特許 7562631 マラリア伝播の減少

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-09-27

(45)【発行日】2024-10-07

(54)【発明の名称】マラリア伝播の減少

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20240930BHJP

   A01N 63/20 20200101ALI20240930BHJP

   A61K 35/74 20150101ALI20240930BHJP

   A61P 33/06 20060101ALI20240930BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 Z

A01N63/20

A61K35/74 A

A61P33/06

【請求項の数】 13

(21)【出願番号】P 2022501360

(86)(22)【出願日】2020-07-10

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-16

(86)【国際出願番号】 EP2020069569

(87)【国際公開番号】W WO2021009050

(87)【国際公開日】2021-01-21

【審査請求日】2023-06-05

(31)【優先権主張番号】19382593.2

(32)【優先日】2019-07-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】19382821.7

(32)【優先日】2019-09-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】513032275

【氏名又は名称】グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＧＬＡＸＯＳＭＩＴＨＫＬＩＮＥ ＩＮＴＥＬＬＥＣＴＵＡＬ ＰＲＯＰＥＲＴＹ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＬＩＭＩＴＥＤ

(74)【代理人】

【識別番号】100091487

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 行孝

(74)【代理人】

【識別番号】100120031

【弁理士】

【氏名又は名称】宮嶋 学

(74)【代理人】

【識別番号】100120617

【弁理士】

【氏名又は名称】浅野 真理

(74)【代理人】

【識別番号】100172557

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 啓靖

(72)【発明者】

【氏名】アルフォンソ、メンドーサ、ロサーナ

(72)【発明者】

【氏名】ジャネット、ロドリゲス

【審査官】鈴木 崇之

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１５／００５３０７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】中国特許出願公開第１０４５３１５８５（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０１９９３８３８（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０１０１６５２５（ＣＮ，Ａ）

【文献】Acta Tropica，2008年，Vol. 107, No. 3，pp. 242-250

【文献】Parasites & Vectors，2014年，7:419，pp. 1-8

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８

Ａ０１Ｎ １／００－６５／４８

Ａ０１Ｐ １／００－２３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

デルフチア属の細菌を含む、（ｉ）マラリア伝播及び／又は（ｉｉ）マラリア原虫の伝播を減少させるための組成物。

【請求項2】

前記細菌が、デルフチア・ツルハテンシスである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記マラリア原虫が、熱帯熱マラリア原虫である、請求項１又は２に記載の組成物。

【請求項4】

前記組成物が、（ｉ）蚊によるマラリア伝播及び／又は（ｉｉ）蚊によるマラリア原虫の伝播を減少させるための組成物である、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項5】

前記蚊が、ハマダラカ属の蚊である、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

前記蚊が、ガンビエハマダラカ又はステフェンスハマダラカである、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

前記蚊が、ステフェンスハマダラカである、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

前記組成物が、糖供給源又は蜜飼料の形態である、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

１又は２以上の蚊をデルフチア属の細菌と接触させる工程を含む、マラリア原虫の伝播を減少させる方法。

【請求項10】

前記デルフチア属の細菌が、デルフチア・ツルハテンシスである、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記蚊が、ハマダラカ属の蚊である、請求項９又は１０に記載の方法。

【請求項12】

前記蚊が、ガンビエハマダラカ又はステフェンスハマダラカである、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記蚊が、ステフェンスハマダラカである、請求項１２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、マラリアの分野に関連し、マラリア伝播の阻止に有用な組成物及び方法を提供する。

【背景技術】

【0002】

寄生原虫感染症は、マラリアを含む医学的に重要な幅広い疾患の原因である。

【0003】

マラリアは蚊媒介性の疾患であり、ヒトでは、５種のプラスモジウム属の寄生虫（Plasmodium parasite）によって引き起こされ得、そのうち、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ：Plasmodium falciparum）が最も強毒性である。

【0004】

２０１８年には、世界中で推定２億２８００万人がマラリアに感染し、マラリア疾患が推定４０５，０００人の死亡原因であり、幼児及び妊婦が最も影響を受けたグループであった。サハラ以南のアフリカでは、１，１００万人の妊婦が２０１８年にマラリアに感染し、５歳未満の子供がマラリアによる全死亡の６７％を占めた(WORLD HEALTH ORGANIZATION. 2018. World malaria report.スイス、ジュネーブ、世界保健機関）。

【0005】

貧しい未発達のマラリア流行国における弱体化した医療制度と相まった、抗マラリア薬及び殺虫剤に対する耐性に加えて、ワクチン及び効果的な薬剤の欠如は、根絶の努力を妨げている。

【0006】

マラリア伝播を阻害するための追加のツールを開発及び供給する緊急の必要性があり、これらのツールは、撲滅の目的を達成するために既存のアプローチに統合され得る。

【発明の概要】

【0007】

本発明の第１の態様によれば、デルフチア属（Delftia genus）の細菌を含む組成物が提供される。

【0008】

本発明の第２の態様によれば、１又は２以上の蚊をデルフチア属の細菌と接触させる工程を含む、マラリア原虫の伝播を減少させるか又は阻止する方法が提供される。

【0009】

さらなる態様において、本発明は、マラリア伝播の減少に使用するためのデルフチア属の細菌を提供する。

【0010】

さらに別の態様では、デルフチア細菌（Delftia bacteria）を定着させたハマダラカ属（Anopheles genus）の蚊（以下、本発明の蚊と呼ぶ）が提供される。

【0011】

これらの態様の特定の実施形態において、デルフチア属の細菌は、デルフチア・ツルハテンシス（Delftia tsuruhatensis）である。

【0012】

本発明は、多くの点で有利であり得る。本発明者らは、デルフチア属の細菌、特にデルフチア・ツルハテンシスが、蚊によるプラスモジウム属の寄生虫の伝播を妨げることを見出した。本発明の組成物は、蚊を含む環境に導入されると、蚊の中腸におけるマラリア原虫のオーキネート（ookinete）及びオーシスト（oocyst）を抑止することにより、マラリア原虫の伝播を阻止する。デルフチア属の細菌、特にデルフチア・ツルハテンシス（Ｄ．ｔｓｕｒｕｈａｔｅｎｓｉｓ）は、マラリアの蔓延に対抗するためのツールとして使用され得る。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】図１は、デルフチア・ツルハテンシスのコロニー形態を示す図である。

【図2】図２は、熱帯熱マラリア原虫のオーシスト強度に対するデルフチア・ツルハテンシスの影響を示す図である。各ドットは、単一の蚊の中腸におけるオーシストの総数を表し、水平の線は、感染の平均オーシスト強度を示す。マンホイットニー検定を使用して、様々な処理と対照との統計的有意性を比較した。（統計的に有意な分布を示す処理はアスタリスクで表されている：ｐ＜０．１、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１、ｐ＜０．０００１は、それぞれ＊、＊＊、＊＊＊、＊＊＊＊で表され、ｎｓは、有意差なしを表す）。グラフの下の表は、処理ごとの解剖された完全給餌の蚊（full-fed mosquito）の総数、感染率、伝播阻害の可能性、平均オーシスト強度の低下、及び平均オーシスト強度を示す。伝播阻害の可能性のパーセンテージ及び平均オーシスト強度の低下は、対照群の値で正規化することによって計算された。図２Ａ及び２Ｂは、２回の独立した実験の結果を表す。

【発明を実施するための形態】

【0014】

一態様において、本発明は、デルフチア属の細菌を含む組成物を提供する。デルフチア属は、グラム陰性の運動性桿菌の属であり、ベータプロテオバクテリア綱（class Betaproteobacteria）のコマモナス科（family Comamonadaceae）に属している。

【0015】

デルフチア属の細菌は、デルフチア属の任意の細菌であり得る。本発明の一実施形態において、デルフチア属の細菌はデルフチア・ツルハテンシスである。細菌は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA Scotland）の下で、２０１９年５月２１日に、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４３３９８で寄託された。この細菌は、分離されており、１６Ｓ ｒＲＮＡシーケンシングによってデルフチア・ツルハテンシスとして同定されている。この細菌は、ベータプロテオバクテリア綱のコマモナス科に属するグラム陰性菌である。本発明の一実施形態において、デルフチア属の細菌は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA Scotland）の下で、２０１９年５月２１日に、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４３３９８で寄託されている細菌である。

【0016】

本発明の一実施形態において、組成物は、（ｉ）蚊によるマラリア伝播及び／又は（ｉｉ）蚊によるマラリア原虫の伝播を減少させるか又は阻止するのに適している。一実施形態において、組成物は、蚊によるマラリア伝播を減少させるか又は阻止するのに適している。別の実施形態において、組成物は、蚊によるマラリア原虫の伝播を阻止するのに適している。

【0017】

本明細書で定義されるように、「マラリア伝播又はマラリア原虫の伝播の減少又は阻止」は、マラリアを防止することとして定義され、例えば、マラリア原虫の蚊の段階（オーシスト形成）を抑止することによってマラリアを防止する。

【0018】

デルフチア細菌、特にデルフチア・ツルハテンシスは、マラリア原虫を阻害することにより、蚊によるマラリア伝播を抑制することができることが見出された。具体的には、蚊を含む環境に導入されると、デルフチア・ツルハテンシスは、蚊の中腸におけるマラリア原虫のオーキネート及びオーシストを抑止することにより、マラリア原虫の伝播を阻止することができることが本明細書で示された。したがって、本発明の組成物は、蚊によるマラリア伝播及び／又はマラリア原虫の伝播を減少させるか又は阻止することができる。

【0019】

蚊は、マラリアを伝播させることができる任意の蚊、例えば、ハマダラカ属の蚊であってもよい。本発明の組成物及び方法は、任意のハマダラカ属種の蚊に及ぶことが想定される。本発明の一実施形態において、蚊は、ガンビエハマダラカ（Anopheles gambiae）又はステフェンスハマダラカ（Anopheles stephensi）である。一実施形態において、蚊はステフェンスハマダラカである。別の実施形態において、蚊はガンビエハマダラカである。

【0020】

マラリア原虫は、任意のマラリア原虫であり得る。一実施形態において、マラリア原虫はプラスモジウム属の寄生虫である。一実施形態において、寄生虫は熱帯熱マラリア原虫である。別の実施形態において、寄生虫はプラスモディウム・ベルゲイ（Plasmodium berghei）である。

【0021】

本発明の組成物は、任意の適切な形態であり得、任意の適切な担体を含み得る。

【0022】

組成物は、飼料組成物であり得、すなわち、組成物は、食物摂取のために蚊に供給され得る形態であり得る。一実施形態において、飼料組成物は、糖供給源（sugar source）又は蜜飼料（nectar feed）である。一実施形態において、飼料組成物は糖供給源である。糖供給源は、誘引性の糖餌であっても、誘引性の糖餌内に含まれていてもよい。誘引性の糖餌は、糖及び毒性成分を含む。本発明による誘引性の糖餌は、毒性成分の代わりに本発明の組成物を含むこと、すなわち、糖及び本発明の組成物を含むことが想定される。

【0023】

一実施形態において、組成物は餌の形態である。餌は、蚊が組成物との接触に引きつけられるように設計される。一実施形態において、それと接触すると、次いで、組成物は、蚊に、例えば摂取によって、取り込まれる。誘引物質もまた使用されてもよい。誘引物質は、フェロモン、例えば、雄又は雌のフェロモンであってもよい。誘引物質は、蚊を餌に引きつける働きをする。餌は、任意の適切な形態、例えば、固体、ペースト、ペレット又は粉末形態であり得る。

【0024】

餌は、適切な「ハウジング（housing）」又は「トラップ（trap）」内で提供されてもよい。そのようなハウジング及びトラップは市販されており、本発明の組成物を含むように既存のトラップを適合させることができる。ハウジング又はトラップは、例えば、箱型であり得、予め形成された状態で提供され得るか、又は例えば、折り畳み可能なボール紙（cardboard）で形成され得る。ハウジング又はトラップに適した材料には、プラスチック及びボール紙、特に段ボール紙（corrugated cardboard）が含まれる。一旦トラップ内に入った蚊の動きを制限するために、トラップの内面を粘着性の物質によって覆ってもよい。ハウジング又はトラップには、餌を所定の位置に保持可能な適切な餌入れ（trough）を内部に含んでもよい。トラップは、蚊が侵入後にトラップを簡単に離れることができないため、ハウジングと区別される。一方、ハウジングは、蚊が餌を摂取することができ、且つ、捕食者に対する安全を感じることができる好ましい環境を蚊に提供する「餌場」として機能する。

【0025】

第２の態様において、本発明は、１又は２以上の蚊をデルフチア属の細菌と接触させる工程を含む、マラリア原虫の伝播を減少させるか又は阻止する方法を提供する。

【0026】

本発明の一実施形態において、デルフチア属の細菌は、デルフチア・ツルハテンシスである。

【0027】

別の実施形態において、デルフチア属の細菌は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA Scotland）の下で、２０１９年５月２１日に、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４３３９８で寄託されている細菌である。

【0028】

蚊を細菌と接触させる工程は、任意の適切な方法で行うことができる。例えば、人が蚊及びデルフチア細菌に物理的に接触する必要はない。蚊と接触することがわかっている場所に細菌を置いておくことができる。

【0029】

細菌は、本発明の第１の態様に記載されているように、本発明の組成物の形態であり得る。

【0030】

本発明の特定の実施形態において、接触は、本発明の組成物でエリアを処理することによって、例えば、スプレー製剤、例えば、エアロゾル又はポンプスプレーを使用することによって、達成され得る。本発明の特定の実施形態において、エリアは、例えば、トラックに設置された装置による空中投下等を介して処理され得る。いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、バックパック散布（backpack spraying）、空中散布（aerial spraying）、散布／ダスティング（spraying/dusting）等によって散布される。

【0031】

蚊は、マラリアを伝播させることができる任意の蚊、例えば、ハマダラカ属の蚊であってもよい。本発明の組成物及び方法は、任意のハマダラカ属種の蚊に及ぶことが想定される。本発明の一実施形態において、蚊は、ガンビエハマダラカ又はステフェンスハマダラカである。一実施形態において、蚊はステフェンスハマダラカである。別の実施形態において、蚊はガンビエハマダラカである。

【0032】

マラリア原虫は、任意のマラリア原虫であり得る。一実施形態において、マラリア原虫はプラスモジウム属の寄生虫である。一実施形態において、寄生虫は熱帯熱マラリア原虫である。別の実施形態において、寄生虫はプラスモディウム・ベルゲイである。

【0033】

第３の態様において、本発明は、マラリア伝播の減少に使用するためのデルフチア属の細菌を提供する。一実施形態において、デルフチア属の細菌は、デルフチア・ツルハテンシスである。細菌は、本発明の第１の態様で上記したような組成物の形態であり得る。一実施形態において、デルフチア属の細菌は、蚊によるマラリア伝播を減少させるのに使用するための細菌である。本明細書において、マラリア伝播を減少させることはまた、「マラリア原虫の伝播を減少させること」を意味すると解釈することもできる。

【0034】

蚊は、マラリアを伝播させることができる任意の蚊、例えば、ハマダラカ属の蚊であってもよい。本発明の一実施形態において、蚊は、ガンビエハマダラカ又はステフェンスハマダラカである。一実施形態において、蚊はステフェンスハマダラカである。別の実施形態において、蚊はガンビエハマダラカである。

【0035】

マラリア原虫は、任意のマラリア原虫であり得る。一実施形態において、マラリア原虫はプラスモジウム属の寄生虫である。一実施形態において、寄生虫は熱帯熱マラリア原虫である。別の実施形態において、寄生虫はプラスモディウム・ベルゲイである。

【0036】

本発明のさらなる態様において、デルフチア属の細菌は、細菌に対する幼生期又は成虫期の蚊の直接曝露に基づく疾患管理戦略において使用され得る。曝露は、バクテリアの直接投与（direction administration）を通じて、又は蚊の在来種とデルフチア細菌がすでに定着している蚊との相互作用を介して達成され得る。本発明の蚊は、デルフチア細菌を含み、エリア内のその他の蚊集団と交配し得、したがって、細菌をその他の蚊集団に伝播させることができる作用因子（agent）として使用することができる。デルフチアを含む蚊は、所望のデルフチア株を使用して適切な蚊種に感染させることによって容易に生産され得る。

【0037】

或いは、細菌を直接展開させて、現地の蚊の個体数を増やすこともできる。ハマダラカは、別の蚊からのデルフチア細菌に曝露するか、細菌自体に直接曝露し得る。デルフチア細菌に直接（すなわち、別の蚊を介さずに）曝露する場合には、細菌は、任意の適切な方法によって、及び組成物を蚊に投与することを可能にする任意の適切な方法で送達剤と組み合わせて送達され得る。例えば、蚊は、純粋又は実質的に純粋な形態で、例えば、デルフチアを含む溶液で細菌と接触させることができる。

【0038】

特定の実施形態において、デルフチア属の細菌は、送達剤とともに組成物中に存在する。

【0039】

別の特定の実施形態において、蚊の幼虫形態は、細菌を含む溶液に単に「浸漬」又は細菌を含む溶液で単に「噴霧」され得る。

【0040】

或いは、デルフチアを含む組成物は、送達を容易にするために、及び／又は蚊による組成物の取り込みを増加させるために、蚊の食物成分、例えば、人工蜜又は糖餌に結びつけることができる。経口導入の方法には、例えば、組成物を蚊の食物と直接混合すること、定常の水域を含む蚊の生息地又は野原に組成物を散布することが含まれる。組成物はまた、蚊が成長し、生活し、繁殖し、食餌し、又は寄生する培地に組み込まれ得る。

【0041】

別の実施形態において、組成物は餌の形態である。餌は、蚊が組成物との接触に引きつけられるように設計される。一実施形態において、それと接触すると、次いで、組成物は、蚊に、例えば摂取によって、蚊に取り込まれる。餌は、標的とされる種に依存し得る。誘引物質もまた使用されてもよい。誘引物質は、フェロモン、例えば、雄又は雌のフェロモンであってもよい。誘引物質は、蚊を餌に引きつける働きをする。餌は、任意の適切な形態、例えば、固体、ペースト、ペレット又は粉末形態であり得る。

【0042】

餌は、適切な「ハウジング」又は「トラップ」内で提供されてもよい。そのようなハウジング及びトラップは市販されており、本発明の組成物を含むように既存のトラップを適合させることができる。ハウジング又はトラップは、例えば、箱型であり得、予め形成された状態で提供され得るか、又は例えば、折り畳み可能なボール紙で形成され得る。ハウジング又はトラップに適した材料には、プラスチック及びボール紙、特に段ボール紙が含まれる。一旦トラップ内に入った蚊の動きを制限するために、トラップの内面を粘着性の物質によって覆ってもよい。ハウジング又はトラップには、餌を所定の位置に保持可能な適切な餌入れを内部に含んでもよい。トラップは、蚊が侵入後にトラップを簡単に離れることができないため、ハウジングと区別される。一方、ハウジングは、蚊が餌を摂取することができ、且つ、捕食者に対する安全を感じることができる好ましい環境を蚊に提供する「餌場」として機能する。

【0043】

本発明の特定の実施形態において、例えば、スプレー製剤、例えば、エアロゾル又はポンプスプレーを使用することによって、エリアを処理してもよい。本発明の特定の実施形態において、エリアは、例えば、トラックに設置された装置による空中投下等を介して処理され得る。いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、バックパック散布、空中散布、散布／ダスティング等によって散布される。

【0044】

デルフチア細菌の直接使用に加えて、本発明による蚊は、マラリア原虫を伝播することができないため、マラリア伝播を阻止するために使用するのに適した作用因子となる。

【0045】

本発明は、その他のマラリア根絶の努力とともに展開されることが想定される。例えば、本発明を使用するための組成物、方法及び細菌は、既知の抗マラリア剤と一緒に使用され得る。一実施形態において、本発明を使用するための組成物又は細菌は、１種、２種又は３種の追加の抗マラリア剤と組み合わせて使用され得る。総合的なベクター対策管理（ＩＶＭ）は、利用可能なツールを最大限に活用することを提案している。

【0046】

少なくとも１種のその他の抗マラリア剤はまた、フェロキン、ＫＡＦ１５６、シパルガミン（cipargamin）、ＤＳＭ２６５、アルテミソン（artemisone）、アルテミシノン（artemisinone）、アルテフェノメル（artefenomel）、ＭＭＶ０４８、ＳＪ７３３、Ｐ２１８、ＭＭＶ２５３、ＰＡ９２、ＤＤＤ４９８、ＡＮ１３７６２、ＤＳＭ４２１、ＵＣＴ９４７、ＡＣＴ４５１８４０、ＯＺ６０９、ＯＺ２７７及びＳＡＲ９７２７６から選択され得る。

【0047】

熱帯熱マラリア原虫感染症の処置において、少なくとも１種、２種又は３種の追加の抗マラリア剤を以下のリストから選択し得、抗マラリア剤の少なくとも１種はアルテミシニン系の薬剤である。
・アルテメテル＋ルメファントリン
・アルテスネイト＋アモジアキン
・アルテスネイト＋メフロキン
・ジヒドロアルテミシニン＋ピペラキン
・アルテスネイト＋スルファドキシン－ピリメタミン（ＳＰ）

【0048】

上記の併用処置は、アルテミシニン系併用療法（ＡＣＴ）として既知である。ＡＣＴの選択は通常、熱帯熱マラリア原虫の現地株に対する治療効果研究の結果に基づいている。

【0049】

三日熱マラリア原虫（P. vivax）感染症の処置では、上記のようにＡＣＴを使用することができる。或いは、少なくとも１種のその他の抗マラリア剤は、特にクロロキン耐性の三日熱マラリア原虫がいないエリアでは、クロロキンであってもよい。耐性のある三日熱マラリア原虫が確認されているエリアでは、上記のように、感染症をＡＣＴにより処置することができる。

【0050】

治療薬の組み合わせは、医薬組成物又は製剤の形態で使用するために便利に提示され得、一緒に又は別個に投与され得る。別個に投与する場合には、これは、別個に又は連続的に任意の順序で（同じ又は異なる投与経路によって）起こり得る。

【0051】

本発明の使用のための組成物又は細菌は、殺虫剤処理ネット（ＩＴＮ）（長時間作用型殺虫剤ネット（ＬＬＩＮ）を含む）及び／ＩＲＳ（屋内残留スプレー）の使用と組み合わせて使用され得る。ＡＴＳＢ（誘引性の有毒な糖餌）は蚊を引きつけて、有毒な蚊を殺す化合物とともに糖を食べさせる。効率を上げるために、ＡＴＳＢには、デルフチア細菌を含めることもでき、或いは、前述のように、毒性化合物の代わりにデルフチア細菌を使用することもできる。

【実施例】

【0052】

以下の非限定的な実施例は、本発明を例示する。

【0053】

実施例１ 熱帯熱マラリア原虫が感染することができなかったステフェンスハマダラカのコロニーの観測後の、このコロニー由来の微生物の分離及び同定
熱帯熱マラリア原虫が感染することができない蚊のコロニーが見出された。ＧＳＫステフェンスハマダラカによる熱帯熱マラリア原虫に対する感受性の喪失に影響を与え得る因子を明らかにするために、蚊の中腸組織、加えて、生殖適応度、生存、並びにこれらの蚊を繁殖させるために使用された様々な蚊の成長段階及び環境に存在する微生物叢を調査した。

【0054】

ステフェンスハマダラカのコロニーは、ロンドンのインペリアルカレッジから輸入された卵を使って２０１２年８月に新たに樹立された。スタンダードメンブレンフィーディングアッセイ（ＳＭＦＡ：Standard Membrane Feeding Assay）では、雌の成虫の蚊を日常的に熱帯熱マラリア原虫の感染のために使用し、蚊は中腸のオーシストの平均強度（１匹の蚊あたり２～２５個のオーシスト）及び有病率（８０～１００％）を示した。このコロニーは、１年間のコロニー形成の後、熱帯熱マラリア原虫に対する感受性を徐々に失った。本研究では、感受性の低下に寄与し得るその他の因子の中でも、様々な蚊の組織及び実験室の様々な繁殖環境に存在する微生物叢、繁殖条件、食物、温度、水を含むいくつかの異なる因子を調査した。

【0055】

方法
蚊の生存及び生殖能力
成虫の雌の蚊の死亡率をモニターした。マウスの血液（繁殖中）及びヒトの血液（ＳＭＦＡ中）を給餌した蚊の割合を記録した。マウスの血液を給餌した後の産卵もまた認められた。

【0056】

蚊の繁殖に使用されたインキュベーター（表面、加湿器及び水）からのサンプル採取及び分析
サンプルタイプ：すべてのインキュベーター（１～６）の内壁からの綿棒
サンプルソース：綿棒の採取のために設定されたエリアは、内部の床、内部の天井、及び内部の２つの側壁からであった。

【0057】

サンプリング方法：設定されたエリア（上記）を、基部に綿が付いた棒で拭き取った。それぞれのエリアからの各綿棒を、試験チューブ中の５ｍＬの滅菌ＬＢ培地に入れた。別個の試験チューブには、採取日、インキュベーター番号、及びインキュベーター内のサンプリング場所を記した。

【0058】

次いで、これらをロータリーシェーカーにより３７℃でインキュベートし、濁りの存在を一定の時間間隔（Ｏ／Ｎ、２４時間、４８時間、９６時間）でスクリーニングした。

【0059】

サンプルタイプ：繁殖目的で使用されるインキュベーター内の加湿器の水及び水受け（インキュベーター５及び６）
サンプルソース：加湿器容器の水（水容器が空の場合、綿棒を水受けの内側から採取し、上記のように処理した）。

【0060】

サンプリング方法：２５０ｍＬの水サンプルを水受けから滅菌ガラス瓶に採取した。次いで、これを、真空濾過装置に配置された０．２２ミクロンのフィルターを通じて濾過した。フィルターを鉗子で取り外し、試験チューブ中の５ｍＬの滅菌ＬＢ培地に入れた。次いで、フィルターをＬＢで穏やかに洗浄した。別個の試験チューブには、採取日、インキュベーター番号、及びインキュベーター内のサンプリング場所を記した。

【0061】

次いで、これらをロータリーシェーカーにより３７℃でインキュベートし、濁度の存在を一定の時間間隔（Ｏ／Ｎ、２４時間、４８時間、９６時間）でスクリーニングした。

【0062】

サンプル分析
上記の結果を、Ｘｃｅｌスプレッドシートに集計した。

【0063】

外部の分析グループ（ＤＹＮＡＭＩＭＥＤ Ｓ．Ｌ．）による細菌同定のための分析に、サンプルの選択されたセットを送った。細菌コロニーは、標準的な生化学的試験を使用した生化学的特性評価によって同定された。

【0064】

蚊の組織のサンプル採取（卵、幼虫、蚊全体、中腸）
サンプルソース：様々な発生段階の蚊の組織を、１００μＬの滅菌ＰＢＳを含む滅菌エッペンドルフに新鮮に採取し、さらなる使用のためにすぐに－８０℃で保存した。

【0065】

含まれる組織：
・卵（湿らせた濾紙から採取した卵）
・異なるスタジアムからの幼虫全体（１０～１２匹／チューブ）
・成虫の雌の蚊を中腸組織のために顕微解剖し、合計１０～１２匹の中腸を使用した。
・成虫の雌の蚊全体（１０～１２匹／チューブ）（ＰＢＳを添加せず、－８０℃で滅菌エッペンドルフに直接保存された。）

【0066】

蚊の組織からのサンプルの分析
滅菌使い捨てペッスルを備えたＫＯＮＴＥＳハンドヘルド自動ホモジナイザーを使用して、蚊の組織サンプルをホモジナイズした。ホモジネート全体をガラス試験管中の滅菌ＬＢブロス又はＹＥＳＰブロス（５～１０ｍＬ）に移し、ロータリーシェーカーにおいて２７℃でインキュベートした。濁りが観察されると、サンプルを固形寒天（ＬＢ又はＹＥＳＰ）にプレーティングして、単一の純粋な区別可能なコロニーを得た。単一の別個のコロニーは、区別可能なコロニー形態に基づいて選択され、新鮮な液体培地に移された。一晩培養した培養物（５００μＬ）を、等量の８０％滅菌グリセロールと完全に混合し、－８０℃で凍結保存した。

【0067】

サンプル分析
上記の様々な組織から分離した細菌のサンプルを外部の分析グループ（ＤＹＮＡＭＩＭＥＤ Ｓ．Ｌ．）による同定のために送った。細菌コロニーは、標準的な生化学的試験を使用した生化学的特性評価によって同定された。

【0068】

中腸組織の顕微鏡観察
羽化後の様々な年齢の蚊（成虫の雌）を中腸のために顕微解剖した（Ｌｅｉｃａ、Ｍ８０）。次いで、これらをガラス側の上の滅菌ＰＢＳにマウントするか、又は０．２％マーキュロクロムＤ／Ｗ溶液で１０～１５分間インキュベートした。１０倍又は４０倍の対物レンズを備えた光学顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、ＤＭ２０００）を使用して（合計倍率１００倍又は４００倍）、又はガラスカバースリップに油を一滴垂らして油浸を使用して１００倍で個々の中腸を観察した。

【0069】

結果
蚊の生存及び生殖能力
ステフェンスハマダラカのＣＲＥＳＡコロニーは、バルセロナのＣＲＥＳＡから輸入された卵を使用して、２０１２年８月にＴｒｅｓＣａｎｔｏｓ施設で樹立された。蚊のコロニーは、ロンドンのインペリアルカレッジ（Ｒｏｂｅｒｔ Ｓｉｎｄｅｎグループ）からの卵を使用してＣＲＥＳＡで最初に樹立された。時間の経過による蚊の生存、生殖能力及び全体的な品質の妨害はなかった。蚊の異常な死亡は観察されなかった。ヒトの血液を吸血する割合は、６０％～７０％であった（これは、このコロニーの蚊で観察された平均吸血率であった）。

【0070】

【表1】

【0071】

これらのサンプルはすべて、生化学的特性（ＢｉｏｍｅｒｉｅｕｘのＡＰＩストリップ）によってシュードモナス・オリジハビタンス（Pseudomonas oryzihabitans）として最初に同定された、１種の主要な細菌の優勢を示した。これらのサンプルを１６Ｓ ｒＲＮＡタイピングによって再分析し、２種の異なる細菌：デルフチア・ツルハテンシス（図１）及びシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）を同定した。優勢な細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡタイピングによってデルフチア・ツルハテンシスとして同定された。別の細菌であるシュードモナス・プチダもまた蚊の組織から分離されたが、デルフチア・ツルハテンシスほど優勢ではなかった。

【0072】

実施例２ デルフチア・ツルハテンシス及びマラリア伝播：熱帯熱マラリア原虫伝播の阻害におけるデルフチア・ツルハテンシスの役割を明らかにするための概念実証実験
ステフェンスハマダラカにおいて熱帯熱マラリア原虫感染を抑制するデルフチア・ツルハテンシスの能力を評価した。

【0073】

ステフェンスハマダラカのコロニーは、ロンドンのインペリアルカレッジから輸入された卵を使って２０１２年８月にＧＳＫ（スペインのＴｒｅｓＣａｎｔｏｓ施設）で新たに樹立された。スタンダードメンブレンフィーディングアッセイ（ＳＭＦＡ）では、雌の成虫の蚊を日常的に熱帯熱マラリア原虫の感染のために使用し、蚊は中腸のオーシストの平均強度（１匹の蚊あたり２～２５個のオーシスト）及び有病率（８０～１００％）を示した。このコロニーは、１年間のコロニー形成の後、熱帯熱マラリア原虫に対する感受性を徐々に失った。コロニーの適応度及び生殖能力は損なわれなかったが、蚊の中腸は、膜全体に分散した屈折性の微視的な結晶様構造の出現と、オーシストの欠如を示したことが観察された。蚊の組織を真菌及び細菌の両方の存在についてスクリーニングし、すべての組織に優勢的に存在する少なくとも１種の細菌種の存在を確認した。感受性の低下に寄与し得るいくつかの異なる因子、例えば、繁殖条件、食物、温度、水を調査した。特定の種類の細菌がこのように過剰に存在する原因となった可能性のある因子の１つは、当時使用されていた繁殖プロトコルに関連している可能性があった。マラリア原虫に対する感受性の欠如のため、蚊のコロニーを中断した（discontinue）。蚊の組織サンプル（幼虫、雄及び雌の成虫、中腸組織）は－８０℃で保存された。優勢な細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡタイピングによってデルフチア・ツルハテンシスとして同定された。別の細菌であるシュードモナス・プチダもまた蚊の組織から分離されたが、デルフチア・ツルハテンシスほど優勢ではなかった。

【0074】

凍結保存した蚊の組織サンプルの処理
ステフェンスハマダラカの幼虫及び成虫の雌の中腸の凍結保存組織サンプルは、２７℃のＬＢブロスで成長させた後、－８０℃で保存されたＧＳＫグリセロールストックから選択された。これらのサンプルは、熱帯熱マラリア原虫を伝播することができなかった、２０１２年に樹立されたステフェンスハマダラカのコロニーから取得された。番号５、１１及び２８のラベルが付いた３本の異なるバイアルを選択した。
番号５＝５～８日齢の蚊の中腸。
番号ｌｌ＝２６～３０日齢の成虫の中腸。
番号２８＝ホモジナイズされたステージＩＩの幼虫から分離された大きなコロニー。

【0075】

各サンプルから個々のコロニーを分離するために、滅菌ループを各チューブに導入し、３７℃、２００ｒｐｍで一晩維持した２０ｍＬのＬＢブロスに植菌した（デルフチアは３７℃及び２７℃の両方で増殖することができる）。サンプルをＬＢプレートに画線し、３７℃で２４～４８時間保持した。純粋なコロニーを、同定のために外部の研究所（ＤＹＮＡＭＩＭＥＤ Ｓ．Ｌ．）に送った。これらのサンプルはすべて、生化学的特性（ＢｉｏｍｅｒｉｅｕｘのＡＰＩストリップ）によってシュードモナス・オリジハビタンスとして最初に同定された、１種の主要な細菌種の優勢を示した。しかしその後、これらのサンプルを１６Ｓ ｒＲＮＡタイピングによって再分析し、２種の異なる細菌：デルフチア・ツルハテンシス（図１）及びもう一方のシュードモナス・プチダを同定した。図１は、デルフチア・ツルハテンシスのコロニー形態を示す：クリーム白色の円形コロニー、グラム陰性、桿状、カタラーゼ及びオキシダーゼ陽性、コマモナス科の運動性細菌。

【0076】

蚊の飼育及び中腸からの細菌叢の除去のための抗生物質処理
ステフェンスハマダラカの周期性コロニー（cyclic colony）を、２６．５±１℃、１４Ｌ：１０Ｄの光周期、７５±５％ＲＨの環境管理されたチャンバー（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ ＭＬＲ３５２ ＰＥ）で維持した。昆虫飼育ケージ（３０×３０×３０ｃｍ；Ｂｕｇｄｏｒｍ（登録商標））に入れられた成虫は、１０％スクロース（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ（登録商標）Ｓ７９０３）／水溶液＋１％ Ｋａｒｏ（登録商標）シロップに自由にアクセスすることができた。幼虫はプラスチックトレイ（２０×１５×６ｃｍ）で２５０匹の幼虫／トレイの群で飼育され、粉末のＴｅｔｒａ（登録商標）金魚スティックで給餌された。

【0077】

蚊の中腸の正常な細菌叢を除去するために、新しく誕生した蚊（newly emerged mosquito）に、１×ペニシリン・ストレプトマイシン［Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、Ｐ４３３３］及び０．４％ゲンタマイシン［Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、Ｇ１３９７］を含む、１０％スクロースの滅菌蒸留水溶液を給餌した。綿を４８時間ごとに新鮮な抗生物質溶液と交換した。実験を行う２日前に、雌の蚊を二重網で封されたボール紙容器に静かに移した。これらの蚊は、糖に浸した綿を除くことによって一晩飢餓状態にした。抗生物質処置が効果的であるか否かを判断するために、１０～１２匹の蚊の中腸を解剖し、ＰＢＳ中でホモジナイズし、ＬＢ寒天培地にプレーティングした。

【0078】

細菌サンプルの調製及びステフェンスハマダラカの中腸での再増殖
ＬＢプレートからのデルフチア・ツルハテンシスの純粋なコロニーを使用して、蚊に導入するための細菌サンプルを調製した（図１を参照）。単一の細菌コロニーを１００ｍＬのＬＢブロスで３７℃、２００ｒｐｍで、ＯＤ_６００が１．０｛１０^６コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬ｝になるまで一晩増殖させた。８ｍＬの培養物をペレット化し（遠心分離２分、１０，０００ｇ）、１０％スクロース溶液で２回洗浄し、最後に４ｍＬの１０％スクロース溶液に再懸濁した（最終ＯＤ_６００は約２．０）。この懸濁液を、綿のプラグで覆われた小さな（５ｍＬ）ガラス試験管に導入した。綿が懸濁液を完全に吸収するようにチューブを引っ繰り返し、蚊のカップに導入して餌を与えた。実験当日、蚊は１０％糖液＋細菌を染み込ませた綿で２時間餌を与えた。細菌懸濁液を摂食する前に、抗生物質で処理された蚊（上記のように４０～５０匹の雌成虫／カップ）を２４時間飢餓状態にした。次いで、すべての綿を１０％糖溶液に浸した新鮮な綿と交換した。未処理の蚊（対照）には、細菌懸濁液を含まない１０％スクロース溶液が提供された。

【0079】

蚊の中腸からの細菌負荷の計数
滅菌ＰＢＳを含むスライドガラスで、実体顕微鏡下で蚊を注意深く解剖した。１０匹の雌の蚊（各処理）からの中腸を、１．５ｍＬのエペンドルフチューブに入った１００μＬの滅菌ＰＢＳにすばやく導入した。ハンドヘルドホモジナイザーを使用してサンプルをホモジナイズし、段階希釈を行った。各希釈液１００μＬをＬＢ寒天プレートにプレーティングし、３７℃で２４～４８時間インキュベートした。細菌コロニーを計数し、ＣＦＵ／ｍＬを決定した。

【0080】

熱帯熱マラリア原虫の伝播におけるデルフチア・ツルハテンシスの役割
マラリア原虫伝播におけるデルフチア・ツルハテンシスの役割を決定するために、細菌が定着している蚊（上記のとおり）に、以下に説明するようにＳＭＦＡにおいて、成熟したガメトサイト（gametocyte）を給餌した。表１は、対照群及び試験群における様々な処理を説明する。

【0081】

【表2】

【0082】

ガメトサイトの生産
Ｍ．Ｄｅｌｖｅｓ（インペリアルカレッジ、ロンドン）から親切に提供された熱帯熱マラリア原虫ＮＦ５４ガメトサイト生産株から、ガメトサイト培養物を生成した。１０％のヒト血清を含むＲＰＭＩ培地で、無性生殖体（asexual）を最大１％の総パラサイテミアで（at a maximum of 1% total parasitemia）維持した。Ifediba and Vanderberg (1981)によって記載されたプロトコルからガメトサイト培養プロトコルを適応した。ガメトサイトの誘導は、５％ヒト血清Ａ＋及び０．５％ Ａｌｂｕｍａｘを含むＲＭＰＩ培地において、０．５％パラサイテミア（parasitemia）（＞７０％ 輪状（ring））及び４％ヘマトクリット値で開始された｛ガメトサイト生産培地：ＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ Ｒ５８８６）１５００ｍＬ、３０ｍＭ重炭酸塩（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓ５７６１）、５ｍＭヒポキサンチン（Ｇｉｂｃｏ １１０６７－０３０）。培地は、５％ヒト血清Ａ＋及び０．５％ Ａｌｂｕｍａｘにより完全となった｝。

【0083】

毎日培地を交換し、新鮮なＲＢＣを添加せずに、培養物を最大２０日間維持した。誘導後１３～１５日目に、培地を血清のみのガメトサイト処理培地に置き換えた｛Ｌ－グルタミン及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ １３０１８－０３１）を含むＲＰＭＩ １６４０（１５．８７ｇ）、１０ｍＭグルコース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｇ８２７０）；２０ｍＭ重炭酸塩（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓ５７６１）；５ｍＭヒポキサンチン（Ｇｉｂｃｏ １１０６７）／Ｌ。培地は、１０％ヒトＡ＋血清（Ｉｎｔｅｒｓｔａｔｅ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ）により完全となった｝。ステージＶガメトサイテミア（gametocytemia）の雄及び雌のガメトサイト比についてギムザ染色塗抹標本を使用し、生存率について鞭毛放出アッセイ（exflagellation assay）を実施することにより、培養物を１３日目以降、毎日モニターした。

【0084】

スタンダードメンブレンフィーディングアッセイ（ＳＭＦＡ）
ＳＭＦＡの開始の２日前に、抗生物質で処理された蚊に上記のデルフチア属の種を給餌した。給餌の日に、成熟したガメトサイト培養物を、３７℃で３分間、２５００×ｇで遠心分離した。上清を除去し、血中血球容積が１００％である新鮮なヒトＲＢＣで１：１にペレットを希釈して、最終的に、事前に温めたヒト血清を含む５０％ヘマトクリット値である蚊用人工血液ミール（artificial mosquito blood meal）として、調合した。すべての工程を３７℃で実行した。ガメトサイトを含まない血液ミールを同様の方法で調製した。３７℃の循環水浴に接続されたガラスフィーダー（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃１２８３１２８３）に取り付けられたパラフィルムメンブレンを介して、調製した血液ミールを雌のステフェンスハマダラカに３０～４０分間、デュプリケートで給餌した。２６．５±１℃、１４Ｌ：１０Ｄの光周期及び７５±５％ ＲＨのインキュベーターで、給餌した蚊を維持した。吸血後２４時間で蚊を中腸について注意深く解剖し、細菌数を上記のように決定した。中腸のオーシストを計数するために、完全に発達した卵巣を有する蚊（給餌された蚊）を、給餌後７～８日目で中腸について解剖し（Ｌｅｉｃａ、Ｍ８０）、０．２％マーキュロクロムＤ／Ｗ溶液中で１０～１５分間インキュベートした。１０倍の対物レンズを使用する光学顕微鏡（倍率１００倍）（Ｌｅｉｃａ、ＤＭ２０００）を使用して、個々の中腸におけるオーシストの総数をカウントした。感染率（１又は２以上のオーシストを有する蚊の割合）及び感染の平均オーシスト強度の両方が、各処理で決定された。

【0085】

結果
デルフチア・ツルハテンシスはステフェンスハマダラカの中腸に定着することに成功した。
デルフチア属の種（デルフチア・ツルハテンシス）が蚊の中腸に定着するのに効率的か否かを判断するために、デルフチアを給餌した蚊を、２回の異なる時点（感染性の血液の給餌（ＳＭＦＡ）前及び吸血から２４時間後）で解剖した。１０匹の蚊の中腸をプールし、１００μＬのＰＢＳでホモジナイズし、ＬＢ寒天培地にプレーティングし、ＣＦＵを測定した。１種類のコロニーのみが観察された。回収された細菌のコロニー形態及び特徴は（数は非常に少ないが）、デルフチア属の種と同一であり、それによりデルフチア属の種が蚊の中腸に定着することができたことが確認された。（表２）。吸血後、細菌数は２～３桁増加した（吸血後の中腸フローラの増加を示す報告／研究と一致）。対照未処理群の蚊の中腸は、吸血前後の両方でコロニーの存在を示さず、在来の細菌叢の除去におけるゲンタマイシン・ペニシリン・ストレプトマイシン処理の有効性を証明した（表２）。

【0086】

【表3】

【0087】

デルフチア・ツルハテンシスは、ステフェンスハマダラカにおける熱帯熱マラリア原虫の平均オーシスト強度及び感染率を大幅に低下させた。
未処理の対照と比較して、平均オーシスト強度の７０％以上の低下が再定着させた蚊において観察された。結果は、処理された蚊において６０％を超える伝播の阻害を示した（図２）。

【0088】

使用されたゲンタマイシン・ペニシリン・ストレプトマイシン処理は、ＧＳＫステフェンスハマダラカに存在する在来の培養可能な細菌性中腸フローラの除去に成功した。糖又は血液を給餌された蚊の中腸で、デルフチア・ツルハテンシスの細菌集団を検出することに成功した。血液を給餌した蚊は、血液ミールを給餌した２４時間後に、糖を給餌した蚊と比較して細菌数の２～３倍の増加を示した。熱帯熱マラリア原虫の平均オーシスト強度の７０％以上の減少及び６０％の伝播の阻害が、未処理の対照と比較して検出された。蚊の中腸への熱帯熱マラリア原虫のオーキネートの侵入は、吸血後１６～２４時間で起こる。この期間（吸血後２４時間）中に、蚊の中腸からデルフチア・ツルハテンシスの細菌コロニーのみが回収され、熱帯熱マラリア原虫のオーシスト数の減少にデルフチア・ツルハテンシスが直接的に関与していることが示唆された。

【図1】

【図2】