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特許7562066変形性関節症の予防又は治療剤、及び変形性関節症の予防又は治療用医薬組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-27
(45)【発行日】2024-10-07
(54)【発明の名称】変形性関節症の予防又は治療剤、及び変形性関節症の予防又は治療用医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 35/35 20150101AFI20240930BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240930BHJP
【ＦＩ】
A61K35/35
A61P19/02
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2019206493
(22)【出願日】2019-11-14
(65)【公開番号】P2021080184
(43)【公開日】2021-05-27
【審査請求日】2022-11-09
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１９年３月２５日に日本大学リポジトリのウェブサイト＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ．ｎｉｈｏｎ－ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｘｍｌｕｉ／ｈａｎｄｌｅ／１１２６３／１５３０＞に公表
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】524178090
【氏名又は名称】松本 太郎
(74)【代理人】
【識別番号】100161207
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 和純
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100126882
【弁理士】
【氏名又は名称】五十嵐 光永
(72)【発明者】
【氏名】松本 太郎
(72)【発明者】
【氏名】遠藤 則行
(72)【発明者】
【氏名】風間 智彦
【審査官】柴原 直司
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／０６７１７５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】日大医誌，2015年，74, [5]，p.246-252
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３５／００－３５／７６８
Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８
Ａ６１Ｐ １９／０２
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
脱分化脂肪細胞を有効成分として含有する、変形性関節症の予防又は治療剤。
【請求項2】
前記脱分化脂肪細胞は、膝蓋下脂肪体由来である、請求項１に記載の変形性関節症の予防又は治療剤。
【請求項3】
前記脱分化脂肪細胞が変形性関節症患者又は患畜由来の自家細胞である、請求項１又は２に記載の変形性関節症の予防又は治療剤。
【請求項4】
変形性関節症が変形性膝関節症である、請求項１～３のいずれか一項に記載の変形性関節症の予防又は治療剤。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載の変形性関節症の予防又は治療剤、及び薬学的に許容可能な担体を含む、変形性関節症の予防又は治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、変形性関節症の予防又は治療剤、及び変形性関節症の予防又は治療用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
変形性関節症（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ；ＯＡ）は、軟骨が変性及び摩耗する病気である。ＯＡの中でも変形性膝関節症（以下、「膝ＯＡ」と略記する場合がある）は、膝関節の軟骨の摩耗及び消失を特徴とし、主に加齢に伴って発症する疾患であり、日本には２４００万人の患者がいると推定されている。軟骨変性が重度な症例では手術（人工膝関節置換術等）が行われるが、発症初期から中期では、消炎鎮痛剤やヒアルロン酸注射等の対症療法が主となっている。近年、発症初期から中期の膝ＯＡに対して、患者の血液から調製される多血小板血漿（ＰＲＰ）や脂肪組織等から調製される間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を関節内注射する治療法（例えば、非特許文献１参照）が保険外診療として行われており、一定の有効性が示されている。
【0003】
一方、発明者らは、これまで、脂肪細胞から脱分化脂肪細胞（ＤＦＡＴ）を簡便且つ大量に作製する方法を開発している（例えば、特許文献１参照）。得られたＤＦＡＴが歯周組織の再生（例えば、特許文献２参照）や、真皮の再建（例えば、特許文献３参照）に有用であることが確かめられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特許第５０５５６１３号公報
【文献】国際公開第２０１４／１９６５０３号
【文献】特開２０１６－０８７１８７号公報
【非特許文献】
【0005】
【文献】Lopa S et al., “Injective mesenchymal stem cell-based treatments for knee osteoarthritis: from mechanisms of action to current clinical evidences.”, Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy, Vol. 27, Issue 6, p2003-2020, 2018.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
上述したとおり、膝ＯＡの治療法は対症療法が主となっている。ＰＲＰを用いた治療法では、異なった採取方法による調製キットが多数存在し、成分も雑多であり、治療効果も安定していない。ＭＳＣを用いる治療法では、採取時の侵襲が大きく、増殖速度が遅く、さらに採取後の細胞には、間葉系幹細胞以外の細胞も多く混在している。そのため、短期間で純度の高い細胞を大量に調製することが困難である。
さらに、膝ＯＡのような慢性疾患では、長期に亘り継続的な治療により効果を維持することが求められる。しかしながら、ＰＲＰやＭＳＣは１回の採取で、通常１回の治療しかできない。そのため、長期に亘り継続的な治療により効果を維持できる新規の治療方法が求められている。
さらに、膝ＯＡのような慢性疾患では、長期に亘り継続的な治療により効果を維持することが求められる。しかしながら、ＰＲＰやＭＳＣは１回の採取で、通常１回の治療しかできない。そのため、長期に亘り継続的な治療により効果を維持できる新規の治療方法が求められている。
【0007】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、新規の変形性関節症の予防又は治療剤、及び変形性関節症の予防又は治療用医薬組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＤＦＡＴ細胞を膝ＯＡモデルラットに投与することで、優れた治療効果を発揮することを見出し、本発明を完成するに至った。
【0009】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る変形性関節症の予防又は治療剤は、脱分化脂肪細胞又はその培養上清を有効成分として含有する。
前記脱分化脂肪細胞が変形性関節症患者又は患畜由来の自家細胞であってもよい。
変形性関節症が変形性膝関節症であってもよい。
本発明の第１態様に係る変形性関節症の予防又は治療剤は、脱分化脂肪細胞又はその培養上清を有効成分として含有する。
前記脱分化脂肪細胞が変形性関節症患者又は患畜由来の自家細胞であってもよい。
変形性関節症が変形性膝関節症であってもよい。
【0010】
本発明の第２態様に係る変形性関節症の予防又は治療用医薬組成物は、上記第１態様に係る変形性関節症の予防又は治療剤、及び薬学的に許容可能な担体を含む。
【発明の効果】
【0011】
上記態様の変形性関節症の予防又は治療剤、及び変形性関節症の予防又は治療用医薬組成物によれば、ＯＡの進行を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】実施例１における膝ＯＡモデルラットの調製方法を示す画像である。
【図2】実施例１における膝ＯＡモデルラットへのラットＤＦＡＴ細胞の投与スケジュールを示す概略図である。
【図3】実施例１における膝ＯＡモデルラットへのラットＤＦＡＴ細胞の関節内投与する様子を示す画像である。
【図4】実施例１におけるＤＦＡＴ細胞（ＤＦＡＴ群）又はＰＢＳ（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）を投与した膝ＯＡモデルラットの大腿骨顆部及び脛骨近位部でのＩｎｄｉａ Ｉｎｋ染色像である。
【図5】実施例１におけるＤＦＡＴ群又はＣｏｎｔｒｏｌ群の大腿骨遠位関節面のサフラニンＯ染色像である。下の画像は上の画像の実線で囲った部分の拡大像である。上の画像のスケールバーは１,０００μｍである。下の画像のスケールバーは２００μｍである。
【図6A】実施例１におけるＤＦＡＴ群又はＣｏｎｔｒｏｌ群の大腿骨顆部の軟骨変性の組織学的スコア（Ｍａｎｋｉｎ’ｓ ｓｃｏｒｅ）を示すグラフである。
【図6B】実施例１におけるＤＦＡＴ群又はＣｏｎｔｒｏｌ群の大腿骨顆部の軟骨変性の組織学的スコア（ＯＡＲＳＩ ｓｃｏｒｅ）を示すグラフである。
【図7】実施例１におけるＤＦＡＴ群又はＣｏｎｔｒｏｌ群の脛骨近位関節面のサフラニンＯ染色像である。下の画像は上の画像の実線で囲った部分の拡大像である。上の画像のスケールバーは１,０００μｍである。下の画像のスケールバーは２００μｍである。
【図8A】実施例１におけるＤＦＡＴ群又はＣｏｎｔｒｏｌ群の脛骨近位部の軟骨変性の組織学的スコア（Ｍａｎｋｉｎ’ｓ ｓｃｏｒｅ）を示すグラフである。
【図8B】実施例１におけるＤＦＡＴ群又はＣｏｎｔｒｏｌ群の脛骨近位部の軟骨変性の組織学的スコア（ＯＡＲＳＩ ｓｃｏｒｅ）を示すグラフである。
【図9】実施例２における滑膜線維芽細胞とＤＦＡＴ細胞との間接的な共培養によるＡＤＡＭＴＳ４の発現の評価方法を示す概略図である。
【図10】実施例２におけるＤＦＡＴ細胞と共培養した滑膜線維芽細胞のＡＤＡＭＴＳ４の発現量を示すグラフである。
【図11】実施例２における炎症性サイトカイン（ＴＮＦ－α又はＩＮＦ－γ）存在下又は非存在下で培養したＤＦＡＴ細胞でのＰＴＧＳ２の発現量を示すグラフである。
【図12】実施例２における炎症性サイトカイン（ＴＮＦ－α又はＩＮＦ－γ）存在下又は非存在下で培養したＤＦＡＴ細胞でのＴＮＦＡＩＰ６の発現量を示すグラフである。
【図13】実施例２における炎症性サイトカイン（ＴＮＦ－α又はＩＮＦ－γ）存在下又は非存在下で培養したＤＦＡＴ細胞でのＰＲＧ４の発現量を示すグラフである。
【図14】実施例２における炎症性サイトカイン（ＴＮＦ－α又はＩＮＦ－γ）存在下又は非存在下で培養したＤＦＡＴ細胞でのＢＭＰ２の発現量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0013】
≪変形性関節症≫
一般に、ＯＡ（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ；変形性関節症）は、全身のあらゆる関節に起こり得る疾患である。ＯＡを引き起こす関節として具体的には、膝関節、股関節、脊椎等が挙げられ、それぞれ、変形性膝関節症（膝ＯＡ）、変形性股関節症、変形性脊椎症と呼ばれる。中でも、本実施形態のＯＡの予防又は治療剤は、変形性膝関節症（膝ＯＡ）に対して特に好適に用いられる。
一般に、ＯＡ（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ；変形性関節症）は、全身のあらゆる関節に起こり得る疾患である。ＯＡを引き起こす関節として具体的には、膝関節、股関節、脊椎等が挙げられ、それぞれ、変形性膝関節症（膝ＯＡ）、変形性股関節症、変形性脊椎症と呼ばれる。中でも、本実施形態のＯＡの予防又は治療剤は、変形性膝関節症（膝ＯＡ）に対して特に好適に用いられる。
【0014】
≪変形性関節症の予防又は治療剤≫
本実施形態の変形性関節症（ＯＡ）の予防又は治療剤は、ＤＦＡＴ細胞又はその培養上清を有効成分として含有する。
なお、ここでいう「ＤＦＡＴ細胞を有効成分として含有する」とは、ＤＦＡＴ細胞又はその培養上清をＯＡの予防又は治療効果を奏する成分として含有することを意味する。
本実施形態の変形性関節症（ＯＡ）の予防又は治療剤は、ＤＦＡＴ細胞又はその培養上清を有効成分として含有する。
なお、ここでいう「ＤＦＡＴ細胞を有効成分として含有する」とは、ＤＦＡＴ細胞又はその培養上清をＯＡの予防又は治療効果を奏する成分として含有することを意味する。
【0015】
現在、ＯＡの治療への臨床応用が検討されているＭＳＣは、ＥＳ細胞と比べて、腫瘍形成能が低いと考えられており、骨髄、羊水、臍帯血及び脂肪組織等から採取することができる。しかしながら、骨髄からのＭＳＣの採取は侵襲性が高く、ＭＳＣは骨髄中の全有核細胞数に対して０．００１％以上０．０１％以下程度の極微量しか含まれず、加齢とともに増殖力が低下するため、採取対象となるドナーの年齢に増殖力は依存する。羊水からのＭＳＣの採取は、侵襲性は低いが、ＭＳＣは羊水中の全有核細胞数に対して１％以上２%以下程度の微量しか含まれず、増殖が遅い。脂肪組織からのＭＳＣの採取は、侵襲性は低いが、ＭＳＣは間質血管分画中の全有核細胞数に対して０．３％以上４％以下程度の微量しか含まれないため、細胞治療に必要な１０８個程度の細胞数を得るためには、通常５０ｍＬ以上３００ｍＬ以下の脂肪組織の採取が必要となる。また、脂肪組織のＭＳＣは、骨髄及び羊水中のＭＳＣに対して増殖力は高いが、加齢とともに増殖力が低下するため、採取対象となるドナーの年齢に増殖力は依存する。さらに、細胞組織からＭＳＣを採取する際に、ＭＳＣ以外の細胞を多く含むため、継代培養を複数回繰り返して純化する必要があり、純化に時間を要する。
これに対して、ＤＦＡＴ細胞は、脂肪組織の約３０％を占める成熟脂肪細胞を原料としているため、１０ｍＬ程度の少量の脂肪組織から細胞数１０８個程度の細胞治療に十分なＤＦＡＴ細胞が得られる。従って、採取に伴う侵襲性は、脂肪組織からＭＳＣを採取するより低い。また、脂肪組織から成熟脂肪細胞を単離する際に、その他の細胞が混入しにくいため、培養早期より純度の高いＤＦＡＴ細胞が得られる。さらに、ＤＦＡＴ細胞の増殖力はＭＳＣと同等であるが、その増殖力や多分化能はＭＳＣと異なり採取対象となるドナーの年齢や基礎疾患の影響を受けずに保たれる。
また、後述する実施例に記載のとおり、ＤＦＡＴ細胞を膝ＯＡモデルラットに関節内投与することで、軟骨変性抑制効果が示されており、ＤＦＡＴ細胞の投与はＯＡの治療効果を期待できる。
これに対して、ＤＦＡＴ細胞は、脂肪組織の約３０％を占める成熟脂肪細胞を原料としているため、１０ｍＬ程度の少量の脂肪組織から細胞数１０８個程度の細胞治療に十分なＤＦＡＴ細胞が得られる。従って、採取に伴う侵襲性は、脂肪組織からＭＳＣを採取するより低い。また、脂肪組織から成熟脂肪細胞を単離する際に、その他の細胞が混入しにくいため、培養早期より純度の高いＤＦＡＴ細胞が得られる。さらに、ＤＦＡＴ細胞の増殖力はＭＳＣと同等であるが、その増殖力や多分化能はＭＳＣと異なり採取対象となるドナーの年齢や基礎疾患の影響を受けずに保たれる。
また、後述する実施例に記載のとおり、ＤＦＡＴ細胞を膝ＯＡモデルラットに関節内投与することで、軟骨変性抑制効果が示されており、ＤＦＡＴ細胞の投与はＯＡの治療効果を期待できる。
【0016】
ＤＦＡＴ細胞は、ＯＡ患者又は患畜由来の自家細胞であってもよく、当該患者又は患畜以外のドナー由来の他家細胞であってもよい。当該患者又は患畜以外のドナーとしては、ＯＡ患者又は患畜と同種の動物であればよく、年齢及び性別は問わない。
ＯＡの治療にＯＡ患者又は患畜由来の自家細胞を用いる場合、ＤＦＡＴ細胞は、上述のとおり増殖力が高いことから、少量の成熟脂肪細胞から大量に自家細胞のＤＦＡＴ細胞を調製することができ、１回の組織採取から複数回（例えば、５回程度）の治療に必要な細胞数を得ることができる。また、自家細胞であるため、免疫拒絶を受けるリスクがない。
また、当該患者又は患畜以外のドナー由来の他家細胞である場合、免疫拒絶により速やかに排除される可能性があるが、他家細胞であるＤＦＡＴ細胞が炎症部において抗炎症作用を発現することができるため、十分に治療効果が期待できる。また、他家細胞である場合、外科手術時に廃棄される脂肪組織から採取された成熟脂肪細胞を用いて調製することができ、侵襲度が低い。さらに、これら廃棄される脂肪組織から採取された成熟脂肪細胞を用いて調製されたＤＦＡＴ細胞からなるバンキングシステムを容易に構築することができ、このバンキングシステムを利用することで、患者又は患畜に適したＤＦＡＴ細胞を適宜選択して用いることもできる。
ＯＡの治療にＯＡ患者又は患畜由来の自家細胞を用いる場合、ＤＦＡＴ細胞は、上述のとおり増殖力が高いことから、少量の成熟脂肪細胞から大量に自家細胞のＤＦＡＴ細胞を調製することができ、１回の組織採取から複数回（例えば、５回程度）の治療に必要な細胞数を得ることができる。また、自家細胞であるため、免疫拒絶を受けるリスクがない。
また、当該患者又は患畜以外のドナー由来の他家細胞である場合、免疫拒絶により速やかに排除される可能性があるが、他家細胞であるＤＦＡＴ細胞が炎症部において抗炎症作用を発現することができるため、十分に治療効果が期待できる。また、他家細胞である場合、外科手術時に廃棄される脂肪組織から採取された成熟脂肪細胞を用いて調製することができ、侵襲度が低い。さらに、これら廃棄される脂肪組織から採取された成熟脂肪細胞を用いて調製されたＤＦＡＴ細胞からなるバンキングシステムを容易に構築することができ、このバンキングシステムを利用することで、患者又は患畜に適したＤＦＡＴ細胞を適宜選択して用いることもできる。
【0017】
ＤＦＡＴ細胞は、公知の方法、例えば、特開２０００－８３６５６号公報（参考文献１）に記載の方法を用いて、動物の脂肪組織から採取された成熟脂肪細胞から調製することができる。具体的には、まず、脂肪組織からコラゲナーゼ処理等により成熟脂肪細胞を単離する。次いで、単離された成熟脂肪細胞を天井培養法によって培養することでＤＦＡＴ細胞が得られる。調製されたＤＦＡＴ細胞は、継代培養を少なくとも１回した後、すぐに使用することができる。
【0018】
ＤＦＡＴ細胞は、ＣＤ３１陰性、ＣＤ４５陰性及びＨＬＡ－ＤＲ陰性である。ＣＤ３１、ＣＤ４５及びＨＬＡ－ＤＲは、細胞表面抗原であり、例えばフローサイトメトリー、細胞染色等により検出することができる。そのため、これら細胞表面抗原を検出することで、ＤＦＡＴ細胞の純度を確認することができる。具体的には、例えば、蛍光標識抗体を用いるフローサイトメトリーでは、ネガティブコントロール（アイソタイプコントロール）と比較してより強い蛍光を発する細胞が検出された場合、当該細胞は当該細胞表面抗原について「陽性」と判定される。蛍光標識抗体は、当該技術分野において公知の任意の抗体を使用することができ、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等により標識された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。細胞染色において、着色する又は蛍光を発する細胞が顕微鏡下にて観察された場合、当該細胞は当該細胞表面抗原について「陽性」と判定される。細胞染色は、抗体を使用する免疫細胞染色であってもよく、抗体を使用しない非免疫細胞染色であってもよい。
上記細胞表面抗原を検出するタイミングとしては、特別な限定はなく、例えば、成熟脂肪細胞からＤＦＡＴ細胞が調製された直後、継代培養中、製剤化する前等が挙げられる。
上記細胞表面抗原を検出するタイミングとしては、特別な限定はなく、例えば、成熟脂肪細胞からＤＦＡＴ細胞が調製された直後、継代培養中、製剤化する前等が挙げられる。
【0019】
本実施形態のＯＡの予防又は治療剤は、ＤＦＡＴ細胞の代わりに、ＤＦＡＴ細胞の培養上清を含んでいてもよい。後述する実施例に示すように、軟骨変性抑制効果は、炎症性サイトカイン存在下でＤＦＡＴ細胞から産生される因子によって、引き起こされるものであると考えられる。そのため、例えば、炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ等）存在下で培養したＤＦＡＴ細胞の培養上清を、本実施形態のＯＡの予防又は治療剤の有効成分として使用することができる。医療製剤として用いる観点から、ＤＦＡＴ細胞の培養上清は、培養液成分を実質的に含まないことが好ましい。
【0020】
≪ＯＡの予防又は治療用医薬組成物≫
本実施形態のＯＡの予防又は治療用医薬組成物（以下、「本実施形態の医薬組成物」と略記する場合がある）は、上記ＯＡの予防又は治療剤、及び薬学的に許容可能な担体を含む。本実施形態の医薬組成物を投与することにより、ＯＡを予防又は治療することができる。
本実施形態のＯＡの予防又は治療用医薬組成物（以下、「本実施形態の医薬組成物」と略記する場合がある）は、上記ＯＡの予防又は治療剤、及び薬学的に許容可能な担体を含む。本実施形態の医薬組成物を投与することにより、ＯＡを予防又は治療することができる。
【0021】
本実施形態の医薬組成物は、公知の方法を用いて適宜製剤とすることができ、一般的な細胞製剤が含む成分を配合することができる。具体的には、本実施形態の医薬組成物の製剤においては、製剤上の必要に応じて、適宜の薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、吸着剤、甘味剤、希釈剤等の任意成分を配合することができる。
投与経路は、皮下投与、経皮投与、筋肉内投与、血管内投与、関節内投与等の非経口投与経路が好ましく、関節内投与が特に好ましい。
投与経路は、皮下投与、経皮投与、筋肉内投与、血管内投与、関節内投与等の非経口投与経路が好ましく、関節内投与が特に好ましい。
【0022】
本実施形態の医薬組成物の投与量としては、ＯＡの重症度や、剤型、投与対象の体重等によって変わり得るが、ＤＦＡＴ細胞を、例えば、１回当たり、１．０×１０4個／ｋｇ体重以上１．０×１０9個／ｋｇ体重以下の範囲で投与することができる。また、本実施形態の医薬組成物の投与は、単回投与でもよく、複数回投与であってもよい。複数回投与である場合は、例えば、２時間以上１２時間以下の期間毎、毎日、又は２日、１週間、数週間、１か月若しくは数か月に１回等の頻度で投与することができる。
【0023】
本実施形態の医薬組成物の投与対象としては、哺乳動物であることが好ましい。哺乳動物としては、特別な限定はないが、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ等が挙げられる。中でも、哺乳動物としては、ヒトが好ましい。
【0024】
また、一実施形態において、本発明は、ＯＡの予防又は治療用医薬組成物の製造のための、ＤＦＡＴ細胞又はその培養上清の使用を提供することができる。
また、一実施形態において、本発明は、ＯＡの予防又は治療のための、ＤＦＡＴ細胞又はその培養上清の使用を提供することができる。
また、一実施形態において、本発明は、ＯＡ患者又は患畜に投与して、軟骨変性の抑制のために使用される、ＤＦＡＴ細胞又はその培養上清を提供することができる。
また、一実施形態において、本発明は、ＤＦＡＴ細胞又はその培養上清の治療有効量をＯＡ患者又は患畜に投与する、ＯＡの治療方法を提供することができる。
また、一実施形態において、本発明は、ＯＡの予防又は治療のための、ＤＦＡＴ細胞又はその培養上清の使用を提供することができる。
また、一実施形態において、本発明は、ＯＡ患者又は患畜に投与して、軟骨変性の抑制のために使用される、ＤＦＡＴ細胞又はその培養上清を提供することができる。
また、一実施形態において、本発明は、ＤＦＡＴ細胞又はその培養上清の治療有効量をＯＡ患者又は患畜に投与する、ＯＡの治療方法を提供することができる。
【実施例】
【0025】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0026】
［実施例１］
１．ラットＤＦＡＴ細胞の調製
ラットＤＦＡＴ細胞は、特開２０００－８３６５６号公報（参考文献１）に記載の方法を用いて、ラット脂肪組織から採取された成熟脂肪細胞から、予め調製した。
１．ラットＤＦＡＴ細胞の調製
ラットＤＦＡＴ細胞は、特開２０００－８３６５６号公報（参考文献１）に記載の方法を用いて、ラット脂肪組織から採取された成熟脂肪細胞から、予め調製した。
【0027】
２．膝ＯＡモデルラットの作製及びＤＦＡＴ細胞の投与
膝ＯＡモデルラットは、１０～１２週齢のＷｉｓｔａｒラット（雄性）に前十字靭帯（ＡＣＬ）切離及び内側半月板（ＭＭ）切除（以下、「ＡＣＬＴ＋ＭＭｘ処置」と略記する場合がある。）により作製した（図１参照）。ＡＣＬＴ＋ＭＭｘ処置1週間後に、ラットＤＦＡＴ細胞（ＤＦＡＴ投与群）又はＰＢＳ（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）を１週間毎に４回関節内投与した（各群ｎ＝１０、図２及び３参照）。処置５週間後に、両群の膝関節軟骨の変性を肉眼的及び組織学的に評価した。
膝ＯＡモデルラットは、１０～１２週齢のＷｉｓｔａｒラット（雄性）に前十字靭帯（ＡＣＬ）切離及び内側半月板（ＭＭ）切除（以下、「ＡＣＬＴ＋ＭＭｘ処置」と略記する場合がある。）により作製した（図１参照）。ＡＣＬＴ＋ＭＭｘ処置1週間後に、ラットＤＦＡＴ細胞（ＤＦＡＴ投与群）又はＰＢＳ（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）を１週間毎に４回関節内投与した（各群ｎ＝１０、図２及び３参照）。処置５週間後に、両群の膝関節軟骨の変性を肉眼的及び組織学的に評価した。
【0028】
３．肉眼的評価
肉眼的評価では、両群の膝関節をＩｎｄｉａ Ｉｎｋ染色により評価した。結果を図４に示す。図４において、破線部分は、軟骨変性範囲を示す。
図４に示すように、ＤＦＡＴ群のほうがＣｏｎｔｒｏｌ群に比べて、大腿骨顆部及び脛骨近位部の関節軟骨の変性範囲が少ない傾向にあった。
肉眼的評価では、両群の膝関節をＩｎｄｉａ Ｉｎｋ染色により評価した。結果を図４に示す。図４において、破線部分は、軟骨変性範囲を示す。
図４に示すように、ＤＦＡＴ群のほうがＣｏｎｔｒｏｌ群に比べて、大腿骨顆部及び脛骨近位部の関節軟骨の変性範囲が少ない傾向にあった。
【0029】
４．組織学的評価
組織学的評価では、両群の膝関節に対してサフラニンＯ染色を行い、Ｍａｎｋｉｎ’ｓ ｓｃｏｒｅ及びＯＡＲＳＩ ｓｃｏｒｅを用いて定量評価を行なった。Ｍａｎｋｉｎ’ｓ ｓｃｏｒｅにおける評価基準を表１に、ＯＡＲＳＩ ｓｃｏｒｅにおける評価基準を表２に示す。なお、ＯＡＲＳＩ ｓｃｏｒｅは「Ｓｃｏｒｅ＝Ｇｒａｄｅ×Ｓｔａｇｅ」で示され、Ｇｒａｄｅ及びＳｔａｇｅの各評価基準を表３に示す。両群の大腿骨遠位関節面の染色像を図５に、両群の大腿骨遠位関節面の組織学的スコアを図６Ａ及び図６Ｂに示す。また、両群の脛骨近位関節面の染色像を図７に、両群の脛骨近位関節面の組織学的スコアを図８Ａ及び図８Ｂに示す。
組織学的評価では、両群の膝関節に対してサフラニンＯ染色を行い、Ｍａｎｋｉｎ’ｓ ｓｃｏｒｅ及びＯＡＲＳＩ ｓｃｏｒｅを用いて定量評価を行なった。Ｍａｎｋｉｎ’ｓ ｓｃｏｒｅにおける評価基準を表１に、ＯＡＲＳＩ ｓｃｏｒｅにおける評価基準を表２に示す。なお、ＯＡＲＳＩ ｓｃｏｒｅは「Ｓｃｏｒｅ＝Ｇｒａｄｅ×Ｓｔａｇｅ」で示され、Ｇｒａｄｅ及びＳｔａｇｅの各評価基準を表３に示す。両群の大腿骨遠位関節面の染色像を図５に、両群の大腿骨遠位関節面の組織学的スコアを図６Ａ及び図６Ｂに示す。また、両群の脛骨近位関節面の染色像を図７に、両群の脛骨近位関節面の組織学的スコアを図８Ａ及び図８Ｂに示す。
【0030】
【表1】
【0031】
【表2】
【0032】
【表3】
【0033】
図５～図６Ｂに示すように、大腿骨遠位関節面の組織学検討から、Ｃｏｎｔｒｏｌ群では、硝子軟骨変性による菲薄化と軟骨表面の不整及び裂隙が認められた。一方、ＤＦＡＴ群では、関節軟骨の変性の程度が軽い傾向にあった。軟骨変性の組織学的スコアであるＭａｎｋｉｎ’ｓ ｓｃｏｒｅ及びＯＡＲＳＩ ｓｃｏｒｅは、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べてＤＦＡＴ群で有意に低値を示した。
【0034】
図７～図８Ｂに示すように、脛骨近位関節面の組織学検討から、Ｃｏｎｔｒｏｌ群では、硝子軟骨変性による菲薄化と軟骨細胞の減少が認められた。一方、ＤＦＡＴ群では、関節硝子軟骨変性による菲薄化と軟骨細胞の減少が抑制されていた。軟骨変性の組織学的スコアであるＭａｎｋｉｎ’ｓ ｓｃｏｒｅ及びＯＡＲＳＩ ｓｃｏｒｅは、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べてＤＦＡＴ群で有意に低値を示した。
【0035】
［実施例２］
１．ＤＦＡＴ細胞の調製
ヒト膝ＯＡ患者（ｎ＝３）の皮下脂肪組織と膝蓋下脂肪体から単離した成熟脂肪細胞から、上記参考文献１に記載の方法を用いて、ヒトＤＦＡＴ細胞を予め調製した。
１．ＤＦＡＴ細胞の調製
ヒト膝ＯＡ患者（ｎ＝３）の皮下脂肪組織と膝蓋下脂肪体から単離した成熟脂肪細胞から、上記参考文献１に記載の方法を用いて、ヒトＤＦＡＴ細胞を予め調製した。
【0036】
２．滑膜線維芽細胞との共培養
滑膜線維芽細胞（ＳＦ）をＴＮＦαで刺激するとアグリカン分解酵素であるＡＤＡＭＴＳ４の遺伝子発現が亢進することが知られている。健常者由来滑膜線維芽細胞（Ｎ－ＳＦ）１×１０６ｃｅｌｌｓ、又は膝ＯＡ患者由来滑膜線維芽細胞（ＯＡ－ＳＦ）１×１０６ｃｅｌｌｓを、１×１０６ｃｅｌｌｓとＴＮＦ－α存在下（終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）又は非存在下で１２時間間接的に共培養した（図９参照）。その後、各条件下で培養した滑膜線維芽細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＡＤＡＭＴＳ４の発現をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法にて定量評価した。結果を図１０に示す。
滑膜線維芽細胞（ＳＦ）をＴＮＦαで刺激するとアグリカン分解酵素であるＡＤＡＭＴＳ４の遺伝子発現が亢進することが知られている。健常者由来滑膜線維芽細胞（Ｎ－ＳＦ）１×１０６ｃｅｌｌｓ、又は膝ＯＡ患者由来滑膜線維芽細胞（ＯＡ－ＳＦ）１×１０６ｃｅｌｌｓを、１×１０６ｃｅｌｌｓとＴＮＦ－α存在下（終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）又は非存在下で１２時間間接的に共培養した（図９参照）。その後、各条件下で培養した滑膜線維芽細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＡＤＡＭＴＳ４の発現をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法にて定量評価した。結果を図１０に示す。
【0037】
図１０に示すように、滑膜線維芽細胞によるＡＤＡＭＴＳ４の発現は、ＦＰ－ＤＦＡＴ、又はＳＣ－ＤＦＡＴと共培養することにより、有意に抑制された。この作用は、健常者由来滑膜線維芽細胞（Ｎ－ＳＦ）でも、膝ＯＡ患者由来滑膜線維芽細胞（ＯＡ－ＳＦ）でも認められた。
【0038】
３．抗炎症及び免疫制御に関与する遺伝子群の発現
「１．」で調製された膝蓋下脂肪体由来ＤＦＡＴ（ＦＰ－ＤＦＡＴ）、及び皮下脂肪組織由来ＤＦＡＴ（ＳＣ－ＤＦＡＴ）をＴＮＦ－α又はＩＦＮ－γで刺激し、抗炎症及び免疫制御に関与する遺伝子群（ＰＴＧＳ２、ＴＮＦＡＩＰ６、ＰＲＧ４、及びＢＭＰ２）の発現をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法にて定量評価した。ＰＴＧＳ２の発現量の結果を図１１に、ＴＮＦＡＩＰ６の発現量の結果を図１２に、ＰＲＧ４の発現量の結果を図１３に、及びＢＭＰ２の発現量の結果を図１４に示す。
「１．」で調製された膝蓋下脂肪体由来ＤＦＡＴ（ＦＰ－ＤＦＡＴ）、及び皮下脂肪組織由来ＤＦＡＴ（ＳＣ－ＤＦＡＴ）をＴＮＦ－α又はＩＦＮ－γで刺激し、抗炎症及び免疫制御に関与する遺伝子群（ＰＴＧＳ２、ＴＮＦＡＩＰ６、ＰＲＧ４、及びＢＭＰ２）の発現をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法にて定量評価した。ＰＴＧＳ２の発現量の結果を図１１に、ＴＮＦＡＩＰ６の発現量の結果を図１２に、ＰＲＧ４の発現量の結果を図１３に、及びＢＭＰ２の発現量の結果を図１４に示す。
【0039】
【0040】
図１３及び図１４に示すように、ＦＰ－ＤＦＡＴは、軟骨形成促進因子であるＰＲＧ４を定常状態で発現し、この発現は炎症性サイトカイン（ＴＮＦ－αやＩＦＮ－γ）で刺激することで抑制された。また、ＤＦＡＴ細胞は、ＴＮＦ－αで刺激することで、軟骨形成促進因子であるＢＭＰ２を発現した。ＰＲＧ４及びＢＭＰ２の発現は、ＳＣ－ＤＦＡＴに比べて、ＦＰ－ＤＦＡＴで高い傾向にあった。
【0041】
以上のことから、膝ＯＡに対するＤＦＡＴ細胞の軟骨変性抑制効果が明らかになった。また、ＤＦＡＴ細胞の軟骨変性抑制メカニズムは、炎症下におけるＤＦＡＴ細胞による抗炎症因子の誘導によるものであることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【0042】
本実施形態の変形性関節症の予防又は治療剤、及び変形性関節症の予防又は治療用医薬組成物によれば、ＯＡの進行を抑制することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】