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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-09-30
(45)【発行日】2024-10-08
(54)【発明の名称】遺伝子増幅法及び遺伝子増幅用キット
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/686 20180101AFI20241001BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20241001BHJP
C12N 9/12 20060101ALN20241001BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/686 Z ZNA
C12M1/34 Z
C12N9/12
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2021502223
(86)(22)【出願日】2020-02-21
(86)【国際出願番号】 JP2020007232
(87)【国際公開番号】W WO2020175406
(87)【国際公開日】2020-09-03
【審査請求日】2023-02-17
(31)【優先権主張番号】P 2019036367
(32)【優先日】2019-02-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000210067
【氏名又は名称】池田食研株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】504179255
【氏名又は名称】国立大学法人 東京医科歯科大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】青木 秀之
(72)【発明者】
【氏名】森 朋子
(72)【発明者】
【氏名】喜田 幹子
(72)【発明者】
【氏名】宮原 裕二
(72)【発明者】
【氏名】松元 亮
(72)【発明者】
【氏名】田畑 美幸
【審査官】福澤 洋光
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１５－５３２５９３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００７－２６７７３８（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００５／１１８８１５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１８－５３８００７（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１５／１４５７０２（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
Ｃ１２Ｍ １／００－ ３／１０
ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
２～３５ｍＭのＮａＨ
2
ＰＯ
4
－Ｎａ
2
ＨＰＯ
4
緩衝液、ＮａＨ
2
ＰＯ
4
－ＮａＯＨ緩衝液又はクエン酸緩衝液と、３０ｍＭ～１２５ｍＭの塩化カリウムとを含むｐＨ５．７～６．９の酸性反応液中のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で対象遺伝子を増幅させる工程（Ｉ）を含む、遺伝子増幅法。
【請求項2】
工程（Ｉ）で用いる酸性反応液が、３０ｍＭ～１１５ｍＭの塩化カリウムを含むことを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子増幅法。
【請求項3】
工程（Ｉ）で用いるＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ属、又はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、又はＢａｃｉｌｌｕｓ属バクテリオファージ由来のＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子増幅法。
【請求項4】
工程（Ｉ）で用いる酸性反応液がマグネシウム塩及び糖類から選ばれる１種以上を含むことを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子増幅法。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載の工程（Ｉ）、及び、該工程（Ｉ）で得られた増幅産物又は反応副産物に基づき前記対象遺伝子を検出する工程（ＩＩ）を含む、遺伝子検出法。
【請求項6】
工程（ＩＩ）に於いて、該工程（Ｉ）で生じた反応副産物の量を測定し、該反応副産物の測定量に基づき前記対象遺伝子の量を決定することを特徴とする、請求項５記載の遺伝子検出法。
【請求項7】
反応副産物がピロリン酸である、請求項６に記載の遺伝子検出法。
【請求項8】
工程（ＩＩ）に於いて、ピリジルボロン酸との反応による電位変化を測定することによって、工程（Ｉ）で生じたピロリン酸の量を測定する、請求項７に記載の遺伝子検出法。
【請求項9】
工程（ＩＩ）に於いて、吸光度法により工程（Ｉ）で生じたピロリン酸の量を測定する、請求項７に記載の遺伝子検出法。
【請求項10】
請求項１～４のいずれか一項に記載の遺伝子増幅法を実施するための遺伝子増幅用キットであって、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝剤、及び反応試薬を含む、前記遺伝子増幅用キット。
【請求項11】
請求項５～９のいずれか一項に記載の遺伝子検出法を実施するための遺伝子検出装置またはシステムであって、請求項１０に記載の遺伝子増幅用キットを含む、前記遺伝子検出装置またはシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、遺伝子増幅法及び遺伝子増幅用キット等に関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子を増幅する技術は、医療分野において病原菌の検査、がん診断などに、ライフサイエンス分野においては、食中毒菌の検査、水質検査、遺伝子組換え作物検査などに広く産業利用されている。遺伝子増幅は、目的遺伝子をテンプレートとしＤＮＡポリメラーゼと作用させ、生成された目的遺伝子を電気泳動と染色で検出する方法が知られている。また、簡便な遺伝子増幅を確認する方法として、反応副産物であるピロリン酸を測定することで目的遺伝子の増幅を判別する方法が使用されている。
【0003】
反応副産物であるピロリン酸の測定法として蛍光試薬で検出する方法があり、リアルタイムＰＣＲなどの検出系として実用化されている。しかし、該方法は、蛍光試薬を使用するため高価となること、蛍光物質の影響を受けやすいことが知られている。他のピロリン酸の測定方法として集積化トランジスタを用いた方法がある。該方法は、目的遺伝子増幅反応で副生したピロリン酸から生じるプロトンをｐＨセンサで捉え検出することで遺伝子増幅を評価する方法であり、ＤＮＡシーケンサの検出系としても実用化されている。しかしながら、該方法では、遺伝子増幅反応のプロトンを捉える必要があるため、反応液中の緩衝能を極力抑える必要があり、その為、酵素反応を繰り返すと遺伝子増幅反応で産生したプロトンが蓄積することで反応液が酸性に傾き酵素の至適ｐＨから乖離し、酵素活性が低下、遺伝子増幅が低下することが知られている（非特許文献１）。
【0004】
そこでこれら課題を解決する方法として、ピロリン酸を特異的に認識するピリジルボロン酸を用いた方法がある。該方法では、蛍光試薬を使用する必要がなく安価であり、また、酸性条件下でピロリン酸とピリジルボロン酸が作用するため、遺伝子増幅反応で産生したプロトンが蓄積しても問題なく検出できる。しかし、ピリジルボロン酸がピロリン酸と結合できるｐＨの範囲が５～７であり、一般的な遺伝子増幅反応が、アルカリ側で行われていること、また、酸性条件下では、遺伝子の脱プリン化が起こりやすいことが知られており（非特許文献２）、脱プリン化が起こった遺伝子では、ＤＮＡポリメラーゼが作用できず、その為、遺伝子増幅が起こらない。このことから、酸性条件下で遺伝子増幅を行える有効な方法が未だないため、本方法は活用されていない状況である。
【0005】
その他にも、遺伝子増幅については多く検討されており、これらの方法の多くは、アルカリ側での反応であるが、その中でｐＨが７以下における遺伝子増幅に関する記載のある公知文献がある（特許文献１、２、３）。しかし、該公知文献では、酸性条件下で遺伝子増幅を行うことが目的ではないため、酸性条件下でＤＮＡポリメラーゼを反応させる具体的な組成や条件が示されてなく、実際に酸性条件下で遺伝子増幅を行った例については全く記載されていない。
【0006】
また、酸性条件に至適ｐＨが６であるＤＮＡポリメラーゼを用いて遺伝子増幅の検討が行なわれている（非特許文献３）。しかしながら、該方法では、遺伝子増幅の最適ｐＨは８.２であり、ｐＨ７.４では遺伝子増幅が認められなかった。酵素の至適ｐＨと遺伝子増幅の至適ｐＨは異なっており、酸性条件に至適ｐＨを有するＤＮＡポリメラーゼであれば、酸性条件で遺伝子増幅ができるわけではない。以上のように、酸性条件下でピロリン酸を検出するのに有用なピリジルボロン酸を用いた方法等を活用できるような、実際に酸性条件下でのＤＮＡポリメラーゼを用いた遺伝子増幅法は未だない状況である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】特許４６９９４１５号明細書
【文献】特許５００７４４０号明細書
【文献】特開２０１６－５２１１２０号公報
【非特許文献】
【0008】
【文献】日本学術振興会 科学研究費助成事業 研究成果報告書 課題番号２６７０２０１３ ２版 平成２９年６月２６日
【文献】ベーシックマスター 分子生物学 Ｐ１５－１６ 出版年２００６年１２月 オーム社
【文献】Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５１, ３３４－３４１，２０１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、上記の遺伝子増幅に関する従来技術に於ける様々な問題点を解決し、酸性条件下でＤＮＡポリメラーゼを用いて、測定対象の遺伝子を選択的且つ簡便に増幅する方法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
発明者らは、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、測定対象の遺伝子を増幅する方法を詳細に検討した結果、予想外にも、酸性条件下での遺伝子増幅反応を有意に行うことを可能とする、緩衝液の種類及び各種塩濃度等の遺伝子増幅反応条件が存在することを見出し、本発明を完成させた。
【0011】
本発明は、以下の［１］～［８］の態様に関する。
［１］ｐＨ４.２～６.９の酸性反応液中でのＤＮＡポリメラーゼ反応で対象遺伝子を増幅させる工程（Ｉ）を含む、遺伝子増幅法。
［２］工程（Ｉ）で用いる酸性反応液をｐＨ４.０～６．９の緩衝液を用いて調製することを特徴とする、態様［１］に記載の遺伝子増幅法。
［３］工程（Ｉ）で用いる酸性反応液が、５ｍＭ～１２５ｍＭの塩化カリウムを含むことを特徴とする、態様［２］に記載の遺伝子増幅法。
［４］工程（Ｉ）で用いるＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、又は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属バクテリオファージ由来のＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする、態様［１］に記載の遺伝子増幅法。
［５］工程（Ｉ）で用いる酸性反応液が糖類を含むことを特徴とする、態様［１］に記載の遺伝子増幅法。
［６］態様［１］～［５］のいずれか一項に記載の工程（Ｉ）、及び、該工程（Ｉ）で得られた増幅産物又は反応副産物に基づき前記対象遺伝子を検出する工程（ＩＩ）を含む、遺伝子検出法。
［７］工程（ＩＩ）に於いて、該工程（Ｉ）で生じた反応副産物の量を測定し、該反応副産物の測定量に基づき前記対象遺伝子の量を決定することを特徴とする、遺伝子検出法。
［８］反応副産物がピロリン酸である、態様［７］に記載の遺伝子検出法。
［９］工程（ＩＩ）に於いて、ピリジルボロン酸との反応による電位変化を測定することによって工程（Ｉ）で生じた反応ピロリン酸の量を測定する、態様［８］に記載の遺伝子検出法。
［１０］工程（ＩＩ）に於いて、吸光度法により工程（Ｉ）で生じたピロリン酸の量を測定する、態様［８］に記載の遺伝子検出法。
［１１］態様［１］～［５］のいずれか一項に記載の遺伝子増幅法を実施するための遺伝子増幅用キットであって、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝剤、及び反応試薬を含む、前記遺伝子増幅用キット。
［１２］態様［６］～［１０］のいずれか一項に記載の遺伝子検出法を実施するための遺伝子検出装置またはシステムであって、態様［１１］に記載の遺伝子増幅用キットを含む、前記遺伝子検出装置またはシステム。
［１］ｐＨ４.２～６.９の酸性反応液中でのＤＮＡポリメラーゼ反応で対象遺伝子を増幅させる工程（Ｉ）を含む、遺伝子増幅法。
［２］工程（Ｉ）で用いる酸性反応液をｐＨ４.０～６．９の緩衝液を用いて調製することを特徴とする、態様［１］に記載の遺伝子増幅法。
［３］工程（Ｉ）で用いる酸性反応液が、５ｍＭ～１２５ｍＭの塩化カリウムを含むことを特徴とする、態様［２］に記載の遺伝子増幅法。
［４］工程（Ｉ）で用いるＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、又は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属バクテリオファージ由来のＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする、態様［１］に記載の遺伝子増幅法。
［５］工程（Ｉ）で用いる酸性反応液が糖類を含むことを特徴とする、態様［１］に記載の遺伝子増幅法。
［６］態様［１］～［５］のいずれか一項に記載の工程（Ｉ）、及び、該工程（Ｉ）で得られた増幅産物又は反応副産物に基づき前記対象遺伝子を検出する工程（ＩＩ）を含む、遺伝子検出法。
［７］工程（ＩＩ）に於いて、該工程（Ｉ）で生じた反応副産物の量を測定し、該反応副産物の測定量に基づき前記対象遺伝子の量を決定することを特徴とする、遺伝子検出法。
［８］反応副産物がピロリン酸である、態様［７］に記載の遺伝子検出法。
［９］工程（ＩＩ）に於いて、ピリジルボロン酸との反応による電位変化を測定することによって工程（Ｉ）で生じた反応ピロリン酸の量を測定する、態様［８］に記載の遺伝子検出法。
［１０］工程（ＩＩ）に於いて、吸光度法により工程（Ｉ）で生じたピロリン酸の量を測定する、態様［８］に記載の遺伝子検出法。
［１１］態様［１］～［５］のいずれか一項に記載の遺伝子増幅法を実施するための遺伝子増幅用キットであって、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝剤、及び反応試薬を含む、前記遺伝子増幅用キット。
［１２］態様［６］～［１０］のいずれか一項に記載の遺伝子検出法を実施するための遺伝子検出装置またはシステムであって、態様［１１］に記載の遺伝子増幅用キットを含む、前記遺伝子検出装置またはシステム。
【発明の効果】
【0012】
従来技術では、酸性条件下で測定対象の遺伝子を選択的に増幅させ、該遺伝子を検出することが不可能であったが、本発明に係る遺伝子増幅法に於いては、従来技術で見られたような遺伝子の脱プリン化も見られず、酸性条件下でもＤＮＡポリメラーゼの作用により測定対象遺伝子を有意に増幅させることが出来る。更に、引き続き、増幅反応に使用した酸性反応液を用いて、該遺伝子を選択的且つ簡便に検出又は測定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼにおける遺伝子増幅反応液中の緩衝液の影響を示す図である。
【図2】Ｔｈｅｒｍｕｓ属由来ＤＮＡポリメラーゼにおける遺伝子増幅反応液中の緩衝液の影響を示す図である。
【図3】Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来ＤＮＡポリメラーゼにおける酸性条件下での遺伝子増幅反応における緩衝液及び塩化カリウム濃度の影響を示す図である。
【図4】遺伝子増幅反応におけるマグネシウム濃度の影響を示す図である。
【図5】遺伝子増幅反応における塩化カリウム濃度の影響を示す図である。
【図6】遺伝子増幅反応におけるトレハロースの添加効果を示す図である。
【図7】本発明と公知文献記載の遺伝子増幅反応組成における酸性条件下での遺伝子増幅反応の比較を示す図である。
【図8】Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓバクテリオファージ由来のＤＮＡポリメラーゼにおける遺伝子増幅反応液中の緩衝液の影響を示す図である。
【図9】Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓバクテリオファージ由来のＤＮＡポリメラーゼにおける遺伝子増幅反応液中の塩化カリウム濃度の影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明は、第一に、遺伝子増幅法に係る。本発明の遺伝子増幅法の工程（Ｉ）では、ｐＨ４.２～６.９、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ属及びＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼの場合、好ましくは、ｐＨ５．７～６．９又は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓバクテリオファージ由来のＤＮＡポリメラーゼの場合、好ましくは、ｐＨ５.０～６.５の範囲にある（酸性）反応液中でのＤＮＡポリメラーゼ反応において、測定の対象となる遺伝子（ＤＮＡ）を増幅させる。尚、上記の酸性反応液のｐＨは遺伝子増幅反応が進むにつれて多少変動するので、遺伝子増幅反応開始時のｐＨで規定する。本発明方法に使用するＤＮＡポリメラーゼは、原核生物、真核生物及びウィルス由来の何れのＤＮＡポリメラーゼでも良く、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属などの微生物由来やＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓバクテリオファージなどのウィルス由来のＤＮＡポリメラーゼが好ましい。また、組換え型ＤＮＡポリメラーゼでも良く、合成したＤＮＡポリメラーゼでも良い。可溶性酵素が好ましいが、不溶性酵素に界面活性剤を組み合わせても良く、可溶化タンパクとの融合又は膜結合部分の削除等により不溶性酵素を可溶化させた酵素でも良い。ＤＮＡポリメラーゼの公知のアミノ酸配列を利用でき、組換え型のＤＮＡポリメラーゼとしては、公知のＤＮＡポリメラーゼと６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％以上の同一性を有するアミノ配列を有し、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白質を使用しても良い。尚、本発明の遺伝子増幅法に於いては、特定のｐＨ範囲の酸性反応液中でのＤＮＡポリメラーゼ反応において、測定対象の遺伝子の増幅を繰り返し行うことによって、ピロリン酸等の反応産生物(反応副産物)を増加させ、その後、該反応副産物を係る酸性ｐＨ条件下で測定することが可能となる。従って、このような反応液のｐＨの範囲に於いて有意な遺伝子増幅活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。尚、既に述べたように、ＤＮＡポリメラーゼ自体の至適ｐＨと遺伝子増幅活性の至適ｐＨとは必ずしも一致していない。
【0015】
本発明の遺伝子増幅法に使用するＤＮＡポリメラーゼの調製方法としては、当業者に公知の任意の方法・手段、例えば、ＤＮＡポリメラーゼを含む対象物に加水し、粉砕機、超音波破砕機などで粉砕後、破砕した破砕物を遠心分離、濾過などで固形物を取り除いた抽出物、さらに当該抽出物をカラムクロマトグラフィーなどにより精製又は単離する方法があり、その精製又は単離したＤＮＡポリメラーゼなどを用いることができる。
【0016】
当該遺伝子増幅反応に使用される酸性反応液中のＤＮＡポリメラーゼ濃度は、試料の種類、推定される試料中の遺伝子濃度及び、反応時間・温度等の各種反応条件に応じて、当業者が適宜決められる。例えば、遺伝子増幅反応液中のＢａｃｉｌｌｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属などの微生物由来やＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓバクテリオファージなどのウィルス由来のＤＮＡポリメラーゼの濃度は、０.５μｇ/ｍＬ以上、より好ましくは１μｇ/ｍＬ以上、さらに好ましくは３μｇ/ｍＬ以上とすることができる。いずれにしても、本発明方法では、ＤＮＡポリメラーゼを繰り返し使用できるので、予想される試料中の遺伝子に対して、過剰量のＤＮＡポリメラーゼを添加する必要はない、という利点を有する。従って、ＤＮＡポリメラーゼ濃度の上限は、経済性なども考慮して当業者が適宜設定することが出来る。
【0017】
本発明の遺伝子増幅法における対象遺伝子（ＤＮＡ）は、当業者に公知の任意の方法で・手段で取得することが出来る。例えば、血液、生鮮食品、加工食品及び飲料など検査の目的に応じた試料から適宜調製することが出来る。各試料中からのＤＮＡ調製方法としては、当業者に公知の任意の方法・手段、例えば、試料をドデシル硫酸ナトリウム、酵素、ビーズ破壊などで溶解させ、得られた溶解液中のＤＮＡをシリカ膜などに結合後、溶出液でＤＮＡを溶出させるなどにより調製したＤＮＡを遺伝子増幅用のＤＮＡ試料として使用することができる。更に、増幅反応の種類などに応じて、ＤＮＡはｃＤＮＡであっても良い。
【0018】
本発明の遺伝子増幅法で使用する特定のｐＨ範囲の酸性反応液は、ＤＮＡポリメラーゼの種類や反応条件等に応じて、例えば、ｐＨ４.０～６．９、好ましくはｐＨ５.０～６.５、より好ましくはｐＨ５．５～６．５等の適当なｐＨ範囲の緩衝液を用いて当業者が適宜調製することが出来る。該緩衝液としては、当業者に公知の任意の緩衝剤、好ましくは、ＮａＨ２ＰＯ４－Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４－ＮａＯＨ、ＮａＨ２ＰＯ４－ＫＯＨなどのリン酸塩緩衝剤を用いて調製するリン酸塩緩衝液やクエン酸－クエン酸ナトリウム、クエン酸－ＮａＯＨなどのクエン酸緩衝剤を用いて調製するクエン酸緩衝液などを使用することが出来る。酸性反応液中の緩衝剤の（終）濃度に関しては、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼをｐＨ５.５の緩衝液を用いて調製した反応液中で反応させる場合、該反応液中のリン酸塩の濃度は、０.１～２００ｍＭがよく、より好ましくは０.５～１００ｍＭ、さらに好ましくは５～５０ｍＭがよい。このような緩衝剤の濃度の上限は、経済性なども考慮して当業者が適宜設定することが出来る。尚、酸性反応液の最終容量に対して、通常、１～１０倍濃度の緩衝剤を１～２５容量％程度を使用することによって上記のｐＨ範囲の酸性反応液を調製することが出来る。
【0019】
本発明の遺伝子増幅法で使用する酸性反応液には塩化カリウムが含まれていることが好ましい。該反応液中の塩化カリウムの濃度は、ＤＮＡポリメラーゼの種類や反応条件に応じて、当業者が適宜決められる。アルカリ側ｐＨで反応させる従来の一般的な遺伝子増幅反応においては、塩化カリウム濃度が７５ｍＭ以上になると遺伝子増幅反応が阻害されることが知られているが、本発明方法に於ける酸性条件下での遺伝子増幅反応においては、塩化カリウム濃度は、使用する反応液のｐＨが酸性になるほど、過剰となるように添加するのが好ましい。例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼをｐＨ６.０の緩衝液を用いて調製した酸性反応液中で反応させる場合、該反応液中の塩化カリウムの濃度は、５～１１５ｍＭがよく、より好ましくは３０～１１５ｍＭがよい。例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼをｐＨ５.５の緩衝液を用いて調製した酸性反応液中で反応させる場合、該反応液中の塩化カリウムの終濃度は、５～１１５ｍＭがよく、より好ましくは３０～１１５ｍＭがよい。更に、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓバクテリオファージ由来のＤＮＡポリメラーゼをｐＨ４.０の緩衝液を用いて調製した酸性反応液中で反応させる場合、該反応液中の塩化カリウムの終濃度は、５～１２５ｍＭがよく、より好ましくは３０～１２５ｍＭがよい。塩化カリウムの濃度は、緩衝剤の濃度を考慮し、緩衝剤が高濃度の場合、塩化カリウム濃度は低濃度とし、緩衝剤が低濃度の場合、塩化カリウム濃度は高濃度とするのがよい。また、塩化カリウム濃度の上限は、経済性なども考慮して当業者が適宜設定することが出来る。
【0020】
本発明の遺伝子増幅法で使用する酸性反応液には更に二価イオンが含まれる。該二価イオンとしては、マグネシウム、マンガン、コバルトなどが使用できるが、マグネシウムを使用するのが好ましい。当該反応に使用される反応液中のマグネシウムの濃度は、適宜決められる。例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼをｐＨ５.５の緩衝液で反応させる場合、該反応液中のマグネシウム濃度は、１.５～９ｍＭがよく、より好ましくは２～６ｍＭがよい。例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼをｐＨ６.０の緩衝液を用いて調製した酸性反応液中で反応させる場合、該反応液中のマグネシウム濃度は、２～６ｍＭがよく、より好ましくは２～４ｍＭがよい。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓバクテリオファージなどのウィルス由来のＤＮＡポリメラーゼをｐＨ４.０の緩衝液を用いて調製した酸性反応液中で反応させる場合、該反応液中のマグネシウム濃度は、１～３０ｍＭがよく、より好ましくは１０～１４ｍＭがよい。
【0021】
本発明の遺伝子増幅法では、遺伝子を増幅させるため、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）の４種が混合されたデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を用いる。当該反応に使用される反応液中のｄＮＴＰの濃度は、各種反応条件に応じて、当業者が適宜決められるが、例えば、ｄＮＴＰ濃度は、０.０１ｍＭ以上がよく、より好ましくは０.１ｍＭ以上、さらに好ましくは０.２ｍＭ以上とすることができる。
【0022】
更に、本発明の遺伝子増幅法では、遺伝子を増幅させるために各種のプライマーを用いる。該プライマーは増幅の対象とする遺伝子の具体的なヌクレオチド配列に基づき、当業者が適宜、設計・調製することが出来る。当該反応に使用される反応液中のプライマーの濃度は、各種反応条件に応じて、当業者が適宜決められるが、例えば、プライマー濃度は、０.０１ｍＭ以上、より好ましくは０.１ｍＭ以上、さらに好ましくは０.２ｍＭ以上とすることができる。
【0023】
本発明の遺伝子増幅法の工程（Ｉ）における遺伝子増幅反応は、当業者に公知の任意の方法、例えば、各種のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等で行われ、該反応の各サイクルに於ける温度や時間は、遺伝子増幅反応が生じるような任意の温度で良い。例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ属及びＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属のＤＮＡポリメラーゼを用いる場合では、９８℃・１０ｓｅｃ→５５℃・３０ｓｅｃ→７２℃・１ｍｉｎを繰り返すことや、９４℃・３ｍｉｎ→９４℃・３０ｓｅｃ→６２℃・３０ｓｅｃ→７２℃・３０ｓｅｃを繰り返した後、７２℃・１０ｍｉｎとすることなどできる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓバクテリオファージ由来のＤＮＡポリメラーゼを用いる場合では、９５℃・１ｍｉｎ加熱、３０℃まで冷却した後、３０℃・１６ｈｒ→６５℃・１０ｍｉｎ処理することなどできる。酸性条件下では、高温ほど遺伝子の脱プリン化が起こりやすいことから低温で遺伝子増幅を行うことが好ましい。
【0024】
また、本発明の遺伝子増幅法で使用する酸性反応液に糖類を含有させる（共存させる）ことによって、更に、反応産生物の量を増加させることが出来る。糖類としては、ショ糖、トレハロースなど当業者に公知の糖類が使用できる。当該反応に使用される反応液中の糖類の濃度は、各種反応条件に応じて、当業者が適宜決められる。例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼをｐＨ５.５の緩衝液で反応させる場合、該反応液中の糖類濃度は、１０％以下がよく、より好ましくは５％以下がよい。例えば 、Ｔｈｅｒｍｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼをｐＨ６.０の緩衝液を用いて調製した酸性反応液中で反応させる場合、該反応液中の糖類濃度は、１％以上がよく、より好ましくは５％以上がよい。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓバクテリオファージなどのウィルス由来のＤＮＡポリメラーゼをｐＨ４.０の緩衝液を用いて調製した酸性反応液中で反応させる場合、該反応液中の糖類濃度は、０.１％以上がよく、より好ましくは１％以上がよい。
【0025】
さらに、本発明の遺伝子増幅法で使用する酸性反応液に牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、非イオン製剤、アンモニウムイオンを添加する（共存させる）ことによって、酵素やＤＮＡの安定性を増し、反応産生物の量を増加させることが出来る。ＢＳＡの濃度は、各種反応条件に応じて、当業者が適宜決められる。例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼをｐＨ５.５の緩衝液で反応させる場合、該反応液中のＢＳＡ濃度は、０.００１％以上がよく、より好ましくは０.００５％以上、さらに好ましくは０.０１％以上がよい。非イオン製剤としては、ＮＰ-４０、ＴｒｉｔｏｎＸ-１００など当業者に公知の非イオン製剤が使用できる。当該反応に使用される反応液中の非イオン製剤の濃度は、各種反応条件に応じて、当業者が適宜決められる。例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼをｐＨ５.５の緩衝液で反応させる場合、該反応液中の非イオン製剤濃度は、０.０００５％以上がよく、より好ましくは０.００１％以上、さらに好ましくは０.０１％以上がよい。また、アンモニウムイオンとしては、硫酸アンモニウムなど当業者に公知のアンモニウムイオンが使用できる。当該反応に使用される反応液中のアンモニウムイオンの濃度は、各種反応条件に応じて、当業者が適宜決められる。例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼをｐＨ５.５の緩衝液で反応させる場合、反応液中のアンモニウムイオン濃度は、１２０ｍＭ以下がよく、より好ましくは１００ｍＭ以下、さらに好ましくは８０ｍＭ以下がよい。
【0026】
本発明方法の工程（Ｉ）で使用する反応試薬・酵素等の各反応成分は、所定の酸性条件下で遺伝子増幅反応が生じる添加方法である限り、当業者に公知の任意の手段・手順等で反応系に添加することができる。例えば、各成分を反応開始前に一度に反応液に予め添加するか、又は、ＤＮＡポリメラーゼ又は遺伝子を含む試料を最後に添加し反応させても良い。従って、例えば、本願明細書の実施例にあるように、塩化カリウム、二価イオン、及び、糖類等を予めＰＣＲ用緩衝液に含有させておくことが出来る。
【0027】
本発明は、第二に、ｐＨ４．２～６.９の酸性反応液中でのＤＮＡポリメラーゼ反応で対象遺伝子を増幅させる工程（Ｉ）の後に、該工程（Ｉ）で得られた増幅産物又は反応副産物に基づき前記対象遺伝子を検出する工程（ＩＩ）を含む、遺伝子検出法に係る。
増幅産物又は反応副産物に基づく対象遺伝子の検出は、当業者に公知の任意の方法・手段を用いて、定性的、半定量的、又は、定量的に実施することが出来る。
例えば、増幅産物である増幅遺伝子を電気泳動した後、これを染色することによって、定性的又は半定量的に検出することが出来る。又は、反応副産物であるピロリン酸を蛍光試薬で検出する方法もある。
或いは、工程（Ｉ）で生じたピロリン酸及び水素イオン等の反応副産物の夫々の量を測定し、該反応副産物の測定量に基づき対象遺伝子の量を決定する（定量的に検出する)ことが出来る。この方法では、反応副産物の量と測定対象遺伝子の量との一定の相関関係に基づく検量線等を利用することができる。特に、本発明の工程（Ｉ）で生じたピロリン酸の量の測定には、当業者に公知の任意の方法・手段を使用することができる。特に、本発明の工程（Ｉ）では酸性条件下で測定対象遺伝子の増幅が可能であるので、酸性条件下で行われる、ピロリン酸を特異的に検出するピリジルボロン酸により電位変化を測定する方法を効果的に使用することが出来る。また、本発明の工程（Ｉ）で生じたピロリン酸をヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、キサンチンオキシダーゼ又はキサンチンデヒドロゲナーゼを組み合わせた方法や、ピロリン酸を無機ピロホスファターゼなどで２分子のリン酸とし、そのリン酸を測定することで、より高感度の測定、例えば、ルミノールと無機ピロホスファターゼ、ピルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼを組み合わせた方法などにより、ピロリン酸を吸光度法で測定できる。さらに遺伝子増幅反応に於いてピロリン酸から生じるプロトン（水素イオン）の測定には、水素イオンを検出するガラス電極やイオン感応性電界効果トランジスタにより電位変化を測定する測定方法などを使用することができる。本発明の工程（Ｉ）で生じたピロリン酸、水素イオンなどは、適宜、遺伝子増幅反応溶液から分離し、測定することができる。該反応溶液からのピロリン酸、水素イオンなどの分離方法としては、測定に影響の無い方法であれば特に限定されないが、例えば、ペーパークロマトグラフィー分離、マイクロ流体デバイスでの分離などが挙げられる。
増幅産物又は反応副産物に基づく対象遺伝子の検出は、当業者に公知の任意の方法・手段を用いて、定性的、半定量的、又は、定量的に実施することが出来る。
例えば、増幅産物である増幅遺伝子を電気泳動した後、これを染色することによって、定性的又は半定量的に検出することが出来る。又は、反応副産物であるピロリン酸を蛍光試薬で検出する方法もある。
或いは、工程（Ｉ）で生じたピロリン酸及び水素イオン等の反応副産物の夫々の量を測定し、該反応副産物の測定量に基づき対象遺伝子の量を決定する（定量的に検出する)ことが出来る。この方法では、反応副産物の量と測定対象遺伝子の量との一定の相関関係に基づく検量線等を利用することができる。特に、本発明の工程（Ｉ）で生じたピロリン酸の量の測定には、当業者に公知の任意の方法・手段を使用することができる。特に、本発明の工程（Ｉ）では酸性条件下で測定対象遺伝子の増幅が可能であるので、酸性条件下で行われる、ピロリン酸を特異的に検出するピリジルボロン酸により電位変化を測定する方法を効果的に使用することが出来る。また、本発明の工程（Ｉ）で生じたピロリン酸をヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、キサンチンオキシダーゼ又はキサンチンデヒドロゲナーゼを組み合わせた方法や、ピロリン酸を無機ピロホスファターゼなどで２分子のリン酸とし、そのリン酸を測定することで、より高感度の測定、例えば、ルミノールと無機ピロホスファターゼ、ピルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼを組み合わせた方法などにより、ピロリン酸を吸光度法で測定できる。さらに遺伝子増幅反応に於いてピロリン酸から生じるプロトン（水素イオン）の測定には、水素イオンを検出するガラス電極やイオン感応性電界効果トランジスタにより電位変化を測定する測定方法などを使用することができる。本発明の工程（Ｉ）で生じたピロリン酸、水素イオンなどは、適宜、遺伝子増幅反応溶液から分離し、測定することができる。該反応溶液からのピロリン酸、水素イオンなどの分離方法としては、測定に影響の無い方法であれば特に限定されないが、例えば、ペーパークロマトグラフィー分離、マイクロ流体デバイスでの分離などが挙げられる。
【0028】
更に、本発明は上記の本発明方法を実施するための、対象遺伝子を増幅するに必要な前述の各成分、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝剤、反応試薬（プライマー及びｄＮＴＰ等）並びに、糖類等の各種添加剤等を含む、遺伝子増幅用キットを提供する。当該キットは、安定化剤又は緩衝剤等の当業者に公知の他の任意成分を適宜含有させ、前記酵素等試薬成分の安定性を高めても良い。測定に影響の無い成分であれば特に限定されないが、例えば、卵白アルブミン、糖アルコール類、カルボキシル基含有化合物、酸化防止剤、界面活性剤等を例示できる。
【0029】
又、本発明は、当該遺伝子増幅用キットを含み、上記遺伝子検出法（測定法）を実施するための遺伝子検出装置または遺伝子検出システムを提供する。係る遺伝子検出装置または遺伝子検出システムには、当該遺伝子増幅用キットに加えて、本発明方法に於ける対象遺伝子の増幅工程（Ｉ）で得られた増幅産物又は反応副産物に基づき該遺伝子を検出する工程（ＩＩ）を実施する様々な手段・方法に応じて、それらの各手段・方法に必要とされる当該技術分野に於いて公知である任意の試薬、装置、器具及びキット等を適宜含むことができる。
【0030】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例によって限定されるものではない。
【実施例1】
【0031】
（超好熱菌由来のポリメラーゼの調製）
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｉｏｔａｐｕｅｎｓｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（非特許文献３）を組み込んだプラスミドｐＥＴ２８ｂ（＋）で大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ ２(ＤＥ３)ｐＬｙｓＳを形質転換し、発現株として用いた。発現株について、カナマイシンを終濃度５０μg／ｍＬ及びクロラムフェニコールを終濃度３４μｇ/ｍＬ含むＬＢ培地により３７℃で４時間培養後、終濃度０．２ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加した。さらに、培養液を２５℃で終夜培養後、集菌を行い、得られた菌体を超音波破砕し、無細胞抽出液を調製した。調製した無細胞抽出液について遠心分離を行い、得られた上清の一部を用いて電気泳動法により目的酵素の発現を確認した。次いで残りの上清をアフィニティカラム（商品名：ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ ＨＰ、ＧＥヘルスケア製）により夾雑タンパクを除去し、０.１５ｍｇ／ｍＬのＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼを得た。なお、Ｔｈｅｒｍｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼはタカラバイオ製（商品名：Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓバクテリオファージ由来のＤＮＡポリメラーゼは関東化学製（商品名：ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ）を用いた。
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｉｏｔａｐｕｅｎｓｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（非特許文献３）を組み込んだプラスミドｐＥＴ２８ｂ（＋）で大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ ２(ＤＥ３)ｐＬｙｓＳを形質転換し、発現株として用いた。発現株について、カナマイシンを終濃度５０μg／ｍＬ及びクロラムフェニコールを終濃度３４μｇ/ｍＬ含むＬＢ培地により３７℃で４時間培養後、終濃度０．２ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加した。さらに、培養液を２５℃で終夜培養後、集菌を行い、得られた菌体を超音波破砕し、無細胞抽出液を調製した。調製した無細胞抽出液について遠心分離を行い、得られた上清の一部を用いて電気泳動法により目的酵素の発現を確認した。次いで残りの上清をアフィニティカラム（商品名：ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ ＨＰ、ＧＥヘルスケア製）により夾雑タンパクを除去し、０.１５ｍｇ／ｍＬのＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼを得た。なお、Ｔｈｅｒｍｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼはタカラバイオ製（商品名：Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓバクテリオファージ由来のＤＮＡポリメラーゼは関東化学製（商品名：ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ）を用いた。
【0032】
尚、上記Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来のポリメラーゼＤＮＡの塩基配列は以下のとおりである。
［Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼ ］
ATGGGGATCCTGGACGCAGACTACATTACGGAAGATGGCAAGCCGGTCATTCGTGTGTTCAAGAAAGAAAAGGGCGAATTCAAAATCAATTATGATCGTGACTTTGAACCGTATATTTACGCTCTGCTGAAAGATGACAGCGCGATCGAAGATATTAAAAAGATCACCGCTGAACGTCACGGTACCACGGTCCGTGTGACGCGCGCCGAACGTGTTAAAAAGAAATTTCTGGGTCGCCCGGTTGAAGTCTGGAAACTGTATTTCACCCATCCGCAGGATGTGCCGGCTATTCGTGACAAAATCCGCGAACACCCGGCGGTGGTTGATATTTATGAATACGACATCCCGTTTGCAAAGCGTTATCTGATTGATAAAGGCCTGATCCCGATGGAGGGTAACGAAGAACTGCGCATGCTGGCGTTTGACATTGAAACCCTGTACCATGAAGGCGAAGAATTCGGCGAAGGTCCGATTCTGATGATCAGCTATGCGGATGAAGAAGGTGCCCGTGTGATTACCTGGAAAAATATCGACCTGCCGTATGTTGAAAGTGTCTCCACGGAAAAAGAAATGATTAAGCGCTTTCTGAAAGTGATCCAGGAAAAAGATCCGGACGTTCTGATTACCTATAACGGCGATAATTTTGACTTCGCGTACCTGAAGAAACGTTCAGAAACGCTGGGTGTTAAGTTCATTCTGGGCCGCGATGGTTCGGAACCGAAAATCCAACGTATGGGCGACCGCTTTGCCGTGGAAGTTAAAGGTCGCATCCACTTCGATCTGTACCCGGTGATTCGTCGCACCATCAACCTGCCGACCTATACGCTGGAAACGGTGTACGAAGCCATTTTTGGCCAGCCGAAAGAAAAGGTTTATGCAGAAGAAATCGCACAAGCTTGGGAAAGTGGCGAAGGTCTGGAACGCGTTGCCCGTTATTCCATGGAAGATGCGAAGGCCACCTACGAACTGGGTAAAGAATTTTTCCCGATGGAAGCACAGCTGAGCCGTCTGGTCGGCCAAAGCCTGTGGGATGTGTCTCGCAGCTCTACCGGTAACCTGGTGGAATGGTTCCTGCTGCGTAAAGCCTATGAACGCAACGAACTGGCACCGAATAAACCGGATGAACGTGAACTGGCACGTCGCGCAGAATCTTATGCGGGCGGTTACGTCAAGGAACCGGAAAAAGGCCTGTGGGAAAACATCGTGTACCTGGATTACAAGTCACTGTACCCGTCGATTATCATTACCCATAACGTTAGTCCGGATACGCTGAATCGTGAAGGCTGCCGCGAATATGACGTGGCACCGCAGGTTGGTCACCGCTTTTGTAAAGATTTTCCGGGCTTCATTCCGTCCCTGCTGGGTGACCTGCTGGAAGAACGTCAGAAGGTCAAGAAAAAGATGAAAGCGACCGTGGATCCGATCGAACGCAAGCTGCTGGACTATCGTCAACGCGCAATCAAAATTCTGGCTAACAGCTATTACGGCTATTACGGTTATGCAAATGCTCGTTGGTACTGCCGCGAATGTGCGGAATCTGTGACCGCCTGGGGCCGTCAGTACATTGAAACCACGATGCGCGAAATCGAAGAAAAGTTTGGTTTCAAAGTTCTGTATGCTGATACCGACGGCTTTTTCGCGACGATTCCGGGTGCGGATGCCGAAACCGTCAAAAAGAAAACGAAGGAATTCCTGAACTACATCAACCCGCGTCTGCCGGGCCTGCTGGAACTGGAATATGAAGGCTTCTACCGTCGCGGCTTTTTCGTTACCAAGAAAAAGTATGCCGTCATTGATGAAGAAGACAAAATCACCACGCGTGGCCTGGAAATTGTGCGTCGCGATTGGTCAGAAATCGCAAAAGAAACCCAGGCTCGCGTTCTGGAAGCGATTCTGAAACATGGTGATGTCGAAGAAGCCGTGCGTATCGTTAAGGAAGTCACGGAAAAACTGTCGCGCTATGAAGTGCCGCCGGAAAAACTGGTTATTTACGAACAAATCACCCGCAACCTGCGTGATTATCGTGCAACGGGTCCGCACGTCGCAGTGGCTAAGCGTCTGGCAGCGCGTGGCATCAAAATTCGTCCGGGTACCGTTATTAGTTACATCGTCCTGAAAGGCCCGGGTCGTGTGGGTGATCGCGCGATTCCGTTTGATGAATTCGACCCGGCCAAACATCGCTATGACGCAGAATATTACATTGAAAATCAGGTCCTGCCGGCAGTGGAACGTATCCTGCGTGCATTTGGTTATCGTAAAGAAGATCTGCGCTACCAGAAAACCAAGCAAGCAGGCCTGGGTGCTTGGCTGAAACCGAAGACGTAA
［Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼ ］
ATGGGGATCCTGGACGCAGACTACATTACGGAAGATGGCAAGCCGGTCATTCGTGTGTTCAAGAAAGAAAAGGGCGAATTCAAAATCAATTATGATCGTGACTTTGAACCGTATATTTACGCTCTGCTGAAAGATGACAGCGCGATCGAAGATATTAAAAAGATCACCGCTGAACGTCACGGTACCACGGTCCGTGTGACGCGCGCCGAACGTGTTAAAAAGAAATTTCTGGGTCGCCCGGTTGAAGTCTGGAAACTGTATTTCACCCATCCGCAGGATGTGCCGGCTATTCGTGACAAAATCCGCGAACACCCGGCGGTGGTTGATATTTATGAATACGACATCCCGTTTGCAAAGCGTTATCTGATTGATAAAGGCCTGATCCCGATGGAGGGTAACGAAGAACTGCGCATGCTGGCGTTTGACATTGAAACCCTGTACCATGAAGGCGAAGAATTCGGCGAAGGTCCGATTCTGATGATCAGCTATGCGGATGAAGAAGGTGCCCGTGTGATTACCTGGAAAAATATCGACCTGCCGTATGTTGAAAGTGTCTCCACGGAAAAAGAAATGATTAAGCGCTTTCTGAAAGTGATCCAGGAAAAAGATCCGGACGTTCTGATTACCTATAACGGCGATAATTTTGACTTCGCGTACCTGAAGAAACGTTCAGAAACGCTGGGTGTTAAGTTCATTCTGGGCCGCGATGGTTCGGAACCGAAAATCCAACGTATGGGCGACCGCTTTGCCGTGGAAGTTAAAGGTCGCATCCACTTCGATCTGTACCCGGTGATTCGTCGCACCATCAACCTGCCGACCTATACGCTGGAAACGGTGTACGAAGCCATTTTTGGCCAGCCGAAAGAAAAGGTTTATGCAGAAGAAATCGCACAAGCTTGGGAAAGTGGCGAAGGTCTGGAACGCGTTGCCCGTTATTCCATGGAAGATGCGAAGGCCACCTACGAACTGGGTAAAGAATTTTTCCCGATGGAAGCACAGCTGAGCCGTCTGGTCGGCCAAAGCCTGTGGGATGTGTCTCGCAGCTCTACCGGTAACCTGGTGGAATGGTTCCTGCTGCGTAAAGCCTATGAACGCAACGAACTGGCACCGAATAAACCGGATGAACGTGAACTGGCACGTCGCGCAGAATCTTATGCGGGCGGTTACGTCAAGGAACCGGAAAAAGGCCTGTGGGAAAACATCGTGTACCTGGATTACAAGTCACTGTACCCGTCGATTATCATTACCCATAACGTTAGTCCGGATACGCTGAATCGTGAAGGCTGCCGCGAATATGACGTGGCACCGCAGGTTGGTCACCGCTTTTGTAAAGATTTTCCGGGCTTCATTCCGTCCCTGCTGGGTGACCTGCTGGAAGAACGTCAGAAGGTCAAGAAAAAGATGAAAGCGACCGTGGATCCGATCGAACGCAAGCTGCTGGACTATCGTCAACGCGCAATCAAAATTCTGGCTAACAGCTATTACGGCTATTACGGTTATGCAAATGCTCGTTGGTACTGCCGCGAATGTGCGGAATCTGTGACCGCCTGGGGCCGTCAGTACATTGAAACCACGATGCGCGAAATCGAAGAAAAGTTTGGTTTCAAAGTTCTGTATGCTGATACCGACGGCTTTTTCGCGACGATTCCGGGTGCGGATGCCGAAACCGTCAAAAAGAAAACGAAGGAATTCCTGAACTACATCAACCCGCGTCTGCCGGGCCTGCTGGAACTGGAATATGAAGGCTTCTACCGTCGCGGCTTTTTCGTTACCAAGAAAAAGTATGCCGTCATTGATGAAGAAGACAAAATCACCACGCGTGGCCTGGAAATTGTGCGTCGCGATTGGTCAGAAATCGCAAAAGAAACCCAGGCTCGCGTTCTGGAAGCGATTCTGAAACATGGTGATGTCGAAGAAGCCGTGCGTATCGTTAAGGAAGTCACGGAAAAACTGTCGCGCTATGAAGTGCCGCCGGAAAAACTGGTTATTTACGAACAAATCACCCGCAACCTGCGTGATTATCGTGCAACGGGTCCGCACGTCGCAGTGGCTAAGCGTCTGGCAGCGCGTGGCATCAAAATTCGTCCGGGTACCGTTATTAGTTACATCGTCCTGAAAGGCCCGGGTCGTGTGGGTGATCGCGCGATTCCGTTTGATGAATTCGACCCGGCCAAACATCGCTATGACGCAGAATATTACATTGAAAATCAGGTCCTGCCGGCAGTGGAACGTATCCTGCGTGCATTTGGTTATCGTAAAGAAGATCTGCGCTACCAGAAAACCAAGCAAGCAGGCCTGGGTGCTTGGCTGAAACCGAAGACGTAA
【実施例2】
【0033】
（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼにおける酸性条件下での遺伝子増幅反応液中の緩衝液の影響）
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）時の終濃度として、表１に示す組成のものをＰＣＲ緩衝液とした。各ＰＣＲ緩衝液に、２．５ｍＭ ｄＮＴＰを４μＬ、０．１％ ＢＳＡを２．５μＬ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を５μＬ、１０μＭ フォワードプライマー（１）：CAGTCGTCATGCATTGCCTGCTC、及びリバースプライマー（１）：GTAGGCGCAATCACTTTCGTCTACTCCGを各２μＬ、６．４ｎｇ／μＬのλ―ＤＮＡを４μＬ、実施例１で取得したＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼを１μＬ添加し、５０μＬのＰＣＲ増幅反応液を調製した。ＰＣＲの反応温度と時間は、表２に示す条件で実施した。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）時の終濃度として、表１に示す組成のものをＰＣＲ緩衝液とした。各ＰＣＲ緩衝液に、２．５ｍＭ ｄＮＴＰを４μＬ、０．１％ ＢＳＡを２．５μＬ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を５μＬ、１０μＭ フォワードプライマー（１）：CAGTCGTCATGCATTGCCTGCTC、及びリバースプライマー（１）：GTAGGCGCAATCACTTTCGTCTACTCCGを各２μＬ、６．４ｎｇ／μＬのλ―ＤＮＡを４μＬ、実施例１で取得したＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼを１μＬ添加し、５０μＬのＰＣＲ増幅反応液を調製した。ＰＣＲの反応温度と時間は、表２に示す条件で実施した。
【0034】
【実施例3】
【0035】
ＰＣＲ増幅後、実施例２で調した実施品１～７について、アガロース電気泳動にて目的遺伝子の増幅を確認したところ、図１のとおり、５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４－ＮａＯＨ ｐＨ５．５及び６．０、並びに、５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４－Ｎａ２ＨＰＯ４ ｐＨ６．０を用いたサンプル（実施品５～７）で、目的遺伝子の増幅が確認された。
【実施例4】
【0036】
（Ｔｈｅｒｍｕｓ属由来ＤＮＡポリメラーゼにおける酸性条件下での遺伝子増幅反応液中の緩衝液の影響）
ＰＣＲ反応時の終濃度として、表３及び表４に示す組成のものをＰＣＲ緩衝液とした。各ＰＣＲ緩衝液に、２．５ｍＭ ｄＮＴＰを４μＬ、１０μＭ フォワードプライマー（１）及びリバースプライマー（１）を各０．４μＬ、６．４ｎｇ／μＬのλ―ＤＮＡを１μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳポリメラーゼを０．２５μＬ、終濃度１０％となるようにトレハロースを添加し（実施品８、９、１０のみ添加）、５０μＬのＰＣＲ増幅反応液を調製した。ＰＣＲの反応温度と時間は、表５に示す条件で実施した。
ＰＣＲ反応時の終濃度として、表３及び表４に示す組成のものをＰＣＲ緩衝液とした。各ＰＣＲ緩衝液に、２．５ｍＭ ｄＮＴＰを４μＬ、１０μＭ フォワードプライマー（１）及びリバースプライマー（１）を各０．４μＬ、６．４ｎｇ／μＬのλ―ＤＮＡを１μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳポリメラーゼを０．２５μＬ、終濃度１０％となるようにトレハロースを添加し（実施品８、９、１０のみ添加）、５０μＬのＰＣＲ増幅反応液を調製した。ＰＣＲの反応温度と時間は、表５に示す条件で実施した。
【0037】
【0038】
【実施例5】
【0039】
ＰＣＲ増幅後、実施例４で調製した実施品８～１６について、アガロース電気泳動にて目的遺伝子の増幅を確認したところ、図２のとおり、２ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４－Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ６．０）を用いたサンプル（実施品８）では、目的遺伝子の増幅が確認されたが、クエン酸緩衝液を用いたサンプルは、いずれも増幅が見られなかった。また、２ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４－ＫＯＨ（ｐＨ６．０）を用いたサンプル（実施品１１）では、目的遺伝子の増幅が確認されたが、ＮａＨ２ＰＯ４－ＫＯＨ（ｐＨ５．０、又は、５．５）を用いたサンプルは増幅が見られなかった。さらにマッキルベイン緩衝液（ｐＨ５．０、又は、５．５、又は、６．０）を用いたサンプルでは、増幅が見られなかった。
【実施例6】
【0040】
（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来ＤＮＡポリメラーゼにおける酸性条件下での遺伝子増幅 反応液中の緩衝液及び塩化カリウムの濃度の影響）
ＰＣＲ反応時の終濃度として、表６に示す組成のものをＰＣＲ緩衝液とした。各ＰＣＲ緩衝液に、２．５ｍＭ ｄＮＴＰを４μＬ、０．１％ ＢＳＡを２．５μＬ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を５μＬ、１０μＭ フォワードプライマー（１）及びリバースプライマー（２）：GCATTGCCCGTCAGGCTAATTCTGAAを各２μＬ、６．４ｎｇ／μＬのλ―ＤＮＡを２．５μＬ、実施例１で取得したＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼを１μＬ添加し、５０μＬのＰＣＲ増幅反応液を調製した。また、ＰＣＲの反応温度と時間は、表７に示す条件で実施した。
ＰＣＲ反応時の終濃度として、表６に示す組成のものをＰＣＲ緩衝液とした。各ＰＣＲ緩衝液に、２．５ｍＭ ｄＮＴＰを４μＬ、０．１％ ＢＳＡを２．５μＬ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を５μＬ、１０μＭ フォワードプライマー（１）及びリバースプライマー（２）：GCATTGCCCGTCAGGCTAATTCTGAAを各２μＬ、６．４ｎｇ／μＬのλ―ＤＮＡを２．５μＬ、実施例１で取得したＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼを１μＬ添加し、５０μＬのＰＣＲ増幅反応液を調製した。また、ＰＣＲの反応温度と時間は、表７に示す条件で実施した。
【0041】
【実施例7】
【0042】
ＰＣＲ増幅後、実施例６で調製した実施品１７～２２について、アガロース電気泳動にて目的遺伝子の増幅を確認したところ、図３のとおり、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４－ＮａＯＨ（ｐＨ５．５）を用いたサンプルでは、５ｍＭ ＫＣｌ及び３０ｍＭ ＫＣｌを添加したサンプル（実施品１７及び１８）において目的遺伝子の増幅が確認されたが、５０ｍＭ ＫＣｌを添加したサンプルにおいては増幅が見られなかった。また、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４－ＮａＯＨ（ｐＨ５．５）を用いたサンプルでは、５、３０、５０ｍＭ ＫＣｌを添加したいずれのサンプルでも増幅が見られなかった。
【実施例8】
【0043】
（遺伝子増幅反応におけるマグネシウム濃度の影響）
ＰＣＲ反応時の終濃度として、表８に示す組成のものをＰＣＲ緩衝液とした。各ＰＣＲ緩衝液に、２．５ｍＭ ｄＮＴＰを４μＬ、０．１％ ＢＳＡを２．５μＬ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を５μＬ、１０μＭ フォワードプライマー（１）及びリバースプライマー（２）を各２μＬ、６．４ｎｇ／μＬのλ―ＤＮＡを１μＬ、実施例１で取得したＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼを１μＬ添加し、５０μＬのＰＣＲ増幅反応液を調製した。ＰＣＲの反応温度と時間は、表７に示す条件で実施した。
ＰＣＲ反応時の終濃度として、表８に示す組成のものをＰＣＲ緩衝液とした。各ＰＣＲ緩衝液に、２．５ｍＭ ｄＮＴＰを４μＬ、０．１％ ＢＳＡを２．５μＬ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を５μＬ、１０μＭ フォワードプライマー（１）及びリバースプライマー（２）を各２μＬ、６．４ｎｇ／μＬのλ―ＤＮＡを１μＬ、実施例１で取得したＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼを１μＬ添加し、５０μＬのＰＣＲ増幅反応液を調製した。ＰＣＲの反応温度と時間は、表７に示す条件で実施した。
【実施例9】
【0044】
ＰＣＲ増幅後、実施例８で調製した実施品２３～２７について、アガロース電気泳動にて目的遺伝子の増幅を確認したところ、図４のとおり、ＰＣＲ反応時の終濃度で２、４、６ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むＰＣＲ緩衝液を用いたサンプル（実施品２４～２６）において、目的遺伝子の増幅が確認された。また、ＰＣＲ増幅反応後の溶液中のピロリン酸をピロリン酸測定キット（商品名：ＰＰiＬiｇｈｔ Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ａｓｓａｙ、ＬＯＮＺＡ製）を用いて測定したところ、表９のとおりとなり、ＰＣＲ反応時の終濃度で２ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むＰＣＲ緩衝液を用いた時に、最もピロリン酸量が高かった。なお、ピロリン酸量は最も高い値を１００％として相対値で示した。
【0045】
【実施例10】
【0046】
（遺伝子増幅反応における塩化カリウム濃度の影響）
ＰＣＲ反応時の終濃度として、表１０示す組成のものをＰＣＲ緩衝液とした。各ＰＣＲ緩衝液に、２．５ｍＭ ｄＮＴＰを４μＬ、０．１％ ＢＳＡを２．５μＬ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を５μＬ、１０μＭ フォワードプライマー（１）及びリバースプライマー（２）を各２μＬ、６．４ｎｇ／μＬのλ―ＤＮＡを１μＬ、実施例１で取得したＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼを１μＬ添加し、５０μＬのＰＣＲ増幅反応液を調製した。ＰＣＲの反応温度と時間は、表７に示す条件で実施した。
ＰＣＲ反応時の終濃度として、表１０示す組成のものをＰＣＲ緩衝液とした。各ＰＣＲ緩衝液に、２．５ｍＭ ｄＮＴＰを４μＬ、０．１％ ＢＳＡを２．５μＬ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を５μＬ、１０μＭ フォワードプライマー（１）及びリバースプライマー（２）を各２μＬ、６．４ｎｇ／μＬのλ―ＤＮＡを１μＬ、実施例１で取得したＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼを１μＬ添加し、５０μＬのＰＣＲ増幅反応液を調製した。ＰＣＲの反応温度と時間は、表７に示す条件で実施した。
【実施例11】
【0047】
ＰＣＲ増幅後、実施例１０で調製した実施品２８～３３について、アガロース電気泳動にて目的遺伝子の増幅を確認したところ、図５のとおり、ＰＣＲ反応時の終濃度で３０、５０、７５、又は１００ｍＭ ＫＣｌを含むＰＣＲ緩衝液を用いたサンプル（実施品３０～３３）において、目的遺伝子の増幅が確認された。また、ＰＣＲ増幅反応後の溶液中のピロリン酸をピロリン酸測定キット（商品名：ＰＰiＬiｇｈｔ Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ａｓｓａｙ、ＬＯＮＺＡ製）を用いて測定したところ、表１１のとおり、ＰＣＲ反応時の終濃度で７５、又は１００ｍＭ ＫＣｌを含むＰＣＲ緩衝液を用いた時に、最もピロリン酸量が高かった。なお、ピロリン酸量は、最も高かった値を１００％として相対値で示した。
【0048】
【実施例12】
【0049】
（酸性条件下での遺伝子増幅反応におけるトレハロース添加効果）
ＰＣＲ反応時の終濃度として、表１２に示す組成のものをＰＣＲ緩衝液とした。各ＰＣＲ緩衝液に、２．５ｍＭ ｄＮＴＰを４μＬ、１０μＭ フォワードプライマー(１)及びリバースプライマー(１)を各０.４μＬ、６．４ｎｇ／μＬのλ―ＤＮＡを１μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳポリメラーゼを０．２５μＬ添加し、５０μＬの遺伝子増幅反応液を調製した。ＰＣＲの反応温度と時間は、表５に示す条件で実施した。
ＰＣＲ反応時の終濃度として、表１２に示す組成のものをＰＣＲ緩衝液とした。各ＰＣＲ緩衝液に、２．５ｍＭ ｄＮＴＰを４μＬ、１０μＭ フォワードプライマー(１)及びリバースプライマー(１)を各０.４μＬ、６．４ｎｇ／μＬのλ―ＤＮＡを１μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳポリメラーゼを０．２５μＬ添加し、５０μＬの遺伝子増幅反応液を調製した。ＰＣＲの反応温度と時間は、表５に示す条件で実施した。
【実施例13】
【0050】
ＰＣＲ増幅後、実施例１２で調製した実施品３４～３７について、アガロース電気泳動にて目的遺伝子の増幅を確認したところ、図６のとおり、全てのサンプルについて、目的遺伝子の増幅が確認された。また、反応後の溶液中のピロリン酸をピロリン酸測定キット（商品名：ＰＰiＬiｇｈｔ Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ａｓｓａｙ、ＬＯＮＺＡ製）を用いて測定したところ、表１３のとおり、トレハロースを添加した方が遺伝子増幅反応で生じるピロリン酸量が多くなった。なお、ピロリン酸量は最も高かった値を１００％として相対値で示した。
【0051】
【0052】
［比較例１］
（本発明と公知文献記載の遺伝子増幅反応組成における酸性条件下での遺伝子増幅反応の比較）
市販のＤＮＡポリメラーゼ（商品名：Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳ、タカラバイオ製）の添付資料に記載の組成をもとに緩衝液のみ２ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４－Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ６．０）に変更し、ＰＣＲ反応時の終濃度として、表１４に示す比較品１の組成のものをＰＣＲ緩衝液とした。ＰＣＲ緩衝液を５μＬ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰを４μＬ、１０μＭ フォワードプライマー(１)及びリバースプライマー(１)を各０.４μＬ、６．４ｎｇ／μＬのλ―ＤＮＡを１μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳポリメラーゼを０．２５μＬ添加し、５０μＬの遺伝子増幅反応液を調製した。ＰＣＲの反応温度と時間は、表５に示す条件で実施した。
（本発明と公知文献記載の遺伝子増幅反応組成における酸性条件下での遺伝子増幅反応の比較）
市販のＤＮＡポリメラーゼ（商品名：Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳ、タカラバイオ製）の添付資料に記載の組成をもとに緩衝液のみ２ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４－Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ６．０）に変更し、ＰＣＲ反応時の終濃度として、表１４に示す比較品１の組成のものをＰＣＲ緩衝液とした。ＰＣＲ緩衝液を５μＬ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰを４μＬ、１０μＭ フォワードプライマー(１)及びリバースプライマー(１)を各０.４μＬ、６．４ｎｇ／μＬのλ―ＤＮＡを１μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳポリメラーゼを０．２５μＬ添加し、５０μＬの遺伝子増幅反応液を調製した。ＰＣＲの反応温度と時間は、表５に示す条件で実施した。
【実施例14】
【0053】
ＰＣＲ反応時の終濃度として、表１４の実施品３８の組成のものをＰＣＲ緩衝液とした。ＰＣＲ緩衝液に、２．５ｍＭ ｄＮＴＰを４μＬ、１０μＭ フォワードプライマー(１)及びリバースプライマー(１)を各０.４μＬ、６．４ｎｇ／μＬのλ―ＤＮＡを１μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳポリメラーゼを０．２５μＬ添加し、５０μＬの遺伝子増幅反応液を調製した。ＰＣＲの反応温度と時間は、表５に示す条件で実施した。また、表１４の実施品３９の組成のものをＰＣＲ緩衝液とし、ＰＣＲ緩衝液に、２．５ｍＭ ｄＮＴＰを４μＬ、０．１％ ＢＳＡを２．５μＬ、０．０１％、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を５μＬ、１０μＭ フォワードプライマー(１)及びリバースプライマー(２)を各２μＬ、６．４ｎｇ／μＬのλ―ＤＮＡを１μＬ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＤＮＡポリメラーゼを１μＬ添加し、５０μＬの遺伝子増幅反応液を調製した。また、ＰＣＲの反応温度と時間は、表７に示す条件で実施した。
【0054】
【実施例15】
【0055】
ＰＣＲ増幅後、比較例１及び実施例１６で調製した比較品１及び実施品３８、３９について、アガロース電気泳動にて目的遺伝子の増幅を確認したところ、図７のとおり、従来の遺伝子増幅組成では、遺伝子増幅が認められなかったが、緩衝液の種類や塩化カリウム濃度を変えることにより、酸性条件下で遺伝子増幅が認められた。
【実施例16】
【0056】
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓバクテリオファージ由来のＤＮＡポリメラーゼにおける酸性条件下での遺伝子増幅反応液中の緩衝液の影響）
ＰＣＲ反応時の終濃度として、表１５に示す組成のものをＰＣＲ緩衝液とした。ＰＣＲ緩衝液２μＬに、０.５μｇ／μＬ ｐＵＣ１９を１μＬ、１００μＭ Ｍ －１３Ｆプライマー：CAGTCGTCATGCATTGCCTGCTCを２μＬ、滅菌水を５μＬ添加した、１０μＬのテンプレート混合液を調製した。テンプレート混合液を９５℃、1分加熱後、３０℃まで０.１℃／秒で冷却した。冷却後、ＰＣＲ緩衝液２μＬに、２５ｍＭ ｄＮＴＰを０.８μＬ、１００ｍＭ ＤＴＴを１μＬ、１００Ｕ／ｍＬ ピロホスファターゼを０.２μＬ、５０μｇ／ｍＬ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓバクテリオファージ由来のＤＮＡポリメラーゼを２μＬ、滅菌水を４μＬ添加した、１０μＬの反応混合液をテンプレート混合液に添加し、３０℃、１６時間のＰＣＲ反応を行った。
ＰＣＲ反応時の終濃度として、表１５に示す組成のものをＰＣＲ緩衝液とした。ＰＣＲ緩衝液２μＬに、０.５μｇ／μＬ ｐＵＣ１９を１μＬ、１００μＭ Ｍ －１３Ｆプライマー：CAGTCGTCATGCATTGCCTGCTCを２μＬ、滅菌水を５μＬ添加した、１０μＬのテンプレート混合液を調製した。テンプレート混合液を９５℃、1分加熱後、３０℃まで０.１℃／秒で冷却した。冷却後、ＰＣＲ緩衝液２μＬに、２５ｍＭ ｄＮＴＰを０.８μＬ、１００ｍＭ ＤＴＴを１μＬ、１００Ｕ／ｍＬ ピロホスファターゼを０.２μＬ、５０μｇ／ｍＬ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓバクテリオファージ由来のＤＮＡポリメラーゼを２μＬ、滅菌水を４μＬ添加した、１０μＬの反応混合液をテンプレート混合液に添加し、３０℃、１６時間のＰＣＲ反応を行った。
【0057】
【実施例17】
【0058】
ＰＣＲ増幅後、実施例１６で調製した実施品４０～４４について、アガロース電気泳動にて目的遺伝子の増幅を確認したところ、図８のとおり、３５ｍＭ クエン酸－クエン酸ナトリウム ｐＨ４.０、３５ｍＭ クエン酸－クエン酸ナトリウム ｐＨ４.５、３５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４－ＮａＯＨ ｐＨ５．０及び、３５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４－Ｎａ２ＨＰＯ４ ｐＨ６．０を用いたサンプル（実施品４１～４４）で、目的遺伝子の増幅が確認され、酸性条件下において室温付近で遺伝子増幅を行うことで、ｐＨ４台において酸性条件下でも遺伝子増幅させることができることが認められた。
【実施例18】
【0059】
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓバクテリオファージ由来のＤＮＡポリメラーゼにおける酸性条件下での遺伝子増幅反応液中の塩化カリウム濃度の影響）
ＰＣＲ反応時の終濃度として、表１６に示す組成のものをＰＣＲ緩衝液とした。ＰＣＲ緩衝液２μＬに、０.５μｇ／μＬ ｐＵＣ１９を１μＬ、１００μＭ Ｍ－１３Ｆプライマー：CAGTCGTCATGCATTGCCTGCTCを２μＬ、滅菌水を５μＬ添加した、１０μＬのテンプレート混合液を調製した。テンプレート混合液を９５℃、1分加熱後、３０℃まで０.１℃／秒で冷却した。冷却後、ＰＣＲ緩衝液２μＬに、２５ｍＭ ｄＮＴＰを０.８μＬ、１００ｍＭ ＤＴＴを１μＬ、１００Ｕ／ｍＬ ピロホスファターゼを０.２μＬ、５０μｇ／ｍＬ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓバクテリオファージ由来のＤＮＡポリメラーゼを２μＬ、滅菌水を４μＬ添加した、１０μＬの反応混合液をテンプレート混合液に添加し、３０℃、１６時間のＰＣＲ反応を行った。
ＰＣＲ反応時の終濃度として、表１６に示す組成のものをＰＣＲ緩衝液とした。ＰＣＲ緩衝液２μＬに、０.５μｇ／μＬ ｐＵＣ１９を１μＬ、１００μＭ Ｍ－１３Ｆプライマー：CAGTCGTCATGCATTGCCTGCTCを２μＬ、滅菌水を５μＬ添加した、１０μＬのテンプレート混合液を調製した。テンプレート混合液を９５℃、1分加熱後、３０℃まで０.１℃／秒で冷却した。冷却後、ＰＣＲ緩衝液２μＬに、２５ｍＭ ｄＮＴＰを０.８μＬ、１００ｍＭ ＤＴＴを１μＬ、１００Ｕ／ｍＬ ピロホスファターゼを０.２μＬ、５０μｇ／ｍＬ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓバクテリオファージ由来のＤＮＡポリメラーゼを２μＬ、滅菌水を４μＬ添加した、１０μＬの反応混合液をテンプレート混合液に添加し、３０℃、１６時間のＰＣＲ反応を行った。
【0060】
【実施例19】
【0061】
ＰＣＲ増幅後、実施例１８で調製した実施品４５～４７について、アガロース電気泳動にて目的遺伝子の増幅を確認したところ、図９のとおり、ＰＣＲ反応時の終濃度で７５、１１５、又は、１２５ｍＭ ＫＣｌを含むＰＣＲ緩衝液を用いたサンプル（実施品４５～４７）において、目的遺伝子の増幅が確認された。
【0062】
以上の結果から、本発明方法における遺伝子増幅反応では、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、酸性条件下で測定対象の遺伝子を選択的且つ簡便に増幅させることができた。実施例２～７に示されるように、各種ＤＮＡポリメラーゼにおいて、緩衝液の種類や該緩衝液と塩化カリウムの濃度を適切な範囲に設定することよって酸性条件下での遺伝子増幅が変化することが分かった。また、実施例８～１１及び、実施例１８～１９に示されるように、反応液中のマグネシウムや塩化カリウム濃度を適切な範囲に設定し、実施例１２～１３に示されるように、トレハロースを反応液に添加することによっても酸性条件下での遺伝子増幅が変化することが分かった。また、比較例１及び実施例１４～１５に示されるように、従来の遺伝子増幅条件では、酸性条件下で遺伝子増幅が起こらなかったが、本発明方法に於いて、緩衝液の種類や塩化カリウム濃度を適切な範囲に設定することで、酸性条件下でも遺伝子増幅させることができることが分かった。さらに実施例１６～１７に示されるように、室温付近で遺伝子増幅を行う場合には、ｐＨ４台の酸性条件下でも遺伝子増幅させることができることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【0063】
従来の遺伝子増幅条件では、酸性条件下でＤＮＡポリメラーゼを反応させる具体的な組成や条件が示されていなかった。これに対して、本発明に係る遺伝子増幅法に於いては、酸性条件下で測定対象の遺伝子を増幅させるための適切な緩衝液、各種塩類、添加物等の反応組成及び反応条件を見出し、酸性条件下で測定対象の遺伝子を増幅させることができた。その結果、本発明に係る遺伝子増幅法は、遺伝子増幅反応で産生したプロトンが蓄積しても問題なく反応が進む。その結果、優れた遺伝子検出技術として有用である、ピロリン酸を特異的に認識するピリジルボロン酸を用いた遺伝子検出法等に本発明の遺伝子増幅法で用いた酸性反応液を直ちに利用することが可能である。更に、本発明方法は、蛍光試薬を使用する必要がなくて安価である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】