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特許7561405抗体において自己抗原に対する反応性を低減する方法、および低減された自己抗原に対する反応性を有する抗体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-26
(45)【発行日】2024-10-04
(54)【発明の名称】抗体において自己抗原に対する反応性を低減する方法、および低減された自己抗原に対する反応性を有する抗体
(51)【国際特許分類】
C12P 21/08 20060101AFI20240927BHJP
C07K 16/10 20060101ALI20240927BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20240927BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240927BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20240927BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240927BHJP
【ＦＩ】
C12P21/08 ZNA
C07K16/10
A61P31/16
A61K39/395 S
C12N5/10
C12N15/13
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2019221173
(22)【出願日】2019-12-06
(65)【公開番号】P2021090354
(43)【公開日】2021-06-17
【審査請求日】2022-12-05
(73)【特許権者】
【識別番号】503359821
【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所
(74)【代理人】
【識別番号】230104019
【弁護士】
【氏名又は名称】大野 聖二
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(72)【発明者】
【氏名】福山 英啓
(72)【発明者】
【氏名】岡村 千絵子
(72)【発明者】
【氏名】畑 ひかる
【審査官】田中 晴絵
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第１５／０２５８２５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】The Journal of Immunology，2011年，187(7)，3785-3797, suppl.
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｐ ２１／０８
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
特定の抗原に結合すると共に非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体から、当該特定の抗原への結合親和性を少なくとも部分的に有し、かつ、低減された非特異的な結合反応性を有するモノクローナル抗体を得る方法であって、前記特定の抗原に結合すると共に非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体の軽鎖をコードする遺伝子を有する細胞であって、前記特定の抗原に結合すると共に非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体の重鎖をコードする遺伝子によってＩｇｈ遺伝子座が置き換えられた前記細胞を非ヒト哺乳動物に移植して生着させ、前記非ヒト哺乳動物に生着した前記細胞において軽鎖の遺伝子再構成を引き起こすことと、但し、前記細胞は、造血幹細胞、リンパ系幹細胞、プロＢ細胞、および大型プレＢ細胞から選択される細胞または多能性細胞であり、
前記非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を調製することと、
前記軽鎖の遺伝子再構成を引き起こした抗体産生細胞であって、前記特定の抗原に対する結合親和性を有し、かつ、低減された非特異的な結合反応性を有するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞を選択することと、
当該抗体産生細胞が産生する抗体の重鎖ＣＤＲ１～３と軽鎖ＣＤＲ１～３とを有する抗体を発現する組換え抗体産生細胞株を得ることと、
前記組換え抗体産生細胞株からモノクローナル抗体を得ることと
を含む、方法。
【請求項2】
前記特定の抗原が、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのステム領域である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記特定の抗原に結合すると共に非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体が自己抗原反応性の抗体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記特定の抗原に結合すると共に非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体がＣ１７９抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記非ヒト哺乳動物が、Ｈ３株のヘマグルチニンまたはＨ３株のヘッドレスヘマグルチニンで免疫された前記非ヒト哺乳動物である、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）のいずれかに結合する抗体であって、
Ｃ１７９抗体と比較して、自己抗原に対する反応性を低下させており、かつ
（１）配列番号１４０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを有する抗体； もしくは
（２）配列番号１３８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１３９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを有する抗体
またはその抗原結合フラグメント。
【請求項7】
請求項６に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗体において自己抗原に対する反応性を低減する方法、および低減された自己抗原に対する反応性を有する抗体に関する。
【背景技術】
【0002】
インフルエンザウイルス感染は、深刻な健康と社会経済的結果をもたらす季節性の疾患であり、さらにＨ５Ｎ１やＨ７Ｎ９などの新興ウイルスによる致命的な大流行のリスクがある。伝播中にインフルエンザウイルスゲノムが遺伝的に改変されると、抗原に変化が起こり、これにより季節性ワクチンの有効性が繰り返し妨げられてきた。１９９３年、インフルエンザ免疫マウス1から最初の広範囲中和モノクローナル抗体（ｂｎＡｂ）Ｃ１７９が単離され、現在までのところ、ヒトでもいくつかの他のｂｎＡｂが発見された2。驚くべきことに、ヒトとマウスの両ｂｎＡｂの構造研究は、それらｂｎＡｂの大部分がヘマグルチニンのステム領域3、4、5、6においてＨＡ１とＨＡ２の両方のドメインからなる共通の構造エピトープを認識することを明らかにした。Ｃ１７９はＨＡ１ドメインとＨＡ２ドメインを架橋し、ＨＡ１ドメインの融合ペプチドが宿主細胞膜に向かって反転するのを防ぎ、宿主－ウイルス融合を可能にする1。これらのｂｎＡｂが発見されたことにより、普遍的なインフルエンザワクチンの開発が現実的に可能になった。
【0003】
一方、ヒトステム特異的「交差反応性」抗体は比較的よく見られるものであるが7、ステム特異的「広範囲中和」抗体は稀である3,8。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】Ｏｋｕｎｏ， Ｙ．， Ｉｓｅｇａｗａ， Ｙ．， Ｓａｓａｏ， Ｆ． ＆ Ｕｅｄａ， Ｓ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７， ２５５２－２５５８ （１９９３）．
【文献】Ｃｏｒｔｉ， Ｄ． ＆ Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ， Ａ．， Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３１， ７０５－７４２ （２０１３）．
【文献】Ｃｏｒｔｉ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １２０， １６６３－１６７３ （２０１０）．
【文献】Ｄｒｅｙｆｕｓ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７， １３４３－１３４８ （２０１２）．
【文献】Ｓｕｉ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １６， ２６５－２７３ （２００９）．
【文献】Ｔｈｒｏｓｂｙ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ３ （２００８）．
【発明の概要】
【0005】
本発明は、特定の抗原に結合すると共に非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体（特に特定の抗原が、外来の侵入者の抗原であり、非特異的な結合が、自己抗原に対するものである抗体）について、非特異的な結合反応性（例えば、自己抗原に対する反応性）を低減する方法を見出した。本発明は、抗体において自己抗原に対する反応性を低減する方法、および低減された自己抗原に対する反応性を有する抗体を提供する。
【0006】
本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］特定の抗原に結合すると共に非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体から、当該特定の抗原への結合親和性を少なくとも部分的に有し、かつ、低減された非特異的な結合反応性を有するモノクローナル抗体を得る方法であって、
前記非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体の軽鎖をコードする遺伝子を有する細胞であって、前記非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体の重鎖をコードする遺伝子によってＩｇｈ遺伝子座が置き換えられた前記細胞を非ヒト哺乳動物に移植して生着させ、軽鎖の遺伝子再構成を引き起こすことと、
前記非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を調製することと、
前記特定の抗原に対する結合親和性を有する抗体を産生する抗体産生細胞を選択することと、
当該抗体産生細胞が産生する抗体の重鎖ＣＤＲ１～３と軽鎖ＣＤＲ１～３とを有する抗体を発現する組換え抗体産生細胞株を得ることと、
前記組換え抗体産生細胞株からモノクローナル抗体を得ることと
を含む、方法。
［１Ａ］特定の抗原に結合すると共に非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体から、当該特定の抗原への結合親和性を少なくとも部分的に有し、かつ、低減された非特異的な結合反応性を有するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞を得る方法であって、
前記非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体の軽鎖をコードする遺伝子を有する細胞であって、前記非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体の重鎖をコードする遺伝子によってＩｇｈ遺伝子座が置き換えられた前記細胞を非ヒト哺乳動物に移植して生着させ、軽鎖の遺伝子再構成を引き起こすことと、
前記非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を調製することと、
前記特定の抗原に対する結合親和性を有する抗体を産生する抗体産生細胞を選択することと、
当該抗体産生細胞が産生する抗体の重鎖ＣＤＲ１～３と軽鎖ＣＤＲ１～３とを有する抗体を発現する組換え抗体産生細胞株を得ることと
を含む、方法。
［１Ｂ］モノクローナル抗体を得る方法であって、
組換え抗体産生細胞株から産生されるモノクローナル抗体を回収することを含み、
当該組換え抗体産生細胞株は、
非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体の軽鎖をコードする遺伝子を有する細胞であって、前記非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体の重鎖をコードする遺伝子によってＩｇｈ遺伝子座が置き換えられた前記細胞を非ヒト哺乳動物に移植して生着させ、軽鎖の遺伝子再構成を引き起こすことと、
前記非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を調製することと、
前記特定の抗原に対する結合親和性を有する抗体を産生する抗体産生細胞を選択することと、
当該抗体産生細胞が産生する抗体の重鎖ＣＤＲ１～３と軽鎖ＣＤＲ１～３とを有する抗体を発現する組換え抗体産生細胞株を得ること
を含む方法によって得られた株である、
方法。
［２］前記特定の抗原が、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのステム領域である、上記［１］、［１Ａ］、および［１Ｂ］のいずれかに記載の方法。
［３］前記特定の抗原に結合するモノクローナル抗体が自己抗原反応性の抗体である、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記特定の抗原に結合するモノクローナル抗体がＣ１７９抗体である、上記［３］に記載の方法。
［５］前記非ヒト哺乳動物が、Ｈ３株のヘマグルチニンまたはＨ３株のヘッドレスヘマグルチニンで免疫された前記非ヒト哺乳動物である、上記［２］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）のいずれかに結合する抗体であって、
（１）配列番号１４０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを有する抗体；
（２）配列番号１３８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１３９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを有する抗体；および
（３）上記（２）に記載の抗体と当該ＨＡとの結合に関して競合する抗体、
またはその抗原結合フラグメント。
［７］上記［６］に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、医薬組成物。
［１］特定の抗原に結合すると共に非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体から、当該特定の抗原への結合親和性を少なくとも部分的に有し、かつ、低減された非特異的な結合反応性を有するモノクローナル抗体を得る方法であって、
前記非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体の軽鎖をコードする遺伝子を有する細胞であって、前記非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体の重鎖をコードする遺伝子によってＩｇｈ遺伝子座が置き換えられた前記細胞を非ヒト哺乳動物に移植して生着させ、軽鎖の遺伝子再構成を引き起こすことと、
前記非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を調製することと、
前記特定の抗原に対する結合親和性を有する抗体を産生する抗体産生細胞を選択することと、
当該抗体産生細胞が産生する抗体の重鎖ＣＤＲ１～３と軽鎖ＣＤＲ１～３とを有する抗体を発現する組換え抗体産生細胞株を得ることと、
前記組換え抗体産生細胞株からモノクローナル抗体を得ることと
を含む、方法。
［１Ａ］特定の抗原に結合すると共に非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体から、当該特定の抗原への結合親和性を少なくとも部分的に有し、かつ、低減された非特異的な結合反応性を有するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞を得る方法であって、
前記非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体の軽鎖をコードする遺伝子を有する細胞であって、前記非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体の重鎖をコードする遺伝子によってＩｇｈ遺伝子座が置き換えられた前記細胞を非ヒト哺乳動物に移植して生着させ、軽鎖の遺伝子再構成を引き起こすことと、
前記非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を調製することと、
前記特定の抗原に対する結合親和性を有する抗体を産生する抗体産生細胞を選択することと、
当該抗体産生細胞が産生する抗体の重鎖ＣＤＲ１～３と軽鎖ＣＤＲ１～３とを有する抗体を発現する組換え抗体産生細胞株を得ることと
を含む、方法。
［１Ｂ］モノクローナル抗体を得る方法であって、
組換え抗体産生細胞株から産生されるモノクローナル抗体を回収することを含み、
当該組換え抗体産生細胞株は、
非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体の軽鎖をコードする遺伝子を有する細胞であって、前記非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体の重鎖をコードする遺伝子によってＩｇｈ遺伝子座が置き換えられた前記細胞を非ヒト哺乳動物に移植して生着させ、軽鎖の遺伝子再構成を引き起こすことと、
前記非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を調製することと、
前記特定の抗原に対する結合親和性を有する抗体を産生する抗体産生細胞を選択することと、
当該抗体産生細胞が産生する抗体の重鎖ＣＤＲ１～３と軽鎖ＣＤＲ１～３とを有する抗体を発現する組換え抗体産生細胞株を得ること
を含む方法によって得られた株である、
方法。
［２］前記特定の抗原が、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのステム領域である、上記［１］、［１Ａ］、および［１Ｂ］のいずれかに記載の方法。
［３］前記特定の抗原に結合するモノクローナル抗体が自己抗原反応性の抗体である、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記特定の抗原に結合するモノクローナル抗体がＣ１７９抗体である、上記［３］に記載の方法。
［５］前記非ヒト哺乳動物が、Ｈ３株のヘマグルチニンまたはＨ３株のヘッドレスヘマグルチニンで免疫された前記非ヒト哺乳動物である、上記［２］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）のいずれかに結合する抗体であって、
（１）配列番号１４０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを有する抗体；
（２）配列番号１３８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１３９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを有する抗体；および
（３）上記（２）に記載の抗体と当該ＨＡとの結合に関して競合する抗体、
またはその抗原結合フラグメント。
［７］上記［６］に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、医薬組成物。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】Ｃ１７９ＢＣＲ発現Ｂ細胞およびそのＨＡタンパク質への結合。（Ａ）Ｃ１７９ ＢＣＲマウスの脾臓中の総リンパ球、Ｂ細胞、Ｔ細胞の数。（Ｂ）インフルエンザＨ２Ｎ２ウイルスの安定な三量体ＨＡタンパク質の生産。組換えＨＡタンパク質の概略図；ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるタンパク質発現；三量体ＨＡタンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー分析。（Ｃ）ＨＡタンパク質に対する抗体の親和性（Ｋｄ（Ｍ）で示す）。フローサイトメトリー解析（Ｄ）代表図と各種ＢＣＲマウス系統由来のＢ細胞へのＨＡタンパク質結合の要約データ（Ｅ）。ＮＳＰ２およびＮＳＰ２９は、Ｎａｒｉｔａ（Ｈ１ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｄｍ様）株特異的モノクローナル抗体である。Ｈｙ１０は抗ＨＥＬ ＢＣＲマウスである。エラーバーはｎ＝３～８の動物のデータのＳＥＭを示す。全データを６つの独立した実験からプールする。統計解析には独立２群両側ｓｔｕｄｅｎｔ検定を用いた。Ｎ．Ｔ．：試験せず。
【図2】Ｃ１７９、Ｃ１７９生殖系列、ＮＳＰ２ Ｂ細胞の単一細胞Ｉｇレパートリー分析。Ｉｇｈ、Ｉｇκ、Ｉｇｈ－Ｉｇκのペアの導入遺伝子の使用頻度を円グラフに示す。解析した配列の数は円グラフの中心に示した。黒色および薄いグレーは、それぞれ導入遺伝子および非導入遺伝子アリル（対立遺伝子）を示す。Ｉｇκの濃いグレーはＩＧＫＶ１２－４６＊０１アリルを示し、これはＣ１７９およびＣ１７９生殖系列Ｂ細胞に頻繁に用いられる。２つの独立した実験の１つが示されている。他の実験のデータを図１１に示す。
【図3】Ｃ１７９Ｒａｇ１欠損およびＲａｇ１の十分なＢ細胞の単一細胞Ｉｇレパートリー分析。円グラフはＩｇｈ、Ｉｇκ、Ｉｇｈ－Ｉｇκのペアの導入遺伝子の使用頻度を示す。解析した配列の数は円グラフの中心に示した。黒色および薄いグレーは、それぞれ導入遺伝子および非導入遺伝子アリルを示す。Ｉｇκの濃いグレーは、ＩＧＫＶ１２－４６＊０１アリルを示す。ホモＣ１７９ノックインアリルを持つマウス由来のＢ細胞をこの実験に用いた。２つの独立した実験の１つが示されている。他の実験のデータを図１２に示す。
【図4】末梢血Ｂ細胞の頻度とＣＤ２１の発現。異なるＲａｇ－１遺伝子型の６～１０週齢のＣ１７９ＢＣＲマウス（Ａ）またはＣ１７９生殖系列ＢＣＲマウス（Ｂ）の末梢血におけるＢ細胞（ＣＤ３‐Ｂ２２０＋）の頻度を示した。細胞表面のＣＤ２１発現は、代表的なデータ（左）としてヒストグラム、要約データとして幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）を有する棒グラフ（右）で示されている。平均値とＳＥＭをそれぞ棒とエラーバーで示す。各ドットは個々のマウスのデータを示す。一方向ＡＮＯＶＡを実施した。ｐ値はＴｕｋｅｙの多重比較検定の結果による。
【図5】免れた中和抗体のレパートリー。（Ａ）ＰＲ８およびＨ２ ＨＡの両方に結合するナイーブ成熟Ｂ細胞（ＩｇＭ＋ＩｇＤ＋Ｂ２２０＋）を単一細胞ソーティングし、それらのＩｇ遺伝子の配列を決定した。ＩＧＫＶ１２－４６＊０１の使用割合は円グラフに示す。この円グラフに用いた２つの独立した実験を図１３に示す。解析した配列の数は円グラフの中心に示した。黒色および濃いグレーは、それぞれ元の導入遺伝子およびＩＧＫＶ１２－４６＊０１アリルを示す。Ｉｇκにおける薄いグレーは他のアリルを示す。ＩＧＫＶ１２－４６＊０１（濃いグレー）は、Ｃ１７９ ＩＧＫＶ１２－９８＊０１導入遺伝子（黒色）と８２．４％のヌクレオチド同一性を示す。組換え抗体は、Ｂ１１と命名されたＰＲ８＋Ｈ２＋Ｂ細胞クローンの一つから作製した。各種ＨＡタンパク質に対するＢ１１抗体の親和性を（Ｂ）に示す。ＰＲ８およびＨ２ウイルスに対する中和活性を（Ｃ）に示す。
【図6】自己抗原タンパク質アレイ分析。一連の抗体、Ｃ１７９、Ｃ１７９生殖系列、Ｂ１１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ２９、およびＭ２１３９をアレイ分析に供した。各自己抗原のＮＦＩの標準偏差指数（ＳＤＩ）を計算した。（Ａ）ＳＤＩ値がヒートマップで表される。（Ｂ）ＳＤＩ＞１．２の抗体ごとに陽性となる自己抗原の数。（Ｃ）ＳＤＩ＞１．８の各自己抗原に対する全抗体の総ＮＦＩ値の割合で示した上位の自己抗原の一覧。３未満の各自己抗原に対するすべてのＳＮＲ値は、非特異的結合と考えられる。
【図7】ＢＣＲマウス系統のスキーム図。（ａ）重鎖遺伝子座に関する遺伝子断片がノックインされ、軽鎖遺伝子座に関する遺伝子断片がランダムに挿入された。（ｂ）重鎖遺伝子断片に関するＧａｔｅｗａｙ－ｂａｓｅｄ標的ベクターが示されている。クローニング後に、６５２ｂｐの上流と３６３ｂｐの下流の領域を含むＶＤＪ断片がｐＥＮＴＲベクターに挿入された。ＦＲＴ部位の近傍にＮｅｏおよびジフテリアトキシン（ＤＴＡ）遺伝子を含むＩｇｈノックインＧａｔｅｗａｙ発現ベクターがｐＤＥＳＴTMＶＨを用いたＬＲ反応により生み出され、次の工程に用いられた。（ｃ）Ｃ１７９ハイブリドーマ由来の６８４９ｂｐのゲノムＤＮＡ断片がｐＧＥＭバックボーンのＩｇκベクターにクローニングされた。Ｃ１７９の図はプロトタイプとして示されている。同じ一般的手法が他のＢＣＲマウス系統に用いられた。
【図8】Ｃ１７９とＣ１７９生殖系列のアミノ酸配列の比較。Ｃ１７９とＣ１７９生殖系列の重鎖可変領域（図８ａ）および軽鎖可変領域（図８ｂ）のアミノ酸配列のアラインメント。インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質と相互作用する重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を丸印で示した12。Ｘは、置換を伴うアミノ酸の位置を示す。四角は、ＣＤＲを示す。
【図9】単一Ｂ細胞のソーティング戦略。ＢＣＲマウス系統由来の脾細胞をＲＢＣで溶解し、後述する抗体で染色した。７ＡＡＤ－Ｄｕｍｐ－Ｂ２２０＋ＩｇＤ＋ＩｇＭ＋の単一細胞がソートされた。用いられたＤｕｍｐ染色抗体は、ＣＤ５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４２、ＣＤ１３８、Ｔｈｙ１．２、ＴＥＲ１１９、Ｆ４／８０、Ｇｒ－１であった。
【図10】Ｃ１７９、Ｃ１７９生殖系列およびＢ１１の軽鎖配列の比較。（ａ）Ｂ１１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と、その生殖系列の対応物とのアラインメント。（ｂ）Ｃ１７９、Ｃ１７９生殖系列、およびＢ１１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列のアラインメント。インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質と相互作用する重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を丸印で示した12。Ｘは、置換を伴うアミノ酸の位置を示す。四角は、ＣＤＲを示す。（ｂ）において、ＨＡ２ドメインと相互作用するＣ１７９のＣＤＲ１におけるＴ３１Ｗ３２がＢ１１においてはＳ３１Ｎ３２で置き換えられている。
【図11】Ｃ１７９、Ｃ１７９生殖系列およびＮＳＰ２ Ｂ細胞の単一細胞Ｉｇレパートリー解析。図２におけるのと同様の実験の結果が示されている。図２においても示されたように、ＮＳＰ２ Ｂ細胞は、元々のペアであった重鎖と軽鎖の遺伝子を発現している。しかし、Ｃ１７９とＣ１７９生殖系列のＢ細胞は、元々のペアであった重鎖と軽鎖の遺伝子を発現しない。Ｉｇｈ、Ｉｇκ、およびＩｇｈ－Ｉｇκにおける導入遺伝子の使用頻度は、円グラフで示されている。分析された配列の数が円グラフの中心に示されている。黒と薄いグレーはそれぞれ、導入遺伝子アリルおよび非導入遺伝にアリルを示す。
【図12】Ｃ１７９Ｒａｇ１欠損Ｂ細胞の単一細胞Ｉｇレパートリー解析。図３においても示されたように、Ｒａｇ１が十分なＣ１７９ Ｂ細胞とは異なり、Ｒａｇ１欠損Ｃ１７９ Ｂ細胞は、元々のペアであった重鎖と軽鎖の遺伝子を発現する。Ｉｇｈ、Ｉｇκ、およびＩｇｈ－Ｉｇκにおける導入遺伝子の使用頻度は、円グラフで示されている。分析された配列の数が円グラフの中心に示されている。黒と薄いグレーはそれぞれ、導入遺伝子アリルおよび非導入遺伝にアリルを示す。Ｉｇκにおける濃いグレーは、ＩＧＫＶ１２－４６＊０１アリルを示す。ホモのＣ１７９ノックインアリルを有するマウス由来のＢ細胞が本実験では用いられた。
【図13】ＰＲ８＋Ｈ２＋のナイーブＢ細胞におけるＩＧＫＶ１２－４６の使用。２回の独立した実験の結果が示されている。Ｉｇｈ、Ｉｇκ、およびＩｇｈ－Ｉｇκにおける導入遺伝子の使用頻度は、円グラフで示されている。元々のペアであった重鎖と軽鎖の遺伝子が黒で示されており、ＩＧＫＶ１２－４６遺伝子が濃いグレーで示されており、その他が薄いグレーで示されている。分析された配列の数が円グラフの中心に示されている。
【発明の詳細な説明】
【0008】
本明細書では、「非ヒト哺乳動物」とは、ヒト以外の哺乳動物を意味し、霊長類、および非霊長類の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ネコ、イヌ）の動物を含む。
【0009】
本明細書では、「抗体」とは、免疫グロブリンを意味し、一対のジスルフィド結合で安定化された２本の重鎖（Ｈ鎖）と２本の軽鎖（Ｌ鎖）が会合した構造をとるタンパク質をいう。重鎖は、重鎖可変領域ＶＨ、重鎖定常領域ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ１とＣＨ２の間に位置するヒンジ領域からなり、軽鎖は、軽鎖可変領域ＶＬと軽鎖定常領域ＣＬとからなる。この中で、ＶＨとＶＬからなる可変領域断片（Ｆｖ）が、抗原結合に直接関与し、抗体に多様性を与える領域である。また、ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、ＣＨ１からなる抗原結合領域をＦａｂ領域と呼び、ヒンジ領域、ＣＨ２、ＣＨ３からなる領域をＦｃ領域と呼ぶ。
可変領域のうち、直接抗原と接触する領域は特に変化が大きく、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる。ＣＤＲ以外の比較的変異の少ない部分をフレームワーク（ＦＲ）と呼ぶ。軽鎖と重鎖の可変領域には、それぞれ３つのＣＤＲが存在し、それぞれＮ末端側から順に、重鎖ＣＤＲ１～３及び軽鎖ＣＤＲ１～３と呼ばれる。抗体の重鎖ＣＤＲ１～３及び軽鎖ＣＤＲ１～３は、例えば、Ｋａｂａｔの番号付けシステム（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ ｅｄ．， １９９１， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ）に基づいて決定され得る。
抗体は、非ヒト哺乳動物の抗体、ヒト化抗体、およびヒトキメラ抗体を含む。
可変領域のうち、直接抗原と接触する領域は特に変化が大きく、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる。ＣＤＲ以外の比較的変異の少ない部分をフレームワーク（ＦＲ）と呼ぶ。軽鎖と重鎖の可変領域には、それぞれ３つのＣＤＲが存在し、それぞれＮ末端側から順に、重鎖ＣＤＲ１～３及び軽鎖ＣＤＲ１～３と呼ばれる。抗体の重鎖ＣＤＲ１～３及び軽鎖ＣＤＲ１～３は、例えば、Ｋａｂａｔの番号付けシステム（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ ｅｄ．， １９９１， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ）に基づいて決定され得る。
抗体は、非ヒト哺乳動物の抗体、ヒト化抗体、およびヒトキメラ抗体を含む。
【0010】
本明細書では、「ヒト化抗体」とは、非ヒト由来の抗体に特徴的なアミノ酸配列で、ヒト抗体の対応する位置（具体的には６つのＣＤＲ）を置換した抗体を意味し、例えば、マウス又はラットを免疫して作製した抗体の重鎖ＣＤＲ１～３及び軽鎖ＣＤＲ１～３を有し、重鎖及び軽鎖のそれぞれ４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含むその他のすべての領域がヒト抗体に由来するものが挙げられる。かかる抗体は、ＣＤＲ移植抗体と呼ばれる場合もある。
本明細書では、「ヒトキメラ抗体」は、非ヒト由来の抗体において、非ヒト由来の抗体の定常領域がヒトの抗体の定常領域に置換されている抗体である。ヒトキメラ抗体では、ＡＤＣＣ活性を高める観点では、例えば、定常領域に用いるヒトの抗体のサブタイプはＩｇＧ１とすることができる。
本明細書では、「ヒトキメラ抗体」は、非ヒト由来の抗体において、非ヒト由来の抗体の定常領域がヒトの抗体の定常領域に置換されている抗体である。ヒトキメラ抗体では、ＡＤＣＣ活性を高める観点では、例えば、定常領域に用いるヒトの抗体のサブタイプはＩｇＧ１とすることができる。
【0011】
本明細書では、「抗原結合フラグメント」とは、抗体のフラグメントであって、抗原への結合性を維持したフラグメントをいう。具体的には、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１領域からなるＦａｂ；２つのＦａｂがヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結されているＦ（ａｂ’）２；ＶＬ及びＶＨからなるＦｖ；ＶＬ及びＶＨを人工のポリペプチドリンカーで連結した一本鎖抗体であるｓｃＦｖのほか、ｄｉａｂｏｄｙ型、ｓｃＤｂ型、ｔａｎｄｅｍ ｓｃＦｖ型、ロイシンジッパー型などの二重特異性抗体等が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書では、抗体は、抗原結合フラグメントであり得る。
【0012】
本明細書では、「抗原への結合性を損なわずに」とは、抗原への結合親和性が少なくとも部分的に維持されていること、または抗原への結合親和性を少なくとも部分的に有することを意味する。
【0013】
本明細書では、「特定抗原への結合親和性を少なくとも部分的に有する」とは、特定抗原への結合親和性を少なくとも部分的に又は完全に有することを意味する。「特定抗原への結合親和性を少なくとも部分的に有する」は、抗体が複数の抗原に親和性を有する場合には、すべての抗原への結合親和性が少なくとも部分的に維持されていること、または抗原の幾つかへの結合親和性を有することを意味する。本明細書では、「特定抗原」は、外来の侵入者の抗原であり得る。外来の侵入者としては、感染性の病原体（例えば、ウイルス、細菌、微生物、寄生生物等）が挙げられる。
【0014】
本明細書では、「非特異的な結合反応性」とは、抗体が目的の抗原以外の生体内の分子と反応する性質（非特異的に反応する性質）をいう。目的の抗原は、１つまたは複数である。
【0015】
本明細書では、「非特異的な結合反応性を低減する」は、抗体が反応する目的の抗原（複数の抗原であり得る）以外の分子の数を低減すること、および／または、抗体が反応する目的の抗原（複数の抗原であり得る）以外の分子の少なくとも一部への結合親和性を低下させることを意味する。本明細書では、「非特異的な結合反応性を低減する」は、目的の抗原以外に対する非特異的な反応性を低減させることにより、目的とする抗原（特定の抗原（複数の抗原であり得る））に対する特異性を向上させることであり得る。非特異的な結合反応性は、特に、抗体が、特定の抗原に加えて、生体内の他の抗原（例えば、自己抗原）にも反応性を有することを意味し得る。この場合、「非特異的な結合反応性を低減する」は、抗体が反応する生体内の他の抗原（例えば、自己抗原）の数を低減させること、および／または、抗体が反応する生体内の他の抗原（例えば、自己抗原）の少なくとも一部への結合親和性を低下させることを意味し得る。
【0016】
本明細書では、「自己抗原」とは、哺乳動物自身の体内に存在する抗原を意味する。体内に存在する抗原としては、例えば、核抗原、細胞質抗原、膜抗原、ＤＮＡおよびＲＮＡが上げられる。
【0017】
本明細書では、「Ｂ細胞」とは、抗体産生を担う免疫細胞である。Ｂ細胞は、造血幹細胞からプロＢ細胞、大型プレＢ細胞、および小型プレＢ細胞を経て、骨髄から脾臓に移動し、成熟Ｂ細胞になる。プロＢ細胞においては、重鎖（Ｈ鎖）の遺伝子再編成が起きる。完成したＨ鎖を含むｐｒｅ－ＢＣＲを形成して、大型プレＢ細胞となる。その後、軽鎖（Ｌ鎖）の遺伝子再編成が引き起こされ、小型プレＢ細胞へ分化する。完成した重鎖と軽鎖はＩｇＭとして細胞膜上に提示される。このＢ細胞は、骨髄から抹消へ移動して、脾臓、リンパ節において成熟する。Ｂ細胞は、形質細胞に最終分化して抗体を産生する。
【0018】
本明細書では、「ハイブリドーマ」とは、脾臓、リンパ節細胞とミエローマ細胞を公知の方法により融合させて得られるクローン化された細胞株を意味する。ハイブリドーマは、モノクローナル抗体を産生することができる。
【0019】
本明細書では、「モノクローナル抗体」とは、クローン化された単一の抗体産生細胞から得られる抗体を意味する。本明細書では、「抗体産生細胞」とは、抗体を産生する細胞であり、１種類の抗体を産生する。クローン化された抗体産生細胞は、単一の抗体（モノクローナル抗体）を産生しうる。抗体産生細胞としては、特に限定されないが例えば、ハイブリドーマや抗体遺伝子を発現可能に有するチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などが挙げられる。
【0020】
本発明によれば、特定の抗原に結合すると共に非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体から、当該特定の抗原への結合親和性を少なくとも部分的に有し、かつ、低減された非特異的な結合反応性を有するモノクローナル抗体を得る方法が提供される。
本発明は、前記非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体の軽鎖をコードする遺伝子を有する細胞であって、前記非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体の重鎖をコードする遺伝子によってＩｇｈ遺伝子座が置き換えられた細胞を非ヒト哺乳動物に移植して生着させ、移植した細胞中で軽鎖の遺伝子再構成を引き起こすことを含む方法である。本発明の方法は、移植した細胞中で軽鎖の遺伝子再構成を引き起こすことにより、例えば、生体内の分子に対して反応性を有する抗体を産生する細胞はその発生段階において除去されるのに対して、生体内の分子に対して反応性を有しないか、低い反応性を有する抗体を産生する細胞は生き残り、結果として、生体内の分子の分子に対して低い反応性を有する抗体を産生する細胞が得られることとなる。
本発明は、前記非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体の軽鎖をコードする遺伝子を有する細胞であって、前記非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体の重鎖をコードする遺伝子によってＩｇｈ遺伝子座が置き換えられた細胞を非ヒト哺乳動物に移植して生着させ、移植した細胞中で軽鎖の遺伝子再構成を引き起こすことを含む方法である。本発明の方法は、移植した細胞中で軽鎖の遺伝子再構成を引き起こすことにより、例えば、生体内の分子に対して反応性を有する抗体を産生する細胞はその発生段階において除去されるのに対して、生体内の分子に対して反応性を有しないか、低い反応性を有する抗体を産生する細胞は生き残り、結果として、生体内の分子の分子に対して低い反応性を有する抗体を産生する細胞が得られることとなる。
【0021】
ここで、前記非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体の軽鎖をコードする遺伝子を有する細胞とは、細胞の軽鎖遺伝子は少なくとも一対立遺伝子は破壊または置換されておらず、機能的であるが、追加的に前記非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体の軽鎖をコードする遺伝子を有する細胞を意味する。また、前記非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体の重鎖をコードする遺伝子によってＩｇｈ遺伝子座が置き換えられた細胞とは、抗体重鎖をコードする遺伝子座（Ｉｇｈ遺伝子座）が、前記非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体の重鎖をコードする遺伝子によって置き換えられた細胞であり、元来のＩｇｈ遺伝子座の代わりに前記非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体の重鎖をコードする遺伝子を有する細胞を意味する。前記細胞は、生後の非ヒト哺乳動物に移植される場合には、造血幹細胞から大型プレＢ細胞までの分化系列のいずれかの細胞であり得、例えば、造血幹細胞、リンパ系幹細胞、プロＢ細胞、および大型プレＢ細胞から選択される細胞であり得る。これらの細胞は、大型プレＢ細胞から小型プレＢ細胞に分化する過程において軽鎖の遺伝子再構成が行われ、抗原特異性が部分的に修正されるためである。当業者であれば、造血幹細胞移植などの血液細胞の移植に関する公知の方法に従って、細胞を非ヒト哺乳動物に移植し、生着させることができる。前記細胞は、非ヒト哺乳動物の胚（例えば、胚盤胞、桑実胚等）に移植される場合には、多能性細胞（例えば、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞）であり得る。
【0022】
また、本発明において、細胞を移植される非ヒト哺乳動物は、造血幹細胞から大型プレＢ細胞までの分化系列のいずれかの細胞が移植される場合には、免疫不全の非ヒト哺乳動物（例えば、Ｔ細胞を欠損した動物（例えば、ヌードマウス）、Ｔ細胞およびＢ細胞の２系統を欠失した動物（例えば、ＳＣＩＤマウス）、補体活性が減衰され、マクロファージが機能不全である動物（例えば、ＮＯＤマウス）、ＮＫ細胞の欠損および樹状細胞の機能不全を有する動物（例えば、ＩＬ－２ｒγノックアウト動物（例えば、ＩＬ－２ｒγノックアウトマウス））であり得る。免疫不全の非ヒト哺乳動物には、造血幹細胞などの幹細胞や免疫性棒が生着させることができる。本発明において、細胞を移植される非ヒト哺乳動物は、Ｒａｇ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔであり、すなわち、機能的なＲａｇ１およびＲａｇ２をコードする遺伝子のいずれかまたは両方を有する。
【0023】
本発明において、軽鎖の遺伝子再構成は、大型プレＢ細胞から小型プレＢ細胞に分化する過程においてなされる。従って、大型プレＢ細胞またはそれ以前の発生段階のＢ細胞系列の細胞を免疫不全の非ヒト哺乳動物に移植することによって、生着した細胞において、軽鎖の遺伝子再構成が引き起こされる。移植は、非ヒト哺乳動物の骨髄に対してなされ得る。Ｂ細胞系列の細胞とは、造血幹細胞から大型プレＢ細胞までの分化系列のいずれかの細胞であり得、例えば、造血幹細胞、リンパ系幹細胞、プロＢ細胞、および大型プレＢ細胞から選択される細胞であり得る。上述のように免疫不全の非ヒト哺乳動物の胚に多能性細胞を移植することによっても、造血系を当該多能性細胞によって再構築することができることが知られており、この方法によっても、多能性細胞を生着させ、然るべき発生段階において軽鎖の遺伝子再構成が引き起こされる。
【0024】
非ヒト哺乳動物からハイブリドーマを調製することは、当業者に周知の方法によって達成され得る。具体的には、当業者であれば、周知の方法により、非ヒト哺乳動物の脾細胞およびリンパ節から得られた細胞を得て、脾細胞または、リンパ節から得られた細胞とミエローマとを細胞融合させることによって、ハイブリドーマを得ることができる。ハイブリドーマは、限外希釈によりクローン化することができる。バイブリドーマは、ハイブリドーマの培養に適した条件下で培養される。ハイブリドーマの培養に適した条件は当業者に周知である。
【0025】
特定の抗原に対する結合親和性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することは、当業者に周知の方法によって達成され得る。具体的には、当該特定の抗原をプレートに固相化し、当該抗原に対する抗体の結合を検出することによって、当該抗原に対する結合親和性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。特定の抗原が複数である場合には、残りの抗原に対しても結合親和性を有するか否かを試験することができる。
【0026】
ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体の重鎖ＣＤＲ１～３と軽鎖ＣＤＲ１～３とを有する抗体を発現する組換え抗体産生細胞株を得ることは、特定の抗原に対する結合親和性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの産生するｍＲＮＡから当業者に周知の方法でｃＤＮＡを合成し、当該ｃＤＮＡの配列を決定することによりなされ得る。抗体をコードする遺伝子の配列から抗体のアミノ酸配列を推定することができ、抗体のアミノ酸配列から、例えば、Ｋａｂａｔの番号付けシステム（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ ｅｄ．， １９９１， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ）に基づいて重鎖ＣＤＲ１～３および軽鎖ＣＤＲ１～３を決定することができる。
【0027】
非ヒト哺乳動物から抗原に特異的に結合する単一Ｂ細胞をその結合特性に基づいて選別し（例えば、前記抗原に結合する抗体を産生するナイーブ成熟Ｂ細胞を単一細胞ソーティングすることによって選別し）、得られた単一Ｂ細胞の抗体から抗体の重鎖ＣＤＲ１～３と軽鎖ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を取得し、当該重鎖ＣＤＲ１～３と軽鎖ＣＤＲ１～３とを有する抗体を発現する組換え抗体産生細胞株を得ることは、当業者に周知の方法によって達成され得る。具体的には、当業者であれば、周知の方法により、非ヒト哺乳動物のリンパ球を得て、Ｂ細胞を一細胞ずつ単離し、ｍＲＮＡから当業者に周知の方法でｃＤＮＡを合成し、当該ｃＤＮＡの配列を決定することによりなされ得る。抗体をコードする遺伝子の配列から抗体のアミノ酸配列を推定することができ、抗体のアミノ酸配列から、例えば、Ｋａｂａｔの番号付けシステム（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ ｅｄ．， １９９１， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ）に基づいて重鎖ＣＤＲ１～３および軽鎖ＣＤＲ１～３を決定することができる。
【0028】
得られた抗体の重鎖ＣＤＲ１～３および軽鎖ＣＤＲ１～３を有する抗体は、得られた抗体と同様の結合特性を有し得る。得られた抗体が、非ヒト哺乳動物抗体である場合には、重鎖ＣＤＲ１～３および軽鎖ＣＤＲ１～３を用いてヒト化抗体を作製することができる。得られた抗体が、非ヒト哺乳動物抗体である場合には、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を用いてヒトキメラ抗体を作製することができる。抗体産生細胞に、上記抗体をコードする遺伝子を発現可能に導入して、抗体を産生する組換え抗体産生細胞を作製することができる。抗体産生細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）がよく用いられている。その他、抗体産生細胞としては、例えば、Ｓｐ２／０およびＮＳ０細胞などのマウス骨髄腫細胞を用いることもできる。また、Ｆｃ領域を持たない低分子抗体は、大腸菌を抗体産生細胞として用いることができる。また、場合によっては、得られたハイブリドーマがそのまま抗体産生細胞として用いられることがある。抗体は、抗体産生細胞の培養上清中に分泌される。分泌された抗体は、例えば、プロテインＡをリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーで精製することができる。精製された抗体は、さらなるクロマトグラフィーによってさらに精製されてもよく、抗体医薬品の原薬を調製し得る。このようにして、本発明では、単離されたモノクローナル抗体または精製されたモノクローナル抗体が得られる。本発明によれば、単離されたモノクローナル抗体を含む、医薬組成物が提供され得る。医薬組成物は、医薬上許容可能な賦形剤をさらに含んでいてもよい。
【0029】
前記特定の抗原は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）であり得る。前記特定の抗原は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのステム領域であり得る。またある態様では、前記特定の抗原は、インフルエンザウイルスのＨＡ分子のステム領域のＨｉｓ３８， Ｌｙｓ４０， Ｉｌｅ４２， Ｔｈｒ２９１， Ｌｅｕ２９２， Ｐｒｏ２９３， Ｔｈｒ３１８（ＨＡ１）とＶａｌ１８，Ａｓｐ１９， Ｇｌｙ２０， Ｔｒｐ２１， Ｌｙｓ３８， Ｔｈｒ４１， Ｇｌｎ４２， Ｐｈｅ４５， Ｖａｌ５２，および Ｉｌｅ５６（ＨＡ２）であり得る。
【0030】
Ｃ１７９抗体は、インフルエンザＡ型（Ｈ２Ｎ２）のＡ／Ｏｋｕｄａ／５７株で免疫したマウスの脾臓細胞とマウスミエローマＰ３Ｕ１とのハイブリドーマ（大阪府立公衆衛生研究所の奥野良信氏らにより樹立された）に由来するモノクローナル抗体である。Ｃ１７９抗体は、ＨＡ分子のステム領域のＴＧＬＲＮ（ＨＡ１の３１８～３２２）とＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫ（ＨＡ２の４７～５８）であり、ウイルス間で高度に保存された領域である。Ｃ１７９抗体を産生するハイブリドーマは、ＦＥＲＭ ＢＰ－４５１７により寄託されており、Ｃ１７９抗体は、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏなどから市販されている。
【0031】
本発明により得られる抗体は、Ｃ１７９抗体とは異なるアミノ酸配列を有し、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのステム領域において、Ｃ１７９抗体と重なるエピトープに結合する抗体であり得る。本発明により得られる抗体はまた、Ｃ１７９抗体とは異なるアミノ酸配列を有し、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのステム領域への結合に関して、Ｃ１７９抗体と競合する抗体であり得る。本発明により得られる抗体はまた、Ｃ１７９抗体とは異なるアミノ酸配列を有し、インフルエンザウイルスのＨＡ分子のステム領域のＨｉｓ３８， Ｔｈｒ３１８（ＨＡ１）とＶａｌ１８，Ａｓｐ１９， Ｇｌｙ２０， Ｔｒｐ２１， Ｌｙｓ３８， Ｔｈｒ４１， Ｇｌｎ４２，および Ｐｈｅ４５（ＨＡ２）に結合する抗体であり得る。
【0032】
本発明では、非特異的な結合反応性を示すモノクローナル抗体は、自己抗原反応性の抗体であり得る。Ｃ１７９抗体は、自己抗原反応性である。従って、本発明の方法は、非特異的な結合反応性を示す抗体は、Ｃ１７９抗体であり得る。
【0033】
本発明の方法では、前記非ヒト哺乳動物が、Ｈ３株のヘマグルチニンまたはＨ３株のヘッドレスヘマグルチニンで免疫された前記非ヒト哺乳動物であり得る。これにより、インフルエンザウイルスのＨ３株に対して親和性を有する抗体をより効果的に得られ得る。
【0034】
本発明の別の側面では、インフルエンザウイルスのＨＡのいずれかに結合する抗体であって、
（１）配列番号１４０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを有する抗体；
（２）配列番号１３８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１３９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを有する抗体；および
（３）上記（２）に記載の抗体と当該ＨＡ（抗体が結合するＨＡ、例えば、ＨＡ１、ＨＡ２、および／またはＨＡ３）との結合に関して競合する抗体
が提供される。本発明の抗体は、インフルエンザウイルスのＨＡのステム領域に結合し得る。本発明の抗体は、インフルエンザウイルスのＨＡのステム領域のＨｉｓ３８， Ｔｈｒ３１８（ＨＡ１）とＶａｌ１８，Ａｓｐ１９， Ｇｌｙ２０， Ｔｒｐ２１， Ｌｙｓ３８， Ｔｈｒ４１， Ｇｌｎ４２，および Ｐｈｅ４５（ＨＡ２）に結合する抗体であり得る。
（１）配列番号１４０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを有する抗体；
（２）配列番号１３８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１３９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを有する抗体；および
（３）上記（２）に記載の抗体と当該ＨＡ（抗体が結合するＨＡ、例えば、ＨＡ１、ＨＡ２、および／またはＨＡ３）との結合に関して競合する抗体
が提供される。本発明の抗体は、インフルエンザウイルスのＨＡのステム領域に結合し得る。本発明の抗体は、インフルエンザウイルスのＨＡのステム領域のＨｉｓ３８， Ｔｈｒ３１８（ＨＡ１）とＶａｌ１８，Ａｓｐ１９， Ｇｌｙ２０， Ｔｒｐ２１， Ｌｙｓ３８， Ｔｈｒ４１， Ｇｌｎ４２，および Ｐｈｅ４５（ＨＡ２）に結合する抗体であり得る。
【0035】
本発明によれば、前記インフルエンザウイルスのＨＡに結合する抗体を含む医薬組成物が提供され得る。医薬組成物は、医薬上許容可能な賦形剤をさらに含んでいてもよい。
【0036】
医薬上許容可能な賦形剤としては、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、界面活性剤等が挙げられるがこれらに限定されない。当業者であれば、適宜医薬組成物を調製することができる。
【0037】
本発明の医薬組成物は、様々な形態、例えば、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤などとすることができる。好ましい態様は、注射剤であり、非経口（例えば、静脈内、経皮、腹腔内、筋内）で投与することが好ましい。
【実施例】
【0038】
［材料と方法］
（１）マウス
Ｃ１７９、Ｃ１７９生殖系列、ＮＳＰ２およびＮＳＰ２９ ＢＣＲマウス系統を以下のように作成した。前に記載したＶＨ１８６．２－ＤＦＬ１６．１－ＪＨ２配列を含むターゲティングベクター44に基づき、ａｔｔＲに隣接するＧａｔｅｗａｙTMｃｃｄＢカセットを挿入し、Ｉｇｈノックインゲートウェイ デシグネーション ベクター（ｐＤＥＳＴTMＶＨ）を確立した。次いで、ハイブリドーマ細胞株Ｃ１７９、ＮＳＰ２、およびＮＳＰ２９からの再編成した重鎖遺伝子を含む約１．５ｋｂｐ長のＩｇｈゲノムＤＮＡ断片を、ｐＥＮＴＲ、ｐＣＲ（商標）８／ＧＷ／ＴＯＰＯ（商標）ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローン化した。配列決定検証およびＬＲ組換え反応の後、Ｉｇｈノックインゲートウェイ発現ベクターをＣ５７ＢＬ／６ Ｊ／Ｎ Ｆ１ ＥＳ細胞にトランスフェクトした。ジェネティシン選択後、標的ＥＳクローンを選択し、ＰＣＲにより検証した。軽鎖をつくるにはトランスジェニックマウス系統を用い、高橋博士からの贈答物であるκ軽鎖トランスジーンｐＧＥＭ－バックボーンベクターを用いた。本ベクターは、Ｖκリーダー配列の５’上流５ｋｂｐ、リーダー－Ｖκ－Ｊκゲノム配列及び３’Ｅκを含む３’下流フランキング配列からなる約２０ｋｂｐ長のゲノムＤＮＡ断片を含有した。ハイブリドーマ細胞株、Ｃ１７９，ＮＳＰ２，ＮＳＰ２９から５’上流及びリーダー－Ｖκ－Ｊκゲノム配列の５ｋｂｐのゲノムＤＮＡ断片をクローニングし、それらをベクター中の対応する配列と置換するために使用した。Ｃ１７９生殖系列ＢＣＲマウス系統をさらに作製するために、ｐＥＮＴＲ Ｃ１７９またはｐＧＥＭ－Ｃ１７９κ軽鎖トランスジーンベクターのＣ１７９ＤＮＡ配列を部位特異的突然変異誘発（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）により生殖細胞系列配列に変換した。この構築物とその戦略は図７に示してあり、Ｈｙ１０ ＢＣＲマウス株はＤｒ． Ｊ．Ｇ Ｃｙｓｔｅｒ13により提供された。Ｒａｇ１ ＫＯ（Ｂ６．１２９Ｓ７－Ｒａｇ１tm1Mom／Ｊ ＳＴＯＣＫ＃００２２１６）マウスをＪＡＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウスは日本クレア（株）から購入した。すべての動物実験は、理化学研究所ＩＭＳの動物実験計画書によって行われた。
（１）マウス
Ｃ１７９、Ｃ１７９生殖系列、ＮＳＰ２およびＮＳＰ２９ ＢＣＲマウス系統を以下のように作成した。前に記載したＶＨ１８６．２－ＤＦＬ１６．１－ＪＨ２配列を含むターゲティングベクター44に基づき、ａｔｔＲに隣接するＧａｔｅｗａｙTMｃｃｄＢカセットを挿入し、Ｉｇｈノックインゲートウェイ デシグネーション ベクター（ｐＤＥＳＴTMＶＨ）を確立した。次いで、ハイブリドーマ細胞株Ｃ１７９、ＮＳＰ２、およびＮＳＰ２９からの再編成した重鎖遺伝子を含む約１．５ｋｂｐ長のＩｇｈゲノムＤＮＡ断片を、ｐＥＮＴＲ、ｐＣＲ（商標）８／ＧＷ／ＴＯＰＯ（商標）ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローン化した。配列決定検証およびＬＲ組換え反応の後、Ｉｇｈノックインゲートウェイ発現ベクターをＣ５７ＢＬ／６ Ｊ／Ｎ Ｆ１ ＥＳ細胞にトランスフェクトした。ジェネティシン選択後、標的ＥＳクローンを選択し、ＰＣＲにより検証した。軽鎖をつくるにはトランスジェニックマウス系統を用い、高橋博士からの贈答物であるκ軽鎖トランスジーンｐＧＥＭ－バックボーンベクターを用いた。本ベクターは、Ｖκリーダー配列の５’上流５ｋｂｐ、リーダー－Ｖκ－Ｊκゲノム配列及び３’Ｅκを含む３’下流フランキング配列からなる約２０ｋｂｐ長のゲノムＤＮＡ断片を含有した。ハイブリドーマ細胞株、Ｃ１７９，ＮＳＰ２，ＮＳＰ２９から５’上流及びリーダー－Ｖκ－Ｊκゲノム配列の５ｋｂｐのゲノムＤＮＡ断片をクローニングし、それらをベクター中の対応する配列と置換するために使用した。Ｃ１７９生殖系列ＢＣＲマウス系統をさらに作製するために、ｐＥＮＴＲ Ｃ１７９またはｐＧＥＭ－Ｃ１７９κ軽鎖トランスジーンベクターのＣ１７９ＤＮＡ配列を部位特異的突然変異誘発（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）により生殖細胞系列配列に変換した。この構築物とその戦略は図７に示してあり、Ｈｙ１０ ＢＣＲマウス株はＤｒ． Ｊ．Ｇ Ｃｙｓｔｅｒ13により提供された。Ｒａｇ１ ＫＯ（Ｂ６．１２９Ｓ７－Ｒａｇ１tm1Mom／Ｊ ＳＴＯＣＫ＃００２２１６）マウスをＪＡＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウスは日本クレア（株）から購入した。すべての動物実験は、理化学研究所ＩＭＳの動物実験計画書によって行われた。
【0039】
（２）細胞
Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を、加湿５％ＣＯ2インキュベーター中で３７℃で１０％ウシ胎児血清を含むイーグル最小必須培地中に維持した。発現２９３細胞を、加湿５％ＣＯ2インキュベーター中で３７℃でＥｘｐｉ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に維持した。
Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を、加湿５％ＣＯ2インキュベーター中で３７℃で１０％ウシ胎児血清を含むイーグル最小必須培地中に維持した。発現２９３細胞を、加湿５％ＣＯ2インキュベーター中で３７℃でＥｘｐｉ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に維持した。
【0040】
（３）ウイルス
Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４、ＰＲ８と命名）とＨ２Ｎ２（Ａ／Ｏｋｕｄａ／１９５７）を用い、ＭＤＣＫ細胞内でウイルスを増殖させた。
Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４、ＰＲ８と命名）とＨ２Ｎ２（Ａ／Ｏｋｕｄａ／１９５７）を用い、ＭＤＣＫ細胞内でウイルスを増殖させた。
【0041】
（４）微量中和法
以前に記載された迅速焦点減少中和試験45を改変した。簡単に述べると、感染前日に２×１０4細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種し、Ｄ－ＭＥＭで洗浄し、１００ＴＣＩＤ50／ウェルのウイルスで１時間感染させた。ウイルス感染培地の除去後、細胞を洗浄し、０．５％トラガカントガム（Ｗａｋｏ）および１μｇ／ｍＬ Ｌ－（トシルアミド－２－フェニル）エチルクロロメチルケトン処理トリプシンを含有するＤ－ＭＥＭで覆った。ＰＲ８については２０～２４時間、Ｈ２Ｎ２については４０～４５時間後、細胞を固定し、ＥＬＩＳＡに供する。細胞を０．３％ Ｔｗｅｅｎ－２０ ＰＢＳ洗浄バッファーで洗浄し、洗浄バッファーを含む５％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ， Ｉｎｃ．）中の抗ＮＰ抗体（Ｃ４３、Ｄｒ． Ｙ． Ｏｋｕｎｏからの贈答物）で染色した。抗体溶液を除去し、洗浄した後、細胞をＨＲＰ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ２ａ抗体（Ｂｅｔｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共にインキュベートし、洗浄し、ＴＭＢ比色アッセイを行った。すべての洗浄工程は、４０５ＴＳ洗浄機（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて実施した。
以前に記載された迅速焦点減少中和試験45を改変した。簡単に述べると、感染前日に２×１０4細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種し、Ｄ－ＭＥＭで洗浄し、１００ＴＣＩＤ50／ウェルのウイルスで１時間感染させた。ウイルス感染培地の除去後、細胞を洗浄し、０．５％トラガカントガム（Ｗａｋｏ）および１μｇ／ｍＬ Ｌ－（トシルアミド－２－フェニル）エチルクロロメチルケトン処理トリプシンを含有するＤ－ＭＥＭで覆った。ＰＲ８については２０～２４時間、Ｈ２Ｎ２については４０～４５時間後、細胞を固定し、ＥＬＩＳＡに供する。細胞を０．３％ Ｔｗｅｅｎ－２０ ＰＢＳ洗浄バッファーで洗浄し、洗浄バッファーを含む５％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ， Ｉｎｃ．）中の抗ＮＰ抗体（Ｃ４３、Ｄｒ． Ｙ． Ｏｋｕｎｏからの贈答物）で染色した。抗体溶液を除去し、洗浄した後、細胞をＨＲＰ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ２ａ抗体（Ｂｅｔｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共にインキュベートし、洗浄し、ＴＭＢ比色アッセイを行った。すべての洗浄工程は、４０５ＴＳ洗浄機（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて実施した。
【0042】
（５）フローサイトメトリー
脾細胞または末梢リンパ球の赤血球溶解単一細胞懸濁液を、マウスＢＤ Ｆｃ ＢｌｏｃｋTM抗ＣＤ１６／ＣＤ３２（ＢＤからの２．４Ｇ２）で染色し、その後、以下のような種々の抗体で染色した：Ｂ２２０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄからのクローンＲＡ３－６Ｂ２、ＦＩＴＣ、ＰＥ－Ｃｙ７、ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ、Ｂｖ５１０）、Ｔｈｙ１．２（ＢＤからのクローン３６Ｈ１２、ＰＥ）、ＣＤ３ｅ（クローン１４５－２Ｃ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄからのＦＩＴＣ）、ＩｇＭｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄからのクローンＡＦ６－７８、ＰＥ）、ＩｇＭ（ＡｌｅｘａからのクローンＩＩ／４１、ＦＩＴＣおよびＰＥ－Ｃ７クローン）、ＢＤからのＢＲ１１ＢＤクローン（クローン、ＢＴＣ１１ＤおよびＢ１８７からのＢＴＣ１１ＢＲ、ＢＴＣ１１ＢＲ、ＢＴＣ１１７、ＢＴＣクローン、Ｂ６およびＢＰＥ。死細胞は７‐アミノアクチノマイシンＤ（７‐ＡＡＤ）で染色し、除外した。染色された細胞は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏTMＩＩ（ＢＤバイオサイエンス）を用いて分析するか、ＦＡＣＳＡｒｉａTMシリーズによって分類した（ＢＤバイオサイエンス）。データはＦｌｏｗＪｏTMソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ， ＬＬＣ）を用いて分析した。
脾細胞または末梢リンパ球の赤血球溶解単一細胞懸濁液を、マウスＢＤ Ｆｃ ＢｌｏｃｋTM抗ＣＤ１６／ＣＤ３２（ＢＤからの２．４Ｇ２）で染色し、その後、以下のような種々の抗体で染色した：Ｂ２２０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄからのクローンＲＡ３－６Ｂ２、ＦＩＴＣ、ＰＥ－Ｃｙ７、ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ、Ｂｖ５１０）、Ｔｈｙ１．２（ＢＤからのクローン３６Ｈ１２、ＰＥ）、ＣＤ３ｅ（クローン１４５－２Ｃ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄからのＦＩＴＣ）、ＩｇＭｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄからのクローンＡＦ６－７８、ＰＥ）、ＩｇＭ（ＡｌｅｘａからのクローンＩＩ／４１、ＦＩＴＣおよびＰＥ－Ｃ７クローン）、ＢＤからのＢＲ１１ＢＤクローン（クローン、ＢＴＣ１１ＤおよびＢ１８７からのＢＴＣ１１ＢＲ、ＢＴＣ１１ＢＲ、ＢＴＣ１１７、ＢＴＣクローン、Ｂ６およびＢＰＥ。死細胞は７‐アミノアクチノマイシンＤ（７‐ＡＡＤ）で染色し、除外した。染色された細胞は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏTMＩＩ（ＢＤバイオサイエンス）を用いて分析するか、ＦＡＣＳＡｒｉａTMシリーズによって分類した（ＢＤバイオサイエンス）。データはＦｌｏｗＪｏTMソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ， ＬＬＣ）を用いて分析した。
【0043】
（６）単一Ｂ細胞Ｉｇレパートリーの配列決定と分析
単一細胞を、４μＬ／ウェルの溶解バッファー（２Ｕ／μＬ ＲＮＡＳｉｎ、０．５ｘ ＰＢＳ、１０ｍＭ ＤＴＴ）および１μＬの１２μＭ ３’＿ＳＭＡＲＴ＿ｄＴに滴下した。細胞溶解物を７２℃で３分間インキュベートし、次いで氷上に２分間置いた。第１ストランドｃＤＮＡ合成のために、細胞溶解物に５μＬのＲＴ混合液（２ｘＦｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ、５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ、２．５μＭ ＳＭＡＲＴ ５’ＲＡＣＥ オリゴヌクレオチド、１０Ｕ ＲＮａｓｉｎ、１００Ｕ ＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅTM逆転写酵素）を加え、４２℃で９０分、７０℃で１０分インキュベートし、その後、４℃で保持した。ＳＭＡＲＴ １ｓｔプライマーセットによるｃＤＮＡ増幅では、２５μＬの第１増幅混合物（１×Ｋａｐａ ＨｉＦｉ ｈｏｔｓｔａｒｔｅｒ Ｒｅａｄｙ－ｍｉｘ、１×ＵＰＭ、３００ｎＭ Ｏｕｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒ、２μＬの第１ストランドｃＤＮＡ、６．２５μＬのヌクレアーゼフリーＨ2Ｏ）を調製し、９５℃で３分間インキュベートし、その後、９８℃で２０秒間、６０℃で１５秒間、および７２℃で１５秒間の３５サイクルに供し、その後、７２℃で１分間インキュベートしてから冷却した。Ｉｇ特異的２ｎｄプライマーセットによるｃＤＮＡ増幅のために、２０μＬの第２増幅混合物（１ｘＫＯＤ ＦＸ ｎｅｏバッファー、４００μＭ ｄＮＴＰ、５００ｎＭ ５’マトリックスプライマーミックス、５００ｎＭ ３’マトリックスプライマーミックス、２μＬの第１ｃＤＮＡ増幅産物、０．５Ｕ ＫＯＤ ＦＸ ｎｅｏ ポリメラーゼ）を調製し、９４℃で２分間インキュベートし、その後、９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、および６８℃で４５秒間の４０サイクルに供し、冷却した。最後に、増幅による更なるプレートインデックス化のために、２ｎｄ ｃＤＮＡ増幅産物の３μＬを使用した。２０μＬのプレートインデックス増幅混合物（１ｘＫＯＤ ＦＸ ｎｅｏ緩衝液、４００μＭ ｄＮＴＰ、それぞれ５００ｎＭのＰ５＿ｉ５＿Ｒｅａｄ１＿Ｍ１３Ｆ又はＰ７＿ｉ７＿Ｒｅａｄ２＿Ｍ１３Ｆ、又はＰ５＿ｉ５＿Ｒｅａｄ１＿Ｍ１３Ｒ、２μＬの第２ｃＤＮＡ増幅産物、０．５Ｕ ＫＯＤ ＦＸ ｎｅｏ ポリメラーゼ）を調製し、９４℃で２分間インキュベートし、その後、９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、および６８℃で４５秒間の２５サイクルに供し、冷却した。すべてのプライマーを表３に示す。ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、ペアエンド（Ｒｅａｄ１：４００ｎｔ、Ｒｅａｄ２：１００ｎｔ）を用いて配列決定を行った。各ウェルのＤＮＡ配列をウェルインデックスおよびプレートインデックスによりソートした。５’－４００ｎｔおよび３’－４００ｎｔのＩｇ配列をＲｅａｄ１から得た。リードに対してＱ２０を用いたトリミングとそれに続くクラスタリングを実施した。以下の４つの条件を満たすリードのみが、結果として生じるＩｇ配列として用いられる。（１）長さ２６０ｎｔ以上のリード、（２）全リードの上限５％の割合でクラスター化された累積リード、（３）２０塩基またはそれ以上の５’および３’ リードオーバーラッピング長、（４）重鎖の総長４６０±５０ｂｐ、または軽鎖の総長３９０±４０ｂｐ。得られた配列データはすべて、アノテーション46のためにＩＭＧＴ／Ｈｉｇｈ Ｖ－ＱＵＥＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｖｑｕｅｓｔ）にかけた。配列アノテーション、Ｉｇデータベースの構築、およびＩｇレパートリーの可視化を、インハウスＢＯＮＳＣＩソフトウェアを用いて実施した。
単一細胞を、４μＬ／ウェルの溶解バッファー（２Ｕ／μＬ ＲＮＡＳｉｎ、０．５ｘ ＰＢＳ、１０ｍＭ ＤＴＴ）および１μＬの１２μＭ ３’＿ＳＭＡＲＴ＿ｄＴに滴下した。細胞溶解物を７２℃で３分間インキュベートし、次いで氷上に２分間置いた。第１ストランドｃＤＮＡ合成のために、細胞溶解物に５μＬのＲＴ混合液（２ｘＦｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ、５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ、２．５μＭ ＳＭＡＲＴ ５’ＲＡＣＥ オリゴヌクレオチド、１０Ｕ ＲＮａｓｉｎ、１００Ｕ ＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅTM逆転写酵素）を加え、４２℃で９０分、７０℃で１０分インキュベートし、その後、４℃で保持した。ＳＭＡＲＴ １ｓｔプライマーセットによるｃＤＮＡ増幅では、２５μＬの第１増幅混合物（１×Ｋａｐａ ＨｉＦｉ ｈｏｔｓｔａｒｔｅｒ Ｒｅａｄｙ－ｍｉｘ、１×ＵＰＭ、３００ｎＭ Ｏｕｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒ、２μＬの第１ストランドｃＤＮＡ、６．２５μＬのヌクレアーゼフリーＨ2Ｏ）を調製し、９５℃で３分間インキュベートし、その後、９８℃で２０秒間、６０℃で１５秒間、および７２℃で１５秒間の３５サイクルに供し、その後、７２℃で１分間インキュベートしてから冷却した。Ｉｇ特異的２ｎｄプライマーセットによるｃＤＮＡ増幅のために、２０μＬの第２増幅混合物（１ｘＫＯＤ ＦＸ ｎｅｏバッファー、４００μＭ ｄＮＴＰ、５００ｎＭ ５’マトリックスプライマーミックス、５００ｎＭ ３’マトリックスプライマーミックス、２μＬの第１ｃＤＮＡ増幅産物、０．５Ｕ ＫＯＤ ＦＸ ｎｅｏ ポリメラーゼ）を調製し、９４℃で２分間インキュベートし、その後、９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、および６８℃で４５秒間の４０サイクルに供し、冷却した。最後に、増幅による更なるプレートインデックス化のために、２ｎｄ ｃＤＮＡ増幅産物の３μＬを使用した。２０μＬのプレートインデックス増幅混合物（１ｘＫＯＤ ＦＸ ｎｅｏ緩衝液、４００μＭ ｄＮＴＰ、それぞれ５００ｎＭのＰ５＿ｉ５＿Ｒｅａｄ１＿Ｍ１３Ｆ又はＰ７＿ｉ７＿Ｒｅａｄ２＿Ｍ１３Ｆ、又はＰ５＿ｉ５＿Ｒｅａｄ１＿Ｍ１３Ｒ、２μＬの第２ｃＤＮＡ増幅産物、０．５Ｕ ＫＯＤ ＦＸ ｎｅｏ ポリメラーゼ）を調製し、９４℃で２分間インキュベートし、その後、９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、および６８℃で４５秒間の２５サイクルに供し、冷却した。すべてのプライマーを表３に示す。ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、ペアエンド（Ｒｅａｄ１：４００ｎｔ、Ｒｅａｄ２：１００ｎｔ）を用いて配列決定を行った。各ウェルのＤＮＡ配列をウェルインデックスおよびプレートインデックスによりソートした。５’－４００ｎｔおよび３’－４００ｎｔのＩｇ配列をＲｅａｄ１から得た。リードに対してＱ２０を用いたトリミングとそれに続くクラスタリングを実施した。以下の４つの条件を満たすリードのみが、結果として生じるＩｇ配列として用いられる。（１）長さ２６０ｎｔ以上のリード、（２）全リードの上限５％の割合でクラスター化された累積リード、（３）２０塩基またはそれ以上の５’および３’ リードオーバーラッピング長、（４）重鎖の総長４６０±５０ｂｐ、または軽鎖の総長３９０±４０ｂｐ。得られた配列データはすべて、アノテーション46のためにＩＭＧＴ／Ｈｉｇｈ Ｖ－ＱＵＥＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｖｑｕｅｓｔ）にかけた。配列アノテーション、Ｉｇデータベースの構築、およびＩｇレパートリーの可視化を、インハウスＢＯＮＳＣＩソフトウェアを用いて実施した。
【0044】
（７）プラスミド
ＰＲ８（ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８ウイルス47、Ｄｒ． Ｋａｗａｏｋａから提供）およびＨ２Ｎ２（Ａ／Ｏｋｕｄａ／１９５７、Ｄｒ． Ｏｋｕｎｏから提供）のＨＡエクトドメインおよび完全長ＮＡ ｃＤＮＡを、感染細胞から抽出した全ＲＮＡを用いてＲＴＰＣＲにより増幅した。Ｈ１株Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｘ１７９Ａ）、Ｈ３株Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｘ－２２３）およびＨ５株Ａ／Ｅｇｙｐｔ／Ｎ０３０７２／２０１０）のヒトコドンを最適化し合成した（ＧＥＮＥＷＩＺ）。可溶性三量体ＨＡプローブを作製するために、発現構築物は、元のＮ末端シグナルペプチド、次いでＨＡエクトドメイン、Ｔ４フィブリチンフォールドオン三量体化ドメイン、ビオチン化可能なＡｖｉＴａｇ、およびヘキサヒスチジンタグを含んでいた。また、ＨＡ１におけるシアル酸結合を失わせるＹ９８Ｆ突然変異、および、ＨＡ１およびＨＡ２において新規のジスルフィド結合を取り込んで三量体安定性を高めるためにＴ３０ＣおよびＱ４７Ｃ突然変異それぞれをすべてのＨＡ構築物に導入した。全てのＨＡ遺伝子をｐｃＤＮＡ３．４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローン化し、ＮＡ遺伝子をｐＥＦ－ＢＯＳ48にクローン化した。ミニＨＡ（ＰＤＢ ＩＤ ５ＣＪＱ）は、Ｎ末端のｍｕ－ホスファターゼシグナルペプチドおよびＣ末端のヘキサヒスチジンタグに隣接している。ミニＨＡを合成し、ｐｃＤＮＡ３．４（ＧＥＮＥＷＩＺ）にクローニングした。Ｃ１７９生殖抗体については、鋳型としてＣ１７９生殖ＢＣＲマウス系統に対するＩｇｈターゲティングまたはＩｇｋトランスジェニックベクターを用いてＰＣＲ増幅したフラグメントを、ｍｕ－ホスファターゼシグナルペプチド、マウスＩｇＧ２ａ定常領域、ビオチン化可能なＡｖｉＴａｇおよびヘキサヒスチジンタグを含むｐｃＤＮＡ３．４－ｍＩｇＧ２ａベクターにクローン化した。Ｂ１１抗体について、Ｃ１７９ＨＬ（雌、８週齢）由来のＲＢＣ溶解脾細胞を、マウスＢＤ Ｆｃ ＢｌｏｃｋTM抗ＣＤ１６／ＣＤ３２、続いて抗Ｂ２２０－ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ、ＩｇＭ－ＰＥ－ｃｙ７、ＩｇＤ－ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ（商標）６４７、ＰＥ－Ｄｕｍｐｍｉｘ（ＣＤ５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４３、Ｔｈｙ１．２、ＴＥＲ１１９、Ｆ４／８０、Ｇｒ－１）、ＨＡプローブ（Ｈ１ＰＲ８）－Ｈｉｓ）、ＨＡプローブ（Ｈ２）－Ｂｉｏ、抗Ｈｉｓ－ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ（商標）４８８、ストレプトアビジン－ＢＶ４２１（商標）で染色した。死細胞は７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）により除外した。次いで、ソートされたダンプ－Ｂ２２０+ＩｇＭ+ＩｇＤ+ＰＲ８+Ｈ２+単一Ｂ細胞を溶解した。ｃＤＮＡを合成し、単一Ｂ細胞Ｉｇレパートリー配列決定および分析で記載されたように一度増幅した。重鎖および軽鎖のクローニングについては、５０μＬの第２の増幅混合物（１×ＫＯＤ－ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ緩衝液、２００μＭ ｄＮＴＰ、２ｍＭ ＭｇＳＯ4、３００ｎＭ ＦＷＤクローニングプライマー、３００ｎＭ ＲＥＶクローニングプライマー、０．５μＬの第１ｃＤＮＡ増幅産物、１Ｕ ＫＯＤ－ｐｌｕｓポリメラーゼ）を調製し、９４℃で２分間、９４℃で１５秒間および７４℃で１５秒間の５サイクル、９４℃で１５秒間およびで１５秒間の５サイクル、９４℃で１５秒間および７０℃で１５秒間の５サイクル、次いで、９４℃で１５秒間および６８℃で１５秒間の３０サイクルでインキュベートし、６８℃で７分間インキュベートして冷却した。ＰＣＲ断片をｐｃＤＮＡ３．４－ｍＩｇＧ２ａまたはｐｃＤＮＡ３．４－κ（ｐｃＤＮＡ３．４－ｍＩｇＧ２ａのマウスＩｇｋバージョン）ベクターにクローン化した。
ＰＲ８（ＭＡ－Ｖｅｎｕｓ－ＰＲ８ウイルス47、Ｄｒ． Ｋａｗａｏｋａから提供）およびＨ２Ｎ２（Ａ／Ｏｋｕｄａ／１９５７、Ｄｒ． Ｏｋｕｎｏから提供）のＨＡエクトドメインおよび完全長ＮＡ ｃＤＮＡを、感染細胞から抽出した全ＲＮＡを用いてＲＴＰＣＲにより増幅した。Ｈ１株Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｘ１７９Ａ）、Ｈ３株Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｘ－２２３）およびＨ５株Ａ／Ｅｇｙｐｔ／Ｎ０３０７２／２０１０）のヒトコドンを最適化し合成した（ＧＥＮＥＷＩＺ）。可溶性三量体ＨＡプローブを作製するために、発現構築物は、元のＮ末端シグナルペプチド、次いでＨＡエクトドメイン、Ｔ４フィブリチンフォールドオン三量体化ドメイン、ビオチン化可能なＡｖｉＴａｇ、およびヘキサヒスチジンタグを含んでいた。また、ＨＡ１におけるシアル酸結合を失わせるＹ９８Ｆ突然変異、および、ＨＡ１およびＨＡ２において新規のジスルフィド結合を取り込んで三量体安定性を高めるためにＴ３０ＣおよびＱ４７Ｃ突然変異それぞれをすべてのＨＡ構築物に導入した。全てのＨＡ遺伝子をｐｃＤＮＡ３．４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローン化し、ＮＡ遺伝子をｐＥＦ－ＢＯＳ48にクローン化した。ミニＨＡ（ＰＤＢ ＩＤ ５ＣＪＱ）は、Ｎ末端のｍｕ－ホスファターゼシグナルペプチドおよびＣ末端のヘキサヒスチジンタグに隣接している。ミニＨＡを合成し、ｐｃＤＮＡ３．４（ＧＥＮＥＷＩＺ）にクローニングした。Ｃ１７９生殖抗体については、鋳型としてＣ１７９生殖ＢＣＲマウス系統に対するＩｇｈターゲティングまたはＩｇｋトランスジェニックベクターを用いてＰＣＲ増幅したフラグメントを、ｍｕ－ホスファターゼシグナルペプチド、マウスＩｇＧ２ａ定常領域、ビオチン化可能なＡｖｉＴａｇおよびヘキサヒスチジンタグを含むｐｃＤＮＡ３．４－ｍＩｇＧ２ａベクターにクローン化した。Ｂ１１抗体について、Ｃ１７９ＨＬ（雌、８週齢）由来のＲＢＣ溶解脾細胞を、マウスＢＤ Ｆｃ ＢｌｏｃｋTM抗ＣＤ１６／ＣＤ３２、続いて抗Ｂ２２０－ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ、ＩｇＭ－ＰＥ－ｃｙ７、ＩｇＤ－ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ（商標）６４７、ＰＥ－Ｄｕｍｐｍｉｘ（ＣＤ５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４３、Ｔｈｙ１．２、ＴＥＲ１１９、Ｆ４／８０、Ｇｒ－１）、ＨＡプローブ（Ｈ１ＰＲ８）－Ｈｉｓ）、ＨＡプローブ（Ｈ２）－Ｂｉｏ、抗Ｈｉｓ－ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ（商標）４８８、ストレプトアビジン－ＢＶ４２１（商標）で染色した。死細胞は７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）により除外した。次いで、ソートされたダンプ－Ｂ２２０+ＩｇＭ+ＩｇＤ+ＰＲ８+Ｈ２+単一Ｂ細胞を溶解した。ｃＤＮＡを合成し、単一Ｂ細胞Ｉｇレパートリー配列決定および分析で記載されたように一度増幅した。重鎖および軽鎖のクローニングについては、５０μＬの第２の増幅混合物（１×ＫＯＤ－ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ緩衝液、２００μＭ ｄＮＴＰ、２ｍＭ ＭｇＳＯ4、３００ｎＭ ＦＷＤクローニングプライマー、３００ｎＭ ＲＥＶクローニングプライマー、０．５μＬの第１ｃＤＮＡ増幅産物、１Ｕ ＫＯＤ－ｐｌｕｓポリメラーゼ）を調製し、９４℃で２分間、９４℃で１５秒間および７４℃で１５秒間の５サイクル、９４℃で１５秒間およびで１５秒間の５サイクル、９４℃で１５秒間および７０℃で１５秒間の５サイクル、次いで、９４℃で１５秒間および６８℃で１５秒間の３０サイクルでインキュベートし、６８℃で７分間インキュベートして冷却した。ＰＣＲ断片をｐｃＤＮＡ３．４－ｍＩｇＧ２ａまたはｐｃＤＮＡ３．４－κ（ｐｃＤＮＡ３．４－ｍＩｇＧ２ａのマウスＩｇｋバージョン）ベクターにクローン化した。
【0045】
（８）タンパク質の発現と精製
ＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅTM２９３トランスフェクションキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造者の使用説明書に従い、２５．７μｇのＨＡ、１．３μｇのＮＡ、および３μｇのＢｉｒＡを発現するプラスミドの混合物を、Ｅｘｐｉ２９３TM細胞にトランスフェクトし、３７℃の加湿された８％ＣＯ2インキュベーター中で、インビボＢｉｒＡビオチン化のためにＤ－ビオチンを最終濃度１００Ｍ添加したＥｘｐｉ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。ミニＨＡ産生については、３０μｇミニＨＡ発現プラスミドをトランスフェクトし、Ｄ－ビオチンを含まない培地で培養した。トランスフェクション後３日後の培養上清を回収し、０．４５μｍのフィルター（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過した。すべてのタンパク質をＴａｌｏｎ金属親和性樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で精製し、パイロジェンフリーのＰＢＳで透析した。オリゴマーの状態および純度は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより、２５℃で測定した。
ＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅTM２９３トランスフェクションキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造者の使用説明書に従い、２５．７μｇのＨＡ、１．３μｇのＮＡ、および３μｇのＢｉｒＡを発現するプラスミドの混合物を、Ｅｘｐｉ２９３TM細胞にトランスフェクトし、３７℃の加湿された８％ＣＯ2インキュベーター中で、インビボＢｉｒＡビオチン化のためにＤ－ビオチンを最終濃度１００Ｍ添加したＥｘｐｉ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。ミニＨＡ産生については、３０μｇミニＨＡ発現プラスミドをトランスフェクトし、Ｄ－ビオチンを含まない培地で培養した。トランスフェクション後３日後の培養上清を回収し、０．４５μｍのフィルター（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過した。すべてのタンパク質をＴａｌｏｎ金属親和性樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で精製し、パイロジェンフリーのＰＢＳで透析した。オリゴマーの状態および純度は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより、２５℃で測定した。
【0046】
（９）抗体産生
Ｃ１７９、ＮＳＰ２およびＮＳＰ２９抗体はハイブリドーマ細胞から作製した（Ｄｒ． Ｙ． ＯｋｕｎｏおよびＤｒ． Ｙ． Ｔａｋａｈａｓｈｉから授与）。ハイブリドーマ細胞を中空繊維細胞システム（ＦｉｂｅｒＣｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に播種し、培養上清を回収した。プロテインＧセファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてモノクローナル抗体を精製した。タンパク質ぼ発現と精製のセクションで説明したように、Ｅｘｐｉ２９３TM細胞において組換えＣ１７９生殖抗体およびＢ１１ ＩｇＧ２ａ抗体を作製した。組換えモノクローナルＩｇＧ２ａ抗体を、Ｔａｌｏｎ金属親和性樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて培養上清から精製した。発現ベクタープラスミドはＩｇ重鎖を含み、次いでＣ末端ビオチン化可能なＡｖｉＴａｇおよびヘキサヒスチジンタグを含んでいた。
Ｃ１７９、ＮＳＰ２およびＮＳＰ２９抗体はハイブリドーマ細胞から作製した（Ｄｒ． Ｙ． ＯｋｕｎｏおよびＤｒ． Ｙ． Ｔａｋａｈａｓｈｉから授与）。ハイブリドーマ細胞を中空繊維細胞システム（ＦｉｂｅｒＣｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に播種し、培養上清を回収した。プロテインＧセファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてモノクローナル抗体を精製した。タンパク質ぼ発現と精製のセクションで説明したように、Ｅｘｐｉ２９３TM細胞において組換えＣ１７９生殖抗体およびＢ１１ ＩｇＧ２ａ抗体を作製した。組換えモノクローナルＩｇＧ２ａ抗体を、Ｔａｌｏｎ金属親和性樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて培養上清から精製した。発現ベクタープラスミドはＩｇ重鎖を含み、次いでＣ末端ビオチン化可能なＡｖｉＴａｇおよびヘキサヒスチジンタグを含んでいた。
【0047】
（１０）表面プラスモン共鳴
ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００マシン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて２５℃で動態解析を行った。Ｃ１７９、Ｃ１７９生殖、ＮＳＰ２、Ｍ２１３９および／またはＢ１１抗体を、供給者の使用説明書に従ってアミンカップリングキットによりＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に固相化した。ＨＡプローブを５つの異なる濃度で系列希釈し、ＨＢＳ‐ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．００５％界面活性剤Ｐ２０）中で、流速３０μＬ／分で３分間、解離時間７分間で注入した。チップは、Ｃ１７９、Ｃ１７９生殖、ＮＳＰ２およびＭ２１３９に対しては１０ｍＭグリシン（ｐＨ２．５）、またはＢ１１に対しては４Ｍ ＭｇＣｌ2中で再生させた。Ｍ２１３９ ｍＡｂを、バックグラウンド結合の差し引くための参照として使用した。結合動態は、１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに基づいてソフトウェアＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン３．０を用いて計算した。
ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００マシン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて２５℃で動態解析を行った。Ｃ１７９、Ｃ１７９生殖、ＮＳＰ２、Ｍ２１３９および／またはＢ１１抗体を、供給者の使用説明書に従ってアミンカップリングキットによりＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に固相化した。ＨＡプローブを５つの異なる濃度で系列希釈し、ＨＢＳ‐ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．００５％界面活性剤Ｐ２０）中で、流速３０μＬ／分で３分間、解離時間７分間で注入した。チップは、Ｃ１７９、Ｃ１７９生殖、ＮＳＰ２およびＭ２１３９に対しては１０ｍＭグリシン（ｐＨ２．５）、またはＢ１１に対しては４Ｍ ＭｇＣｌ2中で再生させた。Ｍ２１３９ ｍＡｂを、バックグラウンド結合の差し引くための参照として使用した。結合動態は、１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに基づいてソフトウェアＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン３．０を用いて計算した。
【0048】
（１１）自己抗原マイクロアレイを用いた自己抗体プロファイリング
テキサス大学サウスウェスタン医療センター（ｈｔｔｐｓ：／／ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ．ｓｗｍｅｄ．ｅｄｕ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｃａｔｅｇｏｒｙ／ｐｒｏｔｅｉｎ－ａｒｒａｙ／）が開発した自己抗原マイクロアレイプラットフォームを用いて、１２４自己抗原のパネルに対する自己抗体再活性体を測定した。簡単に言うと、自己抗体プロファイリングのために、モノクローナルｍＡｂをＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）緩衝液中で１μｇ／ｍＬに希釈した。１２４の自己抗原と４つの対照タンパク質を備えた自己抗原アレイを、Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｒｏｓｅｌｌフィルムスライド（Ｇｒａｃｅ Ｂｉｏ－Ｌａｂｓ）上に複製して印刷した。希釈したｍＡｂ試料を自己抗原アレイと共にインキュベートし、Ｃｙ３結合抗マウスＩｇＧ（１：２０００、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＣｙ５結合抗マウスＩｇＭ（１：２０００、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、５３２ｎｍおよび６３５ｎｍのレーザー波長を有するＧｅｎｅｐｉｘ ４２００Ａスキャナー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて自己抗体を検出した。得られた画像はＧｅｎｅｐｉｘ Ｐｒｏ ７．０ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて解析した。各スポットの信号強度の中央値を算出し、スポット周辺の局所バックグラウンドを差し引いて、複製した２つのスポットから得られたデータを平均した。各抗原のバックグラウンドを差し引いたシグナル強度を、内部対照としてアレイ上にスポットしたマウスＩｇＧおよびＩｇＭ（またはＩｇＡおよびＩｇＥ）の平均強度に対して正規化した。最後に、各抗原に対する正味蛍光強度（ＮＦＩ）を、陰性対照として各実験に含めたＰＢＳ対照を差し引くことにより計算した。シグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）を、バックグラウンドノイズを超える真の信号の定量的な大きさとして用いた。３以上のＳＮＲ値はバックグラウンドよりも有意に高く、真のシグナルであると考えられた。
テキサス大学サウスウェスタン医療センター（ｈｔｔｐｓ：／／ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ．ｓｗｍｅｄ．ｅｄｕ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｃａｔｅｇｏｒｙ／ｐｒｏｔｅｉｎ－ａｒｒａｙ／）が開発した自己抗原マイクロアレイプラットフォームを用いて、１２４自己抗原のパネルに対する自己抗体再活性体を測定した。簡単に言うと、自己抗体プロファイリングのために、モノクローナルｍＡｂをＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）緩衝液中で１μｇ／ｍＬに希釈した。１２４の自己抗原と４つの対照タンパク質を備えた自己抗原アレイを、Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｒｏｓｅｌｌフィルムスライド（Ｇｒａｃｅ Ｂｉｏ－Ｌａｂｓ）上に複製して印刷した。希釈したｍＡｂ試料を自己抗原アレイと共にインキュベートし、Ｃｙ３結合抗マウスＩｇＧ（１：２０００、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＣｙ５結合抗マウスＩｇＭ（１：２０００、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、５３２ｎｍおよび６３５ｎｍのレーザー波長を有するＧｅｎｅｐｉｘ ４２００Ａスキャナー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて自己抗体を検出した。得られた画像はＧｅｎｅｐｉｘ Ｐｒｏ ７．０ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて解析した。各スポットの信号強度の中央値を算出し、スポット周辺の局所バックグラウンドを差し引いて、複製した２つのスポットから得られたデータを平均した。各抗原のバックグラウンドを差し引いたシグナル強度を、内部対照としてアレイ上にスポットしたマウスＩｇＧおよびＩｇＭ（またはＩｇＡおよびＩｇＥ）の平均強度に対して正規化した。最後に、各抗原に対する正味蛍光強度（ＮＦＩ）を、陰性対照として各実験に含めたＰＢＳ対照を差し引くことにより計算した。シグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）を、バックグラウンドノイズを超える真の信号の定量的な大きさとして用いた。３以上のＳＮＲ値はバックグラウンドよりも有意に高く、真のシグナルであると考えられた。
【0049】
（１２）統計
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いた統計解析には、両側スチューデントｔ検定と一方向ＡＮＯＶＡを用いた。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いた統計解析には、両側スチューデントｔ検定と一方向ＡＮＯＶＡを用いた。
【0050】
結果
［１］Ｃ１７９ Ｂ細胞は低頻度でＨＡと結合する
発明者らは、重鎖遺伝子座およびＣ１７９κ軽鎖導入遺伝子にＣ１７９ノックインＶＤＪを保有するステム特異的中和抗体Ｃ１７９ ＢＣＲマウス株を作製した（図７）。脾臓内の総細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞の数は野生型とＣ１７９ＢＣＲマウスで同等であり（図１Ａ）、Ｂ細胞の発生に大きな欠陥がないことを示している。
［１］Ｃ１７９ Ｂ細胞は低頻度でＨＡと結合する
発明者らは、重鎖遺伝子座およびＣ１７９κ軽鎖導入遺伝子にＣ１７９ノックインＶＤＪを保有するステム特異的中和抗体Ｃ１７９ ＢＣＲマウス株を作製した（図７）。脾臓内の総細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞の数は野生型とＣ１７９ＢＣＲマウスで同等であり（図１Ａ）、Ｂ細胞の発生に大きな欠陥がないことを示している。
【0051】
次に、Ｃ１７９ Ｂ細胞が様々なインフルエンザ株由来のＨＡタンパク質に結合できるかどうかを調べた。ここに示した報告書（図１Ｂ）で述べた以下のような改変によって、一連の三量体化組換えＨＡタンパク質が作製された。（１）二つの個々の単量体ＨＡタンパク質が互いに会合して三量体型を安定化させる残基において置換によって２つのシステインを組み込んだ9；（２）バクテリオファージＴ４からのｆｏｌｄｏｎフラグメントがＨＡタンパク質のＣ末端に結合して三量体化を促進した10；（３）ＨＡタンパク質上の受容体結合部位（ＲＢＳ）とＢ細胞表面のシアル酸の非特異的結合を最小限にするために、Ｈ３、ＨＡの９８アミノ酸残基に相当する位置のアミノ酸において全てのＨＡプローブにＹからＦへの置換を導入した11。これらの組換えＨＡタンパク質のオリゴマー化状態をサイズ排除クロマトグラフィーで解析し、Ｃ１７９と他の抗体との結合親和性を表面プラズモン共鳴で測定した（図１ＢとＣ）。Ｃ１７９は以前の研究12で報告されたのと同様の親和性でグループ１のＨＡタンパク質に対する広い反応性を示した。また、２つの他の抗ＨＡ抗体、ＮＳＰ２およびＮＳＰ２９、ならびに生殖細胞系、Ｃ１７９抗体の非変異型も試験した（表１および図８）。ＮＳＰ２とＮＳＰ２９はともにＨＡ Ｃａｌに特異的に結合する（Ｋｄ：それぞれ１．２９×１０-13Ｍと１．７７×１０-13Ｍ；図１Ｃ）。注目すべきことに、ＮＳＰ２はＨＡヘッド領域に結合し、その抗体がヘマグルチニン阻害活性を有するという事実によって裏付けられている（表２）。組換えＣ１７９生殖系列抗体は、試験したいずれのＨＡタンパク質にも結合活性を示さなかった。
【0052】
【表1】
【0053】
【表2】
# Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）ウイルス由来の遺伝子改変株。
【0054】
次に、Ｃ１７９ Ｂ細胞が細胞表面ＢＣＲによって同じ一連のＨＡタンパク質と結合できるかどうかを調べた。対照として、Ｃ１７９ＢＣＲマウス系統に加えて、一連の他のＢＣＲマウス系統、Ｃ１７９生殖系列、ＮＳＰ２およびＮＳＰ２９を作製し、よく記載されたＢＣＲマウス系統Ｈｙ１０（抗ＨＥＬ ＢＣＲ）13も使用した。予想通り、Ｃ１７９ Ｂ細胞はＨ１Ｎ１ ＰＲ８、Ｈ２Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ１Ｎ１ Ｃａｌ、およびｍｉｎｉ ＨＡ由来のＨＡに結合し、ＮＳＰ２およびＮＳＰ２９Ｂ細胞はＨ１Ｎ１ Ｃａｌ ＨＡのみに結合した（図１ＤおよびＥ）。しかし、インビトロでのＨ２ ＨＡのＣ１７９抗体への結合は、ＨＥＬ－Ｈｙ１０抗体結合の親和性（Ｋｄ：１０-10Ｍ）13と同様のサブナノモルレベルであるにもかかわらず、ＨＡ結合Ｃ１７９ Ｂ細胞の頻度は極めて低く０．６８～１．５７％の範囲であった。対照的に、ＮＳＰ２、ＮＳＰ２９、およびＨｙ１０ Ｂ細胞は、それぞれ５７．４２％、４８．７６％、および９３．３７％の頻度でＨ１Ｎ１ Ｃａｌ ＨＡタンパク質およびＨＥＬ抗原と結合した（図１Ｄ、Ｅ）。
【0055】
［２］Ｃ１７９ Ｂ細胞は代わりの軽鎖遺伝子を発現する
次に、予想外に低い頻度のＨＡ結合を考え、Ｃ１７９ Ｂ細胞が実際にＣ１７９のＩｇ導入遺伝子を発現しているかどうかを試験した。ナイーブＣ１７９ Ｂ細胞におけるＢＣＲ重鎖および軽鎖導入遺伝子の発現を、単一細胞Ｉｇレパートリー解析により検討した（図９）。Ｃ１７９ Ｂ細胞のうち、元々のペアである導入遺伝子ＩＧＨＶ７－３およびＩＧＫＶ１２－９８を発現したものはほとんどなく、ＮＳＰ２のＢ細胞は元々のペアである導入遺伝子ＩＶＧＨＶ２－９－１およびＩＧＫＶ１４－１１１を発現したものが多いことを見出した（表１；図２）。Ｃ１７９生殖系列Ｂ細胞はいずれも、元々のκ軽鎖導入遺伝子を発現しなかった。注目すべきことに、Ｃ１７９ Ｂ細胞はＩＧＫＶ１２－４６遺伝子セグメントを発現する傾向があった。これらの結果は、軽鎖受容体エディティングがＣ１７９およびＣ１７９生殖系列ＢＣＲマウス系統において起こり得ることを示唆する。
次に、予想外に低い頻度のＨＡ結合を考え、Ｃ１７９ Ｂ細胞が実際にＣ１７９のＩｇ導入遺伝子を発現しているかどうかを試験した。ナイーブＣ１７９ Ｂ細胞におけるＢＣＲ重鎖および軽鎖導入遺伝子の発現を、単一細胞Ｉｇレパートリー解析により検討した（図９）。Ｃ１７９ Ｂ細胞のうち、元々のペアである導入遺伝子ＩＧＨＶ７－３およびＩＧＫＶ１２－９８を発現したものはほとんどなく、ＮＳＰ２のＢ細胞は元々のペアである導入遺伝子ＩＶＧＨＶ２－９－１およびＩＧＫＶ１４－１１１を発現したものが多いことを見出した（表１；図２）。Ｃ１７９生殖系列Ｂ細胞はいずれも、元々のκ軽鎖導入遺伝子を発現しなかった。注目すべきことに、Ｃ１７９ Ｂ細胞はＩＧＫＶ１２－４６遺伝子セグメントを発現する傾向があった。これらの結果は、軽鎖受容体エディティングがＣ１７９およびＣ１７９生殖系列ＢＣＲマウス系統において起こり得ることを示唆する。
【0056】
［３］Ｃ１７９ Ｂ細胞における軽鎖レセプター編集
この限定的な導入遺伝子発現が軽鎖受容体編集14、15、16、17、18、19によるものかどうかを検証するために、Ｃ１７９マウス系統にＲａｇ１欠損を導入した。Ｒａｇ１ ＶＤＪリコンビナーゼも受容体の編集に不可欠な役割を果たしている。ホモのＣ１７９Ｉｇｈを有するＢ細胞は、Ｒａｇ１が十分なバックグラウンドにおいては元のＩＧＫＶ１２－９８遺伝子セグメントを発現することはまれであるが、Ｒａｇ１が欠損したバックグラウンドでは、解析したすべてのＢ細胞が元々のペアである導入遺伝子を発現した（図３）。このため、軽鎖受容体の編集が元のＣ１７９軽鎖遺伝子の発現を制限し、Ｃ１７９ Ｉｇを有するＨＡ結合Ｂ細胞の頻度を劇的に減少させたと考えられる。
この限定的な導入遺伝子発現が軽鎖受容体編集14、15、16、17、18、19によるものかどうかを検証するために、Ｃ１７９マウス系統にＲａｇ１欠損を導入した。Ｒａｇ１ ＶＤＪリコンビナーゼも受容体の編集に不可欠な役割を果たしている。ホモのＣ１７９Ｉｇｈを有するＢ細胞は、Ｒａｇ１が十分なバックグラウンドにおいては元のＩＧＫＶ１２－９８遺伝子セグメントを発現することはまれであるが、Ｒａｇ１が欠損したバックグラウンドでは、解析したすべてのＢ細胞が元々のペアである導入遺伝子を発現した（図３）。このため、軽鎖受容体の編集が元のＣ１７９軽鎖遺伝子の発現を制限し、Ｃ１７９ Ｉｇを有するＨＡ結合Ｂ細胞の頻度を劇的に減少させたと考えられる。
【0057】
次に、Ｒａｇ１の枯渇によって生じたＣ１７９ Ｉｇを有するＢ細胞がインビボで生存できるかどうかを検討した。Ｒａｇ１欠損Ｃ１７９ ＢＣＲマウスおよびＲａｇ１欠損Ｃ１７９生殖系列ＢＣＲマウスの両方において、末梢Ｂ細胞集団が有意に減少した（図４Ａ、４Ｂ）。さらに、Ｒａｇ１欠損Ｃ１７９ ＢＣＲマウスから得た血流循環のＢ細胞はＣＤ２１のダウンレギュレーションを示し、アネルギー表現型を示した。これらの結果は、Ｃ１７９ Ｉｇを有するＢ細胞が欠失するか、またはアネルギーの状態に陥る運命にあることを示す。
【0058】
［４］寛容圧から逃れるＣ１７９ Ｂ細胞は異なる軽鎖を使い、広範な中和活性を維持する
Ｒａｇ１に十分なバックグラウンドにおいてはＣ１７９ Ｂ細胞は元々の重鎖および軽鎖遺伝子のペアを発現していないが、Ｃ１７９のＢ細胞の一部は広範囲のＨＡタンパク質と結合できることに気づいた（図１）。これを分子レベルで理解するために、Ｈ１Ｎ１ ＰＲ８およびＨ２Ｎ２ ＨＡタンパク質の両方に結合するＣ１７９ Ｂ細胞の集団を収集し、単一細胞Ｉｇレパートリー分析を実施した。驚くべきことに、配列決定された１９０のレパートリーのうち１５９のレパートリーが、最初のＩＧＫＶ１２－９８（１１．１％）の代わりにＩＧＫＶ１２－４６（８３．３％、図５Ａ）を使用していた。ＩＧＫＶ１２－４６レパートリーの中で、元々のＣ１７９重鎖と関連する１３５のクローンおよびこれらのＣ１７９重鎖結合クローンの１０５は同一であった。これらのクローン由来のＩＧＫＶ１２－４６のアミノ酸配列は生殖細胞系列であった（図１０）。Ｂ１１と命名されたこのユニークなクローンから組換え抗体を作製し、広範囲のＨＡタンパク質との交差反応性を検証した（図５Ｂ、図１Ｃ）。Ｂ１１は４／５のグループ１のＨＡとＨ３ ＨＡに結合し、一方、Ｃ１７９はグループ１のＨＡのみに結合した。さらに、軽鎖を編集しても、Ｈ１Ｎ１ ＰＲ８およびＨ２Ｎ２に対する中和活性は維持された（図５Ｃ）。これらの結果は、Ｃ１７９軽鎖を置換することにより、Ｂ細胞レパートリーがそのｂｎＡｂの特徴を維持している末梢で出現し得ることを示す。
Ｒａｇ１に十分なバックグラウンドにおいてはＣ１７９ Ｂ細胞は元々の重鎖および軽鎖遺伝子のペアを発現していないが、Ｃ１７９のＢ細胞の一部は広範囲のＨＡタンパク質と結合できることに気づいた（図１）。これを分子レベルで理解するために、Ｈ１Ｎ１ ＰＲ８およびＨ２Ｎ２ ＨＡタンパク質の両方に結合するＣ１７９ Ｂ細胞の集団を収集し、単一細胞Ｉｇレパートリー分析を実施した。驚くべきことに、配列決定された１９０のレパートリーのうち１５９のレパートリーが、最初のＩＧＫＶ１２－９８（１１．１％）の代わりにＩＧＫＶ１２－４６（８３．３％、図５Ａ）を使用していた。ＩＧＫＶ１２－４６レパートリーの中で、元々のＣ１７９重鎖と関連する１３５のクローンおよびこれらのＣ１７９重鎖結合クローンの１０５は同一であった。これらのクローン由来のＩＧＫＶ１２－４６のアミノ酸配列は生殖細胞系列であった（図１０）。Ｂ１１と命名されたこのユニークなクローンから組換え抗体を作製し、広範囲のＨＡタンパク質との交差反応性を検証した（図５Ｂ、図１Ｃ）。Ｂ１１は４／５のグループ１のＨＡとＨ３ ＨＡに結合し、一方、Ｃ１７９はグループ１のＨＡのみに結合した。さらに、軽鎖を編集しても、Ｈ１Ｎ１ ＰＲ８およびＨ２Ｎ２に対する中和活性は維持された（図５Ｃ）。これらの結果は、Ｃ１７９軽鎖を置換することにより、Ｂ細胞レパートリーがそのｂｎＡｂの特徴を維持している末梢で出現し得ることを示す。
【0059】
［５］Ｃ１７９とその祖先であるＣ１７９の生殖系列は自己反応性である
Ｃ１７９とＣ１７９の生殖系列レパートリーの出現は非常に限られていたため、これらの抗体が自己抗原を認識するかどうかを疑った。自己抗原マイクロアレイ20を用いて各種抗体の自己反応性を検討した。アレイには、それぞれ核抗原、細胞質抗原、膜抗原、ＤＮＡおよびＲＮＡ、細菌およびウイルス抗原、ＬＰＳおよびＥＢＮＡ１を含む１２３の自己抗原のパネルが含まれる。６種類の抗体を検査した。Ｃ１７９、Ｃ１７９生殖系列、Ｂ１１、ＮＳＰ２および２９（陰性対照）、ならびにＭ２１３９（マウス関節炎モデルに使用される抗ＩＩ型コラーゲン抗体21、陽性対照）。図６に示すように、Ｍ２１３９はコラーゲンＩＩ（Ｃｏｌ ＩＩ）に特異的に結合する（図６ＡとＣ）。インビボで許容される陰性対照としてのＮＳＰ２およびＮＳＰ２９とは対照的に、Ｃ１７９およびさらに顕著なＣ１７９生殖系列は複数の自己抗原に結合する（図６Ａおよび６Ｂ）。驚くべきことに、逃れたＢ１１抗体は自己抗原のパネルに結合しなかった（図６ＡとＢ）。Ｃ１７９の生殖系列抗体結合自己抗原は、補体関連因子、Ｊｏ－１、Ｋｕ、Ｌａ／ＳＳＢを含んでいた（図６Ｃ）。Ｃ１７９およびＣ１７９の生殖細胞系抗体は他反応性および自己反応性であると結論する。
Ｃ１７９とＣ１７９の生殖系列レパートリーの出現は非常に限られていたため、これらの抗体が自己抗原を認識するかどうかを疑った。自己抗原マイクロアレイ20を用いて各種抗体の自己反応性を検討した。アレイには、それぞれ核抗原、細胞質抗原、膜抗原、ＤＮＡおよびＲＮＡ、細菌およびウイルス抗原、ＬＰＳおよびＥＢＮＡ１を含む１２３の自己抗原のパネルが含まれる。６種類の抗体を検査した。Ｃ１７９、Ｃ１７９生殖系列、Ｂ１１、ＮＳＰ２および２９（陰性対照）、ならびにＭ２１３９（マウス関節炎モデルに使用される抗ＩＩ型コラーゲン抗体21、陽性対照）。図６に示すように、Ｍ２１３９はコラーゲンＩＩ（Ｃｏｌ ＩＩ）に特異的に結合する（図６ＡとＣ）。インビボで許容される陰性対照としてのＮＳＰ２およびＮＳＰ２９とは対照的に、Ｃ１７９およびさらに顕著なＣ１７９生殖系列は複数の自己抗原に結合する（図６Ａおよび６Ｂ）。驚くべきことに、逃れたＢ１１抗体は自己抗原のパネルに結合しなかった（図６ＡとＢ）。Ｃ１７９の生殖系列抗体結合自己抗原は、補体関連因子、Ｊｏ－１、Ｋｕ、Ｌａ／ＳＳＢを含んでいた（図６Ｃ）。Ｃ１７９およびＣ１７９の生殖細胞系抗体は他反応性および自己反応性であると結論する。
【0060】
［６］考察
ＨＡ－ステム領域を標的とするＢｎＡｂは集中的に研究され、その知見は普遍的なワクチン開発のための貴重な洞察を提供してきた。発明者らは、古典的なマウスＣ１７９ ｂｎＡｂを用いて、ＢＣＲマウス系統を作製し、Ｃ１７９抗体レパートリーがインビボで発達し、維持されるかどうかを理解した。発明者らの研究は、Ｃ１７９およびその祖先Ｃ１７９生殖系列レパートリーは多重反応性および自己反応性であり、インビボでのそれらの出現は耐性機構によって制限されることを明らかにした。Ｃ１７９の生殖系列抗体はより顕著な多得反応性／自己反応性と末梢Ｂ細胞の欠失を有しているので、Ｃ１７９のレパートリーは自己抗原を認識することから発生の当初から排除されるように思われる。今日まで、いくつかのヒトＣ１７９様ステム指向性ｂｎＡｂが単離され2、Ｃ１７９、ＦＩ６、ＣＲ９１１４、ＣＲ６２６１などのいくつかのｂｎＡｂｓのＡｇ－Ａｂ複合体構造が解明された22。これらの抗体は全て、ＨＡ１のＴｈｒ３１８およびＨｉｓ３８、ＨＡ２のＶａｌ１８、Ａｓｐ１９、Ｇｌｙ２０、Ｔｒｐ２１、Ｌｙｓ３８、Ｔｈｒ４１、Ｇｌｎ４２、Ｐｈｅ４５から構成される疎水性グルーブの共通構造エピトープに結合する。他のグループによる最近の研究も、この疎水性グルーブが共通の構造エピトープであるという概念を支持している23。それでは、重要な疑問は、これらのヒトｂｎＡｂｓは自己反応性だろうか、ということである。Ｂａｊｉｃらは、生化学アッセイを用いて、多重反応性および自己反応性について６種類のｂｎＡｂを検討した：ＭＤＩ８８５２、ＦＹ１（ＭＤＩ８８５２の祖先レパートリー）、ＦＩ６、ＣＲ９１１４、ＣＲ６２６１、および４１－５Ｅ４24。ＭＤＩ８８５２を除き、全てが多重反応性および自己反応性であることが判明した。これらのｂｎＡｂｓの個体発生のさらなるインビボの検証が必要である。これらのｂｎＡｂｓは通常インビボでの寛容機構により発生においてブロックされると仮定すると、非自己反応性ｂｎＡｂｓはマウスとヒトに存在するかどうかという疑問が生じる。
発明者らは、Ｈ２とＰＲ８の両方に結合する逃避Ｂ細胞クローンであるＢ１１を分離した。驚くべきことに、Ｈ２+ＰＲ８+Ｂ細胞クローンの大部分は、単一クローンに由来する同一クローンであった。このクローンは、Ｃ１７９重鎖と通常使用される別の軽鎖ＩＧＫＶ１２４６25から構成され、広範な中和活性を有するが、多重反応性または自己反応性は有さない。この軽鎖エディターＩＧＫＶ１２－４６は、Ｈ３のようなインフルエンザグループ２を含むＢ１１抗体の反応性の幅を決定し、Ｃ１７９自己反応性を非自己反応性に変換する。本実施例の結果はＢＣＲマウス系統を用いてｂｎＡｂがインビボで産生されるかどうかを問う最初のインフルエンザウイルス研究報告であるが、ＨＩＶの場合、多くのｂｎＡｂが単離され、４つのｂｎＡｂ ＢＣＲマウス系統がすでに作成されている：２Ｆ５、４Ｅ１０、ｇｌ３ＢＮＣ６０、およびｂ１２26、27、28、29、30、31。（ｇｌ３ＢＮ６０のレパートリーは、予測によって元の３ＢＮ６０ ｂｎＡｂから先祖の生殖細胞系クローンに変換された。）２Ｆ５および４Ｅ１０ ｂｎＡｂｓはｇｐ４１の膜近位外部領域（ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｐｒｏｘｉｍａｌ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ；ＭＰＥＲ）に結合し、ｂ１２および３ＢＮＣ６０はｇｐ１２０のＣＤ４結合部位に結合する。ｂ１２を除き、他の３系統のＢＣＲマウスは中枢性寛容によりＢ細胞の欠失とアネルギーを示した。アネルギー性の２Ｆ５および４Ｅ１０ Ｂ細胞は元の導入遺伝子を使用していたが、ｇｌ３ＢＮＣ６０ Ｂ細胞は内因性軽鎖を使用していた。これらの結果は、ＨＩＶ ｂｎＡｂもまた、複数の寛容機構によって制限され、従って、インビボで誘導し、維持することが困難であることが示された。しかし、ｂ１２ Ｂ細胞が出現し、広範な中和活性を示した。我々の報告と併せて、インビボにおける非自己反応性ＨＩＶおよびインフルエンザｂｎＡｂの存在は、インフルエンザＨＡステム領域を標的とする普遍的ワクチンの設計の実現可能性を強く支持する。
ＨＡ－ステム領域を標的とするＢｎＡｂは集中的に研究され、その知見は普遍的なワクチン開発のための貴重な洞察を提供してきた。発明者らは、古典的なマウスＣ１７９ ｂｎＡｂを用いて、ＢＣＲマウス系統を作製し、Ｃ１７９抗体レパートリーがインビボで発達し、維持されるかどうかを理解した。発明者らの研究は、Ｃ１７９およびその祖先Ｃ１７９生殖系列レパートリーは多重反応性および自己反応性であり、インビボでのそれらの出現は耐性機構によって制限されることを明らかにした。Ｃ１７９の生殖系列抗体はより顕著な多得反応性／自己反応性と末梢Ｂ細胞の欠失を有しているので、Ｃ１７９のレパートリーは自己抗原を認識することから発生の当初から排除されるように思われる。今日まで、いくつかのヒトＣ１７９様ステム指向性ｂｎＡｂが単離され2、Ｃ１７９、ＦＩ６、ＣＲ９１１４、ＣＲ６２６１などのいくつかのｂｎＡｂｓのＡｇ－Ａｂ複合体構造が解明された22。これらの抗体は全て、ＨＡ１のＴｈｒ３１８およびＨｉｓ３８、ＨＡ２のＶａｌ１８、Ａｓｐ１９、Ｇｌｙ２０、Ｔｒｐ２１、Ｌｙｓ３８、Ｔｈｒ４１、Ｇｌｎ４２、Ｐｈｅ４５から構成される疎水性グルーブの共通構造エピトープに結合する。他のグループによる最近の研究も、この疎水性グルーブが共通の構造エピトープであるという概念を支持している23。それでは、重要な疑問は、これらのヒトｂｎＡｂｓは自己反応性だろうか、ということである。Ｂａｊｉｃらは、生化学アッセイを用いて、多重反応性および自己反応性について６種類のｂｎＡｂを検討した：ＭＤＩ８８５２、ＦＹ１（ＭＤＩ８８５２の祖先レパートリー）、ＦＩ６、ＣＲ９１１４、ＣＲ６２６１、および４１－５Ｅ４24。ＭＤＩ８８５２を除き、全てが多重反応性および自己反応性であることが判明した。これらのｂｎＡｂｓの個体発生のさらなるインビボの検証が必要である。これらのｂｎＡｂｓは通常インビボでの寛容機構により発生においてブロックされると仮定すると、非自己反応性ｂｎＡｂｓはマウスとヒトに存在するかどうかという疑問が生じる。
発明者らは、Ｈ２とＰＲ８の両方に結合する逃避Ｂ細胞クローンであるＢ１１を分離した。驚くべきことに、Ｈ２+ＰＲ８+Ｂ細胞クローンの大部分は、単一クローンに由来する同一クローンであった。このクローンは、Ｃ１７９重鎖と通常使用される別の軽鎖ＩＧＫＶ１２４６25から構成され、広範な中和活性を有するが、多重反応性または自己反応性は有さない。この軽鎖エディターＩＧＫＶ１２－４６は、Ｈ３のようなインフルエンザグループ２を含むＢ１１抗体の反応性の幅を決定し、Ｃ１７９自己反応性を非自己反応性に変換する。本実施例の結果はＢＣＲマウス系統を用いてｂｎＡｂがインビボで産生されるかどうかを問う最初のインフルエンザウイルス研究報告であるが、ＨＩＶの場合、多くのｂｎＡｂが単離され、４つのｂｎＡｂ ＢＣＲマウス系統がすでに作成されている：２Ｆ５、４Ｅ１０、ｇｌ３ＢＮＣ６０、およびｂ１２26、27、28、29、30、31。（ｇｌ３ＢＮ６０のレパートリーは、予測によって元の３ＢＮ６０ ｂｎＡｂから先祖の生殖細胞系クローンに変換された。）２Ｆ５および４Ｅ１０ ｂｎＡｂｓはｇｐ４１の膜近位外部領域（ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｐｒｏｘｉｍａｌ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ；ＭＰＥＲ）に結合し、ｂ１２および３ＢＮＣ６０はｇｐ１２０のＣＤ４結合部位に結合する。ｂ１２を除き、他の３系統のＢＣＲマウスは中枢性寛容によりＢ細胞の欠失とアネルギーを示した。アネルギー性の２Ｆ５および４Ｅ１０ Ｂ細胞は元の導入遺伝子を使用していたが、ｇｌ３ＢＮＣ６０ Ｂ細胞は内因性軽鎖を使用していた。これらの結果は、ＨＩＶ ｂｎＡｂもまた、複数の寛容機構によって制限され、従って、インビボで誘導し、維持することが困難であることが示された。しかし、ｂ１２ Ｂ細胞が出現し、広範な中和活性を示した。我々の報告と併せて、インビボにおける非自己反応性ＨＩＶおよびインフルエンザｂｎＡｂの存在は、インフルエンザＨＡステム領域を標的とする普遍的ワクチンの設計の実現可能性を強く支持する。
【0061】
このような普遍的インフルエンザワクチンはどのように設計できるか？ＨＩＶに対する普遍的なワクチン開発が進んでいる。いわゆる抗体系列ベースのワクチンデザインと呼ばれる逐次免疫プロトコルが開発中である32。この戦略の背後にあるアイデアは、次の２つの観察から導かれる：（１）ＨＩＶ ｂｎＡｂレパートリーは高度に変異しており、これはおそらくＨＩＶ抗原への連続的な暴露と胚中心への繰り返しのＢ細胞の侵入によるものと思われること、および（２）ｂｎＡｂ抗体レパートリーの生殖系列変換は、抗原的にドリフトされたウイルスに対する親和性の喪失をもたらすこと。系列ベースのワクチンでは、生殖系列Ａｂ感受性からｂｎＡｂ感受性へのＨＩＶ抗原の段階的に一連の改変の後、この一連の抗原で順次免疫する。このアイデアは、抗体応答は元のウイルス抗原に対する応答からドリフト抗原に対する応答へと徐々に変化するという考え方である。現在実施されているヒト臨床試験は、このアプローチの妥当性を我々に通知するであろう。
【0062】
インフルエンザｂｎＡｂレパートリーはＨＩＶのように高度に変異していないため33,34,35,36、普遍的なインフルエンザワクチンの開発は、このような複雑なワクチン改変戦略を必要としない可能性がある。興味深いことに、ＭｃＧｕｉｒｅらは、多量体化ＨＩＶ Ｅｎｖ免疫原が、野生型マウス由来のナイーブＢ細胞ならびにｂｎＡｂ ＢＣＲマウス系統由来のＢ細胞を活性化できることを報告した37。これらの観察に基づいて、効果的な抗原を設計できれば、１回のワクチン接種によってｂｎＡｂを誘導することが可能であるはずである。Ｗｉｌｓｏｎらは、ヘッドレスＨＡを作製し、マトリックス－ＭTM 38と呼ばれる新たに開発されたアジュバントの存在下でステム領域を標的とするｂｎＡｂｓの誘導に成功した。このアジュバントは、樹木Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａに由来するサポニンからなる免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）技術に基づいている39,40。同時に、Ｙａｓｓｉｎｅらは、モノホスホリルリピッドＡ－合成トレハロースジコリノミコレートアジュバント［Ｓｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＳＡＳ）］の存在下でウイルス様粒子（ＶＬＰ）中の多量体ヘッドレスＨＡは、種々のインフルエンザ株に対する交差反応性Ａｂを誘発し得ることを報告したが、これらの抗体は直接的なウイルス中和活性を有していなかった41。両群とも、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介したウイルス感染からの防御を示した。ＨＡのステム領域のみで免疫すると、ＨＡ頭部の正常な免疫優位を回避することにより、この領域のエピトープ応答を歪めることができる42。しかしながら、ｂｎＡｂｓが標的とする特異的領域は、前述の疎水性グルーブの共通の構造エピトープのように狭い領域である。この領域の最小で安定な抗原エピトープを設計するのは難しいが、疎水性グルーブ領域からなる最小エピトープを設計するのが理想的であろう。また、いくつかのアジュバントは、耐性を破壊することによりｂｎＡｂを誘導するのを助けるかもしれない43。全体として、抗原のデザインに加えて、抗原の多量体化およびアジュバントの選択はｂｎＡｂｓの誘導の鍵となる可能性がある。
【0063】
【表3】
【0064】
配列表：
配列番号１３３：Ｃ１７９クローンの重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１３４：Ｃ１７９クローンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１３５：Ｃ１７９生殖系列の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１３６：Ｃ１７９生殖系列の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１３７：１２－４６生殖系列の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１３８：Ｂ１１クローンの重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１３９：Ｂ１１クローンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１４０：Ｂ１１クローンの重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１４１：Ｂ１１クローンの重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１４２：Ｂ１１クローンの重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１４３：Ｂ１１クローンの軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１４４：Ｂ１１クローンの軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１４５：Ｂ１１クローンの軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１３３：Ｃ１７９クローンの重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１３４：Ｃ１７９クローンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１３５：Ｃ１７９生殖系列の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１３６：Ｃ１７９生殖系列の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１３７：１２－４６生殖系列の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１３８：Ｂ１１クローンの重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１３９：Ｂ１１クローンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１４０：Ｂ１１クローンの重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１４１：Ｂ１１クローンの重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１４２：Ｂ１１クローンの重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１４３：Ｂ１１クローンの軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１４４：Ｂ１１クローンの軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１４５：Ｂ１１クローンの軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
【0065】
参照文献
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】