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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-25
(45)【発行日】2024-10-03
(54)【発明の名称】ペプチドがロードされたキャリアシステムおよびその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20240926BHJP
C07K 17/04 20060101ALI20240926BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240926BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240926BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20240926BHJP
A61P 33/00 20060101ALI20240926BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20240926BHJP
A61K 47/69 20170101ALI20240926BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240926BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20240926BHJP
A61K 39/02 20060101ALI20240926BHJP
A61K 39/12 20060101ALI20240926BHJP
A61K 39/002 20060101ALI20240926BHJP
A61K 31/436 20060101ALI20240926BHJP
A61K 31/59 20060101ALI20240926BHJP
A61K 31/56 20060101ALI20240926BHJP
A61K 31/616 20060101ALI20240926BHJP
A61K 31/195 20060101ALI20240926BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20240926BHJP
C07K 5/093 20060101ALN20240926BHJP
C07K 5/113 20060101ALN20240926BHJP
C07K 5/083 20060101ALN20240926BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20240926BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
C07K17/04
A61P37/04
A61P35/00
A61P31/12
A61P33/00
A61P31/04
A61K47/69
A61P37/06
A61K39/00 H
A61K39/02
A61K39/12
A61K39/002
A61K31/436
A61K31/59
A61K31/56
A61K31/616
A61K31/195
A61K39/00 A
A61K39/39
C07K5/093
C07K5/113
C07K5/083
C12N15/62 Z ZNA
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2022506143
(86)(22)【出願日】2020-07-29
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-30
(86)【国際出願番号】 US2020043963
(87)【国際公開番号】W WO2021021861
(87)【国際公開日】2021-02-04
【審査請求日】2022-01-28
(31)【優先権主張番号】62/880,421
(32)【優先日】2019-07-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】505008028
【氏名又は名称】中央研究院
【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＡ ＳＩＮＩＣＡ
【住所又は居所原語表記】１２８ Ａｃａｄｅｍｉａ Ｒｏａｄ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ２，Ｎａｎｋａｎｇ Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(74)【代理人】
【識別番号】100137626
【弁理士】
【氏名又は名称】田代 玄
(72)【発明者】
【氏名】フ チェ－ミン ジャック
(72)【発明者】
【氏名】リン チェン－ウェイ
(72)【発明者】
【氏名】リン ジュン－チェン
(72)【発明者】
【氏名】パイ チェン－スエ
【審査官】坂崎 恵美子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１４－５１３９３４（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／１６５５０６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１２－５２２７８６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５０６８１２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１０－５３５７１４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１０－５２７６０７（ＪＰ，Ａ）
【文献】Appl. Mater. Interfaces，2018年，Vol.10，p.17437-17447
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ ５／００
Ｃ０７Ｋ １７／０４
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ナノキャリアおよびナノキャリアと非共有結合的に会合したペプチドを含むキャリアシステムであって、ペプチドが、標的ペプチドのＮ末端にスペーサーセグメントを介して融合されたアダプターペプチド配列を含有し、ナノキャリアが、コアおよび表面を有し、コアが、親水性であり、表面が、正味の負電荷を有するか、正味の正電荷を有するか、または１つもしくは複数の官能基を持ち、アダプターペプチド配列が、ＤＤＤ（配列番号８）またはＤＤＤＤ（配列番号９）であり、スペーサーセグメントが、ＧＧＧ（配列番号１０）であり、標的ペプチドが、スペーサーセグメントのＣ末端に融合されている、キャリアシステム。
【請求項2】
標的ペプチドが、ＭＨＣクラスＩ制限エピトープまたはＭＨＣクラスＩＩ制限エピトープである、請求項１に記載のキャリアシステム。
【請求項3】
インターフェロン遺伝子の刺激剤（ＳＴＩＮＧ）アゴニスト、ＣｐＧ－ＯＤＮ、Ｒ８４８およびポリ（Ｉ：Ｃ）から選択される免疫応答刺激剤をさらに含む、請求項２に記載のキャリアシステム。
【請求項4】
ラパマイシン、アスピリン、ビタミンＤ、ステロイドおよびＮ－アセチルシスチンから選択される免疫応答抑制剤をさらに含む、請求項２に記載のキャリアシステム。
【請求項5】
ナノキャリアが、中空ポリマーナノ粒子である、請求項３に記載のキャリアシステム。
【請求項6】
ナノキャリアが、中空ポリマーナノ粒子である、請求項４に記載のキャリアシステム。
【請求項7】
ペプチド抗原の免疫原性を改善するための方法であって、ペプチド抗原をアダプターペプチド配列に融合して、免疫化ペプチドを形成すること、および免疫化ペプチドがナノキャリアと非共有結合的に安定に会合するように、免疫化ペプチドをナノキャリアと接触させることを含み、標的ペプチドが、ＭＨＣクラスＩ制限エピトープまたはＭＨＣクラスＩＩ制限エピトープであり、ナノキャリアが、親水性コアを有し、アダプターペプチド配列が、ＤＤＤ（配列番号８）またはＤＤＤＤ（配列番号９）であり、方法が、ペプチド抗原およびアダプターペプチド配列の間でスペーサーセグメントを融合することをさらに含み、スペーサーセグメントが、ＧＧＧ（配列番号１０）であり、ペプチド抗原が、スペーサーセグメントのＣ末端に融合されている、方法。
【請求項8】
対象における状態を処置するための免疫化組成物を製造する方法であって、標的ペプチドをアダプターペプチド配列に融合して、免疫化ペプチドを形成すること、および免疫化ペプチドがナノキャリアと非共有結合的に安定に会合してキャリアシステムを形成するように、免疫化ペプチドをナノキャリアと接触させることを含み、標的ペプチドが、ＭＨＣクラスＩ制限エピトープまたはＭＨＣクラスＩＩ制限エピトープであり、ナノキャリアが、親水性コアを有し、アダプターペプチド配列が、ＤＤＤ（配列番号８）またはＤＤＤＤ（配列番号９）であり、状態が、がん、ウイルス感染、細菌感染、寄生生物感染、自己免疫または生物学的処置に対する望ましくない免疫応答であり、方法が、アダプターペプチド配列のＣ末端および標的ペプチドのＮ末端の間でスペーサーセグメントを融合することをさらに含み、スペーサーセグメントが、ＧＧＧ（配列番号１０）であり、標的ペプチドが、スペーサーセグメントのＣ末端に融合されている、方法。
【請求項9】
ナノキャリアに、インターフェロン遺伝子の刺激剤（ＳＴＩＮＧ）アゴニスト、ＣｐＧ－ＯＤＮ、Ｒ８４８およびポリ（Ｉ：Ｃ）から選択される免疫応答刺激剤を組み込むことをさらに含み、標的ペプチドが、がん抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または寄生生物抗原である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
ナノキャリアに、ラパマイシン、アスピリン、ビタミンＤ、ステロイドおよびＮ－アセチルシスチンから選択される免疫応答抑制剤を組み込むことをさらに含み、標的ペプチドが、自己抗原であり、キャリアシステムの投与が、自己抗原に対する寛容を誘導する、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
ナノキャリアが、中空ポリマーナノ粒子である、請求項９に記載の方法。
【請求項12】
ナノキャリアが、中空ポリマーナノ粒子である、請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
請求項１～６のいずれか１項に記載のキャリアシステムを含む、対象における状態を処置するための免疫化組成物。
【請求項14】
状態が、がん、ウイルス感染、細菌感染、寄生生物感染、自己免疫または生物学的処置に対する望ましくない免疫応答である、請求項１３に記載の免疫化組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
個別化がんワクチンが開発されており、これは、動物研究および初期臨床試験において有望な結果を示す。けれども、これらの研究および治験は、個別化ワクチンの将来性を完全に実現し得る前に、解決する必要があるいくつかの重大な課題を明らかにした。例えば、強い抗がん効果のために必要な、複数のがんペプチド標的に対するＴ細胞の刺激は、ワクチン送達のための新たな技術を要求する困難なタスクである。現在の臨床試験レジメンは、観察可能な細胞性免疫を誘発するための１０回ものブースターワクチン接種を含み（Sahin et al., Nature 547: 222-226；Keskin et al., Nature 565:234-239；Hilf et al., Nature 565:240-245；およびOtt et al., Nature 547:217-221を参照されたい）、長期の処置期間および妥協された処置有効性をもたらす。
合成ナノキャリアが、ペプチド抗原のための送達ビヒクルとして試験されている。そのようなナノキャリアは、投与後に、厳しい細胞外環境からペプチドを遮蔽し、その細胞取り込みを促進し、増強された有効性をもたらすと考えられる。加えて、免疫学的アジュバントが、免疫応答を誘発するための理想である、免疫を強化するシグナルおよびペプチドの同時送達のためのナノキャリアに組み込まれている（Crouse, J. et al., Nature Rev. Immunol. 15:231-42を参照されたい）。しかしながら、このアプローチは、複雑な化学、または非生体適合性材料の使用を必要とし（Kuai, R., et al., Nature Materials 16:489-496；Li, A.W. et al., Nature Materials 17:528-534；Luo, M., et al., Nature Nanotechnol. 12:648-654；およびLiu, H., et al., Nature 507:519-522を参照されたい）、ロジスティックおよび安全性の懸念の両方を高める。
合成ナノキャリアが、ペプチド抗原のための送達ビヒクルとして試験されている。そのようなナノキャリアは、投与後に、厳しい細胞外環境からペプチドを遮蔽し、その細胞取り込みを促進し、増強された有効性をもたらすと考えられる。加えて、免疫学的アジュバントが、免疫応答を誘発するための理想である、免疫を強化するシグナルおよびペプチドの同時送達のためのナノキャリアに組み込まれている（Crouse, J. et al., Nature Rev. Immunol. 15:231-42を参照されたい）。しかしながら、このアプローチは、複雑な化学、または非生体適合性材料の使用を必要とし（Kuai, R., et al., Nature Materials 16:489-496；Li, A.W. et al., Nature Materials 17:528-534；Luo, M., et al., Nature Nanotechnol. 12:648-654；およびLiu, H., et al., Nature 507:519-522を参照されたい）、ロジスティックおよび安全性の懸念の両方を高める。
【0002】
さまざまな物理化学的特徴のペプチドを、労力を要する化学を用いることなく、ナノキャリアと容易に会合することができるキャリアシステムを開発する必要性が存在する。このアプローチは、複数ペプチドの製剤および送達を容易にし、それによって、ペプチドに基づく治療学の研究および臨床適用を拡大する。特に、さまざまなペプチド抗原をそれらの免疫原性を損なうことなく送達する戦略は、有効な複数抗原ワクチンの開発のために必要である。キャリアシステム技術は、有効なネオ抗原ワクチン接種のために重要であり、感染性疾患の管理および免疫寛容誘導の領域においても適用可能である。
【発明の概要】
【0003】
上記に記載されるように標的ペプチドを効率的に送達するために、ナノキャリアおよびナノキャリアと非共有結合的に会合したペプチドを含むキャリアシステムが提供される。ペプチドは、標的ペプチドのＮ末端に融合されたアダプターペプチド配列で構成される。ナノキャリアは、疎水性または親水性であり得るコアを有する。ナノキャリアは、正味の負電荷、正味の正電荷または１つもしくは複数の官能基を有し得る表面も有する。アダプターペプチド配列は、疎水性コア、親水性コア、正味の負電荷を有する表面、正味の正電荷を有する表面、または１つもしくは複数の官能基を持つ表面と非共有結合的に会合するように設計される。
ペプチド抗原の免疫原性を改善するための方法も提供される。この方法は、ペプチド抗原をアダプターペプチド配列に融合して、免疫化ペプチドを形成するステップ、および免疫化ペプチドがナノキャリアと非共有結合的に安定に会合するように、免疫化ペプチドをナノキャリアと接触させるステップを含む。標的ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ制限エピトープまたはＭＨＣクラスＩＩ制限エピトープであり、ナノキャリアは、親水性コアを有し、アダプターペプチド配列は、Ｄ、Ｅ、Ｒ、ＫおよびＨから選択される２つ以上の親水性アミノ酸を含む。
対象における状態を処置するための免疫化方法がさらに開示される。この方法は、標的ペプチドをアダプターペプチド配列に融合して、免疫化ペプチドを形成すること、免疫化ペプチドがナノキャリアと非共有結合的に安定に会合してキャリアシステムを形成するように、免疫化ペプチドをナノキャリアと接触させること、およびキャリアシステムを対象に投与し、それによって標的ペプチドに対する免疫応答を高めることによって行われる。標的ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ制限エピトープまたはＭＨＣクラスＩＩ制限エピトープであり、この方法は、がん、ウイルス感染、細菌感染、寄生生物感染、自己免疫または生物学的処置に対する望ましくない免疫応答を患う対象を処置するために使用することができる。
ペプチド抗原の免疫原性を改善するための方法も提供される。この方法は、ペプチド抗原をアダプターペプチド配列に融合して、免疫化ペプチドを形成するステップ、および免疫化ペプチドがナノキャリアと非共有結合的に安定に会合するように、免疫化ペプチドをナノキャリアと接触させるステップを含む。標的ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ制限エピトープまたはＭＨＣクラスＩＩ制限エピトープであり、ナノキャリアは、親水性コアを有し、アダプターペプチド配列は、Ｄ、Ｅ、Ｒ、ＫおよびＨから選択される２つ以上の親水性アミノ酸を含む。
対象における状態を処置するための免疫化方法がさらに開示される。この方法は、標的ペプチドをアダプターペプチド配列に融合して、免疫化ペプチドを形成すること、免疫化ペプチドがナノキャリアと非共有結合的に安定に会合してキャリアシステムを形成するように、免疫化ペプチドをナノキャリアと接触させること、およびキャリアシステムを対象に投与し、それによって標的ペプチドに対する免疫応答を高めることによって行われる。標的ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ制限エピトープまたはＭＨＣクラスＩＩ制限エピトープであり、この方法は、がん、ウイルス感染、細菌感染、寄生生物感染、自己免疫または生物学的処置に対する望ましくない免疫応答を患う対象を処置するために使用することができる。
【0004】
１つまたは複数の実施形態の詳細を、下記の説明および実施例において説明する。他の特徴、目的および利点は、詳細な説明から、図面から、および添付の特許請求の範囲からも明らかである。
下記の説明は、添付の図面を指す。
下記の説明は、添付の図面を指す。
【図面の簡単な説明】
【0005】
【図1】図１は、本発明のペプチドの略図である。これは、アダプターペプチド配列（適合性を提供するセグメント）、任意のスペーサーセグメント（切断可能リンカー）および標的ペプチドを含む。それぞれの丸は、単一のアミノ酸を表す。
【図8】図８は、中空の薄いシェルのナノ粒子ならびに親水性ペプチドＡ（ｇｐ１００；ＫＶＰＲＮＱＤＷＬ－配列番号１）およびＢ（Ｔｒｐ１ｍ；ＴＡＹＲＹＨＬＬ－配列番号２）、ならびに未修飾チロシナーゼ放出タンパク質２（Ｔｒｐ２；ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ－配列番号３）（上側のグラフ）、ならびにＤＭＳＯ中の対照Ｔｒｐ２ペプチド（下側のグラフ）のＨＰＬＣ分析についての保持時間に対する吸光度のグラフである。
【図9】図９は、そのＮ末端でペプチドアダプター／スペーサー配列Ｄ3Ｇ3と融合された中空の薄いシェルのナノ粒子封入Ｔｒｐ２（Ｄ3Ｇ3－Ｔｒｐ２；上側のグラフ）、およびＤＭＳＯ中の対照Ｄ3Ｇ3－Ｔｒｐ２ペプチド（下側のグラフ）のＨＰＬＣ分析についての保持時間に対する吸光度のグラフである。
【図10】図１０は、Ｔｒｐ２ペプチドによる脾細胞負荷後のインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）を産生するＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージを示す棒グラフである。脾細胞を、インターフェロン遺伝子の刺激剤（ＳＴＩＮＧ）アゴニストの環状ｄｉ－ＧＭＰと一緒に中空の薄いシェルのナノ粒子に封入された、示されたＴｒｐ２ペプチドでワクチン接種されたマウスから単離した。
【図11A】図１１Ａは、Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞の接種後の日数に対する腫瘍サイズのグラフである。マウスは、（ｉ）修飾Ｄ3Ｇ3－Ｔｒｐ２ペプチドがロードされた中空の薄いシェルのナノ粒子（ＮＰ）、（ｉｉ）修飾Ｄ3Ｇ3－Ｔｒｐ２ペプチドと環状ｄｉ－ＧＭＰ（ペプチド＋ｄｃＧＭＰ）、（ｉｉｉ）修飾Ｄ3Ｇ3－Ｔｒｐ２ペプチドとポリ（Ｉ：Ｃ）（ペプチド＋ポリ（ＩＣ））、またはＰＢＳでワクチン接種された。
【図12】図１２は、３つの修飾標的ペプチド、すなわち、Ｄ3Ｇ3修飾ＲａｌＢＰ１関連Ｅｐｓドメイン含有タンパク質１（Ｄ3Ｇ3－Ｒｅｓｐ１）、Ｄ3Ｇ3修飾ＡＤＰ依存性グルコキナーゼ（Ｄ3Ｇ3－Ａｄｐｇｋ）およびＤ4Ｇ3修飾ドリチル－ホスフェートＮ－アセチルグルコサミンホスホトランスフェラーゼ（Ｄ4Ｇ3－Ｄｐａｇｔ１）が同時にロードされた中空の薄いシェルのナノ粒子（上のグラフ）、ならびにＤＭＳＯ中の対照ペプチド（下の３つのグラフ）のＨＰＬＣ分析についての保持時間に対する吸光度のグラフである。
【図13A】図１３Ａは、Ｒｅｓｐ１、ＡｄｐｇｋおよびＤｐａｇｔ１ペプチドによる脾細胞負荷後のＩＦＮ－γを産生するＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージを示す棒グラフである。脾細胞を、（ｉ）３つの修飾ペプチドＤ3Ｇ3－Ｒｅｓｐ１、Ｄ3Ｇ3－ＡｄｐｇｋおよびＤ4Ｇ3－Ｄｐａｇｔ１ならびにＳＴＩＮＧアゴニストの環状ｄｉ－ＧＭＰがロードされた中空の薄いシェルのナノ粒子（ナノ粒子）、（ｉｉ）３つの未修飾ペプチドと環状ｄｉ－ＧＭＰ（ペプチド＋ｃｄＧＭＰ）、ならびに（ｉｉｉ）３つの未修飾ペプチドとポリ（Ｉ：Ｃ）（ペプチド＋ポリ（ＩＣ））でワクチン接種されたマウスから単離した。
【図15】図１５は、オボアルブミンエピトープＯＶＡ257-264ペプチドによる脾細胞負荷後のＩＦＮ－γを産生するＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージを示す棒グラフである。脾細胞を、環状ｄｉ－ＧＭＰと一緒に中空の薄いシェルのナノ粒子に封入された、示されたＯＶＡ257-264ペプチドでワクチン接種されたマウスから単離した。
【図16A】図１６Ａは、示された疎水性未修飾ペプチド抗原による脾細胞負荷後のＩＦＮ－γを産生するＣＤ８ Ｔ細胞（上半分）およびＩＦＮ－γを産生するＣＤ４ Ｔ細胞（下半分）のパーセンテージを示す棒グラフを含む。脾細胞を、環状ｄｉ－ＧＭＰと一緒に中空の薄いシェルのナノ粒子に封入された、示されたペプチドでワクチン接種されたマウスから単離した。
【図16B】図１６Ｂは、示された親水性未修飾ペプチド抗原による脾細胞負荷後のＩＦＮ－γを産生するＣＤ８ Ｔ細胞（上半分）およびＩＦＮ－γを産生するＣＤ４ Ｔ細胞（下半分）のパーセンテージを示す棒グラフを含む。脾細胞を、図１６Ａについての凡例に記載の通りワクチン接種されたマウスから単離した。
【図18A】図１８Ａは、Ｍ０５、Ｍ２４、Ｍ２７、Ｍ２８、Ｍ３０、Ｍ３３およびＭ５０（グループＩ）として指定される７つの別個のＢ１６黒色腫ネオエピトープを含有する中空の薄いシェルのナノ粒子のＨＰＬＣ分析についての保持時間に対する吸光度のグラフである。ＩＥＤＢコンセンサス法バージョン２．５を使用して予測された２１のネオエピトープのうちのこれらの７つを、自由裁量で一緒にグループ化して、ナノ粒子を調製した。
【図18B】図１８Ｂは、Ｍ０８、Ｍ１２、Ｍ１７、Ｍ２１、Ｍ２５、Ｍ２９およびＭ４４（グループＩＩ）として指定される７つの別個のＢ１６黒色腫ネオエピトープを含有する中空の薄いシェルのナノ粒子のＨＰＬＣ分析についての保持時間に対する吸光度のグラフである。
【図18C】図１８Ｃは、Ｍ２０、Ｍ２２、Ｍ３６、Ｍ４５、Ｍ４６、Ｍ４７およびＭ４８（グループＩＩＩ）として指定される７つの別個のＢ１６黒色腫ネオエピトープを含有する中空の薄いシェルのナノ粒子のＨＰＬＣ分析についての保持時間に対する吸光度のグラフである。
【図19A】図１９Ａは、マウスＢ１６黒色腫において予測されたネオエピトープによる脾細胞負荷後のＩＦＮ－γを産生するＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージを示す棒グラフである。脾細胞を、環状ｄｉ－ＧＭＰと一緒に中空の薄いシェルのナノ粒子に封入された修飾ネオペプチドでワクチン接種されたマウスから単離した。図１８Ａ～１８Ｃへの凡例に列挙されたネオエピトープ候補は、ＩＥＤＢコンセンサス法バージョン２．５を使用して予測した。
【図19B】図１９Ｂは、ＤｅｅｐＨＬＡｐａｎを使用してマウスＢ１６黒色腫において予測されたネオエピトープによる脾細胞負荷後のＩＦＮ－γを産生するＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージを示す棒グラフである。脾細胞を、図１９Ａへの凡例に記載の通り単離した。
【図20A】図２０Ａは、結腸直腸がん患者においてＤｅｅｐＨＬＡｐａｎによって予測されたネオエピトープによる脾細胞負荷後のＩＦＮ－γを産生するＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージを示す棒グラフである。脾細胞を、環状ｄｉ－ＧＭＰと一緒に中空の薄いシェルのナノ粒子に封入された修飾ネオペプチドでワクチン接種されたヒトＨＬＡトランスジェニックマウスから単離した。
【図20B】図２０Ｂは、第２の結腸直腸がん患者においてＤｅｅｐＨＬＡｐａｎによって予測されたネオエピトープによる脾細胞負荷後のＩＦＮ－γを産生するＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージを示す棒グラフである。脾細胞を、図２０Ａへの凡例において上記に記載の通り単離した。
【図22A】図２２Ａは、示されたアスピリン／ペプチド製剤または対照が接種されたマウスに由来する脾細胞におけるＣＤ２５+Ｆｏｘｐ３+Ｔreg集団のパーセンテージを示すフローサイトメトリーのプロットである。ＮＰ＝ナノ粒子。
【図23】インビボでの免疫寛容誘導の評価のためのナノ粒子接種スケジュールおよびプロトコールを図示する概略図。
【発明を実施するための形態】
【0006】
本発明のキャリアシステムは、ナノキャリアおよびナノキャリアと非共有結合的に会合したペプチドを含む。
上記で述べたように、ペプチドは、標的ペプチドのＮ末端に融合されたアダプターペプチド配列を含有する。図１を参照されたい。
アダプターペプチド配列は、Ｄ、Ｅ、Ｒ、ＫおよびＨから選択される２つ以上の親水性アミノ酸を含むことができる。親水性アミノ酸を含有するアダプターペプチド配列は、疎水性標的ペプチドに融合され得、それによって融合ペプチドを親水性にする。アダプターペプチド配列は、親水性標的ペプチドに融合することもできる。アダプターペプチド配列の配列は、限定されるものではないが、Ｄn、Ｅn、（ＤＥ）n、（ＤＸ）nまたは（ＥＸ）n（式中、ｎは、２～２０の整数であり、Ｘは、任意のアミノ酸である）であり得る。特定の例において、アミノ酸Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ｗは、この段落において示されるアダプターペプチド配列から排除される。
上記で述べたように、ペプチドは、標的ペプチドのＮ末端に融合されたアダプターペプチド配列を含有する。図１を参照されたい。
アダプターペプチド配列は、Ｄ、Ｅ、Ｒ、ＫおよびＨから選択される２つ以上の親水性アミノ酸を含むことができる。親水性アミノ酸を含有するアダプターペプチド配列は、疎水性標的ペプチドに融合され得、それによって融合ペプチドを親水性にする。アダプターペプチド配列は、親水性標的ペプチドに融合することもできる。アダプターペプチド配列の配列は、限定されるものではないが、Ｄn、Ｅn、（ＤＥ）n、（ＤＸ）nまたは（ＥＸ）n（式中、ｎは、２～２０の整数であり、Ｘは、任意のアミノ酸である）であり得る。特定の例において、アミノ酸Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ｗは、この段落において示されるアダプターペプチド配列から排除される。
【0007】
使用することができる他のアダプターペプチド配列は、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｐ、Ｆ、ＷおよびＭから選択される２つ以上の疎水性アミノ酸を含む。
さらに、正電荷アミノ酸、例えば、Ｋ、ＲおよびＨを有するアダプターペプチド配列は、本発明の範囲内であり、負電荷アミノ酸、例えば、ＤおよびＥを有するアダプターペプチド配列も同様である。
加えて、アダプターペプチド配列は、官能基、例えば、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＫ－配列番号５）、ＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ－配列番号６）およびＭｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ－配列番号７）に結合するものであり得、これらのそれぞれは、それぞれの抗タグ抗体に結合することができる。図５を参照されたい。
ポリヒスチジンもアダプターペプチド配列に含まれ得る。図６を参照されたい。
最後に、図７に示されるように、アダプターペプチド配列は、自己集合配列（例えば、アルファヘリックス、Ｑ１１ペプチド、イオン相補的自己集合ペプチドおよび長鎖アルキル化ペプチド）であり得る。追加の自己集合配列は、Sun et al., Int. J. Nanomedicine 2017:73-86およびLi et al., Soft Matter, 15:1704-1715に記載されている。
さらに、正電荷アミノ酸、例えば、Ｋ、ＲおよびＨを有するアダプターペプチド配列は、本発明の範囲内であり、負電荷アミノ酸、例えば、ＤおよびＥを有するアダプターペプチド配列も同様である。
加えて、アダプターペプチド配列は、官能基、例えば、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＫ－配列番号５）、ＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ－配列番号６）およびＭｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ－配列番号７）に結合するものであり得、これらのそれぞれは、それぞれの抗タグ抗体に結合することができる。図５を参照されたい。
ポリヒスチジンもアダプターペプチド配列に含まれ得る。図６を参照されたい。
最後に、図７に示されるように、アダプターペプチド配列は、自己集合配列（例えば、アルファヘリックス、Ｑ１１ペプチド、イオン相補的自己集合ペプチドおよび長鎖アルキル化ペプチド）であり得る。追加の自己集合配列は、Sun et al., Int. J. Nanomedicine 2017:73-86およびLi et al., Soft Matter, 15:1704-1715に記載されている。
【0008】
開示されるキャリアシステム中のペプチドは、標的ペプチドおよびアダプターペプチド配列の間で融合されたスペーサーセグメントを含むことができる。スペーサーセグメントは、Ｇ、Ａ、ＳおよびＰから選択される２つ以上のアミノ酸残基を含むことができる。例示的なスペーサーセグメントは、アミノ酸配列Ｇn（式中、ｎは、１～１５の整数である）を有する。スペーサーセグメントは、ペプチドのナノキャリアによる細胞への送達の際に、アダプターペプチド配列が標的ペプチドから切断され得るような、細胞機構による切断に感受性であり得る。
ペプチドの具体的な例は、アダプターペプチド配列ＤＤＤ（配列番号８）またはＤＤＤＤ（配列番号９）、およびスペーサーセグメントＧＧＧ（配列番号１０）を含有する。このペプチドにおいて、アダプターペプチド配列は、スペーサーセグメントのＮ末端に融合され、このセグメントは、次に、標的ペプチドに融合される。図１を参照されたい。
ペプチドの具体的な例は、アダプターペプチド配列ＤＤＤ（配列番号８）またはＤＤＤＤ（配列番号９）、およびスペーサーセグメントＧＧＧ（配列番号１０）を含有する。このペプチドにおいて、アダプターペプチド配列は、スペーサーセグメントのＮ末端に融合され、このセグメントは、次に、標的ペプチドに融合される。図１を参照されたい。
【0009】
上記で述べたように、キャリアシステムはナノキャリアを含む。ナノキャリアは、限定されるものではないが、（ｉ）親水性カーゴを封入するための１つまたは複数の水性コアを含有する中空構築物、（ｉｉ）疎水性カーゴを封入するための疎水性コアを有する固体または油系構造体、（ｉｉｉ）負電荷カーゴを運ぶための正の帯電を有するキャリア、（ｉｖ）正電荷カーゴを運ぶための負の帯電を有するキャリア、および（ｖ）規定されたペプチド配列と会合するための規定された表面官能基を有するキャリアであり得る。図２を参照されたい。
具体的な例において、ナノキャリアは、その内容がその全体で本明細書に組み込まれるＨｕらの国際出願公開第２００７／１６５５０６号に記載の１つまたは複数の水性コアを有する中空の薄いシェルのナノ粒子である。
上記に記載のアダプターペプチド配列は、キャリアシステムおよび特定の標的ペプチドにおけるナノキャリアの種類に基づいて選択することができる。例えば、上記に記載の親水性アミノ酸を含有するアダプターペプチド配列は、標的ペプチドに融合されて、その水溶性を増加させることができる。この水溶性ペプチドは、中空ポリマーナノ粒子の内部水性コアに封入することができる。図３を参照されたい。あるいは、疎水性アミノ酸に基づくアダプターペプチド配列は、固体または油系キャリアの疎水性区画への組み込みのために標的ペプチドに融合され得る。
具体的な例において、ナノキャリアは、その内容がその全体で本明細書に組み込まれるＨｕらの国際出願公開第２００７／１６５５０６号に記載の１つまたは複数の水性コアを有する中空の薄いシェルのナノ粒子である。
上記に記載のアダプターペプチド配列は、キャリアシステムおよび特定の標的ペプチドにおけるナノキャリアの種類に基づいて選択することができる。例えば、上記に記載の親水性アミノ酸を含有するアダプターペプチド配列は、標的ペプチドに融合されて、その水溶性を増加させることができる。この水溶性ペプチドは、中空ポリマーナノ粒子の内部水性コアに封入することができる。図３を参照されたい。あるいは、疎水性アミノ酸に基づくアダプターペプチド配列は、固体または油系キャリアの疎水性区画への組み込みのために標的ペプチドに融合され得る。
【0010】
荷電したアミノ酸を含有するアダプターペプチド配列を使用して、標的ペプチドおよび逆の帯電を持つナノキャリアの間の会合を促進することができる。例えば、負電荷のアスパラギン酸またはグルタミン酸を含有するアダプターペプチド配列は、融合ペプチドが正電荷のナノキャリアと会合するように、標的ペプチドに融合され得る。図４を参照されたい。同様に、正電荷アミノ酸、例えば、リジン、アルギニンおよびヒスチジンを有するアダプターペプチド配列は、標的ペプチドに融合され得、そのようにして、負電荷を持つキャリアと会合し得る。図４も参照されたい。
キャリアシステムの官能化を用いて、アダプターペプチド配列中のアミノ酸の特定の配列に対する特異的な親和性を有するナノキャリアを与えることができる。上記で述べたように、アダプターペプチド配列は、例えば、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグおよびＭｙｃタグを含むことができる。これらのアダプターペプチド配列に融合された標的ペプチドは、タグに結合する抗体をその表面上に持つナノキャリアと会合することができる。図５を参照されたい。
キャリアシステムの官能化を用いて、アダプターペプチド配列中のアミノ酸の特定の配列に対する特異的な親和性を有するナノキャリアを与えることができる。上記で述べたように、アダプターペプチド配列は、例えば、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグおよびＭｙｃタグを含むことができる。これらのアダプターペプチド配列に融合された標的ペプチドは、タグに結合する抗体をその表面上に持つナノキャリアと会合することができる。図５を参照されたい。
【0011】
さらなる例において、ナノキャリアは、金属キレート化剤、例えば、ＮｉまたはＣｏイオンの存在下でポリヒスチジンに対する強い親和性を有するニトリロ三酢酸で表面官能化することができる。ポリヒスチジンを含有するアダプターペプチド配列は、標的ペプチドに融合され得、その結果、融合ペプチドは、非共有結合的にキャリアの表面に結合する。図６を参照されたい。
また、自己集合アミノ酸配列、例えば、アルファヘリックスまたはＱ１１ペプチドを、アダプターペプチド配列の一部として、また、ナノキャリア表面を官能化するために、使用することができる。そのため、特定の配列の自己集合能力により、アダプターペプチド連結標的ペプチドが、ナノキャリアにカップリングされ得る。図７を参照されたい。
本明細書に開示されるキャリアシステムは、上記で説明されたナノキャリアおよびアダプターペプチド配列－標的ペプチド融合体の組み合わせを含有することができる。例えば、例示的なキャリアシステムは、そのそれぞれが親水性アミノ酸を有するアダプターペプチド配列を含む２つの別個のペプチドがロードされた親水性コアを有するナノキャリアを含む。
キャリアシステムを使用して、アダプターペプチド配列に融合されている任意の所望の標的ペプチドを送達することができる。一例において、標的ペプチドは、治療用ペプチドである。別の例において、ナノキャリアは、インビボで検出され得、標的ペプチドは、ナノキャリアを特定の解剖学的部位に局在化させる働きをする。
また、自己集合アミノ酸配列、例えば、アルファヘリックスまたはＱ１１ペプチドを、アダプターペプチド配列の一部として、また、ナノキャリア表面を官能化するために、使用することができる。そのため、特定の配列の自己集合能力により、アダプターペプチド連結標的ペプチドが、ナノキャリアにカップリングされ得る。図７を参照されたい。
本明細書に開示されるキャリアシステムは、上記で説明されたナノキャリアおよびアダプターペプチド配列－標的ペプチド融合体の組み合わせを含有することができる。例えば、例示的なキャリアシステムは、そのそれぞれが親水性アミノ酸を有するアダプターペプチド配列を含む２つの別個のペプチドがロードされた親水性コアを有するナノキャリアを含む。
キャリアシステムを使用して、アダプターペプチド配列に融合されている任意の所望の標的ペプチドを送達することができる。一例において、標的ペプチドは、治療用ペプチドである。別の例において、ナノキャリアは、インビボで検出され得、標的ペプチドは、ナノキャリアを特定の解剖学的部位に局在化させる働きをする。
【0012】
加えて、標的ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ制限エピトープまたはＭＨＣクラスＩＩ制限エピトープであり得る。そのような標的ペプチドは、キャリアシステムとともに使用されて、エピトープに対するＴ細胞応答を増強する。
特定の例において、標的ペプチドは、がんネオ抗原、ネオ抗原ではないがん抗原、細菌抗原、ウイルス抗原または寄生生物抗原である。
標的ペプチドの特定の例としては、結核菌ｐ２５、インフルエンザ核タンパク質ＮＰ３１１、ならびにがん関連抗原のＡｄｐｇｋ、Ｄｐａｇｔ、Ｒｅｓｐ１、Ｔｒｐ１ｍおよびｇｐ１００が挙げられる。マラリア原虫、ＨＩＶ、ＨＢＶおよびＭＥＲＳ－ＣｏＶ由来の抗原ペプチドは、標的ペプチドの他の例である。
抗原性標的ペプチドを含むキャリアシステムは、アダプターペプチド配列／標的ペプチド融合体と一緒に、ナノキャリアに封入された免疫調節剤を含むこともできる。免疫調節剤は、免疫応答刺激剤、例えば、インターフェロン遺伝子の刺激剤（ＳＴＩＮＧ）アゴニスト、例えば、環状ｄｉ－ＧＭＰ（ｃｄＧＭＰ）、ＣｐＧ－ＯＤＮ、Ｒ８４８およびポリ（Ｉ：Ｃ）であり得る。そのようなキャリアシステムを使用して、標的ペプチドに対する免疫応答を増強することができる。
特定の例において、標的ペプチドは、がんネオ抗原、ネオ抗原ではないがん抗原、細菌抗原、ウイルス抗原または寄生生物抗原である。
標的ペプチドの特定の例としては、結核菌ｐ２５、インフルエンザ核タンパク質ＮＰ３１１、ならびにがん関連抗原のＡｄｐｇｋ、Ｄｐａｇｔ、Ｒｅｓｐ１、Ｔｒｐ１ｍおよびｇｐ１００が挙げられる。マラリア原虫、ＨＩＶ、ＨＢＶおよびＭＥＲＳ－ＣｏＶ由来の抗原ペプチドは、標的ペプチドの他の例である。
抗原性標的ペプチドを含むキャリアシステムは、アダプターペプチド配列／標的ペプチド融合体と一緒に、ナノキャリアに封入された免疫調節剤を含むこともできる。免疫調節剤は、免疫応答刺激剤、例えば、インターフェロン遺伝子の刺激剤（ＳＴＩＮＧ）アゴニスト、例えば、環状ｄｉ－ＧＭＰ（ｃｄＧＭＰ）、ＣｐＧ－ＯＤＮ、Ｒ８４８およびポリ（Ｉ：Ｃ）であり得る。そのようなキャリアシステムを使用して、標的ペプチドに対する免疫応答を増強することができる。
【0013】
あるいは、キャリアシステムを用いて、標的ペプチドに対する免疫応答を抑制することができる。そのようなシステムにおいて、ナノキャリアに封入される免疫調節剤は、免疫応答抑制剤、例えば、ラパマイシン、アスピリン、ビタミンＤ、ステロイドおよびＮ－アセチルシスチンであり得る。
ペプチド抗原の免疫原性を改善するための方法も本発明の範囲内である。この方法は、ペプチド抗原をアダプターペプチド配列に融合して、免疫化ペプチドを形成するステップ、および免疫化ペプチドがナノキャリアと非共有結合的に安定に会合するように、免疫化ペプチドをナノキャリアと接触させるステップを含む。
ペプチド抗原の免疫原性の改善は、ペプチド抗原の免疫応答を修飾ペプチド抗原、すなわち、免疫化ペプチドの免疫応答と比較することによって評価される。免疫応答は、ペプチド特異的ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ Ｔ細胞（「Ｔ細胞」）の数を、総Ｔ細胞のパーセンテージ、すなわち、頻度として、測定することによって特徴付けられる。したがって、改善された免疫応答は、未修飾ペプチド抗原と比較して、修飾ペプチド抗原によって誘導されたペプチド特異的Ｔ細胞の頻度において、１．２～２５０倍（例えば、１．２、１．５、１．８、２、４、６、８、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５および２５０倍）の増加として規定することができる。
ペプチド抗原の免疫原性を改善するための方法も本発明の範囲内である。この方法は、ペプチド抗原をアダプターペプチド配列に融合して、免疫化ペプチドを形成するステップ、および免疫化ペプチドがナノキャリアと非共有結合的に安定に会合するように、免疫化ペプチドをナノキャリアと接触させるステップを含む。
ペプチド抗原の免疫原性の改善は、ペプチド抗原の免疫応答を修飾ペプチド抗原、すなわち、免疫化ペプチドの免疫応答と比較することによって評価される。免疫応答は、ペプチド特異的ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ Ｔ細胞（「Ｔ細胞」）の数を、総Ｔ細胞のパーセンテージ、すなわち、頻度として、測定することによって特徴付けられる。したがって、改善された免疫応答は、未修飾ペプチド抗原と比較して、修飾ペプチド抗原によって誘導されたペプチド特異的Ｔ細胞の頻度において、１．２～２５０倍（例えば、１．２、１．５、１．８、２、４、６、８、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５および２５０倍）の増加として規定することができる。
【0014】
標的ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ制限エピトープまたはＭＨＣクラスＩＩ制限エピトープであり、ナノキャリアは、親水性コアを有し、アダプターペプチド配列は、Ｄ、Ｅ、Ｒ、ＫおよびＨから選択される２つ以上の親水性アミノ酸を含む。標的ペプチド抗原、アダプターペプチド配列およびナノキャリアは、上記に詳細に記載されている。
好ましい実施形態において、免疫化ペプチドは、アダプターペプチド配列ＤＤＤ（配列番号８）またはＤＤＤＤ（配列番号９）、アダプターペプチド配列のＣ末端に融合されたスペーサーセグメントＧＧＧ（配列番号１０）、およびスペーサーセグメントのＣ末端に融合されたペプチド抗原を含有する。
上記に記載のキャリアシステムの利点を取る、対象における状態を処置するための免疫化方法も提供される。免疫化方法は、（ｉ）標的ペプチドをアダプターペプチド配列に融合して、免疫化ペプチドを形成するステップ、（ｉｉ）免疫化ペプチドがナノキャリアと非共有結合的に安定に会合してキャリアシステムを形成するように、免疫化ペプチドをナノキャリアと接触させるステップ、および（ｉｉｉ）キャリアシステムを対象に投与し、それによって標的ペプチドに対する免疫応答を高めるステップを含む。
この方法において、標的ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ制限エピトープまたはＭＨＣクラスＩＩ制限エピトープであり、状態は、がん、ウイルス感染、細菌感染、寄生生物感染または生物学的処置に対する望ましくない免疫応答である。
さらなる精緻化なく、当業者は、本明細書における開示に基づいて、その最大限まで本開示を利用することができると考えられる。したがって、以下の具体的な実施例は、単なる説明として解釈されるべきであり、どんな方法であれ、本開示の残部の制限ではない。本明細書において引用されるすべての刊行物は、それらの全体が参照によって組み込まれる。
好ましい実施形態において、免疫化ペプチドは、アダプターペプチド配列ＤＤＤ（配列番号８）またはＤＤＤＤ（配列番号９）、アダプターペプチド配列のＣ末端に融合されたスペーサーセグメントＧＧＧ（配列番号１０）、およびスペーサーセグメントのＣ末端に融合されたペプチド抗原を含有する。
上記に記載のキャリアシステムの利点を取る、対象における状態を処置するための免疫化方法も提供される。免疫化方法は、（ｉ）標的ペプチドをアダプターペプチド配列に融合して、免疫化ペプチドを形成するステップ、（ｉｉ）免疫化ペプチドがナノキャリアと非共有結合的に安定に会合してキャリアシステムを形成するように、免疫化ペプチドをナノキャリアと接触させるステップ、および（ｉｉｉ）キャリアシステムを対象に投与し、それによって標的ペプチドに対する免疫応答を高めるステップを含む。
この方法において、標的ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ制限エピトープまたはＭＨＣクラスＩＩ制限エピトープであり、状態は、がん、ウイルス感染、細菌感染、寄生生物感染または生物学的処置に対する望ましくない免疫応答である。
さらなる精緻化なく、当業者は、本明細書における開示に基づいて、その最大限まで本開示を利用することができると考えられる。したがって、以下の具体的な実施例は、単なる説明として解釈されるべきであり、どんな方法であれ、本開示の残部の制限ではない。本明細書において引用されるすべての刊行物は、それらの全体が参照によって組み込まれる。
【実施例】
【0015】
（実施例１）
疎水性ペプチドの送達
疎水性ペプチド、すなわち、Ｔｒｐ２180-188（Ｔｒｐ２；ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ－配列番号３）を、ペプチドアダプター配列への融合によって修飾し、ナノ粒子に封入した。Ｔｒｐ２は、免疫優性の高疎水性Ｂ１６マウス黒色腫エピトープである。このペプチドを、そのＮ末端で、親水性アダプター、すなわち、ペプチドアダプター配列として３つのアスパラギン酸残基（Ｄ）および切断可能リンカーを形成する３つのグリシン残基（Ｇ）のスペーサーセグメントを含有するＤ3Ｇ3に融合した。ペプチドを、日常的な手順によって合成した。修飾Ｔｒｐ２ペプチドの配列は、ＤＤＤＧＧＧＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（Ｄ3Ｇ3－Ｔｒｐ２；配列番号１１）である。
水性コアを有する中空の薄いシェルのナノ粒子を、本質的に、Ｈｕらに記載の通り調製した。
疎水性ペプチドの送達
疎水性ペプチド、すなわち、Ｔｒｐ２180-188（Ｔｒｐ２；ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ－配列番号３）を、ペプチドアダプター配列への融合によって修飾し、ナノ粒子に封入した。Ｔｒｐ２は、免疫優性の高疎水性Ｂ１６マウス黒色腫エピトープである。このペプチドを、そのＮ末端で、親水性アダプター、すなわち、ペプチドアダプター配列として３つのアスパラギン酸残基（Ｄ）および切断可能リンカーを形成する３つのグリシン残基（Ｇ）のスペーサーセグメントを含有するＤ3Ｇ3に融合した。ペプチドを、日常的な手順によって合成した。修飾Ｔｒｐ２ペプチドの配列は、ＤＤＤＧＧＧＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（Ｄ3Ｇ3－Ｔｒｐ２；配列番号１１）である。
水性コアを有する中空の薄いシェルのナノ粒子を、本質的に、Ｈｕらに記載の通り調製した。
【0016】
ナノ粒子にロードされたペプチドを定量化するために、ＨＰＬＣ分析を以下の通り行った。ナノ粒子を、凍結乾燥し、次いで、９５％のアセトンを添加することによって破壊した。アセトンを、乾燥バスにおける６０℃でのインキュベーションによって除去し、試料を、Ｈ2Ｏに再懸濁させ、グラジエントＨＰＬＣ法を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣシステムにおいて分析した。例示的な方法において、開始移動相は、水中の０．１％のトリフルオロ酢酸およびアセトン中の０．１％のトリフルオロ酢酸の７５：２５の混合物で構成された。第２の移動相は、水中の０．１％のトリフルオロ酢酸およびアセトン中の０．１％のトリフルオロ酢酸の１５：８５の混合物で２０分間であり、続いて、アセトン中の０．１％のトリフルオロ酢酸である第３の移動相での１０分間の溶出を行った。ペプチドの定量化のための標準較正曲線を、２２０ｎｍの波長での吸光度によって決定した。
未修飾Ｔｒｐ２ペプチドは、水に難溶性であり、０．０６ｍＭの最大溶解度を有する。Vasievich, E.A., et al., Molecular pharmaceutics, 2012, 9:261-8を参照されたい。そのため、ＨＰＬＣ分析によって示されるように、中空ナノ粒子の水性コアに封入することができなかった。図８を参照されたい。対照的に、２つの親水性ペプチド、すなわち、ｇｐ１００（ペプチドＡ）およびＴｒｐ１ｍ（ペプチドＢ）は、ナノ粒子に容易に組み込まれた。図８を参照されたい。
対照的に、Ｄ3Ｇ3－Ｔｒｐ２ペプチドは、Ｔｒｐ２ペプチドよりも５００倍を超えて高い、Ｈ2Ｏ中で＞３０ｍＭの溶解度を有していた。Ｄ3Ｇ3－Ｔｒｐ２ペプチドは、ナノ粒子の水性コアに容易に組み込まれた。図９を参照されたい。
未修飾Ｔｒｐ２ペプチドは、水に難溶性であり、０．０６ｍＭの最大溶解度を有する。Vasievich, E.A., et al., Molecular pharmaceutics, 2012, 9:261-8を参照されたい。そのため、ＨＰＬＣ分析によって示されるように、中空ナノ粒子の水性コアに封入することができなかった。図８を参照されたい。対照的に、２つの親水性ペプチド、すなわち、ｇｐ１００（ペプチドＡ）およびＴｒｐ１ｍ（ペプチドＢ）は、ナノ粒子に容易に組み込まれた。図８を参照されたい。
対照的に、Ｄ3Ｇ3－Ｔｒｐ２ペプチドは、Ｔｒｐ２ペプチドよりも５００倍を超えて高い、Ｈ2Ｏ中で＞３０ｍＭの溶解度を有していた。Ｄ3Ｇ3－Ｔｒｐ２ペプチドは、ナノ粒子の水性コアに容易に組み込まれた。図９を参照されたい。
【0017】
（実施例２）
修飾ペプチドの免疫原性
修飾Ｔｒｐ２ペプチドの免疫原性を、中空の薄いシェルのナノ粒子の水性コアに、それらを固定された量のインターフェロン遺伝子の刺激剤（ＳＴＩＮＧ）アゴニストの環状ｄｉ－ＧＭＰ（ｃｄＧＭＰ）と一緒に封入すること、およびそれらをマウスに注射することによって試験した。
修飾Ｔｒｐ２ペプチドは、以下の通りであった：（ｉ）Ｄ4－Ｔｒｐ２－Ｄ5、（ｉｉ）Ｔｒｐ２－Ｄ5、（ｉｉｉ）Ｄ5－Ｔｒｐ２、（ｉｖ）Ｄ2Ｇ3－Ｔｒｐ２－Ｇ3Ｄ2、（ｖ）Ｔｒｐ２－Ｇ3Ｄ3、および（ｖｉ）Ｄ3Ｇ3－Ｔｒｐ２。Ｔｒｐ２それ自身は、その疎水性に起因して水性コアに組み込むことができず、より長いＴｒｐ２ペプチド、すなわち、Ｔｒｐ２168-195を陽性対照として封入した。
修飾ペプチドの免疫原性
修飾Ｔｒｐ２ペプチドの免疫原性を、中空の薄いシェルのナノ粒子の水性コアに、それらを固定された量のインターフェロン遺伝子の刺激剤（ＳＴＩＮＧ）アゴニストの環状ｄｉ－ＧＭＰ（ｃｄＧＭＰ）と一緒に封入すること、およびそれらをマウスに注射することによって試験した。
修飾Ｔｒｐ２ペプチドは、以下の通りであった：（ｉ）Ｄ4－Ｔｒｐ２－Ｄ5、（ｉｉ）Ｔｒｐ２－Ｄ5、（ｉｉｉ）Ｄ5－Ｔｒｐ２、（ｉｖ）Ｄ2Ｇ3－Ｔｒｐ２－Ｇ3Ｄ2、（ｖ）Ｔｒｐ２－Ｇ3Ｄ3、および（ｖｉ）Ｄ3Ｇ3－Ｔｒｐ２。Ｔｒｐ２それ自身は、その疎水性に起因して水性コアに組み込むことができず、より長いＴｒｐ２ペプチド、すなわち、Ｔｒｐ２168-195を陽性対照として封入した。
【0018】
等用量のＴｒｐ２ペプチドの１つおよびｃｄＧＭＰをそれぞれ含有するナノ粒子を、上記の実施例１に記載の通り調製し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０日目および２１日目に、尾の付け根に、皮下注射によって投与した。２８日目に、ワクチン接種されたマウスの脾細胞を、単離し、Ｔｒｐ２特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の免疫応答について調べた。簡潔には、それぞれのマウスからの脾細胞を、Ｔｒｐ２ペプチドで負荷し、ＣＤ８ Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γの発現を、細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリーによって測定した。結果を図１０に示す。
親水性アスパラギン酸配列で修飾されたＴｒｐ２ペプチドはすべて、Ｔｒｐ２と比較して、それらの水溶解度において顕著な改善、すなわち、少なくとも３０ｍＭを示した。試験されたペプチドのうち、親水性ペプチドアダプター配列が切断可能スペーサーセグメントと一緒にＮ末端にのみ融合されたＤ3Ｇ3－Ｔｒｐ２は、最も高いレベルのＴ細胞刺激を生じ、ＩＦＮ－γを産生するＣＤ８ Ｔ細胞が４％に達することを示した。図１０を参照されたい。切断可能スペーサーセグメントの包含、および標的ペプチドのＮ末端における親水性アダプターおよびスペーサーセグメントの位置決めの両方が、ペプチドの最大免疫原性を得るために重要であったことは驚くべきことであった。
親水性アスパラギン酸配列で修飾されたＴｒｐ２ペプチドはすべて、Ｔｒｐ２と比較して、それらの水溶解度において顕著な改善、すなわち、少なくとも３０ｍＭを示した。試験されたペプチドのうち、親水性ペプチドアダプター配列が切断可能スペーサーセグメントと一緒にＮ末端にのみ融合されたＤ3Ｇ3－Ｔｒｐ２は、最も高いレベルのＴ細胞刺激を生じ、ＩＦＮ－γを産生するＣＤ８ Ｔ細胞が４％に達することを示した。図１０を参照されたい。切断可能スペーサーセグメントの包含、および標的ペプチドのＮ末端における親水性アダプターおよびスペーサーセグメントの位置決めの両方が、ペプチドの最大免疫原性を得るために重要であったことは驚くべきことであった。
【0019】
また、修飾Ｄ3Ｇ3－Ｔｒｐ２を含有するナノ粒子による免疫化マウスは、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫負荷に対して顕著な保護をもたらした。より具体的には、これらのナノ粒子で免疫されたマウスにおいて、腫瘍成長が阻害され（図１１Ａを参照されたい）、生存が増加し（図１１Ｂを参照されたい）、Ｄ3Ｇ3修飾がＴｒｐ２ペプチドの抗腫瘍活性を低減しなかったことを示した。
理論に拘束されないが、Ｎ末端に融合されたＤ3Ｇ3ペプチドは、細胞保護機構により容易にプロセシングされ、ペプチド抗原に対する妨げられない免疫応答をもたらすと考えられる。
さらにまた、標的エピトープに隣接するアミノ酸配列、すなわち、アミノ酸１８０～１８８を含有する長いペプチドであるＴｒｐ２168-195の免疫原性も、親水性アダプターのモダリティとの比較のために評価した。Ｔｒｐ２168-195の水溶性は、Ｔｒｐ２180-188の水溶性よりも良好であり、水性コアへのより長いペプチドの組み込みを可能にする。それでも、Ｔｒｐ２168-195ペプチドは、Ｄ3Ｇ3－Ｔｒｐ２と比較して、約２０倍弱いＣＤ８+Ｔ細胞応答を誘導した。図１０を参照されたい。
理論に拘束されないが、Ｎ末端に融合されたＤ3Ｇ3ペプチドは、細胞保護機構により容易にプロセシングされ、ペプチド抗原に対する妨げられない免疫応答をもたらすと考えられる。
さらにまた、標的エピトープに隣接するアミノ酸配列、すなわち、アミノ酸１８０～１８８を含有する長いペプチドであるＴｒｐ２168-195の免疫原性も、親水性アダプターのモダリティとの比較のために評価した。Ｔｒｐ２168-195の水溶性は、Ｔｒｐ２180-188の水溶性よりも良好であり、水性コアへのより長いペプチドの組み込みを可能にする。それでも、Ｔｒｐ２168-195ペプチドは、Ｄ3Ｇ3－Ｔｒｐ２と比較して、約２０倍弱いＣＤ８+Ｔ細胞応答を誘導した。図１０を参照されたい。
【0020】
（実施例３）
がんネオエピトープによるワクチン接種
上記で説明された修飾戦略を、ＭＣ３８マウス結腸腺がん細胞において、Ｒｅｓｐ１、ＡｄｐｇｋおよびＤｐａｇｔ１遺伝子に由来する３つのがんネオエピトープにおいても試験した。Yadav, M. et al., Nature 515:572-576を参照されたい。これらの３つのネオエピトープは、高い割合の疎水性アミノ酸をそれぞれ含有し、したがって、本質的に、Ｈ2Ｏに難溶性である。Ｄ3Ｇ3ペプチドのそれらのＮ末端への融合後、融合ペプチド中の疎水性アミノ酸の部分は、４０％未満に低減され、それらの溶解度はすべて、Ｈ2Ｏ中で３０ｍＭを超えるまでに増加した。
３つの修飾ペプチド、すなわち、Ｄ3Ｇ3－Ｒｅｓｐ１、Ｄ3Ｇ3－ＡｄｐｇｋおよびＤ3Ｇ3－Ｄｐａｇｔを、実施例１に記載の通り、二重エマルションプロセスを使用して調製された中空ＰＬＧＡ系ナノ粒子に、同時に、共封入した。ＨＰＬＣによるナノ粒子の分析は、３つのペプチドすべてが共封入されたことを確認した。図１２を参照されたい。
マウスを、（ｉ）３つのＤ3Ｇ3修飾ネオエピトープペプチドおよびＳＴＩＮＧアゴニストアジュバントを含有するナノ粒子、または（ｉｉ）未修飾ネオエピトープペプチドおよびポリ（Ｉ：Ｃ）アジュバントで、実施例２に説明される通り、ワクチン接種した。異なるワクチン接種によって上昇した免疫応答を、ＣＤ８ Ｔ細胞のサイトカイン産生によって、および腫瘍細胞負荷によって、調べた。
がんネオエピトープによるワクチン接種
上記で説明された修飾戦略を、ＭＣ３８マウス結腸腺がん細胞において、Ｒｅｓｐ１、ＡｄｐｇｋおよびＤｐａｇｔ１遺伝子に由来する３つのがんネオエピトープにおいても試験した。Yadav, M. et al., Nature 515:572-576を参照されたい。これらの３つのネオエピトープは、高い割合の疎水性アミノ酸をそれぞれ含有し、したがって、本質的に、Ｈ2Ｏに難溶性である。Ｄ3Ｇ3ペプチドのそれらのＮ末端への融合後、融合ペプチド中の疎水性アミノ酸の部分は、４０％未満に低減され、それらの溶解度はすべて、Ｈ2Ｏ中で３０ｍＭを超えるまでに増加した。
３つの修飾ペプチド、すなわち、Ｄ3Ｇ3－Ｒｅｓｐ１、Ｄ3Ｇ3－ＡｄｐｇｋおよびＤ3Ｇ3－Ｄｐａｇｔを、実施例１に記載の通り、二重エマルションプロセスを使用して調製された中空ＰＬＧＡ系ナノ粒子に、同時に、共封入した。ＨＰＬＣによるナノ粒子の分析は、３つのペプチドすべてが共封入されたことを確認した。図１２を参照されたい。
マウスを、（ｉ）３つのＤ3Ｇ3修飾ネオエピトープペプチドおよびＳＴＩＮＧアゴニストアジュバントを含有するナノ粒子、または（ｉｉ）未修飾ネオエピトープペプチドおよびポリ（Ｉ：Ｃ）アジュバントで、実施例２に説明される通り、ワクチン接種した。異なるワクチン接種によって上昇した免疫応答を、ＣＤ８ Ｔ細胞のサイトカイン産生によって、および腫瘍細胞負荷によって、調べた。
【0021】
ＩＦＮ－γを産生するＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージを、それぞれの未修飾ネオエピトープペプチドによって別々に負荷された脾細胞において、上記に記載の通り測定した。図１３Ａに示される結果は、ネオエピトープ負荷後、５％～１２％のＣＤ８ Ｔ細胞がＩＦＮ－γを産生したことを示した。測定可能なＣＤ８ Ｔ細胞応答は、遊離未修飾ネオエピトープペプチドでワクチン接種されたマウスからの脾細胞において見られなかった。
腫瘍細胞負荷に目を向けると、ＭＣ３８細胞を、（ｉ）ＰＢＳ、（ｉｉ）３つの未修飾ネオエピトープペプチドとポリ（Ｉ：Ｃ）アジュバントとの混合物、（ｉｉｉ）３つの未修飾ネオエピトープペプチドとＳＴＩＮＧアゴニストの環状ｄｉ－ＧＭＰとの混合物、または（ｉｖ）３つの修飾ネオ抗原ペプチドすべておよびＳＴＩＮＧアゴニストを含有するナノ粒子で以前に免疫されたマウスに、皮下注射した。結果を図１３Ｂに示す。ナノ粒子ワクチン接種は、腫瘍成長の阻害によって証拠付けられるように、ＭＣ３８腫瘍細胞による皮下の負荷に対して、顕著な防御免疫を付与した。対照的に、３つの遊離ネオエピトープペプチドと環状ｄｉ－ＧＭＰまたはポリ（Ｉ：Ｃ）アジュバントによるワクチン接種は、腫瘍成長の遅延において有効性が顕著に低かった。
腫瘍細胞負荷に目を向けると、ＭＣ３８細胞を、（ｉ）ＰＢＳ、（ｉｉ）３つの未修飾ネオエピトープペプチドとポリ（Ｉ：Ｃ）アジュバントとの混合物、（ｉｉｉ）３つの未修飾ネオエピトープペプチドとＳＴＩＮＧアゴニストの環状ｄｉ－ＧＭＰとの混合物、または（ｉｖ）３つの修飾ネオ抗原ペプチドすべておよびＳＴＩＮＧアゴニストを含有するナノ粒子で以前に免疫されたマウスに、皮下注射した。結果を図１３Ｂに示す。ナノ粒子ワクチン接種は、腫瘍成長の阻害によって証拠付けられるように、ＭＣ３８腫瘍細胞による皮下の負荷に対して、顕著な防御免疫を付与した。対照的に、３つの遊離ネオエピトープペプチドと環状ｄｉ－ＧＭＰまたはポリ（Ｉ：Ｃ）アジュバントによるワクチン接種は、腫瘍成長の遅延において有効性が顕著に低かった。
【0022】
上記の結果は、親水性ペプチドアダプター、例えば、Ｄ3Ｇ3を多種多様なペプチドの物理化学的特徴を統一するために用いることができることを明らかにする。この戦略により、異なるペプチドを、それらの元の特性に関わりなく、中空の薄いシェルのナノ粒子に同時に封入することが可能である。
共封入の追加例において、Ｄ3Ｇ3－Ｔｒｐ２は、２つの親水性ペプチド、すなわち、ｇｐ１００およびＴｒｐ１ｍとともに成功裏に共封入された。図１４を参照されたい。
共封入の追加例において、Ｄ3Ｇ3－Ｔｒｐ２は、２つの親水性ペプチド、すなわち、ｇｐ１００およびＴｒｐ１ｍとともに成功裏に共封入された。図１４を参照されたい。
【0023】
（実施例４）
水溶性ペプチドエピトープの修飾
水溶性ペプチドエピトープの免疫原性に対する親水性ペプチドアダプターの効果を、オボアルブミンペプチドエピトープＯＶＡ257-264（ＯＶＡ；ＳＩＩＮＦＥＫＬ－配列番号１２）を修飾すること、およびそれらをナノ粒子に組み込むことによって、試験した。修飾ＯＶＡペプチドは、以下の通りであった：（ｉ）Ｄ4－ＯＶＡ－Ｄ5、（ｉｉ）ＯＶＡ－Ｄ4、（ｉｉｉ）Ｄ4－ＯＶＡ、（ｉｖ）Ｄ2Ｇ3－ＯＶＡ－Ｇ3Ｄ2、（ｖ）ＯＶＡ－Ｇ3Ｄ4、および（ｖｉ）Ｄ3Ｇ3－ＯＶＡ。
２ｍＭのＯＶＡ257-264の水溶性は、そのＮ末端に親水性ペプチドアダプター、すなわちＤ3Ｇ3を融合することによって、５０ｍＭに改善された。同様の溶解度の改善が、Ｄ3Ｇ3をＯＶＡ257-264のＣ末端に融合することによって、およびＤ4Ｇ3をそのＮ末端またはそのＣ末端に融合することによって、得られた。
ＯＶＡおよびそれぞれの修飾ＯＶＡペプチドの免疫原性を、上記に記載の通り試験した。図１５に示す結果は、免疫されたマウスからの脾細胞におけるＯＶＡペプチド特異的応答が、Ｄ３Ｇ３ペプチドアダプターをＮ末端で使用する場合に増加したが、他の修飾は、わずかに低減された免疫原性をもたらしたことを実証した。
水溶性ペプチドエピトープの修飾
水溶性ペプチドエピトープの免疫原性に対する親水性ペプチドアダプターの効果を、オボアルブミンペプチドエピトープＯＶＡ257-264（ＯＶＡ；ＳＩＩＮＦＥＫＬ－配列番号１２）を修飾すること、およびそれらをナノ粒子に組み込むことによって、試験した。修飾ＯＶＡペプチドは、以下の通りであった：（ｉ）Ｄ4－ＯＶＡ－Ｄ5、（ｉｉ）ＯＶＡ－Ｄ4、（ｉｉｉ）Ｄ4－ＯＶＡ、（ｉｖ）Ｄ2Ｇ3－ＯＶＡ－Ｇ3Ｄ2、（ｖ）ＯＶＡ－Ｇ3Ｄ4、および（ｖｉ）Ｄ3Ｇ3－ＯＶＡ。
２ｍＭのＯＶＡ257-264の水溶性は、そのＮ末端に親水性ペプチドアダプター、すなわちＤ3Ｇ3を融合することによって、５０ｍＭに改善された。同様の溶解度の改善が、Ｄ3Ｇ3をＯＶＡ257-264のＣ末端に融合することによって、およびＤ4Ｇ3をそのＮ末端またはそのＣ末端に融合することによって、得られた。
ＯＶＡおよびそれぞれの修飾ＯＶＡペプチドの免疫原性を、上記に記載の通り試験した。図１５に示す結果は、免疫されたマウスからの脾細胞におけるＯＶＡペプチド特異的応答が、Ｄ３Ｇ３ペプチドアダプターをＮ末端で使用する場合に増加したが、他の修飾は、わずかに低減された免疫原性をもたらしたことを実証した。
【0024】
（実施例５）
ＭＨＣクラスＩおよびＩＩエピトープの修飾
上記に記載のペプチドアダプター修飾戦略の広範な適用可能性を、下記の表１に示す融合ペプチドを調製することによって調べた。
ＭＨＣクラスＩおよびＩＩエピトープの修飾
上記に記載のペプチドアダプター修飾戦略の広範な適用可能性を、下記の表１に示す融合ペプチドを調製することによって調べた。
【表1】
【0025】
それぞれの融合ペプチドを、上記に記載の通り、１０００分子のｃｄＧＭＰと一緒に、中空の薄壁のナノ粒子の水性コアにロードした。すべての修飾ペプチドは、未修飾親水性ペプチドエピトープと同様に、ナノ粒子の水性コアに容易に組み込まれた。
上記で説明される通り、ナノ粒子を使用して、マウスにワクチン接種し、Ｔ細胞応答を、未修飾ペプチドエピトープによるワクチン接種マウスから単離された脾細胞を負荷した後、ＣＤ８またはＣＤ４ Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色によって測定した。結果を図１６Ａおよび１６Ｂに示す。
試験された修飾ペプチド抗原はすべて、未修飾ペプチド抗原でワクチン接種されたマウスと比較して、ワクチン接種マウスにおいて増強された免疫応答をもたらした。この増強は、試験された抗原について必要に応じて、ＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞の両方について示した。明らかに、上記に記載のペプチド抗原修飾戦略は、それらの固有の疎水性および親水性に関わらず、多くの異なるペプチド抗原配列に適用可能である。
上記で説明される通り、ナノ粒子を使用して、マウスにワクチン接種し、Ｔ細胞応答を、未修飾ペプチドエピトープによるワクチン接種マウスから単離された脾細胞を負荷した後、ＣＤ８またはＣＤ４ Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色によって測定した。結果を図１６Ａおよび１６Ｂに示す。
試験された修飾ペプチド抗原はすべて、未修飾ペプチド抗原でワクチン接種されたマウスと比較して、ワクチン接種マウスにおいて増強された免疫応答をもたらした。この増強は、試験された抗原について必要に応じて、ＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞の両方について示した。明らかに、上記に記載のペプチド抗原修飾戦略は、それらの固有の疎水性および親水性に関わらず、多くの異なるペプチド抗原配列に適用可能である。
【0026】
さらに、上記のデータは、予想外にも、Ｄ3Ｇ3またはＤ4Ｇ3で修飾された親水性ペプチド抗原がすべて、両方とも同じキャリアシステムによって送達されたにも関わらず、未修飾親水性ペプチド抗原に対応するレベルを超えて免疫原性を増加させたことを示す。図１６Ｂを参照されたい。この予想外の結果は、ペプチドアダプターが、異なるペプチド抗原の物理化学的特性を統一するように働くだけでなく、抗原のプロセシングおよび抗原の提示も改善することを示す。
また、これは、免疫応答性が未修飾ペプチド抗原で負荷された脾細胞において測定されたことを繰り返し担う。修飾ペプチド抗原でワクチン接種されたマウスからの脾細胞が、未修飾ペプチド抗原に対して応答したという事実は、修飾が、所望の抗原配列に対するＴ細胞応答の特異性に影響を与えなかったことを示す。
また、これは、免疫応答性が未修飾ペプチド抗原で負荷された脾細胞において測定されたことを繰り返し担う。修飾ペプチド抗原でワクチン接種されたマウスからの脾細胞が、未修飾ペプチド抗原に対して応答したという事実は、修飾が、所望の抗原配列に対するＴ細胞応答の特異性に影響を与えなかったことを示す。
【0027】
（実施例６）
薄いシェルのナノ粒子封入修飾ペプチドによるネオ抗原の同定および免疫化
ネオ抗原として公知の個々のがん患者における固有の変異は、腫瘍特異的免疫応答を引き起こすためのそれらの可能性に起因して、研究されている。この個別化がんワクチンアプローチは、腫瘍異種性および患者特異的ＨＬＡハプロタイプの相違などの課題を克服することができ、それによってそれぞれの患者に対する抗腫瘍有効性を最大化する。
上記に記載のペプチドアダプター修飾は、ネオエピトープなどの別個のペプチドの物理化学的特性を統一するために理想的であり、したがって、それらが、合理化されたプロセスにおいて薄いシェルのナノ粒子に共封入されるのを可能にする。図１７を参照されたい。
このアプローチの生存率を、（ｉ）免疫エピトープデータベース（ＩＥＤＢ）コンセンサス法バージョン２．５、および（ｉｉ）ＤｅｅｐＨＬＡｐａｎソフトウェアを使用して２１のマウスＢ１６黒色腫ネオエピトープの２つのセットを別々に予測することによって試験した（Wu et al., 2019, Front. Immunol. 10:2559を参照されたい）。個々のペプチドを、合成し、親水性アダプターＤ4Ｇ3で修飾し、次いで、７つのペプチドのグループで、薄いシェルのナノ粒子に組み込んだ。
ＨＰＬＣ分析は、７つの修飾ペプチドのグループで、ＩＥＤＢコンセンサス法によって予測された２１のネオエピトープすべての中空ナノ粒子への成功裏の封入を示した。図１８Ａ～１８Ｃを参照されたい。同様の結果が、ＤｅｅｐＨＬＡｐａｎによって予測された２１のエピトープで得られた（データは示さない）。
薄いシェルのナノ粒子封入修飾ペプチドによるネオ抗原の同定および免疫化
ネオ抗原として公知の個々のがん患者における固有の変異は、腫瘍特異的免疫応答を引き起こすためのそれらの可能性に起因して、研究されている。この個別化がんワクチンアプローチは、腫瘍異種性および患者特異的ＨＬＡハプロタイプの相違などの課題を克服することができ、それによってそれぞれの患者に対する抗腫瘍有効性を最大化する。
上記に記載のペプチドアダプター修飾は、ネオエピトープなどの別個のペプチドの物理化学的特性を統一するために理想的であり、したがって、それらが、合理化されたプロセスにおいて薄いシェルのナノ粒子に共封入されるのを可能にする。図１７を参照されたい。
このアプローチの生存率を、（ｉ）免疫エピトープデータベース（ＩＥＤＢ）コンセンサス法バージョン２．５、および（ｉｉ）ＤｅｅｐＨＬＡｐａｎソフトウェアを使用して２１のマウスＢ１６黒色腫ネオエピトープの２つのセットを別々に予測することによって試験した（Wu et al., 2019, Front. Immunol. 10:2559を参照されたい）。個々のペプチドを、合成し、親水性アダプターＤ4Ｇ3で修飾し、次いで、７つのペプチドのグループで、薄いシェルのナノ粒子に組み込んだ。
ＨＰＬＣ分析は、７つの修飾ペプチドのグループで、ＩＥＤＢコンセンサス法によって予測された２１のネオエピトープすべての中空ナノ粒子への成功裏の封入を示した。図１８Ａ～１８Ｃを参照されたい。同様の結果が、ＤｅｅｐＨＬＡｐａｎによって予測された２１のエピトープで得られた（データは示さない）。
【0028】
マウスを、上記に記載の通り、ｃｄＧＭＰとともにナノ粒子にロードされた修飾ペプチドで、薬物刺激および追加免疫した。強いＣＤ８＋ Ｔ細胞応答が、６つのＩＥＤＢコンセンサスが予測したネオエピトープ（Ｍ３３、Ｍ２１、Ｍ２８、Ｍ４７、Ｍ０５およびＭ４５；図１９Ａを参照されたい）、および３つのＤｅｅｐＨＬＡｐａｎが予測したネオエピトープ（Ｎ２２、Ｎ８およびＮ１４；図１９Ｂを参照されたい）に対して検出され、その大部分は新規である。予測されたマウスＢ１６黒色腫ネオエピトープのうち、Ｍ２８、Ｍ４５、Ｎ２２、Ｎ８およびＮ１４が新たに発見された。
加えて、長い合成ペプチドでマウスをワクチン接種した場合に予想外の優勢ＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を報告した以前の文献（Kreiter et al., 2015, Nature 520(7549): 692-696を参照されたい）とは対照的に、顕著なＣＤ４＋ Ｔ細胞応答は観察されなかった。明らかに、ペプチド親水性アダプター修飾は、個別化がんワクチンの製造を容易にするだけでなく、正確なネオエピトープ特異的免疫も促進する。
加えて、長い合成ペプチドでマウスをワクチン接種した場合に予想外の優勢ＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を報告した以前の文献（Kreiter et al., 2015, Nature 520(7549): 692-696を参照されたい）とは対照的に、顕著なＣＤ４＋ Ｔ細胞応答は観察されなかった。明らかに、ペプチド親水性アダプター修飾は、個別化がんワクチンの製造を容易にするだけでなく、正確なネオエピトープ特異的免疫も促進する。
【0029】
（実施例７）
薄いシェルのナノ粒子封入修飾ペプチドによるヒトがんネオ抗原の同定および免疫化
上記で説明されたペプチドアダプター修飾を、患者に由来するネオエピトープにおいて用いた。腫瘍試料を、２人の結腸直腸がん患者から収集し、次世代シークエンシングを行って、腫瘍特異的変異を同定した。９および２１のネオエピトープのセットを、ＤｅｅｐＨＬＡｐａｎを使用して予測し、結合した親水性アダプターＤ3Ｇ3を用いて合成した。
患者特異的ＨＬＡハプロタイプを持つトランスジェニックマウスを、修飾ネオエピトープ含有ナノ粒子ワクチンで免疫した。結果は、別個のＣＤ８＋ Ｔ細胞応答が、１人の患者からの３つのエピトープ（図２０Ａを参照されたい）および他の患者からの５つのエピトープ（図２０Ｂを参照されたい）に対して刺激された。
これらの結果は、ペプチドアダプター設計が、薄いシェルのナノ粒子によるネオエピトープの共送達を促進するためにペプチドのさまざまな特性を調整するための実現可能な戦略であることを示す。加えて、免疫原性エピトープの同定および検証は、ヒトＨＬＡトランスジェニックマウスと一緒のこのアプローチによって加速することができる。これは、個別化ネオ抗原ワクチン開発のための容易で強力なプラットフォームを提供する。
薄いシェルのナノ粒子封入修飾ペプチドによるヒトがんネオ抗原の同定および免疫化
上記で説明されたペプチドアダプター修飾を、患者に由来するネオエピトープにおいて用いた。腫瘍試料を、２人の結腸直腸がん患者から収集し、次世代シークエンシングを行って、腫瘍特異的変異を同定した。９および２１のネオエピトープのセットを、ＤｅｅｐＨＬＡｐａｎを使用して予測し、結合した親水性アダプターＤ3Ｇ3を用いて合成した。
患者特異的ＨＬＡハプロタイプを持つトランスジェニックマウスを、修飾ネオエピトープ含有ナノ粒子ワクチンで免疫した。結果は、別個のＣＤ８＋ Ｔ細胞応答が、１人の患者からの３つのエピトープ（図２０Ａを参照されたい）および他の患者からの５つのエピトープ（図２０Ｂを参照されたい）に対して刺激された。
これらの結果は、ペプチドアダプター設計が、薄いシェルのナノ粒子によるネオエピトープの共送達を促進するためにペプチドのさまざまな特性を調整するための実現可能な戦略であることを示す。加えて、免疫原性エピトープの同定および検証は、ヒトＨＬＡトランスジェニックマウスと一緒のこのアプローチによって加速することができる。これは、個別化ネオ抗原ワクチン開発のための容易で強力なプラットフォームを提供する。
【0030】
（実施例８）
修飾ペプチド抗原によるＴｒｅｇ細胞の誘導
ペプチドアダプター修飾戦略を用いて、中空ポリマーナノ粒子に、アダプター修飾ペプチド抗原と免疫抑制剤、すなわちアスピリンを共封入することによって、寛容誘導ナノ粒子を調製した。アスピリンは、樹状細胞において寛容原性の表現型を誘発することができる化合物である。この化合物を特異的抗原と組み合わせることにより、抗原特異的制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の誘導を可能にする。そのようなＴｒｅｇ細胞は、自己免疫疾患を処置するため、および治療用生物製剤に対する免疫応答を低減するために使用することができる。図２１Ａを参照されたい。
修飾ペプチド抗原によるＴｒｅｇ細胞の誘導
ペプチドアダプター修飾戦略を用いて、中空ポリマーナノ粒子に、アダプター修飾ペプチド抗原と免疫抑制剤、すなわちアスピリンを共封入することによって、寛容誘導ナノ粒子を調製した。アスピリンは、樹状細胞において寛容原性の表現型を誘発することができる化合物である。この化合物を特異的抗原と組み合わせることにより、抗原特異的制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の誘導を可能にする。そのようなＴｒｅｇ細胞は、自己免疫疾患を処置するため、および治療用生物製剤に対する免疫応答を低減するために使用することができる。図２１Ａを参照されたい。
【0031】
アスピリンおよびＤ4Ｇ3修飾ＯＴＩＩペプチド抗原（Ｄ4Ｇ3－ＯＴＩＩ）を、ナノ粒子に共封入した。図２１Ｂに示されるように、ナノ粒子を使用して、寛容を誘導した。ナノ粒子を、１週間の間隔で３回、マウスに静脈内注射した。最後の注射の７日後、マウスを、Ｒ８４８としても公知のレシキモドと混合されたＯＴＩＩペプチドで負荷して、免疫刺激事象をシミュレートした。対照マウスに、ＰＢＳ、またはＤ4Ｇ3－ＯＴＩＩおよび遊離アスピリンを注射した。
結果は、ナノ粒子接種マウスが、ＰＢＳ、および遊離アスピリン／ペプチドで処置されたマウスと比較して、７～１０倍高い数のＣＤ２５+Ｆｏｘｐ３+Ｔｒｅｇ細胞を産生したことを示した。図２２Ａ～２２Ｃを参照されたい。
産生したＴｒｅｇ細胞を、ＯＴＩＩ四量体への結合による抗原特異性を調べることによって、さらに分析した。Ｆｏｘｐ３+でもあるＯＴＩＩに特異的なＣＤ４ Ｔ細胞のパーセンテージは、Ｄ4Ｇ3－ＯＴＩＩおよびアスピリンがロードされたナノ粒子でワクチン接種されたマウスから単離された脾細胞のうち、１５％に達し、Ｄ4Ｇ3－ＯＴＩＩおよび遊離アスピリンでワクチン接種されたマウスよりも少なくとも９倍高かった。図２２Ｄおよび２２Ｅを参照されたい。
結果は、ナノ粒子接種マウスが、ＰＢＳ、および遊離アスピリン／ペプチドで処置されたマウスと比較して、７～１０倍高い数のＣＤ２５+Ｆｏｘｐ３+Ｔｒｅｇ細胞を産生したことを示した。図２２Ａ～２２Ｃを参照されたい。
産生したＴｒｅｇ細胞を、ＯＴＩＩ四量体への結合による抗原特異性を調べることによって、さらに分析した。Ｆｏｘｐ３+でもあるＯＴＩＩに特異的なＣＤ４ Ｔ細胞のパーセンテージは、Ｄ4Ｇ3－ＯＴＩＩおよびアスピリンがロードされたナノ粒子でワクチン接種されたマウスから単離された脾細胞のうち、１５％に達し、Ｄ4Ｇ3－ＯＴＩＩおよび遊離アスピリンでワクチン接種されたマウスよりも少なくとも９倍高かった。図２２Ｄおよび２２Ｅを参照されたい。
【0032】
（実施例９）
寛容誘導の機構
寛容原性樹状細胞は、多くの場合、それらの表面における、ＭＨＣ分子（例えば、ＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩ）および共刺激分子（例えば、ＣＤ８０およびＣＤ８６）の特徴的な低発現を有する表現型を示す。
樹状細胞の表面マーカー発現を、インビトロ系において調べて、寛容誘導ナノ粒子が、寛容原性表現型に対して樹状細胞をどのように歪めるかを解明した。
樹状細胞を、アダプター修飾ＯＴＩＩペプチドおよびアスピリン、またはアダプター修飾ペプチドのみを共封入するナノ粒子とともに６時間インキュベートし、次いで、低用量のリポ多糖（「ＬＰＳ」）で刺激した。樹状細胞の表現型を、２４時間後に観察した。図２３中の実験スキームを参照されたい。結果を図２４に示す。
寛容誘導の機構
寛容原性樹状細胞は、多くの場合、それらの表面における、ＭＨＣ分子（例えば、ＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩ）および共刺激分子（例えば、ＣＤ８０およびＣＤ８６）の特徴的な低発現を有する表現型を示す。
樹状細胞の表面マーカー発現を、インビトロ系において調べて、寛容誘導ナノ粒子が、寛容原性表現型に対して樹状細胞をどのように歪めるかを解明した。
樹状細胞を、アダプター修飾ＯＴＩＩペプチドおよびアスピリン、またはアダプター修飾ペプチドのみを共封入するナノ粒子とともに６時間インキュベートし、次いで、低用量のリポ多糖（「ＬＰＳ」）で刺激した。樹状細胞の表現型を、２４時間後に観察した。図２３中の実験スキームを参照されたい。結果を図２４に示す。
【0033】
予想通り、ＬＰＳ処理は、媒体対照と比較して、処理された樹状細胞表面におけるＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩの増加した発現をもたらした。図２４の黒色のバーを参照されたい。アダプター修飾ＯＴＩＩペプチドを封入するナノ粒子は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩのＬＰＳ誘導発現に対してほとんど効果を有さなかった。図２４のそれぞれのグラフにおける左から５番目のバーを参照されたい。驚くべきことに、アダプター修飾ＯＴＩＩペプチドおよびアスピリンを共封入するナノ粒子は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩのＬＰＳ誘導発現を抑制した。図２４のそれぞれのグラフにおける右端のバーを参照されたい。これらのデータは、アダプター修飾戦略を、寛容原性ナノ粒子を調製して、樹状細胞を、細胞におけるＭＨＣ分子および共刺激分子の発現を低減することによって、寛容原性樹状細胞に形質転換するために用いることができることを示す。
上記の結果は、ペプチドアダプター修飾戦略が、修飾ペプチドのエピトープの特性を損なうことなく、抗原／ナノキャリアカップリングを促進することによって、寛容原性ナノ粒子の調製を可能にすることを明らかに実証する。
上記の実施例は、ペプチドアダプターが、複数のペプチド標的が選択されたキャリアシステムと会合するためにペプチド標的に普遍的に適用することができることを実証する。また、ペプチドアダプターの標的ペプチドへの融合は、予想外に、標的ペプチドの免疫原性または特異性を低減しない。これは、ネオエピトープに対する個別化がんワクチンの製造において特に重要である。腫瘍特異的ネオエピトープが同定されたら、エピトープの詳細な特性評価の必要性なく、それらを、それらのＮ末端に結合されるペプチドアダプターと一緒に合成することができる。
上記の結果は、ペプチドアダプター修飾戦略が、修飾ペプチドのエピトープの特性を損なうことなく、抗原／ナノキャリアカップリングを促進することによって、寛容原性ナノ粒子の調製を可能にすることを明らかに実証する。
上記の実施例は、ペプチドアダプターが、複数のペプチド標的が選択されたキャリアシステムと会合するためにペプチド標的に普遍的に適用することができることを実証する。また、ペプチドアダプターの標的ペプチドへの融合は、予想外に、標的ペプチドの免疫原性または特異性を低減しない。これは、ネオエピトープに対する個別化がんワクチンの製造において特に重要である。腫瘍特異的ネオエピトープが同定されたら、エピトープの詳細な特性評価の必要性なく、それらを、それらのＮ末端に結合されるペプチドアダプターと一緒に合成することができる。
【0034】
他の実施形態
本明細書に開示される特徴はすべて、任意の組み合わせで、組み合わせられ得る。本明細書に開示されるそれぞれの特徴は、同じ、等価または類似の目的を果たす代替特徴によって置き換えられ得る。したがって、他に明白に述べられない限り、開示されるそれぞれの特徴は、包括的な一連の等価または類似の特徴の例のみである。
上記の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に解明することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、本発明のさまざまな変化および改変を行って、さまざまな使用法および条件にそれを適合させることができる。したがって、他の実施形態も、特許請求の範囲内である。
本明細書に開示される特徴はすべて、任意の組み合わせで、組み合わせられ得る。本明細書に開示されるそれぞれの特徴は、同じ、等価または類似の目的を果たす代替特徴によって置き換えられ得る。したがって、他に明白に述べられない限り、開示されるそれぞれの特徴は、包括的な一連の等価または類似の特徴の例のみである。
上記の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に解明することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、本発明のさまざまな変化および改変を行って、さまざまな使用法および条件にそれを適合させることができる。したがって、他の実施形態も、特許請求の範囲内である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図19A】
【図19B】
【図20A】
【図20B】
【図21A】
【図21B】
【図22A】
【図22B】
【図22C】
【図22D】
【図22E】
【図23】
【図24】
【配列表】