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特許7564712スピルオーバー再調整のためのフローサイトメーターデータの高速再補正
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-01
(45)【発行日】2024-10-09
(54)【発明の名称】スピルオーバー再調整のためのフローサイトメーターデータの高速再補正
(51)【国際特許分類】
G01N 15/1429 20240101AFI20241002BHJP
G01N 15/14 20240101ALI20241002BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20241002BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20241002BHJP
【ＦＩ】
G01N15/1429
G01N15/14 C
G01N21/64 F
G01N33/48 M
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2020565277
(86)(22)【出願日】2019-05-21
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-09-13
(86)【国際出願番号】 US2019033419
(87)【国際公開番号】W WO2019226717
(87)【国際公開日】2019-11-28
【審査請求日】2022-05-19
(31)【優先権主張番号】62/674,273
(32)【優先日】2018-05-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】517203796
【氏名又は名称】サイテック バイオサイエンスィズ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002354
【氏名又は名称】弁理士法人平和国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チャン，ジェンユー
【審査官】鴨志田 健太
(56)【参考文献】
【文献】特開２００４－２０５５０８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１３－２４６１４０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１２－０５２９８５（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１３／０３４６０２３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開２０１１－０８５５８７（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ １５／１４２９
Ｇ０１Ｎ １５／１４
Ｇ０１Ｎ ２１／６４
Ｇ０１Ｎ ３３／４８
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
従来のフローサイトメーターを用いてフローサイトメトリーを実行する方法であって、複数の単一染色補正対照を使用することによって初期スピルオーバー行列を生成することと、
前記フローサイトメーターにサンプルを通すことと、
前記フローサイトメーターを通過する複数の細胞の蛍光を測定することによって、測定されたサンプルイベントベクトルを生成することと、
前記初期スピルオーバー行列及び前記測定されたサンプルイベントベクトルを使用することによって、補正されたサンプルイベントベクトルを生成することと、
前記初期スピルオーバー行列にデルタ行列を加算し、前記初期スピルオーバー行列を微調整することによって、調整されたスピルオーバー行列を生成することと、
を含む方法。
【請求項2】
前記調整されたスピルオーバー行列及び前記測定されたサンプルイベントベクトルを使用することによって、再補正されたイベントベクトルを計算すること、を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記補正されたサンプルイベントベクトルは、前記測定されたサンプルイベントベクトルに前記初期スピルオーバー行列の逆行列を線形乗算したものに等しい、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記デルタ行列は、前記初期スピルオーバー行列を微調整する１つ以上のデルタ値を含み、前記デルタ行列は、前記初期スピルオーバー行列と同じ次元を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記初期スピルオーバー行列はＮ×Ｎの次元を有し、Ｎは前記単一染色補正対照の数である、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記単一染色補正対照のそれぞれは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｒ－フィコエリスリン（ＰＥ）、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体（ＰｅｒＣＰ）、ＰＥ－Ｃｙ７、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、又はＡＰＣ－Ｃｙ７のうちの１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記測定されたサンプルイベントベクトルはＮ個の値を含み、前記補正されたサンプルイベントベクトルはＮ個の値を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項8】
前記再補正されたイベントベクトルは、前記測定されたサンプルイベントベクトルに、前記初期スピルオーバー行列とデルタ行列との和の逆行列を乗算したものに等しい、請求項２に記載の方法。
【請求項9】
スペクトルフローサイトメーターを用いてフローサイトメトリーを実行する方法であって、複数の単一染色補正対照を使用することによって基準行列を生成することと、
前記フローサイトメーターにサンプルを通すことと、
前記フローサイトメーターを通過する複数の細胞の蛍光を測定することによって、測定されたサンプルイベントベクトルを生成することと、
前記基準行列及び前記測定されたサンプルイベントベクトルを使用することによって、非混合サンプルイベントベクトルを生成することと、前記非混合サンプルイベントベクトルのスペクトルスピルオーバー行列は恒等行列であり、
前記スペクトルスピルオーバー行列を微調整することによって、調整されたスペクトルスピルオーバー行列を生成することと、
を含む、方法。
【請求項10】
前記調整されたスペクトルスピルオーバー行列及び前記測定されたサンプルイベントベクトルを使用することによって、再補正されたイベントベクトルを計算すること、を更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記基準行列に前記非混合サンプルイベントベクトルを線形乗算したものは、前記測定されたサンプルイベントベクトルに等しい、請求項９に記載の方法。
【請求項12】
前記非混合サンプルイベントベクトルにおける変数の数は、前記測定されたサンプルイベントベクトルにおける変数の数よりも少ない、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記測定されたサンプルイベントベクトル及び前記基準行列に対して最小二乗アルゴリズムを使用して前記非混合サンプルイベントベクトルの解を求めること、を更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
調整されたスピルオーバー行列を生成することは、前記スペクトルスピルオーバー行列にデルタ行列を加算することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項15】
前記デルタ行列は、前記スペクトルスピルオーバー行列を微調整する１つ以上のデルタ値を含み、前記デルタ行列は、前記スペクトルスピルオーバー行列と同じ次元を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記スペクトルスピルオーバー行列はＮ×Ｎの次元を有し、Ｎは前記単一染色補正対照の数である、請求項９に記載の方法。
【請求項17】
前記測定されたサンプルイベントベクトルはＮ個の値を含み、前記非混合サンプルイベントベクトルはＮ個の値を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項18】
前記再補正されたイベントベクトルは、前記測定されたサンプルイベントベクトルに、前記スペクトルスピルオーバー行列とデルタ行列との和の逆行列を乗算したものに等しい、請求項１０に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願の相互参照］
この非仮特許出願は、発明者Zhenyu Zhangによって２０１８年５月２１日に出願された「FAST RECOMPENSATION OF FLOW CYTOMETERY DATA FOR SPILLOVER READJUSTMENTS」という発明の名称の米国特許出願第６２／６７４，２７３号の利益を主張し、全ての意図及び目的において、引用することによって本明細書の一部をなすものとする。
この非仮特許出願は、発明者Zhenyu Zhangによって２０１８年５月２１日に出願された「FAST RECOMPENSATION OF FLOW CYTOMETERY DATA FOR SPILLOVER READJUSTMENTS」という発明の名称の米国特許出願第６２／６７４，２７３号の利益を主張し、全ての意図及び目的において、引用することによって本明細書の一部をなすものとする。
【0002】
本特許出願は、発明者Ming Yan他によって２０１７年７月２５日に出願された「COMPACT DETECTION MODULE FOR FLOW CYTOMETERS」という発明の名称の米国特許出願第１５／６５９，６１０号に関係し、全ての意図及び目的において、引用することによって本明細書の一部をなすものとする。本特許出願は、David Vrane他によって２０１７年４月２６日に出願された「COMPACT MULTI-COLOR FLOW CYTOMETER」という発明の名称の米国特許出願第１５／４９８，３９７号に更に関係している。この米国特許出願は、本実施の形態をともに用いることができるフローサイトメーターを記載しており、全ての意図及び目的において、引用することによって本明細書の一部をなすものとする。本特許出願は、David Vraneによって２０１７年１１月１９日に出願された「FLOW CYTOMETERY SYSTEM WITH STEPPER FLOW CONTROL VALVE」という発明の名称の米国特許出願第１５／８１７，２７７号に更に関係している。この米国特許出願は、フローサイトメーターのフルイディクスシステム（fluidics system）を記載しており、全ての意図及び目的において、引用することによって本明細書の一部をなすものとする。
【0003】
本発明の実施の形態は、包括的には、フローサイトメーターデータを分析して、サンプル内の粒子のカウントを求めることに関する。
【背景技術】
【0004】
フローサイトメーターは、一般に、１つ以上のレーザーによって照射される視界オリフィス（viewing orifice）を有する。１つ以上のレーザーからのレーザー光は、オリフィスを通過する様々な蛍光色素標識された粒子に衝突する。蛍光色素標識された粒子は、通常は、異なる蛍光色素（蛍光染料）を用いて標識されたサンプル内の様々な生体細胞であり、これらの生体細胞を分析することで、全体的な情報に一般化することができるサンプルについての情報を取得することができる。１つ以上のレーザーからのレーザー光が衝突する、オリフィスを通過する蛍光色素標識された粒子から発光される蛍光（蛍光性光）の検知には、フローサイトメーターにおける１つ以上の光学検出器が使用される。
【0005】
蛍光色素標識された粒子から発光される蛍光が各検出器に到達する前に、１つ以上の異なる光学フィルターを配置することができる。これらの光学フィルターは、蛍光色素の予想される蛍光に関連した光の特定の帯域幅のみが各検出器に見えるように発光蛍光路に配置される。すなわち、任意の所与のフィルターの帯域幅は、特定の蛍光染料の発光スペクトルにおけるピークを利用する。このように、任意の所与の粒子について、検出器からの集合的な信号は、粒子に付着された単数又は複数の蛍光色素のタイプを示す。発光される蛍光から検出器によって検出された信号によって、サンプル内の様々な粒子の迅速かつ広範な細胞分類が可能になる。
【0006】
しかしながら、発光スペクトルは、染料間で重なり合う可能性がある。これによって、単一のレーザー及び検出器によって所与の粒子上で同時に検出することができる異なる蛍光色素の数が制限される。発光帯域幅は、通常、３０ナノメートル（ｎｍ）～６０ｎｍの波長範囲にあるので、従来のフローサイトメーターは、通例、レーザー線ごとにわずか４つ又は５つの蛍光色素しか検出することができない。レーザーの数を増加させることは、同時に検出することができる蛍光色素の数を増加させる好都合ではあるが高価な方法を提供する。
【0007】
発光される蛍光性光の検出を更に複雑にすることは、粒子を染色するのに使用される多くの染料が、通常の３０ｎｍ～６０ｎｍの帯域幅範囲と異なり、この範囲よりも大きなレーザー波長範囲にわたって励起されるということである。これは、異なるレーザーの検出器の間の信号クロストークをもたらす可能性がある。
【0008】
従来のフローサイトメトリー蛍光検出システムは、コリメーティングレンズ焦点距離を増加させることによって発散を制限していた。しかしながら、これによって、光ビームの直径はより大きくなり、検出器の数は、必要とされる最終画像のサイズに応じて６つの検出器等に制限されることになった。これらの従来のフローサイトメトリーシステムでは、最終画像サイズは、８００マイクロメートル（μｍ）、すなわち、８００ミクロン等の大きなサイズの光学結像及び広帯域光（例えば、波長が４００ｎｍ～８００ｎｍ）を、直径が３ミリメートル（ｍｍ）未満のサイズを有する検出器のセット内にコリメートする際の光学収差によって制約されていた。
【0009】
別のフローサイトメトリーシステムでは、入射光は、並びにおける検出器のセットの検出器チェーンにおける検出器ごとに、球面マイクロミラーを使用して再結像される。再結像によって、上述したフローサイトメトリーシステムの発散するコリメート光問題が回避される。しかしながら、検出器の数は、球面マイクロミラーからの反射によってもたらされる収差によって制限される。画像サイズは、検出器チェーンに沿って増加するので、検出器チェーンにおける並びに沿って検出器チャネルの数を増加させるには、大きな面積の検出器が必要とされ、その結果、フローサイトメーターは大きくなり、バルキーで高価なものとなる。
【0010】
スペクトル的に重なり合う発光スペクトルの分解も、検出可能な蛍光色素の数を増加させることの中核をなす。検出器アレイを使用すると、複数の波長にわたる集合的な発光シグネチャに基づいて蛍光色素を識別して、検出可能な蛍光色素の数を増加させることができる。本質的に、蛍光信号全体が、回折格子又はプリズムのいずれかによって色に関して検出器のアレイ内に分散される。このように、発光スペクトル全体が検出器にわたって離散化される。スペクトルデコンボリューション（非混合（unmixing））を使用して、収集された全信号に対する既知の個別の蛍光色素スペクトルの寄与度を計算することができる。しかしながら、検出可能な蛍光色素の数を増加させるこの手法は、２つの主な限界を有する。
【0011】
分散素子／検出器アレイの連続的な線形の特徴によって、帯域幅を調整して蛍光色素スペクトルの真の性質を利用することができなくなっている。したがって、より広い帯域幅の識別は、長い波長の蛍光色素に有利であるが、圧縮されたスペクトルを有する短い波長の蛍光色素の細部を見落とす。加えて、他のレーザーからの散乱光が存在する場合には、この散乱光は、検出器のアレイによって不可避的に集光される。この散乱光は、検出器によって検出される蛍光信号を損なう。
【発明の概要】
【0012】
したがって、検出可能な蛍光色素の数を増加させて、サンプル内の蛍光色素標識された粒子をより良く分析するフローサイトメーターの更なる改良が必要とされている。
【0013】
本発明の実施の形態は、添付の特許請求の範囲によって要約される。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】フローサイトメーターシステムの検出モジュールのブロック図である。
【図2A】連続するチャネル再結像を有する画像アレイの概略図である。
【図2B】１つ置きのチャネル再結像を有する１ｆ画像アレイの概略図である。
【図3】モジュール式フローサイトメーターシステムの１６チャネル１ｆ画像アレイを含むコンパクト検出モジュールの概略図である。
【図4A】光ファイバーの直径にわたって異なる箇所から出射する蛍光性光の拡大図である。
【図4B】光信号を電気信号に変換する検出器の拡大図である。
【図5】１ｆ画像アレイの一部分の拡大図である。
【図6】１６チャネル１ｆ画像アレイ及び１６個の検出器チャネルを有するモジュール式フローサイトメーターシステムにおける検出モジュールの図である。
【図7A】一対の８チャネル１ｆ画像アレイ及び一対の８個の検出器チャネルを有するモジュール式フローサイトメーターシステムにおける検出モジュールの異なる図式図である。
【図7B】一対の８チャネル１ｆ画像アレイ及び一対の８個の検出器チャネルを有するモジュール式フローサイトメーターシステムにおける検出モジュールの異なる図式図である。
【図7C】一対の８チャネル１ｆ画像アレイ及び一対の８個の検出器チャネルを有するモジュール式フローサイトメーターシステムにおける検出モジュールの異なる図式図である。
【図8】球面マイクロミラーを有する１ｆ画像アレイの斜視図である。
【図10】凹面方形マイクロミラーを有する１ｆ画像アレイの斜視図である。
【図13】モジュール式フローサイトメトリーシステムにおける光学プレートアセンブリの上面図である。
【図14】フローサイトメーターシステムの基本概念図である。
【図15】フローサイトメーター上で実験を行う全体的な方法を示す図である。
【図16A】補正（compensation：コンペンセーション）のレベルを有する初期スピルオーバー行列又は基準行列を生成する単一染色（single stained：単染色）補正対照（control：コントロール）を用いたフローサイトメーターの較正プロセスの図である。
【図16B】サンプルをフローサイトメーターに通し、その結果、マルチ染色細胞又は粒子に起因して重なり合うスペクトルプロファイルを有する混合サンプルイベントベクトルを得る図である。
【図16C】イベントデータに関する逆行列（微調整を有する初期スピルオーバー行列及び／又は初期基準行列から求められる）を使用して、補正されたサンプルイベントベクトル又は非混合サンプルイベントベクトルを生成する処理の図である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
実施形態の以下の詳細な説明では、完全な理解を提供するために、非常に多くの具体的な詳細が説明される。しかしながら、これらの具体的な詳細がなくても実施形態を実施することができることが当業者には明らかであろう。その他の場合には、よく知られた方法、手順、構成要素、及び回路は、本発明の実施形態の態様を不必要に不明瞭にしないように詳細に説明されていない。
【0016】
本発明の実施形態は、コンパクト高度多重化検出モジュールを有するフローサイトメーターのための方法、装置及びシステムを含む。
【0017】
全体的概観
従来のフローサイトメーターと比較して増加した数の検出器及び検出器における最小画像サイズを有する、蛍光のコンパクト検出モジュールを有するフローサイトメーターが開示される。各検出器モジュールには、少なくとも１つのレーザーが提供される。複数のレーザーを複数の検出器アレイによってコンパクト形式でサポートすることができる。検出器の数の増加は、光が検出チェーンを通って送信されるときに、検出器アレイ内の漸増的な収差の慎重な制御によって可能になる。コンパクト検出モジュールのコンパクトなサイズは、マイクロミラーとフィルターとの間の距離の削減及び慎重な下方スケーリングによって達成され、それによって、結像アレイにおけるマイクロミラー及びフィルターの並び又はチェーンに沿った画像劣化が最小になる。
従来のフローサイトメーターと比較して増加した数の検出器及び検出器における最小画像サイズを有する、蛍光のコンパクト検出モジュールを有するフローサイトメーターが開示される。各検出器モジュールには、少なくとも１つのレーザーが提供される。複数のレーザーを複数の検出器アレイによってコンパクト形式でサポートすることができる。検出器の数の増加は、光が検出チェーンを通って送信されるときに、検出器アレイ内の漸増的な収差の慎重な制御によって可能になる。コンパクト検出モジュールのコンパクトなサイズは、マイクロミラーとフィルターとの間の距離の削減及び慎重な下方スケーリングによって達成され、それによって、結像アレイにおけるマイクロミラー及びフィルターの並び又はチェーンに沿った画像劣化が最小になる。
【0018】
従来の限界は、複数の個々の検出器とフィルター帯域幅の調整可能な推移とを有する光学システムの使用によって克服することができる。光学システムは、スペクトル選点（spectral collocation point）の集中が、フローサイトメーターによって分析される粒子をマーキングするのに使用される長波長染料及び短波長染料の双方のスペクトルを最良に分解することを可能にする。励起粒子からの蛍光は、高い開口数（ＮＡ）を有する対物レンズによってマルチモードファイバー内に結像される。マルチモードファイバーから出射する広帯域蛍光はコリメートされ、その後、複数の検出器内に結合される（複数の検出器上に結像される）。マルチモードファイバーから出射する広帯域蛍光性光のコリメーションは難題である。
【0019】
フローサイトメーターの検出モジュール
図１は、フローサイトメーターの検出モジュール１００の一部分の機能ブロック図を示している。改良型フローサイトメーターは複数の検出モジュールを含むことができる。検出モジュール１００は波長分波システムである。検出モジュール１００は、画像アレイ１０６において光ファイバー１０２からの蛍光性光出力１０１Ａを連続的に反射して再結像する。画像アレイ１０６は、機械式マウントによって空中に懸架された複数の反射ミラー１１２Ａ～１１２Ｅ及び対応する複数のロングパスダイクロイックフィルター１１０Ａ～１１０Ｅを含む機械式画像アレイである。一般に、ダイクロイックフィルターは、或る範囲の波長の色光の光を選択的に通過させるとともに他の波長の色光を反射するのに使用される精密なカラーフィルターである。或いは、複数のロングパスダイクロイックフィルター１１０Ａ～１１０Ｅは、帯域通過フィルターとすることができる。
図１は、フローサイトメーターの検出モジュール１００の一部分の機能ブロック図を示している。改良型フローサイトメーターは複数の検出モジュールを含むことができる。検出モジュール１００は波長分波システムである。検出モジュール１００は、画像アレイ１０６において光ファイバー１０２からの蛍光性光出力１０１Ａを連続的に反射して再結像する。画像アレイ１０６は、機械式マウントによって空中に懸架された複数の反射ミラー１１２Ａ～１１２Ｅ及び対応する複数のロングパスダイクロイックフィルター１１０Ａ～１１０Ｅを含む機械式画像アレイである。一般に、ダイクロイックフィルターは、或る範囲の波長の色光の光を選択的に通過させるとともに他の波長の色光を反射するのに使用される精密なカラーフィルターである。或いは、複数のロングパスダイクロイックフィルター１１０Ａ～１１０Ｅは、帯域通過フィルターとすることができる。
【0020】
画像アレイ１０６は、この画像アレイの端部におけるファイバースポットの光学的品質を維持しながら、光のファイバースポットをＮ回反射して再結像することが可能である（ここで、Ｎは２よりも大きい）。再結像は、ダイクロイックフィルター１１０Ａ～１１０Ｅのそれぞれの表面等の表面において、或る収差を有する元の画像、すなわち、再画像（reimage：復元画像）を再現するという機能である。検出モジュール１００は、光がそれぞれと通信する複数の対物レンズ１１６Ａ～１１６Ｅ及び複数の検出器１１８Ａ～１１８Ｅをそれぞれ備える複数の検出器チャネル１１３Ａ～１１３Ｅを更に含む。任意選択で、複数の検出器チャネル１１３Ａ～１１３Ｅは、様々な所望の波長範囲が複数の検出器によって検出されることをそれぞれ確認する複数の帯域通過フィルター１１４Ａ～１１４Ｅを更に含むことができる。
【0021】
画像アレイ１０６において、第１（first：最初）のミラー１１０Ａ上に入射する光１０１Ａは、ミラーによって反射され、反射光１０３Ａになる。第１のミラー１１０Ａからの反射光１０３Ａは、空気中を通って第１のロングパスダイクロイックフィルター１１２Ａ上に入射する。第１のミラー１１０Ａからの光１０３Ａは、ロングパスダイクロイックフィルター１１２Ａによって連続光部分１０１Ｂと通過光部分又は透過光部分１０５Ａとに分割される。連続光部分１０１Ｂは、空気中を通って、一連のミラーにおける次のミラーであるミラー１１０Ｂ上に入射する。透過光部分１０５Ａは、第１の検出器チャネル１１３Ａの第１の帯域通過フィルター１１４Ａ内に結合される。透過光部分１０５Ａは、帯域通過フィルター１１４Ａによってクリーンアップされ、その後、対物レンズ１１６Ａによって光学検出器１１８Ａ内に結合される。このプロセスは、画像アレイ１０６内の各ステージ（各検出器チャネル）について繰り返される。
【0022】
画像アレイ１０６は、各ロングパスダイクロイックフィルター上で再結像を５回行う５つのステージを含む。それでも、より多くの数の検出器を含むことが望ましい。しかしながら、６回以降の再結像では、反射ミラーを通したビーム歪が、最後のダイクロイックフィルターにおける画質を非常に悪化させる程蓄積する可能性がある。画像アレイ１０６におけるミラーとダイクロイックフィルターとの間にジグザグ構成を、より多くの数の検出器を用いて適切に動作させるためには、光路に沿った画像劣化を最小にすることが望ましい。
【0023】
検出モジュールにおける画像劣化を最小にすることは、２つのメカニズムを使用して達成することができる。画像アレイにおける各反射ミラーの曲げ力（bending power）が（例えば、２分の１、すなわち、半分の曲げ力に）低減される場合には、画像劣化を低減することができる。光ビームが画像アレイにおいて再結像される回数が（例えば、２分の１、すなわち、半分の回数に）低減される場合には、画像劣化を更に低減することができる。
【0024】
ミラーにおける曲げ角度を削減することによって、全てのタイプの収差が低減される。収差は曲げ角度とともに非線形に増加するので、「高速焦点ミラー」から「低速焦点ミラー」に切り替えることによって得られる改善は、２×よりも大幅に良好であり、これによって、更に多くの反射を通して画質の保持が可能になる。検出器チェーンにおける最後の検出器上に入射する画質は、光ビームが画像アレイにおいて再結像される回数を削減することによって更に改善することができる。各検出器チャネルの各ダイクロイックフィルターにおいて再結像する代わりに、１つおきのダイクロイックフィルター及び検出器チャネル（例えば、奇数の検出器チャネル）上で入射光を再結像することができる。
【0025】
次に、図２Ａ及び図２Ｂを参照して、異なる曲率半径を有するマイクロミラーを備える透明ブロックを使用することによって画質の改善をもたらす画像アレイ１０６Ａ及び１０６Ｂを説明する。一般に、画像アレイは、検出チャネルごとに、マイクロミラーのアレイと、帯域通過フィルター及び／又はダイクロイックフィルターの対向するアレイとからなる。各場合において、一方の側におけるマイクロミラーＭ（ｎ）、Ｍ（ｎ）’の直列のチェーン又は並びと、対向する側におけるダイクロイックフィルターＤ（ｎ）の直列のチェーン又は並びとの間の透明ブロックの厚さＬは同じである。一方、マイクロミラーＭ（ｎ）及びＭ（ｎ）’の焦点距離は、図２Ａの画像アレイ１０６Ａ及び図２Ｂの画像アレイ１０６Ｂにおいて異なる。
【0026】
図２ＢにおけるマイクロミラーＭ（ｎ）’の焦点距離ｆはＬである一方、図２ＡにおけるマイクロミラーＭ（ｎ）の焦点距離ｆはＬの半分である。画像アレイ１０６ＢにおけるマイクロミラーＭ（ｎ）’の焦点距離が大きいほど、ミラーの直列チェーンに沿った結像における曲げ角度及び収差は削減される。さらに、画像アレイ１０６Ｂは、再結像がダイクロイックフィルターＤ（３）、Ｄ（５）、Ｄ（７）～Ｄ（ｎ）等の奇数のダイクロイックフィルター上で行われるように、透明ブロックの厚さＬ及びマイクロミラーＭ（ｎ）’の焦点距離を有する１ｆ画像アレイである。
【0027】
図２Ａ及び図２Ｂにおいて、スポットＡ（１）～スポットＡ（ｎ）は、それぞれダイクロイックフィルターＤ（１）～Ｄ（Ｎ）上のスポットサイズ（面積）である。スポットＡ（０）は、蛍光性光が各アレイ１０６Ａ及び１０６Ｂ内に入力されるマルチモードファイバーのファイバー開口である。図２Ａ及び図２Ｂにおいて、ファイバー開口は、２つの設計の画像共役（image conjugation）特性を示すために無限小に小さいとみなすことができる。
【0028】
図２Ａは、複数のマイクロミラーＭ（１）～Ｍ（Ｎ）と複数のロングパスダイクロイックフィルターＤ（１）～Ｄ（Ｎ）とを有する画像アレイ１０６Ａを示している。ここで、Ｎは、検出器チャネルの数を表す１よりも大きな整数値である。マイクロミラーＭ（１）による反射を通して、ダイクロイックフィルターＤ（１）におけるスポットＡ（１）に合焦される光は、ダイクロイックフィルターＤ（２）におけるスポットＡ（２）に光を合焦させるようにマイクロミラーＭ（１）の反射を通して再結像される。これは、直列のチェーン又は並びに沿ったマイクロミラーＭ（２）～Ｍ（Ｎ）のそれぞれによって繰り返される。画像アレイ１０６Ａは２ｆ画像アレイである。
【0029】
図２Ｂは、複数のマイクロミラーＭ（１）’～Ｍ（Ｎ）’と複数のロングパスダイクロイックフィルターＤ（１）～Ｄ（Ｎ）とを有する画像アレイ１０６Ｂの１ｆ設計を示している。マイクロミラーＭ（１）’～Ｍ（Ｎ）’は、マイクロミラーＭ（１）～Ｍ（Ｎ）の曲率半径と異なる曲率半径を有する。１ｆ画像アレイ１０６Ｂは、検出器（例えば、図１における検出器１１８Ａ～１１８Ｅ）において、２ｆ画像アレイ１０６Ａの画質の改善を上回る画質の改善をもたらす。
【0030】
１ｆ画像アレイ１０６ＢにおけるマイクロミラーＭ（１）’～Ｍ（Ｎ）’のチェーンは、望遠鏡光学機器の特性によってチェーンに沿って画像を中継するように設計される。例えば、ダイクロイックフィルターＤ（１）におけるスポットＡ（１）に合焦される光は、マイクロミラーＭ（１）’及びＭ（２）’の望遠鏡効果によってダイクロイックフィルターＤ（３）におけるスポットＡ（３）に結像される。偶数のスポットであるスポットＡ（２）は、コリメート空間における中間スポットである。
【0031】
複数のロングパスダイクロイックフィルターＤ（１）～Ｄ（Ｎ）は、制限された波長範囲の光が通過することを保証するために、代替的に、通過帯域光学フィルター又は帯域通過光学フィルターとすることもできるし、ダイクロイック光学フィルター及び帯域通過光学フィルターの双方を互いに組み合わせて含むこともできる。ダイクロイック光学フィルターは、薄膜干渉の原理を使用し、干渉フィルターと呼ぶこともできる。各チャネルについて、帯域通過光学フィルター又は通過帯域光学フィルターは、異なる選択範囲の光の波長（通過帯域）を各検出器に渡し、残りの光波長を反射して、マイクロミラーアレイにおけるマイクロミラーに戻すように調節される。
【0032】
コンパクトな検出器モジュールを提供するために、画像アレイ１０６Ｂは、図８及び図１０を参照して更に説明されるような固体透明材料から形成される。１ｆ画像アレイに使用される透明結像ブロックの固体透明材料は、例えば、ミラー及びダイクロイックフィルターがこの透明材料の内部又は上に形成された透明なガラス又は透明なプラスチックとすることができる。
【0033】
１ｆ画像アレイ１０６Ｂの設計及び２ｆ画像アレイ１０６Ａの設計は、固体透明材料の同じ厚さ、同じピッチ及び同じ入射角の条件の下で比較することができる。２ｆ画像アレイ１０６Ａ及び１ｆ画像アレイ１０６Ｂにおける隣接するマイクロミラー間の経路距離はほぼ同じである。この場合に、経路距離は、材料の屈折率が考慮される従来の経路長ではなく、物理的な距離である。しかしながら、２ｆ画像アレイ１０６Ａにおけるマイクロミラーの焦点距離は、１ｆ画像アレイ１０６Ｂにおけるマイクロミラーの焦点距離よりも短い（半分である）。言い換えると、１ｆ画像アレイ１０６Ｂにおけるマイクロミラーの実際の焦点距離は、マイクロミラーの異なる曲率半径に起因して、２ｆ画像アレイ１０６Ａにおけるマイクロミラーの焦点距離の２倍である。焦点距離が長いほど、各反射における曲げ力は低減され、これによって、マイクロミラー反射においてもたらされる収差は最小にされる。したがって、１ｆ画像アレイ１０６Ｂにおける収差は、２ｆ画像アレイ１０６Ａの収差よりも改善される。
【0034】
２ｆ画像アレイシステム１０６Ａでは、ファイバー開口Ａ（０）は、ダイクロイックフィルターＤ（１）におけるスポットＡ（１）に結像される。スポットＡ（２）における画像は、マイクロミラーＭ（１）の反射を通したスポットＡ（１）の再結像である。アレイ１０６Ａにおけるジグザグ光路の通過を続けると、各ダイクロイックフィルターＤ（ｎ）における各スポットＡ（ｎ）は、次のマイクロミラーＭ（ｎ）によって、次のダイクロイックフィルターＤ（ｎ＋１）における次のスポットＡ（ｎ＋１）に結像される。この構成では、スポットＡ（ｎ）とマイクロミラーＭ（ｎ）との間の経路距離は、マイクロミラーＭ（ｎ）の焦点距離の２倍である透明ブロックの厚さＬである。
【0035】
１ｆ画像アレイシステム１０６Ｂでは、ファイバー開口Ａ（０）からの光は、入力チャネルによってダイクロイックフィルターＤ（１）におけるスポットＡ（１）に結像される。画像アレイシステム１０６Ｂでは、マイクロミラーＭ（１）’からマイクロミラーＭ（２）’への光路が１に等しい倍率を有する望遠鏡と等価なものを形成すると考えることができる。そのような場合には、スポットＡ（１）は、マイクロミラーＭ（１）’及びＭ（２）’の望遠鏡を通ってスポットＡ（３）に結像され、スポットＡ（２）はコリメート空間における中間スポットである。隣接するマイクロミラーＭ（３）’及びＭ（４）’は、スポットＡ（３）をスポットＡ（５）に再結像する別の望遠鏡を形成する。結像アレイ１０６Ｂにおけるジグザグ経路を進み続けると、奇数のスポットＡ（１）、Ａ（３）、Ａ（５）．．．Ａ（２ｎ＋１）は全て互いに共役され、偶数のスポットＡ（２）、Ａ（４）、Ａ（６）、．．．Ａ（２ｎ）はコリメート空間における中間スポットである。この構成では、スポットＡ（ｎ）とマイクロミラーＭ（ｎ）’との間の経路距離は、マイクロミラーＭ（ｎ）’の１つの焦点距離である透明ブロックの厚さＬである。
【0036】
フィルター上の各スポットは光線束によって形成される。光線束の角度分布は、結像システムの結像アレイへの入力マルチモードファイバー１０２及び入力チャネルの開口数（ＮＡ）によって決まる。スポットＡ（１）における光の円錐角は、マルチモードファイバー１０２の開口数に比例する。ｍを１よりも大きい数とした場合に、ファイバー開口Ａ（０）からスポットＡ（１）への画像倍率ｍが１対ｍの比である場合には、スポットＡ（１）における円錐角は、ファイバー開口Ａ（０）における円錐角のｍ分の１小さい。
【0037】
図２Ａの２ｆ画像アレイシステム１０６Ａでは、任意のスポットＡ（ｎ）から隣接するスポットＡ（ｎ＋１）への画像倍率は、ｎのどの値についても１に等しい。収差を無視すると、画像アレイシステム１０６ＡのダイクロイックフィルターＤ（１）～Ｄ（Ｎ＋１）における光線の円錐角は、全ての検出器チャネルについて同じである。
【0038】
次に図２Ｂを参照すると、ダイクロイックフィルターＤ（１）とマイクロミラーＭ（１）’との間の距離はＬである。チャネルの総数Ｎが、１ｆ画像アレイ１０６Ｂにおいて偶数である場合には、スポットＡ（１）は、（１×望遠鏡を考慮すると）マイクロミラーＭ（１）’及びＭ（２）’を通ってスポットＡ（３）に結像され、ダイクロイックフィルターＤ（２）におけるスポットＡ（２）はコリメート空間にある。スポットＡ（２）におけるコリメートされた光の一部分は、ダイクロイックフィルターＤ（２）によってマイクロミラーＭ（２）’に向けて反射される。
【0039】
したがって、１ｆ画像アレイ１０６Ｂは、スポットＡ（１）、Ａ（３）、．．．Ａ（２ｋ－１）．．．Ａ（Ｎ－１）における奇数の検出器チャネルと、スポットＡ（２）、Ａ（４）、．．．Ａ（２ｋ）、．．．Ａ（Ｎ）における偶数の検出器チャネルとを有する。ここで、１≦ｋ≦（Ｎ／２）である。スポットＡ（１）は、マイクロミラーＭ（１）’の前側焦点にあり、隣接するマイクロミラー間の経路距離は、焦点距離の２倍であるので、全ての奇数のスポットＡ（１）、Ａ（３）、Ａ（５）．．．Ａ（２ｎ＋１）は、（奇数のスポットへの光線収束によって図２Ｂに示すように）ファイバー開口の画像であり、全ての偶数のスポットＡ（２）、Ａ（４）、Ａ（６）、．．．Ａ（２ｎ）は、（偶数のスポットにおける平行光線によって図２Ｂに示すように）コリメート空間にある。したがって、図５に示すように、奇数の検出器チャネルの奇数のスポットの円錐角（奇数の円錐角ＣＡＯ）は、偶数の検出器チャネルの偶数のスポットの円錐角（偶数の円錐角ＣＡＥ）と異なる。
【0040】
１ｆ画像アレイ１０６Ｂでは、各光学ダイクロイックフィルターＤ（１）～Ｄ（Ｎ）の中心波長及び通過帯域幅は互いに異なる。各光学ダイクロイックフィルターの中心波長及び通過帯域幅は、染料の蛍光スペクトルの最適化されたサンプリングが大量の異なる染料の非混合をより良く正確に行うように設計される。例えば、４００ｎｍ～８００ｎｍの光波長の蛍光スペクトル及び１６個のチャネル検出モジュールを仮定すると、２５ｎｍの光波長帯域幅をそれぞれ分析することができる。例えば、第１の検出器チャネル及び第１のダイクロイックフィルターＤ（１）は、４１２．５ｎｍの中心波長を有する４００ｎｍ～４２５ｎｍの光波長を帯域通過させ、分析することができる。４００ｎｍ～４２５ｎｍの外側にある波長は、実質的にフィルタリング除去され、第１の検出器チャネルにおける第１の検出器には渡らない。第２の検出器チャネル及び第２のダイクロイックフィルターＤ（２）は、４３７．５ｎｍの中心波長を有する４２５ｎｍ～４５０ｎｍの光波長を帯域通過させ、分析することができ、これ以降の２５ｎｍずつ増加する帯域幅についても、これ以降のそれぞれの検出器チャネル及びダイクロイックフィルターが帯域通過させ、分析することができる。最後の、すなわち、第１６の検出器チャネル及び第１６のダイクロイックフィルターＤ（１６）は、７８７．５ｎｍの中心波長を有する７７５ｎｍ～８００ｎｍの光波長を帯域通過させ、分析することができる。
【0041】
１ｆ画像アレイ１０６Ｂの特徴は、２ｆ画像アレイ１０６Ａよりも多くの数の検出器内に初期光信号を伝播させることを可能にする。１ｆ画像アレイ１０６Ｂは、各ミラー反射における曲げ力を低減することによって軸外収差を低減する。一方、奇数チャネル及び偶数チャネルにおけるダイクロイックフィルターにおいて、奇数の円錐角ＣＡＯが偶数の円錐角ＣＡＥと異なる場合には、ファイバー開口Ａ（０）からダイクロイックフィルターＤ（１）におけるスポットＡ（１）への入力ステージにおける最適な倍率ｍを求める必要がある。所与のファイバー開口数（ＮＡ）及び開口直径について、ファイバー開口Ａ（０）からダイクロイックフィルターＤ（１）におけるスポットＡ（１）への倍率ｍは、１ｆ画像アレイ１０６Ｂにおける奇数の検出器チャネル及び偶数の検出器チャネルの双方について最適化される。
【0042】
スペクトル分解の観点から、入射スポットの円錐角が増加するにつれて、ダイクロイックフィルターの性能は低下する。１ｆ画像アレイ１０６Ｂでは、奇数チャネルにおけるスポットの円錐角は、偶数チャネルにおけるスポットの円錐角と異なる。基本的に、奇数チャネルにおける円錐角は、マルチモードファイバーの開口数（ＮＡ）と、ファイバー開口Ａ（０）からダイクロイックフィルターＤ（１）におけるスポットＡ（１）への倍率因子ｍとによって決まる。対照的に、偶数チャネルの円錐角は、奇数チャネルにおけるスポットのスポット直径によって決まる。
【0043】
入力チャネルにおいて、ファイバーにおける開口Ａ（０）からダイクロイックフィルターＤ（１）におけるスポットＡ（１）への画像倍率がｍであると仮定する。偶数の検出器チャネル（ダイクロイックフィルターＤ（２ｋ））において、円錐角は倍率ｍに比例する。一方、奇数の検出器チャネル（ダイクロイックフィルターＤ（２ｋ－１））では、円錐角は倍率ｍに反比例する。ファイバー開口Ａ（０）からスポットＡ（１）への倍率が大きいほど、奇数の検出器チャネル（ダイクロイックフィルターＤ（２ｋ－１））における円錐角は小さくなるが、偶数の検出器チャネル（ダイクロイックフィルターＤ（２ｋ））における円錐角は大きくなる。ＮＡ＝０．１２、開口直径６００μｍ、及びマイクロミラー（フィルター）ピッチ５．５ｍｍであるマルチモードファイバーを有する１つの実施形態例では、推奨倍率ｍが約２であるようにモデル化を行った。明らかに、異なる入力を用いて他の倍率ｍを求めることができ、したがって、本明細書に開示されている実施形態は、２×倍率に制限されるものではない。１ｆ画像アレイ１０６Ｂについて提示した例では、開口数（ＮＡ）及び再結像の数の双方が２分の１に削減され、これによって、同じ長さの並びに沿って２ｆ画像アレイ１０６Ａよりも少なくとも４倍（４×）多くの検出器が可能になる。
【0044】
図３、図４Ａ及び図４Ｂ、並びに図５は、１ｆ画像アレイ１０６Ｂと、ＮＡ＝０．１２、開口直径６００μｍ、マイクロミラー（フィルター）ピッチ５．５ｍｍであるファイバーを有する一実施形態の入力値例と、２×の推奨倍率とを有するコンパクト検出モジュールのシミュレーション結果のグラフを示している。図３、図４Ａ及び図４Ｂ、並びに図５に示す光線の異なる色は、異なる位置にある光が検出器モジュールをどのように通過するのかを示すための明瞭化を目的にしたものにすぎない。
【0045】
図３は、検出システム内に蛍光性光を発射する光ファイバー１０２の一方の端部を示している。光ファイバー１０２の反対側端部（図示せず）の近くでは、高いＮＡを有する集光対物レンズを使用して、開口から蛍光性光を集光し、この光を光ファイバーの反対側端部内に結合することができる。光ファイバー１０２は、その場合に、対物レンズから光を集光し、この光を図３に示す端部に誘導する。図３に示す端部の近くでは、システムは、蛍光性光を検出器アレイに発射するために、自由空間内への開口数を下げるファイバー開口数変換器を含むことができる。
【0046】
次に図３を参照すると、コンパクト検出モジュール３００における倍率ｍは、入力ステージ３０１によって達成される。入力ステージ３０１は、コリメーティングレンズ３０２、遮断フィルター３０３、及び合焦レンズ３０４を含む。倍率ｍは、コリメーティングレンズ３０２及び合焦レンズ３０４の焦点距離の比を調整することによって達成される。例えば、倍率を２に設定するには（ｍ＝２）、合焦レンズ３０４の焦点距離は、コリメーティングレンズ３０２の焦点距離の２倍である。入力チャネル３０１は、第１のダイクロイックフィルターＤ（１）に到達する前に、画像アレイ１０６Ｂに透明ブロックの入力部分（例えば、ブロックの厚い部分であるウェッジ、図８参照）を更に含むものと考えることができる。
【0047】
コリメーティングレンズ３０２は、ファイバー１０２から発射された光を受光し、この光をコリメートする。コリメートされた光は、遮断フィルター３０３を通過し、合焦レンズ３０４内に入力する。遮断フィルター３０３は、光ファイバー１０２の反対側端部の近くの集光光学機器内に散乱されるレーザー光をクリーンアウトするのに使用される。蛍光色素に関連した光の蛍光性スペクトルは、遮断フィルター３０３を通過し、合焦レンズ３０４内に入る。合焦レンズ３０４は、光の蛍光性スペクトルを画像アレイ１０６Ｂにおける第１のダイクロイックフィルターＤ（１）上に合焦させて、スポットＡ（１）に画像を形成する。スポットＡ（１）における画像は、サイズ（例えば、直径及び面積）がファイバーの開口Ａ（０）におけるサイズからｍ倍に拡大される。ファイバー１０２の端部と画像アレイ１０６Ｂとの間のレンズ３０２、３０４の位置を調整することができる。
【0048】
コンパクト検出モジュール３００は、１６チャネル１ｆ画像アレイ１０６Ｂと、この画像アレイ１０６Ｂと通信する１６個の検出器チャネル３１３Ａ～３１３Ｐとを更に含む（例えば、図６参照）。代替の実施形態では、一対の８チャネル１ｆ画像アレイ（例えば、図７Ａ～図７Ｃ参照）を平行に使用して、各コンパクト画像アレイの結像要件を緩和することができる。フローサイトメーターでは、図１３に関して記載された検出器モジュールを用いて説明するように、これらのコンパクト画像アレイの２つ以上（例えば、３つ）を使用して検出器チャネルの数を増大させ、１６個よりも多くすることができる（例えば、４０個の検出チャネルの場合には１６の３倍）。
【0049】
画像アレイ１０６Ｂは、固体透明ブロック材料から形成される。１６チャネル１ｆ画像アレイ１０６Ｂは、透明ブロックの一方の側に１６個のダイクロイックフィルターＤ（１）～Ｄ（１６）と、反対側に１５個のミラーＭ（１）～Ｍ（１５）とを含む。画像アレイは、最後の検出器チャネル３１３Ｐの後に続くミラーを必要としない。その上、最後のフィルターＤ（１６）３１４は、ダイクロイックフィルターでないものとすることができ、代わりに、帯域通過フィルターを使用することができる。帯域通過フィルターの場合には、入射光を別のミラー又はフィルターに更に反射する必要がない。
【0050】
検出器のアレイにおける各検出器チャネル３１３Ａ～３１３Ｐ（検出器チャネル３１３と総称する）は、合焦レンズ３１６、及び検出器３１８（一例を図３に示す）を含む。検出器３１８は、薄い外郭（ＴＯ：thin outline）のカンパッケージ３２０内にパッケージされ、合焦レンズ３１６がこのＴＯカンパッケージに結合されるか又はＴＯカンパッケージ内に統合される。合焦レンズ３１６は、フィルターを通過する蛍光の光を検出器３１８の小さい面積サイズ上に合焦させる。
【0051】
次に図４Ａを参照すると、画像チャンバー（image chamber）から捕捉された蛍光性光信号を検出器アレイに搬送するのに使用される光ファイバー１０２は、マルチモード光ファイバーである。光は、例えば、マルチモードファイバーの端面の、ロケーションＸ１～Ｘ５等のファイバーの直径にわたる様々な（全てではない）ロケーションから出射する。図３に示す入力チャネルにおけるレンズ３０３、３０４は、開口Ａ（０）内の光を第１のダイクロイックフィルターＤ（１）上のスポットＡ（１）に合焦させる。スポットＡ（０）からスポットＡ（１）へ２倍（２×）の倍率があるので、開口Ａ（０）におけるスポットサイズは、スポットＡ（１）におけるスポットサイズよりも小さい。図４Ａに示す開口内の異なるロケーションＸ１～Ｘ５から発する光線の異なる色は、異なる位置にある光が検出器モジュールをどのように通過するのかを示すための明瞭化を目的にしたものにすぎない。図４Ａに示すように、光軸４０２は、光ファイバー１０２の端部の円形中心から外部に延びる。光は、光軸４０２に対して発射円錐角（ＣＡ：cone angle）４０４で光ファイバー１０２の端部の外部に発射される。
【0052】
図３は、画像アレイ１０６Ｂと、光ビームにおける異なるロケーションからの光がミラー及びダイクロイックフィルターの複数の反射を通してどのようにして交互に結像及びコリメートされるのかとのシミュレーション結果を示している。これらの結果は、反射する光の全てを示しているが、任意の特定の位置におけるダイクロイックフィルターＤ（ｎ）は異なり、それらのそれぞれの通過帯域に従って光信号の伝送を可能にする（図３では、最後の検出器チャネル３１３Ｐにおけるもののみを示す）。
【0053】
次に図３及び図４Ｂを参照すると、各検出器チャネル３１３において、ダイクロイックフィルターＤ（ｎ）を通過する光信号の所望の波長範囲は、レンズ３１６を通して集光することができ、小開口感光性検出器３１８によって検出することができる。更なる帯域通過フィルター３１４を各検出器チャネルにおいて代わりに又は更に使用することができる。ダイクロイックフィルターＤ（ｎ）において光の他の波長が存在する場合には、それらの波長は、マイクロミラーのチェーン又は並びに沿って次のマイクロミラーＭ（ｎ）に反射される。ダイクロイックフィルターＤ（ｎ）の並び又はチェーンは、異なる範囲の光波長を検出器チャネル３１３Ａ～３１３Ｐのチェーンに分波する。
【0054】
図５の拡大図は、光学光ビームがマイクロミラー及びダイクロイックフィルターの反射表面を通ってどのようにして交互に結像及びコリメートされるのかのシミュレーション結果を示している。奇数番号のダイクロイックフィルター（例えば、図５に示すダイクロイックフィルターＤ（７）、Ｄ（９）、及びＤ（１１））上では、スポットはファイバー開口の画像である。すなわち、ファイバー開口から発射された光は、奇数番号のダイクロイックフィルターの各フィルター表面に結像される。偶数番号のダイクロイックフィルター（例えば、図５に示すダイクロイックフィルターＤ（８）、Ｄ（１０）、及びＤ（１２））上では、偶数番号のスポット（例えば、図５に示すスポットＡ（８）、Ａ（１０）、及びＡ（１２））はコリメート空間にあり、この空間では、ファイバー開口における或る箇所から発光する光線は、コリメートされたビームになる。各偶数番号のダイクロイックフィルターにおけるコリメート空間内のビーム方向は、ファイバー開口からの箇所が異なれば僅かに異なる。
【0055】
フローサイトメーターでは、１つ以上の線形１６チャネルコンパクト波長検出モジュールを使用して、粒子に関連した光の蛍光性信号を検出することができる。これに代えて又はこれと併せて、１つ以上のデュアル８チャネルコンパクト波長検出モジュールをフローサイトメーターに使用して、粒子に関連した光の蛍光性信号を検出することができる。
【0056】
図６及び図７Ａ～図７Ｃは、図２Ｂに示す１ｆ画像アレイ１０６Ｂの機能を有するコンパクト波長検出モジュールの実施形態を示している。図６は、線形１６チャネルコンパクト波長検出モジュール６００を示している。図７Ａ～図７Ｃは、デュアル８チャネルコンパクト波長検出モジュール７００を示している。
【0057】
次に図６を参照すると、線形１６チャネルコンパクト波長検出モジュール６００は、基部６１０に取り付けられた入力ステージ（ヘッド）６０１及び検出モジュール６１４を含む。光は、光ファイバー１０２によって入力ステージ（ヘッド）６０１内に結合される。入力ステージ（ヘッド）６０１は、光学台に取り付けられたコリメーティングレンズ６０２、ロングパスフィルター６０３、クリーンアップ光学ブロッカー６０４、及び合焦レンズ６０５を含む。入力ステージ（ヘッド）６０１は、第１のダイクロイックフィルター上の初期スポットサイズ画像Ａ（１）の倍率ｍをセットアップする。
【0058】
入力ステージ６０１から、光は検出モジュール６１４内に結合される。入力ステージ（ヘッド）６０１の端部は、合焦レンズ６０５からの光を受光する透明ウェッジ６０７に結合される。入力ステージ（ヘッド）６０１及び検出モジュール６１４は、それらの整列配置を互いに維持するフローサイトメーターのシャーシ又は基部６１０に結合される。
【0059】
検出モジュール６１４は、１ｆ画像アレイ６０８及び検出器／レンズアレイ６１１を含む。画像アレイ６０８は、図２Ｂ及び図５の画像アレイ１０６Ｂの一実施形態である。画像アレイ６０８は、一方の側にウェッジ６０７及び１５個のマイクロミラー６１２を含む透明ブロック６８０（例えば、図８のブロック８０６及び図１０のブロック１００６を参照）を含む。透明ブロック６８０の反対側には、１６個のダイクロイックフィルター６０９がある。複数の検出器３１３Ａ～３１３Ｐの一実施形態である検出器／レンズアレイ６１１は、分波された光をフォト検出器内に合焦させるレンズ（例えば、図３のレンズ３１６）をそれぞれ有する複数のフォト検出器Ｄ１～Ｄ１６（例えば、図３の検出器３１８）を含む。
【0060】
入力ステージ６０１によって画像アレイ６０８内に結合される光は、検出器／レンズアレイ６１１の検出器Ｄ１～Ｄ１６内に分波される波長である。１６チャネル検出モジュールは、或る範囲の波長（例えば、４００ｎｍ～８００ｎｍの波長）を分析する。
【0061】
試験台により良く適合する異なる設置面積を提供するとともに並列処理を提供するために、線形１６チャネルコンパクト波長検出モジュール６００の代わりにデュアル８チャネルコンパクト波長検出モジュールを実施することができる。
【0062】
次に図７Ａを参照すると、一対の８チャネルコンパクト波長検出モジュール７１４、７１５を有するデュアル検出モジュール７００の上面図が示されている。コンパクト波長検出モジュール７００は、第１の８チャネル検出モジュール７１４及び第２の８チャネル検出モジュール７１５と通信する入力ステージ（ヘッド）７０１を含む。これらの全ては、基部７１０に位置合わせされて取り付けられている。第１の８チャネル検出モジュール７１４は、第１の範囲の波長（例えば、６５０ｎｍ～８００ｎｍ－赤色波長）を分波して並列に分析する。第２の８チャネル検出モジュール７１５は、第２の範囲の波長（例えば、４００ｎｍ～６５０ｎｍ－青色波長）を分波して並列に分析する。
【0063】
光ファイバー１０２から発射された光は、入力ステージ（ヘッド）７０１内に結合される。ファイバー１０２からの光は、コリメーティングレンズ７０２を通過してロングパスダイクロイックフィルター７０３に入る。ロングパスダイクロイックフィルター７０３は、レーザー励起波長（例えば、４００ｎｍ未満）における光を４５度の角度で散乱検出器（図示せず）に反射する。側方散乱（ＳＳＣ：side scatter）光は、蛍光性光について説明したものと同様のボールレンズを有する小開口検出器上に合焦させることができる。蛍光性光スペクトル（例えば、４００ｎｍ～８００ｎｍ）における蛍光性光は、ロングパスフィルター７０３を通過して第２のクリーンアップフィルター７０４に入る。クリーンアップフィルター７０４は、励起レーザー光が分波検出モジュール７１４及び７１５に到達しないことを確保する。
【0064】
クリーンアップフィルター７０４の後、蛍光性光は、ロングパスフィルター７０５によって長波長帯域と短波長帯域とに分離される。長波長光（例えば、赤色－６５０ｎｍ～８００ｎｍ）は、ロングパスフィルター７０５を通過し、コリメーティング／合焦レンズ７０６によって第１の検出モジュール７１４内に合焦される。通過して合焦レンズ７０６によって合焦された光の長波長部分は、第１の検出モジュール７１４によって分波される。短波長光帯域（例えば、青色－４００ｎｍ～６５０ｎｍ）は、ロングパスフィルター７０５によって、コリメーティング／合焦レンズ７１３に入る角度で反射される。コリメーティング／合焦レンズ７１３は、短波長帯域の光を第２の検出モジュール７１５内に合焦させる。ロングパスフィルター７０５によって反射された短波長部分は、第２の検出モジュール７１５によって分波される。代替的に、フィルター７０５は、ショートパスフィルターとすることができ、短波長光が、このフィルターを通過し、第１の検出モジュール７１４によって分波される一方、長波長光は、このフィルターによって反射され、第２の検出モジュール７１５によって分波される。
【0065】
第１の検出モジュール７１４を参照すると、合焦レンズ７０６からの光は、１２度ウェッジ面７０７に垂直に入射し、第１のダイクロイックフィルター又は帯域通過フィルター７０９上に結像される前に、画像アレイ７０８の透明ブロック（例えば、図８のブロック８０６）を通過する。光は、帯域通過フィルター７０９を通過し、検出器／レンズアレイ７１１内の第１の小面積検出器Ｄ１上に合焦される。帯域通過フィルター７０９によって拒否された光は反射され、画像アレイにおける複数のマイクロミラーＭ（１）～Ｍ（７）のうちの第１のマイクロミラーＭ（１）７１２上に戻る。第１のマイクロミラーＭ（１）７１２は、この光をコリメートし、第２の検出モジュールＤ２上に反射する。これ以降についても、この動作が、画像アレイ７０８の透明ブロックのマイクロミラー及び検出モジュールの直列チェーンに沿って同様に行われる。第２の検出モジュール７１５は、第１の検出モジュール７１４と同様に機能する。
【0066】
反射波は、本明細書において説明したように、第１の検出モジュール７１４及び第２の検出モジュール７１５のそれぞれにおいて画像アレイ１０６Ｂ、７０８、７０８’を通って進み、光は、ダイクロイックフィルターを通って光の帯域通過が連続的に短くなって行きながら交互に合焦及びコリメートされ、奇数及び偶数の検出器チャネルにおけるそれぞれ奇数及び偶数の検出器１１８に入る。したがって、異なる波長は、第１の検出モジュール７１４及び第２の検出モジュール７１５のそれぞれにおける複数の検出器によって分波される。
【0067】
所与の蛍光性イベントについて、各検出器（例えば、図４Ｂに示す検出器３１８、図６及び図７におけるレンズ／検出器Ｄ１～Ｄ１６）からの信号は、電子機器システムによって増幅、デジタル化及び同期され、入力された蛍光性光信号のスペクトル表現が提供される。検出電子機器を光学モジュールアセンブリ内に統合すると、検出器の結合長及び増幅回路を最小にすることによってコンパクトな設計及びより低い雑音が可能になる。図４Ｂに示す検出器３１８は、入力された蛍光性光信号等の光学信号を電気信号に変換する。
【0068】
図７Ｂ及び図７Ｃは、一対の８チャネルコンパクト波長検出モジュール７１４、７１５を有するデュアル検出モジュール７００の右斜視図及び左斜視図をそれぞれ示している。検出モジュール７１４、７１５のそれぞれは、取り付け基部７２０と、検出器アレイ又は検出器チェーンにおけるレンズ／検出器７１１が取り付けられる取り付けブロック１２００（図１２参照）を取り囲むカバー７２２とを含む。取り付け基部７２０及びカバー７２２は、画像アレイ７０８、７０８’の素子を各検出器モジュール７１４、７１５における検出器アレイと互いに位置合わせされた透明ブロック８０６、１００６内に維持する。各検出モジュール７１４、７１５の取り付け基部７２０は、複数の留め具によって基部７１０に結合される。
【0069】
入力ステージ７０１は、フィルター７０３～７０５を収容する複数のフィルタースロットと、レンズ７０２、７０６、７１３を収容する複数のレンズスロットと、光がフィルター及びレンズを通って反射され伝播する１つ以上の光チャネルとを有する光学台７５１を含む。光学台７５１は、検出モジュール７１４及び７１５との整列を維持するために検出モジュール７００の基部７１０に結合される。
【0070】
図１３は、モジュール式フローサイトメトリーシステム１００における光学プレートアセンブリ１３００の上面図を示している。光学プレートアセンブリ１３００は、サンプル流体がサンプル粒子とともに流れるフローセルアセンブリ１３０８内に励起を誘導する３つの半導体レーザー１３７０Ａ、１３７０Ｂ、１３７０Ｃを有するレーザーシステム１３７０を含む。レーザーシステム１３７０は、フローセルアセンブリ１３０８に向けて同一直線上に複数（例えば、３つ）のレーザービームの誘導を試みる。しかしながら、これらの複数のレーザービームは、互いに僅かにオフセットされる可能性がある。レーザーシステム１３７０は、通常は約４０５ナノメートル（ｎｍ）、４８８ｎｍ、及び６４０ｎｍの波長を有する半導体レーザー１３７０Ａ、１３７０Ｂ、１３７０Ｃを含む。４０５ｎｍ半導体レーザーの出力電力は、通常、３０ミリワット（ｍＷ）よりも大きく、４８８ｎｍ半導体レーザーの出力電力は、通常、２０ｍＷよりも大きく、６４０ｎｍ半導体レーザーの出力電力は、通常、２０ｍＷよりも大きい。コントローラー電子機器は、定温及び定出力電力で動作するように半導体レーザーを制御する。
【0071】
光学システムが、半導体レーザー１３７０Ａ、１３７０Ｂ、１３７０Ｃによってそれぞれ生成される光学レーザービーム１３７１Ａ、１３７１Ｂ、１３７１Ｃを空間的に操作する。光学システムは、生体細胞（バイオ細胞）を運ぶ流体ストリーム上に光学レーザービームを合焦させるレンズ、プリズム、及びステアリングミラーを含む。合焦された光学レーザービームサイズは、５０ミクロン～８０ミクロン（μｍ）の場合には、通常、フローストリームの両端にわたって合焦され、５μｍ～２０μｍの場合には、通常、フローセルアセンブリ１３０８におけるストリームフローに沿って合焦される。図１３では、光学システムは、レーザー光１３７１Ａ、１３７１Ｂ、１３７１Ｃをそれぞれ半導体レーザー１３７０Ａ～１３７０Ｃから受光するビームシェイパー１３３０Ａ～１３３０Ｃを含む。ビームシェイパー１３３０Ａ～１３３０Ｃから出力されたレーザー光は、それぞれミラー１３３２Ａ～１３３２Ｃ内に結合される。これらのミラーは、レーザー光１３９９Ａ、１３９９Ｂ、１３９９Ｃをフローセルアセンブリ１３０８に向けて当該アセンブリ内へ、蛍光色素の染料を用いて染色された標的粒子（例えば、生体細胞）まで誘導する。レーザー光１３９９Ａ、１３９９Ｂ、１３９９Ｃは、互いに僅かに分離されるが、ミラー１３３２Ａ～１３３２Ｃによってフローセルアセンブリ１３０８内へ実質的に平行に誘導される。
【0072】
レーザー光ビーム１３９９Ａ、１３９９Ｂ、１３９９Ｃは、フローセルアセンブリ１３０８においてフローストリーム内の生体細胞（粒子）に到達する。レーザー光ビーム１３９９Ａ、１３９９Ｂ、１３９９Ｃは、その後、フローストリーム内の細胞によって散乱され、蛍光色素を蛍光発光させ、蛍光性光を発生させる。前方散乱ダイオード１３１４が、軸上の散乱光を集光する。集光レンズ１３１３が、軸外の散乱光及び蛍光性光を集光し、それらをともにダイクロマティックミラー１３１０に誘導する。ダイクロマティックミラー１３１０は、軸外散乱光を側方散乱ダイオード１３１５上に合焦させる。ダイクロマティックミラー１３１０は、蛍光性光を少なくとも１つのファイバーヘッド１３１６上に合焦させる。少なくとも１つのファイバーアセンブリ１０２は、蛍光性光を少なくとも１つの検出器モジュール６００、７００に向けて送る。
【0073】
異なる蛍光染料及びレーザー波長を使用して生体サンプルをより詳細に分析するために、複数のファイバーヘッド１３１６、複数のファイバーアセンブリ１０２、及び複数の検出器モジュール６００、７００を使用することができる。３つのファイバーヘッド１３１６Ａ、１３１６Ｂ、１３１６Ｃを平行に配置して蛍光性光を受光することができ、３つのファイバーアセンブリ１０２Ａ、１０２Ｂ、１０２Ｃを使用して、蛍光性光を３つの検出器モジュール６００Ａ、６００Ｂ、６００Ｃ又は７００Ａ、７００Ｂ、７００Ｃに誘導することができる。
【0074】
３つのレーザー光ビーム５９９Ａ、５９９Ｂ、５９９Ｃは僅かにオフセットされている（例えば、正確には同一直線上にない）ので、３つのファイバーヘッド１３１６Ａ、１３１６Ｂ、１３１６Ｃ（及び３つのファイバーアセンブリ１０２Ａ、１０２Ｂ、１０２Ｃ）が有効になる。したがって、３つのファイバーヘッド１３１６Ａ、１３１６Ｂ、１３１６Ｃは、３つの異なる波長を有する３つのレーザー光ビーム５９９Ａ、５９９Ｂ、５９９Ｃから別々に光ビームデータを収集することができる。３つのファイバーアセンブリ１０２Ａ、１０２Ｂ、１０２Ｃは、その後、３つの異なる検出器モジュール（例えば、３つの異なる検出器モジュール６００Ａ、６００Ｂ、６００Ｃ又は７００Ａ、７００Ｂ、７００Ｃ）内に光を誘導する。
【0075】
或いは、モジュール式フローサイトメトリーシステムは、１つの検出器モジュール６００、７００を使用して光ビームデータを収集することができる。例えば、３つのファイバーアセンブリ１０２Ａ、１０２Ｂ、１０２Ｃは、３つの異なる検出器モジュールと対照的に１つの検出器モジュール６００、７００内に光を誘導することができる。光ビームデータの分離は、その後、３つの異なる検出器モジュールを使用することによって光ビームデータを分離する代わりにデータ処理演算として扱われる。１つの検出器モジュールを使用することによって、物理デバイスの観点から複雑さを低下させることができる。一方、データ処理演算はより複雑になる可能性がある。なぜならば、光ビームデータの分離には、より多くのデータ操作（例えば、異なる波長の識別及びそれに応じた光ビームデータの分離）が必要となるからである。
【0076】
細胞幾何学的特徴は、前方散乱データ及び側方散乱データの分析によって分類することができる。流体フロー内の細胞は、４００ｎｍ～９００ｎｍの範囲にある可視波長の染料によって標識される。染料は、レーザーによって励起されると、蛍光性光を生み出す。これらの光は、ファイバーアセンブリ１０２によって集光され、検出器モジュール６００、７００に向けて送られる。モジュール式フローサイトメトリーシステムは、コンパクト半導体レーザー、１１．５×倍率集光レンズ１３１３、及び検出器モジュール６００、７００におけるコンパクト画像アレイによって、光学プレートアセンブリ用に相対的に小さいサイズを維持する。
【0077】
集光レンズ１３１３は、検出器モジュール６００、７００の設計に寄与する。集光レンズ１３１３は、１１．５×倍率用に短い焦点距離を有する。集光レンズ１３１３は、蛍光発光の方向に向いた対物レンズの側では、蛍光発光における光子を広範囲の入射角にわたってより多く捕捉するために約１．３の高い開口数（ＮＡ）を有する。集光レンズ１３１３は、集光ファイバー１０２の方向に向いた側では、蛍光性光を狭い円錐角にわたってファイバー内に発射するために約０．１２の低いＮＡを有する。したがって、集光レンズ１３１３は、ＮＡを一方の側の高いＮＡから反対側の低いＮＡに変換して、検出器モジュール６００、７００の入力チャネルにおける倍率ｍをサポートする。
【0078】
集光ファイバーアセンブリ５１７のコアの直径は、約４００μｍと約８００μｍとの間にあり、ファイバーＮＡは、約６００μｍのコア直径の場合に約０．１２である。ファイバー出力端部は、受光するフォトダイオード上への結像サイズを制御するために、約１００μｍと約３００μｍとの間のコア直径に漸減することができる。
【0079】
集光ファイバー１０２の入力端部は、集光ＮＡを増加させて約４００μｍ未満のファイバーコア直径の使用を可能にするために、レンズ化されたファイバー端部も含むことができる。ファイバー１０２は、フローサイトメーターシステム内の任意の箇所に光を配光するために屈曲性を有するので、蛍光の光の集光にファイバーを使用することによって、コンパクトフローサイトメーターシステムの受光機アセンブリ及び電子機器のロケーションの最適化が可能になる。
【0080】
低コストフローサイトメーターを製造するために、より低コストの構成要素を導入することができる。各検出モジュール６１４、７１４、７１５における画像アレイ１０６Ｂは、信頼性があり、低コストであり、かつコンパクトである検出モジュールを提供するために固体透明材料から形成される。さらに、フローサイトメーターは、低コストの既製品としての薄い外郭（ＴＯ）のカン検出器を使用する。
【0081】
次に図１２を参照すると、透明ブロック８０６、１００６（図８～図１１参照）に隣接する取り付けブロック１２００が示されている。これらは互いに結合され、取り付け基部７２０及びカバー７２２によって図７Ａ～図７Ｃに示すコンパクト検出器モジュール７００の基部７１０に取り付けられる１ｆ画像アレイ７０８、７０８’を形成する。取り付けブロック１２００は、複数のＴＯカンレンズ／検出器７１１を収容する複数の角度を有する湾曲開口部１２０１を含む。取り付けブロック１２００と結像アレイ７０８の透明ブロック８０６、１００６との位置合わせ及び角度を有する湾曲開口部１２０１の角度は、マイクロミラー７１２Ｅから反射される光をダイクロイックフィルター７０９Ｅによって帯域通過フィルタリングすることができるとともにレンズ／検出器７１１Ｅ内に結合することができるようなものになっている。
【0082】
複数のＴＯカンレンズ／検出器７１１のそれぞれは、互いに結合された合焦レンズ１２１１及び低コストＴＯカン検出器１２１２を含む。ＴＯカン検出器１２１２は、ＴＯカンパッケージの内部に上部窓（window top）及び半導体フォト検出器１２１３を含む。半導体フォト検出器１２１３は、ＴＯカンパッケージの外部に延びる複数の電気ピン１２１４に電気的に結合されている。これらのピンには、フローサイトメーターの他の電子機器が電気的に結合する。図４Ｂに示す検出器３１８と同様に、半導体フォト検出器１２１３は、入力蛍光性光信号等の光信号を少なくとも１つの電気ピン１２１４上の電気信号に変換する。
【0083】
次に図８を参照すると、１ｆ画像アレイの一実施形態１０６Ｂ、６０８、７０８、７０８’用の、固体透明材料８００から形成された透明ブロック８０６の斜視図が示されている。透明ブロック８０６に使用される固体透明材料８００は、例えば、透明ガラス又は透明プラスチックとすることができる。並び及び直列チェーンとなっている複数のマイクロミラー８１０が、透明材料８００の透明ブロック８０６の一方の側の内部又はその上に形成される。並び及び直列チェーンになっている複数のダイクロイックフィルター又は帯域通過フィルター８１２が、透明材料８００の透明ブロック８０６の反対側の内部又はその上に形成される。各ダイクロイックフィルター又は帯域通過フィルター８１２は、蛍光色素によって発光される幅広い範囲の蛍光性光の検出を可能にするように異なる範囲の光波長に調節される。１つの実施形態では、複数のマイクロミラー８１０は凹面球面ミラーである。
【0084】
固体透明材料８００から形成される透明ブロック８０６は、１ｆ結像アレイ７０８とともに説明したような、合焦レンズからの光を受光する１２度ウェッジ面８２０を更に含む。光は、ウェッジ面８２０の表面に垂直に入射し、第１のダイクロイックフィルター又は帯域通過フィルターＤ（１）に向けて誘導される（曲げられる）。光は、透明ブロック８０６を通過して、第１のダイクロイックフィルター又は帯域通過フィルターＤ（１）に到達する。
【0085】
次に図１０を参照すると、１ｆ画像アレイの別の実施形態１０６Ｂ、６０８、７０８、７０８’用の、固体透明材料８００から形成された透明ブロック１００６の斜視図が示されている。透明ブロック１００６に使用される固体透明材料８００は、例えば、透明ガラス又は透明プラスチックとすることができる。複数のマイクロミラー１０１０は、透明材料の１つの側の内部に形成された凹面方形ミラーである。複数のダイクロイックフィルター又は帯域通過フィルター１０１２が、透明材料８００の反対側の内部又はその上に形成される。各ダイクロイックフィルター又は帯域通過フィルター８１２は、蛍光色素によって発光される幅広い範囲の蛍光性光の検出を可能にするように異なる範囲の光波長に調節される。
【0086】
固体透明材料８００は、画像アレイ７０８とともに説明したような、合焦レンズからの光を受光する１２度ウェッジ面８２０を更に含む。光は、ウェッジ面８２０の表面に垂直に入射し、第１のダイクロイックフィルター又は帯域通過フィルターＤ（１）に向けて誘導される（曲げられる）。光は、ブロックを通過して、第１のダイクロイックフィルター又は帯域通過フィルターＤ（１）に到達する。
【0087】
次に図９Ａを参照すると、断面図が透明ブロック８０６の一方の側の球面マイクロミラー８１０と反対側との間の距離（例えば、厚さＬ）を示している。球面マイクロミラー８１０の中心における透明ブロックに垂直な軸８１４が、透明ブロック８０６の反対側に延びている。図９Ｂは、ダイクロイックフィルター又は帯域通過フィルター８１２の中心における透明ブロックに垂直な軸８１５を示している。軸８１５は、透明材料８００の透明ブロック８０６の反対側に延びている。軸８１４及び８１５は互いに平行である。
【0088】
反射性材料８１１が、固体透明材料８００の球面透明マイクロレンズの形状に形成され（例えば、配置される）、透明ブロック８０６の一方の側に各球面マイクロミラー８１０が形成される。ダイクロイックフィルター又は帯域通過フィルター８１２は、透明ブロック８０６の反対側において材料８００に結合される。
【0089】
図１１は、透明ブロック１００６を形成する透明材料８００の一方の側の凹面方形マイクロミラー１０１０と反対側との間の距離及び軸１０１４を同様に示している。図１１は、ダイクロイックフィルター又は帯域通過フィルター１０１２の中心点において垂直な軸１０１５を更に示している。光軸１０１５は、透明材料８００によって形成された透明ブロック１００６の反対側に延びている。光軸１０１４及び１０１５は互いに平行である。
【0090】
図１１は、反射性材料１０１１が、透明材料８００から形成された固体透明ブロック１００６の湾曲透明方形形状に形成され（例えば、配置される）、方形マイクロミラー１０１０を形成することを更に示している。ダイクロイックフィルター又は帯域通過フィルター１０１２は、固体透明ブロック１００６の反対側に結合される。
【0091】
フローサイトメトリーの用途において使用される蛍光染料は、可視及び近赤外の波長範囲全体をカバーする。発光波長帯域幅は、通常、長波長蛍光色素用に大きい。ダイクロイックフィルター又は帯域通過フィルター８１２のそれぞれは、同じ量のスペクトルサンプリングを用いて異なる染料を測定するように最適化されたそれらの検出器フィルターの通過帯域及び中心波長を有することができる。さらに、個別のフィルター最適化によって、他のレーザーからの励起波長の除外が可能になる。このように、各チャネルにおける検出器を十分に利用して対象の信号を検出することができる。コンピューターのプロセッサによって実行される蛍光スペクトル非混合アルゴリズムと併せて、個別の最適化された通過帯域検出は、対象となる多数の蛍光染料の究極の検出を提供する。
【0092】
様々な検出システムを使用する方法
次に、フローサイトメーターにおいて本明細書に開示されている様々な検出システムを使用する方法を説明する。図に示す光ファイバー１０２の端部からのレーザー光によって励起された蛍光色素によって生成される蛍光性光を発射する前に、異なる波長の蛍光性光が、レーザー光によって励起されるフローチャネルにおけるサンプル内の異なる粒子をマーキングする様々な蛍光色素によって生成される。生成される蛍光性光は、図１３に見ることができるように、レーザーの対向端部の近くの集光レンズによって受光される。光ファイバーの開口数とより良好に整合するために、捕捉側における第１の開口数から、この第１の開口数よりも小さな第２の開口数への変換を行う変換器が使用される。光ファイバーは、その後、蛍光性光を光ファイバーの端部に向けて誘導し、コンパクト検出モジュール６００、７００に向けてこの光を柔軟に誘導する。
次に、フローサイトメーターにおいて本明細書に開示されている様々な検出システムを使用する方法を説明する。図に示す光ファイバー１０２の端部からのレーザー光によって励起された蛍光色素によって生成される蛍光性光を発射する前に、異なる波長の蛍光性光が、レーザー光によって励起されるフローチャネルにおけるサンプル内の異なる粒子をマーキングする様々な蛍光色素によって生成される。生成される蛍光性光は、図１３に見ることができるように、レーザーの対向端部の近くの集光レンズによって受光される。光ファイバーの開口数とより良好に整合するために、捕捉側における第１の開口数から、この第１の開口数よりも小さな第２の開口数への変換を行う変換器が使用される。光ファイバーは、その後、蛍光性光を光ファイバーの端部に向けて誘導し、コンパクト検出モジュール６００、７００に向けてこの光を柔軟に誘導する。
【0093】
光ファイバー１０２は、蛍光性光を光ファイバーの端部内に結合し、それによって、蛍光性光を光ファイバーから外部に発射する。発射された蛍光性光は、レーザー光によって励起されたサンプル流体内の異なる粒子に付着した異なる蛍光色素によって生成される異なる波長を有する。
【0094】
入力チャネルにおいて、光ファイバーの端部から発射された光は、第１の分波結像アレイにおける第１の複数のダイクロイックフィルターの第１のダイクロイックフィルターに向けてレンズによってコリメート及び合焦される。
【0095】
入力チャネルに更に沿って、光ファイバーから発射される異なる蛍光色素を励起するのに使用されるレーザー光は、ブロックデバイスによって蛍光性光の波長の検出と干渉することが阻止される。
【0096】
入力チャネルに更に沿って、光ファイバーの端部からの画像サイズは、第１の分波結像アレイにおける第１の複数のダイクロイックフィルターの直列チェーン又は並びにおける第１のダイクロイックフィルターのスポットサイズに拡大される。
【0097】
第１の分波結像アレイでは、蛍光性光の第１の波長範囲が、第１の複数のダイクロイックフィルターと第１の複数のマイクロミラーの直列チェーン又は並びとの間で１つ置きに反射され、奇数番号のダイクロイックフィルター上では蛍光性光がコリメートされ、偶数番号のダイクロイックフィルター上では蛍光性光が再結像される。第１の複数のマイクロミラーの焦点距離、及び、第１の複数のダイクロイックフィルターと第１の複数のマイクロミラーとの間の分離の距離は、奇数番号のダイクロイックフィルター上で蛍光性光をコリメートするとともに偶数番号のダイクロイックフィルター上で蛍光性光を再結像するマイクロミラーのチェーンに沿った望遠鏡効果を提供する。
【0098】
第１の複数のダイクロイックフィルターの直列チェーン又は並びにおいて、蛍光性光の第１の波長範囲の異なる波長範囲は、蛍光性光の第１の波長範囲の波長スペクトルを分波するためにそれぞれにおいて帯域通過される。
【0099】
第１の複数のダイクロイックフィルターの直列チェーン又は並びに隣接して、第１の複数の光検出器又はフォト検出器を有する図３、図６、及び図７Ａ～図７Ｃに示すような複数の検出器チャネルの直列チェーン又は並びがある。各検出器チャネルは、蛍光性光の異なる波長範囲を第１の複数の光検出器又はフォト検出器内に合焦させるレンズを有する。
【0100】
複数のフォト検出器の直列チェーン又は並びは、粒子にタグ付けされた各蛍光色素に関連した第１の波長範囲の異なる波長範囲のそれぞれにおいて蛍光性光を検出する。複数の光検出器は、それぞれによって受光された蛍光性光をアナログ電気信号に変換する。各アナログ電気信号は、その後、アナログ／デジタル（Ａ／Ｄ）変換器によってアナログ電気信号からデジタル電気信号にデジタル化／変換することができ、その後、分析及びカウントすることができる。
【0101】
蛍光性光が検出器によってアナログ電気信号に変換され、デジタル電気信号にデジタル化されることによって、David Vrane他によって２０１７年４月２６日に出願された「COMPACT MULTI-COLOR FLOW CYTOMETER」という発明の名称の米国特許出願第１５／４９８，３９７号に開示されているように、その後、サンプル流体内の異なる粒子のそれぞれの数をカウントするのに、プロセッサを有するコンピューターを使用することができる。この米国特許出願は、引用することによって本明細書の一部をなすものとする。
【0102】
第２の分波結像アレイ及び／又は第３の分波結像アレイを第１の分波結像アレイと並列に使用することができる。この場合には、方法は、蛍光性光を、第１の分波結像アレイ用の第１の波長範囲の蛍光性光、第２の分波結像アレイ用の第２の波長範囲の蛍光性光、及び／又は第３の分波結像アレイ用の第３の波長範囲の蛍光性光に分割することを更に含む。図１３に示すように、蛍光性光を第１の分波結像アレイに向けて誘導するのに第１の光ファイバー１０２Ａを使用することができる。蛍光性光を第２の分波結像アレイに向けて誘導するのに第２の光ファイバー１０２Ｂを使用することができる。蛍光性光を第３の分波結像アレイに向けて誘導するのに第３の光ファイバー１０２Ｂを使用することができる。
【0103】
第１の分波結像アレイについて本明細書において説明されるステップは、異なる追加の波長範囲を分析することができるように第２の分波結像アレイ及び／又は第３の分波結像アレイによって同時に実行することができる。簡潔にするために、繰り返されるステップは、繰り返し説明されないが、引用することによってここに組み込まれる。
【0104】
コンピューターシステム概観
次に図１４を参照すると、フローサイトメーターシステム１４００の基本概念図が示されている。フローサイトメーター１４００の様々な実施形態が、商業化可能であり得る。フローサイトメーターシステム１４００の５つの主要なサブシステムは、励起光学機器システム１４０２、フルイディクスシステム１４０４、発光光学機器システム１４０６、取得システム１４０８、及び分析システム１４１０を含む。一般に、「システム」は、ハードウェアデバイス、ソフトウェア、及び／又はそれらの組み合わせを含む。
次に図１４を参照すると、フローサイトメーターシステム１４００の基本概念図が示されている。フローサイトメーター１４００の様々な実施形態が、商業化可能であり得る。フローサイトメーターシステム１４００の５つの主要なサブシステムは、励起光学機器システム１４０２、フルイディクスシステム１４０４、発光光学機器システム１４０６、取得システム１４０８、及び分析システム１４１０を含む。一般に、「システム」は、ハードウェアデバイス、ソフトウェア、及び／又はそれらの組み合わせを含む。
【0105】
励起光学機器システム１４０２は、例えば、レーザーデバイス１４１２、光学素子１４１４、光学素子１４１６、及び光学素子１４１８を含む。光学素子の例としては、光学プリズム及び光学レンズがある。励起光学機器システム１４０２は、光学インターロゲーション領域１４２０を照射する。フルイディクスシステム１４０４は、光学インターロゲーション領域１４２０を通って流体サンプル１４２２を運ぶ。発光光学機器システム１４０６は、例えば、光学素子１４３０と、光学検出器ＳＳＣ、ＦＬ１、ＦＬ２、ＦＬ３、ＦＬ４、及びＦＬ５とを含む。発光光学機器システム１４０６は、通過する粒子から放出又は散乱された光子を収集する。発光光学機器システム１４０６は、これらの光子を光学検出器ＳＳＣ、ＦＬ１、ＦＬ２、ＦＬ３、ＦＬ４、及びＦＬ５上に合焦させる。光学検出器ＳＳＣは側方散乱チャネルである。光学検出器ＦＬ１、ＦＬ２、ＦＬ３、ＦＬ４、及びＦＬ５は、特定の蛍光波長を検出する帯域通過フィルター又はロングパスフィルターを含むことができる蛍光検出器である。各光学検出器は、光子を電気パルスに変換し、これらの電気パルスを取得システム１４０８に送信する。取得システム１４０８は、これらの信号を処理し、分析システム１４１０における分析に備えて準備する。
【0106】
本明細書において説明した図１～図１３は、フローサイトメーター１４００の励起光学機器システム１４０２、発光光学機器システム１４０６、及び取得システム１４０８の例示的な素子を含む。David Vraneによって２０１７年１１月１９日に出願された「FLOW CYTOMETERY SYSTEM WITH STEPPER FLOW CONTROL VALVE」という発明の名称の米国特許出願第１５／８１７，２７７号は、フルイディクスシステム１４０４の例示的な素子を記載している。この米国特許出願は、引用することによって本明細書の一部をなすものとする。
【0107】
分析システム１４１０は、取得システム１４０８が信号のデジタル表現の取得を完了した後に、分析のためにそれらの信号のデジタル表現を記憶することができる。分析システム１４１０は、ディスプレイデバイスと、少なくとも１つのプロセッサと、スクラッチパッドメモリと、より半永久的にデータ（信号データを含む）及びソフトウェアをより多く記憶することができる不揮発性の１つ以上の記憶デバイスとを含むコンピューターである。
【0108】
分析システムの１つ以上の記憶デバイスは、分析される生体サンプル（又は他のタイプのサンプル、例えば、化学サンプル）の検査結果を得るためにプロセッサによって実行することができる命令を有する分析ソフトウェアを記憶することができる。分析システム１４１０及び分析ソフトウェアは、フローサイトメーターに生体サンプルを通す前に、フローサイトメーターに通される対照粒子を用いて初期化されるときに補正対照を用いてフローサイトメーターを較正するために更に使用することができる。分析ソフトウェアは、フローサイトメーターに通される対照を用いた較正中に取得システム１４０８によって取得された記憶されている信号データを分析する、プロセッサによって実行される命令を有する。分析ソフトウェアは、フローサイトメーターの較正後にフローサイトメーターに通される生体サンプルの分析中に取得システム１４０８によって取得された記憶されている信号データを分析する、プロセッサによって実行される命令も有する。
【0109】
方法の概観
次に図１５及び図１６Ａ～図１６Ｃを参照して、高速補正を有するフローサイトメトリーを実行する方法１５００のフローチャートを説明する。例えば、図１４のフローサイトメトリーシステム１４００が方法１５００を実行することができる。フローサイトメトリーは、サンプル流体内の単一の細胞又は粒子に関する高速マルチパラメーター収集及びデータの分析を可能にする。
次に図１５及び図１６Ａ～図１６Ｃを参照して、高速補正を有するフローサイトメトリーを実行する方法１５００のフローチャートを説明する。例えば、図１４のフローサイトメトリーシステム１４００が方法１５００を実行することができる。フローサイトメトリーは、サンプル流体内の単一の細胞又は粒子に関する高速マルチパラメーター収集及びデータの分析を可能にする。
【0110】
図１５に示すステップ１５０１において、フローサイトメトリーシステムは、フローサイトメーター１６０４、１６１４を始動し、フローサイトメーターの動作を確認する。フローサイトメーターは、従来のフローサイトメーター１６０４又はスペクトルフローサイトメーター１６１４とすることができる。従来のフローサイトメーター１６０４は、ミラー、光学フィルター、及び光電子増倍管（ＰＭＴ：photomultiplier tubes）を従来どおり使用して、信号データを捕捉又は検知する。スペクトルフローサイトメーター１６１４は、同様の原理に基づいているが、それよりも、一般的には、複数のチャネルにわたる光スペクトルを検出器内に分散させる手段を有するマルチチャネル検出器（例えば、電荷結合デバイス（ＣＣＤ：charge-coupled device））を使用する。
【0111】
ステップ１５０５において、システムは、図１６Ａによって示すようにフローサイトメーター１６０４、１６１４の較正を開始する。システムは、フローサイトメーター１６０４、１６１４に１つずつ通される単一染色基準対照又は補正対照１６０２と総称される１つ以上の単一染色基準対照又は補正対照１６０２Ａ～１６０２Ｅを使用する。１つ以上の単一染色基準対照１６０２Ａ～１６０２Ｅは、それぞれの様々な自己ルミネッセンス、又は対照粒子にタグ付けされた蛍光色素のルミネッセンスからスペクトルプロファイル又はシグネチャ１６０６Ａ～１６０６Ｅを個別に生成する。
【0112】
ステップ１５１０において、較正中に、システムは、単一染色補正対照１６０２を使用して、従来のフローサイトメーター１６０４の初期スピルオーバー行列又はスペクトルフローサイトメーター１６１４の初期基準行列を生成する。マルチカラーフローサイトメトリーを実行するときに、システムは、フローサイトメーター１６０４、１６１４に通される単一染色サンプル１６０２を使用して、図１６Ａに示すような補正のレベルを求める。粒子１６０２の単一染色は、蛍光色素のスペクトルプロファイル又はシグネチャ１６０６Ａ～１６０６Ｅをフローサイトメーターの蛍光性フォト検出器に示すことができる。これによって、システム及び／又はユーザーは、図１６Ｂに示すように、サンプルに含まれるマルチ染色細胞又は粒子１６１２Ａ～１６１２Ｅに起因したサンプル１６１０からの蛍光のスペクトルプロファイルにおける重なり（例えば、図１６Ｂにおける重なり１６１６を参照）を補正することが可能になる。
【0113】
補正対照１６０２の染色は、サンプル１６１０内の粒子１６１２Ａ～１６１２Ｅと同程度に明るいもの又はそれらの粒子よりも明るいものでなければならない。対照について測定された蛍光がより明るい場合には、抗体キャプチャービーズ（antibody capture beads）を細胞の代わりに用いることができ、或るフルオロフォア結合抗体を別のフルオロフォア結合抗体の代わりに用いることができる。これの例外は、代用が可能でないタンデム染料（tandem dyes）である。種々のベンダー又は種々のバッチからのタンデム染料は、個別の染料と同様に取り扱わなければならず、個別の単一染色対照をそれぞれに使用すべきである。なぜならば、スピルオーバーの量は、これらの染料のそれぞれについて異なり得るからである。また、補正アルゴリズムは、陽性母集団及び陰性母集団を用いて実行されるべきである。各個別の補正対照がビーズを含むのか、実験に使用される細胞を含むのか、又は異なる細胞を含むのかを問わず、対照自体が、同じレベルの自己蛍光を有する粒子を含まなければならない。補正対照の集合全体が、ビーズ又は細胞のいずれかの個別のサンプルを含むことができるが、個別のサンプルは、フルオロフォアの同じ担体粒子を有しなければならない。また、補正対照は、サンプルと同じフルオロフォアを使用する。例えば、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ：green fluorescent protein）及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ：Fluorescein isothiocyanate）の双方は、ほとんど緑色の光子を放出するが、非常に異なる発光スペクトルを有する。したがって、システムは、それらのうちの一方をサンプルに、他方を補正対照にそれぞれ使用することができない。また、システムは、スピルオーバーの統計的に有意な決定を行うのに十分なイベント（例えば、陽性母集団及び陰性母集団の双方について約５０００個のイベント）を収集しなければならない。
【0114】
従来のフローサイトメーター１６０４における較正中に、システムは、従来のフローサイトメーターに１つずつ通される単一染色基準対照１６０２から初期スピルオーバー行列を取得する。従来のフローサイトメーター１６０４では、蛍光信号（例えば、色）が、一連のエッジフィルター及びダイクロイックミラーを使用して離散蛍光帯域１６０６Ａ～１６０６Ｅに分離される。システムは、光電子増倍管（ＰＭＴ）を用いて各個別のチャネルを検出する（例えば、測定する）。理想的には、蛍光帯域は完全に離散的であるが、それは現実ではない。対照１６０２（及びサンプル１６１０）における蛍光性信号の検出中に、結合プロファイル１６１６に示すように、蛍光帯域間に「スピルオーバー」が発生する可能性がある。システムは、スピルオーバー行列［Ｓ］を用いて、蛍光帯域間のスピルオーバー（例えば、図１６Ｂに示す結合プロファイル１６１６の離散帯域間のスピルオーバー１６１８）を定義する。
【0115】
或いは、スペクトルフローサイトメーター１６１４における較正中に、システムは、このスペクトルフローサイトメーターに通される単一染色基準対照１６０２から初期基準行列を取得する。スペクトルフローサイトメトリーは、従来のフローサイトメトリーに基づく技法であるが、スペクトルフローサイトメトリーでは、スペクトルグラフ及びマルチチャネル検出器（例えば、電荷結合デバイス（ＣＣＤ））が、従来のフローサイトメーターシステムの従来のミラー、光学フィルター及び光電子増倍管（ＰＭＴ）の代わりに用いられる。スペクトルフローサイトメーターでは、側方散乱光及び蛍光が集光され、スペクトルグラフ内に直接又は光ファイバーを通して結合され、スペクトルグラフには、全体の光信号が、ＣＣＤ又はマルチチャネル検出器上の高分解スペクトルとして分散及び表示される。
【0116】
ステップ１５１５において、図１５及び図１６Ｂを参照すると、システムは、サンプル１６１０をフローサイトメーター１６０４、１６１４に通す。システムは、サンプル流体１６１０に基づいてスペクトルプロファイル１６１６を表すデータ（例えば、イベントデータ）を生成、取得、及び／又は記録する。例えば、フローサイトメーターを流れるサンプル流体内の蛍光発光した細胞が検出される。蛍光発光した細胞の各検出はイベントである。イベントデータは、測定されたサンプルイベントベクトルに従って定義することができる。
【0117】
ステップ１５２０において、システムは、サンプル１６１０内の様々なタイプの細胞又は粒子の数をカウントして濃度の尺度を取得するために、補正されたサンプルイベントベクトル（従来のフローサイトメーター１６０４の場合）又は非混合サンプルイベントベクトル（スペクトルフローサイトメーター１６１４の場合）を生成する。一般に、図１６Ｃに示すように、逆行列１６２４（微調整を用いて初期スピルオーバー行列及び／又は初期基準行列から求められる）が、スペクトルプロファイル１６１６を表すイベントデータに対して使用され、サンプル１６１０内の様々な細胞１６１２Ａ～１６１２Ｅの様々な自己ルミネッセンス又は細胞１６１２Ａ～１６１２Ｅにタグ付けされた蛍光色素のルミネッセンスの個々のスペクトルプロファイル又はシグネチャ１６０６Ａ～１６０６Ｅを表す補正されたサンプルイベントベクトル又は非混合サンプルイベントベクトルが生成される。
【0118】
従来のフローサイトメーター１６０４の場合には、システムは、初期スピルオーバー行列及び測定されたサンプルイベントベクトルに基づいて、補正されたイベントベクトルを計算する。スペクトルフローサイトメーター１６１４の場合には、システムは、初期基準行列及び測定されたサンプルイベントベクトルに基づいて、非混合サンプルイベントベクトルを計算する。
【0119】
残念なことに、初期スピルオーバー行列及び基準行列は、信頼性のある結果を得るには正確さが十分でない傾向がある。したがって、ステップ１５２５において、システムは高速補正を実行する。従来のフローサイトメーター１６０４の場合には、このステップは、初期スピルオーバー行列の不正確な点を補正することを含む。スペクトルフローサイトメーター１６１４の場合には、このステップは、初期基準行列の不正確な点を補正することを含む。
【0120】
ステップ１５２７において、高速補正に基づいて、システムは、再補正されたサンプルイベントベクトルを以前に実行されていたものよりも迅速な方法で生成する。方法１５００は、その後、ステップ１５３０において終了するが、１つ以上のステップは、フローサイトメーターを用いた較正／サンプリングの同様の日付／時刻の他のサンプルについて繰り返すことができる。
【0121】
従来のフローサイトメーターの単一染色対照からのスピルオーバー行列の取得
したがって、システムは、単一染色対照からスピルオーバー行列を生成又は取得する従来のフローサイトメーターを含むことができる。従来のフローサイトメーターを使用することによってスピルオーバー行列を生成又は取得するステップを更に論述する。
したがって、システムは、単一染色対照からスピルオーバー行列を生成又は取得する従来のフローサイトメーターを含むことができる。従来のフローサイトメーターを使用することによってスピルオーバー行列を生成又は取得するステップを更に論述する。
【0122】
行列［Ｓ］は、単一染色補正対照から取得されたＮ×Ｎ次元スピルオーバー行列であると仮定する。ここで、Ｎは蛍光検出器の数である。補正対照の例として、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｒ－フィコエリスリン（ＰＥ）、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体（ＰｅｒＣＰ）、フィコエリトリン及びシアニン染料（ＰＥ－Ｃｙ７）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、並びにＡＰＣ及びシアニン染料を組み合わせたタンデム蛍光色素（ＡＰＣ－Ｃｙ７）等の蛍光色素を用いて染色又は染料されたビーズ１６０２がある。
【0123】
ベクトル｛Ｕ｝は、Ｎ個の値を有する測定されたサンプルイベントベクトルであると仮定する。Ｎ個の値のそれぞれは、補正対照（例えば、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＰｅｒＣＰ、ＰＥ－Ｃｙ７、ＡＰＣ、ＡＰＣ－Ｃｙ７）を検出するＮ個の検出器のうちの１つからのものである。
【0124】
ベクトル｛Ｖ｝は、Ｎ個の値を有する補正されたサンプルイベントベクトルであると仮定する。測定されたサンプルイベントベクトル｛Ｕ｝は、スピルオーバー行列［Ｓ］に補正されたサンプルイベントベクトル｛Ｖ｝を乗算したものに等しい。これは、測定されたサンプルイベントベクトル｛Ｕ｝との以下の行列関係を用いて表すことができる。
【数1】
【0125】
したがって、逆スピルオーバー行列［Ｓ］－１を用いると、補正されたサンプルイベントベクトル｛Ｖ｝は、以下の行列方程式から取得することができる。
【数2】
【0126】
初期スピルオーバー行列［Ｓ］は、各検出器において各単一染色対照（例えば、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＰｅｒＣＰ、ＰＥ－Ｃｙ７、ＡＰＣ、ＡＰＣ－Ｃｙ７）を測定して以下の行列を取得することによって取得することができる。
式３における下付き文字ｘ、ｙにおいて、ｘ値は検出器番号を表す。式３における下付き文字ｘ、ｙのｙ値は、単一染色対照に関連した列を表す。
【数3】
【0127】
変数分離（ＳＯＶ：separation of variables）行列である初期スピルオーバー行列［Ｓ］における各列は、１つの単一染色対照（例えば、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＰｅｒＣＰ、ＰＥ－Ｃｙ７、ＡＰＣ、ＡＰＣ－Ｃｙ７）に対応する。例えば、列１はＦＩＴＣ単一染色対照に対応する。別の例として、列２はＰＥ単一染色対照に対応する。以下、フローサイトメーターを較正するために通される各単一染色対照についても同様である。初期スピルオーバー行列［Ｓ］内の各行は、所与の検出器番号に対応する。例えば、行１は検出器１に対応する。行２は検出器２に対応し、これ以降の行についても同様である。
【0128】
一般に、生成される初期スピルオーバー行列は、スペクトルを正確に分離して細胞又は粒子を正確に識別するほど十分正確ではない。したがって、初期スピルオーバー行列［Ｓ］の非対角要素値の微調整（例えば、調整されたスピルオーバー行列［Ｓ］’と、その関連した逆行列である調整された補正行列［Ｃ］’とを生成する初期スピルオーバー行列［Ｓ］に対する微調整）が必要とされる。これらの微調整は、検査技師／オペレーターの経験及び判断に基づいて行うことができる。微調整は、同じ細胞若しくは粒子上で染色された蛍光色素の相互作用によって引き起こされる歪、又は、単一染色対照及び未染色対照を測定するシステムによって引き起こされる歪、又は、相互作用及びシステムによって引き起こされる双方の歪を修正するために行われることが多い。
【0129】
調整行列［Ｄ］は、初期スピルオーバー行列［Ｓ］の非対角要素値に対して行われる（例えば、加えられる）微調整であると仮定する。行列方程式｛ＶＲ｝＝［［Ｓ］＋［Ｄ］］－１｛Ｕ｝から従来のフローサイトメーターの再補正されたイベントベクトル｛ＶＲ｝を求めることができる。
【0130】
スペクトルフローサイトメーターの非混合イベントリストデータの取得
或いは、システムは、非混合イベントリストデータを生成又は取得するスペクトルフローサイトメーター１６１４を含むことができる。スペクトルフローサイトメーターを使用することによって非混合イベントリストデータを生成又は取得するステップを更に論述する。
或いは、システムは、非混合イベントリストデータを生成又は取得するスペクトルフローサイトメーター１６１４を含むことができる。スペクトルフローサイトメーターを使用することによって非混合イベントリストデータを生成又は取得するステップを更に論述する。
【0131】
［Ｒ］は、単一染色基準対照から取得されるスペクトルフローサイトメーターのＮ×Ｍ初期基準行列であると仮定する。ここで、Ｎは検出器の数であり、Ｍは、測定される蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＰｅｒＣＰ、ＰＥ－Ｃｙ７、ＡＰＣ、ＡＰＣ－Ｃｙ７）の数であり、ＭはＮよりも常に小さい。
【0132】
｛Ｕ｝は、Ｎ個の値を有する測定されたサンプルイベントベクトルであると仮定し、Ｎ個の値のそれぞれは、Ｎ個の検出器のうちの１つからのものである。
【0133】
｛Ｖ｝は、Ｍ個の値（例えば、蛍光強度）を有する非混合サンプルイベントベクトルであると仮定し、Ｍ個の値のそれぞれは、蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＰｅｒＣＰ、ＰＥ－Ｃｙ７、ＡＰＣ、ＡＰＣ－Ｃｙ７のうちの１つ）の非混合値である。
【0134】
非混合サンプルイベントベクトル｛Ｖ｝は、測定されたサンプルイベントベクトル｛Ｕ｝と以下の行列関係を有する。
【数4】
【0135】
非混合サンプルイベントベクトル｛Ｖ｝における変数Ｍの数は、測定されたサンプルイベントベクトル｛Ｕ｝における変数Ｎの数よりも少ない（例えば、非混合サンプルイベントベクトルの次元は、測定されたサンプルイベントベクトルの次元よりも小さい）ので、その場合、システムは、最小二乗アルゴリズムを使用して上記式の解を取得する。
【0136】
従来のフローサイトメーターと比較すると、非混合イベントベクトルは、補正されたイベントベクトルと等価である。したがって、非混合イベントリストデータ（例えば、非混合サンプルイベントベクトル）のスペクトルスピルオーバー行列は、以下のように恒等行列［Ｉ］である。
【数5】
【0137】
一般に、非混合イベントリストデータは十分に正確なものではなく、そのため、恒等行列のスペクトルスピルオーバー行列（identity spectral spillover）の微調整（例えば、調整されたスペクトルスピルオーバー行列を生成する微調整）が必要とされる。したがって、スペクトルフローサイトメーターの再補正されたイベントベクトルの方程式は、｛ＶＲ｝＝［［Ｉ］＋［Ｄ］］－１｛Ｖ｝となる。ここで、［Ｄ］は、第ｉ行及び第ｊ列に微調整δｉ，ｊをそれぞれ有するとともに、微調整が必要とされない箇所には０を有するｎ×ｎデルタ行列である。例えば、デルタ行列は、
とすることができる。
【数6】
【0138】
フローサイトメトリーデータの高速補正
したがって、フローサイトメトリー（例えば、従来のフローサイトメトリー及びスペクトルフローサイトメトリー）において、サイトメーターから収集されるフローサイトメトリー標準（ＦＣＳ：Flow Cytometry Standard）データは、線形の未処理のリストデータである。リストデータは、プロットでの消費及びサンプル内の細胞の統計分析への使用前に補正する必要はない。システムは、従来のフローサイトメーターのスピルオーバー行列及び／又はスペクトルフローサイトメーターの非混合イベントリストデータにおける不十分な正確さに対処するために高速補正を実行する。
したがって、フローサイトメトリー（例えば、従来のフローサイトメトリー及びスペクトルフローサイトメトリー）において、サイトメーターから収集されるフローサイトメトリー標準（ＦＣＳ：Flow Cytometry Standard）データは、線形の未処理のリストデータである。リストデータは、プロットでの消費及びサンプル内の細胞の統計分析への使用前に補正する必要はない。システムは、従来のフローサイトメーターのスピルオーバー行列及び／又はスペクトルフローサイトメーターの非混合イベントリストデータにおける不十分な正確さに対処するために高速補正を実行する。
【0139】
リストデータの補正は、システムが測定された単一染色補正対照及び／又は微調整入力から取得する初期スピルオーバー行列に基づいている。取得された初期スピルオーバー行列は、一般に、十分正確なものではない。初期スピルオーバー行列内の値を微調整することによって調整されたスピルオーバー行列を生成する微調整が行われる。
【0140】
スピルオーバー値が微調整されるごとに、スピルオーバー行列を反転して補正行列を取得する必要がある。その後、この補正行列には、各リストデータイベントベクトルが乗算され、補正されたリストデータ（例えば、再補正されたイベントベクトル）が生成される。
【0141】
例えば、Ｎ個の蛍光パラメーターの実験を取り上げる。各イベントベクトルの補正について、補正されたイベントベクトルを生成するには、Ｎ２個の乗算に加えてＮ×（Ｎ－１）個の加算が必要とされる。計算複雑度はＮ２のオーダー（例えば、Ｏ（Ｎ２））である。
【0142】
制限された数の蛍光色素パラメーター及び制限された数のイベントを有する実験の場合に、補正計算は、フローサイトメトリーデータ分析におけるボトルネックでない場合がある。しかしながら、実験が、多数のイベント（例えば、２００万個のイベント）とともに多数の蛍光パラメーター（例えば、２０個よりも多くの蛍光性パラメーター）を含む場合には、補正計算は極めて多くの時間を要する可能性がある。その結果、システムがスピルオーバー値を変更するごとに、処理される計算が大量であることに起因して、プロット及び統計量をコンピューターインターフェース上に表示する応答が極めて低速になる可能性がある。
【0143】
有利には、本システムは、フローサイトメトリーデータ分析のスピルオーバー行列の微調整を受信又は実行すると、補正されたリストデータの正確さを何ら犠牲にすることなく計算量を大幅に削減する高速補正アルゴリズムを実行する。この高速補正アルゴリズムは、例えば、（３Ｎ＋１）個の乗算／除算に加えて（Ｎ＋１）個の加算しか必要としない。この高速補正アルゴリズムの複雑度は、Ｎのオーダー（例えば、Ｏ（Ｎ））である。したがって、本システムは、プロット及び統計量の表示の応答性を大幅に改善することができる。
【0144】
例えば、１００万個のイベントを用いた２０色の実験を考える。システムが、スピルオーバー値の微調整をいつ受信又は実行しても、通常の補正アルゴリズムは、全部で４億個の乗算に加えて３億９９００万個の加算を必要とする。対照的に、本システムの高速補正アルゴリズムは、全部で６０００万個の乗算に加えて２０００万個の加算しか必要としない。トータルの乗算及び加算の節約は、通常の補正アルゴリズムと比較してそれぞれ５６６％及び１８９５％である。
【0145】
次に、本高速補正アルゴリズムの誘導を論述する。
【0146】
行列［Ｃ］は補正行列であると仮定する。補正行列［Ｃ］は、行列方程式［Ｃ］＝［Ｓ］－１によってスピルオーバー行列［Ｓ］の逆行列である。補正行列［Ｃ］とスピルオーバー行列［Ｓ］の逆行列とが互いに乗算される場合には、行列方程式［Ｃ］［Ｓ］＝［Ｉ］のように恒等行列が得られる。補正されたイベントベクトル｛Ｖ｝は、行列方程式｛Ｖ｝＝［Ｃ］｛Ｕ｝によって表される補正行列［Ｃ］と未補正の測定されたイベントベクトル｛Ｕ｝とを互いに乗算することによって計算することができる。
【0147】
微調整に起因して、システムは、調整されたスピルオーバー行列［Ｓ］’を生成又は計算する。初期スピルオーバー行列［Ｓ］内の１つの要素の値が変更され、例えば、Ｓｉ，ｊ’＝＞Ｓｉ，ｊ＋δｉ、jにされると仮定すると、この微調整されたスピルオーバー行列［Ｓ］’は、行列方程式［Ｓ］'＝［Ｓ］＋［Ｄ］によって、初期スピルオーバー行列［Ｓ］とデルタ行列［Ｄ］における微調整とを加算した和によって表すことができる。ここで、
は、下付き文字ｉ及びｊがそれぞれ第ｉ行及び第ｊ列を表すデルタ行列である。再補正されたイベントベクトル｛ＶＲ｝は、行列方程式｛ＶＲ｝＝［［Ｓ］＋［Ｄ］］－１｛Ｕ｝によって表されるように、微調整されたスピルオーバー行列［Ｓ］’の逆行列、微調整された補正行列［Ｃ］’、及び未補正の測定されたイベントベクトル｛Ｕ｝を互いに乗算することによって計算することができる。デルタ行列［Ｄ］は、初期スピルオーバー行列［Ｓ］と同じ次元を有する。デルタ行列［Ｄ］は、初期スピルオーバー行列［Ｓ］を微調整するデルタ値δｉ，ｊを含む。
【数7】
【0148】
［Ｓ］＋［Ｄ］＝［Ｓ］（［Ｉ］＋［Ｃ］［Ｄ］）、［［Ｓ］＋［Ｄ］］－１＝（［Ｉ］＋［Ｃ］［Ｄ］）－１［Ｃ］であるので、再補正されたイベントベクトル｛ＶＲ｝の方程式は、以下のように書き換えることができる。
ここで、（［Ｉ］＋［Ｃ］［Ｄ］）－１は再補正行列である。
【数8】
【0149】
再補正行列は、以下のように簡単化することができるので、
その場合、再補正されたイベントベクトルの行列方程式は、以下のように記述することができる。
再補正されたベクトルの各成分は、未補正の測定されたイベントベクトル｛Ｕ｝の成分との加算／減算及び乗算／除算によって求められ、それによって、計算の数は大幅に削減される。したがって、再補正されたイベントベクトル｛ＶＲ｝は、高速補正アルゴリズムを使用してコンピューターのプロセッサによってはるかに高速に計算することができる。
【数9】
【数10】
【0150】
したがって、高速補正アルゴリズムを使用すると、フローサイトメーターを用いて細胞サンプルをより迅速に分析することができ、結果（例えば、細胞カウント、濃度、滴定）をより効率的に取得することができる。研究者又は検査技師が生体サンプル（例えば、血液又は尿）の検査結果を取得するために計算の完了を待って１日以上費やすのではなく、生体サンプルの検査結果は、高速補正アルゴリズムを使用することによって数時間以内に取得することができる。
【0151】
結論
実施形態は上記のとおりである。実施形態を詳細に説明してきたが、実施形態は、そのような実施形態によって制限されるものと解釈されるべきではなく、添付の特許請求の範囲に従って解釈されるべきである。
実施形態は上記のとおりである。実施形態を詳細に説明してきたが、実施形態は、そのような実施形態によって制限されるものと解釈されるべきではなく、添付の特許請求の範囲に従って解釈されるべきである。
【0152】
幾つかの特定の例示的な実施形態が説明され、添付図面に示されているが、そのような実施形態は、広い本発明の例示にすぎず、広い本発明を限定するものでないこと、並びに、実施形態が、図示及び説明された特定の構造及び構成に限定されるものでないことが理解されよう。なぜならば、当業者は、他の様々な変更を想起することができるからである。
【0153】
検出器によって検出された電気信号を分析してサンプル流体内の異なる粒子をカウントする等のフローサイトメーターの幾つかの特定の機能は、ソフトウェアで実施することができ、コンピューター又はプロセッサによって実行することができる。ソフトウェアのプログラム又はコードセグメントは、それらの機能を実行する必要なタスクを実行するのに使用される。これらのプログラム又はコードセグメントは、プロセッサ可読媒体に記憶することもできるし、搬送波に具現化されるコンピューターデータ信号によって伝送媒体又は通信リンクを介して伝送することもできる。プロセッサ可読媒体は、情報を記憶することができる任意の記憶媒体を含むことができる。プロセッサ可読媒体の例として、電子回路、半導体メモリデバイス、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ：read only memory）、フラッシュメモリ、消去可能プログラマブルリードオンリーメモリ（ＥＰＲＯＭ：erasable programmable read only memory）、フロッピーディスケット、ＣＤ－ＲＯＭ、光ディスク、及びハードディスクがある。コードセグメントは、インターネット、イントラネット等のコンピューターネットワークを介して記憶媒体にダウンロードすることができる。
【0154】
本明細書は、多くの具体的内容を含むが、これらは、本開示の範囲に対する限定としても、請求項に記載され得るものの範囲に対する限定としても解釈されるべきではなく、逆に、本開示の特定の実施態様に特有の特徴の説明として解釈されるべきである。個別の実施態様の状況で本明細書に説明された幾つかの特定の特徴は、単一の実施態様において組み合わせて実施することもできる。逆に、単一の実施態様の状況で説明された様々な特徴は、複数の実施態様において別々に又は一部を組み合わせて実施することもできる。さらに、特徴は、上記において、幾つかの特定の組み合わせで動作するものとして説明することができ、さらには、そのようなものとして最初に特許請求することもできるが、特許請求される組み合わせからの１つ以上の特徴は、幾つかの場合には、その組み合わせから削除される場合があり、特許請求される組み合わせは、部分的な組み合わせ又は部分的な組み合わせの変形形態を対象とする場合がある。したがって、特許請求される発明は、添付の特許請求の範囲のみによって限定される。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図16C】