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特許7561775血清学的アッセイにおいてＣＤ４７に結合する薬物の干渉を低減するための方法及び試薬
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-26
(45)【発行日】2024-10-04
(54)【発明の名称】血清学的アッセイにおいてＣＤ４７に結合する薬物の干渉を低減するための方法及び試薬
(51)【国際特許分類】
G01N 33/48 20060101AFI20240927BHJP
G01N 33/80 20060101ALI20240927BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240927BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240927BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240927BHJP
【ＦＩ】
G01N33/48 B
G01N33/80 ZNA
C12N15/13
C07K16/28
G01N33/53 N
G01N33/53 K
G01N33/53 R
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2021572418
(86)(22)【出願日】2020-06-05
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-05
(86)【国際出願番号】 US2020036425
(87)【国際公開番号】W WO2020247820
(87)【国際公開日】2020-12-10
【審査請求日】2023-06-05
(31)【優先権主張番号】62/858,871
(32)【優先日】2019-06-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/934,395
(32)【優先日】2019-11-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】516237639
【氏名又は名称】エーエルエックス オンコロジー インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】ワン， ホン
(72)【発明者】
【氏名】ポンズ， ジャウメ
(72)【発明者】
【氏名】ランドルフ， ソフィア
(72)【発明者】
【氏名】シム， バン ジャネット
【審査官】海野 佳子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１６－５１３６４０（ＪＰ，Ａ）
【文献】RANDALL W. V. et al，Monoclonal anti-CD47 interference in red cell and platelet testing，TRANSFUSION，2018年12月05日，Vol.59,No.2，P.730-737
【文献】PENKA S. PETROVA et al.，TTI-621(SIRPαFc）：A CD47-Blocking innate Immune checkpoint inhibitor with Broad Antitumor Activity and Minimal Erythrocyte Binding，CLINICAL CANCER RESERCH，vol.23,no.4，2017年02月15日，p.1068-1079
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
試薬赤血球（ＲＢＣ）または試薬血小板を使用する輸血前の血清学的アッセイにおける薬物干渉を低減する方法であって、（ａ）薬物に結合し、かつ前記試薬ＲＢＣまたは前記試薬血小板の薬物の結合をブロックする薬物中和剤を、前記薬物による治療を受けた対象由来の血漿試料へ添加することと、
（ｂ）前記試薬ＲＢＣまたは前記試薬血小板を使用して、ステップ（ａ）の後に前記血漿試料の前記血清学的アッセイを実行することと、を含み、
前記薬物は、（ｉ）ヒト抗体Ｆｃ領域、及び（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に結合する部分を含み、
ヒトＣＤ４７に結合する前記薬物の部分が、
（１）膜貫通ドメインを欠く野生型ＳＩＲＰα、または
（２）野生型ＳＩＲＰαの細胞外ドメインと比較して、１つ以上のアミノ酸置換（複数可）、欠失（複数可）、挿入（複数可）、Ｎ末端付加（複数可）及び／またはＣ末端付加（複数可）を含み、ヒトＣＤ４７に結合することができ、かつ膜貫通ドメインを欠く、ＳＩＲＰαバリアント
を含み、
前記薬物中和剤が、抗ＳＩＲＰα抗体であるか、またはヒトＣＤ４７に結合する前記部分に結合することができるその抗原結合フラグメントである、前記方法。
【請求項2】
赤血球（ＲＢＣ）及び／または血小板を含有する血液試料の輸血前の血清学的アッセイにおける薬物干渉を低減する方法であって、
（ａ）薬物による治療を受けた対象の由来の前記血液試料に、抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合フラグメントを追加することと、
（ｂ）ステップ（ａ）の後に、試薬血漿／抗血清を使用した前記血液試料の前記血清学的アッセイを実行することと
を含み、
前記薬物は、（ｉ）ヒト抗体Ｆｃ領域、及び（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に結合する野生型ＳＩＲＰαまたはそのバリアントの細胞外ドメインを含み、ＳＩＲＰαバリアントは、野生型ＳＩＲＰαの細胞外ドメインと比較して、１つ以上のアミノ酸置換（複数可）、欠失（複数可）、挿入（複数可）、Ｎ末端付加（複数可）及び／またはＣ末端付加（複数可）を含み、ヒトＣＤ４７に結合することができ、かつ膜貫通ドメインを欠き、
抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合フラグメントは、血液試料中のＲＢＣの表面でＣＤ４７に結合した薬物を置換する、前記方法。
【請求項3】
前記抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合フラグメントが、
（ａ）配列番号６を含む重鎖可変ドメイン（Ｖ Ｈ ）と、配列番号７を含む軽鎖可変ドメイン（Ｖ Ｌ ）
（ｂ）配列番号２１を含む重鎖可変ドメイン（Ｖ Ｈ ）と、配列番号２２を含む軽鎖可変ドメイン（Ｖ Ｌ ）
（ｃ）配列番号２１を含む重鎖可変ドメイン（Ｖ Ｈ ）と、配列番号２２を含む軽鎖可変ドメイン（Ｖ Ｌ ）
を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記薬物に対する前記薬物中和剤の親和性が、ヒトＣＤ４７に対する前記薬物の親和性よりも高い、請求項１または３に記載の方法。
【請求項5】
前記薬物中和剤が、前記血漿試料中の前記薬物の量に対してモル過剰量で前記血漿試料に添加される、請求項１、３及び４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合フラグメントが、前記血液試料中の前記薬物の量に対してモル過剰量で前記血液試料に添加される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項7】
前記薬物の前記抗体Ｆｃ領域がヒトＩｇＧ Ｆｃ領域であり、任意で前記ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、もしくはＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記輸血前の血清学的アッセイがＡＢＯ／Ｒｈ判定アッセイ、
即時スピン（ＩＳ）アッセイ
ＩｇＧ及び補体Ｃ３を検出する多重特異性試薬を使用する直接抗グロブリン（ＤＡＴ）アッセイ、
補体Ｃ３を検出する単一特異性試薬を使用する直接抗グロブリン（ＤＡＴ）アッセイ、
ＰＥＧ増強血清学的アッセイ、及び／または
前記ＤＡＴアッセイの後に実施される溶出液試験
である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１９年６月７日に出願された米国仮出願第６２／８５８，８７１号及び２０１９年１１月１２日に出願された米国仮出願第６２／９３４，３９５号の優先権を主張し、それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年６月７日に出願された米国仮出願第６２／８５８，８７１号及び２０１９年１１月１２日に出願された米国仮出願第６２／９３４，３９５号の優先権を主張し、それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
ＡＳＣＩＩテキストファイルの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルに関する以下の提出物の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形式（ＣＲＦ）（ファイル名：７５７９７２０００９４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録された日付：２０２０年６月３日、サイズ：２６ＫＢ）。
ＡＳＣＩＩテキストファイルに関する以下の提出物の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形式（ＣＲＦ）（ファイル名：７５７９７２０００９４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録された日付：２０２０年６月３日、サイズ：２６ＫＢ）。
【0003】
本発明は、（ｉ）抗体Ｆｃ領域及び（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に結合する部分を含む薬物による血清学的アッセイにおける干渉を低減するのに使用するための方法及び試薬に関する。
【背景技術】
【0004】
がんを含む多種多様な疾患の治療として、ますます多くの抗体ベースの薬物が開発されている。このような治療は、治療用抗体の標的が赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）、及び／または血小板などの血液細胞にも発現している場合、血液型判定及び血清学的アッセイを妨げる可能性がある。
【0005】
例えば、ＣＤ４７、シグナル調節タンパク質－α（ＳＩＲＰα）に結合し、食作用を阻害する広く発現された細胞表面タンパク質（Ｊａｉｓｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１０）３１（６）：２１２－２１９；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（２００１）１１（３）：１３０－１３５）は、血液腫瘍及び固形腫瘍を含む多種多様な悪性腫瘍で、高レベルで発現される。ＣＤ４７発現の上昇は、侵攻性疾患とも相関する（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２０１２）１０９（１７）：６６６２－６６６７）。ＣＤ４７を標的とするいくつかのがん治療法、例えば抗体及び抗体Ｆｃ領域を含む融合タンパク質は、ＳＩＲＰα－ＣＤ４７相互作用をブロックするために開発されており、それによりマクロファージが食作用機能を実行して腫瘍細胞を除去することが可能になる。
【0006】
ＣＤ４７は、赤血球（ＲＢＣ）及び血小板などの血液細胞の表面にも発現されるため（Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８８（５４７３）：２０５１～２０５４）、ＣＤ４７を標的する抗体Ｆｃ領域を含む薬物は、血液型判定及び血清学的試験を妨げ得る。さらに、ＣＤ４７標的薬（例えば、がんの治療）を投与されている患者は、同時の貧血及び／または血小板減少症を治療するために輸血を必要とすることが多いので、抗ＣＤ４７薬による血清学的及び血液型判定アッセイへの干渉は、患者の安全上の重大な懸念事項である。したがって、当該技術分野では、抗体Ｆｃ領域を含むＣＤ４７標識薬物の血清学的アッセイへの干渉を低減するための方法及び試薬を開発する必要がある。
【発明の概要】
【0007】
試薬赤血球（ＲＢＣ）または試薬血小板を使用する血清学的アッセイにおける薬物干渉を低減する方法が提供され、当該方法は、（ａ）薬物に結合し、薬物が試薬ＲＢＣまたは試薬血小板に結合するのをブロックする薬物中和剤を、薬物による治療を受けた対象由来の血漿試料に対して添加すること、ならびに（ｂ）ステップ（ａ）の後に、試薬ＲＢＣまたは試薬血小板を使用して血漿試料の血清学的アッセイを実施することを含み、この薬物が、（ｉ）ヒト抗体Ｆｃ領域またはそのバリアント、及び（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に結合する部分を含む。
【0008】
いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ４７に結合する薬物の部分は、野生型ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰαのバリアント、または野生型のＳＩＲＰαもしくはＳＩＲＰαのバリアントのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ４７に結合する薬物の部分は、ＳＩＲＰαバリアントを含み、ＳＩＲＰαバリアントは、野生型ＳＩＲＰαと比較して、１つ以上のアミノ酸置換（複数可）、挿入（複数可）、欠失（複数可）、Ｎ末端伸長（複数可）、及び／またはＣ末端伸長（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ４７に結合する薬物の部分は、ＳＩＲＰαバリアントのフラグメントを含み、このフラグメントは、ＳＩＲＰαバリアントの細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、薬物中和剤は、野生型ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰαバリアント、または野生型ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαバリアントのフラグメントに結合し得る抗ＳＩＲＰα抗体である。
【0009】
いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ４７に結合する薬物の部分は、野生型のＳＩＲＰγ、ＳＩＲＰγバリアント、または野生型のＳＩＲＰγもしくはＳＩＲＰγバリアントのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ４７に結合する薬物の部分は、ＳＩＲＰγバリアントを含み、このＳＩＲＰγバリアントは、野生型ＳＩＲＰγと比較して、１つ以上のアミノ酸置換（複数可）、挿入（複数可）、欠失（複数可）、Ｎ末端伸長（複数可）、Ｃ末端伸長（複数可）または前述の任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ４７に結合する薬物の部分は、ＳＩＲＰγバリアントのフラグメントを含み、このフラグメントは、ＳＩＲＰγバリアントの細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、薬物中和剤は、野生型ＳＩＲＰγ、ＳＩＲＰγバリアント、または野生型ＳＩＲＰγもしくはＳＩＲＰγバリアントのフラグメントに結合し得る抗ＳＩＲＰγ抗体である。
【0010】
いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ４７に結合する薬物の部分は、ＳＩＲＰβバリアントまたはＳＩＲＰβバリアントのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ４７に結合する薬物の部分は、ＳＩＲＰβバリアントを含み、ＳＩＲＰβバリアントは、野生型ＳＩＲＰγと比較して、１つ以上のアミノ酸置換（複数可）、挿入（複数可）、欠失（複数可）、Ｎ末端伸長（複数可）、Ｃ末端伸長（複数可）、または前述の任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ４７に結合する薬物の部分は、ＳＩＲＰβバリアントのフラグメントを含み、このフラグメントは、ＳＩＲＰβバリアントの細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、薬物中和剤は、ＳＩＲＰγバリアントまたはＳＩＲＰβバリアントのフラグメントに結合し得る抗ＳＩＲＰβ抗体である。
【0011】
いくつかの実施形態では、薬物は、抗ＣＤ４７抗体である。いくつかの実施形態では、薬物中和剤は、抗ＣＤ４７抗体の抗原結合部分に結合する抗イディオタイプ抗体である。
【0012】
いくつかの実施形態では、薬物中和剤は、ヒトＣＤ４７に結合する薬物の部分に結合し得るＣＤ４７ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７ポリペプチドは、モノマー、ダイマー、またはオリゴマーである。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７ポリペプチドは、ヒトＣＤ４７、マウスＣＤ４７、ラットＣＤ４７、アカゲザルＣＤ４７、またはカニクイザルＣＤ４７である。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７ポリペプチドは、野生型ＣＤ４７と比較して、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、欠失、Ｎ末端伸長、またはＣ末端伸長を含むＣＤ４７バリアントである。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７バリアントは、配列番号２～５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。
【0013】
いくつかの実施形態では、薬物に対する薬物中和剤の親和性は、ヒトＣＤ４７に対する薬物の親和性よりも高い。いくつかの実施形態では、薬物中和剤は、血漿試料中の薬物の量に対してモル過剰量で血漿試料に添加される。
【0014】
赤血球（ＲＢＣ）及び／または血小板を含む血液試料の血清学的アッセイにおける薬物干渉を低減する方法も提供され、当該方法は、（ａ）抗ＳＩＲＰα抗体を、薬物による治療を受けた対象由来の血液試料に添加することと、（ｂ）ステップ（ａ）の後に血液試料の血清学的アッセイを実行することと、を含み、この薬物は（ｉ）抗体Ｆｃ領域、及び（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に結合する野生型ＳＩＲＰαまたはそのバリアントの細胞外ドメインを含み、抗ＳＩＲＰα抗体フラグメントは、血液試料中のＲＢＣの表面でＣＤ４７に結合した薬物を置換する。いくつかの実施形態では、抗ＳＩＲＰα抗体は、（ａ）配列番号６を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号７を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、（ｂ）配列番号２１を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号２２を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、または（ｃ）配列番号２３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号２４を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、薬物は、野生型ＳＩＲＰαの細胞外ドメインのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、このバリアントは、野生型ＳＩＲＰαの細胞外ドメインと比較して、１つ以上のアミノ酸置換（複数可）、挿入（複数可）、欠失（複数可）、Ｎ末端伸長（複数可）、及び／またはＣ末端伸長（複数可）を含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、抗ＳＩＲＰα抗体は、血液試料中の薬物の量に対してモル過剰量で血液試料に添加される。
【0016】
試薬赤血球（ＲＢＣ）、試薬血小板、またはそれらの組み合わせを使用する血清学的アッセイにおける薬物干渉を低減する方法も提供され、当該方法は、（ａ）試薬赤血球（ＲＢＣ）、試薬血小板、またはそれらの組み合わせに細胞結合剤を添加することであって、細胞結合剤がヒトＣＤ４７に結合し、抗体Ｆｃ領域を含まないことと、（ｂ）試薬赤血球（ＲＢＣ）、試薬血小板、またはステップ（ａ）のそれらの組み合わせを使用して血漿試料の血清学的アッセイを実施することとを含み、この血漿試料が、薬物による治療を受けた対象由来のものであり、この薬物が、（ｉ）抗体Ｆｃ領域及び（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に結合する部分を含む。
【0017】
さらに、試薬赤血球（ＲＢＣ）、試薬血小板、またはそれらの組み合わせを使用する血清学的アッセイにおける薬物干渉を低減する方法が提供され、当該方法は、（ａ）細胞結合剤を、細胞結合剤がヒトＣＤ４７に結合し、抗体Ｆｃ領域を含まない、薬物による治療を受けた対象由来の血漿試料に添加することと、（ｂ）ステップ（ａ）の後に、試薬赤血球（ＲＢＣ）、試薬血小板、またはそれらの組み合わせを使用して血漿試料の血清学的アッセイを実施することとを含み、この薬物は（ｉ）抗体Ｆｃ領域及び（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に結合する部分を含む。
【0018】
試薬赤血球（ＲＢＣ）、試薬血小板、またはそれらの組み合わせを含む血液試料の血清学的アッセイにおける薬物干渉を低減する方法も提供され、当該方法は、（ａ）ヒトＣＤ４７に結合し、抗体Ｆｃ領域を含まない細胞結合剤を、薬物による治療を受けた対象由来の血液試料に対して添加することと、（ｂ）ステップ（ａ）の後に血液試料の血清学的アッセイを実施することとを含み、この薬物は、（ｉ）抗体Ｆｃ領域及び（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に結合する部分を含む。
【0019】
いくつかの実施形態では、細胞結合剤は、野生型ＳＩＲＰα、野生型ＳＩＲＰγ、またはヒトＣＤ４７に結合し得る野生型ＳＩＲＰαもしくは野生型ＳＩＲＰγのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、細胞結合剤は、ヒトＣＤ４７に結合し得るＳＩＲＰαバリアントまたはそのＣＤ４７結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰαバリアントは、野生型ＳＩＲＰαと比較して、１つ以上のアミノ酸置換（複数可）、挿入（複数可）、欠失（複数可）、Ｎ末端伸長（複数可）、Ｃ末端伸長（複数可）、または前述のそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞結合剤は、ヒトＣＤ４７に結合し得るＳＩＲＰβバリアントまたはそのＣＤ４７結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰβバリアントは、野生型ＳＩＲＰβと比較して、１つ以上のアミノ酸置換（複数可）、挿入（複数可）、欠失（複数可）、Ｎ末端伸長（複数可）、Ｃ末端伸長（複数可）、または前述のそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞結合剤は、ヒトＣＤ４７に結合し得るＳＩＲＰγバリアントまたはそのＣＤ４７結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰγバリアントは、野生型ＳＩＲＰγと比較して、１つ以上のアミノ酸置換（複数可）、挿入（複数可）、欠失（複数可）、Ｎ末端伸長（複数可）、Ｃ末端伸長（複数可）、または前述のそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、このバリアントは、配列番号８～１６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【0020】
いくつかの実施形態では、細胞結合剤は、抗ＣＤ４７抗体の抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはダイアボディである。
【0021】
いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ４７に対する細胞結合剤の親和性は、ヒトＣＤ４７に対する薬物の親和性よりも高い。いくつかの実施形態では、細胞結合剤は、血漿試料中の薬物の量に対してモル過剰量で試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板に添加される。いくつかの実施形態では、細胞結合剤は、血漿試料中の薬物の量に対してモル過剰量で血漿試料に添加される。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰα剤は、血液試料中の薬物の量に対してモル過剰量で血液試料に添加される。
【0022】
いくつかの実施形態では、薬物の抗体Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域またはそのバリアントである。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、もしくはＩｇＧ４ Ｆｃ領域、またはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、もしくはＩｇＧ４ Ｆｃ領域のバリアントである。
【0023】
いくつかの実施形態では、血清学的アッセイは、ＡＢＯ／Ｒｈ判定アッセイである。いくつかの実施形態では、血清学的アッセイは、即時スピン（ＩＳ）アッセイである。いくつかの実施形態では、血清学的アッセイは、ＩｇＧ及び補体Ｃ３を検出する多重特異性試薬を使用する直接抗グロブリン（ＤＡＴ）アッセイである。いくつかの実施形態では、血清学的アッセイは、補体Ｃ３を検出する単一特異性試薬を使用する直接抗グロブリン（ＤＡＴ）アッセイである。いくつかの実施形態では、血清学的アッセイは、ＰＥＧ増強血清学的アッセイである。いくつかの実施形態では、血清学的アッセイは、ＤＡＴアッセイの後に実施される溶出液試験である。
【0024】
配列番号１１～２０のいずれか１つを含むポリペプチドも提供される。
【0025】
特許出願、特許公開、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号を含む、本明細書で引用される全ての参考文献は、あたかも個々の参考文献が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1A】対象から得られた血漿試料を、試薬赤血球（すなわち、特定の細胞表面抗原または細胞表面抗原の群を発現することが既知の赤血球（「ＲＢＣ」））と混合して、血漿試料中のＲＢＣ表面抗原に結合する抗体の存在を検出する血清学的アッセイを示す。あるいは、そのような血清学的アッセイは、試薬ＲＢＣの代わりに試薬血小板（すなわち、特定の細胞表面抗原、または細胞表面抗原の群を発現することが既知の血小板）を使用して実施してもよい。
【図1C】対象から得られた血液試料を、試薬血漿／抗血清（すなわち、特定のＲＢＣ表面抗原（複数可）または血小板表面抗原（複数可）に対する抗体を含むことが既知の血漿または抗血清）と順番に混合して、対象のＲＢＣ及び／または血小板上の抗原の存在を検出する血清学的アッセイを示す。
【図2】薬物で治療された対象から得られた血漿試料に薬物中和剤を添加することを含む、血清学的アッセイにおける干渉を低減する方法を示す。簡単に説明すると、薬物中和剤は血漿試料中の薬物に結合するので、試薬ＲＢＣまたは試薬血小板の表面にあるＣＤ４７に結合するために利用可能な遊離薬物はほとんどまたはまったくない。
【図3A】薬物による治療を受けた対象由来の血漿試料に抗ＳＩＲＰα抗体を添加することを含む、血清学的アッセイにおける干渉を低減する方法を示す。抗ＳＩＲＰα抗体は、血漿試料中の薬物に結合するので、試薬ＲＢＣまたは試薬血小板の表面にあるＣＤ４７に結合するために利用可能な遊離薬物はほとんどまたはまったくない。
【図3B】薬物による治療を受けた対象由来の血液試料に抗ＳＩＲＰα抗体を添加することを含む、血清学的アッセイにおける干渉を低減する方法を示す。抗ＳＩＲＰα抗体は、対象のＲＢＣ及び／または血小板の表面でＣＤ４７に結合した薬物を置換し、患者の血液試料中の薬物結合ＲＢＣ及び／または薬物結合血小板の量を最小限に抑える（または試料中の薬物結合ＲＢＣ及び／もしくは薬物結合血小板を排除する）。
【図4A】試薬ＲＢＣまたは試薬血小板に細胞結合剤を添加することを含む、血清学的アッセイにおける干渉を低減する方法を示す。簡単に説明すると、ヒトＣＤ４７に結合し、抗体Ｆｃ領域を含まない細胞結合剤は、試薬ＲＢＣまたは試薬血小板の表面のＣＤ４７に結合する。細胞結合剤による試薬ＲＢＣ（または試薬血小板）の結合は、薬物が試薬ＲＢＣ（または試薬血小板）に結合するのをブロックする。
【図4B】薬物による治療を受けた対象由来の血漿に細胞結合剤を添加することを含む、血清学的アッセイにおける干渉を低減する方法を示す。簡単に説明すると、細胞結合剤は、試薬ＲＢＣまたは試薬血小板の表面に発現するＣＤ４７への結合について薬物と競合し、かつこのアッセイにおける薬物結合試薬ＲＢＣまたは薬物結合試薬血小板の量を最小限に抑える（またはこのアッセイにおける薬物結合試薬ＲＢＣ及び／または薬物結合試薬血小板を排除する）。
【図4C】薬物による治療を受けた対象由来の血液試料に細胞結合剤を添加することを含む、血清学的アッセイにおける干渉を低減する方法を示す。簡単に言えば、細胞結合剤は、対象のＲＢＣ及び／または血小板の表面に発現されるＣＤ４７への結合について薬物と競合し、このアッセイにおける薬物結合ＲＢＣ及び／または薬物結合血小板の量を最小化する（または排除する）。
【図5A】ＳＩＲＰαとＣＤ４７との間の相互作用をブロックする例示的な抗ＳＩＲＰα抗体である抗体Ａが赤血球表面上のＣＤ４７に結合した薬物Ａの干渉を軽減するか否かを決定するために実施した血球凝集実験の結果を示す。
【図5B】抗体Ａが、ＤＬＤ－１細胞の表面上のＣＤ４７に結合した薬物Ａを置換するか否かを決定するために実施した実験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0027】
輸血前の血清学的アッセイにおける干渉を軽減する方法
ＣＤ４７は、トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）、ならびにシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）を含む免疫細胞上のいくつかの分子と相互作用する膜貫通タンパク質である。ＣＤ４７に結合すると、ＳＩＲＰαは、食作用を阻害し、免疫系による健康な細胞の食作用による除去を防ぐシグナル伝達カスケードを開始する。しかし、多くのがんは、ＣＤ４７を過剰発現し、食細胞のクリアランスを回避する。したがって、ＣＤ４７を標的とする薬物（例えば、抗ＣＤ４７抗体及び抗体Ｆｃ領域とＣＤ４７に結合する部分とを含む融合タンパク質）は、治療上非常に重要である。ＣＤ４７は、ヒト赤血球（ＲＢＣ）及び血小板の表面にも発現している。したがって、（ｉ）抗体Ｆｃ領域及び（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に結合する部分を含む薬物の対象への投与に続いて、対象の血漿中に存在するか、または対象のＲＢＣ及び／もしくは血小板に結合する薬物は、慣用的な輸血前血清学的アッセイにおける障害となり得る。
ＣＤ４７は、トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）、ならびにシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）を含む免疫細胞上のいくつかの分子と相互作用する膜貫通タンパク質である。ＣＤ４７に結合すると、ＳＩＲＰαは、食作用を阻害し、免疫系による健康な細胞の食作用による除去を防ぐシグナル伝達カスケードを開始する。しかし、多くのがんは、ＣＤ４７を過剰発現し、食細胞のクリアランスを回避する。したがって、ＣＤ４７を標的とする薬物（例えば、抗ＣＤ４７抗体及び抗体Ｆｃ領域とＣＤ４７に結合する部分とを含む融合タンパク質）は、治療上非常に重要である。ＣＤ４７は、ヒト赤血球（ＲＢＣ）及び血小板の表面にも発現している。したがって、（ｉ）抗体Ｆｃ領域及び（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に結合する部分を含む薬物の対象への投与に続いて、対象の血漿中に存在するか、または対象のＲＢＣ及び／もしくは血小板に結合する薬物は、慣用的な輸血前血清学的アッセイにおける障害となり得る。
【0028】
例えば、図１Ａは、対象から得られた血漿試料を、試薬ＲＢＣもしくは「参照ＲＢＣ」（すなわち、特定の細胞表面抗原または細胞表面抗原群を発現することが既知のＲＢＣ）または試薬血小板もしくは「参照血小板」（すなわち、特定の細胞表面抗原を発現することが既知の血小板、または細胞表面抗原の群）と混合して、試薬ＲＢＣまたは試薬血小板上に発現することが既知の、細胞表面抗原に結合する血漿試料中の抗体の存在を検出する、血清学的アッセイを示す。血漿試料と試薬ＲＢＣ（または試薬血小板）を混合した後、抗ヒトグロブリン（ＡＨＧ）を添加し、血漿試料にＲＢＣ表面抗原（または血小板表面抗原）に結合する抗体が含まれている場合、試薬ＲＢＣ（または試薬血小板）の凝集（例えば、クランピング）が起こる。ただし、（ｉ）抗体Ｆｃ領域、及び（ｉｉ）対象の血漿中のヒトＣＤ４７に結合する部分を含む薬物の存在は、アッセイを妨害し、偽陽性の結果をもたらし得る。図１Ｂに示すように、対象の血漿と試薬ＲＢＣ（または試薬血小板）が混合された後、薬物は、試薬ＲＢＣ（または試薬血小板）の表面に発現されるＣＤ４７に結合し得る。混合物にＡＨＧを添加すると、試薬ＲＢＣ（または試薬血小板）の凝集につながる。
【0029】
図１Ｃは、対象由来の血液試料を、試薬血漿／抗血清（すなわち、既知のＲＢＣ表面抗原（複数可）または既知の血小板表面抗原（複数可）に対する抗体を含む血漿または抗血清）と混合して、対象のＲＢＣ及び／または血小板上の抗原の存在を検出する、血清学的アッセイを示す。試薬血漿／抗血清と対象由来の試料とを混合した後、試薬血漿／抗血清中の抗体によって認識される抗原が対象のＲＢＣ及び／または血小板に発現している場合、ＡＨＧの添加は凝集を引き起こす。（ｉ）抗体Ｆｃ領域、及び（ｉｉ）対象のＲＢＣ及び／または血小板を含む試料中のヒトＣＤ４７に結合する部分を含む薬物の存在は、アッセイを妨害し、偽陽性の結果を生じ得る。図１Ｄに示すように、対象のＲＢＣまたは血小板上のＣＤ４７に結合した薬物は、対象の血液試料と試薬血漿／抗血清とを含む混合物にＡＨＧを添加した後、凝集を引き起こす。
【0030】
【0031】
Ａ．輸血前の血清学的アッセイにおける干渉を軽減するために薬物中和剤を使用する方法
いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）薬物に（すなわち、ヒトＣＤ４７に結合する部分を含む薬物の一部に）結合する薬物中和剤を、薬物による治療を受けた対象由来の血漿試料に添加することと、（ｂ）ステップ（ａ）の後に試薬ＲＢＣ（すなわち、特定の細胞表面抗原または細胞表面抗原の群を発現することが既知のＲＢＣ）及び／または試薬血小板（すなわち、特定の細胞表面抗原、または細胞表面抗原の群を発現することが既知の血小板）を使用して血漿試料の血清学的アッセイを実施することとを含み、薬物は、（ｉ）抗体Ｆｃ領域及び（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に結合する部分を含む。そのような実施形態は、一般的に図２に示されている。図２に示されるように、薬物中和剤は、対象の血漿試料中の薬物（例えば、ヒトＣＤ４７に結合する薬物の部分）に結合して、この薬物が試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板に結合するのをブロックする。試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板の表面のＣＤ４７に結合するために利用できる遊離薬物はほとんどまたはまったくない。試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板への薬物の結合から生じる干渉は（図１Ｂに示されるように）、最小限に抑えられ（または、いくつかの実施形態では排除され）、したがって血清学的アッセイにおける偽陽性結果が防止される。いくつかの実施形態では、薬物中和剤はまた、血清学的アッセイが実施される前に、試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板に添加される。
いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）薬物に（すなわち、ヒトＣＤ４７に結合する部分を含む薬物の一部に）結合する薬物中和剤を、薬物による治療を受けた対象由来の血漿試料に添加することと、（ｂ）ステップ（ａ）の後に試薬ＲＢＣ（すなわち、特定の細胞表面抗原または細胞表面抗原の群を発現することが既知のＲＢＣ）及び／または試薬血小板（すなわち、特定の細胞表面抗原、または細胞表面抗原の群を発現することが既知の血小板）を使用して血漿試料の血清学的アッセイを実施することとを含み、薬物は、（ｉ）抗体Ｆｃ領域及び（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に結合する部分を含む。そのような実施形態は、一般的に図２に示されている。図２に示されるように、薬物中和剤は、対象の血漿試料中の薬物（例えば、ヒトＣＤ４７に結合する薬物の部分）に結合して、この薬物が試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板に結合するのをブロックする。試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板の表面のＣＤ４７に結合するために利用できる遊離薬物はほとんどまたはまったくない。試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板への薬物の結合から生じる干渉は（図１Ｂに示されるように）、最小限に抑えられ（または、いくつかの実施形態では排除され）、したがって血清学的アッセイにおける偽陽性結果が防止される。いくつかの実施形態では、薬物中和剤はまた、血清学的アッセイが実施される前に、試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板に添加される。
【0032】
いくつかの実施形態では、薬物中和剤とは、薬物に結合し得、薬物が試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板に結合するのをブロックし得る任意の薬剤である。いくつかの実施形態では、薬物中和剤は、血清学的アッセイが実施される前に、試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板に（例えば、試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板のみに）添加される。
【0033】
いくつかの実施形態では、方法は、例えば、薬物中和剤が可溶性である溶液中で実施される。いくつかの実施形態では、薬物中和剤が、固相に固定化された後、この方法がマトリックスまたは表面への吸着、共有結合、または非共有結合を介して実行される。いくつかの実施形態では、薬物中和剤は、固相への固定化に続いて薬物に結合し得る。固定化に使用される固相または表面は、本質的に水不溶性であり、かつ例えば、表面、粒子、多孔質マトリックス、セルロースポリマースポンジ（Ｉｍｍｕｎｏ ＣＡＰ（登録商標），Ｐｈａｄｉａ）などの形態の支持体を含む、イムノアッセイにおいて有用である任意の不活性支持体または担体であってもよい。一般的に使用される支持体の例としては、小さなシート、セファデックス、ポリ塩化ビニル、プラスチックビーズ、微粒子、アッセイプレート、またはポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンから製造された試験管などが含まれる。いくつかの実施形態では、薬物中和剤は、複数の試料を同時に分析するために使用され得る、マルチウェルマイクロタイタープレートなどのマイクロタイタープレート上にコーティングされる。
【0034】
いくつかの実施形態では、薬物は、（ｉ）抗体Ｆｃ領域、及び（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に結合するＳＩＲＰαバリアント、ＳＩＲＰβバリアント、またはＳＩＲＰγバリアントを含み、そして薬物中和剤は、ＳＩＲＰαバリアント、ＳＩＲＰβバリアント、またはＳＩＲＰγバリアントに結合し得るＣＤ４７ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、薬物は、抗ＣＤ４７抗体（例えば、抗ヒトＣＤ４７抗体）を含み、薬物中和剤は、抗ヒトＣＤ４７抗体に結合し得るＣＤ４７ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７ポリペプチドは、野生型ＣＤ４７（「ＷＴ ＣＤ４７－ＥＣＤ」）の細胞外ドメイン、または薬物に結合し、かつその薬物が試薬ＲＢＣ及び／もしくは血小板に結合するのをブロックし得るＷＴ ＣＤ４７－ＥＣＤの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７ポリペプチドは、ＣＤ４７モノマー、ＣＤ４７ダイマー、またはＣＤ４７オリゴマーを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７オリゴマーは、自発的に（例えば、インビトロで）形成されるオリゴマーである。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７オリゴマーは、操作されたオリゴマー、例えば、ペプチド結合またはリンカーを介して連結されたＣＤ４７ポリペプチドの連結鎖、多量体化を促進するドメインを含むように操作されたＣＤ４７、またはＣＤ４７の固体支持体（例えば、ビーズ、ガラス面など）への結合を促進するタグを含むように操作されたＣＤ４７である。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７ポリペプチドは、融合ポリペプチド、例えば、ＣＤ４７（またはそのフラグメント）を含む融合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、ＣＤ４７（またはそのフラグメント）及び抗体Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７ポリペプチドは、ヒトＣＤ４７、マウスＣＤ４７、ラットＣＤ４７、アカゲザルＣＤ４７、カニクイザルＣＤ４７、または薬物に結合し、そしてその薬物が試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板に結合するのをブロックし得る任意の起源のＣＤ４７を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７ポリペプチドは、フラグメントが薬物に結合し、その薬物が試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板に結合するのをブロックし得るという条件で、任意の起源のヒトＣＤ４７、マウスＣＤ４７、ラットＣＤ４７、アカゲザルＣＤ４７、カニクイザルＣＤ４７、またはＣＤ４７のフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７ポリペプチドは、バリアントが薬物に結合し得るという条件で、野生型ＣＤ４７のバリアント（またはそのフラグメント、例えば、ＷＴ ＣＤ４７－ＥＣＤのバリアント）である。いくつかの実施形態では、バリアント（またはそのフラグメント）は、野生型ＣＤ４７（例えば、野生型のヒト、ラット、マウス、アカゲザル、またはカニクイザルＣＤ４７）と比較して、１つ以上のアミノ酸置換（複数可）、欠失（複数可）、挿入（複数可）、Ｎ末端付加（複数可）及び／またはＣ末端付加（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、バリアント（すなわち、「ＣＤ４７バリアント」）に存在する１つ以上のアミノ酸置換（複数可）、欠失（複数可）、挿入（複数可）、Ｎ末端付加（複数可）及び／またはＣ末端付加（複数可）は、野生型ＣＤ４７（例えば、野生型ヒト、ラット、マウス、アカゲザル、またはカニクイザルのＣＤ４７）と比較して、ＣＤ４７バリアントのグリコシル化パターンを変更する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７バリアントに存在する１つ以上のアミノ酸置換（複数可）、欠失（複数可）、挿入（複数可）、Ｎ末端付加（複数可）及び／またはＣ末端付加（複数可）は、野生型ＣＤ４７（例えば、野生型ヒト、ラット、マウス、アカゲザル、またはカニクイザルＣＤ４７）と比較して薬物のＣＤ４７バリアントの親和性を増大させる。
【0035】
いくつかの実施形態では、ＣＤ４７バリアントは、以下の配列番号１～５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む：
（配列番号１）
（配列番号２）
（配列番号３）
（配列番号４）
（配列番号５）
【0036】
本明細書に記載の方法において薬物中和剤として使用し得る例示的なＣＤ４７バリアントに関する追加の詳細は、Ｈｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）「‘Ｖｅｌｃｒｏ’ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＣＤ４７ Ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ ａｓ Ｓｉｇｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａ（ＳＩＲＰα） Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ Ｔｈａｔ Ｅｎｈａｎｃｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ．」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２９０：１２６５０－１２６６３及びＷＯ２０１６／１７９３９９（これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に示される。
【0037】
いくつかの実施形態では、薬物は、（ｉ）抗体Ｆｃ領域及び（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に結合するＳＩＲＰαバリアントを含み、薬物中和剤は、抗ＳＩＲＰα抗体（またはその抗原結合フラグメント）である。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）薬物による治療を受けた対象由来の血漿試料に、抗ＳＩＲＰα抗体（またはその抗原結合フラグメント）を添加すること、及び（ｂ）ステップ（ａ）後に、試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板を使用して、血漿試料の血清学的アッセイを実施することを含む。図３Ａに一般的に示されているように、抗ＳＩＲＰα抗体（またはその抗原結合フラグメント）は、対象の血漿中に存在する遊離薬物に結合し、試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板の表面上のＣＤ４７に対して利用可能な遊離薬物の量を減少させる（またはいくつかの実施形態では排除する）。試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板への薬物の結合から生じる干渉は（図１Ｂに示されるように）、最小限に抑えられ（または、いくつかの実施形態では排除され）、したがって血清学的アッセイにおける偽陽性の結果を防ぐ。いくつかの実施形態では、抗ＳＩＲＰα抗体（またはその抗原結合フラグメント）は、血清学的アッセイが実施される前に、試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板、ならびに対象の血漿に添加される。ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰβ、及びＳＩＲＰγの細胞外ドメインは相同性が高いので、ＳＩＲＰαと交差反応する抗ＳＩＲＰβ抗体及び／または抗ＳＩＲＰγ抗体は、ＳＩＲＰαと交差反応し得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰαと交差反応する抗ＳＩＲＰβ抗体及び／または抗ＳＩＲＰγ抗体がこの方法で使用される。
【0038】
いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）薬物による治療を受けた対象由来の血液試料に、抗ＳＩＲＰα抗体（またはその抗原結合フラグメント）を添加すること、及び（ｂ）ステップ（ａ）後に、試薬血漿／抗血清を使用した血液試料の血清学的アッセイを実施することを含む。図３Ｂに一般的に示されるように、抗ＳＩＲＰα抗体（またはそのフラグメント）は、対象のＲＢＣ及び／または血小板の表面上のＣＤ４７に結合した薬物を置換し、これによって、例えば、図１Ｄに示されるように、薬物によって生じる干渉を低減する（及びいくつかの実施形態では、排除する）。いくつかの実施形態では、抗ＳＩＲＰα抗体（またはそのフラグメント）を、血清学的アッセイが実施される前に、試薬血漿／抗血清、ならびに対象のＲＢＣ及び／または血小板に添加する。ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰβ、及びＳＩＲＰγの細胞外ドメインは高度に相同であるので、抗ＳＩＲＰβ抗体及び／または抗ＳＩＲＰγ抗体は、ＳＩＲＰαと交差反応し得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰαと交差反応する抗ＳＩＲＰβ抗体及び／またはＳＩＲＰαと交差反応する抗ＳＩＲＰγ抗体がこの方法で使用される。いくつかの実施形態では、抗ＳＩＲＰα抗体（またはＳＩＲＰαと交差反応する抗ＳＩＲＰβ抗体またはＳＩＲＰαと交差反応する抗ＳＩＲＰγ抗体）は、血清学的アッセイで使用される抗ヒトグロブリン試薬（ＡＨＧ）に結合しないＦｃドメイン（またはその一部）を含む。血清学的アッセイ、及びそのようなアッセイで使用される試薬に関するさらなる詳細は、本明細書の他の場所に示される。
【0039】
いくつかの実施形態では、抗ＳＩＲＰα抗体（例えば、ＳＩＲＰαと交差反応する抗ＳＩＲＰβ抗体及び／またはＳＩＲＰαと交差反応する抗ＳＩＲＰγ抗体など）は、全長抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＳＩＲＰα抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ダイアボディ、ワンアーム抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、単一ドメイン抗体、単一重鎖抗体などである。いくつかの実施形態では、抗ＳＩＲＰα抗体（またはその抗原結合フラグメント）は、ＡＤＡ（抗薬物抗体）または薬物に結合するＮＡｂ（中和抗体）（すなわち、ＳＩＲＰαバリアントを含む薬物の一部）である。いくつかの実施形態では、抗ＳＩＲＰα抗体（またはその抗原結合フラグメント）は、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、抗ＳＩＲＰα抗体（またはその抗原結合フラグメント）は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、抗ＳＩＲＰα抗体（またはその抗原結合フラグメント）は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
（配列番号６）
（配列番号７）
（配列番号２１）
（配列番号２２）
（配列番号２３）
（配列番号２４）
【0040】
本明細書に記載の方法において薬物中和剤として使用され得る他の例示的な抗ＳＩＲＰ抗体（例えば、抗ＳＩＲＰα抗体、抗ＳＩＲＰβ抗体、及び／またはＳＩＲＰαと交差反応する抗ＳＩＲＰγ抗体）は、当該技術分野で公知である。そのような抗体に関するさらなる詳細は、例えば、ＷＯ２０１８／０５７６６９、ＵＳ－２０１８－０１０５６００－Ａ１、ＵＳ２０１８０３１２５８７、ＷＯ２０１８１０７０５８、ＷＯ２０１９０２３３４７、ＵＳ２０１８００３７６５２、ＷＯ２０１８２１０７９５、ＷＯ２０１７１７８６５３、ＷＯ２０１８１４９９３８、ＷＯ２０１７０６８１６４、及びＷＯ２０１６０６３２３３（これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される。
【0041】
いくつかの実施形態では、薬物は、（ｉ）抗体Ｆｃ領域及び（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に結合するＳＩＲＰβバリアントを含み、この薬物中和剤は、抗ＳＩＲＰβ抗体（またはその抗原結合フラグメント）である。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）薬物による治療を受けた対象由来の血漿試料に、抗ＳＩＲＰβ抗体（またはその抗原結合フラグメント）を添加すること、及び（ｂ）ステップ（ａ）後、試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板を使用した血漿試料の血清学的アッセイを実施することを含む。いくつかの実施形態では、抗ＳＩＲＰβ抗体（またはその抗原結合フラグメント）は、血清学的アッセイが実施される前に、試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板、ならびに対象の血漿に添加される。いくつかの実施形態では、抗ＳＩＲＰβ抗体は、全長抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＳＩＲＰβ抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ダイアボディ、ワンアーム抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、単一ドメイン抗体、単一重鎖抗体などである。ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰβ、及びＳＩＲＰγの細胞外ドメインは相同性が高いため、抗ＳＩＲＰα抗体及び／または抗ＳＩＲＰγ抗体は、ＳＩＲＰβと交差反応し得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰβと交差反応する抗ＳＩＲＰα抗体及び／またはＳＩＲＰβと交差反応する抗ＳＩＲＰγ抗体を、この方法で使用する。
【0042】
いくつかの実施形態では、薬物は、（ｉ）抗体Ｆｃ領域及び（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に結合するＳＩＲＰγのバリアントを含み、薬物中和剤は、抗ＳＩＲＰγ抗体（またはその抗原結合フラグメント）である。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）薬物による治療を受けた対象由来の血漿試料に対して抗ＳＩＲＰγ抗体（またはその抗原結合フラグメント）を添加することと、（ｂ）ステップ（ａ）後、試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板を使用した血漿試料の血清学的アッセイを実施することと、を含む。いくつかの実施形態では、抗ＳＩＲＰγ抗体（またはその抗原結合フラグメント）は、血清学的アッセイが実施される前に、試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板に、ならびに対象の血漿に添加される。いくつかの実施形態では、抗ＳＩＲＰγ抗体は、全長抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＳＩＲＰγ抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ダイアボディ、ワンアーム抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、単一ドメイン抗体、単一重鎖抗体などである。ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰβ、及びＳＩＲＰγの細胞外ドメインは相同性が高いため、抗ＳＩＲＰβ抗体及び／または抗ＳＩＲＰα抗体は、ＳＩＲＰγと交差反応し得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰγと交差反応する抗ＳＩＲＰα抗体、及び／またはＳＩＲＰγと交差反応する抗ＳＩＲＰβ抗体を、この方法で使用する。
【0043】
いくつかの実施形態では、薬物は、抗ＣＤ４７抗体を含み、薬物中和剤は、抗ＣＤ４７抗体の抗原結合部分に結合する抗イディオタイプ抗体（またはその抗原結合フラグメント）である。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）抗イディオタイプ抗体（またはその抗原結合フラグメント）を、抗ＣＤ４７抗体による治療を受けた対象由来の血漿試料に添加することと、（ｂ）ステップ（ａ）後に、試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板を使用した血漿試料の血清学的アッセイを実施することと、を含む。いくつかの実施形態では、抗イディオタイプ抗体（またはその抗原結合フラグメント）は、血清学的アッセイが実施される前に、試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板、ならびに対象の血漿に添加される。いくつかの実施形態では、抗イディオタイプ抗体は、全長抗体である。いくつかの実施形態では、抗イディオタイプ抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ダイアボディ、ワンアーム抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、単一ドメイン抗体、単一重鎖抗体などである。
【0044】
いくつかの実施形態では、薬物中和剤に対する薬物の親和性は、薬物に対するヒトＣＤ４７（例えば、表面試薬ＲＢＣ上に発現されるヒトＣＤ４７）に対する薬物の親和性よりも高い。いくつかの実施形態では、この薬物に対する薬物中和剤の親和性は、この薬物に対するヒトＣＤ４７の親和性よりも少なくとも約１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、または１０００倍大きいうちのいずれか１つである。
【0045】
いくつかの実施形態では、対象の血漿に、対象のＲＢＣ及び／または血小板を含む試料に、試薬血漿／抗血清に、試薬ＲＢＣに、及び／または試薬血小板に添加される薬物中和剤の量は、対象の血漿中または対象のＲＢＣ及び／もしくは血小板を含む試料中の薬物の量と比較して、過剰量の薬物中和剤を達成するのに十分な量である。いくつかの実施形態では、対象の血漿に、対象のＲＢＣ及び／及び血小板を含む試料に、試薬血漿／抗血清に、試薬ＲＢＣに、及び／または試薬血小板に添加される薬物中和剤の量は、対象の血漿中または対象のＲＢＣ及び／または血小板を含む試料中の薬物の実質的に全て（全てなど）を結合するのに十分な量である。いくつかの実施形態では、対象の血漿に、対象のＲＢＣ及び／もしくは血小板を含む試料に、試薬血漿／抗血清に、試薬ＲＢＣに、及び／または試薬血小板に添加される薬物中和剤の量は、対象の血漿中、または対象のＲＢＣ及び／もしくは血小板を含む試料中の薬物の量に対して、約２倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１０００倍、１５００倍、２０００倍、２５００倍、３０００倍、３５００倍、４０００倍、４５００倍、または５０００倍のモル過剰（モル比または等価など）の薬物中和剤のうちのいずれか１つ（これらの値の間の任意の範囲を含む）を達成するのに十分な量である。いくつかの実施形態では、対象の血漿に、対象のＲＢＣ及び／もしくは血小板を含む試料に、試薬血漿／抗血清に、試薬ＲＢＣに、及び／または試薬血小板に添加される薬物中和剤の量は、約１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１．２５ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、１．７５ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、２．２５ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、２．７５ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、３．２５ｍｇ／ｍｌ、３．５ｍｇ／ｍｌ、３．７５ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、４．２５ｍｇ／ｍｌ、４．５ｍｇ／ｍｌ、４．７５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、２５０ｍｇ／ｍｌ、３００ｍｇ／ｍｌ、３５０ｍｇ／ｍｌ、４００ｍｇ／ｍｌ、４５０ｍｇ／ｍｌ、５００ｍｇ／ｍｌ、５５０ｍｇ／ｍｌ、６００ｍｇ／ｍｌ、６５０ｍｇ／ｍｌ、７００ｍｇ／ｍｌ、７５０ｍｇ／ｍｌ、８００ｍｇ／ｍｌ、８５０ｍｇ／ｍｌ、９００ｍｇ／ｍｌ、１０００ｍｇ／ｍｌ、１１００ｍｇ／ｍｌ、１１５０ｍｇ／ｍｌ、１２００ｍｇ／ｍｌ、１２５０ｍｇ／ｍｌ、１３００ｍｇ／ｍｌ、１３５０ｍｇ／ｍｌ、１４００ｍｇ／ｍｌ、１４５０ｍｇ／ｍｌ、１５００ｍｇ／ｍｌ、１５５０ｍｇ／ｍｌ、１６００ｍｇ／ｍｌ、１６５０ｍｇ／ｍｌ、１７００ｍｇ／ｍｌ、１７５０ｍｇ／ｍｌ、１８００ｍｇ／ｍｌ、１８５０ｍｇ／ｍｌ、１９００ｍｇ／ｍｌ、または２０００ｍｇ／ｍｌの薬物中和剤のうちいずれか１つの濃度（これらの値の間の任意の範囲を含む）を達成するのに十分である。いくつかの実施形態では、少なくとも５μｇ、１０μｇ、５０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｍｇ、１．２５ｍｇ、１．５ｍｇ、１．７５ｍｇ、２ｍｇ、２．２５ｍｇ、２．５ｍｇ、２．７５ｍｇ、３ｍｇ、３．２５ｍｇ、３．５ｍｇ、３．７５ｍｇ、４ｍｇ、４．２５ｍｇ、４．５ｍｇ、４．７５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、５５０ｍｇ、６００ｍｇ、６５０ｍｇ、７００ｍｇ、７５０ｍｇ、８００ｍｇ、８５０ｍｇ、９００ｍｇ、１０００ｍｇ、１１００ｍｇ、１１５０ｍｇ、１２００ｍｇ、１２５０ｍｇ、１３００ｍｇ、１３５０ｍｇ、１４００ｍｇ、１４５０ｍｇ、１５００ｍｇ、１５５０ｍｇ、１６００ｍｇ、１６５０ｍｇ、１７００ｍｇ、１７５０ｍｇ、１８００ｍｇ、１８５０ｍｇ、１９００ｍｇ、または２０００ｍｇの薬物中和剤のいずれか１つを、対象の血漿に、対象のＲＢＣ及び／または血小板を含む試料に、試薬血漿／抗血清に、試薬ＲＢＣに、及び／または試薬血小板に添加する。いくつかの実施形態では、薬物中和剤は、対象の血漿に、対象のＲＢＣ及び／または血小板を含む試料に、試薬血漿／抗血清に、及び／または試薬ＲＢＣに対して、ヒトＣＤ４７の薬物のＫＤの少なくとも約４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、または１００倍過剰（これらの値の間の任意の範囲を含む）のうちいずれか１つを達成する量で添加される。いくつかの実施形態では、薬物中和剤は、対象の血漿に、対象のＲＢＣ及び／または血小板を含む試料に、試薬血漿／抗血清に、及び／または試薬ＲＢＣに対して、ヒトＣＤ４７の薬物のＫＤの少なくとも約５００倍、１０００倍、５０００倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍、１０７倍、１０８倍、１０９倍、または１０１０倍過剰（これらの値の間の任意の範囲を含む）のうちいずれか１つを達成する量で添加される。いくつかの実施形態では、薬物中和剤は、対象の血漿に、対象のＲＢＣ及び／または血小板を含む試料に、試薬血漿／抗血清に、及び／または試薬ＲＢＣに対して、薬物の薬物中和剤のＫＤの約４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、または１００倍過剰（これらの値の間の任意の範囲を含む）のいずれか１つを達成する量で添加される。いくつかの実施形態では、薬物中和剤は、対象の血漿に、対象のＲＢＣ及び／または血小板を含む試料に、試薬血漿／抗血清に、及び／または試薬ＲＢＣに対して、薬物の薬物中和剤のＫＤの約５００倍、１０００倍、５０００倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍、１０７倍、１０８倍、１０９倍、または１０１０倍過剰（これらの値の間の任意の範囲を含む）のいずれか１つを達成する量で添加される。
【0046】
いくつかの実施形態では、薬物中和剤は、薬物のＦｃ領域に結合し得る任意の薬剤である。いくつかの実施形態では、薬物中和剤は、ＳＰ－Ａ（サーファクタントプロテインＡ）またはＳＰ－Ｄ（サーファクタントプロテインＤ）である。
【0047】
いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載の２つ以上の薬物中和剤を使用することを含む。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、例えば、２つ以上の異なるＣＤ４７バリアント（または薬物に結合し得るそのフラグメント）、２つ以上の異なる抗ＳＩＲＰα抗体（またはその抗原結合フラグメント）、２つ以上の異なる抗ＳＩＲＰβ抗体（またはその抗原結合フラグメント）、２つ以上の異なる抗ＳＩＲＰγ抗体（またはその抗原結合フラグメント）、２つ以上の異なる抗イディオタイプ抗ＣＤ４７抗体（またはその抗原結合フラグメント）、または薬物のＦｃ領域を結合する２つ以上の薬剤を、薬物による治療を受けた対象由来の血漿試料に加えることを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、異なる薬物中和剤の組み合わせ、例えば、可溶性ＣＤ４７剤及び／または抗ＳＩＲＰα抗体（またはその結合フラグメント抗原）、及び／または抗ＳＩＲＰα抗体（またはその結合フラグメント抗原）、及び／または抗ＳＩＲＰβ抗体（またはその結合フラグメント抗原）、及び／または抗ＳＩＲＰβ２抗体（またはその結合フラグメント抗原）、及び／または抗ＳＩＲＰγ抗体（またはその結合フラグメント抗原）及び／または抗イディオタイプ抗ＣＤ４７抗体（またはその結合フラグメント抗原）ならびに／あるいは薬物のＦｃ領域に結合する薬剤を含む組み合わせを、薬物による治療を受けた対象由来の血漿試料に添加することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、２つ以上の異なる抗ＳＩＲＰγ抗体（またはその結合フラグメント抗原）を、対象の血漿の試料に、対象のＲＢＣ及び／または血小板を含む試料に、試薬血漿／抗血清に、試薬ＲＢＣに、及び／または試薬血小板に加えることを含む。
【0048】
Ｂ．輸血前血清学的アッセイにおける干渉を軽減するために細胞結合剤を使用する方法。
いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）ヒトＣＤ４７に結合し、抗体Ｆｃ領域を含まない細胞結合剤を、試薬ＲＢＣ（すなわち、特定の細胞表面抗原または細胞表面抗原の群を発現することが既知のＲＢＣ）及び／または試薬血小板（すなわち、特定の細胞表面抗原、または細胞表面抗原の群を発現することが既知の血小板）に添加することと、（ｂ）ステップ（ａ）後に、試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板を使用して血漿試料の血清学的アッセイを実施することとを含み、血漿試料は、薬物による治療を受けた対象由来のものであり、薬物は、（ｉ）抗体Ｆｃ領域及び（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に結合する部分を含む。そのような実施形態は、一般的に図４Ａに示されている。図４Ａに示されるように、細胞結合剤は、試薬ＲＢＣ（及び／または試薬血小板）の表面に発現されるＣＤ４７に結合し、薬物が試薬ＲＢＣ（及び／または試薬血小板）に結合するのをブロックし、それによって（図１Ｂに示されるように）試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板への薬物の結合から生じるであろう干渉を最小化する（または、いくつかの実施形態では排除する）。いくつかの実施形態では、細胞結合剤は、血清学的アッセイが実施される前に、対象の血漿に、ならびに試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板に添加される。
いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）ヒトＣＤ４７に結合し、抗体Ｆｃ領域を含まない細胞結合剤を、試薬ＲＢＣ（すなわち、特定の細胞表面抗原または細胞表面抗原の群を発現することが既知のＲＢＣ）及び／または試薬血小板（すなわち、特定の細胞表面抗原、または細胞表面抗原の群を発現することが既知の血小板）に添加することと、（ｂ）ステップ（ａ）後に、試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板を使用して血漿試料の血清学的アッセイを実施することとを含み、血漿試料は、薬物による治療を受けた対象由来のものであり、薬物は、（ｉ）抗体Ｆｃ領域及び（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に結合する部分を含む。そのような実施形態は、一般的に図４Ａに示されている。図４Ａに示されるように、細胞結合剤は、試薬ＲＢＣ（及び／または試薬血小板）の表面に発現されるＣＤ４７に結合し、薬物が試薬ＲＢＣ（及び／または試薬血小板）に結合するのをブロックし、それによって（図１Ｂに示されるように）試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板への薬物の結合から生じるであろう干渉を最小化する（または、いくつかの実施形態では排除する）。いくつかの実施形態では、細胞結合剤は、血清学的アッセイが実施される前に、対象の血漿に、ならびに試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板に添加される。
【0049】
いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）ヒトＣＤ４７に結合し、抗体Ｆｃ領域を含まない細胞結合剤を、薬物による治療を受けた対象由来の血漿試料に添加することと、（ｂ）ステップ（ａ）の後に、試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板を使用する血漿試料の血清学的アッセイを実施することと、を含み、薬物は、（ｉ）抗体Ｆｃ領域及び（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に結合する部分を含む。図４Ｂに示されるように、細胞結合剤は、試薬ＲＢＣ（及び／または試薬血小板）の表面に発現されるＣＤ４７への結合について薬物と競合し、それにより、試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板への薬物の結合から生じる干渉を最小化する（または、いくつかの実施形態では、排除する）（図１Ｂに示すように）。
【0050】
いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）ヒトＣＤ４７に結合し、抗体Ｆｃ領域を含まない細胞結合剤を、薬物による治療を受けた対象由来の血液試料に添加することと、（ｂ）ステップ（ａ）の後に、試薬血漿／抗血清を使用した血液試料の血清学的アッセイを実施することと、を含み、薬物は（ｉ）抗体Ｆｃ領域及び（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に結合する部分を含む。図４Ｃに示すように、細胞結合剤は、対象のＲＢＣ及び／または血小板の表面に発現されるＣＤ４７への結合について薬物と競合し、それにより、対象のＲＢＣ及び／または血小板に対する薬物の結合から生じる干渉を最小化する（または、いくつかの実施形態では、排除する）（図１Ｄに示されているように）。いくつかの実施形態では、細胞結合剤を、血清学的アッセイが実施される前に、試薬血漿／抗血清に対して、ならびに対象由来の血液試料に対して添加する。
【0051】
いくつかの実施形態では、細胞結合剤は、ＣＤ４７に結合し、薬物がＣＤ４７に結合するのをブロックする任意の薬剤である。上記で考察されるように、細胞結合剤は抗体Ｆｃ領域を含まない。代替の実施形態では、細胞結合剤は、ＡＨＧに結合しない抗体Ｆｃ領域バリアントを含む。
【0052】
いくつかの実施形態では、この方法は、例えば、細胞結合剤が可溶性である溶液中で実施される。いくつかの実施形態では、細胞結合剤は、固相に固定化され、その後、この方法がマトリックスまたは表面への吸着、共有結合、または非共有結合を介して実行される。いくつかの実施形態では、細胞結合剤は、固相への固定化に続いて、ＣＤ４７に結合し得る。固定化に使用される固相または表面は、本質的に水不溶性であり、例えば、表面、粒子、多孔質マトリックス、セルロースポリマースポンジ（Ｉｍｍｕｎｏ ＣＡＰ（登録商標）、Ｐｈａｄｉａ）などの形態の支持体を含む、イムノアッセイにおいて有用である、任意の不活性支持体または担体であり得る。一般的に使用される支持体の例としては、小さなシート、セファデックス、ポリ塩化ビニル、プラスチックビーズ、微粒子、アッセイプレート、またはポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンなどから製造された試験管が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞結合剤は、複数の試料を同時に分析するために使用され得るマルチウェルマイクロタイタープレートなどのマイクロタイタープレート上にコーティングされる。
【0053】
いくつかの実施形態では、細胞結合剤は、ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰγを含む。いくつかの実施形態では、細胞結合剤は、ＣＤ４７に結合し得るＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰγのフラグメント（例えば、野生型ＳＩＲＰαの細胞外ドメイン（「ＷＴ ＳＩＲＰα－ＥＣＤ」）またはそのＤ１ドメイン、例えば、野生型ＳＩＲＰγの細胞外ドメイン（「ＷＴ ＳＩＲＰγ－ＥＣＤ」）またはそのＤ１ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、細胞結合剤は、ヒトＳＩＲＰα、ヒトＳＩＲＰγ、マウスＳＩＲＰα、マウスＳＩＲＰγ、ラットＳＩＲＰα、ラットＳＩＲＰγ、アカゲザルＳＩＲＰα、アカゲザルＳＩＲＰγ、カニクイザルＳＩＲＰα、カニクイザルＳＩＲＰγ、任意の起源のＳＩＲＰα、または任意の起源のＳＩＲＰγを含み、ただしこれは、ＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰγがＣＤ４７（例えば、試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板の表面に発現するヒトＣＤ４７）に結合可能である条件である。いくつかの実施形態では、細胞結合剤は、ヒトＳＩＲＰα、ヒトＳＩＲＰγ、マウスＳＩＲＰα、マウスＳＩＲＰγ、ラットＳＩＲＰα、ラットＳＩＲＰγ、アカゲザルＳＩＲＰα、アカゲザルＳＩＲＰγ、カニクイザルＳＩＲＰα、カニクイザルＳＩＲＰγ、任意の起源のＳＩＲＰα、または任意の起源のＳＩＲＰγ、のフラグメントを含み、ただし、これは、フラグメントがＣＤ４７（例えば、試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板の表面に発現するヒトＣＤ４７）に結合し得る条件である。いくつかの実施形態では、細胞結合剤は、ヒトＣＤ４７へ結合し得る、ＳＩＲＰαバリアント（またはそのフラグメント、例えば、ＷＴ ＳＩＲＰα－ＥＣＤまたはそのＤ１ドメインのバリアント）、可溶性ＳＩＲＰβバリアント（またはそのフラグメント、例えば、ＷＴＳＩＲＰβ－ＥＣＤまたはそのＤ１ドメインのバリアント）、または可溶性ＳＩＲＰγバリアント（またはそのフラグメント、例えば、ＷＴ ＳＩＲＰγ－ＥＣＤまたはそのＤ１ドメインのバリアント）である。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰαバリアント、ＳＩＲＰβバリアント、またはＳＩＲＰγバリアント（またはＣＤ４７に結合し得る前述のいずれか１つのフラグメント）は、それぞれ、野生型ＳＩＲＰα、野生型ＳＩＲＰβ、または野生型ＳＩＲＰγと比較して、１つ以上のアミノ酸置換（複数可）、欠失（複数可）、挿入（複数可）、Ｎ末端付加（複数可）及び／またはＣ末端付加（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰαバリアント、ＳＩＲＰβバリアント、またはＳＩＲＰγバリアント（またはＣＤ４７に結合し得る前述のいずれか１つのフラグメント）に存在する１つ以上のアミノ酸置換（複数可）、欠失（複数可）、挿入（複数可）、Ｎ末端付加（複数可）及び／またはＣ末端付加（複数可）は、それぞれ、野生型ＳＩＲＰα、野生型ＳＩＲＰβ、または野生型ＳＩＲＰγと比較して、ＳＩＲＰαバリアント、可溶性ＳＩＲＰβバリアント、または可溶性ＳＩＲＰγバリアントのグリコシル化パターンを変更する。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰαバリアント、ＳＩＲＰβバリアント、またはＳＩＲＰγバリアント（またはＣＤ４７に結合し得る前述のいずれかのフラグメント）に存在する１つ以上のアミノ酸置換（複数可）、欠失（複数可）、挿入（複数可）、Ｎ末端付加（複数可）及び／またはＣ末端付加（複数可）は、それぞれ、野生型ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰβ、またはＳＩＲＰγと比較して、ヒトＣＤ４７に対するＳＩＲＰαバリアント、ＳＩＲＰβバリアント、またはＳＩＲＰγバリアントの親和性を高める。いくつかの実施形態では、細胞結合剤は、モノマー（例えば、野生型ＳＩＲＰαモノマー、野生型ＳＩＲＰγモノマー、ＳＩＲＰαバリアントモノマー、ＳＩＲＰβバリアントモノマー、ＳＩＲＰγモノマー、またはＣＤ４７に結合し得る前述のいずれか１つのフラグメント）である。いくつかの実施形態では、細胞結合剤は、ダイマー（例えば、野生型ＳＩＲＰα、野生型ＳＩＲＰγ、ＳＩＲＰαバリアント、ＳＩＲＰβバリアント、ＳＩＲＰγバリアント、またはＣＤ４７に結合し得る前述のいずれか１つのフラグメントのうちいずれかの組み合わせを含むホモダイマーまたはヘテロダイマー）である。いくつかの実施形態では、細胞結合剤は、オリゴマー（例えば、１つ以上の野生型ＳＩＲＰα、野生型ＳＩＲＰγ、ＳＩＲＰαバリアント、ＳＩＲＰβバリアント、ＳＩＲＰγバリアント、及び／またはＣＤ４７に結合し得る前述のいずれか１つのフラグメントの任意の組み合わせを含むホモオリゴマーまたはヘテロオリゴマー）である。
【0054】
いくつかの実施形態では、細胞結合剤は、ＳＩＲＰαバリアント、ＳＩＲＰβバリアント、またはＳＩＲＰγバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰαバリアント、ＳＩＲＰβバリアント、またはＳＩＲＰγバリアントは、以下の配列番号８～１６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
（配列番号８）
（配列番号９）
（配列番号１０）
（配列番号１１）
（配列番号１２）
（配列番号１３）
（配列番号１４）
（配列番号１５）
（配列番号１６）
（配列番号１７）
（配列番号１８）
（配列番号１９）
（配列番号２０）
【0055】
他の例示的な可溶性ＳＩＲＰαバリアント、可溶性ＳＩＲＰβバリアント、及びＳＩＲＰγバリアントは、当該技術分野で公知であり、ＷＯ２０１３／１０９７５２、ＵＳ２０１５／００７１９０５、ＵＳＰ９，９４４，９１１、ＷＯ２０１６／０２３０４０、ＷＯ２０１７／０２７４２２、ＵＳ２０１７／０１０７２７０、ＵＳＰ１０，２５９，８５９、ＵＳ９８４５３４５、ＷＯ２０１６１８７２２６、ＵＳ２０１８０１５５４０５、ＷＯ２０１７１７７３３３、ＷＯ２０１４０９４１２２、ＵＳ２０１５３２９６１６、ＵＳ２０１８０３１２５６３、ＷＯ２０１８１７６１３２、ＷＯ２０１８０８１８９８、ＷＯ２０１８０８１８９７、ＵＳ２０１８０１４１９８６Ａ１、及びＥＰ３２８７４７０Ａ１（その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【0056】
いくつかの実施形態では、細胞結合剤は、Ｆｃ領域を含まない抗ＣＤ４７抗体のフラグメントである。いくつかの実施形態では、そのようなフラグメントとしては、例えば、限定するものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはダイアボディが挙げられる。本明細書で提供される方法で使用され得る例示的な抗ＣＤ４７抗体フラグメントとしては、限定するものではないが、例えば、マウス５Ｆ９（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＰＬｏＳＯｎｅ．１０（９）：ｅ０１３７３４５を参照）、Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４（Ｆｏｒｔｙ Ｓｅｖｅｎ，Ｉｎｃ．）、Ｂ６Ｈ１２．２、ＣＣ２Ｃ６、８Ｈ７、ＢＲＩＣ１２６などが挙げられる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４７抗体は、ＡＨＧに結合しないＦｃ領域を含む。
【0057】
いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ４７に対する細胞結合剤の親和性は、薬物に対するヒトＣＤ４７（例えば、表面試薬ＲＢＣ及び／または血小板上に発現されるヒトＣＤ４７）に対する薬物の親和性よりも高い。いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ４７に対する細胞結合剤の親和性は、ＣＤ４７に対する薬物の親和性よりも少なくとも約１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、または１０００倍大きい（これらの値の間の任意の範囲を含む）のうちのいずれか１つである。
【0058】
いくつかの実施形態では、対象の血漿に、対象のＲＢＣ／血小板を含む試料に、試薬血漿／抗血清に、試薬ＲＢＣに及び／または試薬血小板に対して添加される細胞結合剤の量は、対象のＲＢＣ／血小板、試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板上に発現されるＣＤ４７の量と比較して、過剰量の細胞結合剤を達成するのに十分な量である。いくつかの実施形態では、対象の血漿に、対象のＲＢＣ／血小板を含む試料に、試薬血漿／抗血清に、試薬ＲＢＣに及び／または試薬血小板に対して添加される細胞結合剤の量は、対象のＲＢＣ／血小板、試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板上に発現するＣＤ４７の実質的に全て（全てなど）に結合するのに十分な量である。いくつかの実施形態では、対象の血漿に、対象のＲＢＣ／血小板を含む試料に、試薬血漿／抗血清に、試薬ＲＢＣに及び／または試薬血小板に対して添加される細胞結合剤の量は、対象のＲＢＣ／血小板、試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板上に発現するＣＤ４７の量に対する細胞結合剤の例えば、約２倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１０００倍、１５００倍、２０００倍、２５００倍、３０００倍、３５００倍、４０００倍、４５００倍、または５０００倍のモル過剰（モル比または同等物など）（これらの値の間の任意の範囲を含む）のいずれか１つを達成するのに十分な量である。いくつかの実施形態では、対象の血漿に、対象のＲＢＣ／血小板を含む試料に、試薬血漿／抗血清に、試薬ＲＢＣに及び／または試薬血小板に対して添加される細胞結合剤の量は、約１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１．２５ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、１．７５ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、２．２５ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、２．７５ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、３．２５ｍｇ／ｍｌ、３．５ｍｇ／ｍｌ、３．７５ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、４．２５ｍｇ／ｍｌ、４．５ｍｇ／ｍｌ、４．７５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、２５０ｍｇ／ｍｌ、３００ｍｇ／ｍｌ、３５０ｍｇ／ｍｌ、４００ｍｇ／ｍｌ、４５０ｍｇ／ｍｌ、５００ｍｇ／ｍｌ、５５０ｍｇ／ｍｌ、６００ｍｇ／ｍｌ、６５０ｍｇ／ｍｌ、７００ｍｇ／ｍｌ、７５０ｍｇ／ｍｌ、８００ｍｇ／ｍｌ、８５０ｍｇ／ｍｌ、９００ｍｇ／ｍｌ、１０００ｍｇ／ｍｌ、１１００ｍｇ／ｍｌ、１１５０ｍｇ／ｍｌ、１２００ｍｇ／ｍｌ、１２５０ｍｇ／ｍｌ、１３００ｍｇ／ｍｌ、１３５０ｍｇ／ｍｌ、１４００ｍｇ／ｍｌ、１４５０ｍｇ／ｍｌ、１５００ｍｇ／ｍｌ、１５５０ｍｇ／ｍｌ、１６００ｍｇ／ｍｌ、１６５０ｍｇ／ｍｌ、１７００ｍｇ／ｍｌ、１７５０ｍｇ／ｍｌ、１８００ｍｇ／ｍｌ、１８５０ｍｇ／ｍｌ、１９００ｍｇ／ｍｌ、または２０００ｍｇ／ｍｌの細胞結合剤（これらの値の間のいずれかの範囲を含む）のうちのいずれか１つの濃度を達成するのに十分である。いくつかの実施形態では、少なくとも約５μｇ、１０μｇ、５０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｍｇ、１．２５ｍｇ、１．５ｍｇ、１．７５ｍｇ、２ｍｇ、２．２５ｍｇ、２．５ｍｇ、２．７５ｍｇ、３ｍｇ、３．２５ｍｇ、３．５ｍｇ、３．７５ｍｇ、４ｍｇ、４．２５ｍｇ、４．５ｍｇ、４．７５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、５５０ｍｇ、６００ｍｇ、６５０ｍｇ、７００ｍｇ、７５０ｍｇ、８００ｍｇ、８５０ｍｇ、９００ｍｇ、１０００ｍｇ、１１００ｍｇ、１１５０ｍｇ、１２００ｍｇ、１２５０ｍｇ、１３００ｍｇ、１３５０ｍｇ、１４００ｍｇ、１４５０ｍｇ、１５００ｍｇ、１５５０ｍｇ、１６００ｍｇ、１６５０ｍｇ、１７００ｍｇ、１７５０ｍｇ、１８００ｍｇ、１８５０ｍｇ、１９００ｍｇ、または２０００ｍｇの細胞結合剤のうちのいずれか１つが、対象の血漿に、対象のＲＢＣを含む試料に、試薬血漿／抗血清に、及び／または試薬ＲＢＣに対して添加される。いくつかの実施形態では、対象の血漿に、対象のＲＢＣ／血小板を含む試料に、試薬血漿／抗血清に、試薬ＲＢＣ及び／または試薬血小板に添加される細胞結合剤の量は、ヒトＣＤ４７の薬物のＫＤの少なくとも約４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、または１００倍過剰のいずれか１つ（これらの値の間の任意の範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、対象の血漿に、対象のＲＢＣ／血小板を含む試料に、試薬血漿／抗血清に、試薬ＲＢＣに及び／または試薬血小板に対して添加される細胞結合剤の量は、ヒトＣＤ４７の薬物のＫＤの少なくとも約５００倍、１０００倍、５０００倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍、１０７倍、１０８倍、１０９倍、または１０１０倍過剰（これらの値の間の任意の範囲を含む）のうちのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、対象の血漿に、対象のＲＢＣ／血小板を含む試料に、試薬血漿／抗血清に、試薬ＲＢＣに及び／または試薬血小板に添加される細胞結合剤の量は、ヒトＣＤ４７の細胞結合剤のＫＤの少なくとも約４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、または１００倍過剰（これらの値の間の任意の範囲を含む）のうちのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、対象の血漿に、対象のＲＢＣ／血小板を含む試料に、試薬血漿／抗血清に、試薬ＲＢＣに及び／または試薬血小板に添加される細胞結合剤の量は、ヒトＣＤ４７の細胞結合剤のＫＤの少なくとも約５００倍、１０００倍、５０００倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍、１０７倍、１０８倍、１０９倍、または１０１０倍過剰（これらの値の間の任意の範囲を含む）のうちのいずれか１つである。
【0059】
Ｃ．例示的な薬物
本明細書で提供される方法は、（ｉ）抗体Ｆｃ領域及び（ｉｉ）薬物による治療を受けた対象から得られた血漿またはＲＢＣ／血小板を含む試料中のヒトＣＤ４７に結合する部分を含む薬物の存在によって引き起こされる血清学的アッセイにおける干渉を低減する（または、いくつかの実施形態では排除する）。いくつかの実施形態では、薬物は、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域などのＩｇＧ Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、薬物は、野生型ヒトＦｃ領域（例えば、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域）と比較して、１つ以上のアミノ酸置換（複数可）、欠失（複数可）、挿入（複数可）、Ｎ末端付加（複数可）及び／またはＣ末端付加（複数可）を含む修飾Ｆｃ領域（修飾ＩｇＧ Ｆｃ領域など）を含む。例示的なＦｃ領域は、ＷＯ２０１７１７７３３３、ＷＯ２０１４０９４１２２、ＵＳ２０１５３２９６１６、ＷＯ２０１７／０２７４２２、ＵＳ２０１７／０１０７２７０号、及びＵＳＰ１０，２５９，８５９（これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
本明細書で提供される方法は、（ｉ）抗体Ｆｃ領域及び（ｉｉ）薬物による治療を受けた対象から得られた血漿またはＲＢＣ／血小板を含む試料中のヒトＣＤ４７に結合する部分を含む薬物の存在によって引き起こされる血清学的アッセイにおける干渉を低減する（または、いくつかの実施形態では排除する）。いくつかの実施形態では、薬物は、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域などのＩｇＧ Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、薬物は、野生型ヒトＦｃ領域（例えば、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域）と比較して、１つ以上のアミノ酸置換（複数可）、欠失（複数可）、挿入（複数可）、Ｎ末端付加（複数可）及び／またはＣ末端付加（複数可）を含む修飾Ｆｃ領域（修飾ＩｇＧ Ｆｃ領域など）を含む。例示的なＦｃ領域は、ＷＯ２０１７１７７３３３、ＷＯ２０１４０９４１２２、ＵＳ２０１５３２９６１６、ＷＯ２０１７／０２７４２２、ＵＳ２０１７／０１０７２７０号、及びＵＳＰ１０，２５９，８５９（これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【0060】
いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ４７に結合する部分は、膜貫通ドメイン（例えば、ヒトＣＤ４７に結合し得る任意の野生型ＳＩＲＰαの細胞外ドメイン）を欠く野生型ＳＩＲＰαである。いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ４７に結合する部分は、ヒトＣＤ４７に結合し得、膜貫通ドメインを欠くＳＩＲＰαバリアントである。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰαバリアントは、野生型ＳＩＲＰαの細胞外ドメインと比較して、１つ以上のアミノ酸置換（複数可）、欠失（複数可）、挿入（複数可）、Ｎ末端付加（複数可）及び／またはＣ末端付加（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰαバリアントは、ＳＩＲＰα－ｄ１ドメインバリアントである。いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ４７に対するＳＩＲＰαバリアントの親和性は、ヒトＣＤ４７に対する野生型ＳＩＲＰαの親和性よりも高い。
【0061】
いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ４７に結合する部分は、膜貫通ドメイン（例えば、ヒトＣＤ４７に結合し得る任意の野生型ＳＩＲＰγの細胞外ドメイン）を欠く野生型ＳＩＲＰγである。いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ４７に結合する部分は、ヒトＣＤ４７に結合し得、膜貫通ドメインを欠くＳＩＲＰγバリアントである。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰγバリアントは、野生型ＳＩＲＰγの細胞外ドメインと比較して、１つ以上のアミノ酸置換（複数可）、欠失（複数可）、挿入（複数可）、Ｎ末端付加（複数可）及び／またはＣ末端付加（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰγバリアントは、ＳＩＲＰγ－ｄ１ドメインバリアントである。いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ４７に対するＳＩＲＰγバリアントの親和性は、ヒトＣＤ４７に対する野生型ＳＩＲＰγの親和性よりも高い。
【0062】
いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ４７に結合する部分は、ヒトＣＤ４７に結合し得、膜貫通ドメインを欠くＳＩＲＰβバリアントである。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰγβバリアントは、野生型ＳＩＲＰβの細胞外ドメインと比較して、１つ以上のアミノ酸置換（複数可）、欠失（複数可）、挿入（複数可）、Ｎ末端付加（複数可）及び／またはＣ末端付加（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰβバリアントは、ＳＩＲＰβ－ｄ１ドメインバリアントである。
【0063】
例示的なＳＩＲＰαバリアント、ＳＩＲＰβバリアント、及びＳＩＲＰγバリアントは、当該技術分野で公知であり、ＷＯ２０１３／１０９７５２、ＵＳ２０１５／００７１９０５、ＵＳＰ９，９４４，９１１、ＷＯ２０１６／０２３０４０、ＷＯ２０１７／０２７４２２、ＵＳ２０１７／０１０７２７０、ＵＳＰ１０，２５９，８５９、ＵＳ９８４５３４５、ＷＯ２０１６１８７２２６、ＵＳ２０１８０１５５４０５、ＷＯ２０１７１７７３３３、ＷＯ２０１４０９４１２２、ＵＳ２０１５３２９６１６、ＵＳ２０１８０３１２５６３、ＷＯ２０１８１７６１３２、ＷＯ２０１８０８１８９８、ＷＯ２０１８０８１８９７、ＵＳ２０１８０１４１９８６Ａ１、及びＥＰ３２８７４７０Ａ１（その内容は、その全体が参照によって本明細書に援用される）に記載されている。
【0064】
上記の方法のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、薬物は抗ＣＤ４７抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４７抗体は、ＡＯ－１７６、ＣＣ－９０００２、Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４（５Ｆ９とも呼ばれる）、ＳＨＲ－１６０３、ＮＩ－１７０１、ＳＲＦ２３１、ＴＪＣ４、またはＩＢＩ１８８である。これら及び他の治療用抗ＣＤ４７抗体に関する詳細は、ＷＯ２０１８１７５７９０Ａ１、ＵＳ２０１８０１４２０１９、ＵＳ２０１８０１７１０１４、ＵＳ２０１８００５７５９２、ＵＳ２０１７０２８３４９８、ＵＳ９，５１８，１１６、ＵＳ９，５１８，１１７、ＵＳ２０１５０２７４８２６、ＵＳ２０１６０１３７７３３、ＵＳ９，２２１，９０８号、ＵＳ２０１４０１６１７９９、ＵＳ２０１６０１３７７３４、ＷＯ２０１５１９１８６１、ＷＯ２０１４０９３６７８、ＷＯ２０１４１２３５８０、ＷＯ２０１３１１９７１４、ＵＳ９，０４５，５４１、ＷＯ２０１６１０９４１５、ＷＯ２０１８１８３１８２、ＷＯ２０１８００９４９９、ＷＯ２０１７１９６７９３、ＵＳ９６６３５７５、ＵＳ２０１４０１４０９８９、ＷＯ２０１８２３７１６８、ＵＳ２０１８００３７６５２、ＵＳ２０１９００２３７８４、ＷＯ２０１８０９５４２８、ＥＰ３４１１０７１、ＷＯ２０１９０４２２８５、ＷＯ２０１６０８１４２３、ＷＯ２０１１０７６７８１、ＷＯ２０１２１７２５２１、ＷＯ２０１４０８７２４８、ＵＳ２０１４０３０３３５４、ＷＯ２０１６１５６５３７、ＵＳ２０１６０２８９７２７、ＵＳ２０１９００６２４２８、ＵＳ２０１８０２０１６７７、ＵＳ９３５２０３７、ＵＳ２０１７００４４２５８、ＵＳ９６５０４４１、及びＵＳ２０１８０１０５５９１に記載されている。
【0065】
輸血前検査のための血清学的アッセイ
輸血前の試験は、輸血を目的とした血液製剤が対象（すなわち、輸血のレシピエント）の血液と適合性があることを確認するために実施される。輸血前検査には、ドナー血液とレシピエント血液との間のＡＢＯ適合性を確認するために使用される血清学的アッセイ、ならびにドナーＲＢＣ及び／またはドナー血小板上の抗原と反応する最も臨床的に重要なＲＢＣ／血小板同種抗体を検出するために使用されるアッセイが含まれる（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ，１８ｔｈ ｅｄ，ＡＡＢＢ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，２０１４参照。）。ドナー／レシピエント輸血適合性を決定するために血清学的アッセイが実施される他の例示的な血液群抗原としては、限定するものではないが、例えば、ケル（Ｋｅｌｌ）血液群抗原、ダッフィー（Ｄｕｆｆｙ）血液群抗原、ノップス（Ｋｎｏｐｓ）血液群抗原、カートライト（Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ）血液群抗原、シアナ（Ｓｃｉａｎｎａ）血液群抗原、インドの血液群抗原、アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ）血液群抗原、ドンブロック（Ｄｏｍｂｒｏｃｋ）血液群抗原、ラントシュタイナー・ウェイナー（Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ－Ｗｉｅｎｅｒ）血液群抗原、及びＶＥＬ血液群抗原が挙げられる。本明細書で提供される方法は、当該技術分野で公知の多数の血清学的アッセイにおいて、薬物干渉（例えば、（ｉ）抗体Ｆｃ領域及び（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に結合する部分を含む薬物による干渉）を低減または防止する。この方法を使用し得る例示的な血清学的アッセイとしては、以下でさらに詳細に記載されるものが含まれる（ただし、これらに限定されない）。
輸血前の試験は、輸血を目的とした血液製剤が対象（すなわち、輸血のレシピエント）の血液と適合性があることを確認するために実施される。輸血前検査には、ドナー血液とレシピエント血液との間のＡＢＯ適合性を確認するために使用される血清学的アッセイ、ならびにドナーＲＢＣ及び／またはドナー血小板上の抗原と反応する最も臨床的に重要なＲＢＣ／血小板同種抗体を検出するために使用されるアッセイが含まれる（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ，１８ｔｈ ｅｄ，ＡＡＢＢ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，２０１４参照。）。ドナー／レシピエント輸血適合性を決定するために血清学的アッセイが実施される他の例示的な血液群抗原としては、限定するものではないが、例えば、ケル（Ｋｅｌｌ）血液群抗原、ダッフィー（Ｄｕｆｆｙ）血液群抗原、ノップス（Ｋｎｏｐｓ）血液群抗原、カートライト（Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ）血液群抗原、シアナ（Ｓｃｉａｎｎａ）血液群抗原、インドの血液群抗原、アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ）血液群抗原、ドンブロック（Ｄｏｍｂｒｏｃｋ）血液群抗原、ラントシュタイナー・ウェイナー（Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ－Ｗｉｅｎｅｒ）血液群抗原、及びＶＥＬ血液群抗原が挙げられる。本明細書で提供される方法は、当該技術分野で公知の多数の血清学的アッセイにおいて、薬物干渉（例えば、（ｉ）抗体Ｆｃ領域及び（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に結合する部分を含む薬物による干渉）を低減または防止する。この方法を使用し得る例示的な血清学的アッセイとしては、以下でさらに詳細に記載されるものが含まれる（ただし、これらに限定されない）。
【0066】
典型的には、血清学的アッセイは、例えば、非溶血血液、血漿（例えば、ＥＤＴＡで抗凝固処理された血漿試料）、凝固血液、または輸血を必要とする対象（例えば、（ｉ）抗体Ｆｃ領域及び（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に結合する部分を含む薬物による治療を受けた対象）由来の血清を含む試料を使用して実施される。一般に、対象のＡＢＯ群及びＲｈ型を最初に決定する。次に、抗体スクリーニング法を、対象の血漿中に存在し得る臨床的に有意な予期されない非ＡＢＯ血液群抗体を検出するために使用する。スクリーニング試験でそのような抗体の存在が明らかになった場合、その抗体の特異性は、抗体識別パネルを使用して決定される。抗体の特異性が確認された後、適切なＡＢＯ群及びＲｈ型のドナーユニットを、対応する抗原についてスクリーニングする。その抗原に対して陰性であるユニットは、互換性を確保するために輸血を必要としている対象と交差適合される。
【0067】
血清学的アッセイは、チューブ、スライド、ゲルカラム、またはマイクロタイターウェルプレートで実施してもよく、溶血及び凝集は、陽性（不適合）試験結果を示すシグナルである。抗体でコーティングされた隣接するＲＢＣの結合を反映する反応である凝集反応は、最も一般的に使用されるチューブ法で、肉眼的及び／または顕微鏡的及び０～４＋のスケールでスコアリングされ得る。スコアがゼロの場合は、反応性がないことを示し、細胞が滑らかで分散しやすいことを特徴としている。４＋のスコアは強い反応性を示し、容易に分散されない１つの固体凝集物によって特徴付けられる。１＋、２＋、または３＋のスコアは、反応性の中間レベルを示し、スコアが高くなると凝集体のサイズが徐々に大きくなることを特徴としている。凝集スコアリングの同様の原則は、カラムに抗ＩｇＧ抗体を含むゲルカラム（ゲルカード）または赤血球抗原が結合したマイクロタイターウェルプレート（固相）を使用して、血清学的試験を行う場合に適用され得る。さまざまな感度で抗体－ＲＢＣ抗原相互作用を検出するために、現在さまざまな技術が利用可能である。いくつかの実施形態では、血清学的アッセイは手動で実施される。いくつかの実施形態では、血清学的アッセイは、自動化された機械を介して実行される。
【0068】
例えば、即時スピン（ＩＳ）（「即時スピン交差適合」としても知られる）は、例えば、試薬血漿／抗血清（すなわち、既知のＲＢＣ及び／または血小板表面抗原に対する抗体を含む血漿）及び対象の血球を混合すること、直ちにこの混合物を室温または３７℃で約１５～３０秒間遠心分離すること、チューブが直接凝集していないか目視検査することを伴うアッセイである。直接凝集は、血漿中の抗体とＲＢＣ表面抗原との間に強い相互作用があることを示している。あるいは、対象の血漿及び試薬ＲＢＣ（すなわち、特定の細胞表面抗原、または細胞表面抗原の群を発現することが既知のＲＢＣ）及び／または試薬血小板（すなわち、特定の細胞表面抗原、または細胞表面抗原の群を発現することが既知の血小板）を混合し、遠心分離し、直接凝集について視覚的に評価してもよい。
【0069】
抗ヒトグロブリン（ＡＨＧ）を使用して、直接凝集を生じない抗体結合ＲＢＣを検出する。ＡＨＧは、別の種で産生された二次抗ヒトグロブリン抗体である。ＡＨＧ試薬は、単一クラスのヒトＩｇ（ＩｇＧなど）に特異的、または多重特異的、すなわち複数のヒトＩｇクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡなど）に結合して、補完し得る。ＡＨＧ血清は、直接抗グロブリン試験（ＤＡＴ）及び／または間接抗グロブリン試験（ＩＡＴ）で使用され得る。ＤＡＴは、赤血球のインビボ感作を示し、洗浄された患者の赤血球の試料をＡＨＧで直接試験することによって実行される。ＩＡＴは、赤血球と抗体との間のインビトロ反応を示す。ＩＡＴでは、血清（または血漿）を赤血球とインキュベートし、次にこの赤血球を洗浄して未結合のグロブリンを除去する。ＡＨＧの添加による凝集の存在は、特定の赤血球抗原に結合する抗体を示す。一部の方法では、生理食塩水、アルブミン、低イオン強度生理食塩水（ＬＩＳＳ）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの増強試薬（強化）を添加し、次いで、試料を３７℃で１０～６０分間インキュベートした後に、ＡＨＧ試験を行う。
【0070】
ＡＢＯ判定は、抗Ａ及び抗Ｂ抗血清（フォワード分類）を使用して、Ａ及びＢ抗原の存在についてレシピエントの赤血球を試験することを含む。既知のＡ型及びＢ型の赤血球を使用した抗Ａ及び抗Ｂの存在についてレシピエント血漿を検査すること（逆分類）はまた、慣用的なＡＢＯ血液型検査の一部でもある。
【0071】
輸血レシピエントのＲｈ（Ｄ）型は、レシピエントの赤血球を抗Ｄで試験することによって決定される。ＡＢＯ分類は通常、即時スピン（ＩＳ）を使用して試験される。
【0072】
個体の赤血球に存在しない抗原に対する同種抗体は、妊娠または輸血によって外来赤血球抗原に曝露された人に発生し得る。Ａ群でもＢ群でもない抗原に対する抗体を検出するために、患者の血漿または血清の試料を、Ａ及びＢ以外の臨床的に重要な抗原の大部分を発現する選択された市販のＯ型赤血球に対して試験する。
【0073】
陽性抗体スクリーニングの場合、臨床的に重要な抗体の同定のために、市販のＯ型試薬ＲＢＣの拡大されたパネルを用いて、さらなる血清学的試験を実施する必要がある。次に、抗体の特異性が一度わかれば、対応する抗原について、ドナーユニットをスクリーニングして、抗原を欠くユニットを選択しなければならない。
【0074】
レシピエント赤血球の抗原型判定（表現型タイピング）もまた、個体がどの赤血球抗体を発現する可能性が高いかを決定するために実施され得る。ＲＢＣ表現型の血清学的アッセイでは、レシピエント細胞を特定の抗体を含む市販の試薬抗血清と混合することを含む。
【0075】
増強なし及び増強ありのＩＡＴ（例えば、生理食塩水、ＬＩＳＳ、ＰＥＧ）は、抗体検出及び抗体同定において使用される。
【0076】
「交差適合（クロスマッチ）」とは、患者の血液（血漿）とドナー赤血球との間の適合性を確認する方法を指す。交差適合とは、主にＡＢＯの非互換性を検出して防止することを意味する。血清学的交差適合アッセイ（ＩＳ交差適合またはＡＨＧフェーズ交差適合のいずれか）には、ドナー赤血球とレシピエント血漿の直接混合、及び即時スピン法またはＡＨＧ試験後の溶血及び凝集のスコアが含まれる。
【0077】
本明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするのに十分であると考えられる。本明細書に示され、説明されたものに加えて、本発明の様々な修正は、前述の説明から当業者に明らかになり、添付の特許請求の範囲に含まれる。本明細書で引用された全ての刊行物、特許、及び特許出願は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【0078】
実施例１：（ｉ）抗体Ｆｃ領域及び（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に結合する部分を含む薬物は、慣用的な血清学的アッセイを妨害する
ＣＤ４７は、シグナル調節タンパク質－α（ＳＩＲＰα）に結合し、食作用を阻害する広く発現されている細胞表面タンパク質である（Ｊａｉｓｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１０）３１（６）：２１２－２１９；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（２００１）１１（３）：１３０－１３５）。血液腫瘍及び固形腫瘍を含む多種多様な悪性腫瘍は、ＣＤ４７発現の上昇を示し、これは進行性疾患と相関する（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２０１２）１０９（１７）：６６６２－６６６７）。ＣＤ４７を標的とするいくつかのがん治療法は、ＳＩＲＰα－ＣＤ４７相互作用をブロックするために開発されており、それによってマクロファージが食細胞機能を実行して腫瘍細胞を除去することを可能にする。重要なことに、ＣＤ４７は、赤血球（ＲＢＣ）及び血小板などの表面血球にも発現しているので（Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８８（５４７３）：２０５１－２０５４）、ＣＤ４７結合薬物は、血液型判定及び血清学的試験を妨害し得る。
ＣＤ４７は、シグナル調節タンパク質－α（ＳＩＲＰα）に結合し、食作用を阻害する広く発現されている細胞表面タンパク質である（Ｊａｉｓｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１０）３１（６）：２１２－２１９；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（２００１）１１（３）：１３０－１３５）。血液腫瘍及び固形腫瘍を含む多種多様な悪性腫瘍は、ＣＤ４７発現の上昇を示し、これは進行性疾患と相関する（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２０１２）１０９（１７）：６６６２－６６６７）。ＣＤ４７を標的とするいくつかのがん治療法は、ＳＩＲＰα－ＣＤ４７相互作用をブロックするために開発されており、それによってマクロファージが食細胞機能を実行して腫瘍細胞を除去することを可能にする。重要なことに、ＣＤ４７は、赤血球（ＲＢＣ）及び血小板などの表面血球にも発現しているので（Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８８（５４７３）：２０５１－２０５４）、ＣＤ４７結合薬物は、血液型判定及び血清学的試験を妨害し得る。
【0079】
例えば、ＣＤ４７標的化薬物は、ＲＢＣ及び血小板を含む血球の表面で立体障害をブロックするか、及び／または引き起こすことにより、血液型判定及び血清学的試験を妨害し得る。さらに、抗ＣＤ４７抗体などのＦｃ領域を含む抗ＣＤ４７薬は、血清学的試験で使用される試薬と相互作用し、血球の凝集及び誤った反応性の読み取りにつながり得る。
【0080】
薬物Ａを使用して、ＣＤ４７を標的とする抗体ベースの薬物が血液型判定及び血清学的アッセイを妨害する程度を決定した。薬物Ａは、ＳＩＲＰαバリアント（すなわち、ヒトＳＩＲＰαに由来するＣＤ４７結合ドメイン）及びヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のＦｃ領域に由来するＦｃバリアントを含む例示的なＣＤ４７結合薬物である。
【0081】
材料及び方法
血液型判定及び血清学的アッセイにおける薬物Ａによる干渉の検出
薬物Ａを、０．１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、または１０μｇ／ｍＬの濃度で、５ｍＬのＡ、Ｂ、及びＯ型のドナー血液試料と混合した。混合物を２～８℃で一晩インキュベートした。次に、チューブ法を使用したＢｏｎｆｉｌｓ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌａｂの手順に従って、薬物Ａと以下の血液型判定及び血清学的試験との干渉を確認した。
血液型判定及び血清学的アッセイにおける薬物Ａによる干渉の検出
薬物Ａを、０．１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、または１０μｇ／ｍＬの濃度で、５ｍＬのＡ、Ｂ、及びＯ型のドナー血液試料と混合した。混合物を２～８℃で一晩インキュベートした。次に、チューブ法を使用したＢｏｎｆｉｌｓ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌａｂの手順に従って、薬物Ａと以下の血液型判定及び血清学的試験との干渉を確認した。
【0082】
血液型判定アッセイ
薬物Ａと共にインキュベートされたドナー血液試料（上記のように）を回収し、特定の細胞表面抗原を発現することが既知で、凝集についてスコア付けされる試薬ＲＢＣを用いたスライド試験を使用して、ＡＢＯ及びＲｈＤの判定に供した。
薬物Ａと共にインキュベートされたドナー血液試料（上記のように）を回収し、特定の細胞表面抗原を発現することが既知で、凝集についてスコア付けされる試薬ＲＢＣを用いたスライド試験を使用して、ＡＢＯ及びＲｈＤの判定に供した。
【0083】
抗免疫グロブリン及び補体アッセイ
血漿試料は、薬物Ａと共にインキュベートされたドナー血液試料のそれぞれから回収した。次いで、血漿試料を、試薬ＲＢＣ（Ｉｍｍｕｃｏｒ）を用いた血清学的試験に使用した。血漿試料を試薬ＲＢＣと混合すること、この混合物を直ちに遠心分離すること、及び遠心分離した混合物を調べて凝集を検出することにより、即時スピン交差適合（または即時スピンフェーズ）を実行した。抗体試験もまた、ＰＥＧ増強（１１．５％ＰＥＧｗ／ｖ）を使用した血漿試料で実施し、続いて抗ヒトグロブリン（ＡＨＧ）試薬を添加した。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、フィシン、及び／または同種吸着処理が読み出しに及ぼす影響を確認するために、ＰＥＧ増強（１１．５％ＰＥＧｗ／ｖ）を使用して血漿試料を使用し、続いてＡＨＧ試薬を添加して抗体試験の別のセットを実行した。各アッセイには標準プロトコルを使用し、自己対照（すなわち、薬物Ａを含むドナー試料の血清を、薬物Ａを含むドナー試料のＲＢＣと混合した）を並行して実行した。
血漿試料は、薬物Ａと共にインキュベートされたドナー血液試料のそれぞれから回収した。次いで、血漿試料を、試薬ＲＢＣ（Ｉｍｍｕｃｏｒ）を用いた血清学的試験に使用した。血漿試料を試薬ＲＢＣと混合すること、この混合物を直ちに遠心分離すること、及び遠心分離した混合物を調べて凝集を検出することにより、即時スピン交差適合（または即時スピンフェーズ）を実行した。抗体試験もまた、ＰＥＧ増強（１１．５％ＰＥＧｗ／ｖ）を使用した血漿試料で実施し、続いて抗ヒトグロブリン（ＡＨＧ）試薬を添加した。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、フィシン、及び／または同種吸着処理が読み出しに及ぼす影響を確認するために、ＰＥＧ増強（１１．５％ＰＥＧｗ／ｖ）を使用して血漿試料を使用し、続いてＡＨＧ試薬を添加して抗体試験の別のセットを実行した。各アッセイには標準プロトコルを使用し、自己対照（すなわち、薬物Ａを含むドナー試料の血清を、薬物Ａを含むドナー試料のＲＢＣと混合した）を並行して実行した。
【0084】
さらに、ＲＢＣ試料を、薬物Ａと共にインキュベートされたドナー血液試料のそれぞれから回収した。次いで、ＲＢＣ試料は、ＲＢＣを多重特異性ＡＨＧ試薬（ＩｇＧ及び補体に結合する）またはＡＨＧ試薬（補体にのみ結合する）と組み合わせることを伴う、直接抗グロブリン試験（ＤＡＴ）に使用した。さらに、各試料のＲＢＣに結合した抗体を溶出し、試薬ＲＢＣで試験し、すなわち、自己抗体及び／または同種抗体を検出／識別した。標準プロトコルを使用した。
【0085】
結果
表１に示されるように、薬物Ａは、試験された薬物Ａの濃度（最大１０μｇ／ｍＬ）のいずれにおいても、ＡＢＯ／ＲｈＤ判定または即時スピン交差適合（ＩＳ）による抗体スクリーニングを妨害しなかった。しかし、薬物Ａは、１０μｇ／ｍＬの最高用量でＡＨＧ試薬及びＰＥＧ増強による抗体スクリーニングを妨害し、３＋の反応性レベルを示した。ＡＨＧ試薬及びＰＥＧ増強を用いた抗体スクリーニングアッセイも、自己対照抗体を用いて実施し、薬物Ａが用量依存的に反応性のレベルを増大させたことが明らかになった（０．１μｇ／ｍＬの薬物Ａでの弱い反応性から１０μｇ／ｍＬの薬物Ａでの４＋反応性まで）。
表１に示されるように、薬物Ａは、試験された薬物Ａの濃度（最大１０μｇ／ｍＬ）のいずれにおいても、ＡＢＯ／ＲｈＤ判定または即時スピン交差適合（ＩＳ）による抗体スクリーニングを妨害しなかった。しかし、薬物Ａは、１０μｇ／ｍＬの最高用量でＡＨＧ試薬及びＰＥＧ増強による抗体スクリーニングを妨害し、３＋の反応性レベルを示した。ＡＨＧ試薬及びＰＥＧ増強を用いた抗体スクリーニングアッセイも、自己対照抗体を用いて実施し、薬物Ａが用量依存的に反応性のレベルを増大させたことが明らかになった（０．１μｇ／ｍＬの薬物Ａでの弱い反応性から１０μｇ／ｍＬの薬物Ａでの４＋反応性まで）。
【0086】
ＤＴＴもフィシンも、ＡＨＧ試薬及びＰＥＧ増強を用いた抗体スクリーニングアッセイにおいて、１０μｇ／ｍＬの薬物Ａによって引き起こされた反応性を解決しなかった。対照的に、同種吸着試験は、ＰＥＧ増強を伴う抗体スクリーニングアッセイにおいて薬物Ａによって引き起こされる反応性を解決し、血清学的試験に対する薬物Ａの干渉は、試薬血球への飽和結合によって減少または解決される可能性があることを示唆している。
【0087】
ＩｇＧのＤＡＴ試験は、薬物Ａが用量依存的に反応性を引き起こしたことを示した（０．１μｇ／ｍＬの薬物Ａでの弱い反応性から１０μｇ／ｍＬの薬物Ａでの３＋反応性まで）。対照的に、試験された薬物Ａの濃度（最大１０μｇ／ｍＬ）で補体のＤＡＴ試験中に反応性は観察されず、このことは、薬物Ａの干渉が補体相互作用ではなくＩｇＧ抗体－抗原相互作用によって引き起こされることを示唆している。試験した全ての薬物Ａ濃度での溶出液試験で中程度の反応性が観察された（２＋から３＋の反応性）。
表１：血清学的試験の反応性に関する薬物Ａの存在
表１：血清学的試験の反応性に関する薬物Ａの存在
【0088】
上で考察され、表１に提示された結果は、薬物Ａが慣用的な血清学的アッセイを妨害することを示した。干渉は、血球上のＣＤ４７への血漿薬物Ａの結合に起因する可能性が高く、その後、ＡＨＧなどの血清学的試験で一般的に使用されるＩｇＧ特異的試薬によって検出される。
【0089】
実施例２：Ｆｃ含有タンパク質によって引き起こされる血清学的試験への干渉の軽減
実施例１に提示された結果によって、（ｉ）抗体Ｆｃ領域及び（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に結合する部分を含む薬物が、慣用的な血液型判定及び血清学的アッセイに干渉し得ることが示唆された。このような干渉は、輸血を必要とする患者へのドナー血液製剤の供給を遅らせることにより、患者の安全を危険にさらす場合がある。ＣＤ４７モノマーを含む例示的な薬物中和剤である因子Ｂが、血清学的試験における薬物Ａの干渉を防止または低減する能力を、以下に記載するように評価した。
実施例１に提示された結果によって、（ｉ）抗体Ｆｃ領域及び（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に結合する部分を含む薬物が、慣用的な血液型判定及び血清学的アッセイに干渉し得ることが示唆された。このような干渉は、輸血を必要とする患者へのドナー血液製剤の供給を遅らせることにより、患者の安全を危険にさらす場合がある。ＣＤ４７モノマーを含む例示的な薬物中和剤である因子Ｂが、血清学的試験における薬物Ａの干渉を防止または低減する能力を、以下に記載するように評価した。
【0090】
材料及び方法
薬物Ａを、１０μｇ／ｍＬの濃度で５ｍＬのドナー全血と組み合わせ、約２℃～８℃で一晩インキュベートした。血漿試料は、薬物Ａをスパイクしたドナー全血のそれぞれから得て、アリコートにした。次に、２．７５ｍｇ／ｍＬまたは０．２７５ｍｇ／ｍＬの濃度で因子Ｂを使用して、因子Ｂを１：９の比率（９滴の血漿対１滴の因子Ｂ）で血漿試料に添加した。各血漿試料中の因子Ｂの最終濃度は、それぞれ１７．５μＭまたは１．７５μＭであった。血漿試料／因子Ｂ混合物を、室温で約３０分間インキュベートした。次に、実施例１に記載の血清学的試験を、因子Ｂで処理された血漿試料に対して実施した。
薬物Ａを、１０μｇ／ｍＬの濃度で５ｍＬのドナー全血と組み合わせ、約２℃～８℃で一晩インキュベートした。血漿試料は、薬物Ａをスパイクしたドナー全血のそれぞれから得て、アリコートにした。次に、２．７５ｍｇ／ｍＬまたは０．２７５ｍｇ／ｍＬの濃度で因子Ｂを使用して、因子Ｂを１：９の比率（９滴の血漿対１滴の因子Ｂ）で血漿試料に添加した。各血漿試料中の因子Ｂの最終濃度は、それぞれ１７．５μＭまたは１．７５μＭであった。血漿試料／因子Ｂ混合物を、室温で約３０分間インキュベートした。次に、実施例１に記載の血清学的試験を、因子Ｂで処理された血漿試料に対して実施した。
【0091】
結果
表２に示されるように、１７．５μＭの濃度の因子Ｂは、実施例１に記載される血清学的アッセイにおける薬物Ａ（１０μｇ／ｍＬ）の干渉を軽減した（表１を参照）。しかし、１．７μＭの低濃度では、因子Ｂは、薬物Ａで観察された反応性を排除しなかった（表２を参照）。
表２：反応性の解決におけるＣＤ４７因子Ｂによる薬物Ａの中和
表２に示されるように、１７．５μＭの濃度の因子Ｂは、実施例１に記載される血清学的アッセイにおける薬物Ａ（１０μｇ／ｍＬ）の干渉を軽減した（表１を参照）。しかし、１．７μＭの低濃度では、因子Ｂは、薬物Ａで観察された反応性を排除しなかった（表２を参照）。
表２：反応性の解決におけるＣＤ４７因子Ｂによる薬物Ａの中和
【0092】
したがって、上記の結果は、ＣＤ４７因子Ｂが、薬物Ａを中和し、血清学的試験への干渉を軽減し得ることを示した。
【0093】
実施例３．（ｉ）抗体Ｆｃ領域及び（ｉｉ）ヒトＣＤ４に結合する部分を含む薬物による干渉を、例示的な可溶性ＣＤ４７モノマーである薬剤Ｂまたは例示的な可溶性ＳＩＲＰαモノマーである薬剤Ｃを使用する慣用的な血清学的試験において、軽減する
導入
ＣＤ４７は、自己のマーカーとして機能し、マクロファージ上のその天然の受容体であるシグナル調節タンパク質－α（ＳＩＲＰα）に結合して食作用を阻害することにより、「私を食べるな」シグナルを提供する、広く発現される細胞表面タンパク質である（Ｊａｉｓｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１０）３１（６）：２１２－２１９；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（２００１）１１（３）：１３０－１３５）。腫瘍細胞は、ＣＤ４７を過剰発現して、免疫学的監視を回避する（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２０１２）１０９（１７）：６６６２－６６６７）。豊富なＣＤ４７発現は、血液腫瘍及び固形腫瘍を含む多種多様な悪性腫瘍で観察されており、ＣＤ４７発現の上昇は、進行性疾患及び生存確率の低下と相関している（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２０１２）１０９（１７）：６６６２－６６６７；Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．（２０１０）１４２（４）：６９９－７１３）。
導入
ＣＤ４７は、自己のマーカーとして機能し、マクロファージ上のその天然の受容体であるシグナル調節タンパク質－α（ＳＩＲＰα）に結合して食作用を阻害することにより、「私を食べるな」シグナルを提供する、広く発現される細胞表面タンパク質である（Ｊａｉｓｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１０）３１（６）：２１２－２１９；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（２００１）１１（３）：１３０－１３５）。腫瘍細胞は、ＣＤ４７を過剰発現して、免疫学的監視を回避する（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２０１２）１０９（１７）：６６６２－６６６７）。豊富なＣＤ４７発現は、血液腫瘍及び固形腫瘍を含む多種多様な悪性腫瘍で観察されており、ＣＤ４７発現の上昇は、進行性疾患及び生存確率の低下と相関している（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２０１２）１０９（１７）：６６６２－６６６７；Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．（２０１０）１４２（４）：６９９－７１３）。
【0094】
ＣＤ４７は、ヒトＲＢＣの表面に広く発現されている（Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８８（５４７３）：２０５１－２０５４）。患者への投与後に循環する薬物Ａの存在下では、レシピエント患者からの薬物Ａが、試薬またはドナーＲＢＣ上のＣＤ４７に結合し得る可能性がある。実施例１及び２で考察されるように、薬物Ａは、ＳＩＲＰαバリアント（すなわち、ヒトＳＩＲＰαに由来するＣＤ４７結合ドメイン）及びヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のＦｃ領域に由来するＦｃバリアントを含む例示的なＣＤ４７結合薬物である。薬物Ａには、ＩｇＧ１のＦｃ領域が含まれているため、ＲＢＣ表面ＣＤ４７への結合は、抗体－抗原相互作用に似ている場合があり、慣用的な血液型判定及び輸血前血液バンク検査の血清学的試験のスクリーニングにアッセイの干渉を引き起こす。以前のインビトロ研究では、血漿中の薬物Ａの存在は、ＡＢＯ／Ｒｈ判定及び即時スピンによる抗体スクリーニングを妨害しないことが示唆された。ただし、１０μｇ／ｍＬの濃度では、血漿中の薬物ＡがＰＥＧ増強による抗体スクリーニングを妨害した。
【0095】
以下に記載の実験を行って、高濃度の薬物Ａによって誘発される干渉が、ＣＤ４７モノマー（すなわち、実施例２及び以下に記載の因子Ｂ）または高親和性ＳＩＲＰαモノマー（すなわち、因子Ｃ、これについては以下でさらに詳しく説明する）の添加によって中和され得るか否かを評価した。相関フローサイトメトリー分析を実施して、ＲＢＣへの薬物Ａの結合が可溶性ＣＤ４７モノマー（因子Ｂ）または可溶性高親和性ＳＩＲＰαモノマー（因子Ｃ）の添加によって排除され得るか否かを評価した。
【0096】
材料及び方法
因子Ｂ及び因子Ｃは、製造業者のプロトコルに基づいて、Ｅｘｐｉ２９３発現システム（サーモフィッシャー）を使用してそれぞれ発現された。両方の構築物とも、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグを含み、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製された。全ての精製は、ＧＥ ＡｋｔａＡｖａｎｔ２５またはＡｖａｎｔ１５０を使用して実行した。使用したＩＭＡＣ樹脂は、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥカタログ番号１７－５３１８－０１）であった。まず、平衡緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール）を使用して樹脂を平衡化した。ｈｉｓタグ付きタンパク質を含む粗上清を、樹脂にロードした。この樹脂は、約２０～３０カラム容積の平衡化緩衝液、続いて２０～３０カラム容積の洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７、５００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾール）で再平衡化した。タンパク質を、約１０カラム容積の溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール）で溶出した。溶出したタンパク質を、ゲルろ過により直ちに精製し、１×ＰＢＳ（１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム、４．３ｍＭリン酸ナトリウム（二塩基性、無水）、１．４ｍＭリン酸カリウム（一塩基性、無水））に再懸濁した。
因子Ｂ及び因子Ｃは、製造業者のプロトコルに基づいて、Ｅｘｐｉ２９３発現システム（サーモフィッシャー）を使用してそれぞれ発現された。両方の構築物とも、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグを含み、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製された。全ての精製は、ＧＥ ＡｋｔａＡｖａｎｔ２５またはＡｖａｎｔ１５０を使用して実行した。使用したＩＭＡＣ樹脂は、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥカタログ番号１７－５３１８－０１）であった。まず、平衡緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール）を使用して樹脂を平衡化した。ｈｉｓタグ付きタンパク質を含む粗上清を、樹脂にロードした。この樹脂は、約２０～３０カラム容積の平衡化緩衝液、続いて２０～３０カラム容積の洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７、５００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾール）で再平衡化した。タンパク質を、約１０カラム容積の溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール）で溶出した。溶出したタンパク質を、ゲルろ過により直ちに精製し、１×ＰＢＳ（１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム、４．３ｍＭリン酸ナトリウム（二塩基性、無水）、１．４ｍＭリン酸カリウム（一塩基性、無水））に再懸濁した。
【0097】
この研究で使用された患者の血清試料は、病院環境での日常的なケアの一部として収集された。
【0098】
抗Ｅは、頻繁に特定される臨床的に重要な同種抗体である。抗Ｅ陽性の結果を示すプールされた患者血清は、研究用の病院輸血サービスから入手した。
【0099】
この研究で使用されたＲＢＣ試薬細胞は、Ｂｉｏｒａｄ ＩＤ－ＤｉａＣｅｌｌ Ｉ－ＩＩ－ＩＩＩから入手した。
【0100】
実験プロトコル
ＢｉｏＲａｄ抗体スクリーニングセルＩ及びＩＩを使用した抗ヒトグロブリン（ＡＨＧ）フェーズでのカラム凝集試験（ＣＡＴ）
薬物Ａは、５００μｇ／ｍＬまでの濃度で血清学的血液バンク試験を妨害する可能性について評価された。薬物Ａをスパイクした血清は、ＲＢＣ試薬セルＩＤ－ＤｉａＣｅｌｌ Ｉ－ＩＩ（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して、ゲルＩＡＴ（ＩＤ－Ｃａｒｄ ＬＩＳＳ／Ｃｏｏｍｂｓ，ＢＩＯ－ＲＡＤ）による抗体スクリーニングを受けた。具体的には、２５μＬの薬物Ａスパイク血清（０．１、１．０、１０．０、１００．０、及び５００．０μｇ／ｍＬ）及び低イオン強度生理食塩水（ＬＩＳＳ）に懸濁した５０μＬの０．８％試薬ＲＢＣを、ＬＩＳＳ／Ｃｏｏｍｂｓカードに追加した。３７℃で１５分間インキュベートした後、カードを１，０３０ｒｐｍで１０分間遠心分離した。凝集の強さは、０（凝集なし）、０．５＋（非常に弱い凝集）、１＋（弱い凝集）、２＋（中程度の凝集）、３＋（強い凝集）、または４＋（非常に強い凝集）に分類された。
ＢｉｏＲａｄ抗体スクリーニングセルＩ及びＩＩを使用した抗ヒトグロブリン（ＡＨＧ）フェーズでのカラム凝集試験（ＣＡＴ）
薬物Ａは、５００μｇ／ｍＬまでの濃度で血清学的血液バンク試験を妨害する可能性について評価された。薬物Ａをスパイクした血清は、ＲＢＣ試薬セルＩＤ－ＤｉａＣｅｌｌ Ｉ－ＩＩ（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して、ゲルＩＡＴ（ＩＤ－Ｃａｒｄ ＬＩＳＳ／Ｃｏｏｍｂｓ，ＢＩＯ－ＲＡＤ）による抗体スクリーニングを受けた。具体的には、２５μＬの薬物Ａスパイク血清（０．１、１．０、１０．０、１００．０、及び５００．０μｇ／ｍＬ）及び低イオン強度生理食塩水（ＬＩＳＳ）に懸濁した５０μＬの０．８％試薬ＲＢＣを、ＬＩＳＳ／Ｃｏｏｍｂｓカードに追加した。３７℃で１５分間インキュベートした後、カードを１，０３０ｒｐｍで１０分間遠心分離した。凝集の強さは、０（凝集なし）、０．５＋（非常に弱い凝集）、１＋（弱い凝集）、２＋（中程度の凝集）、３＋（強い凝集）、または４＋（非常に強い凝集）に分類された。
【0101】
ＲＢＣに結合する薬物Ａのフローサイトメトリー分析
フローサイトメトリーを実施して、試薬ＲＢＣへの薬物Ａの結合及び因子Ｂまたは因子Ｃを使用することによる結合の減少を測定した。２５μＬの薬物Ａをスパイクした血清（０．１、１．０、１０．０、１００．０、及び５００．０μｇ／ｍＬ）または、予期しない抗体が陰性である通常の血清試験を、５０μＬの試薬ＲＢＣ（ＩＤ－ＤｉａＣｅｌｌ Ｉ）に添加した。１０、３０、及び５０倍モル過剰の因子Ｂとプレインキュベートした２５μＬの薬物Ａスパイク血清（５００．０μｇ／ｍＬ）を、５０μＬの試験ＲＢＣ（ＩＤ－ＤｉａＣｅｌｌ Ｉ）に添加した。２５μＬの薬物Ａスパイク血清（５００．０μｇ／ｍＬ）を、１０、５０、１００、３００、及び５００倍モル過剰の因子Ｃとプレインキュベートした５０μＬの試薬ＲＢＣ（ＩＤ－ＤｉａＣｅｌｌ Ｉ）に添加した。その混合物を３７℃で１５分間インキュベートした後、ＰＢＳで４回洗浄した。洗浄した混合物を、０．５μＬのＦＩＴＣコンジュゲートＦ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）とともに４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で試料あたり少なくとも２０，０００の事象を取得して、ＲＢＣは、前方及び側方散乱パラメーターによってゲートした。
フローサイトメトリーを実施して、試薬ＲＢＣへの薬物Ａの結合及び因子Ｂまたは因子Ｃを使用することによる結合の減少を測定した。２５μＬの薬物Ａをスパイクした血清（０．１、１．０、１０．０、１００．０、及び５００．０μｇ／ｍＬ）または、予期しない抗体が陰性である通常の血清試験を、５０μＬの試薬ＲＢＣ（ＩＤ－ＤｉａＣｅｌｌ Ｉ）に添加した。１０、３０、及び５０倍モル過剰の因子Ｂとプレインキュベートした２５μＬの薬物Ａスパイク血清（５００．０μｇ／ｍＬ）を、５０μＬの試験ＲＢＣ（ＩＤ－ＤｉａＣｅｌｌ Ｉ）に添加した。２５μＬの薬物Ａスパイク血清（５００．０μｇ／ｍＬ）を、１０、５０、１００、３００、及び５００倍モル過剰の因子Ｃとプレインキュベートした５０μＬの試薬ＲＢＣ（ＩＤ－ＤｉａＣｅｌｌ Ｉ）に添加した。その混合物を３７℃で１５分間インキュベートした後、ＰＢＳで４回洗浄した。洗浄した混合物を、０．５μＬのＦＩＴＣコンジュゲートＦ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）とともに４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で試料あたり少なくとも２０，０００の事象を取得して、ＲＢＣは、前方及び側方散乱パラメーターによってゲートした。
【0102】
結果
薬物Ａに起因する干渉の確認
ＲＢＣ抗体スクリーニングを妨害する薬物Ａの可能性に関する以前の結果に基づいて（例えば、実施例１を参照）、薬物Ａを、赤血球抗体がないことが確認された正常なプールされた血清にスパイクした。この研究で使用された患者の血清試料は、病院状況での日常的なケアの一環として収集された。薬物Ａの最終濃度は、０．１、１、１０、１００、及び５００μｇ／ｍＬであった。最高濃度は、ヒト患者で観察された１０ｍｇ／ｋｇ（ＱＷ）用量レベルで観察された２４７±３２．５μｇ／ｍＬという平均Ｃｍａｘを超えた（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．“Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＲＵＧ Ａ，ａ ＣＤ４７ Ｂｌｏｃｋｅｒ，ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ ａｎｄ Ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．”（Ｐｏｓｔｅｒ）Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ７－１１，２０１８参照）。
薬物Ａに起因する干渉の確認
ＲＢＣ抗体スクリーニングを妨害する薬物Ａの可能性に関する以前の結果に基づいて（例えば、実施例１を参照）、薬物Ａを、赤血球抗体がないことが確認された正常なプールされた血清にスパイクした。この研究で使用された患者の血清試料は、病院状況での日常的なケアの一環として収集された。薬物Ａの最終濃度は、０．１、１、１０、１００、及び５００μｇ／ｍＬであった。最高濃度は、ヒト患者で観察された１０ｍｇ／ｋｇ（ＱＷ）用量レベルで観察された２４７±３２．５μｇ／ｍＬという平均Ｃｍａｘを超えた（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．“Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＲＵＧ Ａ，ａ ＣＤ４７ Ｂｌｏｃｋｅｒ，ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ ａｎｄ Ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．”（Ｐｏｓｔｅｒ）Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ７－１１，２０１８参照）。
【0103】
ＢｉｏＲａｄ抗体スクリーニングセルＩ及びＩＩを使用する抗ヒトグロブリン（ＡＨＧ）フェーズでのカラム凝集試験（ＣＡＴ）を実施した。試験した薬物Ａ濃度全体で、０から４＋のスケールで２＋から３＋の範囲の反応の強度が観察され、薬物ＡのＲＢＣへの結合、及び薬物ＡのＦｃ部分とＡＨＧ試薬との相互作用に起因する干渉が示唆された（表３）。
表３．抗ヒトグロブリン（ＡＨＧ）フェーズでのカラム凝集試験で陽性と試験された薬物Ａスパイク血清
表３．抗ヒトグロブリン（ＡＨＧ）フェーズでのカラム凝集試験で陽性と試験された薬物Ａスパイク血清
【0104】
因子Ｂを使用した干渉の軽減
因子Ｂは、ＩｇＳＦドメインを含むＣＤ４７モノマーである。溶液中の薬物Ａへの因子Ｂの結合は、因子Ｂ－薬物Ａ複合体を形成すると仮定された。また、因子Ｂ－薬物Ａ複合体は、ＲＢＣで発現される内因性ＣＤ４７に結合できず、それによって薬物Ａが、ＲＢＣ抗体スクリーニング試験に干渉するのを防ぐとも仮定された。この可能性を試験するために、薬物Ａの１０倍から５００倍のモル比に対応する濃度の因子Ｂを、薬物Ａをスパイクした血清に添加した。室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした後、ＢｉｏＲａｄ抗体スクリーニングセルＩ及びＩＩを使用したＡＨＧフェーズのＣＡＴを再度実行した。薬物Ａ干渉の解決は、因子Ｂの４０倍～１００倍のモル比で達成された（表４）。
表４．因子Ｂは、抗ヒトグロブリン（ＡＨＧ）フェーズでのカラム凝集試験における薬物Ａに起因する干渉を軽減する
＊ＮＴ：試験なし
因子Ｂは、ＩｇＳＦドメインを含むＣＤ４７モノマーである。溶液中の薬物Ａへの因子Ｂの結合は、因子Ｂ－薬物Ａ複合体を形成すると仮定された。また、因子Ｂ－薬物Ａ複合体は、ＲＢＣで発現される内因性ＣＤ４７に結合できず、それによって薬物Ａが、ＲＢＣ抗体スクリーニング試験に干渉するのを防ぐとも仮定された。この可能性を試験するために、薬物Ａの１０倍から５００倍のモル比に対応する濃度の因子Ｂを、薬物Ａをスパイクした血清に添加した。室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした後、ＢｉｏＲａｄ抗体スクリーニングセルＩ及びＩＩを使用したＡＨＧフェーズのＣＡＴを再度実行した。薬物Ａ干渉の解決は、因子Ｂの４０倍～１００倍のモル比で達成された（表４）。
表４．因子Ｂは、抗ヒトグロブリン（ＡＨＧ）フェーズでのカラム凝集試験における薬物Ａに起因する干渉を軽減する
【0105】
２０９．８２μＭの因子Ｂ（３．３２ｍｇ／ｍＬ）を中和のために使用した。具体的には、２５μＬの薬物Ａをスパイクした血漿（５００μｇ／ｍＬ、１６０ｐｍｏｌ）を、８、１６、２４、３２、及び４０μＬの因子Ｂ（１０Ｘ、１．６ｎｍｏｌ；２０Ｘ、３．２ｎｍｏｌ；３０Ｘ、４．８ｎｍｏｌ；４０Ｘ、６．４ｎｍｏｌ；５０Ｘ、８．０ｎｍｏｌ）とともにインキュベートした。２５μＬの薬物Ａをスパイクした血漿（１００μｇ／ｍＬ、３２ｐｍｏｌ）を、１．６、３．２、４．８、６．４、及び８．０μＬの因子Ｂ（１０Ｘ、３２０ｐｍｏｌ；２０Ｘ、６４０ｐｍｏｌ；３０Ｘ、９６０ｐｍｏｌ；４０Ｘ、１．２８ｎｍｏｌ；５０Ｘ、１．６ｎｍｏｌ）とインキュベートした。２５μＬの薬物Ａをスパイクした血漿（１０μｇ／ｍＬ、３．２ｐｍｏｌ）を、１６０、３２０、４８０、６４０、及び８００ｎＬの因子Ｂ（１０Ｘ、３２ｐｍｏｌ；２０Ｘ、６４ｐｍｏｌ；３０Ｘ、９６ｐｍｏｌ；４０Ｘ、１２８ｐｍｏｌ；５０Ｘ、１６０ｐｍｏｌ）とインキュベートした。２５μＬの薬物Ａをスパイクした血漿（１μｇ／ｍＬ、３２０ｆｍｏｌ）を、１６、３２、４８、６４、８０、１６０、３２０、及び４８０ｎＬの因子Ｂ（１０Ｘ、３．２ｐｍｏｌ；２０Ｘ、６．４ｐｍｏｌ；３０Ｘ、９．６ｐｍｏｌ；４０Ｘ、１２．８ｐｍｏｌ；５０Ｘ、１６．０ｐｍｏｌ；１００Ｘ、３２．０ｐｍｏｌ；２００Ｘ、６４．０ｐｍｏｌ；３００Ｘ、９６．０ｐｍｏｌ）とインキュベートした。２５μＬの薬物Ａをスパイクした血漿（０．１μｇ／ｍＬ、３２ｆｍｏｌ）を、１．６、３．２、４．８、６．４、８．０、１６．０、３２．０、及び４８．０ｎＬの因子Ｂ（１０Ｘ、３２０ｆｍｏｌ；２０Ｘ、６４０ｐｍｏｌ；３０Ｘ、９６０ｆｍｏｌ；４０Ｘ、１．２８ｐｍｏｌ；５０Ｘ、１．６０ｐｍｏｌ；１００Ｘ、３．２ｐｍｏｌ；２００Ｘ、６．４ｐｍｏｌ；３００Ｘ、９．６ｐｍｏｌ）とインキュベートした。
【0106】
因子Ｃを使用した干渉の軽減
因子Ｃは、組換え高親和性ＳＩＲＰαモノマー（ヒトＣＤ４７のＫｄ＝１４．４ｐＭ）である。ＲＢＣ上で発現されたＣＤ４７への因子の結合は、薬物ＡがＲＢＣ上で発現されたＣＤ４７に結合するのをブロックし、これによって薬物ＡがＲＢＣ抗体スクリーニング試験に干渉するのを防ぐと仮定された。この可能性を試験するために、ＢｉｏＲａｄ抗体スクリーニングセルＩ及びＩＩを、薬物Ａの１０倍～５００倍のモル比に対応する濃度で因子Ｃとインキュベートした。室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした後、因子Ｃでインキュベートした試薬ＲＢＣを、薬物Ａをスパイクした血清を用いたＡＨＧフェーズのＣＡＴで試験した。薬物Ａ干渉の解決は、因子Ｃの３００倍のモル比で達成された（表５）。
表５：因子Ｃは、カラム凝集試験での薬物Ａに起因する干渉を、抗ヒトグロブリン（ＡＨＧ）フェーズで軽減する
ＮＴ：試験せず
因子Ｃは、組換え高親和性ＳＩＲＰαモノマー（ヒトＣＤ４７のＫｄ＝１４．４ｐＭ）である。ＲＢＣ上で発現されたＣＤ４７への因子の結合は、薬物ＡがＲＢＣ上で発現されたＣＤ４７に結合するのをブロックし、これによって薬物ＡがＲＢＣ抗体スクリーニング試験に干渉するのを防ぐと仮定された。この可能性を試験するために、ＢｉｏＲａｄ抗体スクリーニングセルＩ及びＩＩを、薬物Ａの１０倍～５００倍のモル比に対応する濃度で因子Ｃとインキュベートした。室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした後、因子Ｃでインキュベートした試薬ＲＢＣを、薬物Ａをスパイクした血清を用いたＡＨＧフェーズのＣＡＴで試験した。薬物Ａ干渉の解決は、因子Ｃの３００倍のモル比で達成された（表５）。
表５：因子Ｃは、カラム凝集試験での薬物Ａに起因する干渉を、抗ヒトグロブリン（ＡＨＧ）フェーズで軽減する
【0107】
試薬ＲＢＣのＣＤ４７上の薬物Ａ結合部位をマスキングするために、３４５．６６μＭの因子Ｃ（４．７７ｍｇ／ｍＬ）を使用した。具体的には、２５μＬの薬物Ａをスパイクした血漿（５００μｇ／ｍＬ、１６０ｐｍｏｌ）を、５、１０、１５、２０、２５、５０、及び１５０μＬの因子Ｃ（１０Ｘ、１．６ｎｍｏｌ；２０Ｘ、３．２ｎｍｏｌ；３０Ｘ、４．８ｎｍｏｌ；４０Ｘ、６．４ｎｍｏｌ；５０Ｘ、８．０ｎｍｏｌ；１００Ｘ、１６．０ｎｍｏｌ；３００Ｘ、４８．０ｎｍｏｌ）とともにインキュベートした。２５μＬの薬物Ａをスパイクした血漿（１００μｇ／ｍＬ、３２ｐｍｏｌ）を、１、２、３、４、５、１０、３０、及び５０μＬの因子Ｃ（１０Ｘ、３２０ｐｍｏｌ；２０Ｘ、６４０ｐｍｏｌ；３０Ｘ、９６０ｐｍｏｌ；４０Ｘ、１．２８ｎｍｏｌ；５０Ｘ、１．６ｎｍｏｌ；１００Ｘ．３．２ｎｍｏｌ；３００Ｘ、９．６ｎｍｏｌ；５００Ｘ、１６ｎｍｏｌ）とともにインキュベートした。２５μＬの薬物Ａをスパイクした血漿（１０μｇ／ｍＬ、３．２ｐｍｏｌ）を、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１．０、３．０、及び５．０μＬの因子Ｃ（１０Ｘ、３２ｐｍｏｌ；２０Ｘ、６４ｐｍｏｌ；３０Ｘ、９６ｐｍｏｌ；４０Ｘ、１２８ｐｍｏｌ；５０Ｘ、１６０ｐｍｏｌ、１００Ｘ、３２０ｐｍｏｌ；３００Ｘ、９６０ｐｍｏｌ；５００Ｘ、１．６ｎｍｏｌ）とともにインキュベートした。２５μＬの薬物Ａをスパイクした血漿（１μｇ／ｍＬ、３２０ｆｍｏｌ）を、１０、２０、３０、４０、５０、１００、３００、及び５００ｎＬの因子Ｃ（１０Ｘ、３．２ｐｍｏｌ；２０Ｘ、６．４ｐｍｏｌ；３０Ｘ、９．６ｐｍｏｌ；４０Ｘ、１２．８ｐｍｏｌ；５０Ｘ、１６．０ｐｍｏｌ；１００Ｘ、３２．０ｐｍｏｌ；３００Ｘ、９６．０ｐｍｏｌ；５００Ｘ、１６０．０ｐｍｏｌ）とともにインキュベートした。２５μＬの薬物Ａをスパイクした血漿（０．１μｇ／ｍＬ、３２ｆｍｏｌ）を、１、２、３、４、５、１０、３０、及び５０ｎＬの因子Ｃ（１０Ｘ、３２０ｆｍｏｌ；２０Ｘ、６４０ｐｍｏｌ；３０Ｘ、９６０ｆｍｏｌ；４０Ｘ、１．２８ｐｍｏｌ；５０Ｘ、１．６０ｐｍｏｌ；１００Ｘ、３．２ｐｍｏｌ；３００Ｘ、９．６ｐｍｏｌ；５００Ｘ、１６．０ｐｍｏｌ）とともにインキュベートした。
【0108】
因子Ｂまたは因子Ｃのいずれかを使用した干渉の軽減により、患者の血清中のＲＢＣ同種抗体の検出が可能になる
因子Ｂまたは因子Ｃによる薬物Ａ干渉の軽減が、真のＲＢＣ同種抗体の検出を可能にするか否かを調査するために、例示的なＲＢＣ同種抗体である抗Ｅを含むプールされたヒト血清を、上記と同様の実験で使用した。抗Ｅは、頻繁に同定される臨床的に重要な同種抗体であり、抗Ｅ陽性の結果を伴うプールされた患者血清は、研究用の病院輸血サービスから得た。この研究で使用された患者の血清試料は、日常的なケアの一環として収集された。抗Ｅを含む患者の血清を、０．１～５００μｇ／ｍＬの薬物Ａでスパイクした。ＡＨＧフェーズのＣＡＴは、ＢｉｏｒａｄＩ及びＩＩセルを使用して実行した。Ｂｉｏｒａｄ ＩＩセルはＥ陽性であるが、全ての薬物Ａ濃度の両方の試薬細胞で汎陽性（ｐａｎ－ｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ）が観察された（表６Ａ）。しかし、２５μＬの薬物Ａ（５００μｇ／ｍｌ）のモル比の４０倍である３２μＬの因子Ｂ（３．３２ｍｇ／ｍＬ）との、ＲＴで３０分間のインキュベーション後、ＡＨＧフェーズのＣＡＴのみが、Ｂｉｏｒａｄ ＩＩセルで明らかに陽性であり、これによって、抗Ｅ活性のみが検出され、試験された全ての薬物Ａ濃度で薬物Ａ干渉が解消されたことが示唆される（表６Ｂ）。
因子Ｂまたは因子Ｃによる薬物Ａ干渉の軽減が、真のＲＢＣ同種抗体の検出を可能にするか否かを調査するために、例示的なＲＢＣ同種抗体である抗Ｅを含むプールされたヒト血清を、上記と同様の実験で使用した。抗Ｅは、頻繁に同定される臨床的に重要な同種抗体であり、抗Ｅ陽性の結果を伴うプールされた患者血清は、研究用の病院輸血サービスから得た。この研究で使用された患者の血清試料は、日常的なケアの一環として収集された。抗Ｅを含む患者の血清を、０．１～５００μｇ／ｍＬの薬物Ａでスパイクした。ＡＨＧフェーズのＣＡＴは、ＢｉｏｒａｄＩ及びＩＩセルを使用して実行した。Ｂｉｏｒａｄ ＩＩセルはＥ陽性であるが、全ての薬物Ａ濃度の両方の試薬細胞で汎陽性（ｐａｎ－ｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ）が観察された（表６Ａ）。しかし、２５μＬの薬物Ａ（５００μｇ／ｍｌ）のモル比の４０倍である３２μＬの因子Ｂ（３．３２ｍｇ／ｍＬ）との、ＲＴで３０分間のインキュベーション後、ＡＨＧフェーズのＣＡＴのみが、Ｂｉｏｒａｄ ＩＩセルで明らかに陽性であり、これによって、抗Ｅ活性のみが検出され、試験された全ての薬物Ａ濃度で薬物Ａ干渉が解消されたことが示唆される（表６Ｂ）。
【0109】
同様の結果が因子Ｃで観察された。ＢｉｏＲａｄ抗体スクリーニングセルＩ及びＩＩを、２５μＬの薬物Ａ（５００μｇ／ｍｌ）の３００倍のモル比である１５０μＬの因子Ｃ（４．７７ｍｇ／ｍＬ）と共に、室温で３０分間インキュベートした。抗Ｅを含む薬物Ａをスパイクした患者血清を用いたＡＨＧフェーズのＣＡＴを実行し、Ｂｉｏｒａｄ ＩＩセルでのみ陽性を示し、これによって、抗Ｅ活性のみが検出され、薬物Ａの干渉が試験された全ての薬物Ａ濃度で解決されたことが示唆される（表６Ｃ）。
表６Ａ－６Ｃ。因子Ｂまたは因子Ｃのいずれかを使用した緩和干渉により、患者血清中のＲＢＣ同種抗体の検出が可能になる
表６Ａ。
＊Ｂｉｏｒａｄ ＩＩセルは、Ｅ陽性である。
表６Ｂ‡．
＊Ｂｉｏｒａｄ ＩＩセルはＥ－陽性である。
‡試験した全ての薬物Ａ濃度について、６．４ｎｍｏｌ因子Ｂ（５００μｇ／ｍＬの薬物Ａの４０×モル比）を用いた。
表６Ｃ‡．
＊Ｂｉｏｒａｄ ＩＩセルは、Ｅ陽性である。
‡試験した全ての薬物Ａ濃度について、４８ｎｍｏｌの因子Ｃ（５００μｇ／ｍＬの薬物Ａの３００×モル比）を用いた。
表６Ａ－６Ｃ。因子Ｂまたは因子Ｃのいずれかを使用した緩和干渉により、患者血清中のＲＢＣ同種抗体の検出が可能になる
表６Ａ。
表６Ｂ‡．
‡試験した全ての薬物Ａ濃度について、６．４ｎｍｏｌ因子Ｂ（５００μｇ／ｍＬの薬物Ａの４０×モル比）を用いた。
表６Ｃ‡．
‡試験した全ての薬物Ａ濃度について、４８ｎｍｏｌの因子Ｃ（５００μｇ／ｍＬの薬物Ａの３００×モル比）を用いた。
【0110】
フローサイトメトリーによるＲＢＣへの薬物Ａの結合の相関分析
試薬ＲＢＣ上で発現されるＣＤ４７への薬物Ａの結合が、可溶性高親和性ＳＩＲＰα（因子Ｃ）または可溶性ＣＤ４７（因子Ｂ）の存在によって実際に減少するか否かを決定するために、フローサイトメトリー分析を以下のように実施した。薬物Ａは、正常血清に対して、０（陰性対照）、０．１、１．０、１０、１００、及び５００μｇ／ｍＬでスパイクされた。ＢｉｏＲＡＤ Ｉセルは、薬物Ａをスパイクした血清試料とともに３７℃で１５分間インキュベートした。ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧを、薬物Ａに結合したＲＢＣの染色に使用した。セルをフローサイトメトリーで分析し、ＭＦＩ（平均蛍光強度）を測定した。
試薬ＲＢＣ上で発現されるＣＤ４７への薬物Ａの結合が、可溶性高親和性ＳＩＲＰα（因子Ｃ）または可溶性ＣＤ４７（因子Ｂ）の存在によって実際に減少するか否かを決定するために、フローサイトメトリー分析を以下のように実施した。薬物Ａは、正常血清に対して、０（陰性対照）、０．１、１．０、１０、１００、及び５００μｇ／ｍＬでスパイクされた。ＢｉｏＲＡＤ Ｉセルは、薬物Ａをスパイクした血清試料とともに３７℃で１５分間インキュベートした。ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧを、薬物Ａに結合したＲＢＣの染色に使用した。セルをフローサイトメトリーで分析し、ＭＦＩ（平均蛍光強度）を測定した。
【0111】
薬物ＡのＲＢＣへの結合に対する因子Ｂの影響を評価するために、薬物Ａをスパイクした血清試料、及びスパイクしていない陰性対照試料を、因子Ｂ（薬物Ａの１０×～５０×のモル比範囲の濃度）と共に、室温で１５分間、インキュベートした。ＢｉｏＲＡＤ Ｉセルを血清試料とともに３７℃で１５分間インキュベートし、フローサイトメトリー分析に供した。
【0112】
薬物ＡのＲＢＣへの結合に対する因子Ｃの影響を評価するために、因子Ｃ（薬物Ａの１０×～５００×のモル比の範囲の濃度）を３７℃で１５分間、ＢｉｏＲＡＤ Ｉセルに加えた。このセルをさらに、薬物Ａをスパイクした血清試料、及びスパイクしていない陰性対照試料とともに３７℃で１５分間インキュベートし、フローサイトメトリー分析に供した。
【0113】
増加したＦＩＴＣシグナルによって示されるように、ＲＢＣは、血清に含まれる薬物Ａと結合した。血清にスパイクされる薬物Ａの濃度の増大に伴い、ＭＦＩの濃度依存性の増大が観察された（表７Ａ）。因子Ｂと因子Ｃの両方＝ＲＢＣへの薬物Ａの結合を効果的かつ濃度依存的に低減する（表７Ｂ及び７Ｃ）。
表７Ａ～７Ｃ。因子Ｂ及び因子Ｃは薬物ＡのＲＢＣへの結合を低減させる
表７Ａ．
表７Ｂ．
表７Ｃ．
表７Ａ～７Ｃ。因子Ｂ及び因子Ｃは薬物ＡのＲＢＣへの結合を低減させる
表７Ａ．
【0114】
結論
ＢｉｏＲａｄ抗体スクリーニングセルＩ及びＩＩを使用する抗ヒトグロブリン（ＡＨＧ）フェーズでのカラム凝集試験（ＣＡＴ）において、最大５００μｇ／ｍＬまでの濃度の血清中の薬物Ａの存在は、この試験を妨害し、そして偽陽性の結果を生じた。組換えＣＤ４７モノマー（因子Ｂ）または高親和性ＳＩＲＰαモノマー（因子Ｃ）を使用して、この干渉を解決した。さらに、臨床的に関連する同種抗体である抗Ｅは、薬物Ａによる因子Ｂまたは因子Ｃのいずれかの干渉の解消後、血清中で検出可能であった。相関フローサイトメトリー分析によって、薬物Ａが濃度依存的にＲＢＣに結合することが示唆された。因子Ｂと因子Ｃの両方が、ＲＢＣ上に発現するＣＤ４７に結合する薬物Ａの干渉の中和と一致して、ＲＢＣへの薬物Ａの結合を減少させた。
ＢｉｏＲａｄ抗体スクリーニングセルＩ及びＩＩを使用する抗ヒトグロブリン（ＡＨＧ）フェーズでのカラム凝集試験（ＣＡＴ）において、最大５００μｇ／ｍＬまでの濃度の血清中の薬物Ａの存在は、この試験を妨害し、そして偽陽性の結果を生じた。組換えＣＤ４７モノマー（因子Ｂ）または高親和性ＳＩＲＰαモノマー（因子Ｃ）を使用して、この干渉を解決した。さらに、臨床的に関連する同種抗体である抗Ｅは、薬物Ａによる因子Ｂまたは因子Ｃのいずれかの干渉の解消後、血清中で検出可能であった。相関フローサイトメトリー分析によって、薬物Ａが濃度依存的にＲＢＣに結合することが示唆された。因子Ｂと因子Ｃの両方が、ＲＢＣ上に発現するＣＤ４７に結合する薬物Ａの干渉の中和と一致して、ＲＢＣへの薬物Ａの結合を減少させた。
【0115】
引用文献
Ｂｒｏｗｎ ＥＪ，Ｆｒａｚｉｅｒ ＷＡ．Ｉｎｔｅｇｒｉｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＤ４７） ａｎｄ ｉｔｓ ｌｉｇａｎｄｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００１ Ｍａｒ；１１（３）：１３０－５．
Ｃｈａｏ ＭＰ，Ａｌｉｚａｄｅｈ ＡＡ，Ｔａｎｇ Ｃ，Ｍｙｋｌｅｂｕｓｔ ＪＨ，Ｖａｒｇｈｅｓｅ Ｂ，Ｇｉｌｌ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉ－ＣＤ４７ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｙｎｅｒｇｉｚｅｓ ｗｉｔｈ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｔｏ ｐｒｏｍｏｔｅ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｅｒａｄｉｃａｔｅ ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｃｅｌｌ．２０１０ Ｓｅｐ ３；１４２（４）：６９９－７１３．
Ｊａｉｓｗａｌ Ｓ，Ｃｈａｏ ＭＰ，Ｍｅｊｅｔｉ Ｒ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｍａｎ ＩＬ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｓ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０ Ｊｕｎｅ；３１（６）：２１２－２１９．
Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇ ＰＡ，Ｚｈｅｌｅｚｎｙａｋ Ａ，Ｆａｎｇ ＹＦ，Ｌａｇｅｎａｕｒ ＣＦ，Ｇｒｅｓｈａｍ ＨＤ ｅｔ ａｌ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ＣＤ４７ ａｓ ａ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｓｅｌｆ ｏｎ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００ Ｊｕｎ １６；２８８（５４７３）：２０５１－４．
Ｗｅｉｓｋｏｐｆ Ｋ，Ｒｉｎｇ ＡＭ，Ｈｏ ＣＣ，Ｖｏｌｋｍｅｒ Ｊ－Ｐ，Ｌｅｖｉｎ ＡＭ，Ｖｏｌｋｍｅｒ ＡＫ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＳＩＲＰα ｖａｒｉａｎｔｓ ａｓ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｔｏ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３ Ｊｕｌ ５；３４１（６１４１）：８８－９１．
Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ ＳＢ，Ｖｏｌｋｍｅｒ ＪＰ，Ｇｅｎｔｌｅｓ ＡＪ，Ｓａｈｏｏ Ｄ，Ｄａｌｅｒｂａ Ｐ，Ｍｉｔｒａ ＳＳ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＣＤ４７－ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｌｐｈａ（ＳＩＲＰα） ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１２ Ａｐｒ ２４；１０９（１７）：６６６２－７．
Ｚｈａｏ ＸＷ，Ｖａｎ Ｂｅｅｋ ＥＭ，Ｓｃｈｏｒｎａｇｅｌａ Ｋ，Ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａａｄｅｎｂ Ｈ，Ｈｏｕｄｔａ ＭＶ；ＣＤ４７－ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ－α（ＳＩＲＰα） ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒｍ ａ ｂａｒｒｉｅｒ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１１ Ｎｏｖ ８；１０８（４５）：１８３４２－７．
Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ：ＡＡＢＢ．
Ｂｒｏｗｎ ＥＪ，Ｆｒａｚｉｅｒ ＷＡ．Ｉｎｔｅｇｒｉｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＤ４７） ａｎｄ ｉｔｓ ｌｉｇａｎｄｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００１ Ｍａｒ；１１（３）：１３０－５．
Ｃｈａｏ ＭＰ，Ａｌｉｚａｄｅｈ ＡＡ，Ｔａｎｇ Ｃ，Ｍｙｋｌｅｂｕｓｔ ＪＨ，Ｖａｒｇｈｅｓｅ Ｂ，Ｇｉｌｌ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉ－ＣＤ４７ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｙｎｅｒｇｉｚｅｓ ｗｉｔｈ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｔｏ ｐｒｏｍｏｔｅ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｅｒａｄｉｃａｔｅ ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｃｅｌｌ．２０１０ Ｓｅｐ ３；１４２（４）：６９９－７１３．
Ｊａｉｓｗａｌ Ｓ，Ｃｈａｏ ＭＰ，Ｍｅｊｅｔｉ Ｒ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｍａｎ ＩＬ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｓ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０ Ｊｕｎｅ；３１（６）：２１２－２１９．
Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇ ＰＡ，Ｚｈｅｌｅｚｎｙａｋ Ａ，Ｆａｎｇ ＹＦ，Ｌａｇｅｎａｕｒ ＣＦ，Ｇｒｅｓｈａｍ ＨＤ ｅｔ ａｌ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ＣＤ４７ ａｓ ａ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｓｅｌｆ ｏｎ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００ Ｊｕｎ １６；２８８（５４７３）：２０５１－４．
Ｗｅｉｓｋｏｐｆ Ｋ，Ｒｉｎｇ ＡＭ，Ｈｏ ＣＣ，Ｖｏｌｋｍｅｒ Ｊ－Ｐ，Ｌｅｖｉｎ ＡＭ，Ｖｏｌｋｍｅｒ ＡＫ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＳＩＲＰα ｖａｒｉａｎｔｓ ａｓ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｔｏ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３ Ｊｕｌ ５；３４１（６１４１）：８８－９１．
Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ ＳＢ，Ｖｏｌｋｍｅｒ ＪＰ，Ｇｅｎｔｌｅｓ ＡＪ，Ｓａｈｏｏ Ｄ，Ｄａｌｅｒｂａ Ｐ，Ｍｉｔｒａ ＳＳ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＣＤ４７－ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｌｐｈａ（ＳＩＲＰα） ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１２ Ａｐｒ ２４；１０９（１７）：６６６２－７．
Ｚｈａｏ ＸＷ，Ｖａｎ Ｂｅｅｋ ＥＭ，Ｓｃｈｏｒｎａｇｅｌａ Ｋ，Ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａａｄｅｎｂ Ｈ，Ｈｏｕｄｔａ ＭＶ；ＣＤ４７－ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ－α（ＳＩＲＰα） ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒｍ ａ ｂａｒｒｉｅｒ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１１ Ｎｏｖ ８；１０８（４５）：１８３４２－７．
Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ：ＡＡＢＢ．
【0116】
概要
ＢｉｏＲａｄ抗体スクリーニングセルＩ及びＩＩを使用する抗ヒトグロブリン（ＡＨＧ）フェーズでのカラム凝集試験（ＣＡＴ）において、血清中の薬物Ａの存在は、試験への干渉を示し、偽陽性の結果を引き起こした。組換えＣＤ４７モノマー（因子Ｂ）または高親和性ＳＩＲＰαモノマー（因子Ｃ）を使用して、この干渉を解決した。さらに、臨床的に関連する同種抗体である抗Ｅは、因子Ｂまたは因子Ｃのいずれかによる干渉の解決後、検出されたままであった。相関フローサイトメトリー分析によって、薬物Ａが濃度依存的にＲＢＣに結合することが示唆された。因子Ｂと因子Ｃの両方が、ＡＬＸ干渉の中和と一致して、薬物ＡのＲＢＣへの結合を減少させた。
ＢｉｏＲａｄ抗体スクリーニングセルＩ及びＩＩを使用する抗ヒトグロブリン（ＡＨＧ）フェーズでのカラム凝集試験（ＣＡＴ）において、血清中の薬物Ａの存在は、試験への干渉を示し、偽陽性の結果を引き起こした。組換えＣＤ４７モノマー（因子Ｂ）または高親和性ＳＩＲＰαモノマー（因子Ｃ）を使用して、この干渉を解決した。さらに、臨床的に関連する同種抗体である抗Ｅは、因子Ｂまたは因子Ｃのいずれかによる干渉の解決後、検出されたままであった。相関フローサイトメトリー分析によって、薬物Ａが濃度依存的にＲＢＣに結合することが示唆された。因子Ｂと因子Ｃの両方が、ＡＬＸ干渉の中和と一致して、薬物ＡのＲＢＣへの結合を減少させた。
【0117】
実施例４．抗ＳＩＲＰα抗体（またはその抗原結合フラグメント）を使用する慣用的な血清学的試験において、（ｉ）抗体Ｆｃ領域及び（ｉｉ）ヒトＣＤ４に結合する部分を含む薬物による干渉を軽減する。
【0118】
以下に記載される実験は、より高い濃度で薬物Ａによって誘導される干渉が、抗ＳＩＲＰα抗体（またはそのＦａｂフラグメント）の添加によって中和され得るか否かを評価するために実施した。相関フローサイトメトリー分析を実施して、ＲＢＣの表面上のＣＤ４７に結合した薬物Ａが抗ＳＩＲＰα抗体（またはそのＦａｂフラグメント）の添加によって置換され得るか否かを評価した。
【0119】
血球凝集アッセイは以下のように実施した：３～３．４％修飾アルサーバー溶液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）中のプールされたヒト赤血球を、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）において１ウェルあたり４０μｌで添加した。ウェルを、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）または薬物Ａのいずれかと２５０ｎｇ／ｍＬで、３７℃で１時間インキュベートし、その後、各洗浄後に完全にデカントしながらＰＢＳで３回洗浄した。抗体Ａ及びＣのＦａｂフラグメント、すなわち、ＳＩＲＰαとＣＤ４７との間の相互作用をブロックする例示的な抗ＳＩＲＰα抗体を、１００μｇ／ｍＬまたは６２５μｇ／ｍＬで開始して、１：２で滴定し、薬物Ａでコーティングした赤血球と３７℃で１時間インキュベートした後に、ＰＢＳで３回洗浄し、残りの液体を完全にデカントする。次に、２滴の抗ヒトグロブリン抗ＩｇＧ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を、各ウェルに添加し、８００Ｇで３０秒間回転させた後、ペレットとｊｐｅｇ画像キャプチャーを静かに取り除いた。抗体Ａは、配列番号６を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号７を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。抗体Ｃは、配列番号２１を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号２２を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。抗体Ｂ、すなわち、ＳＩＲＰαとＣＤ４７との間の相互作用をブロックしない例示的な抗ＳＩＲＰα抗体を用いて並行実験を行った。抗体Ｂは、配列番号２３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号２４を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。抗体Ａ、Ｂ、及びＣのそれぞれは、ＳＩＲＰβ及びＳＩＲＰγと交差反応する。ＰＢＳまたは薬物Ａのみとインキュベートした赤血球は、それぞれアッセイの陰性対照及び陽性対照として機能した。
【0120】
図５Ａに示すように、ＳＩＲＰαとＣＤ４７との間の相互作用をブロックする抗体Ｃは、薬物Ａの量に対して２００倍及び４００倍モル過剰で、薬物Ａでコーティングされた赤血球に添加されたとき、血球凝集を防止した。ＳＩＲＰαとＣＤ４７との間の相互作用もブロックする抗体Ａは、薬物Ａの量に対して２５００倍モル過剰で、薬物Ａでコーティングされた赤血球に添加されたとき、血球凝集を防止した。ＳＩＲＰαとＣＤ４７との間の相互作用をブロックしない抗ＳＩＲＰα抗体である抗体Ｂの添加は、薬物Ａの量に対して４００倍モル過剰で、薬物Ａでコーティングされた赤血球に添加されたとき、血球凝集を防止した。図５Ａに示す結果、抗体Ａ、抗体Ｂ、及び抗体ＣのＦａｂがそれぞれ、赤血球の表面のＣＤ４７であるＣＤ４７赤血球から薬物Ａを置換することによって、血球凝集を防止したことが示された。
【0121】
抗体Ａ及び抗体ＣのＦａｂが赤血球の表面上のＣＤ４７に結合した薬物Ａを置換し得ることを確認するために、フローサイトメトリー実験を以下のように実施した：薬物Ａを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７タンパク質標識キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、製造業者の指示に従って用いて、蛍光標識した。ＤＬＤ－１ヒト結腸上皮細胞を、染色緩衝液（ＰＢＳ、２％ＦＢＳ）で１回洗浄し、固定可能な生／死染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＰＢＳで、４℃で１時間染色した。次いで、細胞を、染色緩衝液で洗浄し、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）中で、１００ｎｇ／ｍＬの標識薬物Ａと、５０μｇ／ｍＬから開始する１：２滴定の未標識抗体ＡＦａｂまたは未標識抗体ＣＦａｂのいずれかと共インキュベートした。４℃で１時間インキュベートした後、細胞を染色緩衝液で２回洗浄し、０．５％パラホルムアルデヒドで固定した。細胞は、Ａｔｔｕｎｅ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分析し、その後Ｆｌｏｗｊｏ１０．６を使用してデータ分析を行った。ＤＬＤ－１細胞の表面のＣＤ４７への薬物Ａの結合は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７の蛍光強度の中央値によって示された。図５Ｂに示すように、抗体Ａ及び抗体Ｃを薬物Ａ結合細胞に添加すると、ＤＬＤ－１細胞の表面のＣＤ４７に対する薬物Ａの結合が減少した。これらの結果は、抗体Ａ及び抗体ＣがＤＬＤ－１細胞の表面上のＣＤ４７に結合した薬物Ａを置換し得ることを示した。
【0122】
この実施例の結果を総合すると、抗体Ａ、Ｂ及びＣは、血球の表面上のＣＤ４７に結合した薬物Ａを置換することによって、慣用的な血清学的アッセイにおける干渉を防ぎ得ることが示される。これらの結果はまた、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰβ、及びＳＩＲＰγと交差反応する抗体が、血球表面のＣＤ４７に結合した薬物Ａを置換することにより、慣用的な血清学的アッセイでの干渉を防ぎ得ることも示している。
【0123】
本明細書に記載の各実施形態は、反対に明確に示されない限り、任意の他の実施形態（複数可）と組み合わせてもよい。特に、好ましいかまたは有利であると示される任意の特徴または実施形態は、反対に明確に示されない限り、好ましいかまたは有利であると示される任意の他の特徴（複数可）または実施形態（複数可）と組み合わされてもよい。
【0124】
本出願で引用された全ての参考文献は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【配列表】