特許 7562523 エクソソームの測定方法およびエクソソームの測定キット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-09-27

(45)【発行日】2024-10-07

(54)【発明の名称】エクソソームの測定方法およびエクソソームの測定キット

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20240930BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20240930BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20240930BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 D

G01N33/543 575

G01N33/543 595

G01N21/64 F

【請求項の数】 19

(21)【出願番号】P 2021527640

(86)(22)【出願日】2020-06-23

(86)【国際出願番号】 JP2020024585

(87)【国際公開番号】W WO2020262374

(87)【国際公開日】2020-12-30

【審査請求日】2023-04-13

(31)【優先権主張番号】P 2019119824

(32)【優先日】2019-06-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000206956

【氏名又は名称】大塚製薬株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100111039

【弁理士】

【氏名又は名称】前堀 義之

(74)【代理人】

【識別番号】100184343

【弁理士】

【氏名又は名称】川崎 茂雄

(72)【発明者】

【氏名】青木 洋一

(72)【発明者】

【氏名】彼谷 高敏

【審査官】中村 直子

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１６／０３３４３９８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開２０１６－１２５９３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１９－０５０７３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１４－５２２９９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】ZHU, Ling et al.，Label-Free Quantitative Detection of Tumor-Derived Exosomes through Surface Plasmon Resonance Imagin，Analytical Chemistry，2014年，86(17)，8857-8864

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８

Ｇ０１Ｎ ２１／６４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

金属膜と、前記金属膜に固定化された、エクソソームに結合する第１の結合物質とを含む測定チップを準備する工程と、
前記金属膜上にエクソソームを含む検体を提供して、前記検体に含まれる前記エクソソームを前記第１の結合物質に結合させる工程と、
前記第１の結合物質に結合する前または結合した後の前記エクソソームを、前記エクソソームに結合する第２の結合物質を介して蛍光物質で標識する工程と、
前記蛍光物質で標識された前記エクソソームが前記第１の結合物質に結合している状態で、前記金属膜で表面プラズモン共鳴が生じるように前記金属膜に励起光を照射し、前記蛍光物質から放出される蛍光を検出する工程と、
を含み、
前記励起光の照射エネルギーは、７．５μＷ／ｍｍ ^２ 以上３０ｍＷ／ｍｍ ^２ 以下である、
エクソソームの測定方法。

【請求項2】

前記第１の結合物質は前記エクソソームが有する第１の結合決定基に結合するものであり、前記第２の結合物質は前記エクソソームが有する第２の結合決定基に結合するものであり、前記第１の結合決定基と前記第２の結合決定基とは異なる、請求項１に記載のエクソソームの測定方法。

【請求項3】

前記第１の結合決定基および前記第２の結合決定基の少なくとも一方が、前記エクソソームのマーカーとして知られる結合決定基である、請求項２に記載のエクソソームの測定方法。

【請求項4】

前記第１の結合決定基および前記第２の結合決定基の少なくとも一方が、前記エクソソームを分泌する細胞のマーカーとして知られる結合決定基である、請求項２または３に記載のエクソソームの測定方法。

【請求項5】

前記標識する工程において、前記第２の結合物質に対して結合する第３の結合物質を用いて前記エクソソームを蛍光物質で標識する、請求項１～４のいずれか一項に記載のエクソソームの測定方法。

【請求項6】

前記励起光の照射エネルギーは、７．５μＷ／ｍｍ^２以上１０ｍＷ／ｍｍ^２以下である、請求項１～５のいずれか一項に記載のエクソソームの測定方法。

【請求項7】

前記金属膜上にエクソソームを含む検体を提供する前に、前記検体に界面活性剤を添加する、請求項１～６のいずれか一項に記載のエクソソームの測定方法。

【請求項8】

前記界面活性剤が、Ｔｗｅｅｎ２０、デオキシコール酸ナトリウム、およびＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項７に記載のエクソソームの測定方法。

【請求項9】

前記検体が、血清、血漿、全血またはこれらの希釈物である、請求項１～８のいずれか一項に記載のエクソソームの測定方法。

【請求項10】

前記検体が、エクソソーム抽出物である、請求項１～８のいずれか一項に記載のエクソソームの測定方法。

【請求項11】

前記金属膜は、プリズムの上に配置されており、
前記励起光は、プリズムを介して前記金属膜に照射される、
請求項１～１０のいずれか一項に記載のエクソソームの測定方法。

【請求項12】

前記金属膜は、回折格子を含み、
前記第１の結合物質は、前記回折格子の上に固定化されており、
前記励起光は、前記回折格子に照射される、
請求項１～１０のいずれか一項に記載のエクソソームの測定方法。

【請求項13】

金属膜と、前記金属膜に固定化された、エクソソームに結合する第１の結合物質とを含む測定チップと、
エクソソームを蛍光物質で標識するための標識試薬と、
を含み、
前記標識試薬が、前記エクソソームに結合する第２の結合物質を含み、
前記蛍光物質で標識された前記エクソソームが前記第１の結合物質に結合している状態で、前記金属膜で表面プラズモン共鳴が生じるように前記金属膜に励起光を照射し、前記蛍光物質から放出される蛍光を検出する工程において、
前記励起光の照射エネルギーは、７．５μＷ／ｍｍ ^２ 以上３０ｍＷ／ｍｍ ^２ 以下である、
エクソソームの測定キット。

【請求項14】

前記第１の結合物質は前記エクソソームが有する第１の結合決定基に結合するものであり、前記第２の結合物質は前記エクソソームが有する第２の結合決定基に結合するものであり、前記第１の結合決定基と前記第２の結合決定基とは異なる、請求項１３に記載のエクソソームの測定キット。

【請求項15】

前記第１の結合決定基および前記第２の結合決定基の少なくとも一方が、前記エクソソームのマーカーとして知られる結合決定基である、請求項１４に記載のエクソソームの測定キット。

【請求項16】

前記第１の結合決定基および前記第２の結合決定基の少なくとも一方が、前記エクソソームを分泌する細胞のマーカーとして知られる結合決定基である、請求項１４または１５に記載のエクソソームの測定キット。

【請求項17】

前記標識試薬が、前記第２の結合物質に対して結合する第３の結合物質をさらに含む、請求項１３～１６のいずれか一項に記載のエクソソームの測定キット。

【請求項18】

検体に添加するための界面活性剤をさらに含む、請求項１３～１７のいずれか一項に記載のエクソソームの測定キット。

【請求項19】

前記界面活性剤が、Ｔｗｅｅｎ２０、デオキシコール酸ナトリウム、およびＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１８に記載のエクソソームの測定キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、エクソソームの測定方法およびエクソソームの測定キットに関する。

【背景技術】

【0002】

エクソソームは、細胞により産生されて細胞外に放出される、直径４０ｎｍ～１５０ｎｍ程度の膜小胞である。エクソソームは、リン脂質二重膜で覆われており、膜タンパク質やマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）といった多様な細胞成分を含む。細胞の種類や状態によって異なるエクソソームが細胞から放出されることから、エクソソームは細胞間や臓器間のコミュニケーションを仲介すると考えられている。

【0003】

近年、癌や感染症といった様々な疾患の診断マーカーとして、血液や唾液といった体液中に分泌されたエクソソームが着目されている。例えば、特許文献１には、腫瘍マーカーとなるエクソソームを検出するための分析方法、分析試薬および分析装置が開示されている。この方法では、エクソソームが有する抗原に対する抗体と、エクソソームを分泌する細胞が有する抗原に対する抗体とを使用し、アビジン－ビオチン相互作用に基づき、エクソソームを検出している。また、特許文献２には、凹凸構造を有する合性樹脂などからなるベース部の凹部にエクソソームに対する抗体を固定し、凹部にエクソソームを捕捉する、エクソソーム分析用デバイスおよびエクソソームの捕捉方法が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】国際公開第２０１３／０９４３０７号

【文献】特開２０１４－２１９３８４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

上記のとおり、これまでに様々なエクソソームの分析方法が開発されてきたが、より高感度かつより高い再現性でエクソソームを測定できる方法が求められている。

【0006】

本発明は、従来の測定方法よりも高感度かつ簡便に検体中のエクソソームの濃度を測定できる、エクソソームの測定方法およびエクソソームの測定キットを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の一実施形態に係るエクソソームの測定方法は、金属膜と、前記金属膜に固定化された、エクソソームに結合する第１の結合物質とを含む測定チップを準備する工程と、前記金属膜上にエクソソームを含む検体を提供して、前記検体に含まれる前記エクソソームを前記第１の結合物質に結合させる工程と、前記第１の結合物質に結合する前または結合した後の前記エクソソームを、前記エクソソームに結合する第２の結合物質を介して蛍光物質で標識する工程と、前記蛍光物質で標識された前記エクソソームが前記第１の結合物質に結合している状態で、前記金属膜で表面プラズモン共鳴が生じるように前記金属膜に励起光を照射し、前記蛍光物質から放出される蛍光を検出する工程と、を含む。

【0008】

本発明の一実施形態に係るエクソソームの測定キットは、金属膜と、前記金属膜に固定化された、エクソソームに結合する第１の結合物質とを含む測定チップと、エクソソームを蛍光物質で標識するための標識試薬と、を含み、前記標識試薬が、前記エクソソームに結合する第２の結合物質を含む。

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、従来の測定方法よりも高感度かつ簡便に検体中のエクソソームの濃度を測定することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1A】図１Ａは、本実施の形態に係るエクソソームの測定方法の一例を示すフローチャートである。

【図1B】図１Ｂは、本実施の形態に係るエクソソームの測定方法の他の一例を示すフローチャートである。

【図2】図２Ａは、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップの構成を説明するための断面模式図であり、図２Ｂは、ＧＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップの構成を説明するための断面模式図である。

【図3A】図３Ａは、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップの一例を示す断面模式図である。

【図3B】図３Ｂは、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップの他の一例を示す斜視模式図である。

【図3C】図３Ｃは、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップの他の一例を示す断面模式図である。

【図4】図４は、エクソソームの個数と濃度との関係を示す検量線である。

【図5】図５は、ＣＤ９陽性ＣＤ６３陽性エクソソーム検量線である。

【図6】図６は、ＣＤ９陽性ＣＤ６３陽性エクソソームに関する、照射エネルギー、シグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）および検出限界の関係を示すグラフである。

【図7】図７は、ＣＤ９陽性ＰＳＭＡ陽性エクソソームの検量線である。

【図8】図８は、ＣＤ９陽性ＰＳＭＡ陽性エクソソームに関する、照射エネルギー、シグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）および検出限界の関係を示すグラフである。

【図9】図９は、ＬＮＣａｐ細胞由来のＣＤ９陽性ＣＤ６３陽性エクソソームの検量線である。

【図10】図１０は、ＬＮＣａｐ細胞由来のＣＤ９陽性ＣＤ６３陽性エクソソームに関する、照射エネルギー、シグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）および検出限界の関係を示すグラフである。

【図11】図１１は、エクソソーム上の糖鎖を認識するレクチンを用いた、ＬＮＣａｐ細胞由来のＣＤ９陽性糖鎖保有エクソソームの検量線である。

【図12】図１２は、エクソソーム上の糖鎖を認識するレクチンを用いた、前立腺癌細胞に由来するＣＤ９陽性糖鎖保有エクソソームの検量線である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。

【0012】

［エクソソームの測定方法］
エクソソームは、正常な細胞によっても、癌細胞などの疾患関連細胞によっても分泌されるものである。よって、エクソソームを疾患のマーカーとして利用するためには、検体（例えば血液）中に存在する大量の正常細胞由来のエクソソームと、より少量の疾患関連細胞由来のエクソソームとを区別して検出することが可能な方法が必要となる。一般的に血清中に存在するエクソソームの濃度は１．０×１０^１１個／ｍｌ（１．０×１０^８個／μｌ）程度といわれており、その中から疾患（例えば癌）に関連するエクソソームを検出するには、１．０×１０^６個／ｍｌ（１．０×１０^３個／μｌ）以下のエクソソームを検出可能な方法が必要である。

【0013】

本実施の形態に係るエクソソームの測定方法では、測定感度を向上させるために、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy、以下「ＳＰＦＳ」ともいう）を利用してエクソソームを測定する。ＳＰＦＳは、表面プラズモン共鳴（以下「ＳＰＲ」ともいう）により増強された電場により蛍光物質を励起して蛍光を放出させるため、一般的な蛍光免疫測定法よりもターゲット（本実施の形態ではエクソソーム）を高感度に検出することができる。

【0014】

また、ＳＰＦＳは、検体として全血も使用することができるため、血液中のエクソソームを精製することなく、少ない手順で簡便に疾患関連エクソソームを検出することができる。

【0015】

本発明者らは上記の考えのもとに、鋭意検討を重ねた結果、ＳＰＦＳで高感度にエクソソームを測定できることを見出し、本実施の形態に係るエクソソームの測定方法を完成させた。

【0016】

以下、本実施の形態に係るエクソソームの測定方法について、具体的に説明する。図１Ａは、本実施の形態に係るエクソソームの測定方法の一例である、１次反応および２次反応を用いる測定方法を示すフローチャートであり、図１Ｂは、本実施の形態に係るエクソソームの測定方法の一例である、１次反応、２次反応および３次反応を用いる測定方法を示すフローチャートである。

【0017】

（測定チップの準備）
まず、金属膜と、エクソソームに結合する第１の結合物質とを含む測定チップを準備する（工程Ｓ１０）。ＳＰＦＳでは、金属膜に光（本実施の形態では励起光）を照射したときに生じるエバネッセント波と表面プラズモンとを結合させてＳＰＲを生じさせる。ＳＰＲを生じさせる手法としては、金属膜の一方の面上にプリズムを配置する手法（Kretschmann配置）や、金属膜に回折格子を形成する手法などが知られている。前者の手法を採用したＳＰＦＳは、プリズムカップリング（ＰＣ）－ＳＰＦＳと称され、後者の手法を採用したＳＰＦＳは、格子カップリング（ＧＣ）－ＳＰＦＳと称される。本実施の形態に係るエクソソームの測定方法は、ＰＣ－ＳＰＦＳおよびＧＣ－ＳＰＦＳのどちらを採用してもよい。

【0018】

上述のとおり、金属膜は、励起光を照射されたときにＳＰＲを生じさせる。金属膜を構成する金属の種類は、ＳＰＲを生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜を構成する金属の例には、金、銀、銅、アルミニウムおよびこれらの合金が含まれる。

【0019】

第１の結合物質は、エクソソームに結合することができ、検体中のエクソソームを捕捉するために金属膜上に固定化されている。通常、第１の結合物質は、金属膜上の所定の領域（反応場）に均一に固定化されている。金属膜に固定化される第１の結合物質の種類は、エクソソームに結合することができるもの、即ち、エクソソームが有する第１の結合決定基に結合するものであれば特に限定されない。結合物質の例には、エクソソームに結合できる抗体、エクソソームに結合できる核酸、エクソソームに結合できる脂質、およびエクソソームに結合できる抗体以外のタンパク質、例えば、エクソソーム上の糖鎖に結合できるレクチン、が含まれる。ここで、エクソソームが有する結合決定基とは、結合物質がエクソソームに結合する際に認識するエクソソームの一部分である。例えば、結合物質が抗体の場合、結合決定基は抗原の抗原決定基（エピトープ）であり、結合物質がリガンドの場合、結合決定基は対応する受容体の結合部位である。

【0020】

第１の結合物質が結合する、エクソソームが有する第１の結合決定基に特に限定はないが、エクソソームのマーカーとして知られる結合決定基や、エクソソームを分泌する細胞のマーカーとして知られる結合決定基が含まれる。エクソソームのマーカーとして知られる結合決定基としては、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ８２、ＣＤ１３、ＣＤ１１、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ－１、Ｒａｂ５、アネキシン Ｖ（Annexin V）、ＬＡＭＰ１等が挙げられる。これら結合決定基に対する抗体は市販されており、当該抗体を第１の結合物質として使用することができる。エクソソームのマーカーとして知られる結合決定基に結合する第１の結合物質に上記の物質と反応する物質（例えば抗体）を使用する場合、エクソソームにのみ結合するため、検体中のエクソソームを検出するのに有効である。

【0021】

エクソソームを分泌する細胞のマーカーとして知られる結合決定基としては、カベオリン－１（Caveolin-1）、ＰＳＭＡ、ＥｐＣＡＭ、グリピカン－１（Grypican-1）、サバイビン（Survivin）、ＣＤ９１、Ｔｓｐａｎ８、ＣＤ１４７、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＣＤ４４、ガラクチン（Galactin）、インテグリン（Integrin）等が挙げられる。これら結合決定基に対する抗体も市販されており、当該抗体を第１の結合物質として使用することができる。第1の結合物質としてエクソソームを分泌する細胞マーカーとして知られる結合決定基に結合する結合物質（例えば抗体）を使用する場合は、特定の細胞およびそこから分泌されたエクソソームにのみ結合するため、検体中の特定の細胞由来のエクソソームを検出するのに有効である。

【0022】

第１の結合物質が抗体である場合、当該抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよいし、抗体の断片であってもよい。また、金属膜に固定化される第１の結合物質の種類は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。たとえば、金属膜に固定化される第１の結合物質が抗体の場合、当該抗体は、１種類または２種類以上のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。

【0023】

なお、第１の結合物質は、蛍光標識と関連して説明する第２の結合物質との組み合わせを考慮して選択することが好ましい。第１の結合物質と第２の結合物質との好ましい組み合わせについては後述する。

【0024】

結合物質の固定化方法は、特に限定されない。たとえば、金属膜上に、結合物質（例えば抗体）を結合させた自己組織化単分子膜（以下「ＳＡＭ」という）または高分子膜を形成すればよい。ＳＡＭの例には、ＨＯＯＣ－（ＣＨ_２）_１１－ＳＨなどの置換脂肪族チオールで形成された膜が含まれる。高分子膜を構成する材料の例には、ポリエチレングリコールおよびＭＰＣポリマーが含まれる。また、結合物質（例えば抗エクソソーム抗体）に結合可能な反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を有する高分子を金属膜に固定化し、この高分子に結合物質（例えば抗体）を結合させてもよい。

【0025】

測定チップは、好ましくは各片の長さが数ｍｍ～数ｃｍの構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。

【0026】

図２Ａは、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップの構成を説明するための断面模式図であり、図２Ｂは、ＧＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップの構成を説明するための断面模式図である。説明の便宜上、これらの図において、各構成要素の大きさおよび形状は、正確ではない。また、これらの図では、第１の結合物質としてエクソソーム上の抗原を認識する抗エクソソーム抗体を使用する例を示している。

【0027】

図２Ａに示されるように、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップ１００は、プリズム１１０、金属膜１２０およびエクソソーム上の抗原を認識する抗エクソソーム抗体（第１の結合物質）１３０（の層）を有する。プリズム１１０は、励起光Ｌ１に対して透明な誘電体からなり、励起光Ｌ１が入射する入射面１１１と、励起光Ｌ１が反射する成膜面１１２と、反射光Ｌ２が出射する出射面１１３とを有する。プリズム１１０の形状は、特に限定されない。図２Ａに示される例では、プリズム１１０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面１１２であり、一方の脚に対応する面が入射面１１１であり、他方の脚に対応する面が出射面１１３である。プリズム１１０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム１１０の材料は、好ましくは、励起光に対する屈折率が１．４～１．６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。金属膜１２０は、プリズム１１０の成膜面１１２上に配置されている。金属膜１２０の形成方法は、特に限定されない。金属膜１２０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、めっきが含まれる。金属膜１２０の厚みは、特に限定されないが、３０～７０ｎｍの範囲内であることが好ましい。

【0028】

図２Ａに示されるように、金属膜１２０においてＳＰＲが生じるようにプリズム１１０を介して金属膜１２０に励起光Ｌ１を照射すると、ＳＰＲにより増強された電場が金属膜１２０近傍に生じる。このとき、金属膜１２０上のエクソソーム上の抗原を認識する抗エクソソーム抗体（第１の結合物質）１３０に蛍光物質１５０で標識された第２の結合物質１３１と反応したエクソソーム１４０が結合していると、蛍光物質１５０が増強電場により励起され、蛍光Ｌ３を放出する。

【0029】

図２Ｂに示されるように、ＧＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップ２００は、回折格子２１１を形成された金属膜２１０およびエクソソーム上の抗原を認識する抗エクソソーム抗体（第１の結合物質）１３０（の層）を有する。金属膜２１０の形成方法は、特に限定されない。金属膜２１０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、めっきが含まれる。金属膜２１０の厚みは、特に限定されないが、３０～５００ｎｍの範囲内であることが好ましい。回折格子２１１の形状は、エバネッセント波を生じさせることができれば特に限定されない。たとえば、回折格子２１１は、１次元回折格子であってもよいし、２次元回折格子であってもよい。たとえば、１次元回折格子では、金属膜２１０の表面に、互いに平行な複数の凸部が所定の間隔で形成されている。２次元回折格子では、金属膜２１０の表面に、所定形状の凸部が周期的に配置されている。凸部の配列の例には、正方格子、三角（六方）格子などが含まれる。回折格子２１１の断面形状の例には、矩形波形状、正弦波形状、鋸歯形状などが含まれる。回折格子２１１の形成方法は、特に限定されない。たとえば、平板状の基板（不図示）の上に金属膜２１０を形成した後、金属膜２１０に凹凸形状を付与してもよい。また、予め凹凸形状を付与された基板（不図示）の上に、金属膜２１０を形成してもよい。いずれの方法であっても、回折格子２１１を含む金属膜２１０を形成することができる。

【0030】

図２Ｂに示されるように、金属膜２１０（回折格子２１１）においてＳＰＲが生じるように金属膜２１０（回折格子２１１）に励起光Ｌ１を照射すると、ＳＰＲにより増強された電場が金属膜２１０（回折格子２１１）近傍に生じる。このとき、金属膜２１０（回折格子２１１）上のエクソソーム上の抗原を認識する抗エクソソーム抗体（第１の結合物質）１３０に蛍光物質１５０で標識された第２の結合物質１３１と反応したエクソソーム１４０が結合していると、蛍光物質１５０が増強電場により励起され、蛍光Ｌ３を放出する。

【0031】

図３Ａ～３Ｃは、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップの一例を示す断面模式図である。図３Ａに示されるように、測定チップ３００は、入射面１１１、成膜面１１２および出射面１１３を有するプリズム１１０と、プリズム１１０の成膜面１１２に形成された金属膜１２０と、プリズム１１０の成膜面１１２または金属膜１２０上に配置された流路蓋３１０とを有する。図３において、入射面１１１および出射面１１３は、紙面の手前および奥にそれぞれ存在している。測定チップ３００は、さらに、流路３２０と、流路３２０の一端に接続された液体注入部３３０と、流路３２０の他端に接続された貯留部３４０も有する。本実施の形態では、流路蓋３１０は、両面テープなどの接着層３５０を介して金属膜１２０（またはプリズム１１０）に接着されており、接着層３５０は流路３２０の側面形状を規定する役割も担っている。図３では省略しているが、流路３２０内に露出している金属膜１２０の一部の領域（反応場）には、エクソソーム上の抗原を認識する抗エクソソーム抗体（第１の結合物質）１３０が固定化されている。液体注入部３３０は、液体注入部被覆フィルム３３１により塞がれ、貯留部３４０は、貯留部被覆フィルム３４１により塞がれている。貯留部被覆フィルム３４１には、通気孔３４２が設けられている。

【0032】

流路蓋３１０は、蛍光Ｌ３に対して透明な材料で形成されている。ただし、蛍光Ｌ３の取り出しの妨げにならない限り、流路蓋３１０の一部は蛍光Ｌ３に対して不透明な材料で形成されていてもよい。蛍光Ｌ３に対して透明な材料の例には、樹脂が含まれる。流路蓋３１０は、接着層３５０を用いずに、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより、金属膜１２０（またはプリズム１１０）に接合されていてもよい。この場合は、流路３２０の側面形状は、流路蓋３１０により規定される。

【0033】

液体注入部３３０には、ピペットチップが挿入される。このとき、液体注入部３３０の開口部（液体注入部被覆フィルム３３１に設けられた貫通孔）はピペットチップの外周に隙間なく接触する。このため、ピペットチップから液体注入部３３０内に液体を注入することで流路３２０内に液体を導入することができ、液体注入部３３０内の液体をピペットチップに吸引することで流路３２０内の液体を除去することができる。また、液体の注入および吸引を交互に行うことで、流路３２０内において液体を往復送液することもできる。

【0034】

液体注入部３３０から流路３２０内に流路３２０の容積を超える量の液体が導入された場合、貯留部３４０には流路３２０から液体が流入する。また、流路３２０内において液体を往復送液するときにも、貯留部３４０には液体が流入する。貯留部３４０に流入した液体は、貯留部３４０内で攪拌される。貯留部３４０内で液体が攪拌されると、流路３２０を通過する液体（検体や洗浄液など）の成分（例えばエクソソームや洗浄成分など）の濃度が均一になり、流路３２０内で各種反応が生じやすくなったり、洗浄効果が高まったりする。

【0035】

図３Ｂおよび図３Ｃは、それぞれ、ウェル形状の測定チップの一例を示す模式図である。図３Ｂは、反応検出部が底面にあるウェル形状の測定チップ４００の模式図である（例えば、国際公開第２０１２／１５７４０３号を参照）。このチップにおいては、誘電体部材４１２が断面略台形形状の六面体（截頭四角錐形状）であり、ウェル部材４１８が誘電体部材４１２の形状に合わせて方形に構成されている。そしてセンサ構造体２２の金属薄膜４１４上のリガンド固定領域４１６に検出対象となるエクソソームと結合する第１の結合物質を固定した状態で、エクソソームを含んだ試料溶液を貫通穴４２０内に供給し、センサ構造体４２２を撹拌する。

【0036】

また、図３Ｃは、反応検出部が側壁面にあるウェルである（例えば、国際公開第２０１８／０２１２３８号を参照）。検出チップ５００は、ウェル本体５１０および側壁部材５２０を有する。ウェル本体５１０は、その内部に収容部（ウェル）５１１を有している。収容部５１１は、液体を収容できるように構成された有底の凹部であり、上部に設けられた第１開口５１２および側部に設けられた第２開口５１３により外部に開放されている。側壁部材５２０は、光学素子としてのプリズム５２１、金属膜５２５および反応場５２６を有している。プリズム５２１は、励起光に対して透明な誘電体からなる光学素子であり、入射面（図示せず）、反射面５２３および出射面（図示せず）を有する。プリズム５２１は、収容部５１１を構成する側壁としても機能する。金属膜５２５上には捕捉領域があり、捕捉領域は、検体中のエクソソームを捕捉するための第１の結合物質が固定化される領域である。

【0037】

検体の種類は、エクソソームを含むものである限り、特に限定されない。検体の例には、血液（血清、血漿、全血）、尿、汗、唾液、母乳、精液、リンパ液、脳脊髄液、涙液等の体液、ならびにこれら体液を生理食塩水や緩衝液などで希釈した希釈液が含まれる。本実施の形態に係るエクソソームの検出方法では、ＳＰＦＳを利用してエクソソームを検出するため、検体として全血も使用することができる。よって、入手の容易性等の観点から、血清、血漿、全血またはこれらの希釈液が、検体として好ましい。これらの検体にはエクソソーム以外にマイクロベシクルや夾雑物等も含まれている場合もある。本発明においては、遠心処理やフィルタリングによる除去などをせずに検体をそのまま測定に使用することが可能であるが、遠心処理やフィルタリングを行い、マイクロベシクルや夾雑物を除去または沈降させてから精製した液を測定に使用しても問題はない。また、イクロベシクルや夾雑物等の除去の方法についてはこれらに限定されない。

【0038】

また、検体は、体液から調製したエクソソーム抽出物であってもよい。体液からエクソソームを抽出して検体とすることで、体液そのものでは検出の難しかった極微量のエクソソームも検出して定量することが可能となる。エクソソームの抽出方法に特に限定はなく、従来から知られているエクソソームの抽出方法を採用することができる。例えば、超遠心分離法、免疫沈降法やポリマー沈殿法で、体液からエクソソームを抽出することができる。

【0039】

検体には、界面活性剤をさらに添加してもよい。界面活性剤を添加することでエクソソームの凝集を防止し、バックグラウンドノイズや測定値のバラツキを低減することが可能となる。界面活性剤は、生物・医学の分野で広く使用されている界面活性剤が好ましく、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、デオキシコール酸ナトリウム、およびＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００が含まれる。界面活性剤は、エクソソームを破壊することはないが、その凝集を防止する程度の濃度で使用すればよい。例えば、Ｔｗｅｅｎ２０の場合、０．００１％～５％以下、好ましくは０．００５％～１％以下、より好ましくは０．０１０％～０．０５％以下の濃度で使用することができる。また、デオキシコール酸ナトリウムの場合、０．００１％～０．０２５％以下、好ましくは０．００２％～０．０２０％以下、より好ましくは０．００３％～０．０１０％以下の濃度で使用することができる。また、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００の場合、０．００１％～０．０１０％以下、好ましくは０．００２％～０．００７％以下、より好ましくは０．００３％～０．００５％以下の濃度で使用することができる。

【0040】

（１次反応）
次に、測定チップの金属膜上に検体を提供して、金属膜に固定化された第１の結合物質に、検体に含まれるエクソソームを結合させる（１次反応；工程Ｓ２０）。検体を提供する方法は、特に限定されない。たとえば、ピペットチップを先端に装着したピペットを用いて金属膜上に検体を提供すればよい。１次反応の反応時間に特に限定はないが、エクソソームと第１の結合物質との反応効率を上げるという観点からは、反応時間は長い方が好ましく、通常、５分以上１８０分以下、好ましくは６０分以上１５０分以下、より好ましくは１００分以上１２０以下である。通常は、１次反応を終えた後、金属膜の表面を緩衝液などで洗浄して、第１の結合物質に結合していない成分を除去する（洗浄；工程Ｓ２１）。
又、洗浄後には、光学ブランクを測定することができる（光学ブランクを測定；工程Ｓ２）。

【0041】

（２次反応）
次に、測定チップの金属膜上に標識試薬を提供して、結合物質に結合したエクソソームを、エクソソームに結合する第２の結合物質を介して蛍光物質で標識する。標識試薬の種類は、第１の結合物質に結合したエクソソームに蛍光物質で標識された第２の結合物質が反応できれば特に限定されない。たとえば、標識試薬は、蛍光物質で標識された、エクソソームが有する第２の結合決定基に結合する第２の結合物質である（図１Ａの２次反応＋蛍光標識；工程Ｓ３０）。あるいは、標識試薬は、エクソソームが有する第２の結合決定基に結合する第２の結合物質、およびエクソソームに結合した第２の結合物質に結合する、蛍光物質で標識された第３の結合物質の両方を含む［図１Ｂの２次反応；工程Ｓ３０および蛍光標識（３次反応）；工程Ｓ３５］。

【0042】

標識試薬を提供する方法は、特に限定されない。たとえば、ピペットチップを先端に装着したピペットを用いて金属膜上に標識試薬を提供すればよい。通常は、２次反応および／または３次反応を終えた後、金属膜の表面を緩衝液などで洗浄して、エクソソームに結合していない第２の結合物質（または第３の結合物質）を除去する（洗浄；工程Ｓ３１および工程Ｓ３６）。

【0043】

標識試薬に含まれる第２の結合物質の種類は、エクソソームに結合することができれば特に限定されない。第２の結合物質の例には、エクソソームに結合できる抗体、エクソソームに結合できる核酸、エクソソームに結合できる脂質、およびエクソソームに結合できる抗体以外のタンパク質、例えば、エクソソーム上の糖鎖に結合できるレクチン、が含まれる。

【0044】

第２の結合物質が結合する、エクソソームが有する第２の結合決定基に特に限定はないが、エクソソームのマーカーとして知られる結合決定基や、エクソソームを分泌する細胞のマーカーとして知られる結合決定基が含まれる。エクソソームのマーカーとして知られる結合決定基としては、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ８２、ＣＤ１３、ＣＤ１１、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ－１、Ｒａｂ５、アネキシン Ｖ（Annexin V）、ＬＡＭＰ１等が挙げられる。これら結合決定基に対する抗体は市販されており、当該抗体を第２の結合物質として使用することができる。エクソソームのマーカーとして知られる結合決定基に結合する第２の結合物質に上記の物質と反応する物質（例えば抗体）を使用する場合、エクソソームにのみ結合するため、たとえ金属膜上にエクソソーム以外のもの（細胞など）が結合していても、エクソソームのみを検出するのに有効である。

【0045】

エクソソームを分泌する細胞のマーカーとして知られる結合決定基としては、カベオリン－１（Caveolin-1）、ＰＳＭＡ、ＥｐＣＡＭ、グリピカン－１（Grypican-1）、サバイビン（Survivin）、ＣＤ９１、Ｔｓｐａｎ８、ＣＤ１４７、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＣＤ４４、ガラクチン（Galactin）、インテグリン（Integrin）等が挙げられる。これら結合決定基に対する抗体も市販されており、当該抗体を第２の結合物質として使用することができる。第２の結合物質としてエクソソームを分泌する細胞のマーカーとして知られる結合決定基に結合する結合物質（例えば抗体）を使用する場合は、特定の細胞およびそこから分泌されたエクソソームにのみ結合するため、金属膜上に結合した種々のエクソソームの中から特定の細胞由来のエクソソームのみを検出するのに有効である。

【0046】

第２の結合物質が抗体である場合、当該抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよいし、抗体の断片であってもよい。また、標識試薬に含まれる第２の結合物質の種類は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。たとえば、蛍光物質で標識された抗エクソソーム抗体は、１種類または２種類以上の抗エクソソームモノクローナル抗体または抗エクソソームポリクローナル抗体である。この場合、蛍光物質で標識された抗エクソソームモノクローナル抗体および抗エクソソームポリクローナル抗体は、金属膜に固定化されている１種類または２種類以上の抗エクソソームモノクローナル抗体とは異なるものであることが好ましい。

【0047】

標識試薬に含まれる第２の結合物質の種類は、金属膜に固定化される第１の結合物質の種類と同一であってもよいし、異なっていてもよい。例えば、第１の結合物質および第２の結合物質が共に抗体であってもよいし、一方が抗体で、他方が抗体以外のタンパク質でもよい。

【0048】

金属膜に固定化されている第１の結合物質と、標識試薬に含まれる第２の結合物質は、それぞれがエクソソームが有する結合決定基に結合するものであるが、第１の結合物質の結合する第１の結合決定基と、第２の結合物質の結合する第２の結合決定基とは異なることが好ましい。第１の結合物質と第２の結合物質とが同じ結合決定基を奪い合うのではなく、異なる結合決定基に結合することで、エクソソームの金属膜への固定および標識物質による標識をより確実に実施することが可能となる。また、第１の結合物質の結合する第１の結合決定基と、第２の結合物質の結合する第２の結合決定基とが異なることによって、第１の結合物質の結合に基づき検体から検出したエクソソームの中から、第２の結合物質の結合に基づきさらに測定すべきエクソソームを絞り込むことができる。

【0049】

第１の結合物質および第２の結合物質について、第１の結合決定基および第２の結合決定基の少なくとも一方が、エクソソームのマーカーとして知られる結合決定基であることが好ましい。エクソソームのマーカーとして知られる結合決定基に結合する結合物質を使用することによって、検体中の物質からエクソソームのみを検出することができる。また、第１の結合決定基および第２の結合決定基の少なくとも一方が、エクソソームを分泌する細胞のマーカーとして知られる結合決定基であることが好ましい。エクソソームを分泌する細胞のマーカーとして知られる結合決定基に結合する結合物質を使用することによって、特定の細胞由来のエクソソームを検出することができる。本発明においては、第１の結合物質および第２の結合物質の一方をエクソソームのマーカーとして知られる結合決定基に結合するものとし、他方をエクソソームを分泌する細胞のマーカーとして知られる結合決定基に結合するものとすることがより好ましい。このような２種の結合物質を組み合わせて使用することによって、特定の細胞の分泌するエクソソームを特異的に検出することができる。例えば、癌細胞は正常細胞とは異なるエクソソームを分泌することが知られており、体液中の癌細胞由来のエクソソームを検出することで、エクソソームを癌マーカーとして使用することが可能となる。

【0050】

標識試薬に含まれる第３の結合物質は、蛍光物質で標識することができ、且つ第２の結合物質に結合できるものであれば特に限定されない。第３の結合物質の例には、第２の結合物質として使用する抗体、核酸、脂質、抗体以外のタンパク質等に結合できる抗体、核酸、脂質、および抗体以外のタンパク質（例えば、レクチン）が含まれる。たとえば、１つの第２の結合物質に対して複数の第３の結合物質が結合するような第２および第３の結合物質の組み合わせを使用すると、第２の結合物質を直接蛍光標識して用いた場合よりも多くの蛍光物質をエクソソームに結合させて、測定感度を向上させることが可能となる。また、第２の結合物質を蛍光物質で直接標識するのが難しい場合や、蛍光標識によって第２の結合物質のエクソソームに対する結合性が変化、低下または失われる場合等にも、第３の結合物質を用いてエクソソームを標識することができる。

【0051】

第２または第３の結合物質を標識するための蛍光物質の種類は、ＳＰＦＳで使用可能なものであれば特に限定されない。蛍光物質の例には、シアニン系色素、Thermo Scientific社のAlexa Fluor（登録商標）色素、およびBiotium社のＣＦ色素が含まれる。Alexa Fluor色素およびＣＦ色素は、市販されている蛍光色素の中では、ＳＰＦＳで使用する励起光の波長についての量子効率が高い。また、ＣＦ色素は、蛍光検出時における退色があまり生じないため、安定して蛍光検出を行うことができる。結合物質を蛍光物質で標識する方法は、特に限定されず、公知の方法から適宜選択されうる。たとえば、結合物質（例えば抗エクソソーム抗体）のアミノ基またはスルフヒドリル基に蛍光物質を結合させればよい。

【0052】

なお、上記の説明では、金属膜に固定化された第１の結合物質にエクソソームを結合させてからエクソソームを標識試薬を用いて蛍光物質で標識したが、金属膜に固定化された第１の結合物質にエクソソームを結合させる前にエクソソームを標識試薬を用いて蛍光物質で標識してもよい。この場合は、検体を金属膜上に提供する前に、検体と標識試薬（第２の結合物質）とを混合すればよい。また、検体と標識試薬（第２の結合物質）との混合物に、さらに蛍光標識した第３の結合物質を加えることもできる。さらに、金属膜に固定化された結合物質にエクソソームを結合させる工程とエクソソームを蛍光物質で標識する工程を同時に行ってもよい。この場合は、検体と標識試薬（第２の結合物質、または第２および第３の結合物質）を金属膜上に同時に提供すればよい。

【0053】

（蛍光測定）
次に、ＳＰＦＳによりエクソソームの量を示す蛍光を測定する（工程Ｓ４０）。具体的には、蛍光物質で標識されたエクソソームが金属膜に固定化された結合物質に結合している状態で、金属膜でＳＰＲが生じるように金属膜に励起光を照射し、これにより蛍光物質から放出される蛍光を測定する。通常は、測定された蛍光値から、予め測定された光学ブランク値を引いて、エクソソームの量に相関するシグナル値を算出する。必要に応じて、予め作成しておいた検量線などにより、シグナル値をエクソソームの量（個数／ｍｌ）や濃度（μｇ／ｍｌ）などに換算してもよい。

【0054】

例えば、検量線は、市販のエクソソームを用いて希釈率の異なる検体を調製し、各検体中のエクソソームの個数や濃度を求めると共に、本発明の方法でシグナル値を求め、シグナル値をエクソソームの個数や濃度に対してプロットすることで、エクソソームの検量線を得ることができる。また、検体中のエクソソームの個数と濃度とをそれぞれ測定し、エクソソームの濃度に対してエクソソームの個数をプロットした検量線（図４）を得ることもできる。このような検量線を用いることによって、個数として計数したエクソソーム量を濃度（μｇ／ｍｌ）に換算することができる。このような換算を行うことで、エクソソーム量を濃度（μｇ／ｍｌ）として検出する他社装置などとの比較も可能となる。

【0055】

なお、エクソソームの個数を測定する方法に特に限定はないが、例えば、ｑＮａｎｏ／ナノ粒子マルチアナライザー（メイワフォーシス株式会社製）を使用することができる。エクソソームの濃度を測定する方法にも特に限定はないが、例えば、タンパク質定量（ＢＣＡ法、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ社製）によって測定することができる。

【0056】

図２Ａに示されるように、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップ１００を用いる場合は、励起光Ｌ１は、プリズム１１０を介して金属膜１２０に照射される。これにより、金属膜１２０においてＳＰＲが生じ、金属膜１２０近傍に存在する蛍光物質１５０は、増強電場により励起され、蛍光Ｌ３を放出する。金属膜１２０に対する励起光Ｌ１の入射角は、金属膜１２０でＳＰＲが生じるように設定されるが、共鳴角または増強角であることが好ましい。ここで「共鳴角」とは、金属膜１２０に対する励起光Ｌ１の入射角を走査した場合に、反射光Ｌ２の光量が最小となるときの入射角を意味する。また、「増強角」とは、金属膜１２０に対する励起光Ｌ１の入射角を走査した場合に、金属膜１２０の上方（プリズム１１０の反対側）に放出される励起光Ｌ１と同一波長の散乱光（プラズモン散乱光）の光量が最大となるときの入射角を意味する。

【0057】

図２Ｂに示されるように、ＧＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップ２００を用いる場合は、励起光Ｌ１は、金属膜２１０（回折格子２１１）に直接照射される。これにより、金属膜２１０（回折格子２１１）においてＳＰＲが生じ、金属膜２１０（回折格子２１１）近傍に存在する蛍光物質１５０は、増強電場により励起され、蛍光Ｌ３を放出する。金属膜２１０に対する励起光Ｌ１の入射角は、金属膜２１０でＳＰＲが生じるように設定されるが、ＳＰＲにより形成される増強電場の強度が最も強くなる角度が好ましい。励起光Ｌ１の最適な入射角は、回折格子２１１のピッチや励起光Ｌ１の波長、金属膜２１０を構成する金属の種類などに応じて適宜設定される。

【0058】

励起光の種類は、特に限定されないが、通常はレーザー光である。たとえば、励起光は、出力が１０μＷ～３０ｍＷのレーザー光源から出射されたレーザー光である。励起光の照射エネルギーとしては、７．５μＷ／ｍｍ^２以上３０ｍＷ／ｍｍ^２以下であり、８．５μＷ／ｍｍ^２以上１０ｍＷ／ｍｍ^２以下が好ましく、９．５μＷ／ｍｍ^２以上５ｍＷ／ｍｍ^２以下がより好ましい。励起光の照射エネルギーを３０ｍＷ／ｍｍ^２以下とすることで、蛍光強度を高めてシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を大きくし、より少量のエクソソームを検出することが可能となるため、検出限界を向上させることができる。励起光の波長は、使用する蛍光物質の励起波長に応じて適宜設定される。また、光量が３０ｍＷ／ｍｍ^２を超えると、照射熱による抗原抗体反応の解離が進むため、シグナル対ノイズ比が悪くなる。

【0059】

蛍光の検出器は、測定チップに対して蛍光の強度が最も高い方向に設置されることが好ましい。たとえば、図２Ａに示されるように、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップ１００を用いる場合は、蛍光Ｌ３の強度が最も高い方向は金属膜１２０の法線方向であるので、検出器は、測定チップの直上に設置される。一方、図２Ｂに示されるように、ＧＣ－ＳＰＦＳ用の測定チップ２００を用いる場合は、蛍光Ｌ３の強度が最も高い方向は金属膜１２０の法線に対してある程度傾斜した方向であるので、検出器は、測定チップの直上ではない位置に設置される。検出器は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）などである。

【0060】

以上の手順により、検体に含まれるエクソソームの濃度を測定することができる。

【0061】

［エクソソームの測定キット］
本実施の形態に係るエクソソームの測定キットは、上記の測定チップと、上記標識試薬（蛍光物質と、第２の結合物質とを含み、所望により第３の結合物質をさらに含むもの）と、をセットにしたものである。このように上記の測定チップおよび標識試薬を予めセットとしておくことで、ユーザー（医療従事者など）が上記のエクソソームの測定方法をより簡便に行うことが可能となる。また、測定キットは、界面活性剤をさらに含んでもよい。界面活性剤をさらに使用することで、バックグラウンドノイズや測定値のバラツキを低減することが可能となる。

【0062】

［効果］
以上のように、本実施の形態に係るエクソソームの測定方法または測定キットによれば、ＳＰＦＳを利用して検体中のエクソソームを高感度かつ簡便に測定することができる。

【実施例】

【0063】

以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。

【0064】

実験１： ２種のエクソソームに対する抗体を用いた、健常者血液からのエクソソームの測定
図３に示される構成の測定チップ３００を準備した。流路３２０内に露出している金属膜１２０（金薄膜）の特定の領域（反応部）に、第１の結合物質として抗ＣＤ９モノクローナル抗体を固定化した。

【0065】

コスモバイオ社から購入した健常人由来のスタンダードエクソソーム（凍結乾燥品）を水和し、検体サンプルとして使用した。希釈は１０倍希釈系列とし、希釈には１％ＢＳＡを含むＰＢＳを使用した。
なお、装置内での検体希釈液には界面活性剤を含み、界面活性剤の濃度は０．０５％であった。

【0066】

希釈率の異なる検体のそれぞれについて、検体中のエクソソームの個数を測定した。測定にはｑＮａｎｏ／ナノ粒子マルチアナライザー（メイワフォーシス株式会社製）を使用した。

【0067】

さらに上記と同じ検体について、エクソソームの量に相関するシグナル値を測定した。ピペットチップにより、液体注入部３３０から流路３２０内に検体（希釈した血液のいずれか）を導入し、往復送液させた（１次反応）。１次反応の反応時間は１００分とした。液体注入部３３０から流路３２０内の検体を除去した後、流路３２０内を洗浄液で１回洗浄した。次いで、標識試薬（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素で標識された抗ＣＤ６３モノクローナル抗体を液体注入部３３０から流路３２０内に導入し、往復送液させた（２次反応）。２次反応の反応時間は１０分とした。液体注入部３３０から流路３２０内の標識試薬を除去した後、流路３２０内を洗浄液で１回洗浄した。次いで、液体注入部３３０から流路３２０内に測定液を導入した。この状態で、ＳＰＦＳにより蛍光値を測定した。すなわち、金属膜１２０に対する励起光の入射角が増強角となるようにプリズム１１０側から金属膜１２０に励起光（レーザー光）を照射し、そのときに放出される蛍光を検出した。検出に用いた励起光の出力は５ｍＷであり、照射エネルギー量は、３．８ｍＷ／ｍｍ^２となった。得られた蛍光値から予め測定した光学ブランク値を引き、エクソソームの量に相関するシグナル値を算出した。各検体について、同じ測定を６回行った。

【0068】

測定したシグナル値を、検体中のエクソソームの個数（個／μｌ）に対してプロットし、ＣＤ９陽性ＣＤ６３陽性エクソソームの検量線（図５）を得た。

【0069】

図５のプロットから明らかなように、検体中のエクソソームの個数とシグナル値との間には相関関係が存在し、検出限界は２．１×１０^２個／μｌと低かった。

【0070】

次に、検出に用いた励起光の出力を変える以外は上記と同様にして、エクソソームの量に相関するシグナル値を算出した。検出に用いた励起光の出力は５ｍＷ、１５ｍＷまたは３０ｍＷとし、それぞれの照射エネルギー量は、３．８ｍＷ／ｍｍ^２、１１．３ｍＷ／ｍｍ^２または２２．６ｍＷ／ｍｍ^２となった。各照射エネルギー量について、上記と同様にして検体からエクソソームを測定する際の検出限界を求めた。

【0071】

また、上記測定について、シグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を次のようにして算出した。シグナル値（Ｓ）として、エクソソーム存在下における測定シグナルから光学ブランクを引いた値を求め、ノイズ値（Ｎ）として、エクソソーム非存在下における測定シグナルから光学ブランクを引いた値を求めた。次に、Ｓ／Ｎの比を計算した。

【0072】

照射エネルギー量に対して、算出したＳ／Ｎおよび検出限界をそれぞれプロットし、健常者由来のＣＤ９陽性ＣＤ６３陽性エクソソームエクソソームに関する、照射エネルギー、Ｓ／Ｎおよび検出限界の関係を示すグラフ（図６）を得た。

【0073】

図６のプロットにおいては、検体からエクソソームを測定する際に使用する励起光の照射エネルギーが低い場合は、Ｓ／Ｎは大きくなり（即ち、シグナルに対するノイズが減少し）、検出限界も向上した。

【0074】

実験２： エクソソーム分泌細胞に対する抗体およびエクソソームに対する抗体を用いた、前立腺癌に関連するエクソソームの測定

【0075】

図３に示される構成の測定チップ３００を準備した。流路３２０内に露出している金属膜１２０（金薄膜）の特定の領域（反応部）に、第１の結合物質として抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体を固定化した。

【0076】

コスモバイオ社から購入した前立腺がん細胞であるＬＮＣａｐ細胞由来のスタンダードエクソソーム（凍結乾燥品）を水和し、検体サンプルとして使用した。希釈は１０倍希釈系列とし、希釈には１％ＢＳＡを含むＰＢＳを使用した。
なお、装置内での検体希釈液には界面活性剤を含み、界面活性剤の濃度は０．０５％であった。

【0077】

検体中のＬＮＣａｐ細胞由来エクソソームの個数を測定した。測定にはｑＮａｎｏ／ナノ粒子マルチアナライザー（メイワフォーシス株式会社製）を使用した。

【0078】

さらに上記と同じ検体について、ＬＮＣａｐ細胞由来のＣＤ９陽性ＰＳＭＡ陽性エクソソームの検量線を作成するために、希釈率の異なる検体のそれぞれについて、エクソソームの量に相関するシグナル値を測定した。ピペットチップにより、液体注入部３３０から流路３２０内に検体（希釈した培養上清のいずれか）を導入し、往復送液させた（１次反応）。１次反応の反応時間は１００分とした。液体注入部３３０から流路３２０内の検体を除去した後、流路３２０内を洗浄液で１回洗浄した。次いで、標識試薬（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素）で標識された抗ＣＤ９モノクローナル抗体を液体注入部３３０から流路３２０内に導入し、往復送液させた（２次反応）。２次反応の反応時間は１０分とした。液体注入部３３０から流路３２０内の標識試薬を除去した後、流路３２０内を洗浄液で１回洗浄した。次いで、液体注入部３３０から流路３２０内に測定液を導入した。この状態で、ＳＰＦＳにより蛍光値を測定した。すなわち、金属膜１２０に対する励起光の入射角が増強角となるようにプリズム１１０側から金属膜１２０に励起光（レーザー光）を照射し、そのときに放出される蛍光を検出した。検出に用いた励起光の出力は５ｍＷであり、照射エネルギー量は、３．８ｍＷ／ｍｍ^２となった。得られた蛍光値から予め測定した光学ブランク値を引き、エクソソームの量に相関するシグナル値を算出した。各検体について、同じ測定を６回行った。

【0079】

測定したシグナル値を、検体中のエクソソームの個数（個／μｌ）に対してプロットし、ＣＤ９陽性ＰＳＭＡ陽性エクソソームの検量線（図７）を得た。

【0080】

図７のプロットから明らかなように、上記方法によって特定の細胞（前立腺癌細胞）由来のエクソソーム（ＣＤ９陽性ＰＳＭＡ陽性エクソソーム）を検出することができた。また、ＣＤ９陽性ＰＳＭＡ陽性エクソソームの個数とシグナル値との間には相関関係が存在し、検出限界は１．７×１０^２個／／μｌと低かった。

【0081】

次に、検出に用いた励起光の出力を変える以外は上記と同様にして、ＣＤ９陽性ＰＳＭＡ陽性エクソソームの量に相関するシグナル値を算出した。検出に用いた励起光の出力は５ｍＷ、１５ｍＷまたは３０ｍＷとし、それぞれの照射エネルギー量は、３．８ｍＷ／ｍｍ^２、１１．３ｍＷ／ｍｍ^２または２２．６ｍＷ／ｍｍ^２となった。各照射エネルギー量について、上記と同様にして検体からエクソソームを測定する際の検出限界を求めた。

【0082】

また、上記測定について、実験１と同様に、シグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を算出した。

【0083】

照射エネルギー量に対して、算出したＳ／Ｎおよび検出限界をそれぞれプロットし、ＣＤ９陽性ＰＳＭＡ陽性エクソソームに関する、照射エネルギー、Ｓ／Ｎおよび検出限界の関係を示すグラフ（図８）を得た。

【0084】

図８のプロットにおいては、ＣＤ９陽性ＰＳＭＡ陽性エクソソームを測定する際に使用する励起光の照射エネルギーが低い場合は、Ｓ／Ｎは大きくなり（即ち、シグナルに対するノイズが減少し）、検出限界も向上した。

【0085】

実験３： ２種のエクソソームに対する抗体を用いた、前立腺癌細胞に由来するエクソソームの測定

【0086】

図３に示される構成の測定チップ３００を準備した。流路３２０内に露出している金属膜１２０（金薄膜）の特定の領域（反応部）に、第１の結合物質として抗抗ＣＤ９モノクローナル抗体を固定化した。

【0087】

コスモバイオ社から購入した前立腺がん細胞であるＬＮＣａｐ細胞由来のスタンダードエクソソーム（凍結乾燥品）を水和し、検体サンプルとして使用した。希釈は１０倍希釈系列とし、希釈には１％ＢＳＡを含むＰＢＳを使用した。
なお、装置内での検体希釈液には界面活性剤を含み、界面活性剤の濃度は０．０５％であった。

【0088】

ＬＮＣａｐ細胞由来のＣＤ９陽性ＣＤ６３陽性エクソソームの検量線を作成するために、希釈率の異なる検体のそれぞれについて、エクソソームの量に相関するシグナル値を測定した。ピペットチップにより、液体注入部３３０から流路３２０内に検体（希釈した培養上清のいずれか）を導入し、往復送液させた（１次反応）。１次反応の反応時間は１００分とした。液体注入部３３０から流路３２０内の検体を除去した後、流路３２０内を洗浄液で１回洗浄した。次いで、標識試薬（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素で標識された抗ＣＤ６３モノクローナル抗体）を液体注入部３３０から流路３２０内に導入し、往復送液させた（２次反応）。２次反応の反応時間は１０分とした。液体注入部３３０から流路３２０内の標識試薬を除去した後、流路３２０内を洗浄液で１回洗浄した。次いで、液体注入部３３０から流路３２０内に測定液を導入した。この状態で、ＳＰＦＳにより蛍光値を測定した。すなわち、金属膜１２０に対する励起光の入射角が増強角となるようにプリズム１１０側から金属膜１２０に励起光（レーザー光）を照射し、そのときに放出される蛍光を検出した。検出に用いた励起光の出力は５ｍＷであり、照射エネルギー量は、３．８ｍＷ／ｍｍ^２となった。得られた蛍光値から予め測定した光学ブランク値を引き、エクソソームの量に相関するシグナル値を算出した。各検体について、同じ測定を６回行った。

【0089】

上記と同じ検体について、検体中のＬＮＣａｐ細胞由来エクソソームの個数を測定した。ｑＮａｎｏ／ナノ粒子マルチアナライザー（メイワフォーシス株式会社製）を使用して、抽出したエクソソームの個数を測定した。重量はタンパク質定量（ＢＣＡ法、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ社製）によって実施した。

【0090】

測定したシグナル値を、検体中のエクソソームの個数（個／μｌ）に対してプロットし、ＣＤ９陽性ＣＤ６３陽性エクソソームの検量線（図９）を得た。

【0091】

図９のプロットから明らかなように、上記方法によって特定の細胞（前立腺癌細胞）由来のサンプルにおいてもＣＤ９陽性ＣＤ６３陽性エクソソームを検出することができた。また、ＣＤ９陽性ＣＤ６３陽性エクソソームの個数とシグナル値との間には相関関係が存在し、検出限界は３．２×１０^０個／μｌと低かった。

【0092】

次に、検出に用いた励起光の出力を変える以外は上記と同様にして、ＣＤ９陽性ＣＤ６３陽性エクソソームの量に相関するシグナル値を算出した。検出に用いた励起光の出力は５ｍＷ、１５ｍＷまたは３０ｍＷとし、それぞれの照射エネルギー量は、３．８ｍＷ／ｍｍ^２、１１．３ｍＷ／ｍｍ^２または２２．６ｍＷ／ｍｍ^２となった。各照射エネルギー量について、上記と同様にして検体からエクソソームを測定する際の検出限界を求めた。

【0093】

また、上記測定について、実験１と同様に、シグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を算出した。

【0094】

照射エネルギー量に対して、算出したＳ／Ｎおよび検出限界をそれぞれプロットし、ＣＤ９陽性ＣＤ６３陽性エクソソームに関する、照射エネルギー、Ｓ／Ｎおよび検出限界の関係を示すグラフ（図１０）を得た。

【0095】

図１０のプロットにおいては、ＣＤ９陽性ＣＤ６３陽性エクソソームを測定する際に使用する励起光の照射エネルギーが低い場合は、Ｓ／Ｎは大きくなり（即ち、シグナルに対するノイズが減少し）、検出限界も向上した。

【0096】

実験４： エクソソームに対する抗体とエクソソーム上の糖鎖を認識するＷＦＡレクチンを用いた、ＣＤ９陽性糖鎖保有エクソソームの測定

【0097】

図３に示される構成の測定チップ３００を準備した。流路３２０内に露出している金属膜１２０（金薄膜）の特定の領域（反応部）に、第１の結合物質として抗ＣＤ９モノクローナル抗体を固定化した。

【0098】

コスモバイオ社から購入した前立腺がん細胞であるＬＮＣａｐ細胞由来のスタンダードエクソソーム（凍結乾燥品）を水和し、検体サンプルとして使用した。希釈は１０倍希釈系列とし、希釈には１％ＢＳＡを含むＰＢＳを使用した。
なお、装置内での検体希釈液には界面活性剤を含み、界面活性剤の濃度は０．０５％であった。

【0099】

ＬＮＣａｐ細胞由来のＣＤ９陽性糖鎖保有エクソソームの検量線を作成するために、希釈率の異なる検体のそれぞれについて、エクソソームの量に相関するシグナル値を測定した。ピペットチップにより、液体注入部３３０から流路３２０内に検体（希釈した培養上清のいずれか）を導入し、往復送液させた（１次反応）。１次反応の反応時間は１００分とした。液体注入部３３０から流路３２０内の検体を除去した後、流路３２０内を洗浄液で１回洗浄した。次いで、標識試薬（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素で標識されたＷＦＡレクチン）を液体注入部３３０から流路３２０内に導入し、往復送液させた（２次反応）。２次反応の反応時間は１０分とした。液体注入部３３０から流路３２０内の標識試薬を除去した後、流路３２０内を洗浄液で１回洗浄した。次いで、液体注入部３３０から流路３２０内に測定液を導入した。この状態で、ＳＰＦＳにより蛍光値を測定した。すなわち、金属膜１２０に対する励起光の入射角が増強角となるようにプリズム１１０側から金属膜１２０に励起光（レーザー光）を照射し、そのときに放出される蛍光を検出した。検出に用いた励起光の出力は５ｍＷであり、照射エネルギー量は、３．８ｍＷ／ｍｍ^２となった。得られた蛍光値から予め測定した光学ブランク値を引き、エクソソームの量に相関するシグナル値を算出した。各検体について、同じ測定を６回行った。

【0100】

上記と同じ検体について、検体中のＬＮＣａｐ細胞由来エクソソームの個数を測定した。ｑＮａｎｏ／ナノ粒子マルチアナライザー（メイワフォーシス株式会社製）を使用して、抽出したエクソソームの個数を測定した。

【0101】

測定したシグナル値を、検体中のエクソソームの個数（個／μｌ）に対してプロットし、ＣＤ９陽性糖鎖保有エクソソームの検量線（図１１）を得た。

【0102】

図１１のプロットから明らかなように、上記方法によって特定の細胞（前立腺癌細胞）由来のサンプルにおいてもＣＤ９陽性糖鎖保有エクソソームを検出することができた。また、ＣＤ９陽性糖鎖保有エクソソームの個数とシグナル値との間には相関関係が存在し、検出限界は９．９×１０^１個／μｌと低かった。

【0103】

実験５： エクソソーム分泌細胞に対する抗体とエクソソーム上の糖鎖を認識するレクチンを用いた、前立腺癌細胞に由来するエクソソームの測定

【0104】

図３に示される構成の測定チップ３００を準備した。流路３２０内に露出している金属膜１２０（金薄膜）の特定の領域（反応部）に、第１の結合物質として抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体を固定化した。

【0105】

コスモバイオ社から購入した前立腺がん細胞であるＬＮＣａｐ細胞由来のスタンダードエクソソーム（凍結乾燥品）を水和し、検体サンプルとして使用した。希釈は１０倍希釈系列とし、希釈には１％ＢＳＡを含むＰＢＳを使用した。
なお、装置内での検体希釈液には界面活性剤を含み、界面活性剤の濃度は０．０５％であった。

【0106】

検体中のＬＮＣａｐ細胞由来エクソソームの個数を測定した。測定にはｑＮａｎｏ／ナノ粒子マルチアナライザー（メイワフォーシス株式会社製）を使用した。

【0107】

さらに上記と同じ検体について、ＬＮＣａｐ細胞由来のＰＳＭＡ陽性糖鎖保有エクソソームの検量線を作成するために、希釈率の異なる検体のそれぞれについて、エクソソームの量に相関するシグナル値を測定した。ピペットチップにより、液体注入部３３０から流路３２０内に検体（希釈した培養上清のいずれか）を導入し、往復送液させた（１次反応）。１次反応の反応時間は１００分とした。液体注入部３３０から流路３２０内の検体を除去した後、流路３２０内を洗浄液で１回洗浄した。次いで、標識試薬（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素）で標識されたＷＦＡレクチンを液体注入部３３０から流路３２０内に導入し、往復送液させた（２次反応）。２次反応の反応時間は１０分とした。液体注入部３３０から流路３２０内の標識試薬を除去した後、流路３２０内を洗浄液で１回洗浄した。次いで、液体注入部３３０から流路３２０内に測定液を導入した。この状態で、ＳＰＦＳにより蛍光値を測定した。すなわち、金属膜１２０に対する励起光の入射角が増強角となるようにプリズム１１０側から金属膜１２０に励起光（レーザー光）を照射し、そのときに放出される蛍光を検出した。検出に用いた励起光の出力は５ｍＷであり、照射エネルギー量は、３．８ｍＷ／ｍｍ^２となった。得られた蛍光値から予め測定した光学ブランク値を引き、エクソソームの量に相関するシグナル値を算出した。各検体について、同じ測定を６回行った。

【0108】

測定したシグナル値を、検体中のエクソソームの個数（個／μｌ）に対してプロットし、ＰＳＭＡ陽性糖鎖保有エクソソームの検量線（図１２）を得た。

【0109】

図１２のプロットから明らかなように、上記方法によって特定の細胞（前立腺癌細胞）由来のエクソソーム（ＰＳＭＡ陽性糖鎖保有エクソソーム）を検出することができた。また、ＰＳＭＡ陽性糖鎖保有エクソソームの個数とシグナル値との間には相関関係が存在し、検出限界は２．５×１０^２個／μｌと低かった。

【0110】

本出願は、２０１９年６月２７日出願の特願２０１９－１１９８２４に基づく優先権を主張する。当該出願明細書に記載された内容は、全て本願明細書に援用される。

【産業上の利用可能性】

【0111】

本実施の形態に係るエクソソームの測定方法または測定キットを用いることで、エクソソームを高感度かつ簡便に測定することができる。したがって、本発明に係るエクソソームの検出方法および測定キットは、例えば臨床検査などに有用である。

【符号の説明】

【0112】

１００、２００、３００，４００，５００ 測定チップ
１１０ プリズム
１１１ 入射面
１１２ 成膜面
１１３ 出射面
１２０ 金属膜
１３０ 抗エクソソーム抗体（第１の結合物質）
１３１ 抗エクソソーム抗体（第２の結合物質）
１４０ エクソソーム
１５０ 蛍光物質
２１０ 金属膜
２１１ 回折格子
３１０ 流路蓋
３２０ 流路
３３０ 液体注入部
３３１ 液体注入部被覆フィルム
３４０ 貯留部
３４１ 貯留部被覆フィルム
３４２ 通気孔
３５０ 接着層
４１２ 誘電体部材
４１４ 金属薄膜
４１６ リガンド固定領域
４１８ ウェル部材
４２０ 貫通穴
４２２ センサ構造体
５１０ ウェル本体
５１１ 収容部
５２０ 側壁部材
５２１ プリズム
５２３ 反射面
５２５ 金属膜
５２６ 反応場
Ｌ１ 励起光
Ｌ２ 反射光
Ｌ３ 蛍光

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】