のＬＣ ＡＡ ＣＤＲ２：
ＡＡＳＴＬＱＳ（配列番号３１）
ＡＡＳＴＬＱＳ（配列番号３１）
【0229】
クローン２Ｅ７のＬＨＣ ＡＡ ＣＤＲ３：
ＬＱＹＮＴＹＰＷＴ（配列番号３２）
ＬＱＹＮＴＹＰＷＴ（配列番号３２）
【0230】
クローン８Ｂ５のＨＣ ＤＮＡ
ＣＡＧＡＴＡＣＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＴＡＧＣＧＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＡＡＣＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＴＡＡＴＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＧＡＧＡＣＣＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＴＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＧＴＣＧＧＧＡＡＴＡＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＧＣＣＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号３３）
ＣＡＧＡＴＡＣＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＴＡＧＣＧＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＡＡＣＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＴＡＡＴＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＧＡＧＡＣＣＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＴＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＧＴＣＧＧＧＡＡＴＡＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＧＣＣＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号３３）
【0231】
クローン８Ｂ５のＨＣ ＡＡ（下線を引いたＣＤＲ）
ＱＩＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＦＴＦＫＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＮＥＹＹＧＤＰＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＭＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＧＩＡＶＡＧＡＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３４）
ＱＩＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＦＴＦＫＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＮＥＹＹＧＤＰＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＭＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＧＩＡＶＡＧＡＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３４）
【0232】
クローン８Ｂ５のＨＣ ＡＡ ＣＤＲ１：
ＮＹＧＭＨ（配列番号９７）
ＮＹＧＭＨ（配列番号９７）
【0233】
クローン８Ｂ５のＨＣ ＡＡ ＣＤＲ２：
ＶＩＷＹＤＧＳＮＥＹＹＧＤＰＶＫＧ（配列番号３５）
ＶＩＷＹＤＧＳＮＥＹＹＧＤＰＶＫＧ（配列番号３５）
【0234】
クローン８Ｂ５のＨＣ ＡＡ ＣＤＲ３：
ＳＧＩＡＶＡＧＡＦＤＹ（配列番号３６）
ＳＧＩＡＶＡＧＡＦＤＹ（配列番号３６）
【0235】
クローン８Ｂ５のＬＣ ＤＮＡ
ＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＡＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＴＴＧＣＡＴＣＣＡＧＡＡＧＧＧＣＣＧＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＴＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＡＡＴＧＴＴＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＣＴＡＴＧＧＴＡＧＧＡＣＡＣＣＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＴＡＴＣＡＡＡＣＧＡ（配列番号３７）
ＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＡＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＴＴＧＣＡＴＣＣＡＧＡＡＧＧＧＣＣＧＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＴＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＡＡＴＧＴＴＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＣＴＡＴＧＧＴＡＧＧＡＣＡＣＣＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＴＡＴＣＡＡＡＣＧＡ（配列番号３７）
【0236】
クローン８Ｂ５のＬＣ ＡＡ（下線を引いたＣＤＲ）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＤＴＬＳＬＳＰＧＥＫＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＳＬＬＩＹＶＡＳＲＲＡＡＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＧＭＦＹＣＱＨＹＧＲＴＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫＲ（配列番号４１）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＤＴＬＳＬＳＰＧＥＫＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＳＬＬＩＹＶＡＳＲＲＡＡＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＧＭＦＹＣＱＨＹＧＲＴＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫＲ（配列番号４１）
【0237】
クローン８Ｂ５のＬＣ ＡＡ ＣＤＲ１：
ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡ（配列番号３８）
ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡ（配列番号３８）
【0238】
クローン８Ｂ５のＬＣ ＡＡ ＣＤＲ２：
ＶＡＳＲＲＡＡ（配列番号３９）
ＶＡＳＲＲＡＡ（配列番号３９）
【0239】
クローン８Ｂ５のＬＣ ＡＡ ＣＤＲ３：
ＱＨＹＧＲＴＰＦＴ（配列番号４０）
ＱＨＹＧＲＴＰＦＴ（配列番号４０）
【0240】
クローン４Ｅ９のＨＣ ＤＮＡ
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＴＡＴＡＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＡＣＣＣＴＡＡＣＡＧＴＧＧＴＧＧＣＡＣＡＡＡＣＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＧＧＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＴＴＴＡＣＡＴＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＡＴＡＣＧＣＧＧＴＧＧＴＡＡＣＴＣＧＧＴＣＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号９８）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＴＡＴＡＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＡＣＣＣＴＡＡＣＡＧＴＧＧＴＧＧＣＡＣＡＡＡＣＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＧＧＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＴＴＴＡＣＡＴＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＡＴＡＣＧＣＧＧＴＧＧＴＡＡＣＴＣＧＧＴＣＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号９８）
【0241】
クローン４Ｅ９のＨＣ ＡＡ（下線を引いたＣＤＲ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＩＨＷＶＲＱＡＰＥＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＡＲＤＴＳＩＳＴＶＹＭＤＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＩＲＧＧＮＳＶＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４２）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＩＨＷＶＲＱＡＰＥＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＡＲＤＴＳＩＳＴＶＹＭＤＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＩＲＧＧＮＳＶＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４２）
【0242】
クローン４Ｅ９のＨＣ ＡＡ ＣＤＲ１：
ＧＹＹＩＨ（配列番号４３）
ＧＹＹＩＨ（配列番号４３）
【0243】
クローン４Ｅ９のＨＣ ＡＡ ＣＤＲ２：
ＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号４４）
ＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号４４）
【0244】
クローン４Ｅ９のＨＣ ＡＡ ＣＤＲ３：
ＩＲＧＧＮＳＶＦＤＹ（配列番号４５）
ＩＲＧＧＮＳＶＦＤＹ（配列番号４５）
【0245】
クローン４Ｅ９のＬＣ ＤＮＡ
ＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＡＣＴＣＣＣＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＣＧＡＧＡＧＧＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＡＧＴＣＣＡＣＣＣＡＧＡＧＴＡＴＴＴＴＡＴＡＣＡＣＣＴＣＣＡＡＣＡＡＴＡＡＧＡＡＣＴＴＣＴＴＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＣＡＧＣＣＴＣＣＴＡＡＡＣＴＧＣＴＣＡＴＴＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＡＴＣＣＧＧＧＡＡＴＣＣＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＧＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＡＴＡＴＴＴＴＡＧＴＡＣＴＡＴＧＴＴＣＡＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＡ（配列番号４６）
ＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＡＣＴＣＣＣＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＣＧＡＧＡＧＧＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＡＧＴＣＣＡＣＣＣＡＧＡＧＴＡＴＴＴＴＡＴＡＣＡＣＣＴＣＣＡＡＣＡＡＴＡＡＧＡＡＣＴＴＣＴＴＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＣＡＧＣＣＴＣＣＴＡＡＡＣＴＧＣＴＣＡＴＴＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＡＴＣＣＧＧＧＡＡＴＣＣＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＧＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＡＴＡＴＴＴＴＡＧＴＡＣＴＡＴＧＴＴＣＡＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＡ（配列番号４６）
【0246】
クローン４Ｅ９のＬＣ ＡＡ（下線を引いたＣＤＲ）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＴＱＳＩＬＹＴＳＮＮＫＮＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＳＷＡＳＩＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＡＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＦＳＴＭＦＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号４７）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＴＱＳＩＬＹＴＳＮＮＫＮＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＳＷＡＳＩＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＡＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＦＳＴＭＦＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号４７）
【0247】
クローン４Ｅ９のＬＣ ＡＡ ＣＤＲ１：
ＫＳＴＱＳＩＬＹＴＳＮＮＫＮＦＬＡ（配列番号４８）
ＫＳＴＱＳＩＬＹＴＳＮＮＫＮＦＬＡ（配列番号４８）
【0248】
クローン４Ｅ９のＬＣ ＡＡ ＣＤＲ２：
ＷＡＳＩＲＥＳ（配列番号４９）
ＷＡＳＩＲＥＳ（配列番号４９）
【0249】
クローン４Ｅ９のＬＣ ＡＡ ＣＤＲ３：
ＱＱＹＦＳＴＭＦＳ（配列番号５０）
ＱＱＹＦＳＴＭＦＳ（配列番号５０）
【0250】
クローン１１Ｆ１１のＨＣ ＤＮＡ
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＧＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＴＣＡＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣＡＧＴＡＧＴＧＧＴＧＣＡＴＡＣＴＡＣＴＧＧＡＣＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＧＴＡＣＡＴＣＣＡＴＴＡＣＡＧＴＧＧＧＡＧＣＡＣＣＴＡＣＴＣＣＡＡＣＣＣＧＴＣＣＣＴＣＡＡＧＡＧＴＣＧＡＡＴＴＡＣＣＡＴＡＴＣＧＴＴＡＧＡＣＡＣＧＴＣＴＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＣＴＣＴＧＴＧＡＣＴＧＣＣＧＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＣＡＡＧＡＧＧＡＣＴＡＣＧＧＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＴＴＣＣＴＣＡ（配列番号５１）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＧＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＴＣＡＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣＡＧＴＡＧＴＧＧＴＧＣＡＴＡＣＴＡＣＴＧＧＡＣＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＧＴＡＣＡＴＣＣＡＴＴＡＣＡＧＴＧＧＧＡＧＣＡＣＣＴＡＣＴＣＣＡＡＣＣＣＧＴＣＣＣＴＣＡＡＧＡＧＴＣＧＡＡＴＴＡＣＣＡＴＡＴＣＧＴＴＡＧＡＣＡＣＧＴＣＴＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＣＴＣＴＧＴＧＡＣＴＧＣＣＧＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＣＡＡＧＡＧＧＡＣＴＡＣＧＧＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＴＴＣＣＴＣＡ（配列番号５１）
【0251】
クローン１１Ｆ１１のＨＣ ＡＡ（下線を引いたＣＤＲ）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＳＧＡＹＹＷＴＷＩＲＱＨＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＨＹＳＧＳＴＹＳＮＰＳＬＫＳＲＩＴＩＳＬＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＮＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＱＥＤＹＧＧＬＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５２）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＳＧＡＹＹＷＴＷＩＲＱＨＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＨＹＳＧＳＴＹＳＮＰＳＬＫＳＲＩＴＩＳＬＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＮＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＱＥＤＹＧＧＬＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５２）
【0252】
クローン１１Ｆ１１のＨＣ ＡＡ ＣＤＲ１：
ＳＧＡＹＹＷＴ（配列番号５３）
ＳＧＡＹＹＷＴ（配列番号５３）
【0253】
クローン１１Ｆ１のＨＣ ＡＡ ＣＤＲ２：
ＹＩＨＹＳＧＳＴＹＳＮＰＳＬＫＳ（配列番号５４）
ＹＩＨＹＳＧＳＴＹＳＮＰＳＬＫＳ（配列番号５４）
【0254】
クローン１１Ｆ１のＨＣ ＡＡ ＣＤＲ３：
ＱＥＤＹＧＧＬＦＤＹ（配列番号５５）
ＱＥＤＹＧＧＬＦＤＹ（配列番号５５）
【0255】
クローン１１Ｆ１１のＬＣ ＤＮＡ
ＧＡＡＡＴＡＧＴＧＡＴＧＡＣＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＡＴＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＴＡＣＣＡＣＣＧＡＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣＴＣＣＣＣＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＡＴＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＧＴＴＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＡＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＴＴＡＴＡＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＴＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＡ（配列番号５６）
ＧＡＡＡＴＡＧＴＧＡＴＧＡＣＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＡＴＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＴＡＣＣＡＣＣＧＡＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣＴＣＣＣＣＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＡＴＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＧＴＴＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＡＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＴＴＡＴＡＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＴＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＡ（配列番号５６）
【0256】
クローン１１Ｆ１１のＬＣ ＡＡ（下線を引いたＣＤＲ）
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＩＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＴＴＤＬＡＷＹＱＱＭＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＴＲＡＴＧＦＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＦＡＶＹＹＣＱＨＹＫＴＷＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号５７）
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＩＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＴＴＤＬＡＷＹＱＱＭＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＴＲＡＴＧＦＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＦＡＶＹＹＣＱＨＹＫＴＷＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号５７）
【0257】
クローン１１Ｆ１１のＬＣ ＡＡ ＣＤＲ１：
ＲＡＳＱＳＶＴＴＤＬＡ（配列番号５８）
ＲＡＳＱＳＶＴＴＤＬＡ（配列番号５８）
【0258】
クローン１１Ｆ１ ＬＣ ＡＡ ＣＤＲ２：
ＤＡＳＴＲＡＴ（配列番号５９）
ＤＡＳＴＲＡＴ（配列番号５９）
【0259】
クローン１１Ｆ１のＬＣ ＡＡ ＣＤＲ３：
ＱＨＹＫＴＷＰＬＴ（配列番号６０）
ＱＨＹＫＴＷＰＬＴ（配列番号６０）
【0260】
【化1】
【0261】
【化2】
【0262】
【化3】
【0263】
【化4】
【0264】
【化5】
【0265】
【化6】
【0266】
【化7】
【0267】
【化8】
【0268】
【化9】
【0269】
【化10】
【0270】
【化11】
【0271】
【化12】
【0272】
【化13】
【0273】
【化14】
【0274】
【化15】
【0275】
【化16】
【0276】
【化17】
【0277】
【化18】
【0278】
【化19】
【0279】
【化20】
【0280】
【化21】
【0281】
【化22】
【0282】
【化23】
【0283】
【化24】
【0284】
ヒトのＦＬＴ３ ＮＭ＿００４１１９ ＡＡ
【0285】
ＭＰＡＬＡＲＤＧＧＱＬＰＬＬＶＶＦＳＡＭＩＦＧＴＩＴＮＱＤＬＰＶＩＫＣＶＬＩＮＨＫＮＮＤＳＳＶＧＫＳＳＳＹＰＭＶＳＥＳＰＥＤＬＧＣＡＬＲＰＱＳＳＧＴＶＹＥＡＡＡＶＥＶＤＶＳＡＳＩＴＬＱＶＬＶＤＡＰＧＮＩＳＣＬＷＶＦＫＨＳＳＬＮＣＱＰＨＦＤＬＱＮＲＧＶＶＳＭＶＩＬＫＭＴＥＴＱＡＧＥＹＬＬＦＩＱＳＥＡＴＮＹＴＩＬＦＴＶＳＩＲＮＴＬＬＹＴＬＲＲＰＹＦＲＫＭＥＮＱＤＡＬＶＣＩＳＥＳＶＰＥＰＩＶＥＷＶＬＣＤＳＱＧＥＳＣＫＥＥＳＰＡＶＶＫＫＥＥＫＶＬＨＥＬＦＧＴＤＩＲＣＣＡＲＮＥＬＧＲＥＣＴＲＬＦＴＩＤＬＮＱＴＰＱＴＴＬＰＱＬＦＬＫＶＧＥＰＬＷＩＲＣＫＡＶＨＶＮＨＧＦＧＬＴＷＥＬＥＮＫＡＬＥＥＧＮＹＦＥＭＳＴＹＳＴＮＲＴＭＩＲＩＬＦＡＦＶＳＳＶＡＲＮＤＴＧＹＹＴＣＳＳＳＫＨＰＳＱＳＡＬＶＴＩＶＥＫＧＦＩＮＡＴＮＳＳＥＤＹＥＩＤＱＹＥＥＦＣＦＳＶＲＦＫＡＹＰＱＩＲＣＴＷＴＦＳＲＫＳＦＰＣＥＱＫＧＬＤＮＧＹＳＩＳＫＦＣＮＨＫＨＱＰＧＥＹＩＦＨＡＥＮＤＤＡＱＦＴＫＭＦＴＬＮＩＲＲＫＰＱＶＬＡＥＡＳＡＳＱＡＳＣＦＳＤＧＹＰＬＰＳＷＴＷＫＫＣＳＤＫＳＰＮＣＴＥＥＩＴＥＧＶＷＮＲＫＡＮＲＫＶＦＧＱＷＶＳＳＳＴＬＮＭＳＥＡＩＫＧＦＬＶＫＣＣＡＹＮＳＬＧＴＳＣＥＴＩＬＬＮＳＰＧＰＦＰＦＩＱＤＮＩＳＦＹＡＴＩＧＶＣＬＬＦＩＶＶＬＴＬＬＩＣＨＫＹＫＫＱＦＲＹＥＳＱＬＱＭＶＱＶＴＧＳＳＤＮＥＹＦＹＶＤＦＲＥＹＥＹＤＬＫＷＥＦＰＲＥＮＬＥＦＧＫＶＬＧＳＧＡＦＧＫＶＭＮＡＴＡＹＧＩＳＫＴＧＶＳＩＱＶＡＶＫＭＬＫＥＫＡＤＳＳＥＲＥＡＬＭＳＥＬＫＭＭＴＱＬＧＳＨＥＮＩＶＮＬＬＧＡＣＴＬＳＧＰＩＹＬＩＦＥＹＣＣＹＧＤＬＬＮＹＬＲＳＫＲＥＫＦＨＲＴＷＴＥＩＦＫＥＨＮＦＳＦＹＰＴＦＱＳＨＰＮＳＳＭＰＧＳＲＥＶＱＩＨＰＤＳＤＱＩＳＧＬＨＧＮＳＦＨＳＥＤＥＩＥＹＥＮＱＫＲＬＥＥＥＥＤＬＮＶＬＴＦＥＤＬＬＣＦＡＹＱＶＡＫＧＭＥＦＬＥＦＫＳＣＶＨＲＤＬＡＡＲＮＶＬＶＴＨＧＫＶＶＫＩＣＤＦＧＬＡＲＤＩＭＳＤＳＮＹＶＶＲＧＮＡＲＬＰＶＫＷＭＡＰＥＳＬＦＥＧＩＹＴＩＫＳＤＶＷＳＹＧＩＬＬＷＥＩＦＳＬＧＶＮＰＹＰＧＩＰＶＤＡＮＦＹＫＬＩＱＮＧＦＫＭＤＱＰＦＹＡＴＥＥＩＹＩＩＭＱＳＣＷＡＦＤＳＲＫＲＰＳＦＰＮＬＴＳＦＬＧＣＱＬＡＤＡＥＥＡＭＹＱＮＶＤＧＲＶＳＥＣＰＨＴＹＱＮＲＲＰＦＳＲＥＭＤＬＧＬＬＳＰＱＡＱＶＥＤＳ（配列番号８５）
【0286】
ＣＡＲのシグナルペプチド ＤＮＡ
ＡＴＧＧＣＡＣＴＣＣＣＣＧＴＡＡＣＴＧＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＧＴＴＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＣＡＣＧＣＣＣＧ（配列番号８６）
ＡＴＧＧＣＡＣＴＣＣＣＣＧＴＡＡＣＴＧＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＧＴＴＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＣＡＣＧＣＣＣＧ（配列番号８６）
【0287】
ＣＡＲのシグナルペプチド：
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号８７）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号８７）
【0288】
ｓｃＦｖ Ｇ４Ｓリンカー ＤＮＡ
ＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧＧＧＣＴＣＣ（配列番号８８）
ＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧＧＧＣＴＣＣ（配列番号８８）
【0289】
ｓｃＦｖ Ｇ４ｓリンカー：
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８９）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８９）
【0290】
ｓｃＦｖ Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー ＤＮＡ
ＧＧＧＴＣＴＡＣＡＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＡＧＣＣＣＧＧＡＡＧＴＧＧＣＧＡＡＧＧＴＡＧＴＡＣＡＡＡＧＧＧＧ（配列番号９０）
ＧＧＧＴＣＴＡＣＡＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＡＧＣＣＣＧＧＡＡＧＴＧＧＣＧＡＡＧＧＴＡＧＴＡＣＡＡＡＧＧＧＧ（配列番号９０）
【0291】
ｓｃＦｖ Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー：
ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号９１）
ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号９１）
【0292】
４－１ＢＢ 核酸配列（細胞内ドメイン）
ＡＡＧＣＧＣＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＴＣＣＴＣＴＡＣＡＴＴＴＴＴＡＡＧＣＡＧＣＣＴＴＴＴＡＴＧＡＧＧＣＣＣＧＴＡＣＡＧＡＣＡＡＣＡＣＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＴＴＣＣＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＴＧＣＧＡＧＣＴＧ（配列番号９２）
ＡＡＧＣＧＣＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＴＣＣＴＣＴＡＣＡＴＴＴＴＴＡＡＧＣＡＧＣＣＴＴＴＴＡＴＧＡＧＧＣＣＣＧＴＡＣＡＧＡＣＡＡＣＡＣＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＴＴＣＣＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＴＧＣＧＡＧＣＴＧ（配列番号９２）
【0293】
４－１ＢＢ ＡＡ（細胞内ドメイン）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号９３）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号９３）
【0294】
ＯＸ４０ ＡＡ
ＲＲＤＱＲＬＰＰＤＡＨＫＰＰＧＧＧＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＡＤＡＨＳＴＬＡＫＩ（配列番号９４）
ＲＲＤＱＲＬＰＰＤＡＨＫＰＰＧＧＧＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＡＤＡＨＳＴＬＡＫＩ（配列番号９４）
【0295】
参照による組み入れ
本明細書で言及されている出版物、特許及び特許出願はすべて、それぞれ個々の出版物、特許、又は特許出願が具体的に且つ個々に参照によって組み入れられるように指示されたかのような同じ程度に参照によって本明細書に組み入れられる。しかしながら、本明細書での参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明にとって従来技術であるという承認として解釈されるべきではない。参照によって組み入れられた参考文献で提供された定義又は用語のいずれかが本明細書で提供されている用語及び議論と異なる程度に、ここでの用語及び定義は規制する。
本明細書で言及されている出版物、特許及び特許出願はすべて、それぞれ個々の出版物、特許、又は特許出願が具体的に且つ個々に参照によって組み入れられるように指示されたかのような同じ程度に参照によって本明細書に組み入れられる。しかしながら、本明細書での参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明にとって従来技術であるという承認として解釈されるべきではない。参照によって組み入れられた参考文献で提供された定義又は用語のいずれかが本明細書で提供されている用語及び議論と異なる程度に、ここでの用語及び定義は規制する。
【0296】
同等物
上述の文書の明細書は、当業者が本発明を実践するのを可能にするのに十分であると考えられる。上述の記載及び例は本発明の特定の好まれる実施形態を詳述し、本発明者らによって熟考された最良の方法を記載している。しかしながら、どんなに詳細に上述のことが本文に現れても、本発明は多数の方法で実践されてもよく、本発明は添付の特許請求の範囲及びその同等物に従って解釈されるべきであることが十分に理解されるであろう。
上述の文書の明細書は、当業者が本発明を実践するのを可能にするのに十分であると考えられる。上述の記載及び例は本発明の特定の好まれる実施形態を詳述し、本発明者らによって熟考された最良の方法を記載している。しかしながら、どんなに詳細に上述のことが本文に現れても、本発明は多数の方法で実践されてもよく、本発明は添付の特許請求の範囲及びその同等物に従って解釈されるべきであることが十分に理解されるであろう。
【0297】
実施された実験及び達成された結果を含む以下の実施例は説明目的のみのために提供されるのであって本発明を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【0298】
実施例１
Ｎａｍａｌｗａ細胞、ＭＶ４；１１細胞、及びＨＬ６０細胞（ＡＴＣＣ）及びＥｏＬ１細胞（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をＲＰＭＩ１６４０（Ｌｏｎｚａ）＋１０％ＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）＋１×ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌグルタミン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）（Ｒ１０）の培地で培養し、０．５～２．０×１０６個の細胞／ｍｌの間の細胞密度で維持した。細胞表面のＦＬＴ３の発現を調べるために、細胞を染色緩衝液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）にて抗ＦＬＴ３抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）又はＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に４℃で３０分間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、データ取得に先立ってヨウ化プロピジウム（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に染色緩衝液に再浮遊させた。標的細胞上のＦＬＴ３の発現を図１に示す。
Ｎａｍａｌｗａ細胞、ＭＶ４；１１細胞、及びＨＬ６０細胞（ＡＴＣＣ）及びＥｏＬ１細胞（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をＲＰＭＩ１６４０（Ｌｏｎｚａ）＋１０％ＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）＋１×ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌグルタミン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）（Ｒ１０）の培地で培養し、０．５～２．０×１０６個の細胞／ｍｌの間の細胞密度で維持した。細胞表面のＦＬＴ３の発現を調べるために、細胞を染色緩衝液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）にて抗ＦＬＴ３抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）又はＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に４℃で３０分間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、データ取得に先立ってヨウ化プロピジウム（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に染色緩衝液に再浮遊させた。標的細胞上のＦＬＴ３の発現を図１に示す。
【0299】
実施例２
Ｔ７プロモータとＣＡＲ構築物とベータグロビン安定化配列とをコードするプラスミドを１０μｇのＤＮＡのＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨ１（ＮＥＢ）による一晩の消化によって線状化した。次いでプロテイナーゼＫ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，６００Ｕ／ｍｌ）によって５０℃で２時間ＤＮＡを消化し、フェノール／クロロホルムによって精製し、酢酸ナトリウムと２容量のエタノールを加えることによって沈殿させた。次いでペレットを乾燥させ、ＲＮＡ分解酵素／ＤＮＡ分解酵素を含まない水に再懸濁し、ＮａｎｏＤｒｏｐを用いて定量した。次いで、製造元の指示書に従ってｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ Ｕｌｔｒａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いた試験管内の転写に１μｇの線状ＤＮＡを使用した。製造元の指示書に従ってＭＥＧＡＣｌｅａｒキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてＲＮＡをさらに精製し、ＮａｎｏＤｒｏｐを用いて定量した。ｍＲＮＡの完全性をアガロースゲル上での移動度を用いて評価した。製造元の指示書によってＦｉｃｏｌｌ－ｐａｑｕｅ密度遠心分離を用いて健常ドナーの白血球濃縮物（ｌｅｕｋｏｐａｋ）（Ｈｅｍａｃａｒｅ）からＰＢＭＣを単離した。Ｒ１０培地＋ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ，Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標），Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ（登録商標）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）におけるＯＫＴ３（５０ｎｇ／ｍｌ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＰＢＭＣを刺激した。刺激の７日後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で２回Ｔ細胞を洗浄し、２．５×１０７個の細胞／ｍｌの最終濃度でＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地に再浮遊させた。エレクトロポレーション当たり１０μｇのｍＲＮＡを使用した。細胞のエレクトロポレーションは、Ｇｅｍｉｎｉ Ｘ２ ｓｙｓｔｅｍ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＢＴＸ）を用いて行い、２ｍｍのキュベット（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＢＴＸ）にて単回４００Ｖのパルスを０．５ミリ秒間送達した。細胞を直ちにＲ１０＋ＩＬ－２培地に移し、６時間回復させた。ＣＡＲの発現を調べるために、染色緩衝液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）におけるＦＬＴ－＝３－ＨＩＳ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．）又はビオチン化タンパク質Ｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でＴ細胞を４℃で３０分間染色した。次いで細胞を洗浄し、染色緩衝液における抗－ＨＩＳ－ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）又はＰＥストレプトアビジン（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）によって４℃で３０分間染色した。次いで細胞を洗浄し、データ取得に先立ってヨウ化プロピジウム（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に染色緩衝液に再浮遊させた。エレクトロポレーションしたＴ細胞におけるＦＬＴ３ ＣＡＲの発現は図２に示す。
Ｔ７プロモータとＣＡＲ構築物とベータグロビン安定化配列とをコードするプラスミドを１０μｇのＤＮＡのＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨ１（ＮＥＢ）による一晩の消化によって線状化した。次いでプロテイナーゼＫ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，６００Ｕ／ｍｌ）によって５０℃で２時間ＤＮＡを消化し、フェノール／クロロホルムによって精製し、酢酸ナトリウムと２容量のエタノールを加えることによって沈殿させた。次いでペレットを乾燥させ、ＲＮＡ分解酵素／ＤＮＡ分解酵素を含まない水に再懸濁し、ＮａｎｏＤｒｏｐを用いて定量した。次いで、製造元の指示書に従ってｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ Ｕｌｔｒａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いた試験管内の転写に１μｇの線状ＤＮＡを使用した。製造元の指示書に従ってＭＥＧＡＣｌｅａｒキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてＲＮＡをさらに精製し、ＮａｎｏＤｒｏｐを用いて定量した。ｍＲＮＡの完全性をアガロースゲル上での移動度を用いて評価した。製造元の指示書によってＦｉｃｏｌｌ－ｐａｑｕｅ密度遠心分離を用いて健常ドナーの白血球濃縮物（ｌｅｕｋｏｐａｋ）（Ｈｅｍａｃａｒｅ）からＰＢＭＣを単離した。Ｒ１０培地＋ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ，Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標），Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ（登録商標）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）におけるＯＫＴ３（５０ｎｇ／ｍｌ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＰＢＭＣを刺激した。刺激の７日後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で２回Ｔ細胞を洗浄し、２．５×１０７個の細胞／ｍｌの最終濃度でＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地に再浮遊させた。エレクトロポレーション当たり１０μｇのｍＲＮＡを使用した。細胞のエレクトロポレーションは、Ｇｅｍｉｎｉ Ｘ２ ｓｙｓｔｅｍ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＢＴＸ）を用いて行い、２ｍｍのキュベット（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＢＴＸ）にて単回４００Ｖのパルスを０．５ミリ秒間送達した。細胞を直ちにＲ１０＋ＩＬ－２培地に移し、６時間回復させた。ＣＡＲの発現を調べるために、染色緩衝液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）におけるＦＬＴ－＝３－ＨＩＳ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．）又はビオチン化タンパク質Ｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でＴ細胞を４℃で３０分間染色した。次いで細胞を洗浄し、染色緩衝液における抗－ＨＩＳ－ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）又はＰＥストレプトアビジン（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）によって４℃で３０分間染色した。次いで細胞を洗浄し、データ取得に先立ってヨウ化プロピジウム（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に染色緩衝液に再浮遊させた。エレクトロポレーションしたＴ細胞におけるＦＬＴ３ ＣＡＲの発現は図２に示す。
【0300】
実施例３
エレクトロポレーションしたＦＬＴ３ ＣＡＲ Ｔ細胞における細胞溶解活性を調べるために、Ｒ１０培地にてエフェクター細胞を１：１のＥ：Ｔ比にて標的細胞と共に培養した。培養の１６時間後、上清をＬｕｍｉｎｅｘ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって解析し、標的細胞の生存率をＣＤ３陰性細胞によるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の取り込みのフローサイトメトリー解析によって評価した。エレクトロポレーションしたＣＡＲ Ｔ細胞における細胞溶解活性を図３に示し、サイトカイン産生を図４に示す。
エレクトロポレーションしたＦＬＴ３ ＣＡＲ Ｔ細胞における細胞溶解活性を調べるために、Ｒ１０培地にてエフェクター細胞を１：１のＥ：Ｔ比にて標的細胞と共に培養した。培養の１６時間後、上清をＬｕｍｉｎｅｘ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって解析し、標的細胞の生存率をＣＤ３陰性細胞によるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の取り込みのフローサイトメトリー解析によって評価した。エレクトロポレーションしたＣＡＲ Ｔ細胞における細胞溶解活性を図３に示し、サイトカイン産生を図４に示す。
【0301】
実施例４
異なるＣＡＲ構築物を含有する第３世代のレンチウイルス遺伝子導入ベクターは、ＶｉｒａＰｏｗｅｒ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に使用されてレンチウイルス上清を生成した。手短には、６００μｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地にて１５μｇのＤＮＡと２２．５μｇのポリエチレンイミン（Ｐｏｌｔｓｃｉｅｎｃｅｓ、１ｍｇ／ｍｌ）を混合することによって形質移入ミックスを生成した。ミックスを室温で５分間インキュベートした。同時に、２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）をトリプシン処理し、数え、１０×１０６個の総数の全細胞を形質移入ミックスと共にＴ７５フラスコに入れた。形質移入の３日後、上清を回収し、０．４５μｍのフィルターで濾過し、使用まで－８０℃で保存した。製造元の指示書によってＦｉｃｏｌｌ－ｐａｑｕｅ密度遠心分離を用いて健常ドナーの白血球濃縮物（Ｈｅｍａｃａｒｅ）からＰＢＭＣを単離した。Ｒ１０培地＋ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ，Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標），Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ（登録商標）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）におけるＯＫＴ３（５０ｎｇ／ｍｌ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＰＢＭＣを刺激した。刺激の４８時間後、ＭＯＩ＝１０でのレンチウイルスを用いて細胞に形質導入した。活性アッセイでの使用に先立って細胞を０．５～２．０×１０６個の細胞／ｍｌで維持した。ＣＡＲの発現を調べるために、染色緩衝液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）におけるＦＬＴ－３－ＨＩＳ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．）又はビオチン化タンパク質Ｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってＴ細胞を４℃で３０分間染色した。次いで細胞を洗浄し、染色緩衝液における抗－ＨＩＳ－ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）又はＰＥストレプトアビジン（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）によって４℃で３０分間染色した。次いで細胞を洗浄し、データ取得に先立ってヨウ化プロピジウム（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に染色緩衝液に再浮遊させた。２人の健常ドナーに由来するＴ細胞におけるＦＬＴ３ ＣＡＲの発現を図５に示す。
異なるＣＡＲ構築物を含有する第３世代のレンチウイルス遺伝子導入ベクターは、ＶｉｒａＰｏｗｅｒ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に使用されてレンチウイルス上清を生成した。手短には、６００μｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地にて１５μｇのＤＮＡと２２．５μｇのポリエチレンイミン（Ｐｏｌｔｓｃｉｅｎｃｅｓ、１ｍｇ／ｍｌ）を混合することによって形質移入ミックスを生成した。ミックスを室温で５分間インキュベートした。同時に、２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）をトリプシン処理し、数え、１０×１０６個の総数の全細胞を形質移入ミックスと共にＴ７５フラスコに入れた。形質移入の３日後、上清を回収し、０．４５μｍのフィルターで濾過し、使用まで－８０℃で保存した。製造元の指示書によってＦｉｃｏｌｌ－ｐａｑｕｅ密度遠心分離を用いて健常ドナーの白血球濃縮物（Ｈｅｍａｃａｒｅ）からＰＢＭＣを単離した。Ｒ１０培地＋ＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ，Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標），Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ（登録商標）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）におけるＯＫＴ３（５０ｎｇ／ｍｌ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＰＢＭＣを刺激した。刺激の４８時間後、ＭＯＩ＝１０でのレンチウイルスを用いて細胞に形質導入した。活性アッセイでの使用に先立って細胞を０．５～２．０×１０６個の細胞／ｍｌで維持した。ＣＡＲの発現を調べるために、染色緩衝液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）におけるＦＬＴ－３－ＨＩＳ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．）又はビオチン化タンパク質Ｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってＴ細胞を４℃で３０分間染色した。次いで細胞を洗浄し、染色緩衝液における抗－ＨＩＳ－ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）又はＰＥストレプトアビジン（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）によって４℃で３０分間染色した。次いで細胞を洗浄し、データ取得に先立ってヨウ化プロピジウム（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に染色緩衝液に再浮遊させた。２人の健常ドナーに由来するＴ細胞におけるＦＬＴ３ ＣＡＲの発現を図５に示す。
【0302】
実施例５
レンチウイルスで形質導入したＦＬＴ３ ＣＡＲ Ｔ細胞における細胞溶解活性を調べるために、エフェクター細胞をＲ１０培地にて１：１のＥ：Ｔ比で標的細胞と共に培養した。共培養の１６時間後、上清をＬｕｍｉｎｅｘ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって分析し、標的細胞の生存率をＣＤ３陰性細胞によるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）取り込みのフローサイトメトリー解析によって評価した。２人の健常ドナーに由来するレンチウイルスで形質導入したＣＡＲ Ｔ細胞の平均細胞溶解活性を図６に示し、各健常ドナーに由来するＣＡＲ Ｔ細胞によるサイトカインの産生を図７に示す。
レンチウイルスで形質導入したＦＬＴ３ ＣＡＲ Ｔ細胞における細胞溶解活性を調べるために、エフェクター細胞をＲ１０培地にて１：１のＥ：Ｔ比で標的細胞と共に培養した。共培養の１６時間後、上清をＬｕｍｉｎｅｘ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって分析し、標的細胞の生存率をＣＤ３陰性細胞によるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）取り込みのフローサイトメトリー解析によって評価した。２人の健常ドナーに由来するレンチウイルスで形質導入したＣＡＲ Ｔ細胞の平均細胞溶解活性を図６に示し、各健常ドナーに由来するＣＡＲ Ｔ細胞によるサイトカインの産生を図７に示す。
【0303】
実施例６
ＦＬＴ３を発現している標的細胞に応答したＣＡＲ Ｔ細胞の増殖を評価するために、Ｒ１０培地にて１：１のＥ：Ｔ比で標的細胞と共培養するのに先立って、Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識した。５日後、ＣＦＳＥの希釈のフローサイトメトリー解析によってＴ細胞の増殖を評価した。ＦＬＴ３ ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖を図８に示す。
ＦＬＴ３を発現している標的細胞に応答したＣＡＲ Ｔ細胞の増殖を評価するために、Ｒ１０培地にて１：１のＥ：Ｔ比で標的細胞と共培養するのに先立って、Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識した。５日後、ＣＦＳＥの希釈のフローサイトメトリー解析によってＴ細胞の増殖を評価した。ＦＬＴ３ ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖を図８に示す。
【0304】
実施例７
生体内での抗白血病活性を調べるために、ヒトＡＭＬの異種モデルで使用するためにＦＬＴ３ ＣＡＲ Ｔ細胞を生成した。ヒトＡＭＬの異種モデルで使用した種々のエフェクターラインのＣＡＲの発現を図９に示す。ルシフェラーゼで標識したＭＶ４；１１細胞（２×１０６個／動物）を５～６週齢のメスＮＳＧマウスに静脈内注射した。６日後、２００μｌのＰＢＳ中の６×１０６個のＴ細胞（約５０％ＣＡＲ＋）を静脈内注射し、生物発光画像解析を用いて動物の腫瘍組織量を毎週測定した。図１０に示すように、１０Ｅ３－ＣＤ２８Ｔ及び８Ｂ５－ＣＤ２８Ｔを発現しているＣＡＲ Ｔ細胞の注射は調べたすべての時点で腫瘍組織量を有意に減らした。図１１に示すように、１０Ｅ３－ＣＤ２８Ｔ又は８Ｂ５－ＣＤ２８Ｔを発現しているＣＡＲ Ｔ細胞の注射が疑似対照で形質導入した細胞又は１０Ｅ３－ＣＤ２８もしくは１０Ｅ３－ＣＤ８構築物を発現しているＣＡＲ Ｔ細胞を投与した動物に比べて有意な延命効果を付与したという生存率解析によってこれはさらに裏付けられた。有効性という点では、１０Ｅ３－ＣＤ２８Ｔ及び８Ｂ５－ＣＤ２８Ｔの構築物間で有意差は観察されなかった。
生体内での抗白血病活性を調べるために、ヒトＡＭＬの異種モデルで使用するためにＦＬＴ３ ＣＡＲ Ｔ細胞を生成した。ヒトＡＭＬの異種モデルで使用した種々のエフェクターラインのＣＡＲの発現を図９に示す。ルシフェラーゼで標識したＭＶ４；１１細胞（２×１０６個／動物）を５～６週齢のメスＮＳＧマウスに静脈内注射した。６日後、２００μｌのＰＢＳ中の６×１０６個のＴ細胞（約５０％ＣＡＲ＋）を静脈内注射し、生物発光画像解析を用いて動物の腫瘍組織量を毎週測定した。図１０に示すように、１０Ｅ３－ＣＤ２８Ｔ及び８Ｂ５－ＣＤ２８Ｔを発現しているＣＡＲ Ｔ細胞の注射は調べたすべての時点で腫瘍組織量を有意に減らした。図１１に示すように、１０Ｅ３－ＣＤ２８Ｔ又は８Ｂ５－ＣＤ２８Ｔを発現しているＣＡＲ Ｔ細胞の注射が疑似対照で形質導入した細胞又は１０Ｅ３－ＣＤ２８もしくは１０Ｅ３－ＣＤ８構築物を発現しているＣＡＲ Ｔ細胞を投与した動物に比べて有意な延命効果を付与したという生存率解析によってこれはさらに裏付けられた。有効性という点では、１０Ｅ３－ＣＤ２８Ｔ及び８Ｂ５－ＣＤ２８Ｔの構築物間で有意差は観察されなかった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】