(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-26
(45)【発行日】2024-10-04
(54)【発明の名称】連続細胞保持条件下におけるバイオリアクタ中でのメタン化法
(51)【国際特許分類】
C12P 5/00 20060101AFI20240927BHJP
【ＦＩ】
C12P5/00
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2021561767
(86)(22)【出願日】2020-04-20
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-27
(86)【国際出願番号】 EP2020060979
(87)【国際公開番号】W WO2020212621
(87)【国際公開日】2020-10-22
【審査請求日】2022-06-06
(31)【優先権主張番号】102019110387.8
(32)【優先日】2019-04-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】DE
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】521190406
【氏名又は名称】エレクトロハエア・ゲーエムベーハー
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】イムコ・ガストラ
(72)【発明者】
【氏名】マニュエル・ホエル
(72)【発明者】
【氏名】ローラン・ラードン
(72)【発明者】
【氏名】ドリス・ハーフェンブラドル
(72)【発明者】
【氏名】フェリクス・ポップ
(72)【発明者】
【氏名】ミッヒ・ハイン
(72)【発明者】
【氏名】ハンス・クヌーセン
(72)【発明者】
【氏名】ジェフ・フォルネロ
【審査官】田名部 拓也
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１１／００３０８１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１４／０７６０６２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１２／０９４５３８（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｐ １／００－ ４１／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
メタン生成段階においてバイオリアクタ内のメタン生成微生物によりＨ２及びＣＯ２をメタンに変換する方法であって、以下のステップ：ｉ． 連続工程においてミネラルを含む液体培養培地中で前記メタン生成微生物を培養するステップ、
ｉｉ． 細胞保持条件下において前記メタン生成微生物を培養するステップ、
ｉｉｉ． 前記メタン生成微生物を、細胞保持条件下でＣＯ２及びＨ２を含む少なくとも１つの供給ガスと接触させ、窒素源の供給を減少させるステップ、
ｉｖ． 前記バイオリアクタから前記培養培地中の代謝水を連続的に除去するステップ、
ｖ． メタン又はメタン富化ガス組成物を収集するステップ
を含み、
前記保持が、限外濾過により実現される、
方法。
【請求項2】
前記メタン生成微生物を培養するステップ（ｉｉ）が、以下：－ ０，２ｍｏＬ／Ｌ／日～０ｍｏＬ／Ｌ／日、又は０，０２ｍｏＬ／Ｌ／日～０，００５ｍｏＬ／Ｌ／日の量の前記培養培地中の窒素源を受け取るように、前記メタン生成段階における窒素源の供給を制御及び低減すること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記メタン生成微生物を培養するステップ（ｉｉ）が、以下：０，１１ｍｏＬ／Ｌ／日～０，００５ｍｏＬ／Ｌ／日の量の前記培養培地中の窒素源を受け取るように、前記メタン生成段階における窒素源の供給を制御及び低減すること
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記メタン生成微生物を培養するステップ（ｉｉ）が、以下：－ 硫化物源を提供すること、
－ 培養条件を、嫌気性又は通性嫌気性条件に保つこと、
－ 場合により、培養物を撹拌すること、
－ 温度を３２℃～８５℃の範囲に維持すること
を更に含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記硫化物源が、Ｎａ２Ｓの形態である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記メタン生成微生物を培養するステップ（ｉｉ）が、前記メタン生成段階の前に、以下のステップ：－ 前記培養培地内の窒素源の濃度を、前記窒素源を前記培養培地に供給することによって、０．２ｍｏＬ／Ｌ／日～０．００５ｍｏＬ／Ｌ／日の範囲に制御及び調節するステップ、
－ それぞれ、少なくとも１，９～最大２００まで、又は少なくとも２０～最大１２０までのＯＤ６１０として測定された前記培養培地中における密度まで前記メタン生成微生物を培養するステップ
を含む、細胞増殖段階を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記メタン生成微生物を培養するステップ（ｉｉ）が、前記メタン生成段階の前に、以下のステップ：－ 前記メタン生成微生物の細胞分裂及び細胞増殖を可能にするために、前記培養培地内の窒素源の濃度を、前記窒素源を前記培養培地に供給することによって、０．０２ｍｏＬ／Ｌ／日～０．０１ｍｏＬ／Ｌ／日の範囲に制御及び調節するステップ、
－ 少なくとも６０～最大１００までであるＯＤ６１０であって、それぞれ、少なくとも０．５ｇ／Ｌ～最大５０ｇ／Ｌまで、又は少なくとも６．５ｇ／Ｌ～最大３１．３ｇ／Ｌまで、又は少なくとも１８．３ｇ／Ｌ～最大２６．１ｇ／Ｌまでの培養物中の前記微生物の乾燥重量に対応する、ＯＤ６１０として測定された前記培養培地中における密度まで前記メタン生成微生物を培養するステップ
を含む、細胞増殖段階を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記窒素源が、アンモニウム化合物から選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記窒素源が、ＮＨ４ＯＨ若しくはＮＨ４Ｃｌ又はそれらの組合せから選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
初期ｐＨ値をｐＨ９未満、ｐＨ８未満又はｐＨ７の所与の値に設定するステップ、及び、その後の前記ｐＨ値を連続的に制御するステップを更に含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記代謝水の前記除去が、前記培養培地から過剰水を濾過するステップを含み、及び／又は前記培養培地から過剰水を蒸発させるステップを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記培養培地から過剰水を濾過するステップが、前記培養培地と接触する水についての少なくとも１つの半透膜を用いる逆浸透により実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
過剰水を濾過する前記ステップが、以下のステップ：－ 前記培養培地と接触している少なくとも１つの多孔質膜を通して濾過することによって、前記バイオリアクタから無細胞培養培地の画分を除去するステップ、及び
－ 場合により、続いて、前記除去された培養培地から前記ミネラルを濃縮するステップ、及び
－ 場合により、前記濃縮されたミネラルを前記バイオリアクタへと少なくとも部分的に再利用するステップ
を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
前記培養培地と接触している前記少なくとも１つの多孔質膜が、０．４～０．１μｍの孔径を有し；前記ミネラルが、ナノ濾過、限外濾過から選択される少なくとも１つの更なる濾過ステップによって、及び／又は少なくとも１つの蒸留ステップによって、前記除去された培養培地から濃縮される、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記培養培地と接触している前記少なくとも１つの多孔質膜が、０．３μｍの孔径を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
ミネラルを追加的に添加することによって、前記培養培地中の前記ミネラルの少なくとも１つの実体の濃度を制御し、場合により調節するステップを更に含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
少なくとも１つのメタン生成微生物が、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノブレビバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）、メタノサーモバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ）、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノサルシナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノフィラス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）又はこれらの混合物を含む、古細菌（Ａｒｃｈａｅａ又はａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）の群から選択される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
細胞保持条件下での前記メタン生成段階において、前記バイオリアクタ中の前記メタン生成微生物全体の少なくとも６０％又は８０％超が、５：１～３：１の長さ対幅の比を有する、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、メタン生成段階の窒素供給を低減した条件下であっても、バイオリアクタ中のメタン生成微生物によるＨ２及びＣＯ２を用いて生物起源メタンを生成する高効率な方法に関する。
【背景技術】
【0002】
メタンは、化石燃料の中で炭素原子当たりのエネルギー密度が最も高く、酸素の存在下における燃焼によって、または燃料電池を用いて電気を生成することによって直接得られるいかなる他の天然ガスよりも、エネルギー変換の潜在能力がはるかに高い。メタンのエネルギー発生の可能性は世界市場においてますます重要になってきている。
【0003】
したがって、天然ガスとして、メタンは持続可能かつ再生可能なエネルギー源を構成し、今日では既に石炭及び他の化石燃料をますます代替している。
【0004】
したがって、最近の研究は、二酸化炭素及び水素から非常に効率的にメタンを生成することができるメタン生成菌、例えばＡｒｃｈａｅａによる、メタンを生成する方法の開発及び改善に焦点を当てている。現在、最新技術は、メタン生成微生物を使用することによって生成されたメタンでガス組成物を富化するための、いくつかの試みについて記載している。Ａｒｃｈａｅａ、例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕ株であるＵＣ １２０９１０（ＥＣＨ１００またはＥＣＨ０１００）を用いたメタンの工業的生成のため、蓄積され市販されているものを定期的に使用してもよい。
【0005】
バイオメタン生成を、確立されたスケーラブルかつ信頼性の高い再生可能エネルギー源へとアップグレードすることは、特に連続工程の必要性のために、依然として課題であることが判明している。
【0006】
バイオリアクタ内において、メタン生成微生物を用いる水素の培養物は、以下のようにメタン化反応を触媒する：
ＣＯ２＋４Ｈ２－－－－－－－＞ＣＨ４＋２Ｈ２Ｏ（式１）
ＣＯ２＋４Ｈ２－－－－－－－＞ＣＨ４＋２Ｈ２Ｏ（式１）
【0007】
「代謝水」または「遊離水」とも呼ばれるこのメタン化工程（式１参照）によって生成された水は、バイオリアクタ中の一定の液体レベルを維持し、液量の増加に起因するバイオリアクタのオーバーフローを防止するために、下水道のメタン化工程中に連続的に排出されなければならない。したがって、この排出された水では、メタン生成微生物を維持し、効果的なメタン化を可能にするために重要なミネラル／栄養素（塩、イオン、微量栄養素）のような培地成分もまた失われる。代謝水の生成に関連する別の問題は、培養培地内の培地成分の希釈である。メタン生成生物は、増殖し、それら自体を維持するために一定の培地濃度を必要とするので、従来技術の濃縮培地保存溶液は、通常のメタン化速度を保証するためには連続して面倒な添加をしなければならない。新鮮な培地保存液のこの連続的な添加は工程の運転コストの重大な有害部分である。
【0008】
培地損失をなくす１つの方法は、希釈した排出水から化学成分を回収し再利用することである。一般に、バイオテクノロジープロセスのための培地回収システムは、充分には研究されていない。例えば、繊維状のグラム陰性シアノバクテリアであるＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ（Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）の生成／収穫については、培地回収戦略が知られている（Ｍｏｒｏｃｈｏ－Ｊａｃｏｍｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。この戦略は、培養培地からＡ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓを除去し、元の無細胞培養培地を再使用する、異なるフィルタの複雑なカスケードからなる。しかしながら、Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓは代謝水を生成せず、したがってその増殖培地を希釈しない。したがって、この従来技術では、排出水中のミネラルを濃縮する必要がない。
過剰水を除去するためのいくつかの技術が存在する。周知の技術は蒸留であり、蒸発によって過剰水を除去することができる。水を除去するためのより最近の技術は、逆浸透（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｏｓｍｏｓｉｓ：ＲＯ）である。ＲＯを用いると、溶解した化合物を、高圧及びナノサイズの膜を用いることによって、水から除去することができる。
過剰水を除去するためのいくつかの技術が存在する。周知の技術は蒸留であり、蒸発によって過剰水を除去することができる。水を除去するためのより最近の技術は、逆浸透（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｏｓｍｏｓｉｓ：ＲＯ）である。ＲＯを用いると、溶解した化合物を、高圧及びナノサイズの膜を用いることによって、水から除去することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【文献】Ｍｏｒｏｃｈｏ－Ｊａｃｏｍｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５
【発明の概要】
【0010】
したがって、本発明の目的は、記載された最新技術の欠点を克服すること、特に、メタン富化ガス組成物のためのスケーラブルで信頼性のある連続生成工程を提供することである。
【0011】
本出願の目的は、本発明の請求項１に明記されているような新規に開発された方法によって解決された。
【0012】
特に、記載した目的を達成するための、メタン生成段階においてバイオリアクタ内のメタン生成微生物によりＨ２及びＣＯ２をメタンに変換する方法であって、以下のステップ：
ｉ．連続工程においてミネラルを含む好適な液体培養培地中でメタン生成微生物を培養するステップと、
ｉｉ．細胞保持条件下においてメタン生成微生物を培養するステップと、
ｉｉｉ．メタン生成微生物を、ＣＯ２及びＨ２を含む少なくとも１つの供給ガスと接触させるステップと、
ｉｖ．バイオリアクタから培養培地中の代謝水を連続的に除去するステップと、
ｖ．メタンまたはメタン富化ガス組成物を収集するステップと
を含む、方法が、提供される。
ｉ．連続工程においてミネラルを含む好適な液体培養培地中でメタン生成微生物を培養するステップと、
ｉｉ．細胞保持条件下においてメタン生成微生物を培養するステップと、
ｉｉｉ．メタン生成微生物を、ＣＯ２及びＨ２を含む少なくとも１つの供給ガスと接触させるステップと、
ｉｖ．バイオリアクタから培養培地中の代謝水を連続的に除去するステップと、
ｖ．メタンまたはメタン富化ガス組成物を収集するステップと
を含む、方法が、提供される。
【0013】
本発明の方法は、メタン生成Ａｒｃｈａｅａを培養するステップを含み、このステップは、以前に記載され、医師に知られている、Ａｒｃｈａｅａの典型的な培養条件に基づく。そのような条件は、温度、圧力、体積、湿度、塩含有量、導電率、炭素含有量、窒素含有量、ビタミン含有量、アミノ酸含有量、ミネラル含有量、またはこれらいずれかの組合せを含む、培養物に影響する一般的なパラメータによって、医師の技能に従って影響及び制御される。
【0014】
本発明によれば、バイオリアクタ中でＣＯ２及びＨ２含有ガス（１種）またはガス（複数種）からメタンを生成する方法においてメタン生成微生物を培養するステップは、例えば窒素源及び塩などの好適なミネラルまたは栄養素を提供する好適な液体培養培地中に該メタン生成微生物を保持することを含む。
【0015】
ＣＯ２及びＨ２は、例えば、純粋なガスとして適用され得る。ＣＯ２はまた、または代替的に、工業用ガスの供給を用いて送達されてもよい。そのような工業用ガスは、その供給源に応じて、極めて異なるガス組成を含んでもよい。それらは、空気と比較して、比較的多量のＣＯ２を含有するという点で主に共通している。それらは通常の（空気様の）部分量の酸素及び／または窒素を含有し得るが、しかしながら、それらの起源に応じて、酸素を含まなくてもよい。更に、それらは、以下の、具体的には一酸化炭素、水素及び硫化水素、他の硫黄化合物（スルフィド、ジスルフィド、チオール）、シロキサン（有機ケイ素化合物）、ハロゲン化化合物、アンモニア、ならびに有機塩素、すなわち農薬及び塩素化芳香族分子を有する他の合成有機化合物のうち、少なくとも１つの実質的な量を含有し得る。
【0016】
本発明にかかる新規の示唆された細胞保持ステップがなければ、または、すなわち従来技術の古典的な培養方法では、かなりの数の細胞がバイオリアクタから連続的に流出し、これらの細胞は、細胞分裂及び細胞増殖の更なるサイクルによって置き換えられなければならず、したがって、目的のメタン出力の生成のためでなく細胞の生成及び増殖のためのＣＯ２及びＨ２の利用によって置き換えられなければならず、これは、システムの効率にとって好ましくない。あるいは、及び／または更に、流出した量を補償するのに充分な量の新規のメタン生成微生物を供給する選択肢があり得る。
【0017】
本発明の発明者らは、有利かつ驚くべきことに、細胞保持条件下においてバイオリアクタを運転することによって、ＣＯ２及びＨ２の供給が本質的にメタン生成に使用されるので、この条件がシステムの全体的な効率を高めることを見出した。このシステムの有効性は、細胞保持条件を適用しない同等の実験よりも、３０％以上、または好ましくは５０％以上であることが観察された。この有効性の計算に含まれる工程は、全体的なメタン化率を増加させながらの、コストの削減、栄養素の節約である。
【0018】
本発明によれば、本発明の意味における「段階」とは、本発明のバイオリアクタ中のメタン生成微生物の状態または状況を説明する。これは、メタン生成微生物に適用される特定の発酵条件、例えば、水素と二酸化炭素の分圧の比、または少なくとも１つの栄養素の特定の値もしくは範囲によって特徴付けられ、例えば、細胞をリアクタ中で保持（細胞保持）するか否かのアンモニウム及び／またはバイオリアクタの設定に適用される。
【0019】
本発明にかかる「細胞増殖段階」とは、細胞分裂及び細胞増殖によるメタン生成微生物のバイオマスの増加を主に特徴とする段階である。本発明にかかる「メタン生成段階」とは、細胞分裂及び細胞増殖よりも、メタン生成を主に特徴とする段階である。しかしながら、任意の細胞増殖段階の間、細胞はメタンを生成してもしなくてもよく、任意のメタン生成段階の間、バイオマス全体もまた増加し得る。
【0020】
本発明によれば、「細胞保持条件」という用語は、細胞、すなわちメタン生成微生物がバイオリアクタ内に保持されるか、または再利用されてバイオリアクタ中に再導入されることを可能にし、これを保証する、稼働中のバイオリアクタ中の条件を指す。連続工程で稼働中のバイオリアクタにおいてそのような細胞保持条件を可能にする多くの方法が可能であり、当業者は容易にアクセス可能である。
【0021】
増殖段階及び／またはメタン生成段階は、細胞保持条件下において細胞を培養することによって実施され得る。また、本発明にかかる細胞保持条件下における段階は、細胞無保持条件下において細胞を培養することによって行われる増殖段階またはメタン生成段階によって、交互に片方または両方で交互に隣接しすることも可能である。本発明にかかる「細胞無保持条件下における細胞の培養」とは、細胞、すなわちメタン生成微生物がバイオリアクタ内に保持されることを可能にせず、かつこれを保証しない、すなわち、メタン生成微生物がこの段階の間にバイオリアクタから流出するであろう、稼働中であるバイオリアクタ中の状態を意味する。
【0022】
本出願の文脈において、メタン化、またはメタン生成もしくはバイオメタン化とは、以下に記載される本発明を実施するのに好適なメタン生成微生物のリストに含まれるものなどのメタン生成微生物によって実施される、メタンまたはメタン富化ガス組成物の生成として理解される。
【0023】
特に、従来から知られており、本発明によれば好適なメタン化反応は、Ｈ２とＣＯ２とを４：１の化学量論で消費する（上記式１参照）。
【0024】
本発明によれば、メタン生成微生物は、バイオメタンを生成するためにバイオリアクタ中で培養される。そのようなメタン生成微生物または独立栄養性メタン生成微生物は、嫌気性Ａｒｃｈａｅａ、または最近分類された耐気性Ａｒｃｈａｅａであってもよく、純粋な株、または複数の、すなわち２つ以上の株とのコンソーシア、またはメタン化が異種間の栄養共生的（ｓｙｎｔｒｏｐｈｉｃ）交換によっても促進され得る混合培養物のいずれかであってもよい。
【0025】
本発明の理解において、「バイオリアクタ」とは、リアクタを表し、バイオ反応容器、またはバイオ反応エンクロージャ、またはバイオ反応タンク、及び／または少なくともバイオ反応チャンバ、及び／またはセル、またはこれらの組合せのいずれかであって、また、最新技術で意図されるように、とりわけ例えば温度及び／または圧力の変化に耐えることができ、及び／または、例えば温度及び／または圧力が反応工程の前、後または最中に割り当てられているか、または維持されなければならない、いずれかの付与された値を維持することができ、ここで、本発明の実施に関連する意図された反応が行われてもよい。そのような反応は、微生物が関与する反応の分域に関連し、本明細書においてそれらの通常の生理学（例えば、代謝発酵、または好気性もしくは嫌気性の消化など）に言及し、そのため、好適な環境、好適な微生物の培養物、好適な培養培地及び適切な反応物が生じることを必要とするため、バイオ反応として理解される。本発明の意味におけるバイオリアクタは、開示された方法を可能にするために各変数の許容差の値内で確実に機能し、そして列挙されたステップを確実に経時的に実行することができると予想される。
【0026】
メタン生成微生物を培養するための好適なリアクタは、ほんの一例として、振盪タンク型バイオリアクタ、連続撹拌型タンクバイオリアクタ、間欠式撹拌型タンクバイオリアクタ、中空繊維膜型バイオリアクタ、気泡塔型バイオリアクタ、内部ループエアリフト型バイオリアクタ、外部ループエアリフト型バイオリアクタ、流動床型バイオリアクタ、充填床型バイオリアクタ、光バイオリアクタ、トリクルベッド型リアクタ、微生物電気分解セル等、及び／またはこれらの組合せであってもよい。
【0027】
バイオリアクタの動作モードは、バッチ工程、フェドバッチ工程及び連続工程に分類される。本明細書に提示される方法の異なる実施形態によれば、培養物の特定の動態またはメタンがここで抽出される利便性に最も密接に対処するリアクタを選択することができる。本発明の一実施形態では、気泡塔型リアクタ、もしくはエアリフト型バイオリアクタ、もしくは連続撹拌タンク型リアクタなどのその変形型、及び／または上記のいずれかを使用して、記載された方法を簡便に実行することができ、連続培養が好ましい。ここでは、栄養素、代謝産物、細胞数及びバイオマスの変動がほとんどない、ほぼ均衡した増殖が観察される。
【0028】
本発明によれば、本明細書に開示される方法は、「連続工程」におけるメタン生成微生物の培養に関する。ここで、このような連続性は、メタンの生成において連続性、及び培養において連続性であるとして理解され、コロニーの活性メンバーから不活性末端バイオマスを分離するステップは必要とされない。代わりに、該バイオマスまたはバイオ材料が活性培養のための更なる基質を提供し、栄養の利用可能性を高めることが有利であることが判明しているので、死んだバイオ材料を、いくつかの増殖の段階にわたって活性メンバーと共にリアクタ中で保持することが推奨される。メタン生成及び培養のこのような連続性の理解にはまた、好適な反応物（例えば、供給ガスなど）の連続的な供給が培養物に行われることで、培養物全体及びリアクタの動作段階中のメタン生成活性の任意のサイクルから得られた生成メタンの測定量（すなわち、メタンの収率）を有意に変更することなく、そのメタン生成タスクの実行を可能にするという理解も含まれる。
【0029】
連続的なメタン生成を確実にすることは、本発明の関連する特性あり、記載された方法のステップを実施する有利な効果である。本発明によれば、メタンは、単一の株または混合培養物からメタン生成Ａｒｃｈａｅａによって産生される。ここで、混合培養物は、複数の、したがって２つ以上の株もまた使用され得る培養物、もしくは複数の追加の種がメタン生成Ａｒｃｈａｅａと相互作用する培養物、またはこれらの任意の組合せのいずれかである。
【0030】
更に、培養培地から過剰水分及び／または過剰な代謝水もしくはいわゆる遊離水を、定期的または連続的に除去し、それによって、培地中の栄養素の正確な希釈及び／または分散を確実にすることは、本発明による方法の有利なステップである。本発明にかかる「代謝水」とは、代謝活性中及びメタン生成の工程中、すなわち主にメタン生成段階において、メタン生成生物によって生成される、水またはＨ２Ｏ分子を指す。
【0031】
ステップｉｖ．における本発明の方法の代替的な実施形態によれば、バイオリアクタからの培養培地中の代謝水の除去は、連続的に行われる代わりに、特定の時点で不連続的に行われる。
【0032】
本発明の方法の更なる実施形態によれば、ステップｉは、以下の段階：
少なくとも１種のミネラル供給の減少を含む、培養培地を含有する好適な液体ミネラルでの連続工程における第１段階；続いて、
培養培地をリフレッシュすることを特徴とする第２段階；
場合により、続いて、少なくとも１種のミネラル供給の減少を含む、連続工程における第３段階
による、メタン生成微生物を培養する少なくとも１サイクルを含む。
少なくとも１種のミネラル供給の減少を含む、培養培地を含有する好適な液体ミネラルでの連続工程における第１段階；続いて、
培養培地をリフレッシュすることを特徴とする第２段階；
場合により、続いて、少なくとも１種のミネラル供給の減少を含む、連続工程における第３段階
による、メタン生成微生物を培養する少なくとも１サイクルを含む。
【0033】
第１段階及び／または第３段階中の本発明の条件にかかる「少なくとも１つのミネラル」とは、古典的な細胞培養培地、例えば、窒素源及び／または塩に存在する、典型的なミネラルを指す。一実施形態によれば、「少なくとも１つのミネラル」とは、窒素源である。別の実施形態によれば、「少なくとも１つのミネラル」とは、塩、例えば塩化物含有塩である。塩化物は、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ、ＫＣｌ、ＮＨ４Ｃｌ、または当業者に周知である任意の他の好適な塩化物塩のアニオンとして、生理食塩水として溶解した塩中にそれぞれ存在することができる。供給が減少する「少なくとも１つのミネラル」とは、第１段階及び第３段階において、同じであっても異なっていてもよい。第２段階中の本発明にかかる「培養培地のリフレッシュ」とは、細胞培養培地を少なくとも部分的に変更することによって、または細胞分裂及び細胞増殖を引き起こす少なくとも１つの栄養素を添加することによって、実現することができる。細胞増殖及び細胞分裂を引き起こす栄養素は、当業者に周知であり、窒素源、硫黄源、亜リン酸及び細胞増殖因子の添加または増加を含む。培養培地のリフレッシュのための記載された選択肢の組合せもまた、本発明にかかる可能な選択肢である。この第２段階は、場合により、続いて第３段階を行うことができる。ここで、細胞は、少なくとも１つのミネラルの供給が減少した連続工程で再び培養される。次いで、第２段階は、少なくとも１回のサイクル内の連続工程において、２つの段階間に隣接する移行段階である。そのような「培養培地のリフレッシュ」とは、少なくとも１日、または少なくとも１日～５日間、または少なくとも１日～４日間、少なくとも１日～３日間にわたって、毎月、半年毎に適用することができるが、必ずしもそうとは限らない。
【0034】
本発明の一実施形態によれば、連続工程における培養した細胞の必要性及び細胞による栄養素の消費に応じて、追加の栄養素が細胞培養培地へと連続的に供給される。
【0035】
本発明の方法の別の実施形態によれば、ステップｉｉ．は、以下の段階：
細胞保持条件下における第４段階；続いて、
細胞無保持条件下における細胞の培養を特徴とする、第５段階；
場合により、続いて、細胞保持条件下における第６段階
による、メタン生成微生物を培養する少なくとも１サイクルを含む。
細胞保持条件下における第４段階；続いて、
細胞無保持条件下における細胞の培養を特徴とする、第５段階；
場合により、続いて、細胞保持条件下における第６段階
による、メタン生成微生物を培養する少なくとも１サイクルを含む。
【0036】
第５段階における本発明にかかる「細胞無保持条件下における細胞の培養」とは、細胞、すなわちメタン生成微生物がバイオリアクタ内に保持されることを可能にせず、かつこれを保証しない、すなわち、メタン生成微生物がこの段階の間にバイオリアクタから流出するであろう、稼働中であるバイオリアクタ中の条件を指す。この第５段階は、場合により、続いて第６段階を行うことができる。ここで、細胞は、細胞保持条件下において再び培養される。そして、第５段階は、少なくとも１回のサイクル中の細胞保持条件下における２段階間の移行段階である。
【0037】
本発明の発明者らは、そのような細胞無保持条件下においてメタン生成微生物を培養することが、リアクタの特定の運転時間において有利であり得ることを見出した。このような細胞無保持条件下におけるこの段階は、細胞分裂及び細胞増殖を促進することができ、これは、全体的なメタン化工程効率に正の効果を及ぼし得る。そのような無保持条件とは、少なくとも１日、または少なくとも１日～５日間、または少なくとも１日～４日間、少なくとも１日～３日間にわたって、毎月、半年毎に適用することができるが、必ずしもそうとは限らない。
【0038】
本方法内の本発明の別の実施形態によれば、メタン生成生物を培養するステップは、以下：
培養培地中の窒素源濃度が、０．２ｍｏＬ／Ｌ／日～０ｍｏＬ／Ｌ／日の量、または０．０２ｍｏＬ／Ｌ／日～０．００５ｍｏＬ／Ｌ／日の量、好ましくは０．１１ｍｏＬ／Ｌ／日～０．００５ｍｏＬ／Ｌ／日の量となるように、メタン生成段階における窒素源の供給を制御及び低減すること、を含む。
培養培地中の窒素源濃度が、０．２ｍｏＬ／Ｌ／日～０ｍｏＬ／Ｌ／日の量、または０．０２ｍｏＬ／Ｌ／日～０．００５ｍｏＬ／Ｌ／日の量、好ましくは０．１１ｍｏＬ／Ｌ／日～０．００５ｍｏＬ／Ｌ／日の量となるように、メタン生成段階における窒素源の供給を制御及び低減すること、を含む。
【0039】
メタン生成微生物は一般的に窒素源を必要とし、したがって、全ての公開された先行技術文献では、いずれかの方法における窒素の供給について記載している。にもかかわらず、本発明の発明者らは、驚くべきことに、本発明にかかる細胞保持条件下においてメタン生成微生物を培養することによって、安定し維持された細胞培養数が観察される一方で、メタン生成段階における窒素源の供給を大幅に減少させるか、または更には完全に停止し、依然として高く非常に安定化されたメタン化率を可能とすることができることを見出した。場合により、メタン化工程が顕著になり、細胞保持条件が適用される前に、充分に大きな微生物集団が確立される細胞保持条件下において細胞を培養する段階で、細胞を培養する前に増殖段階を行うことが可能である。２つの他の段階、例えば細胞無保持条件下において２つの細胞増殖段階が隣接する細胞保持条件下で細胞を培養する段階の実行はまた、場合により、そして異なっている。その理論に束縛されるものではないが、全てのメタン生成微生物がリアクタ内に保持される場合、細胞の増殖は、リアクタの始動開始時の「増殖段階」において顕著な量でのみ必要とされ、メタン生成段階中には必要とされないため、メタン生成段階中に細胞の窒素節約をもたらすと考えられる。しかしながら、充分な数の細胞集団がリアクタの始動時に直接適用される場合、増殖段階は必要ではない。
【0040】
更に、理論に束縛されるものではないが、メタン生成微生物の総細胞数が、メタン産生段階における窒素源の外部供給の長期的な減少または停止下でさえも経時的に安定したままである理由は、増殖段階に発生したメタン生成微生物の既存の細胞塊の自然なターンオーバー中の窒素が、メタン生成段階におけるＡｒｃｈａｅａ生成サイクル中に新規の細胞を構築するために使用されるからであると考えられる。これは、例えば、窒素を含む死にかけているメタン生成微生物の栄養素が、分裂によって増殖する及び／または新規の細胞を構築するため、生きているメタン生成微生物によって再利用されることを意味する。
【0041】
本発明は、とりわけ、窒素源の外部供給、及び／または細胞培養培地内の窒素源（すなわち、アンモニア）の（得られた）濃度を制御するステップを特徴とする。これに関連して、制御とは、一定の監視下で保持され、したがって培養のこのパラメータを制御するだけでは不充分であり得るので、当該技術分野で知られている一般的な方法論及び測定機器を用いて、培養に関連するパラメータを一定の監視下で保持し、該パラメータまたは状態インジケータを本質的に測定するという、一般的な共通の意味で理解される。したがって、本発明の更なる実施形態は、特に、細胞培養培地内の窒素源濃度を連続的に調節することを含む。本出願の理解において、調節とは、適切な手段を用いて、パラメータ、例えば培養物の窒素源濃度の「所与の値」または所与の値スパンを積極的に維持することを意図している。
【0042】
本発明にかかる「所与の値」とは、所与の許容差、測定システム内の許容差、または培養物内の変動性もしくは培養物の多様性に起因する許容差を有する、定義された値であってもよい。ここで、該値はメタン化を可能にするのに適しているか、または所与の値は、所与の値と同じメタン化に対する効果を達成する好適な値の範囲であり得る。
【0043】
更に、メタン生成生物の培養物に提供される一般的な培養物または増殖培地は、それらの元素形態で、またはその任意の好適な非毒性塩、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄、塩化物、硫黄源、例えば硫化水素もしくは元素硫黄、リン源、例えばリン酸塩、窒素源、例えばアンモニウム、硝酸塩または窒素ガスで、一般的な無機元素を含み得る。本発明にかかるメタン生成生物を培養するために利用される典型的な塩は、ＮａＣｌ、ＫＨ２ＰＯ４、ＦｅＣｌ２－４Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＳｅＯ３、Ｎａ２Ｓ、ＮＨ４ＯＨ及びＭｇＣｌ２である。
【0044】
本発明の別の実施形態によれば、メタン生成生物を培養するステップは、以下：
硫化物源、好ましくは培養培地中のＮａ２Ｓの形態である硫化物源を提供することと、
培養条件を、嫌気性または条件的嫌気性に保つことと、
場合により、培養物を撹拌することと、
温度を３２℃～８５℃の範囲に維持することと
を更に含む。
硫化物源、好ましくは培養培地中のＮａ２Ｓの形態である硫化物源を提供することと、
培養条件を、嫌気性または条件的嫌気性に保つことと、
場合により、培養物を撹拌することと、
温度を３２℃～８５℃の範囲に維持することと
を更に含む。
【0045】
本発明によれば、バイオリアクタ中でＣＯ２を含有する工業用ガスからメタンを生成する方法においてメタン生成微生物を培養するステップは、以下：培養培地中に好ましくはＮａ２Ｓの形態である硫化物源を提供することと、培養条件を、条件的嫌気性及び／または嫌気性に保つことと、場合により、培養物を撹拌すること（ここで、培養物の撹拌は、定期的に、間隔をおいて、連続的に、または可溶性培養物を少なくとも一定のゆっくりとした一定の運動で保持して行うことができる）と、培養物から代謝水を連続的に除去することと、温度を３２℃～８０℃の範囲、好ましくは５０～７０℃、またはおよそ６２℃に保つことと、を含む。
【0046】
温度は、培養物内の選択された微生物種の存在に応じて変化し得る一方で、その各々は設定された温度の範囲内でより良好に増殖するが、メタン生成微生物のほとんどについて、温度の上昇は有害ではなく、細胞代謝、したがって代謝ターンオーバーまたはメタン化の最適化を支援することさえできる。工業用工程では、温度はエネルギー調節によって制御されなければならない。これに関して、温度制御を可能にすることによってエネルギー消費を削減することが有益な特徴と考えられるべきである。
【0047】
その結果、最適化された培養温度及び対応する水素溶解度と、エネルギー入力のためのコストとのバランスをとることが、極めて重要である。興味深いことに、本発明の方法は、大気圧において、３２℃～８５℃、または代替的に５０～７０℃、または更に代替的におよそ６２℃の温度範囲で最も効率的であることが判明した。いくつかの実施形態によれば、本発明にかかる方法の１つ以上のステップが加圧雰囲気中で行われる場合、圧力は、好ましくは最大１６ｂａｒ、代替的には最大２０ｂａｒ、代替的には最大５０ｂａｒ、代替的には最大６８ｂａｒ、代替的には最大１１０ｂａｒ、または更には最大４２０ｂａｒになるように選択される。
【0048】
他の温度または圧力範囲では、水素溶解度を、比較特性として使用することができる。したがって、本発明はまた、１～１０ｂａｒに等しい範囲の圧力、または１～１０ｂａｒの間の圧力での培養工程にも言及する。高圧、例えば１６ｂａｒ、２０ｂａｒ、３５ｂａｒ、４０ｂａｒまたは６０ｂａｒ、及び対応して、大気圧における３２℃～８５℃の温度範囲、または代替的に５０～７０℃の温度範囲、または更に代替的には約６２℃と同じ水素溶解度を可能にする高温もまた、包含される。
【0049】
メタン生成微生物は、一般に、最高で１００℃はるかに超える、例えば１４０℃の複数の他の極端な温度範囲でも生存及び増殖し得る。したがって、上記の温度範囲は好ましい範囲の指標であるが、本発明の範囲を限定するものとして理解されるべきではない。
【0050】
本発明の別の実施形態によれば、メタン生成生物の培養は、メタン生成段階の前に、以下のステップ：
メタン生成微生物の細胞分裂及び細胞増殖を可能にするために、培養培地内の窒素源の濃度を、０．２ｍｏＬ／Ｌ／日～０．００５ｍｏＬ／Ｌ／日、好ましくは０．０２ｍｏＬ／Ｌ／日～０．０１ｍｏＬ／Ｌ／日の範囲に制御及び調節するステップと、
少なくとも１、９～最大２００まで、または少なくとも２０～最大１２０まで、好ましくは少なくとも６０～最大１００までであり、それぞれ、少なくとも０．５ｇ／Ｌ～最大５０ｇ／Ｌまで、または少なくとも６．５ｇ／Ｌ～最大３１．３ｇ／Ｌまで、または少なくとも１８．３ｇ／Ｌ～最大２６．１ｇ／Ｌまでの培養物中の微生物の乾燥重量に対応する、ＯＤ６１０として測定された培養培地中における密度までメタン生成微生物を培養するステップと、を含む、細胞増殖段階を含む。
メタン生成微生物の細胞分裂及び細胞増殖を可能にするために、培養培地内の窒素源の濃度を、０．２ｍｏＬ／Ｌ／日～０．００５ｍｏＬ／Ｌ／日、好ましくは０．０２ｍｏＬ／Ｌ／日～０．０１ｍｏＬ／Ｌ／日の範囲に制御及び調節するステップと、
少なくとも１、９～最大２００まで、または少なくとも２０～最大１２０まで、好ましくは少なくとも６０～最大１００までであり、それぞれ、少なくとも０．５ｇ／Ｌ～最大５０ｇ／Ｌまで、または少なくとも６．５ｇ／Ｌ～最大３１．３ｇ／Ｌまで、または少なくとも１８．３ｇ／Ｌ～最大２６．１ｇ／Ｌまでの培養物中の微生物の乾燥重量に対応する、ＯＤ６１０として測定された培養培地中における密度までメタン生成微生物を培養するステップと、を含む、細胞増殖段階を含む。
【0051】
培養物中における微生物のＯＤ６１０（６１０ｎｍでの光学密度）または簡単に言えば光学密度とは、各時点での細胞数または濃度を測定するための実行可能なパラメータである。所与の細胞数と培養物中の微生物の効率との間の直接的な関係は、普遍的に確立されているようには見えないが、本発明にかかる方法の結果の理解において、高密度培養はメタン生成及び収率に関して有利な結果をもたらす。
【0052】
特に、本発明にかかる培養物の光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ：ＯＤ）は、当技術分野で公知の一般的な方法及び基準を利用して測定される。光学密度、またはむしろ細胞計数の形態としての濁度測定は、分光光度計を用いて行われ、典型的には６００ｎｍ付近または６００ｎｍで操作されるものの、したがって他の波長が好適であり得る。
【0053】
光学密度は測定設定によって異なり得るので、所与の時点または増殖段階に培養物中に存在する細胞の量の尺度として、培養物中の微生物の乾燥重量またはバイオマス密度を示すことがしばしば有用である。当技術分野で公知の標準的な方法を用いて、異なる濃度で得られた培養物のいくつかの異なるＯＤ値の曲線を構築し、それに応じて培養物の乾燥試料の乾燥重量を測定することによって、所与の増殖段階での所与の培養物のＯＤの測定値と乾燥重量との間の相関を確立することが可能である。これにより、光学密度の関数として乾燥重量の一連のデータポイントが得られる。そのようなデータセットの回帰直線の傾きは、通常、乾燥重量と光学密度との間の相関を定義する。本発明者らによれば、本出願では、ＯＤ６１０＝４の値は、おおよそ、ｌｇ／Ｌのバイオマス密度に変換される。
【0054】
本発明によれば、メタン生成微生物の培養物は、培養物へと充分な栄養素を供給し、同時に培養物から遊離水または代謝水を除去することによって、少なくとも１４、好ましくは２０超、また更には３０超、更には４０超、更には最大１２０または２００のＯＤ６１０を有する高密度培養物に誘導または導くことができる。したがって、本発明の方法は、様々な発達段階を通して、６０～２００間の測定可能なＯＤ６１０；更には１４～１２０間のＯＤ６１０；更には２０～１２０間のＯＤ６１０；更には３０～１２０間のＯＤ６１０；更には４０～１２０間のＯＤ６１０；更には５０～１２０間のＯＤ６１０；更には５０～１００間のＯＤ６１０；更には１４～８０間のＯＤ６１０；更には２０～８０間のＯＤ６１０；更には３０～８０間のＯＤ６１０；更には４０～８０間のＯＤ６１０；更には２０～８０間のＯＤ６１０；更には３０～４０間のＯＤ６１０；更には４０～６０間のＯＤ６１０；更には２０～４０間のＯＤ６１０を有する、メタン生成微生物の１つ以上の株の培養において適切に実施することができる。
【0055】
多数の細胞に対応する高い光学密度が増殖段階で得られ、バイオリアクタ内の培養物のメンバーをそれらの寿命の全段階にわたってそれらの最終段階まで保持することによって維持されるため、結果として、不活性細胞体の残りは培養物の活性メンバーに栄養素を提供することができる。
【0056】
好ましくは、本発明の更なる実施形態によれば、窒素源は、アンモニウム化合物、好ましくはＮＨ４ＯＨもしくはＮＨ４Ｃｌの形態であるアンモニウム化合物、または前述の組合せであるが、これらに限定されない。一実施形態によれば、窒素源は、好ましくはＮＨ４ＯＨの形態のアンモニウム化合物である。
【0057】
本発明の一実施形態によれば、本発明は、初期ｐＨ値を、ｐＨ９未満、ｐＨ８未満またはｐＨ７の所与の値に設定するステップと、続くｐＨ値を連続的に制御するステップと、を更に含む。
【0058】
一実施形態によれば、本発明の発明者らは、驚くべきことに、初期ｐＨを所与の値に設定した後、このｐＨ値を本発明の様々な条件を通して実験全体にわたって維持することができることを見出した。予想外なことに、還元の連続段階（最大４４０時間）及び窒素源供給の完全な停止（最大２１６時間）下において、例えば、具体的にはＮＨ４ＯＨ化合物の欠けている塩基性ＯＨ部分の代用として更なる量の塩基を添加することなくＮＨ４ＯＨの形態で、バイオリアクタを運転した後でさえ、これは、所与の値のｐＨを維持するために塩基（及び／または酸）の追加の供給を必要としない。したがって、所与の値でｐＨを連続的に制御及び調節するための時間及びコストを節約しながら、窒素源の供給が低減されるので、バイオリアクタを動作させるための工程コストを低減する利点が得られる。
【0059】
本発明の一実施形態によれば、ｐＨは、場合により連続的に制御され、及び／または代替的に更に調節され、すなわち所与の異なる値に維持されるように安定化される。
【0060】
本発明の一実施形態によれば、所与の異なる値で保持されるようにｐＨ値を連続的に制御及び調節するステップは、好適な量の塩基及び／または酸、例えばＮａＯＨ／ＨＣｌまたはＮＨ４ＯＨ／ＨＣｌを培養物に投与することによって行われる。
【0061】
本発明の別の実施形態によれば、代謝水の除去は、培養培地から過剰水を濾過するステップを含み、及び／または培養培地から過剰水を蒸発させるステップを含む。これをどのように行うことができるかという非限定的な１つの方法が、実施例１～３に開示されている。
【0062】
運転中のバイオリアクタにおいて培養培地から過剰水を蒸発させる手段は、当業者に周知である。これをどのように行うことができるかという非限定的な１つの方法が、工業規模で開示されている。実施例５を参照されたい。
【0063】
一実施形態によれば、培養培地から過剰水を濾過するステップは、培養培地と接触する水について少なくとも１つの半透膜を用いる逆浸透により実施される。逆浸透を実施する技術及び方法は、当業者に周知である。これをどのように行うことができるかという非限定的な１つの方法が、工業規模で開示されている。実施例４を参照されたい。
【0064】
濾過、例えば逆浸透によって水性細胞培養培地から過剰（代謝）水を分離すると、濃縮され回収された細胞培養培地が得られる。有利には、培養培地と接触している水に対して半透過性である少なくとも１つの膜は、デバイス、例えば培養培地と接触しており、バイオリアクタからの水の正味の流出をもたらす負圧下にあるチューブの近くに配置される。本発明にかかる限外濾過を用いて、全ての細胞をリアクタ内に保持し（細胞保持）、過剰水のみを細胞培養培地の可溶性成分から除去する。
【0065】
この回収された培地を再使用すると、バイオリアクタを作動させるのに必要である新鮮な培地保存液の量が減少する。廃水処理プラントへの排出のため地元当局によって設定された限界を超える濃度の化合物を含有する可能性があるので、コスト的動機に加えて、過剰水相中のミネラルを再利用するための法的な観点からの動機もまたあり得る。
【0066】
本発明の一実施形態によれば、過剰水を濾別するステップは、以下のステップ：
培養培地と接触している少なくとも１つの多孔質膜、好ましくは０．４～０．１μｍ、特に好ましくは０．３μｍの孔径を有する少なくとも１つの多孔質膜を通して濾過することによって、バイオリアクタから無細胞培養培地の画分を除去するステップと、
場合により、続いて、好ましくは少なくとも１つの更なる濾過ステップ、例えばナノ濾過、限外濾過によって、及び／または少なくとも１つの蒸留ステップによって、除去培養培地からミネラルを濃縮するステップと、
場合により、濃縮ミネラルをバイオリアクタへと少なくとも部分的に再利用させるステップと
を含む。
培養培地と接触している少なくとも１つの多孔質膜、好ましくは０．４～０．１μｍ、特に好ましくは０．３μｍの孔径を有する少なくとも１つの多孔質膜を通して濾過することによって、バイオリアクタから無細胞培養培地の画分を除去するステップと、
場合により、続いて、好ましくは少なくとも１つの更なる濾過ステップ、例えばナノ濾過、限外濾過によって、及び／または少なくとも１つの蒸留ステップによって、除去培養培地からミネラルを濃縮するステップと、
場合により、濃縮ミネラルをバイオリアクタへと少なくとも部分的に再利用させるステップと
を含む。
【0067】
適切な細孔径の濾過手段を用いて、全ての細胞をリアクタ内に保持し（細胞保持）、細胞培養培地の可溶性成分（細胞培養培地の無細胞画分）を有する生成された処理水のみを、バイオリアクタから除去する。精密濾過に好適な培養培地と接触する多孔質膜は、無細胞培養培地の除去された画分の連続流が可能である限り、バイオリアクタ内のどこにでも配置することができる。膜は、例えば、バイオリアクタの頂部の方向において細胞培養培地の表面の近くに配置することができるか、またはバイオリアクタの底部または近くに配向することができる。一例を図１４に示す。ここで、実験室規模のリアクタには、電気分解装置によって生成されたＨ２、及びＣＯ２が供給された。水素と二酸化炭素の流速は、典型的には、４：１の比に調整した。リアクタの生成された代謝水を、リアクタ内部に配置されたセラミックフィルタで除去した。この膜を用いて、溶解した栄養素を含有する完全な代謝水を除去し、細胞のみをリアクタ内に保持した。栄養素の損失のバランスを取るために、培地保存溶液を、排出量に従って投与した。
【0068】
本発明の一実施形態によれば、無細胞培養培地の先に除去された画分の全ミネラルが完全に回収され、濃縮ミネラルは、バイオリアクタに再利用される。
【0069】
本発明の別の実施形態によれば、無細胞培養培地の先に除去された画分の全ミネラルは少なくとも部分的に回収され、濃縮ミネラルは、バイオリアクタに再利用される。少なくとも部分的または完全に回収されたミネラルの非限定的な例は、ニッケル、コバルト、鉄、カリウムまたはリンである。
【0070】
本発明の一実施形態によれば、多孔質膜は、セラミック材料、ポリエチレンまたはステンレス鋼で作られる。
【0071】
代替的な実施形態では、細胞はまた、バイオリアクタから少なくとも部分的かつ時間的にのみ除去され、適切な多孔質膜を通過した後にリアクタへと戻されてもよい。
【0072】
本発明の一実施形態によれば、本方法は、ミネラルを追加的に添加することによって、培養培地中のミネラルの少なくとも１つの実体の濃度を制御し、かつ場合により調節するステップを更に含む。栄養素の損失のバランスを取るために、例えば培地保存溶液を、排出量に従って投与することができる。
【0073】
培養物にミネラルまたは栄養素を追加で添加するステップは、連続的または不連続的なモードで実行されてもよく、例えば、ナトリウム、タングステン、モリブデンまたはセレンなどのミネラルを含む。培養物にミネラルまたは栄養素を追加で添加するこのステップは、本発明を限定するものとして理解されるべきではなく、医師にとって有用であると考えられるべきである。メタン生成微生物は、一般に、複数のミネラルまたは栄養素の存在下でも生存及び増殖し得る。
【0074】
独立栄養性メタン生成微生物は、本明細書では、メタンの生合成を行うために、例えば二酸化炭素を還元することによって、それらの周囲環境との無機反応から栄養を誘導する微生物として意図される。独立栄養性微生物の例は、水素を利用することからそれらの栄養を誘導する水素資化性（ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｔｒｏｐｈｉｃ）微生物によって得られる。特に、水素資化性メタン生成微生物は、それらの代謝工程の一部として、水素及び二酸化炭素をメタンに変換することができる。生態系におけるメタン生成微生物の役割は、有機物の腐敗の最終段階において過剰な二酸化炭素及び発酵生成物の除去を補助するため、独特である。メタン生成の非存在下では、腐敗物質からの化合物に結合した大量の炭素が嫌気性環境に蓄積する。
【0075】
本発明の一実施形態によれば、少なくとも１つのメタン生成微生物は、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓもしくはこれらの混合物を含む、Ａｒｃｈａｅａまたはａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａの群から選択される。
【0076】
本発明の一実施形態によれば、細胞保持条件下でのメタン生成段階において、バイオリアクタ中のメタン生成微生物全体の少なくとも６０％、好ましくは８０％超が、５：１～３：１、好ましくは４：１～３：１、特に好ましくは３：１の長さ対幅の比を有する。
【0077】
実験によれば、本発明者らは、特に、細胞無保持条件（図１７Ａ、図１７Ｂを参照）下の匹敵する条件に対する、細胞保持条件下における様々な段階の間に、細胞形態のこのように顕著な変化を示した、試験メタン生成微生物Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒｔｈｅｒｍａｕｔｒｏｐｈｉｃｕｓ ＵＣ１２０９１０（ＥＣＨ０１００）を実施した。これらの形態変化は可逆的であるという予備的なヒントが存在する（データ示さず）。理論に束縛されるものではないが、上記の細胞無保持条件下における同等の条件に対する細胞保持条件下での細胞形態の観察された変化は、これらのメタン生成微生物を細胞保持条件下で培養した後に、特許請求される他のメタン生成微生物においても観察され得るという兆候がある。
【0078】
参考文献
Ｍｏｒｏｃｈｏ－Ｊａｃｏｍｅ，Ａ．，Ｍａｓｃｉｏｌｉ，Ｇ．，Ｓａｔｏ，Ｓ．，＆Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｄｅ Ｃａｒｖａｌｈｏ，Ｊ．（２０１５）．Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｅｘｈａｕｓｔｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｇｒａｎｕｌａｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｒｂｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｌｏｇｙ，５２２（１），４６７－４７４．
Ｍｏｒｏｃｈｏ－Ｊａｃｏｍｅ，Ａ．，Ｍａｓｃｉｏｌｉ，Ｇ．，Ｓａｔｏ，Ｓ．，＆Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ｄｅ Ｃａｒｖａｌｈｏ，Ｊ．（２０１５）．Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｅｘｈａｕｓｔｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｇｒａｎｕｌａｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｒｂｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｌｏｇｙ，５２２（１），４６７－４７４．
【図面の簡単な説明】
【0079】
【図1】細胞保持条件下において多孔質膜フィルタを用いて、アンモニウム還元条件下においてｐＨを調節することによる、過剰な代謝水の濾別（予備実験、細胞保持実験１）。段階／条件（水平座標）：運転時間（ｈ）。垂直座標：Ａ：ＯＤ６１０。Ｂ：ＷＤ（Ｌ／Ｌ／日）。Ｃ：変換率（％）。段階／条件：ａ：細胞増殖、ｂ：細胞保持（フィルタ試験）、ｃ：細胞無保持下におけるメタン生成、ｄ：細胞保持下における生成、ｅ：細胞保持及びアンモニア還元下におけるメタン生成、ｆ：アンモニア供給なしで細胞保持を伴うメタン生成。
【図2】細胞保持条件下において多孔質膜フィルタを用いて、アンモニウム還元条件下においてｐＨを調節することによる、過剰な代謝水の濾別（予備実験）。細胞保持実験１．段階／条件（水平座標）：ａ．細胞増殖、ｂ．細胞保持フィルタ試験、ｃ．細胞保持を伴わない生成、ｄ．細胞保持を伴う生成、ｅ．細胞保持及びアンモニア還元を伴う生成、ｆ．アンモニア供給なしで細胞保持を伴う生成。垂直座標平均及び標準偏差。Ａ：ＯＤ６１０。Ｂ：ＶＶＤ（Ｌ／Ｌ／日）。Ｃ：変換率（％）。
【図3】細胞保持条件下において多孔質膜フィルタを用いて、アンモニウム還元条件下においてｐＨを調節することによる、過剰な代謝水の濾別（予備実験）。細胞保持実験１．水平座標：運転時間（ｈ）、垂直座標：Ｄ：ＣＯ２流量（Ｌ／分）、Ｅ：ＮＨ３供給（ｇ／Ｌ／日）。Ｆ：ＮａＯＨ供給（Ｍ／Ｌ／日）。Ｇ：ＮＨ４
＋濃度上清（ｇ／Ｌ）、段階／条件：ａ：細胞増殖、ｂ：細胞保持フィルタ試験、ｃ：細胞保持を伴わない生成、ｄ：細胞保持下における生成、ｅ：細胞保持及びアンモニア還元下における生成、ｆ：アンモニア供給なしでの細胞保持下における生成。
【図4】アンモニウム還元条件下において初期設定ｐＨ値を調節する必要のない多孔質膜フィルタを用いることによる、細胞保持条件下における過剰な代謝水の濾別（細胞保持実験２）。水平座標：運転時間（ｈ）、垂直座標：Ａ：ＯＤ６１０。Ｂ：ＷＤ（Ｌ／Ｌ／日）。Ｃ：変換率（％）。段階／条件：ａ：細胞増殖、ｂ：細胞無保持下におけるメタン生成、ｃ：移行１及び２、ｄ：細胞保持下におけるメタン生成、ｅ：細胞保持及びアンモニア還元下におけるメタン生成。
【図5】アンモニウム還元条件下において初期設定ｐＨ値を調節する必要のない多孔質膜フィルタを用いることによる、細胞保持条件下における過剰な代謝水の濾別（細胞保持実験２）。段階／条件（水平座標）：ａ：細胞増殖、ｂ：細胞保持を伴わないメタン生成、ｃ：移行１及び２、ｄ：細胞保持下におけるメタン生成、ｅ：細胞保持及びアンモニア還元下におけるメタン生成。垂直座標平均及び標準偏差：Ａ：ＯＤ６１０。Ｂ：ＶＶＤ（Ｌ／Ｌ／日）。Ｃ：変換率（％）。
【図6】アンモニウム還元条件下において初期設定ｐＨ値を調節する必要のない多孔質膜フィルタを用いることによる、細胞保持条件下における過剰な代謝水の濾別（細胞保持実験２）。水平座標：運転時間（ｈ）、左の垂直座標：Ｄ：ＣＯ２流量（Ｌ／分）、Ｅ：ＮＨ３供給（ｇ／Ｌ／日）、右の垂直座標：Ｇ：ＮＨ４
＋濃縮上清（ｇ／Ｌ）。段階／条件：ａ：細胞増殖、ｂ：細胞保持を伴わないメタン生成、ｃ：移行１及び２、ｄ：細胞保持下におけるメタン生成、ｅ：細胞保持及びアンモニア還元下におけるメタン生成。
【図7】過剰な代謝水を除去するためにフィルタを用いた、細胞保持条件下におけるメタン生成及び培養培地成分再利用（細胞保持実験３）。水平座標：運転時間（ｈ）。垂直座標：Ａ：ＯＤ６１０。Ｂ：ＶＶＤ（Ｌ／Ｌ／日）。Ｃ：変換率（％）。段階／条件：ａ．細胞保持下における細胞増殖、ｂ．細胞保持下におけるメタン生成、ｃ．細胞保持下におけるメタン生成及び栄養素回収、ｄ．細胞保持及びアンモニア還元下におけるメタン生成、ｅ．アンモニア供給なしの細胞保持下におけるメタン生成。
【図8】過剰な代謝水を除去するためにフィルタを用いた、細胞保持条件下におけるメタン生成及び培養培地成分再利用（細胞保持実験３）。段階／条件（水平座標）：ａ．細胞保持下における細胞増殖、ｂ．細胞保持下におけるメタン生成、ｃ．細胞保持下におけるメタン生成及び栄養素回収、ｄ．細胞保持及びアンモニア還元下におけるメタン生成、ｅ．アンモニア供給なしの細胞保持下におけるメタン生成。垂直座標平均及び標準偏差。Ａ：ＯＤ６１０。Ｂ：ＷＤ（Ｌ／Ｌ／日）。Ｃ：変換率（％）。
【図9】過剰な代謝水を除去するためにフィルタを用いた、細胞保持条件下におけるメタン生成及び培養培地成分再利用（細胞保持実験３）。水平座標：運転時間（ｈ）、垂直座標：Ｄ：ＣＯ２流量（Ｌ／分）、Ｅ：標準供給に対するＮＨ３供給（％／１００）、標準供給の５０％、２５％及び０％への減少を示す。段階／条件：ａ．細胞保持下における細胞増殖、ｂ．細胞保持下におけるメタン生成、ｃ．細胞保持下におけるメタン生成及び栄養素回収、ｄ．細胞保持及びアンモニア還元下におけるメタン生成、ｅ．アンモニア供給なしの細胞保持下におけるメタン生成。
【図10】逆浸透フィルタを用いることによる、細胞保持条件下における過剰な代謝水の濾別（細胞保持実験４）。水平座標：運転時間（ｈ）、垂直座標：Ａ：ＯＤ６１０。Ｃ：変換率（％）。段階／条件：ａ：細胞保持及び培地回収なしのメタン生成、ｂ：細胞保持及び培地回収下におけるメタン生成。
【図11】細胞保持条件下における蒸発による、過剰な代謝水の除去（細胞保持実験５）。５日間にわたるＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍａｕｔｒｏｐｈｉｃｕｓ ＵＣ１２０９１０（ＥＣＨ０１００）を含む工業規模リアクタの運転。水平座標：運転時間（ｈ）。左の垂直座標：（Ａ．）ｐＨ、（Ｂ．）ＯＤ、右の垂直座標：（Ｃ．）リアクタ質量（ｋｇ）。リアクタ質量とはリアクタ内の液体培地及びバイオマスの重量であり、リアクタ自体の重量を考慮したスケールで決定された。
【図12】細胞保持条件下における蒸発による、過剰な代謝水の除去（細胞保持実験５）。５日間にわたるＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍａｕｔｒｏｐｈｉｃｕｓ ＵＣ １２０９１０（ＥＣＨ０１００）を含む工業規模リアクタの運転。水平座標：運転時間（ｈ）。左の垂直座標：（Ｄ）：リアクタの入口ガスにおけるＨ２：ＣＯ２の比、（Ｅ）リアクタへのバイオガスの流量（Ｎｍ３／時）。右の垂直座標：（Ｆ）リアクタの出口からのガス流である、生成ガス中におけるＣＯ２の割合。
【図13】細胞保持条件下における蒸発による、過剰な代謝水の除去（細胞保持実験５）。５日間にわたるＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍａｕｔｒｏｐｈｉｃｕｓ ＵＣ １２０９１０（ＥＣＨ０１００）を含む工業規模リアクタの運転。グラフは、（Ａ．）リアクタ質量（ｋｇ）、（Ｂ．）ＯＤ、（Ｃ．）リアクタへのバイオガスの流量（Ｎｍ３／時）を示す。リアクタ質量とはリアクタ内の液体培地及びバイオマスの重量であり、リアクタ自体の重量を考慮したスケールで決定された。
【図14】バイオリアクタ細胞培養培地内における、多孔質フィルタを用いることによる、過剰な代謝水の除去のためのリアクタ設定（例えば、細胞保持実験１及び細胞保持実験２）。実験設定．ａ：セラミックフィルタ、ｂ：リアクタ、ｃ：代謝水。実験室規模のリアクタには、電気分解装置によって生成されたＨ２、及びＣＯ２が供給された。水素と二酸化炭素との流速は、４：１の比に調整した。培養物の温度は６２．５℃であり、メタン化反応は大気圧で起こった。リアクタの生成された代謝水を、リアクタ内部に配置されたセラミックフィルタで除去した。この膜を用いて、溶解した栄養素を含有する完全な代謝水を除去し、細胞のみをリアクタ内に保持した。栄養素の損失のバランスを取るために、培地保存溶液を、排出量に従って投与した。
【図15】バイオリアクタの外側で逆浸透フィルタを用いることによる、過剰な代謝水の除去のためのリアクタ設定（細胞保持実験４）。実験設定．ａ：リアクタ、ｂ：代謝水、ｃ：Ｒ／Ｏ膜、ｄ：細胞／栄養素。工業規模のリアクタには、電気分解装置によって生成されたＨ２、及びバイオガス精製の副産物であるＣＯ２が供給された。水素と二酸化炭素との流速は、４．１：１の比に調整した。培養物の温度は６２．５℃であり、メタン化反応は１０ｂａｒで生じた。生体触媒液をリアクタから取り出し、Ｒ／Ｏ膜を通過させて、生成した代謝水を除去した。細胞及びほとんどの溶解した栄養素は、膜を通過した後にリアクタに戻された。
【図16】蒸発を用いることによる、過剰な代謝水を除去するためのリアクタ設定（細胞保持実験５）。実験設定．ａ：リアクタ、ｂ：水蒸気、ｃ：濃縮器、ｄ：代謝水。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【0080】
以下の実施例は、本発明を該実施例に限定する意図なしに、記載された方法を意図通りに実行する実行可能な方法を示す。
【0081】
実施例１：細胞保持実験１
本発明の発明者らは、メタン富化ガス組成物のためのスケーラブルで信頼性のある連続生成工程において、メタン生成微生物によってＨ２及びＣＯ２をメタンに変換する方法を提供するという課題を設定した。
本発明の発明者らは、メタン富化ガス組成物のためのスケーラブルで信頼性のある連続生成工程において、メタン生成微生物によってＨ２及びＣＯ２をメタンに変換する方法を提供するという課題を設定した。
【0082】
したがって、本発明者らは、メタン生成微生物を培養するための新規なアプローチ、すなわち細胞保持条件を適用することによって試験を行った。メタン生成微生物を保持するための１つの方法は、メタン生成段階中に過剰に形成された代謝水を除去するための濾過によって、本発明者らによって試験された。このコンセプトは、リアクタ内部の細胞培養培地の表面近くの細胞培養懸濁液に浸漬された、精密濾過に適したセラミック・フィルタ・ユニットの形態で実現された（図１４に示される実験設定の概略）。セラミックフィルタは、Ｋａｔａｄｙｎ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ及びＧｕａｎｇｚｈｏｕ ＰＵＲＥＥＡＳＹ Ｈｉ－Ｔｅｃｈ ＣＯ．，ＬＴＤから供給され、孔径は、それぞれ０．３μｍ及び０．１μｍであった。フィルタハウジングはＡ４ステンレス鋼部品から構成された。精密濾過を用いることにより、全ての細胞をリアクタ内に保持した（細胞保持）。
【0083】
その上、本発明者らはまた、細胞保持条件下における所与のメタン生成的なメタン生成微生物集団が、窒素源の供給が減少するかまたは完全に停止する条件下であっても、経時的に安定に維持され得るかどうかの仮説を試験することに関心があった。
【0084】
実験は、１０Ｌのバイオリアクタ中で実施し、以下の異なる工程条件／段階で合計１，６００時間以内に収めた：
ａ．細胞増殖。
ｂ．細胞保持下におけるフィルタ試験。
ｃ．細胞保持なし（無細胞）でのメタン生成。
ｄ．細胞保持下におけるメタン生成。
ｅ．細胞保持及びアンモニア還元下におけるメタン生成。
ｆ．アンモニア供給なしの細胞保持下におけるメタン生成。
実験設定は簡略化した形で図１４に示す。実験１のパラメータの測定に使用した機器及び情報を表１に示す。
ａ．細胞増殖。
ｂ．細胞保持下におけるフィルタ試験。
ｃ．細胞保持なし（無細胞）でのメタン生成。
ｄ．細胞保持下におけるメタン生成。
ｅ．細胞保持及びアンモニア還元下におけるメタン生成。
ｆ．アンモニア供給なしの細胞保持下におけるメタン生成。
実験設定は簡略化した形で図１４に示す。実験１のパラメータの測定に使用した機器及び情報を表１に示す。
【0085】
【表1】
【0086】
実験１の結果を、図１、図２及び図３に示す。増殖段階（段階指標ａ）の持続時間は、培養物の密度が最大ＯＤ６１０ ３０まで増加した場合は１６５時間であり、続いて細孔径０．１μｍのフィルタまたは細孔径０．３μｍのフィルタを用いて細胞保持（段階指標ｂ）について異なるフィルタ材料を試験する３８７時間の継続期間中にはＯＤ６１０ ８０まで更に増加した。更なる細胞保持段階の全てについて０．３μｍの細孔径を有するフィルタを選択した後、ＯＤ６１０は定常段階に到達した。ここで、細胞密度は、メタン生成段階の間、細胞保持なし（持続時間：９７時間、段階指標ｃ、図１及び図２も参照）、細胞保持条件（持続時間：２２１時間、段階指標ｄ）、アンモニア還元条件（持続時間：４４０時間、段階指標ｅ）及びアンモニア投与なしの段階（持続時間：２１６時間、段階指標ｆ）で、非常に安定したままであった。したがって、アンモニウム還元条件を適用した後、または追加のアンモニウム供給の完全停止後でさえも、細胞密度が有利には全く影響を受けないままであったことが示される。
【0087】
細胞保持フィルタ試験段階では、２つのフィルタ（０，１μｍ及び０，３μｍ）を試験し、定性的に比較した。異なるフィルタの試験のために、２つの追加のポートを使用し、互いに隣接して同時に試験して、比較した。一方は０．１μｍフィルタに使用され、もう一方は０．３μｍフィルタに使用された。これらをＲｕｓｈｔｏｎインペラ間の細胞懸濁液に浸漬した。手順としては、真空ポンプを用いて、両方のフィルタ上の上清を手動で排出した。比較のために、流量、ＯＤ及び顕微鏡（４０倍）を定性的に使用した。
【0088】
０．１μｍフィルタの流れは遅く、真空ポンプの助けを借りて同じ体積に達するには、倍以上の時間が必要であった。両方のフィルタで、光学密度、及び濾液中の細胞数の定性的比較は同じであった。０．１μｍフィルタのより低い流量は、より小さい表面にも起因し得る。真空ポンプの稼働時間が長くなると、流量の全体的な低減もまた認められた。より高い流量により、０．３μｍの孔径であるフィルタを、以下の細胞保持の実験で使用した。
【0089】
上清のみの排出（細胞保持）と細胞懸濁液の排出（細胞保持なしの生成段階、図１、図２及び図３、段階ｃ）との間の問題のない切替えを検証するために、通常モードへの短時間の切替えを１週間行った。結果として、連続的なアンモニア投与により、細胞が再び再生を開始し、流出は起こらないことが示される。排出は手動で１日１回行った。
【0090】
メタン生成速度は工程の動力学の尺度であり、細胞懸濁液の体積当たり及び１日当たりのメタンの体積（以下ではＷＤと略す）によって示されることが多い。図１及び図２で見られるように、始動中における毎分０．７５ＬのＨ２から毎分０．９４５ＬのＨ２への流量の工程に関連した増加に起因して、初期増殖段階（それぞれ、６０％または８，２Ｌ／Ｌ／日）中に、平均ＣＯ２変換率、したがってＷＤは最も低く、標準偏差は最も高かった。フィルタ試験期間は、変換率及びＷＤの両方の大きな変動を伴う低下をもたらす実験設定の変化及び適応によって特徴付けられる。これらのより安定性が低い条件の間、平均変換率及びＷＤは、予想される高い標準偏差により後続の試験段階よりも低いままである。
【0091】
細胞保持なしの生成期間中、平均（多孔質膜による濾過）変換率は８８％であり、細胞保持条件下での生成期間中の８３％の率に匹敵した。細胞保持条件下におけるアンモニア還元（７０％）及びアンモニア投与なし（７５％）の両方の変換率は、細胞保持なしの生成期間及び細胞保持ありの生成期間の変換率よりも小さかった。それにもかかわらず、有利かつ驚くべきことに、適用されるシステムの実験設定の全体的な高効率を主張する細胞保持条件下において細胞を同時に培養する場合、そのような還元または停止されたアンモニウム供給条件下における変換率は、依然としてかなり高かった。
【0092】
ＣＯ２変換に依存するＷＤは上記の変換率の傾向に従った。しかしながら、細胞保持なしの生成期間中の誤差限界内では、平均３１．７Ｌ／Ｌ／日であるＷＤは、細胞保持段階中のＷＤ（ＷＤ＝３５Ｌ／Ｌ／日）に対して統計的な有意差はなく、還元アンモニアを伴う細胞保持（ＷＤ＝３４、１Ｌ／Ｌ／日）及びアンモニア供給なしの細胞保持（ＷＤ＝３２、４Ｌ／Ｌ／日；図１及び図２、グラフ／バー「Ｂ」参照）は、細胞保持条件下でのみ、または少なくともアンモニウム供給の減少（または完全停止）と組み合わせた細胞保持条件下での適用されたシステムの実験設定の全体的に高い効率を更に示している。
【0093】
細胞保持段階の間、流量は２回増加した（第１回：１．２Ｌ Ｈ２／分、第２回：１．４７Ｌ Ｈ２／分）。これは変換の２回の減少によって認識可能である。流量の第１の増加では変換の以前のレベル（９０％）への回復があったが、第２の増加は、より低い変換（７８％）を有する安定段階をもたらす。以前の流量増加と比較して、変換率が低く、ＷＤの増加がない最後の流量増加は、これが既にリアクタにとって高すぎる流量であったという徴候であった。リアクタ内の撹拌機性能が制限されているせいで、最高ガス供給入力を生体触媒により完全に処理することができなかった。したがって、流量は１．２Ｌ Ｈ２／０．３Ｌ ＣＯ２まで下降した。
【0094】
次に、本発明者らは、安定した細胞集団が確立されると、細胞がより低いアンモニア投与に耐えるという彼らの仮説を試験することに関心があった。アンモニアは増殖に必要であり、細胞は保持されているので、これ以上アンモニアを必要とすべきではない。この相関を試験し、以前の実験を検証するために、投与に半分のアンモニア濃度（１，２Ｍ ＮＨ４ＯＨ）の溶液を使用した。ｐＨを制御するために、３モルの水酸化ナトリウムをポンプで添加した。
【0095】
減少段階におけるアンモニアの濃度は、ＮＨ４＋－濃度が、最初の２５０ｍｇ ＮＨ４＋／Ｌから、アンモニア供給が減少した期間の最後には１００ｍｇ ＮＨ４＋／Ｌまで、実験の最後には１０ｍｇ ＮＨ４＋／Ｌまで、低下することを示す。ＮａＯＨの添加によってｐＨ安定化を行った。
【0096】
低い標準偏差によって認識可能なわずかな変動のみを伴う、極めて安定した工程全体の生成期間（細胞保持なし、細胞保持、ならびに減少したアンモニア供給及びアンモニア供給なしの細胞保持）が、顕著である。
【0097】
したがって、本発明の発明者らは、驚くべきことに、本発明にかかる細胞保持条件下においてメタン生成微生物を培養することによって、細胞培養数を維持しながら（図１、図２及び図３、特に、段階指標ｄ（及び、追加的にはｃ））と比較した段階指標ｅ及び段階指標ｆ）、経時的な完全アンモニウム供給を伴う段階と比較して、依然として高く非常に安定化されたメタン化率がこれらの段階において観察されたように、メタン生成段階における窒素源の供給を大幅に減少させるか、または更には完全に停止することが可能である（本実施例では、その後の増殖段階）ことを見出した。
【0098】
細胞保持条件下で細胞を培養した場合、驚くべき効果が本発明者らによって認められた。実験によれば、本発明者らは、実施した種々の細胞保持実験で一般に観察され得る細胞無保持条件（図１７Ａ、図１７Ｂを参照）下の匹敵する条件に対する、細胞保持条件下における様々な段階の間に、細胞形態の顕著な変化を示した（細胞が有意に短くなった）、試験メタン生成微生物Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍａｕｔｒｏｐｈｉｃｕｓ ＵＣ１２０９１０（ＥＣＨ０１００）を実施した。
【0099】
培養培地へのＮＨ４ＯＨ供給の減少または停止後、ＮａＯＨの添加によってｐＨ安定化を行った。
【0100】
しかしながら、本発明者らは、塩基（ＮａＯＨ）の添加が有害であるためにｐＨが当初は非常に不安定となり、これは、以前のように所与の値で維持するように安定化するにはある程度の時間を必要とすることに気付いた。この好ましくない不安定なｐＨ効果は、実験設定を最適化することで改善されるべきである。
【0101】
そうするために、また、一般的に、先の実験設定及び性能を更に分析及び改善するために、更なる実験を行った。
【0102】
実施例２：細胞保持実験２
細胞保持条件下においてメタン生成微生物を培養しながら代謝水を除去するための、別の長期方法を試験した。
細胞保持条件下においてメタン生成微生物を培養しながら代謝水を除去するための、別の長期方法を試験した。
【0103】
実験２は、１０Ｌのリアクタ中で実施し、以下の異なる工程条件／段階下にて運転時間合計６，０００時間以内に収めた：
ａ．細胞増殖。
ｂ．細胞保持なしでのメタン生成。
ｃ．移行１及び移行２
ｄ．細胞保持下におけるメタン生成。
ｅ．細胞保持及びアンモニア還元下におけるメタン生成。
ａ．細胞増殖。
ｂ．細胞保持なしでのメタン生成。
ｃ．移行１及び移行２
ｄ．細胞保持下におけるメタン生成。
ｅ．細胞保持及びアンモニア還元下におけるメタン生成。
【0104】
実験設定は簡略化した形で図１４に示す。実験２のパラメータの測定に使用した機器及び情報を表２に示す。
【0105】
【表2】
【0106】
実験２の結果を、図４、図５及び図６に示す。培養物の密度が最大ＯＤ４０まで増加した場合、増殖段階の持続時間は５００時間であった。次の生成段階（１，１００時間）では、細胞密度は、ＯＤ３５～５０の範囲内で安定したままであった（図４及び図５を参照されたい）。
【0107】
細胞保持モードを開始する前に、培養物の密度がＯＤ４０からＯＤ１８に減少した移行段階（ｃ１：５００時間）があった。この段階の間、ＯＤは特異的に減少し、次いで移行段階内で、新規の細胞分裂及び細胞増殖インパルスが開始された。細胞保持段階（２，０００時間）では、ＯＤは２００時間以内に６０を超えるレベルまで増加し、続いて１．８００時間の間、常にＯＤ６０～８５の範囲内に留まった。アンモニア還元モードを開始する前に、細胞密度がＯＤ４０まで特異的に減少した、別の移行段階（ｃ２：３００時間）があった。アンモニア還元モード（１，６００時間）では、細胞密度は２００時間以内にＯＤ８０を超えるレベルまで増加し、続いて１，４００時間の間、常にＯＤ８０～１００の間の範囲内に留まった。
【0108】
平均ＣＯ２変換率（８１％）は、増殖段階において最も高かった。始動中における毎分０．０５Ｌから毎分０．２３Ｌ ＣＯ２への流量の工程に関連した増加に起因して、初期増殖段階中に、ＷＤ（１８．７Ｌ／Ｌ／日）は最も低く、標準偏差は最も高かった。
【0109】
しかし、細胞無保持条件下（細胞保持条件なし）でメタン生成段階を適用した場合、ＣＯ２平均変換率は、５７％のレベルで有害に減少した。有利には、メタン生成段階を細胞保持条件下で実施した後、ＣＯ２平均変換率は、メタン生成段階中に７１％まで増加した。興味深いことに、また驚くべきことに、アンモニア還元下で段階を適用した場合、ＣＯ２変換率は、メタン生成段階中に７５％のレベルまで増加した。その結果、より詳細には、ＶＶＤは、細胞保持なしの生成期間中において平均２４．６Ｌ／Ｌ／日と最も低かった。体積生成率は、細胞保持段階（３１．２Ｌ／Ｌ／日）中及び還元アンモニアを伴う細胞保持（３２．４Ｌ／Ｌ／日）中で有意に高かった。細胞保持段階及びアンモニアが還元された段階の最中、流量に変化はなかった（１．２Ｌ Ｈ２／分、０．３０Ｌ Ｈ２／分）。
【0110】
減少段階におけるアンモニアの濃度は、ＮＨ４＋－濃度が、最初の３７３ｍｇ ＮＨ４＋／Ｌ／日から、アンモニア供給が減少した期間の最後には２２４ｍｇ ＮＨ４＋／Ｌ／日まで低下することを示す（図６参照）。減少段階における細胞培養培地中のアンモニアの濃度は、ＮＨ４＋－濃度が、最初の約２５０～２００ｍｇ ＮＨ４＋／Ｌから、実験の最後アンモニア供給が減少した期間の最後には約１００ｍｇ ＮＨ４＋／Ｌまで低下することを示す。
【0111】
最も興味深いことに、また驚くべきことに、ＮＨ４ＯＨ供給の減少を補償するためＮａＯＨのような追加量の塩基を添加することによるｐＨ安定化は、必要なかった（細胞保持実験１（予備実験）で行われたとおり）。対照的に、ｐＨは、更なる実験全体にわたって、すなわち実験終了までの８００時間にわたって、所与の値において、小さな誤差許容範囲内で安定したままであった。
【0112】
低い標準偏差によって認識可能なわずかな変動のみを伴う、極めて安定した工程全体の生成期間（細胞保持なし下、細胞保持下及び減少したアンモニア供給の細胞保持下）が、顕著である。
【0113】
実施例３：細胞保持実験３
実験３は、１０Ｌのリアクタ中で実施し、以下の異なる工程条件／段階下にて３，５００時間以内に収めた：
ａ．細胞保持下における細胞増殖。
ｂ．細胞保持下におけるメタン生成。
ｃ．細胞保持及び栄養素回収下におけるメタン生成。
ｄ．細胞保持及びアンモニア還元下におけるメタン生成。
ｅ．アンモニア供給なしの細胞保持下におけるメタン生成。
実験３は、１０Ｌのリアクタ中で実施し、以下の異なる工程条件／段階下にて３，５００時間以内に収めた：
ａ．細胞保持下における細胞増殖。
ｂ．細胞保持下におけるメタン生成。
ｃ．細胞保持及び栄養素回収下におけるメタン生成。
ｄ．細胞保持及びアンモニア還元下におけるメタン生成。
ｅ．アンモニア供給なしの細胞保持下におけるメタン生成。
【0114】
実験３の結果を、図７、図８及び図９に示す。細胞保持条件下における培養物の密度が最大ＯＤ６０まで増加した場合、増殖段階の持続時間は５５０時間であった。細胞保持を伴う以下の連続メタン生成段階（９８０時間）において、細胞密度は、ＯＤ５０～６０の間で安定した。
【0115】
全部で１，１００時間続く細胞保持条件下における栄養素回収の開始時に、培養物はＯＤ５５からＯＤ３３まで低下し、その後すぐにＯＤ５０以上に再増殖した。ＯＤは、アンモニア還元（５０％、２５％）（５５０時間）の実験及びアンモニア投与なし（５００時間）の実験の残りの期間にわたって安定したままであった。窒素源の供給の減少または完全な停止さえも、細胞密度に全く悪影響を及ぼさないことが示される。
【0116】
ＣＯ２変換率に関するこれらの実験条件／段階の差は有意ではなく、したがって、異なる段階の様々な実験設定において、ＣＯ２変換率が極めて同等であったという結論を示す。詳細には、平均ＣＯ２変換率（７４％）は、増殖段階及び栄養素回収段階で最も低く、細胞保持を伴うメタン生成段階及びアンモニア投与量を減少させた細胞保持段階の培地で中程度（７９％）であり、アンモニアを添加しなかった場合に最も高かった（８３％）。
【0117】
同様に、ＷＤは、細胞増殖段階後の異なる試験条件において有意差はなく、２６．５～３４．４Ｌ／Ｌ／日の間で安定したままであった。詳細には、始動中における毎分０．０３５Ｌから毎分０．３Ｌ ＣＯ２への流量の工程に関連した増加に起因して、初期増殖段階中に、ＶＶＤ（２５．９Ｌ／Ｌ／日）は最も低く、標準偏差は最も高かった。変換率の結果と同様であり、多少の変動があるためである。
【0118】
実施例４：細胞保持実験４
実験４は、３，５００Ｌのバイオリアクタ中で実施し、以下の異なる工程条件／段階下にて２００時間以内に収めた：
ａ．細胞保持及び培養培地成分の再利用を伴わないメタン生成。
ｂ．細胞保持及び培養培地成分の再利用を伴うメタン生成。
実験４は、３，５００Ｌのバイオリアクタ中で実施し、以下の異なる工程条件／段階下にて２００時間以内に収めた：
ａ．細胞保持及び培養培地成分の再利用を伴わないメタン生成。
ｂ．細胞保持及び培養培地成分の再利用を伴うメタン生成。
【0119】
【0120】
培地回収のために、逆浸透（Ｒ／Ｏ）膜／フィルタユニットを使用した。このフィルタ／膜ユニットでは、透水性フィルタ／膜を通過することができない細胞及びミネラルが残留液としてフィルタより前に蓄積され、適切な手段でリアクタにフィードバックされ、したがって細胞保持条件下においてリアクタシステムを作動させることができる一方で代謝水は、システムから除去される（透過液）。
【0121】
細胞保持及び培地回収を伴わない生成段階（３８時間）では、ＯＤは、ＯＤ３４～３６の範囲で安定していた。細胞保持及び培地回収を伴う生成が開始された後、細胞密度は５１時間以内にＯＤ５０を超えるレベルまで増加し、続いて１１１時間の間、常にＯＤ５０～６０の間の範囲内に留まった。
【0122】
実験の開始時、リアクタは約８時間後は常に停止した。リアクタの再起動後、変換率はシャットダウン前と常に同じ範囲であった。８３時間の運転時間の後、リアクタを、中断することなく連続的に運転させた。ＣＯ２変換率は９０～１００％の範囲で主に安定していた。
【0123】
培地回収及び細胞保持は、工程の安定性に悪影響を及ぼさず、反対に、工程の安定性は、細胞保持条件下及び培地再利用下で影響を受けないままであった。
【0124】
実施例５：細胞保持実験５
実験設定は簡略化した形式で図１６に示す。
実験設定は簡略化した形式で図１６に示す。
【0125】
Ａ．短期実験：５日間の実験
４５００～５０００Ｌの充填体積を有する工業規模のリアクタを使用した。リアクタには、嫌気性消化装置から、およそ５０％のメタン及び５０％の二酸化炭素を含有するバイオガスを供給した。水素は水素タンクから供給した。バイオガス中のＣＯ２含有量は赤外線ガス分析計（ｉｎｆｒａｒｅｄ ｇａｓ ａｎａｌｙｚｅｒ：ＩＲＧＡ）を用いて測定し、バイオガス及び水素の流速を調整して、４．０を超えるＨ２：ＣＯ２の比を達成した。リアクタは工業規模で設置した。リアクタが空である場合、スケールは考慮された。したがって、測定される重量は、リアクタの内容物の重量のみである。リアクタの上部空間の温度は６３℃であり、メタン化反応は大気圧で起こった。
４５００～５０００Ｌの充填体積を有する工業規模のリアクタを使用した。リアクタには、嫌気性消化装置から、およそ５０％のメタン及び５０％の二酸化炭素を含有するバイオガスを供給した。水素は水素タンクから供給した。バイオガス中のＣＯ２含有量は赤外線ガス分析計（ｉｎｆｒａｒｅｄ ｇａｓ ａｎａｌｙｚｅｒ：ＩＲＧＡ）を用いて測定し、バイオガス及び水素の流速を調整して、４．０を超えるＨ２：ＣＯ２の比を達成した。リアクタは工業規模で設置した。リアクタが空である場合、スケールは考慮された。したがって、測定される重量は、リアクタの内容物の重量のみである。リアクタの上部空間の温度は６３℃であり、メタン化反応は大気圧で起こった。
【0126】
運転中は、リアクタの内容物を排出しなかった。リアクタから出た唯一の内容物は水蒸気の形態であった。リアクタの出口から出るガスを水蒸気で飽和させた。この水を濃縮し、排水容器から収集した。
【0127】
【0128】
図１１に示す工業規模の実験では、初期リアクタ質量は、４８５０ｋｇであった。
【0129】
この実験の最初の５０時間にわたって、リアクタは水蒸気損失によって５０ｋｇの質量を失い、４８００ｋｇの重量が次の７０時間にわたって維持された。
【0130】
内容物はリアクタの底部または他の場所から排出しなかった。
【0131】
Ｂ．長期結果：５０日間の実験
内容物は、図１２に示す５０日間の実験期間中、リアクタから排出しなかった。バイオガス（５０％メタン及び５０％ＣＯ２）及び水素を４を超えるＨ２：ＣＯ２比でリアクタに供給した。リアクタを６３℃及び大気圧に維持した。バイオガス流量及び撹拌機の速度は、５０日間で変動した。
内容物は、図１２に示す５０日間の実験期間中、リアクタから排出しなかった。バイオガス（５０％メタン及び５０％ＣＯ２）及び水素を４を超えるＨ２：ＣＯ２比でリアクタに供給した。リアクタを６３℃及び大気圧に維持した。バイオガス流量及び撹拌機の速度は、５０日間で変動した。
【0132】
リアクタ質量の範囲は４７５０～４８５０ｋｇであった。ＣＨ４及びＨ２Ｏ生成の増加の結果としてバイオガス流速が増加した場合（２８８～３６５時間）、質量が増加した。出口（生成物）ガス流で放出された水蒸気は、バイオメタン化反応における生体触媒によって生成されたＨ２Ｏを除去する唯一の手段であった。
【0133】
したがって、効率的な連続メタン化工程を実行しながら蒸発によって過剰な代謝水を除去することは、別の適切な選択肢であり、容易に実現できることが示されている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
