特許 7564958 Ｂ７－Ｈ３を標的とする抗体薬物複合体、その製造方法と使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-10-01

(45)【発行日】2024-10-09

(54)【発明の名称】Ｂ７－Ｈ３を標的とする抗体薬物複合体、その製造方法と使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20241002BHJP

   C07K 1/107 20060101ALI20241002BHJP

   C07K 7/06 20060101ALI20241002BHJP

   C07K 5/097 20060101ALI20241002BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20241002BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241002BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241002BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241002BHJP

   A61K 31/4745 20060101ALI20241002BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241002BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20241002BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

C07K1/107

C07K7/06

C07K5/097

A61K47/68

A61P43/00 105

A61P35/00

A61K39/395 C

A61K39/395 L

A61K31/4745

C12N15/13

C12P21/08

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2023537437

(86)(22)【出願日】2020-12-18

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-01

(86)【国際出願番号】 CN2020137472

(87)【国際公開番号】W WO2022126569

(87)【国際公開日】2022-06-23

【審査請求日】2023-08-04

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】510157476

【氏名又は名称】シャンハイ フダン－チャンジャン バイオ－ファーマシューティカル カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001519

【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】クオ、チンソン

(72)【発明者】

【氏名】シェン、イーチュン

(72)【発明者】

【氏名】ヤン、トン

(72)【発明者】

【氏名】パオ、ピン

(72)【発明者】

【氏名】カオ、ペイ

(72)【発明者】

【氏名】ウー、ファン

(72)【発明者】

【氏名】シュイ、チュン

【審査官】福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１４／０５７６８７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０２０／０６３６７３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１７－５３７８９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１９／０３４１７６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１７－５１０５４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１１０３０５２１３（ＣＮ，Ａ）

【文献】Molecular Cancer Therapeutics，2020年11月，Vol.19, No.1，pp.2235-2244

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

構造が式Ｉで表される通りである、抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物。

【化1】

（ただし、Ａｂは、Ｂ７－Ｈ３抗体であり、ｍは、２～８であり、
Ｄは、

【化2】

であり、Ｒ ^２ 及びＲ ^５ は、それぞれ独立してＨ、Ｃ _１ ～Ｃ _６ アルキル又はハロゲンであり、Ｒ ^３ 及びＲ ^６ は、それぞれ独立してＨ、Ｃ _１ ～Ｃ _６ アルキル又はハロゲンであり、Ｒ ^４ 及びＲ ^７ は、それぞれ独立してＣ _１ ～Ｃ _６ アルキルであり、
Ｒ^１は、１つ又は複数の－ＮＲ^１－１Ｒ^１－２により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキル、１つ又は複数のＲ^１－３Ｓ（Ｏ）_２－により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキル、又はＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、前記Ｒ^１－１、Ｒ^１－２及びＲ^１－３は、それぞれ独立してＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、
Ｌ_１は、フェニルアラニン残基、アラニン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、プロリン残基、及びバリン残基の１つ又は複数であり、ｐは、２～４であり、
Ｌ_２は、

【化3】

であり、ここで、ｎは、独立して１～１２であり、ｃ端はカルボニルを介してＬ_１に連結され、ｆ端はＬ_３のｄ端に連結され、
Ｌ_３は、

【化4】

であり、ここで、ｂ端は前記Ａｂに連結され、ｄ端は前記Ｌ_２のｆ端に連結される。）

【請求項2】

Ｌ _３のｂ端は、前記抗体上のスルフヒドリルと、チオエーテルの形態で連結され、
及び／又は、前記Ｒ^１が、１つ又は複数の－ＮＲ^１－１Ｒ^１－２により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記Ｃ_１～Ｃ_６アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、
及び／又は、前記Ｒ^１が、複数の－ＮＲ^１－１Ｒ^１－２により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記複数は、２つ又は３つであり、
及び／又は、前記Ｒ^１－１及びＲ^１－２が、それぞれ独立してＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記Ｃ_１～Ｃ_６アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、
及び／又は、前記Ｒ^１が、１つ又は複数のＲ^１－３Ｓ（Ｏ）_２－により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記Ｃ_１～Ｃ_６アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、
及び／又は、前記Ｒ^１が、複数のＲ^１－３Ｓ（Ｏ）_２－により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記複数は、２つ又は３つであり、
及び／又は、前記Ｒ^１－３が、Ｃ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記Ｃ_１～Ｃ_６アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、
及び／又は、前記Ｒ^１が、Ｃ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記Ｃ_１～Ｃ_６アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、
及び／又は、前記ｍは、４～８の整数又は非整数であり、
及び／又は、前記ｐは、２であり、
及び／又は、前記ｎは、８～１２であり、
及び／又は、前記Ｒ^１－１、Ｒ^１－２及びＲ^１－３が、独立してＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記Ｃ_１～Ｃ_６アルキルは、Ｃ_１～Ｃ_４アルキルであることを特徴とする、請求項１に記載の抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物。

【請求項3】

前記Ｒ^２及びＲ^５が、それぞれ独立してＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記Ｃ_１～Ｃ_６アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、
及び／又は、前記Ｒ^２及びＲ^５が、それぞれ独立してハロゲンである場合、前記ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素であり、
及び／又は、前記Ｒ^３及びＲ^６が、それぞれ独立してＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記Ｃ_１～Ｃ_６アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、
及び／又は、前記Ｒ^３及びＲ^６が、それぞれ独立してハロゲンである場合、前記ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素であり、
及び／又は、前記Ｒ^４及びＲ^７が、それぞれ独立してＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記Ｃ_１～Ｃ_６アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、
及び／又は、前記Ｒ^１が、１つ又は複数の－ＮＲ^１－１Ｒ^１－２により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記－ＮＲ^１－１Ｒ^１－２は、－Ｎ（ＣＨ_３）_２であり、
及び／又は、前記Ｒ^１が、１つの－ＮＲ^１－１Ｒ^１－２により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記１つの－ＮＲ^１－１Ｒ^１－２により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルは、

【化5】

であり、
及び／又は、前記Ｒ^１が、１つのＲ^１－３Ｓ（Ｏ）_２－により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記１つのＲ^１－３Ｓ（Ｏ）_２－により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルは、

【化6】

であり、
及び／又は、前記ｍは、７．４～７．８５であり、
及び／又は、（Ｌ_１）_ｐは、

【化7】

であり、ここで、ｇ端はカルボニルを通じて前記Ｌ_２のｃ端に連結され、
及び／又は、前記ｎは、８、９、１０、１１又は１２であり、
及び／又は、前記Ｒ^１－１、Ｒ^１－２及びＲ^１－３が、独立してＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記Ｃ_１～Ｃ_６アルキルは、メチルであることを特徴とする、請求項１に記載の抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物。

【請求項4】

前記Ｒ^２及びＲ^５が、それぞれ独立してＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記Ｃ_１～Ｃ_６アルキルは、メチルであり、
及び／又は、前記Ｒ^２及びＲ^５が、それぞれ独立してハロゲンである場合、前記ハロゲンは、フッ素であり、
及び／又は、前記Ｒ^３及びＲ^６が、それぞれ独立してＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記Ｃ_１～Ｃ_６アルキルは、メチルであり、
及び／又は、前記Ｒ^３及びＲ^６が、それぞれ独立してハロゲンである場合、前記ハロゲンは、フッ素であり、
及び／又は、前記Ｒ^４及びＲ^７が、それぞれ独立してＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記Ｃ_１～Ｃ_６アルキルは、エチルであり、
及び／又は、前記ｍは、７．４７、７．４８、７．５２、７．６２、７．６４、７．６５、７．６７、７．７２、７．７８、７．８３又は７．８５である
ことを特徴とする、請求項１に記載の抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物。

【請求項5】

Ｒ^２及びＲ^５は、それぞれ独立してＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、
及び／又は、Ｒ^３及びＲ^６は、それぞれ独立してハロゲンであり、
及び／又は、Ｒ^４及びＲ^７は、エチルである、請求項１に記載の抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物。

【請求項6】

前記抗体薬物複合体は、下記のいずれか１つの構成を有することを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物。
（構成２：
前記Ｒ^２及びＲ^５は、それぞれ独立してＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、前記Ｒ^３及びＲ^６は、それぞれ独立してハロゲンである；
構成３：
前記Ｒ^２及びＲ^５は、それぞれ独立してＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、前記Ｒ^３及びＲ^６は、それぞれ独立してハロゲンであり、
前記ｍは、７～８であり、
前記Ｌ_１は、独立してバリン残基及び／又はアラニン残基である；
構成４：
前記Ｄは、

【化8】

である；
構成５：
前記Ｄは、

【化9】

であり、
前記ｍは、７～８であり、
前記Ｌ_１は、独立してバリン残基及び／又はアラニン残基である；
構成２－１：
前記Ａｂは、前記Ｂ７－Ｈ３抗体であり、
Ｄは、

【化10】

である；
構成３－１：
前記Ａｂは、前記Ｂ７－Ｈ３抗体であり、
Ｄは、

【化11】

であり、
ｍは、７～８であり、
Ｌ _１ は、独立してバリン残基及び／又はアラニン残基である。

【請求項7】

前記抗体薬物複合体は、下記の式で表されるいずれか１つの化合物であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物。

【化12】

【化13】

【化14】

【化15】

【化16】

【化17】

【化18】

【化19】

【化20】

【化21】

又は

【化22】

（ただし、Ａｂは、前記Ｂ７－Ｈ３抗体であり、ｍは、７．４７、７．４８、７．５２、７．６２、７．６４、７．６５、７．６７、７．７２、７．７８、７．８３又は７．８５である。）

【請求項8】

前記抗体薬物複合体は、下記の式で表されるいずれか１つの化合物であって、

【化23】

、Ａｂは、前記Ｂ７－Ｈ３抗体であり、ｍは、７．６４であり、

【化24】

、Ａｂは、前記Ｂ７－Ｈ３抗体であり、ｍは、７．６７であり、

【化25】

、Ａｂは、前記Ｂ７－Ｈ３抗体であり、ｍは、７．８３であり、

【化26】

、Ａｂは、前記Ｂ７－Ｈ３抗体であり、ｍは、７．６５であり、

【化27】

、Ａｂは、前記Ｂ７－Ｈ３抗体であり、ｍは、７．７８であり、

【化28】

、Ａｂは、前記Ｂ７－Ｈ３抗体であり、ｍは、７．６２であり、

【化29】

、Ａｂは、前記Ｂ７－Ｈ３抗体であり、ｍは、７．４８であり、

【化30】

、Ａｂは、前記Ｂ７－Ｈ３抗体であり、ｍは、７．５２であり、

【化31】

、Ａｂは、前記Ｂ７－Ｈ３抗体であり、ｍは、７．４７であり、

【化32】

、Ａｂは、前記Ｂ７－Ｈ３抗体であり、ｍは、７．８５であり、又は

【化33】

、Ａｂは、前記Ｂ７－Ｈ３抗体であり、ｍは、７．７２であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物。

【請求項9】

前記Ｂ７－Ｈ３抗体における軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号１に示される通りであり、重鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号２に示される通りである、請求項１に記載の抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物。

【請求項10】

式ＩＩで表される化合物とＡｂ－水素との間で下記に示されるカップリング反応を実行させるステップを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体の製造方法。

【化34】

【請求項11】

物質Ｘ及び医薬補助剤を含む、医薬組成物であって、前記物質Ｘは、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物である、医薬組成物。

【請求項12】

Ｂ７－Ｈ３タンパク質阻害剤の製造における、物質Ｘ又は請求項１１に記載の医薬組成物の使用であって、前記物質Ｘは、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物である、使用。

【請求項13】

腫瘍を治療及び／又は予防するための医薬の製造における、物質Ｘ又は請求項１１に記載の医薬組成物の使用であって、前記物質Ｘは、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物である、使用。

【請求項14】

前記腫瘍は、Ｂ７－Ｈ３陽性腫瘍であり、前記Ｂ７－Ｈ３陽性腫瘍は、Ｂ７－Ｈ３陽性肺癌、卵巣癌、黒色腫、膵臓癌、乳癌、脳神経膠腫、前立腺癌及び胃癌の１つ又は複数である、請求項１３に記載の使用。

【請求項15】

肺癌細胞は、ＮＣＩ－１７０３細胞又はＣａｌｕ－６細胞であり、
及び／又は、卵巣癌細胞は、ＰＡ－１細胞であり、
及び／又は、黒色腫細胞は、Ａ３７５細胞であり、
及び／又は、膵臓癌細胞は、Ｈｓ－７００Ｔ細胞であり、
及び／又は、乳癌細胞は、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞であり、
及び／又は、脳神経膠腫細胞は、ＬＮ－２２９細胞であり、
及び／又は、胃癌細胞は、ＮＣＩ－Ｎ８７細胞である、請求項１４に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はバイオ医学の分野に関し、特にＢ７－Ｈ３を標的とする抗体薬物複合体、その製造方法及び使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ＣＤ２７６としても知られるＢ７－Ｈ３は、２００１年に初めて報告され（Ｃｈａｐｏｖａｌ ＡＩら、Ｎａｔ Ｉｍｍｍｕｎｏｌ ２００１，２（３）：２６９－２７４）、そのタンパク質に一つのｈｅｐｔａｄ構造及びＢ３０．２ドメインが欠けていることから、ブチロフィリン及びミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ではないと考えられ、それを免疫グロブリンスーパーファミリーＢ７ファミリー（Ｃｈａｐｏｖａｌ ＡＩら、Ｎａｔ Ｉｍｍｍｕｎｏｌ ２００１，２（３）：２６９－２７４）に属すると判明し、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６などの他のファミリーメンバーとの違いは、Ｂ７－Ｈ３は、ヒトで２ＩｇＢ７－Ｈ３及び４ＩｇＢ７－Ｈ３の２つの異なる変異体として存在し、その中で４ＩｇＢ７－Ｈ３は２ＩｇＢ７－Ｈ３のエクソンコピーであり、人体では主に４ＩｇＢ７－Ｈ３として存在し（Ｓｕｎ Ｍら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００２，１６８（１２）：６２９４－６２９７；Ｌｉｎｇ Ｖら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２００３，８２（３）：３６５－３７７；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ Ｐら、 Ｊ ＩＭＭＵＮＯＬ ２００４，１７２（４）：２３５２－２３５９）、マウスでは２ＩｇＢ７－Ｈ３構造（Ｓｕｎ Ｍら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００２，１６８（１２）：６２９４－６２９７）のみを含む。この研究の結果は、天然マウスの２ＩｇＢ７－Ｈ３とヒト４ＩｇＢ７－Ｈ３が、機能的な差のない同様の機能を示すことを示し（Ｌｉｎｇ Ｖら、 Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２００３，８２（３）：３６５－３７７； Ｈｏｆｍｅｙｅｒ ＫＡら、 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ）Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ Ａ ２００８，１０５（３０）：１０２７７－１０２７８．）、結晶構造は、当該タンパク質のＩｇＶ領域のＦＧ ｌｏｏｐがＢ７－Ｈ３の機能にとって重要なエピトープであることを示している（Ｖｉｇｄｏｒｏｖｉｃｈ Ｖら、 Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２０１３，２１（５）：７０７－７１７）。

【0003】

Ｂ７－Ｈ３のｍＲＮＡレベルは広く発現され、例えば、心臓、肝臓、胎盤、前立腺、精巣、子宮、膵臓、小腸及び結腸など、人体の多くの組織や器官で高レベルのＢ７－Ｈ３のｍＲＮＡレベルが検出されるが、タンパク質発現レベルは、休止状態の線維芽細胞、内皮細胞、骨芽細胞、羊水幹細胞などの非免疫細胞、ならびに誘導抗原提示細胞及びＮＫ細胞の表面に相対的に限定されている（Ｈｏｆｍｅｙｅｒ ＫＡら、 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２００８， １０５（３０）：１０２７７－１０２７８；Ｙｉ ＫＨら、 Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２００９， ２２９（１）：１４５－１５１； Ｐｉｃａｒｄａ Ｅら、 ＣＬＩＮ ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳ ２０１６， ２２（１４）：３４２５－３４３１）。Ｂ７－Ｈ３のタンパク質レベルは、正常な健康な組織では低発現し、例えば、正常なヒトの肝臓、肺、膀胱、精巣、前立腺、乳房、胎盤、リンパ器官などの組織では、Ｂ７－Ｈ３の低いタンパク質レベルが検出されるが、Ｂ７－Ｈ３タンパク質は多くの悪性腫瘍で過剰発現し、腫瘍細胞のマーカー抗原であり、研究では、Ｂ７－Ｈ３が前立腺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、黒色腫、胃癌、膀胱癌、悪性神経膠腫及び骨肉腫などの多くの癌で高度に発現され、特に頭頸部癌、腎臓癌、神経膠腫及び甲状腺癌などの多くの癌で異常に高発現され（Ｒｏｔｈ ＴＪら、 ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳ ２００７， ６７（１６）：７８９３－７９００；Ｚａｎｇ Ｘら、 ＭＯＤＥＲＮ ＰＡＴＨＯＬ ２０１０， ２３（８）：１１０４－１１１２；Ｉｎｇｅｂｒｉｇｔｓｅｎ ＶＡら、 ＩＮＴ Ｊ ＣＡＮＣＥＲ ２０１２， １３１（１１）：２５２８－２５３６；Ｓｕｎ Ｊら、 Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ２０１０， ５９（８）：１１６３－１１７１；Ｃｒｉｓｐｅｎ ＰＬら、 ＣＬＩＮ ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳ ２００８， １４（１６）：５１５０－５１５７；Ｚｈａｎｇ Ｇら、 ＬＵＮＧ ＣＡＮＣＥＲ ２００９， ６６（２）：２４５－２４９；Ｙａｍａｔｏ Ｉら、 Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００９， １０１（１０）：１７０９－１７１６；Ｔｅｋｌｅ Ｃら、 ＩＮＴ Ｊ ＣＡＮＣＥＲ ２０１２， １３０（１０）：２２８２－２２９０；Ｋａｔａｙａｍａ Ａら、 ＩＮＴ Ｊ ＯＮＣＯＬ ２０１１， ３８（５）：１２１９－１２２６；Ｗｕ ＣＰら、 Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２００６， １２（３）：４５７－４５９；Ｗｕ Ｄら、 ＯＮＣＯＬ ＬＥＴＴ ２０１５， ９（３）：１４２０－１４２４）、Ｂ７－Ｈ３は腫瘍細胞で発現されるだけでなく、腫瘍新生血管内皮細胞でも高度に発現され、非常に広範囲な腫瘍マーカー抗原である。Ｂ７－Ｈ３タンパク質の高発現は癌の進行を促進する可能性があり、患者の予後不良と生存利益の低下に関連している。

【0004】

初期の研究結果では、Ｂ７－Ｈ３が活性化Ｔ細胞の機能を刺激し、ＣＤ４及びＣＤ８細胞の増殖とＩＦＮ－γの分泌を促進できることが示されているが、継続的な研究により、Ｂ７－Ｈ３は免疫チェックポイントとして働き、Ｔ細胞の負の制御分子であり、主にＴ細胞の機能を阻害し、Ｔ細胞の活性をダウンレギュレーションする効果を果たしていることが示された。Ｗｏｏｎｇ－Ｋｙｕｎｇ Ｓｕｈ及びＤｕｒｂａｋａ Ｖ． Ｒ． Ｐｒａｓａｄによる研究では、マウスのＢ７－Ｈ３タンパク質が用量依存的にＣＤ４、ＣＤ８細胞の増殖を有意に阻害できることが示された（Ｓｕｈ Ｗら、 ＮＡＴ ＩＭＭＵＮＯＬ ２００３， ４（９）：８９９－９０６；Ｐｒａｓａｄ ＤＶＲら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００４， １７３（４）：２５００－２５０６）。Ｊｕｄｉｔｈ Ｌｅｉｔｎｅｒらによる研究では、ヒト４Ｉｇ－Ｂ７－Ｈ３Ｉｇ及び２Ｉｇ－Ｂ７－Ｈ３Ｉｇがいずれも体外でＴ細胞の増殖を阻害し、ＣＤ４、ＣＤ８細胞に関連するサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３）の分泌を阻害することを示し（Ｌｅｉｔｎｅｒ Ｊら、ＥＵＲ Ｊ ＩＭＭＵＮＯＬ ２００９， ３９（７）：１７５４－１７６４）、さらなる分析によりＢ７－Ｈ３は主にＩＬ－２の産生を阻害してＴ細胞の阻害を媒介することが示された。しかし、マウスの体内でＢ７－Ｈ３を標的として中和する抗体は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の進行及びＣＤ４細胞の増殖を有意に促進する可能性があり、これは体内でのＴ細胞の阻害におけるＢ７－Ｈ３の機能を客観的に示している（Ｐｒａｓａｄ ＤＶＲら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００４， １７３（４）：２５００－２５０６）。Ｗｏｏｎｇ－Ｋｙｕｎｇ Ｓｕｈの研究では、Ｂ７－Ｈ３欠損マウスは野生型マウスよりも免疫ＥＡＥ条件下で早期に実験的自己免疫性脳脊髄炎（Ｔｈ１細胞によって引き起こされる）を示し、Ｂ７－Ｈ３が主にＴｈ１細胞を阻害することが示された（Ｓｕｈ Ｗら、ＮＡＴ ＩＭＭＵＮＯＬ ２００３， ４（９）：８９９－９０６）。上述のように、Ｂ７－Ｈ３のＴ細胞に対する機能は議論されているが、Ｂ７－Ｈ３によるＴ細胞機能の促進はマウスの研究でのみ現れており、ヒトＢ７－Ｈ３によるＴ細胞機能の促進はまだ報告されてなく、Ｂ７－Ｈ３ので受容体はまだ同定されていないが、Ｂ７－Ｈ３がＴ細胞の負の制御分子であることが現在学界の主な見解である。

【0005】

Ｂ７－Ｈ３がＴ細胞の活性を阻害し、それによって腫瘍細胞が免疫監視から逃れることを媒介できること基づいて、Ｂ７－Ｈ３の未知の受容体への結合をブロックして、Ｔ細胞の活性化を媒介し、腫瘍細胞の活性を阻害することは効果的であり、例えば、Ｅｎｏｂｌｉｔｕｚｕｍａｂの既存の臨床結果は、異なる腫瘍のいずれにも異なる程度の寛解を有し、良好な治療効果があることを示しているが、依然として疾患が進行している患者が多数存在するため、Ｂ７－Ｈ３に対するモノクローナル抗体の単純な開発には臨床上の大きなアンメットニーズまだ残されており、既存の臨床結果は、その抗腫瘍効果を更に改善する必要があることを示している。

【0006】

抗体薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）は、新世代の抗体標的治療薬であり、主に癌腫瘍の治療に使用される。ＡＤＣ医薬品は、低分子細胞傷害性薬剤（Ｄｒｕｇ）、抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ）、及び抗体と細胞傷害性薬剤をつなぐリンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）で構成されており、低分子細胞傷害性薬剤は化学結合により抗体タンパク質に結合している。ＡＤＣ薬物は抗体を使用して小分子薬を特異的に認識し、癌特異抗原を発現する癌細胞標的に誘導し、エンドサイトーシスを通じて癌細胞に侵入する。リンカー部分は、細胞内の低ｐＨ値環境又はリソソームプロテアーゼの作用下で破壊され、小分子の細胞毒性薬物を放出し、正常組織細胞に損傷を与えることなく癌細胞を特異的に殺傷する効果を達成できる。従って、ＡＤＣ薬物は抗体の標的特異性及び癌細胞に対する小分子毒素の高い毒性の特徴を結合し、薬物の有効な治療用量範囲（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｗｉｎｄｏｗ）を大幅に拡大する。臨床研究では、ＡＤＣ薬物は有効性が高く、血液中で比較的安定し、循環系及び健康な組織に対する低分子細胞傷害性薬剤（化学薬品）の毒性を効果的に軽減できることが証明されており、現在抗癌薬物の国際研究開発における研究ホットスポットとなっている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明が解決しようとする技術的課題は、既存の抗体薬物複合体の種類が単一である欠点を克服するための、Ｂ７－Ｈ３を標的とする抗体薬物複合体、その製造方法及び使用を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明により提供される抗体薬物複合体は、良好なターゲティングを有し、Ｂ７－Ｈ３を陽性発現する腫瘍細胞に対して良好な阻害効果を有し、更に良好な創薬可能性及び安全性を有する。当該抗体薬物複合体は、Ｂ７－Ｈ３に対して阻害効果を有し、またＮＣＩ－Ｎ８７、Ａ３７５、ＬＮ－２２９、ＰＡ－１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、Ｃａｌｕ－６及びＨｓ－７００Ｔ細胞の少なくとも１つに対して良好な効果を有する。

【0009】

本発明は、以下の技術的解決手段を通じて上記の技術的問題を解決する。

【0010】

本発明は、構造が式Ｉで表される通りである、抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物を提供する。

【0011】

【化1】

【0012】

ただし、Ａｂは、Ｂ７－Ｈ３抗体又はＢ７－Ｈ３抗体の変異体であり、ｍは、２～８であり、
前記Ｂ７－Ｈ３抗体における軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号１に示される通りであり、重鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号２に示される通りであり、
前記Ｂ７－Ｈ３抗体の変異体は、Ｂ７－Ｈ３抗体と比べて、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％以上の相同性を有し、
Ｄは、細胞毒性薬トポイソメラーゼ阻害剤であり、
Ｒ^１は、１つ又は複数の－ＮＲ^１－１Ｒ^１－２により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキル、１つ又は複数のＲ^１－３Ｓ（Ｏ）_２－により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_３～Ｃ_１０シクロアルキル、Ｃ_６～Ｃ_１４アリール又は５～１４員ヘテロアリールであり、前記５～１４員ヘテロアリールのヘテロ原子は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１つ又は複数であり、ヘテロ原子の数は、１、２、３又は４であり、前記Ｒ^１－１、Ｒ^１－２及びＲ^１－３は、それぞれ独立してＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、
Ｌ_１は、独立してフェニルアラニン残基、アラニン残基、グリシン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、システイン残基、グルタミン酸残基、ヒスチジン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、リジン残基、メチオニン残基、プロリン残基、セリン残基、スレオニン残基、トリプトファン残基、チロシン残基及びバリン残基の１つ又は複数であり、ｐは、２～４であり、
Ｌ_２は、

【0013】

【化2】

【0014】

であり、ここで、ｎは、独立して１～１２であり、ｃ端はカルボニルを介してＬ_１に連結され、ｆ端は前記Ｌ_３のｄ端に連結され、

【0015】

Ｌ_３は、

【0016】

【化3】

【0017】

であり、ここで、ｂ端は前記Ａｂに連結され、ｄ端は前記Ｌ_２のｆ端に連結される。

【0018】

本発明の好ましい実施形態において、前記抗体薬物複合体において、特定の基は以下の定義を有し、言及されていない基の定義は、上記の方案のいずれかに記載される通りである（以下、本段落の内容を「本発明の好ましい実施形態において」と言う）。

【0019】

前記Ｌ_３のｂ端は、好ましくは前記抗体のスルフヒドリルと、チオエーテル結合の形態で連結されている。

【0020】

【化4】

【0021】

を例として、

【0022】

【化5】

【0023】

と前記抗体のシステイン残基との連結形態は

【0024】

【化6】

【0025】

である。

【0026】

本発明の好ましい実施形態において、Ｄが細胞阻害性薬物トポイソメラーゼ阻害剤である場合、前記細胞阻害性薬物トポイソメラーゼ阻害剤は、好ましくは

【0027】

【化7】

【0028】

であり、Ｒ^２及びＲ^５は、それぞれ独立してＨ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル又はハロゲンであり、Ｒ^３及びＲ^６は、それぞれ独立してＨ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル又はハロゲンであり、Ｒ^４及びＲ^７は、それぞれ独立してＣ_１～Ｃ_６アルキルである。

【0029】

本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ^２及びＲ^５が、それぞれ独立してＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記Ｃ_１～Ｃ_６アルキルは、好ましくはＣ_１～Ｃ_４アルキルであり、より好ましくはメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、最も好ましくはメチルである。

【0030】

本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ^２及びＲ^５が、それぞれ独立してハロゲンである場合、前記ハロゲンは、好ましくはフッ素、塩素、臭素又はヨウ素であり、より好ましくはフッ素である。

【0031】

本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ^３及びＲ^６が、それぞれ独立してＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記Ｃ_１～Ｃ_６アルキルは、好ましくはＣ_１～Ｃ_４アルキルであり、より好ましくはメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、最も好ましくはメチルである。

【0032】

本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ^３及びＲ^６が、それぞれ独立してハロゲンである場合、前記ハロゲンは、好ましくはフッ素、塩素、臭素又はヨウ素であり、より好ましくはフッ素である。

【0033】

本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ^４及びＲ^７が、それぞれ独立してＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記Ｃ_１～Ｃ_６アルキルは、好ましくはＣ_１～Ｃ_４アルキルであり、より好ましくはメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、最も好ましくはエチルである。

【0034】

本発明の好ましい実施形態において、Ｒ^２及びＲ^５は、それぞれ独立してＣ_１～Ｃ_６アルキルである。

【0035】

本発明の好ましい実施形態において、Ｒ^３及びＲ^６は、それぞれ独立してハロゲンである。

【0036】

本発明の好ましい実施形態において、Ｒ^４及びＲ^７は、エチルである。

【0037】

本発明の好ましい実施形態において、Ｄは、

【0038】

【化8】

【0039】

である。

【0040】

本発明の好ましい実施形態において、前記Ｄが

【0041】

【化9】

【0042】

である場合、前記抗体薬物複合体は、

【0043】

【化10】

【0044】

であってもよい。

【0045】

本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ^１が、１つ又は複数の－ＮＲ^１－１Ｒ^１－２により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記Ｃ_１～Ｃ_６アルキルは、好ましくはメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、より好ましくはエチルである。

【0046】

本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ^１が、複数の－ＮＲ^１－１Ｒ^１－２により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記複数は２つ又は３つである。

【0047】

本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ^１－１及びＲ^１－２が、それぞれ独立してＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記Ｃ_１～Ｃ_６アルキルは、好ましくはメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、より好ましくはメチルである。

【0048】

本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ^１が、１つ又は複数の－ＮＲ^１－１Ｒ^１－２により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記－ＮＲ^１－１Ｒ^１－２は、好ましくは－Ｎ（ＣＨ_３）_２である。

【0049】

本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ^１が、１つの－ＮＲ^１－１Ｒ^１－２により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記１つの－ＮＲ^１－１Ｒ^１－２により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルは、好ましくは

【0050】

【化11】

【0051】

である。

【0052】

本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ^１が、１つ又は複数のＲ^１－３Ｓ（Ｏ）_２－により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記Ｃ_１～Ｃ_６アルキルは、好ましくはＣ_１～Ｃ_４アルキルであり、より好ましくはメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、最も好ましくはエチルである。

【0053】

本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ^１が、複数のＲ^１－３Ｓ（Ｏ）_２－により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記複数は２つ又は３つである。

【0054】

本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ^１－３が、Ｃ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記Ｃ_１～Ｃ_６アルキルは、好ましくはメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、より好ましくはメチルである。

【0055】

本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ^１が、１つのＲ^１－３Ｓ（Ｏ）_２－により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記１つのＲ^１－３Ｓ（Ｏ）_２－により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルは、

【0056】

【化12】

【0057】

である。

【0058】

本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ^１が、Ｃ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記Ｃ_１～Ｃ_６アルキルは、好ましくはメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、最も好ましくはメチルである。

【0059】

本発明の好ましい実施形態において、前記ｍは、整数（例えば、２、３、４、５、６、７又は８）又は非整数であり、好ましくは４～８であり、より好ましくは６～８であり、より好ましくは７～８であり、更に好ましくは７．４～７．８５であり、例えば、７．４７、７．４８、７．５２、７．６２、７．６４、７．６５、７．６７、７．７２、７．７８、７．８３又は７．８５である。

【0060】

本発明の好ましい実施形態において、前記Ｌ_１は、好ましくはフェニルアラニン残基、アラニン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、プロリン残基及びバリン残基の１つ又は複数であり、より好ましくはフェニルアラニン残基、アラニン残基、グリシン残基及びバリン残基の１つ又は複数であり、より好ましくはバリン残基及び／又はアラニン残基であり、前記複数は、好ましくは２つ又は３つであり、前記ｐは、好ましくは２である。

【0061】

本発明の好ましい実施形態において、前記（Ｌ_１）_ｐは、好ましくは

【0062】

【化13】

【0063】

であり、ここで、ｇ端はカルボニルを通じて前記Ｌ_２のｃ端に連結される。

【0064】

本発明の好ましい実施形態において、前記ｎは、好ましくは８～１２であり、例えば、８、９、１０、１１及び１２であり、また例えば、８又は１２である。

【0065】

本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ^１－１、Ｒ^１－２及びＲ^１－３が、独立して好ましくはＣ_１～Ｃ_６アルキルである場合、前記Ｃ_１～Ｃ_６アルキルは、好ましくはＣ_１～Ｃ_４アルキルであり、より好ましくはメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、最も好ましくはメチルである。

【0066】

本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ^１は、好ましくは１つ又は複数の－ＮＲ^１－１Ｒ^１－２により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキル、１つ又は複数のＲ^１－３Ｓ（Ｏ）_２－により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル又はＣ_３～Ｃ_１０シクロアルキルであり、より好ましくは１つ又は複数の－ＮＲ^１－１Ｒ^１－２により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキル、１つ又は複数のＲ^１－３Ｓ（Ｏ）_２－により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキル、又は、Ｃ_１～Ｃ_６アルキルであり、より好ましくは１つ又は複数の－ＮＲ^１－１Ｒ^１－２により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキル、又は、１つ又は複数のＲ^１－３Ｓ（Ｏ）_２－により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、最も好ましくは１つ又は複数のＲ^１－３Ｓ（Ｏ）_２－により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルである。

【0067】

本発明において、Ａｂが、Ｂ７－Ｈ３抗体又はＢ７－Ｈ３抗体の変異体である場合、前記Ｂ７－Ｈ３抗体又はＢ７－Ｈ３抗体の変異体は、Ｂ７－Ｈ３抗体の残基（Ｂ７－Ｈ３抗体における１つのスルフヒドリル上の水素が置換されて形成した基）又はＢ７－Ｈ３抗体の変異体の残基（Ｂ７－Ｈ３抗体の変異体における１つのスルフヒドリル上の水素が置換されて形成した基）である。

【0068】

本発明の好ましい実施形態において、前記の式Ｉで表される化合物は、下記のいずれか１つスキームに記載された通りである。

【0069】

スキーム１：
Ａｂは、Ｂ７－Ｈ３抗体又はＢ７－Ｈ３抗体の変異体であり、好ましくはＢ７－Ｈ３抗体であり、
Ｄは、

【0070】

【化14】

【0071】

であり、Ｒ^２及びＲ^５は、それぞれ独立してＨ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル又はハロゲンであり、Ｒ^３及びＲ^６は、それぞれ独立してＨ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル又はハロゲンであり、Ｒ^４及びＲ^７は、それぞれ独立してＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、Ｄは、好ましくは

【0072】

【化15】

【0073】

であり、
Ｒ^１は、１つ又は複数の－ＮＲ^１－１Ｒ^１－２により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキル、１つ又は複数のＲ^１－３Ｓ（Ｏ）_２－により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル又はＣ_３～Ｃ_１０シクロアルキルであり、
Ｌ_１は、独立してフェニルアラニン残基、アラニン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、プロリン残基及びバリン残基の１つ又は複数であり、

【0074】

スキーム２：
前記Ａｂは、Ｂ７－Ｈ３抗体又はＢ７－Ｈ３抗体の変異体であり、好ましくはＢ７－Ｈ３抗体であり、
Ｄは、

【0075】

【化16】

【0076】

であり、前記Ｒ^２及びＲ^５は、それぞれ独立してＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、前記Ｒ^３及びＲ^６は、それぞれ独立してハロゲンであり、Ｄは、好ましくは

【0077】

【化17】

【0078】

であり、
前記Ｒ^１は、１つ又は複数の－ＮＲ^１－１Ｒ^１－２により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキル、１つ又は複数のＲ^１－３Ｓ（Ｏ）_２－により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキル、又は、Ｃ_１～Ｃ_６アルキルであり、
Ｌ_１は、独立してフェニルアラニン残基、アラニン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、プロリン残基及びバリン残基の１つ又は複数であり、

【0079】

スキーム３：
前記Ａｂは、Ｂ７－Ｈ３抗体又はＢ７－Ｈ３抗体の変異体であり、好ましくはＢ７－Ｈ３抗体であり、
Ｄは、

【0080】

【化18】

【0081】

であり、前記Ｒ^２及びＲ^５は、それぞれ独立してＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、前記Ｒ^３及びＲ^６は、それぞれ独立してハロゲンであり、Ｄは、好ましくは

【0082】

【化19】

【0083】

であり、
前記ｍは、７～８であり、
前記Ｒ^１は、１つ又は複数の－ＮＲ^１－１Ｒ^１－２により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキル、１つ又は複数のＲ^１－３Ｓ（Ｏ）_２－により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキル、又は、Ｃ_１～Ｃ_６アルキルであり、
前記Ｌ_１は、独立してバリン残基及び／又はアラニン残基であり、

【0084】

スキーム４：
前記Ａｂは、Ｂ７－Ｈ３抗体又はＢ７－Ｈ３抗体の変異体であり、好ましくはＢ７－Ｈ３抗体であり、
前記Ｄは、

【0085】

【化20】

【0086】

であり、
前記Ｒ^１は、１つ又は複数の－ＮＲ^１－１Ｒ^１－２により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキル、１つ又は複数のＲ^１－３Ｓ（Ｏ）_２－により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキル、又は、Ｃ_１～Ｃ_６アルキルであり、

【0087】

スキーム５：
前記Ａｂは、Ｂ７－Ｈ３抗体又はＢ７－Ｈ３抗体の変異体であり、好ましくはＢ７－Ｈ３抗体であり、
前記Ｄは、

【0088】

【化21】

【0089】

であり、
前記ｍは、７～８であり、

【0090】

つ又は複数のＲ^１－３Ｓ（Ｏ）_２－により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキル、又は、Ｃ_１～Ｃ_６アルキルであり、
前記Ｌ_１は、独立してバリン残基及び／又はアラニン残基である。

【0091】

本発明の好ましい実施形態において、前記抗体薬物複合体は、好ましくは

【0092】

【化22】

【0093】

【化23】

【0094】

又は

【0095】

【化24】

【0096】

である。

【0097】

本発明の好ましい実施形態において、前記Ｌ_２は、好ましくは、

【0098】

【化25】

【0099】

である。

【0100】

本発明の好ましい実施形態において、前記Ａｂは、Ｂ７－Ｈ３抗体であり、Ｄは、

【0101】

【化26】

【0102】

であり、Ｌ_１は、バリン残基及び／又はアラニン残基であり、ｐは、２であり、（Ｌ_１）ｐは、好ましくは

【0103】

【化27】

【0104】

であり、Ｒ^１は、１つ又は複数の－ＮＲ^１－１Ｒ^１－２により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキル、１つ又は複数のＲ^１－３Ｓ（Ｏ）_２－により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキル又はＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、好ましくは１つ又は複数の－ＮＲ^１－１Ｒ^１－２により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキル、又は、１つ又は複数のＲ^１－３Ｓ（Ｏ）_２－により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、より好ましくは１つ又は複数のＲ^１－３Ｓ（Ｏ）_２－により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、前記Ｒ^１－１、Ｒ^１－２及びＲ^１－３は、独立してＣ_１～Ｃ_４アルキルであり、好ましくはメチルであり、前記１つ又は複数の－ＮＲ^１－１Ｒ^１－２により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルは、好ましくは

【0105】

【化28】

【0106】

であり、前記１つ又は複数のＲ^１－３Ｓ（Ｏ）_２－により置換されたＣ_１～Ｃ_６アルキルは、好ましくは

【0107】

【化29】

【0108】

であり、Ｌ_２は、

【0109】

【化30】

【0110】

であり、Ｌ_３は、

【0111】

【化31】

【0112】

である。

【0113】

本発明の好ましい実施形態において、前記抗体薬物複合体は、好ましくは下記の式で表されるいずれか１つ化合物である。

【0114】

【化32】

【0115】

【化33】

【0116】

又は

【0117】

【化34】

【0118】

ただし、Ａｂは、Ｂ７－Ｈ３抗体又はＢ７－Ｈ３抗体の変異体であり、ｍは、７．４７、７．４８、７．５２、７．６２、７．６４、７．６５、７．６７、７．７２、７．７８、７．８３又は７．８５である。

【0119】

本発明の好ましい実施形態において、前記抗体薬物複合体は、好ましくは下記の式で表されるいずれか１つ化合物である。

【0120】

【化35】

【0121】

、Ａｂは、Ｂ７－Ｈ３抗体であり、ｍは、好ましくは７．６４であり、

【0122】

【化36】

【0123】

、Ａｂは、Ｂ７－Ｈ３抗体であり、ｍは、好ましくは７．６７であり、

【0124】

【化37】

【0125】

、Ａｂは、Ｂ７－Ｈ３抗体であり、ｍは、好ましくは７．８３であり、

【0126】

【化38】

【0127】

、Ａｂは、Ｂ７－Ｈ３抗体であり、ｍは、好ましくは７．６５であり、

【0128】

【化39】

【0129】

、Ａｂは、Ｂ７－Ｈ３抗体であり、ｍは、好ましくは７．７８であり、

【0130】

【化40】

【0131】

、Ａｂは、Ｂ７－Ｈ３抗体であり、ｍは、好ましくは７．６２であり、

【0132】

【化41】

【0133】

、Ａｂは、Ｂ７－Ｈ３抗体であり、ｍは、好ましくは７．４８であり、

【0134】

【化42】

【0135】

、Ａｂは、Ｂ７－Ｈ３抗体であり、ｍは、好ましくは７．５２であり、

【0136】

【化43】

【0137】

、Ａｂは、Ｂ７－Ｈ３抗体であり、ｍは、好ましくは７．４７であり、

【0138】

【化44】

【0139】

、Ａｂは、Ｂ７－Ｈ３抗体であり、ｍは、好ましくは７．８５であり、又は

【0140】

【化45】

【0141】

、Ａｂは、Ｂ７－Ｈ３抗体であり、ｍは、好ましくは７．７２である。

【0142】

本発明はまた、式ＩＩで表される化合物とＡｂ－水素を下記に示されるカップリング反応を実行させるステップを含む、抗体薬物複合体の製造方法を提供する。

【0143】

【化46】

【0144】

ただし、前記Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ^１、ｐ及びＡｂの定義は上記で記載した通りである。

【0145】

本発明において、前記カップリング反応の条件及び操作は、当技術分野におけるカップリング反応の通常の条件及び操作であってもよい。

【0146】

本発明はまた、物質Ｘ及び医薬補助剤を含む、医薬組成物を提供し、前記物質Ｘは、上記抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物である。

【0147】

前記医薬組成物において、前記上記の物質Ｘの使用量は、治療有効量であってもよい。

【0148】

本発明はまた、Ｂ７－Ｈ３タンパク質阻害剤の製造における上記の物質Ｘ又は上記の医薬組成物の使用を提供する。

【0149】

本発明はまた、腫瘍を治療及び／又は予防するための医薬の製造における、上記の物質Ｘ又は上記の医薬組成物の使用を提供し、前記腫瘍は、好ましくはＢ７－Ｈ３陽性腫瘍である。前記Ｂ７－Ｈ３陽性腫瘍は、好ましくはＢ７－Ｈ３陽性肺癌、卵巣癌、黒色腫、膵臓癌、乳癌、脳神経膠腫、前立腺癌及び胃癌の１つ又は複数である。

【0150】

本発明のいくつかの実施形態において、前記肺癌において、肺癌細胞は、ＮＣＩ－１７０３細胞又はＣａｌｕ－６細胞であり、
本発明のいくつかの実施形態において、前記卵巣癌において、卵巣癌細胞は、ＰＡ－１細胞であり、
本発明のいくつかの実施形態において、前記黒色腫において、黒色腫細胞は、Ａ３７５細胞であり、
本発明のいくつかの実施形態において、前記膵臓癌において、膵臓癌細胞は、Ｈｓ－７００Ｔ細胞であり、
本発明のいくつかの実施形態において、前記乳癌において、乳癌細胞は、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞であり、
本発明のいくつかの実施形態において、前記脳神経膠腫において、脳神経膠腫細胞は、ＬＮ－２２９細胞であり、
本発明のいくつかの実施形態において、前記胃癌において、胃癌細胞は、ＮＣＩ－Ｎ８７細胞である。

【0151】

別途に説明しない限り、本発明の明細書及び請求の範囲で使用される用語は、以下の意味を有する。

【0152】

前記の医薬賦形剤は、医薬製造分野で広く使用されている賦形剤であってもよい。賦形剤は主に、安全、安定及び機能的な医薬組成物を提供するために使用され、更に対象に投与後に有効成分を所望の速度で溶解できるようにする方法、又は対象への組成物の投与後の有効成分の効果的な吸収が促進されるようにする方法を提供することができる。前記医薬賦形剤は、不活性充填剤であってもよく、又は特定の機能、例えば、当該組成物の全体的なｐＨを安定化させるか又は組成物の有効成分の分解を防ぐ機能を提供する。前記医薬賦形剤には、緩衝剤、キレート剤、防腐剤、可溶化剤、安定剤、賦形剤及び界面活性剤着色剤、矯味剤及び甘味料の１つ又は複数が含まれる。

【0153】

用語「薬学的に許容される」とは、一般に無毒で、安全で、また患者への使用に適した塩、溶媒、助剤などを指す。前記の「患者」は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。

【0154】

用語「薬学に許容される塩」とは、本発明の化合物と比較的に無毒で、薬学的に許容される酸又は塩基で製造された塩を指す。本発明の化合物に比較的に酸性の官能基が含まれる場合、単独の溶液又は適切な不活性溶媒において十分な量の薬学的に許容される塩基とこれらの化合物の中性の形態と接触させることで塩基付加塩を得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩は、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩、ビスマス塩、アンモニウム塩、ジエタノールアミン塩などが含まれるが、これらに限定されない。本発明の化合物に比較的塩基性の官能基が含まれる場合、単独の溶液又は、適切な不活性溶媒において十分な量の薬学的に許容される酸とこれらの化合物の中性形態と接触させることで酸付加塩を得ることができる。前記薬学的に許容される酸は、無機酸を含み、前記無機酸は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、リン酸、亜リン酸、硫酸などが含まれるが、これらに限定されない。前記薬学的に許容される酸は、有機酸を含み、前記有機酸は、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、クエン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、イソニコチン酸、酸性クエン酸、オレイン酸、タンニン酸、パントテン酸、酒石酸水素、アスコルビン酸、ゲンチジン酸、フマル酸、グルコン酸、糖酸、ギ酸、エタンスルホン酸、パモ酸（即ち、４，４’－メチレンビス（３－ヒドロキシ－２－ナフトエ酸）、アミノ酸（グルタミン酸、アルギニンなど）などが含まれるが、これらに限定されない。本発明の化合物に比較的酸性及び比較的塩基性の官能基が含まれる場合、塩基付加塩又は酸付加塩に転換することができる。具体的にはＢｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．， 「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６６： １－１９ （１９７７）、又は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ： Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｕｓｅ （Ｐ． Ｈｅｉｎｒｉｃｈ Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃａｍｉｌｌｅ Ｇ． Ｗｅｒｍｕｔｈ， ｅｄ．， Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ， ２００２）を参照できる。

【0155】

用語「溶媒和物」とは、本発明の化合物を化学量論的又は非化学量論的量の溶媒と組み合わせることによって形成される物質を指す。溶媒和物中の溶媒分子は、規則的又は非規則的配置で存在することができる。前記溶媒は、水、メタノール、エタノールなどが含まれるが、これらに限定されない。

【0156】

天然又は天然配列のＢ７－Ｈ３は、自然から分離することができるか、或いは組換えＤＮＡ技術、化学合成、又は上記及び同様の技術の組み合わせによって製造することができる。

【0157】

ここで、抗体は最も広い意味で解釈され、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識領域を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂肪、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合することができる。具体的には、所望の生物学的活性を有する限り、完全なのモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体及び抗体フラグメントが含まれる。本発明の抗体の変異体とは、天然ポリペプチドと同等の生物学的活性が保持されているという条件で、アミノ酸配列の突然変異体、及び天然ポリペプチドの共有結合誘導体を指す。アミノ酸配列突然変異体と天然アミノ酸配列との違いは、一般に、天然アミノ酸配列中の１つ又は複数のアミノ酸が置換されるか、又はポリペプチド配列での１つ又は複数のアミノ酸が欠失及び／又は挿入されることである。欠失突然変異体には、天然ポリペプチドの断片と、Ｎ末端及び／又はＣ末端切断型突然変異体が含まれる。一般に、アミノ酸配列突然変異体は、天然の配列と比較して、少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％）の相同性を有する。

【0158】

本発明の抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、又はこれらの技術の組み合わせ、或いはこの分野で既知の他の技術など、当該分野で既知の技術を用いて製造することができる。

【0159】

用語「抗体薬物複合体比」（ｄｒｕｇ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒａｔｉｏ、即ちＤＡＲ）についての説明する。Ｌ－Ｄは抗体上の結合点と反応する基であり、Ｌはリンカーであり、ＤはＬに連結された抗体に更に結合する細胞傷害性薬剤であり、本発明においてＤはＤｘｄであり、各抗体がＤに最終的に結合するＤＡＲの数をｍで表され、又はｍはＤと結合した単一抗体の数を表すこともできる。いくつかの実施形態において、ｍは、実際には、２～８、４～８又は６～８の間に位置する平均値であり、又はｍは、２、３、４、５、６、７又は８のいずれか１つの整数であり、１つの実施形態において、ｍは、２、４、６、又は８の平均値であり、他の実施形態において、ｍは、２、３、４、５、６、７又は８の平均値である。

【0160】

リンカーとは、抗体と薬物との間を直接的又は間接的連結する部分を指す。リンカーのｍＡｂへの結合は、表面リジン、酸化炭水化物への還元カップリング、及び鎖間ジスルフィド結合によって放出されるシステイン残基の還元など、様々な方法で実現できる。様々なＡＤＣ結合系は当技術分野で周知であり、ヒドラゾン、ジスルフィド及びペプチドベースの結合を含む。

【0161】

用語「治療」又はほかの類似の同義語が、例え癌等に適用される場合、患者の体内の癌細胞の数を減らすか、又は除去すること、又は癌の症状を軽減するための過程またはプロセスを指す。癌又は他の増殖性障害における「治療」は、必ずしも癌細胞又は他の障害が実際に解消されること、細胞又は障害の数が実際に減少すること、又は、癌又は他の障害の症状が実際に減少することを意味するわけではない。通常、成功の可能性が低くても、がんの治療法が実行されるが、患者の病歴と推定生存期間を考慮すると、全体的に有益な行動方針をもたらすと考えられる。

【0162】

用語「予防」とは、疾患又は障害を獲得又は発症するリスクを低減することを指す。

【0163】

用語「シクロアルキル」とは、単環式シクロアルキルを含む、３～２０個の炭素原子を有する飽和環式炭化水素原子団（例えば、Ｃ_３～Ｃ_６シクロアルキル）を指す。シクロアルキルは３～２０個の炭素原子を含み、好ましくは３～１０個の炭素原子を含み、より好ましくは３～６個の炭素原子を含む。シクロアルキルの実例にはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル及びシクロデシルなどが含まれが、これらに限定されない。

【0164】

用語「アルキル」とは、特定の数の炭素原子数を含む直鎖又は分岐鎖アルキルを指す。アルキルの実例には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル及び類似したアルキルが含まれる。

【0165】

用語「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を指す。

【0166】

用語「ヘテロアリール」とは、１、２、３又は４つの独立してＮ、Ｏ及びＳから選択される、ヘテロ原子を含むアリール（又は芳香環）を指し、フリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、チエニル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、ジアゾリル、イミダゾリル、ピロリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリルなどの単環式芳香族系であってもよい。

【0167】

用語「アリール」とは、任意の安定な単環式又は二環式炭素環を指し、その中ではすべての環はいずれも芳香族である。上記アリール単位の実例はフェニル、又はナフチルを含む。

【0168】

前記好ましい条件は、当技術分野の通常の知識を違反しない限り、任意に組み合わせて、本発明の各々の好ましい実施例を得ることができる。

【0169】

特に説明しない限り、本発明における室温は２０～３０℃を指す。

【0170】

本発明で使用される試薬及び原料は市販品として入手できる。

【発明の効果】

【0171】

本発明の積極的な進歩効果は：
１．本発明により提供されるＢ７－Ｈ３抗体を含む抗体薬物複合体は、良好なターゲティングを有し、Ｂ７－Ｈ３などを発現する各種腫瘍細胞に対して良好な阻害効果を有する。
２．体内研究により、本発明の抗体薬物複合体は、より優れた体外細胞毒性、体内抗腫瘍活性を有することを示す。
３．本発明の抗体薬物複合体は良好な溶解性、良好な創薬可能性を有し、カップリング製造過程において沈殿などの異常現象がなく、抗体薬物複合体の製造に非常に適している。

【図面の簡単な説明】

【0172】

【図1】ＦＤＡ０１６抗体の軽鎖、重鎖の発現ベクターの構築を示し、その中でＡｂ－Ｌは、抗体の軽鎖であり、Ａｂ－Ｈは抗体の重鎖である。

【発明を実施するための形態】

【0173】

以下、実施例の形態によってさらに本発明を説明するが、これによって本発明を前記実施例の範囲内に限定するわけではない。以下の実施例において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常の方法及び条件、或いは商品の説明書に従って選ばれる。

【0174】

略語の説明：
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＣＨＯ チャイニーズハムスター卵巣細胞
ＨＴＲＦ 均質時間分解蛍光法
ＰＢ リン酸緩衝液
ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸
ＴＥＣＰ トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＨＡＴＵ ２－（７－アザベンゾトリアゾールオキシド）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ｖ／ｖ Ｖ／Ｖ、体積比
ＵＶ 紫外線可視光
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着測定法
ＢＳＡ ウシ血清アルブミン
ｒｐｍ 回／分（一分間に回転する回転数）
ＦＢＳ ウシ胎児血清

【実施例】

【0175】

実施例１：Ｂ７－Ｈ３抗体の製造

【0176】

本発明では、親和性が高く、Ｂ７－Ｈ３を特異的に標的とするモノクローナル抗体ＦＤＡ０１６を選択し、その軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１に示される通りであり、その重鎖のアミノ酸配列は配列番号２に示される通りである。ＦＤＡ０１６の軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列は、全遺伝子合成（Ｓｕｚｈｏｕ Ｇｅｎｅｗｉｚ）によって取得した。ＥｃｏＲ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ（ＴＡＫＡＲＡから購入）二重酵素切断によってそれぞれｐＶ８１担体に構築し（図１）、ライゲーションによってＴｒａｎｓ１－Ｔ１コンピテントセルに形質転換し（Ｂｅｉｊｉｎｇ ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入、商品番号：ＣＤ５０１－０３）、ＰＣＲ同定のためにクローンを選択し、検査、配列確認し、培養・増幅した陽性クローンを血漿から抽出して、抗体軽鎖の真核生物発現血漿ＦＤＡ０１６－Ｌ／ｐＶ８１及び抗体重鎖の真核生物発現血漿ＦＤＡ０１６－Ｈ／ｐＶ８１を得、これら２つの血漿をＸｂａＩ（Ｔａｋａｒａから購入、商品番号：１０９３Ｓ）で酵素切断して線状化させ、軽鎖、重鎖の真核生物発現血漿の比は１．５／１であり、電気ショックにより懸濁増殖適応のＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣから購入）に形質転換し、電気ショック後の細胞を２０００～５０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに連結し、３週間培養した後、ＨＴＲＦ法（均質時間分解蛍光法）によって発現量を測定し、その中から発現量が上位１０位の細胞プールを選択して増幅した後、凍結保存した。細胞を１２５ｍｌの振盪フラスコ（３０ｍｌの培養体積）で復蘇させ、３７℃、５．０％のＣＯ_２、１３０ｒｐｍで振盪培養し、３日後に１０００ｍｌの振盪フラスコ（３００ｍｌの培養体積）に拡張し、３７℃、５．０％のＣＯ_２、１３０ｒｐｍで振盪培養し、４日目から１日おきに初期培養体積の５～８％のフィード培地の追加を開始し、１０～１２日間培養した後に培養を終了し、回収液を９５００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、細胞沈殿を除去し、上清を収集し、更に０．２２μｍ濾膜で濾過し、処理された試料をＭａｂＳｅｌｅｃｔアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＧＥから購入）で精製して抗体ＦＤＡ０１６を得た。

【0177】

ＦＤＡ０１６の軽鎖アミノ酸配列は下記の通りである：

【0178】

配列番号１：
１ ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＳＩＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＶＹＮ
５１ ＴＫＴＬＰＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＨＨＹＧＴＰＰＷＴＦＧ
１０１ ＱＧＴＲＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫ
１５１ ＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱ
２０１ ＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

【0179】

ＦＤＡ０１６の重鎖アミノ酸配列は下記の通りである：

【0180】

配列番号２：

【0181】

１ ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＴ
５１ ＩＮＳＧＧＳＮＴＹＹＰＤＳＬＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＤ
１０１ ＧＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦ
１５１ ＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣ
２０１ ＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ
２５１ ＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹ
３０１ ＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴ
３５１ ＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳ
４０１ ＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

【0182】

実施例２：リンカー－薬物複合体の合成
実施例２－１：ＬＥ１２の合成

【0183】

【化47】

【0184】

中間体２の合成： （Ｓ）－２－アジドプロピオン酸（１０ｇ、８６．９ｍｍｏｌ）及び４－アミノベンジルアルコール（２１．４０ｇ、１７３．８ｍｍｏｌ）を３００ｍＬのジクロロメタン及びメタノールの混合溶媒（体積比２：１）に溶解させ、２－エトキシ－１－エトキシカルボニル－１，２－ジヒドロキノリン（２１．４９ｇ、８６．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間反応させた後、溶媒を減圧蒸発させ、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：酢酸エチル＝１：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体２（１６．３ｇ、収率：８５％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ ／ ｚ：２２１（Ｍ ＋ Ｈ）であった。

【0185】

中間体３の合成：
中間体２（１５ｇ、６８．２ｍｍｏｌ）及びビス（ｐ－ニトロフェニル）カーボネート（２２．８２ｇ、７５．０２ｍｍｏｌ）を混合して２００ｍＬの無水Ｎ、Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解させ、２５ｍＬのトリエチルアミンを加え、室温で２時間反応させた。液体クロマトグラフィー－質量分析で原料の反応完了をモニターした後、メチルアミン塩酸塩（６．９１ｇ、１０２．３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間反応を続けた。反応終了後、減圧蒸留して溶媒の大部分を除去し、２００ｍＬの水、２００ｍＬの酢酸エチルを加え、溶液を分離した後有機相を収集し、有機相を乾燥させた後に濃縮し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：酢酸エチル＝１０：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体３（１８．９ｇ、収率：１００％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ ／ ｚ：２７８（ Ｍ ＋ Ｈ）であった。

【0186】

中間体５の合成：
中間体３（１０ｇ、３６．１ｍｍｏｌ）及びパラホルムアルデヒド（１．６３ｇ、５４．２ｍｍｏｌ）を混合して１５０ｍＬの無水ジクロロメタンに溶解させ、トリメチルクロロシラン（６．２８ｇ、５７．７６ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、室温で２時間反応させ中間体４の粗溶液を得、サンプリングしてメタノールを加えてクエンチングさせた後、液体質量分析法で反応をモニタリングし、反応終了後、反応液を濾過し、濾液にヒドロキシ酢酸tert-ブチル（９．５４ｇ、７２．２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１０ｍＬ、７２．２ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間反応を続けた。反応終了後、減圧蒸留して溶媒の大部分を除去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［石油エーテル：酢酸エチル＝３：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体５（１１．２ｇ、収率：７４％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ ／ ｚ：４２２（ Ｍ ＋ Ｈ）であった。

【0187】

中間体６の合成：
中間体５（１０ｇ、２３．８ｍｍｏｌ）を８０ｍＬの無水テトラヒドロフランに溶解させ、８０ｍＬの水を加えた後、トリス（２－カルボキシエチルホスフィン）塩酸塩（１３．６ｇ、４７．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間反応させた。反応終了後、減圧蒸留してテトラヒドロフランを除去し、酢酸エチルを加えて抽出した後、得られた有機相を乾燥させ、減圧蒸発して溶媒を除去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：メタノール＝１０：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体６（８．１ｇ、収率：８６％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：３９６（Ｍ＋Ｈ）であった。

【0188】

中間体８の合成：
中間体６（５ｇ、１２．７ｍｍｏｌ）を６０ｍＬのジクロロメタン及びメタノールの混合溶媒（ｖ／ｖ＝２：１）に溶解させ、３ｍＬのトリフルオロ酢酸をゆっくりと加え、室温で３０分間反応させた。反応終了後、同じ体積の水及び酢酸エチルを加え、有機相を乾燥させた後、濃縮し、得られた粗生成物を直接に次のステップに使用した。

【0189】

上記のステップで得られた粗生成物を５０ｍＬの無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解させ、Ｆｍｏｃ－バリンヒドロキシスクシンイミドエステル（８．３ｇ、１９．１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（５ｍＬ）を加え、室温で２時間反応させた。反応終了後、減圧蒸留して溶媒の大部分を除去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：メタノール＝１０：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体８（５．４ｇ、収率：６４％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ ｚ：６６１（Ｍ＋Ｈ）であった。

【0190】

中間体９の合成：
中間体８（１ｇ、１．５ｍｍｏｌ）及びＥｘａｔｅｃａｎメシル酸塩（０．５６８ｇ、１ｍｍｏｌ）を３０ｍＬの無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに混合し、２－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（１．１４ｇ、３．０ｍｍｏｌ）、２ｍＬのトリエチルアミンを加え、室温で２時間反応させた。反応終了後、減圧蒸留して溶媒のを除去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝１０：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体９（０．９４ｇ、収率：８７％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ ｚ：１０７８（Ｍ＋Ｈ）であった。

【0191】

化合物ＬＥ１２の合成：
中間体９（１ｇ、０．９２９ｍｍｏｌ）を２０ｍＬの無水ＤＭＦに溶解させ、０．５ｍＬの１，８－ジアザビシクロウンデカ－７－エンを加え、室温で１時間反応させた。反応終了後、６－（マレイミド）ヘキサン酸スクシンイミジルエステル（４２８．５ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）を直接に加え、室温で１時間撹拌した。減圧蒸留して溶媒を除去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝８：１（ｖ／ｖ）］で精製して表題化合物（０．７ｇ、収率：７３％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：１０３５（Ｍ＋Ｈ）であった。

【0192】

実施例２－２：化合物ＬＥ１３の合成

【0193】

【化48】

【0194】

中間体１４の合成
市販の中間体１２（２６７ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）及びパラホルムアルデヒド（５０ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を混合して２０ｍｌの無水ジクロロメタンに溶解させ、トリメチルクロロシラン（０．３ｍｌ、３．４ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、添加完了後室温で２時間反応させた。その後、サンプリングし、メタノールを加えてクエンチングさせた後、液体質量分析法で反応をモニタリングし、反応終了後に反応溶液を濾過し、濾液にグリコール酸ｔｅｒｔ－ブチル（２１１ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）及び０．５ｍｌのペンピジン（Ｐｅｍｐｉｄｉｎｅ）を加え、室温で約２時間反応を続け、反応終了後、減圧下で蒸留して溶媒の大部分を除去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：メタノール＝２０：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体１４（２６０ｍｇ、収率：６８％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：４７９（Ｍ＋Ｈ）であった。

【0195】

中間体１５の合成
中間体１４（２３８ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を６ｍＬのジクロロメタン及びメタノールの混合溶媒（ｖ／ｖ＝２：１）に溶解させ、０．３ｍＬのトリフルオロ酢酸をゆっくりと加え、室温で３０分間反応させた。反応終了後、同じ体積の水及び酢酸エチルを加え、有機相を乾燥させた後、濃縮し、得られた粗生成物を直接に次のステップに使用した。

【0196】

中間体１６の合成
上記のステップで得られた粗生成物及びＥｘａｔｅｃａｎメシル酸塩（１７０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を５ｍＬの無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに混合し、２－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（３４１ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）、０．６０ｍＬのトリエチルアミンを加え、室温で２時間反応させた。反応終了後、減圧蒸留して溶媒を除去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝１０：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体１６（２１０ｍｇ、収率：８３％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ ｚ：８４０（Ｍ＋Ｈ）であった。

【0197】

中間体１７の合成
中間体１６（１００ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を１５ｍＬの無水テトラヒドロフランに溶解させ、３ｍＬの水を加えた後、１ｍｏｌ／Ｌのトリエチルホスフィン水溶液０．３ｍＬを加え、室温で４時間反応させた。反応の終了をモニタリングした後、反応溶液を減圧蒸留してテトラヒドロフランを除去し、残りの水溶液に炭酸水素ナトリウムを加えて、ｐＨを中性に調節し、ジクロロメタンを加えて抽出し、得られた有機相を乾燥させ、減圧蒸留して溶媒を除去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：メタノール＝１０：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体１７（６９ｍｇ、収率：７１％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：８１４（Ｍ＋Ｈ）であった。

【0198】

化合物ＬＥ１３の合成
前ステップの合成法で得られた中間体１７（１２０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）及び市販の原料ＭＣ－Ｖ（１０２ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を４０ｍＬのジクロロメタンに混合し、縮合剤２－エトキシ－１－エトキシカルボニル－１，２－ジヒドロキノリン（８２ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させ、反応終了後、溶媒を減圧蒸留し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：メタノール＝１０：１（ｖ／ｖ）］で精製して化合物ＬＥ１３（１１６ｍｇ、収率：７０％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：１１０６．５（Ｍ＋Ｈ）であった。

【0199】

実施例２－３：化合物ＬＥ１４の合成

【0200】

【化49】

【0201】

中間体１９の合成
市販の中間体１８（３００ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）とパラホルムアルデヒド（５０ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を混合して２０ｍｌの無水ジクロロメタンに溶解させ、トリメチルクロロシラン（０．３ｍｌ、３．４ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、室温で２時間反応させ、サンプリングし、メタノールを加えてクエンチングさせた後、液体質量分析法で反応をモニタリングした。反応終了後、反応溶液を濾過し、濾液にグリコール酸ｔｅｒｔ－ブチル（２１１ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（０．２２ｍ、１．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で約２時間反応を続け、反応終了後、減圧蒸留して溶媒の大部分を除去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：メタノール＝２０：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体１９（３４９ｍｇ、収率：８５％）を得た。ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：５１４（Ｍ＋Ｈ），^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３） δ ８．１３ （ｓ， １Ｈ）， ７．５６ （ｄ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３５ （ｓ， ２Ｈ）， ５．１４ （ｓ， ２Ｈ）， ４．９１ （ｓ， ２Ｈ）， ４．２５ （ｑ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９９ （ｄ， Ｊ ＝ ４２．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．８５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｄｄ， Ｊ ＝ １８．５， ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．８９ （ｄ， Ｊ ＝ ４８．６ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．６５ （ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．４６ （ｓ， ９Ｈ）。

【0202】

中間体２０の合成
中間体１９（２５７ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を６ｍＬのジクロロメタン及びメタノールの混合溶媒（ｖ／ｖ＝２：１）に溶解させ、０．３ｍＬのトリフルオロ酢酸をゆっくりと加え、室温で３０分間反応させた。反応終了後、同じ体積の水及び酢酸エチルを加え、有機相を乾燥させた後、濃縮し、得られた粗生成物を直接に次のステップに使用した。

【0203】

得られた粗生成物及びＥｘａｔｅｃａｎメシル酸塩（１７０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を５ｍＬの無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに混合し、２－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（３４１ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）、０．０６ｍＬのトリエチルアミンを加え、室温で２時間反応させた。反応終了後、減圧蒸留して溶媒を除去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：メタノール＝２０：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体２０（２１２ｍｇ、収率：８１％）を得た。ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ ｚ：８７５（Ｍ＋Ｈ）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３） δ ８．２７ （ｄ， Ｊ ＝ ３４．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６３ － ７．３５ （ｍ， ５Ｈ）， ７．２１ － ７．１０ （ｍ， １Ｈ）， ５．７１ － ５．４８ （ｍ， ２Ｈ）， ５．２４ － ４．９５ （ｍ， ３Ｈ）， ４．９５ － ４．７２ （ｍ， ４Ｈ）， ４．４５ （ｓ， １Ｈ）， ４．３３ － ３．９７ （ｍ， ３Ｈ）， ３．７５ （ｓ， ２Ｈ）， ３．３９ － ２．９９ （ｍ， ４Ｈ）， ２．７６ （ｄ， Ｊ ＝ １５．３ Ｈｚ， ３Ｈ）， ２．４３ － ２．１５ （ｍ， ５Ｈ）， ２．０４ （ｓ， １Ｈ）， １．９４ － １．７５ （ｍ， ２Ｈ）， １．６２ （ｄ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．１１ － ０．８９ （ｍ， ３Ｈ）。

【0204】

中間体２１の合成
中間体２０（７７ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を１２ｍＬの無水テトラヒドロフランに溶解させ、３ｍＬの水を加えた後、１ｍｏｌ／Ｌのトリエチルホスフィン水溶液を０．３ｍＬ加え、室温で４時間反応させた。反応終了後、減圧蒸留してテトラヒドロフランを除去し、残りの水溶液に炭酸水素ナトリウムを加えて、ｐＨを中性に調節し、ジクロロメタンを加えて抽出し、得られた有機相を乾燥させ、減圧蒸留して溶媒を除去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：メタノール＝１０：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体２１（５３ｍｇ、収率：６９％）を得た。ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：８４９（Ｍ＋Ｈ）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ ８．５２ （ｓ， １Ｈ）， ７．７９ （ｄ， Ｊ ＝ １０．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６７ － ７．５５ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４７ － ７．２１ （ｍ， ３Ｈ）， ６．５１ （ｓ， １Ｈ）， ５．６０ （ｓ， １Ｈ）， ５．５２ － ５．３２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．３０ － ５．１１ （ｍ， ２Ｈ）， ５．１１ － ４．９４ （ｍ， ２Ｈ）， ４．９４ － ４．７４ （ｍ， ２Ｈ）， ４．０２ （ｓ， ２Ｈ）， ３．８１ － ３．６６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６０ － ３．３５ （ｍ， ４Ｈ）， ３．２４ － ３．０８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．９４ （ｄ， Ｊ ＝ ３０．８ Ｈｚ， ３Ｈ）， ２．３９ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２８ － ２．０４ （ｍ，２Ｈ）， ２．００ － １．７３ （ｍ， ２Ｈ）， １．２２ （ｄ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．９６ － ０．７０ （ｍ， ３Ｈ）。

【0205】

化合物ＬＥ１４の合成
中間体２１（１３４ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）及び市販の原料ＭＣ－Ｖ（１０２ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を４０ｍＬのジクロロメタンに混合し、縮合剤２－エトキシ－１－エトキシカルボニル－１，２－ジヒドロキノリン（８２ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させ、反応終了後、溶媒を減圧蒸留し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：メタノール＝１０：１（ｖ／ｖ）］で精製して化合物ＬＥ１４（１３７ｍｇ、収率：７５％）を得た。ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：１１４１．４（Ｍ＋Ｈ）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ ９．９７ （ｓ， １Ｈ）， ８．５２ （ｓ， １Ｈ）， ８．２７ － ８．０９ （ｍ， １Ｈ）， ７．８８ － ７．７０ （ｍ， ２Ｈ）， ７．６３ － ７．５１ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２８ （ｓ， ３Ｈ）， ６．９９ （ｓ， ２Ｈ）， ６．５１ （ｓ， １Ｈ）， ５．５９ （ｓ， １Ｈ）， ５．５０ － ５．３２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．１７ （ｓ， ２Ｈ）， ４．９８ （ｓ， ２Ｈ）， ４．８５ （ｄ， Ｊ ＝ １７．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．４３ － ４．３３ （ｍ， １Ｈ）， ４．２１ － ４．１２ （ｍ， １Ｈ）， ４．０３ （ｓ， ２Ｈ）， ３．７４ － ３．６４ （ｍ， ２Ｈ）， ３．２０ － ３．０３ （ｍ， ３Ｈ）， ３．０２ － ２．８４ （ｍ， ４Ｈ）， ２．３６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２３ － ２．０９ （ｍ， ４Ｈ）， ２．０１ － １．９０ （ｍ， １Ｈ）， １．９０ － １．７８ （ｍ， ２Ｈ）， １．５５ － １．３９ （ｍ， ４Ｈ）， １．３０ （ｄ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．２３ － １．１１ （ｍ， ２Ｈ）， ０．９３ － ０．７７ （ｍ， ９Ｈ）。

【0206】

実施例２－４：化合物ＬＥ１５－ＬＥ２０の合成

【0207】

【化50】

【0208】

中間体ＶＩは、Ｆｍｏｃ－Ｌ－バリン－Ｌ－アラニンを出発原料として、実施例２－１の中間体３の合成方法のステップａ及びｂを参照し、ステップｂのメチルアミン塩酸塩を対応する市販のアミノ化合物に置き換えることにより製造された。後続のステップは中間体ＶＩから出発し、実施例２－１のステップｃ、ｄ、ｆ及びｈと同様な方法に従って、中間体９と似ている中間体ＩＸを得、次に実施例６のステップｉ及びｊと同様な方法に従って処理し、アミノ保護基を除去し、その後、異なる市販のマレイミドと縮合することにより最終生成物を得た。使用したアミノ化合物及びマレイミドの構造は表１に示された通りである。化合物ＬＥ１５：灰白色の固体、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：１１２１．２（Ｍ＋Ｈ）；化合物ＬＥ１６：淡黄色固体、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：１１６７．１（Ｍ＋Ｈ）；化合物ＬＥ１７：黄色固体、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：１１３２．３（Ｍ＋Ｈ）；化合物ＬＥ１８：淡黄色固体、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：１３０５．４（Ｍ＋Ｈ）；化合物ＬＥ１９：淡黄色固体、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：１３０７．４（Ｍ＋Ｈ）；化合物ＬＥ２０：淡黄色固体、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：１３３７．６（Ｍ＋Ｈ）。

【0209】

【表1】

【0210】

【化51】

【0211】

【化52】

【0212】

【化53】

【0213】

【化54】

【0214】

【化55】

【0215】

【化56】

【0216】

実施例２－５：化合物ＬＥ２１とＬＥ２２の合成

【0217】

【化57】

【0218】

化合物ＤＸＤ－１の合成
市販のＥｘａｔｅｃａｎメシル酸塩（０．５６８ｇ、１ｍｍｏｌ）及び市販の２－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルオキシ）酢酸（ＣＡＳ：１０５４５９－０５－０、０．３８ｇ、２ｍｍｏｌ）を混合して２０ｍＬの無水ジクロロメタンに溶解させ、縮合剤ＨＡＴＵ（０．７６ｇ、２ｍｍｏｌ）及び１ｍＬのピリジンを加えて、室温で２時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧蒸発させ、得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：メタノール＝５０：１（ｖ／ｖ）］で精製して表題化合物ＤＸＤ－１（０．５５ｇ、収率：９０％）を得た。ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：６０８．１（Ｍ＋Ｈ）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３） δ ７．７３ （ｄ， Ｊ ＝ １０．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６４ （ｓ， １Ｈ）， ７．０５ （ｄ， Ｊ ＝ ９．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．８０ － ５．６２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．４１ － ５．１４ （ｍ， ４Ｈ）， ４．２９ － ４．１５ （ｍ， ２Ｈ）， ４．０８－４．０３ （ｍ， １Ｈ）， ３．２７ － ３．０７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４５ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３８ － ２．２８ （ｍ， ２Ｈ）， １．９６ － １．８１ （ｍ， ２Ｈ）， １．０４ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．８０ （ｓ， ９Ｈ）， ０．１１ （ｓ， ３Ｈ）， ０．０３ （ｓ， ３Ｈ）．

【0219】

中間体Ｖの製造
中間体Ｖは、実施例２－１の化合物４の製造方法を参照し、ステップｂのメチルアミン塩酸塩を、対応する市販のアミノ化合物で置き換えることにより得られた。

【0220】

ＬＥ２１－ＬＥ２２の合成
中間体ＶとＤＸＤ－１を反応させ、１０％のトリフルオロ酢酸／ジクロロメタン溶液処理により中間体Ｘを得、次に、中間体Ｘを実施例２－１の化合物５の後続ステップｅ、ｇ、ｉ及びｊを参照して反応させ：中間体Ｘを還元してアミノ化合物を得、得られたアミノ化合物とＦｍｏｃ－バリンヒドロキシスクシンイミドエステルを縮合させ、得られた生成物のＦｍｏｃ保護基を除去し、得られたアミノ生成物を更に６－（マレイミド）ヘキサン酸スクシンイミジルエステルと反応させて最終生成物を得た。化合物ＬＥ２１：黄色固体、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ ／ ｚ：１１４１．２（Ｍ ＋ Ｈ）；化合物ＬＥ２２：黄色固体、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ ／ ｚ：１１０６．６（Ｍ ＋ Ｈ）。

【0221】

【化58】

【0222】

【化59】

【0223】

実施例２－６：化合物ＬＳ１３の合成
実施例２－４のＬＥ１５の合成方法を参照して、ＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）を中間体ＶＩＩ（Ｒ^１はメチルスルホンエチルである）と反応させた後、脱保護し、縮合などのステップで、化合物ＬＳ１３を得た：^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ ９．９２ （ｄ， Ｊ ＝ ２２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．１４ （ｓ， １Ｈ）， ８．０８ （ｄ， Ｊ ＝ ９．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．８１ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．７０ － ７．５０ （ｍ， ３Ｈ）， ７．４７ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３４ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２７ （ｓ， １Ｈ）， ７．２０ （ｓ， １Ｈ）， ６．９８ （ｓ， ２Ｈ）， ６．５１ （ｓ， １Ｈ）， ５．６１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．４８ － ５．３５ （ｍ， ２Ｈ）， ５．２７ （ｓ， ２Ｈ）， ５．１０ （ｄ， Ｊ ＝ ２０．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．３６ （ｓ， １Ｈ）， ４．２１ － ４．０７ （ｍ， １Ｈ）， ３．８４ （ｓ， ２Ｈ）， ３．４８ （ｓ， ２Ｈ）， ３．２１ － ２．９２ （ｍ， ６Ｈ）， ２．２５ － ２．０４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．０４ － １．７８ （ｍ， ３Ｈ）， １．５５ － １．３６ （ｍ， ４Ｈ）， １．３６ － １．１０ （ｍ， ９Ｈ）， ０．９５ － ０．７１ （ｍ， １０Ｈ）。

【0224】

【化60】

【0225】

実施例２－７：化合物ＧＧＦＧ－Ｄｘｄの合成
化合物ＧＧＦＧ－Ｄｘｄは、ＷＯ２０１５１４６１３２Ａ１で報告された既知の合成方法を参照して製造された。ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：１０３４．５（Ｍ＋Ｈ），^１Ｈ－ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ８．６１ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．５０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．２８ （ｔ， Ｊ ＝ ５．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．１１ （ｄ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．７７ （ｄ， Ｊ ＝ １１．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３１ （ｓ， １Ｈ）， ７．２５ － ７．１６ （ｍ， ５Ｈ）， ６．９８ （ｓ， ２Ｈ）， ６．５１ （ｓ， １Ｈ）， ５．５９ （ｄｔ， Ｊ ＝ ７．４， ４．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．４１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．２０ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６４ （ｄ， Ｊ ＝ ６．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．５３ － ４．４０ （ｍ， １Ｈ）， ４．０２ （ｓ， ２Ｈ）， ３．７４ － ３．３７ （ｍ， ８Ｈ）， ３．１８ － ３．００ （ｍ， ２Ｈ）， ３．０４ － ２．９７ （ｍ， １Ｈ）， ２．７７ （ｄｄ， Ｊ ＝ １３．５， ９．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．３８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１９ （ｄｄ， Ｊ ＝ １４．９， ８．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．１１ － ２．０５ （ｍ， ２Ｈ）， １．８６ （ｄｄ， Ｊ ＝ １４．０， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．４５ （ｓ， ４Ｈ）， １．２０ － １．１４ （ｍ， ２Ｈ）， ０．８７ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ３Ｈ）．

【0226】

【化61】

【0227】

実施例３：抗体薬物複合体の製造
実施例１の方法に従って製造したＢ７－Ｈ３の抗体ＦＤＡ０１６をＧ２５脱塩カラムを用いて、５０ｍＭのＰＢ／１．０ｍＭのＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．０）に置換し、１２当量のＴＥＣＰを加え、３７℃で２時間撹拌し、抗体鎖間のジスルフィド結合を完全に開き、リン酸を用いて還元された抗体溶液のｐＨを６．０に調節し、水浴温度を２５℃に下げ、カップリング反応を準備した。上記の実施例２の方法に従って製造したリンカー－薬物複合体ＬＥ１２－ＬＥ２２、ＬＳ１３及びＧＧＦＧ－ＤｘｄをそれぞれＤＭＳＯに溶解させ、中から１２当量のリンカー－薬物複合体を吸引し、還元後の抗体溶液に一滴ずつ滴下し、ＤＭＳＯを補充して、その最終濃度を１０％（ｖ／ｖ）にし、２５℃で０．５時間攪拌して反応させ、反応の終了後、０．２２ｕｍメンブレンで試料を濾過した。タンジェンシャルフロー限外濾過システムで精製し、非結合小分子を除去し、緩衝液は５０ｍＭのＰＢ／１．０ｍＭのＥＤＴＡ溶液（ｐＨ６．０）であり、精製後、最終濃度６％のショ糖を加え、－２０℃の冷蔵庫で保存した。ＵＶ法で２８０ｎｍ及び３７０ｎｍでの吸光度値をそれぞれ測定し、ＤＡＲ値を計算し、結果を下記の表２に示される通りである。

【0228】

本実施例と同様な操作ステップでカップリング反応を実行し、試料はいずれも最も高いＤＡＲ（即ちオーバーカップリング）で製造し、各カップリング反応が発生する時の沈殿生成状況を観察し、各カップリング反応完了後のポリマー比率及び回収率を算出し、得られた結果は表２に示される通りである。

【0229】

【表2】

【0230】

実際の研究では、リンカー－薬物複合体のＧＧＦＧ－Ｄｘｄが他の抗体とカップリングする場合に沈殿が生じ、ポリマー比率が高く、普遍性がないことを発見した。一方、本技術的解決策における大部分のリンカー－薬物複合体を、いずれもＦ０１６を含む異なる抗体とカップリングを試し、沈殿は生じず、且つポリマー比率も正常な範囲にあったことから、本発明の抗体薬物複合体は、良好な溶解性及び創薬可能性を有していることを表し、カップリング過程で沈殿が生じないことも、抗体薬物複合体の製造に有益である。

【0231】

効果実施例１：抗体薬物複合体の体外殺傷活性評価
Ｃａｌｕ－６（ＡＴＣＣ）細胞を体外活性検出に使用する細胞株として選択し、９６ウェル細胞培養プレートに２０００細胞／ウェルで播種し、２０～２４時間培養した。実施例３の方法に従って製造した抗体薬物複合体を１０％のＦＢＳを含むＬ１５細胞培地で１０００、１６６．７、５５．６、１８．６、６．１７、２．０６、０．６９、０．２３、０．０８、０．００８及び０ｎＭの１１個の濃度勾配の試験品溶液に調製し、希釈した試験品溶液１００μｌ／ウェルを取り、細胞を接種した培養プレートに加え、３７℃、５％のＣＯ_２インキュベータに入れて１４４時間培養した後ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ^（Ｒ）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ９２４３）（５０μｌ／ウェル）を加え、５００ｒｐｍで室温で１０分間振とうして均一に混合し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＬマイクロプレートリーダーで（ＯＤ５７０ｎｍ、２ｓ間隔で読み取る）データを読み取り、ＩＣ_５０結果を算出し、結果は表３に示される通りである。

【0232】

上記と同様の方法を使用して、ＡＴＣＣから購入したＮＣＩ－Ｎ８７、Ａ３７５、Ｈｓ－７００Ｔ、ＬＮ－２２９、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＰＡ－１及びＲａｊｉの複数の腫瘍細胞に対する各抗体薬物複合体の細胞毒死滅活性を測定し、結果は表３に示される通りである。表３の結果により、本発明で提供される抗体薬物複合体はＣａｌｕ－６、ＮＣＩ－Ｎ８７、Ａ３７５、Ｈｓ－７００Ｔ、ＬＮ－２２９、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８及びＰＡ－１などの細胞に対して優れた体外死滅活性を有していることが分かる。しかし、Ｒａｊｉ陰性細胞に対しては死滅活性がなく、製造したＡＤＣが特異的な標的殺傷活性を有していることを示した。

【0233】

【表3】

【0234】

効果実施例２：体外血漿安定性試験
本実施例では、ヒト血漿における実施例３の方法に従って製造された抗体薬物複合体の安定性を評価した。具体的には、本実施例では、実施例３の抗体薬物複合体の一部をヒト血漿に加え、３７℃の水浴に１、３、７、１４、２１、２８日間置き、内部標準（イキシノテカンを内部標準物質とする）を入れて抽出し、高速液体クロマトグラフィーにより遊離薬物の放出量を検出し、結果は表７に示される通りである。

【0235】

【表4】

【0236】

血漿安定性の結果は、本発明で提供される抗体薬物複合体が優れた血漿安定性を有することを示している。

【0237】

効果実施例３：リンカー－薬物複合体の体外酵素切断実験

【0238】

リンカー－薬物複合体（ＬＥ１４及びＧＧＦＧ－Ｄｘｄ）及びカテプシンＢは３つの異なるｐＨ（５．０、６．０、７．０）緩衝液で共に培養され、異なる時点でサンプリングして高速液体クロマトグラフィー－質量分析計に入れ、外部標準法（ＤＸＤを外部標準とする）により薬物の放出率を確定した。試験結果（表５に示される通りである）は、ＧＧＦＧ－Ｄｘｄが使用されるｐＨ範囲においてより遅い消化速度を有する一方で、本発明のリンカー－薬物複合体ＬＥ１４は、ｐＨ５．０～ｐＨ７．０の範囲において迅速に酵素切断できることを示した。

【0239】

【表5】

【0240】

効果実施例４：ＦＤＡ０１６－ＬＳ１３の体外酵素切断実験

【0241】

実験細胞株としてＮＣＩ－Ｎ８７細胞株を選択し、試料をカテプシンＢ系（１００ｍＭの酢酸ナトリウム－酢酸緩衝液、４ｍＭのジチオスレイトール、ｐＨ５．０）で、３７℃で４時間培養後、得られた試料を培地で異なる濃度に希釈して、ＳＮ－３８濃度７０ｎＭ～０．００３ｎＭで８個の濃度（１．５～１０倍希釈）に設定し、細胞株の殺傷（阻害）能力の変化を１４４時間観察し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ^（Ｒ）ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＡｓｓａｙ化学発光染色を使用して、蛍光データを読み取り、ＩＣ_５０数値を計算した。

【0242】

以上のカテプシンＢ反応系で３７℃で４時間培養した酵素切断試料を適量のエタノールで沈殿させて、タンパク質を除去し、高速液体クロマトグラフィーで放出された小分子化合物を検出し、同量のＳＮ－３８を基準として、４時間の放出率を測定した結果、９９％の放出率を達した。

【0243】

試験結果（表６に示される通りである）は、酵素切断後のＦＤＡ０１６－ＬＳ１３の細胞毒性活性は等量のＳＮ－３８とほぼ同じであることを示し、また、ＦＤＡ０１６－ＬＳ１３がカテプシンＢの作用下でＳＮ－３８をほぼ完全に放出して効果的に機能したが、ＦＤＡ０１６－ＬＳ１３のリソソームへのエンドサイトーシスにより予測できない変化を引き起こし、ＳＮ－３８が効果的に機能できない可能性があることを示した。

【0244】

【表6】

【0245】

効果実施例５：Ｃａｌｕ－６ヒト肺癌モデルにおけるＦＤＡ０１６－ＬＥ１４の抗腫瘍活性試験
６～８週齢のメスＢａｌｂ／ｃ ｎｕｄｅマウスを選択し、１００ｕｌのＰＢＳ溶液に溶解させた５×１０^６ヒト肺癌細胞（Ｃａｌｕ－６）を首の右側と背中に皮下注射し、腫瘍が平均体積１５０～２００ｍｍ^３に成長した後、腫瘍の大きさ及びマウスの体重に応じて無作為に５つの群に分け、各群に６匹の動物とし、それぞれブランク対照群、５ｍｇ／ｋｇのＦＤＡ０１６－ＧＧＦＧ－Ｄｘｄ群、１０ｍｇ／ｋｇのＦＤＡ０１６－ＧＧＦＧ－Ｄｘｄ群、５ｍｇ／ｋｇのＦＤＡ０１６－ＬＥ１４群及び１０ｍｇ／ｋｇのＦＤＡ０１６－ＬＥ１４群であり、週に１回腹腔内投与した。週２回実験動物の体重と腫瘍の体積を測量し、実験中の動物の生存状態を観察した。結果は表７に示される通りであり、ブランク対照群マウスは投与終了後の平均腫瘍体は２１０７．５１ｍｍ^３であった。試験薬物５．０ｍｇ／ｋｇのＦＤＡ０１６－ＧＧＦＧ－Ｄｘｄ治療群は投与終了後の第１４日の平均腫瘍体積は７２．３５ｍｍ^３であり、１０ｍｇ／ｋｇのＦＤＡ０１６－ＧＧＦＧ－Ｄｘｄ治療群は投与終了後の第１４日の平均腫瘍体積は３．２８ｍｍ^３であった。試験薬物５．０ｍｇ／ｋｇのＦＤＡ０１６－ＬＥ１４治療群は投与終了後の第１４日の平均腫瘍体積は５０．４８ｍｍ^３であり、１０ｍｇ／ｋｇのＦＤＡ０１６－ＬＥ１４治療群は投与終了後の第１４日の平均腫瘍体積は０．００ｍｍ^３であった。実験結果は、ＦＤＡ０１６－ＬＥ１４が比較的良好な体内抗腫瘍活性を持っていることを示し、同時にすべての実験マウスは死亡状況がなく、体重減少がなく、ＦＤＡ０１６－ＬＥ１４が非常に良い安全性を持っていることを示した。

【0246】

【表7】

【図1】

【配列表】

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