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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-02
(45)【発行日】2024-10-10
(54)【発明の名称】軟骨組織の再生を促進するための組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 38/17 20060101AFI20241003BHJP
A61P 19/00 20060101ALI20241003BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241003BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20241003BHJP
A61K 38/22 20060101ALN20241003BHJP
A61K 35/28 20150101ALN20241003BHJP
【ＦＩ】
A61K38/17
A61P19/00
A61P43/00 107
G01N33/53 D
A61K38/22
A61K35/28
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2021509301
(86)(22)【出願日】2020-03-19
(86)【国際出願番号】 JP2020012229
(87)【国際公開番号】W WO2020196233
(87)【国際公開日】2020-10-01
【審査請求日】2023-03-08
(31)【優先権主張番号】P 2019059418
(32)【優先日】2019-03-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504179255
【氏名又は名称】国立大学法人 東京医科歯科大学
(74)【代理人】
【識別番号】110001047
【氏名又は名称】弁理士法人セントクレスト国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】辻 邦和
(72)【発明者】
【氏名】尾島 美代子
(72)【発明者】
【氏名】宗田 大
(72)【発明者】
【氏名】古賀 英之
(72)【発明者】
【氏名】関矢 一郎
【審査官】濱田 光浩
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１０－５０１５４７（ＪＰ，Ａ）
【文献】OTA, Fumie et al.，Activin A Induces Cell Proliferation of Fibroblast-Like Synoviocytes in Rheumatoid Arthritis，ARTHRITIS & RHEUMATISM，2003年，Vol. 48, No. 9, 2003，p. 2442-2449
【文献】WENTING, Liao et al.，HDAC10 upregulation contributes to interleukin 1β‐mediated inflammatory activation of synovium‐derived mesenchymal stem cells in temporomandibular joint，Journal of Cell Physiology，2018年12月04日，2019, Vol. 234，p. 12646-12662，https://doi.org/10.1002/jcp.27873
【文献】加藤幸夫，関節症における滑膜線維芽細胞(間葉系幹細胞)の活性化および高分子ヒアルロン酸療法，日本結合組織学会学術大会抄録集，2007年，Vol.39，p. 46
【文献】ZOU, Lixue et al.，Correlation of concentrations of activin A with occurrence and severity of knee osteoarthritis，Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions，2018年，Vol. 18, No. 3， p. 320-322
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／１７
Ａ６１Ｋ ３８／２２
Ａ６１Ｐ １９／００
Ａ６１Ｐ ４３／００
Ａ６１Ｋ ３５／２８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
アクチビンのみを有効成分とする、軟骨組織の再生を促進するための組成物。
【請求項2】
軟骨障害を治療又は予防するための組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記軟骨障害が、半月板の損傷又は欠損によるものである、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
前記軟骨障害が、関節軟骨の欠損又は退行変性によるものである、請求項２に記載の組成物。
【請求項5】
アクチビンのみを有効成分とする、半月板損傷又は軟骨障害を治療及び／又は予防するための医薬組成物。
【請求項6】
前記半月版損傷が、半月板断裂、半月板変性、温存適応の半月板変性、半月板欠損、事故若しくはスポーツ外傷に伴う半月板損傷、又は、加齢に伴う半月板損傷である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記軟骨障害が、軟骨欠損、軟骨損傷、軟骨変性、軟骨摩耗、軟骨消失、軟骨分解、軟骨変形、関節軟骨の欠損、関節軟骨の退行変性、変形性関節症、変性性膝関節症、変性性股関節症、変形性肩関節症、外傷性軟骨損傷、外傷性軟骨欠損症、靭帯損傷合併症、離断性骨軟骨炎、無腐性骨壊死、又は、椎間板損傷である、請求項５又は６に記載の医薬組成物。
【請求項8】
半月板縫合術又は半月板修復術の術前、術中、及び／又は、術後に投与するための、請求項５～７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記アクチビンがアクチビンＡである、請求項５～８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項10】
関節における軟骨障害の予後を予測する方法であって、対象の急性炎症期における関節内のアクチビンの濃度を測定する工程と、
前記工程にて得られた濃度が参照値より高ければ、前記対象における軟骨障害の予後は良好であると予測する工程とを、含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アクチビンを有効成分とする、軟骨組織の再生を促進するための組成物、間葉系幹細胞の増殖を促進するための組成物、及び半月板損傷又は軟骨障害を治療又は予防するための組成物に関する。また、本発明は、アクチビンを用いた半月板損傷又は軟骨障害を治療又は予防する方法、関節内のアクチビン量を指標とした、関節における軟骨障害の予後予測方法に関する。
【背景技術】
【0002】
軟骨組織は、細胞外基質と、その中に点在する軟骨細胞とからなる結合組織であり、その機能は、衝撃を緩和し、関節をほぼ無摩擦にて運動させること等にある。また、この組織は、軟骨膜によって包まれており、血管は該組織中には侵入することができないため、血管が存在する他の組織に比べ、再生に有用な生理活性物質等の提供を受け難いこともあり、再生能は極めて乏しいことが知られている。そのため、加齢、肥満、激しい運動、外傷、病気等により、関節の軟骨が障害を負っても、その障害部は十分には修復されることなく、関節痛や関節機能の喪失（例えば、軟骨変性、半月板損傷、靭帯の障害）等を伴う、変形性関節症（ＯＡ）といった疾患に発展することとなる。
【0003】
ＯＡ等の軟骨障害の治療戦略は、消炎鎮痛剤を用いた症状の管理、プログラムされた運動による関節作動性及び安定性の改善、体重管理等に基づく。しかしながら、このような治療では、関節軟骨の回復を期待することができず、大概の患者は、病状の悪化から免れることはできない。
【0004】
そのため、新しい治療方法を開発すべく、軟骨代謝分野において鋭意研究が進められ、その進展により、関節炎が生じている関節における構造的疾患修飾において役割を果たす新規薬剤標的（ＤＭＯＡＤｓ：Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ＯＡ Ｄｒｕｇｓ）を見出すに至っている。
【0005】
例えば、ＦＧＦ１８は、ラット半月板損傷モデルにおいて、それを関節内に投与することにより、脛骨高原における関節軟骨の変性抑制と軟骨の厚みを増加させることが示されている（非特許文献１)。さらに、リコンビナントＦＧＦ１８タンパク質（ｒｈＦＧＦ１８、商品名：Ｓｐｒｉｆｅｒｍｉｎ）は、米国においてＦｉｒｓｔ－ｉｎ－ｈｕｍａｎ試験が既に開始され、Ｓｐｒｉｆｅｒｍｉｎの関節内注射により関節軟骨の退行変性抑制、軟骨の厚みの増加、関節疼痛の低減効果が確認されている（非特許文献２～４）。しかしながら、ＦＧＦ１８は、もともと骨形成に対して促進的に機能することが示されており（非特許文献５～７）、関節内にリコンビナントタンパクを注射した場合に骨棘の形成等、内軟骨骨化の危険性の増大が懸念される。
【0006】
また、関節軟骨障害の新規治療方法に関し、別の観点から、自家の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、インビトロにて拡張培養し、その患者の膝関節に戻し移植するという、ＯＡ患者のための再生医療が、本発明者らによって近年開発されている。具体的には、本発明者らは、滑膜に多能性のＭＳＣが含まれており、骨髄、骨格筋、膝蓋下脂肪体（ＩＦＰ）といった他の組織に存在するそれらと比較して、軟骨細胞への高い分化能を有していることを報告している（非特許文献８～１０）。
【0007】
一方、ｉｎ ｖｉｔｒｏの研究において、アクチビンＡに対するｓｉＲＮＡで軟骨分化が抑制されること（非特許文献１１）、アクチビン－ＢＭＰ２キメラリガンドの投与により軟骨分化促進が観察されること（非特許文献１２）、アクチビン－ＢＭＰ２キメラリガンド（ＡＢ２３５）が軟骨様組織の形成を促進すること（非特許文献１３）、アクチビンの投与によりプロテオグリカンの発現が促進されること（非特許文献１４）、アクチビンが関節リウマチ由来の滑膜細胞（間葉系細胞）の増殖を促進すること（非特許文献１５）等により、アクチビンと未分化間葉系細胞の増殖や、ｉｎ ｖｉｖｏにおける内軟骨性骨化のプロセス促進との関係が報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【文献】Ｍｏｏｒｅ ＥＥ．ら、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ、２００５年、１３巻、７号、６２３～６３１ページ
【文献】Ｄａｈｌｂｅｒｇ ＬＥ．ら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ、２０１６年、３４巻、３号、４４５～４５０ページ
【文献】Ｌｏｈｍａｎｄｅｒ ＬＳ．ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ（Ｈｏｂｏｋｅｎ， ＮＪ）、２０１４年、６６巻、７号、１８２０～１８３１ページ
【文献】Ｅｃｋｓｔｅｉｎ Ｆ．ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ（Ｈｏｂｏｋｅｎ， ＮＪ）、２０１５年、６７巻、１１号、２９１６～２９２２ページ
【文献】Ｈａｍｉｄｏｕｃｈｅ Ｚ，ら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２０１０年、２２４巻、２号、５０９～５１５ページ
【文献】Ｊｅｏｎ Ｅ．ら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２０１２年、７（８）：ｅ４３９８２
【文献】Ｎａｇａｙａｍａ Ｔ．ら、Ｃｏｎｇｅｎｉｔ Ａｎｏｍ、２０１３年、５３巻、２号、８３～８８ページ
【文献】Ｓｅｋｉｙａ Ｉ．ら、Ｃｌｉｎ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｌａｔ Ｒｅｓ、２０１５年、４７３巻、７号、２３１６～２３２６ページ
【文献】Ｋｏｇａ Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．、２００８年、３３３巻、２号、２０７～２１５ページ
【文献】Ｓｅｇａｗａ Ｙ．ら、Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ．、２００９年、２７巻、４号、４３５～４４１ページ
【文献】Ｄｊｏｕａｄ Ｆ．ら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１０年、１：１１
【文献】Ｐｅｒａｎ Ｍ．ら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１３年、１０巻、４６４～４７６ページ
【文献】Ｊｉｍｅｎｅｚ Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ、２０１５年、５：１６４００
【文献】Ｌｕｙｔｅｎ Ｆ．ら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４年、２１０巻、２号、２２４～２２９ページ
【文献】Ｏｔａ Ｆ．ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、２００３年、４８巻、９号、２４４２～２４４９ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、軟骨組織の再生を促進し、ひいては軟骨障害の治療等を可能とする物質及び方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
上述のとおり、本発明者らによって、滑膜由来のＭＳＣの自家移植による、ＯＡ等の軟骨障害の治療方法の開発が、鋭意進められている。そして、関節軟骨及び／又は半月板を再生する自家ＭＳＣ移植治療への滑膜ＭＳＣの適用が、本発明者らが所属する大学病院にて２０１２年から開始しており、臨床試験の第１セットにおいて、かなりの成果が得られている。
【0011】
その一方で、本発明者らは、移殖に供するＭＳＣをｉｎ ｖｉｔｒｏにて培養する際の細胞増殖能及びＭＳＣ移植後の軟骨の再生効果において、患者間に個人差があることを見出している。そして、この差は、滑膜関節内におけるＭＳＣの増殖性及び／又は生存性に関与する物質の量差に依るものとの仮説を立てた。また、当該物質を同定できたなら、滑膜関節内のＭＳＣをシンプルかつ容易に活性化することが可能となり、軟骨再生、ひいては軟骨障害の治療がより効果的なものになるだろうとも考えた。そこで、本発明者らは、前記仮説に基づき、滑膜関節内におけるＭＳＣの増殖性に関与する生理活性物質の同定及び特徴付けを試みた。
【0012】
具体的には、膝前十字靱帯再建術（ＡＣＬ－Ｒ）を行った患者から得られた関節液を、ＭＳＣの増殖活性を指標に２群に分け、それぞれの関節液群における１７４種のタンパク質の発現量を解析して比較した。その結果、ＭＳＣの高い増殖促進活性を示す関節液において、高い発現量を示すタンパク質として、アクチビンＡを同定することに成功した。
【0013】
そして、更に当該タンパク質とＭＳＣ増殖との関連性につき検討した結果、アクチビンは、ＭＳＣ関連細胞表面抗原の発現及びインビトロの分化多能性に影響を与えることなく、ＭＳＣの細胞増殖を促進できることを見出した。
【0014】
また、ｉｎ ｖｉｖｏ（動物）実験の結果、アクチビンＡを関節内に注入することによって、内側半月板前方切除後の再生過程が有意に促進されることを明らかにした。さらに、関節軟骨全層欠損モデルにおいても、欠損部周囲に生じる軟骨組織の退行変性が、アクチビンＡによって顕著に抑制されることを明らかにした。さらにまた、モノヨード酢酸（ＭＩＡ）誘導関節炎モデルにおいて、関節炎に伴う疼痛も、アクチビンＡによって有意に緩和されることを見出し、アクチビンが、軟骨再生を通じて、軟骨障害の症状の改善及び治療に極めて有効であることを明らかにした。
【0015】
さらに、遡及的なヒト研究の結果、ＡＣＬ－Ｒ外科手術後の関節液におけるアクチビンＡのタンパク質量は、その回復の程度と正の相関を示していること、すなわち、関節内のアクチビンの発現レベルは、関節損傷後の軟骨組織再生の良い指標となり得ることも見出し、本発明を完成するに至った。
【0016】
本発明は、アクチビンを有効成分とする、軟骨組織の再生を促進するための組成物、間葉系幹細胞の増殖を促進するための組成物、及び軟骨障害を治療又は予防するための組成物に関する。また、本発明は、アクチビンを有効成分とする、半月板損傷又は軟骨障害を治療及び／又は予防するための医薬組成物に関する。また、本発明は、アクチビンを用いた軟骨障害を治療又は予防する方法、関節内のアクチビン量を指標とした、関節における軟骨障害の予後予測方法に関し、より具体的には、以下のとおりである。
＜１＞ アクチビンを有効成分とする、軟骨組織の再生を促進するための組成物。
＜２＞ アクチビンを有効成分とする、間葉系幹細胞の増殖を促進するための組成物。
＜３＞ 軟骨障害を治療又は予防するための組成物である、＜１＞又は＜２＞に記載の組成物。
＜４＞ 前記軟骨障害が、半月板の損傷又は欠損によるものである、＜３＞に記載の組成物。
＜５＞ 前記軟骨障害が、関節軟骨の欠損又は退行変性によるものである、＜３＞に記載の組成物。
＜６＞ アクチビンを有効成分とする、半月板損傷又は軟骨障害を治療及び／又は予防するための医薬組成物。
＜７＞ 半月版損傷が、半月板断裂、半月板変性、温存適応の半月板変性、半月板欠損、事故又はスポーツ外傷の伴う半月板損傷、又は加齢に伴う半月板損傷である、＜６＞に記載の組成物。
＜８＞ 軟骨障害が、軟骨欠損、軟骨損傷、軟骨変性、軟骨摩耗、軟骨消失、軟骨分解、軟骨変形、関節軟骨の欠損、関節軟骨の退行変性、変形性関節症、変性性膝関節症、変性性股関節症、変形性肩関節症、外傷性軟骨損傷、外傷性軟骨欠損症、靭帯損傷合併症、離断性骨軟骨炎、無腐性骨壊死、椎間板損傷である、＜６＞又は＜７＞に記載の組成物。
＜９＞ 半月板縫合術又は半月板修復術の術前、術中、及び／又は術後に投与するための、請求項＜６＞～＜８＞のいずれか１項に記載の医薬組成物。
＜１０＞ アクチビンが、アクチビンＡである、＜６＞～＜９＞のいずれか1項に記載の医薬組成物。
＜１１＞ 間葉系幹細胞と併用されてなることを特徴とする、＜６＞～＜１０＞のいずれか1項に記載の医薬組成物。
＜１２＞ 軟骨障害を治療又は予防する方法であって、対象の軟骨障害部位に、アクチビンを投与する工程を含む、方法。
＜１３＞ 前記軟骨障害部位に、間葉系幹細胞を更に投与する工程を含む、＜１２＞に記載の方法。
＜１４＞ 関節における軟骨障害の予後を予測する方法であって、
対象の関節内のアクチビンの濃度を測定する工程と、
前記工程にて得られた濃度が参照値より高ければ、前記対象における軟骨障害の予後は良好であると予測する工程とを、含む方法。
＜１＞ アクチビンを有効成分とする、軟骨組織の再生を促進するための組成物。
＜２＞ アクチビンを有効成分とする、間葉系幹細胞の増殖を促進するための組成物。
＜３＞ 軟骨障害を治療又は予防するための組成物である、＜１＞又は＜２＞に記載の組成物。
＜４＞ 前記軟骨障害が、半月板の損傷又は欠損によるものである、＜３＞に記載の組成物。
＜５＞ 前記軟骨障害が、関節軟骨の欠損又は退行変性によるものである、＜３＞に記載の組成物。
＜６＞ アクチビンを有効成分とする、半月板損傷又は軟骨障害を治療及び／又は予防するための医薬組成物。
＜７＞ 半月版損傷が、半月板断裂、半月板変性、温存適応の半月板変性、半月板欠損、事故又はスポーツ外傷の伴う半月板損傷、又は加齢に伴う半月板損傷である、＜６＞に記載の組成物。
＜８＞ 軟骨障害が、軟骨欠損、軟骨損傷、軟骨変性、軟骨摩耗、軟骨消失、軟骨分解、軟骨変形、関節軟骨の欠損、関節軟骨の退行変性、変形性関節症、変性性膝関節症、変性性股関節症、変形性肩関節症、外傷性軟骨損傷、外傷性軟骨欠損症、靭帯損傷合併症、離断性骨軟骨炎、無腐性骨壊死、椎間板損傷である、＜６＞又は＜７＞に記載の組成物。
＜９＞ 半月板縫合術又は半月板修復術の術前、術中、及び／又は術後に投与するための、請求項＜６＞～＜８＞のいずれか１項に記載の医薬組成物。
＜１０＞ アクチビンが、アクチビンＡである、＜６＞～＜９＞のいずれか1項に記載の医薬組成物。
＜１１＞ 間葉系幹細胞と併用されてなることを特徴とする、＜６＞～＜１０＞のいずれか1項に記載の医薬組成物。
＜１２＞ 軟骨障害を治療又は予防する方法であって、対象の軟骨障害部位に、アクチビンを投与する工程を含む、方法。
＜１３＞ 前記軟骨障害部位に、間葉系幹細胞を更に投与する工程を含む、＜１２＞に記載の方法。
＜１４＞ 関節における軟骨障害の予後を予測する方法であって、
対象の関節内のアクチビンの濃度を測定する工程と、
前記工程にて得られた濃度が参照値より高ければ、前記対象における軟骨障害の予後は良好であると予測する工程とを、含む方法。
【0017】
本発明の医薬組成物は、アクチビンを含有する、半月板損傷又は軟骨障害の治療剤及び／又は予防剤を包含する。また、本発明は、半月板損傷又は軟骨障害の予防及び／又は治療用医薬組成物の製造のためのアクチビンの使用、半月板損傷又は軟骨障害の予防及び／又は治療のためのアクチビンの使用、半月板損傷又は軟骨障害の予防及び／又は治療に用いるためのアクチビン、並びにアクチビンの有効量を対象に投与することからなる半月板損傷又は軟骨障害の予防及び／又は治療方法に関する。なお、「対象」とは、その予防又は治療を必要とするヒト又はその他の動物であり、ある態様としては、その予防又は治療を必要とするヒトである。
【発明の効果】
【0018】
本発明によれば、ＭＳＣの増殖を促進すること、半月板又は軟骨の再生を促進することが可能となり、また半月板損傷又は軟骨障害を治療又は予防することが可能となる。さらには、軟骨障害の予後を予測することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1B】図２Ｃ、２Ｄ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ及び５Ｂに結果を示した実験に用いた、ＡＣＬ－Ｒ後３～４日目の患者から採取した関節液の調製方法ＡＣＬ－Ｒ後３～４日目の患者から採取した関節液の調製方法の概略を示す図である。
【図2A】関節液を１４％の割合でＭＳＣの培養系に添加し、２週間培養した後、細胞数を計測した結果を示す、ドットプロット図である。図中、「Ｐｒｅ」は、ＡＣＬ－Ｒ直前の患者から採取した関節液を添加した結果を示し、「Ａｔ ３－４ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ＡＣＬ－Ｒ」は、ＡＣＬ－Ｒ後３～４日目の患者から採取した関節液を添加した結果を示す。
【図2B】非動化処理前及び処理後の関節液を各々１４％の割合でＭＳＣの培養系に添加し、２週間培養した後、細胞数を計測した結果を示す、ドットプロット図である。
【図2C】関節液中の各補体タンパク質（Ｃ５ａ、Ｃ３ａ及びＣ４ａ）の濃度と、その関節液を１４％の割合で添加した通常培地を用いて２週間培養を行った際のＭＳＣ細胞数との相互関係について解析した結果を示す、ドットプロット図である。
【図2D】関節液中のＰＤＧＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）－ＡＡ及びＰＤＧＦ－ＢＢの各濃度と、関節液存在下培養後のＭＳＣ数との関係を示す、ドットプロット図である。
【図3A】ＡＣＬ－Ｒ術前（ｐｒｅ）、術後３～４日目（３－４ ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ＡＣＬ－Ｒ）の関節液中のサイトカイン、ケモカインを、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）により定量した結果を示す、ドットプロット図である。図中、縦軸は、サイトカイン及びケモカインの濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。
【図3B】関節液中のサイトカイン及びケモカインの各濃度と、関節液存在下培養後のＭＳＣ数との関係を示す、ドットプロット図である。図中、縦軸は、サイトカイン及びケモカインの各濃度を示し、横軸は、関節液存在下培養後のＭＳＣ数を示す。
【図3C】ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０のリコンビナントタンパクを図中に示す量添加した通常増殖培地にて、ＭＳＣを培養し、ＭＴＴアッセイを用い、その増殖について解析を行った結果を示す、グラフである。対照群として通常増殖培地（サイトカイン非含有、図中「１０％ＦＢＳ」）を用いた。比較群として、通常増殖培地に各サイトカイン、ケモカインをＥＤ５０（活性が最大反応の５０％となるサイトカインの濃度）の１０倍及び１００倍添加した培地を用いた（図中、各「１０％ＦＢＳ＋…ＥＤ５０×１０」及び「１０％ＦＢＳ＋…ＥＤ５０×１００」）。図の縦軸は、ＭＴＴアッセイにおいて検出された、細胞数に正比例する５６０ｎｍの吸光度を示し、細胞数が増加するほど、吸光度が増加する。
【図4A】ＡＣＬ－Ｒに採取された関節液をＭＳＣの増殖活性を指標に２群に分け（Ｌｏｗ，ｈｉｇｈ）、それぞれの関節液群におけるタンパクの濃度を１7４種類のタンパク質の発現を同時に評価できる抗体アレイを用いて比較し、２群間で有意な差（ｕ－ｔｅｓｔによる）を持って発現量に差がある１３種のタンパク質を選抜した結果を示す、ヒートマップである。
【図4B】前記２群における、前記１３種のタンパク質の濃度を示す、グラフである。図中、縦軸は関節液における各タンパク質の濃度（ｐｇ／ｍｌ，平均値と標準偏差（ＳＤ））を示す。
【図5A】関節液中のアクチビンＡの濃度と、患者由来の関節液との関係を示す、ドットプロット図である。図中、「Ｐｒｅ」は、ＡＣＬ－Ｒ直前の患者から採取した関節液を示し、「Ａｔ ３－４ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ＡＣＬ－Ｒ」は、ＡＣＬ－Ｒ後３～４日目の患者から採取した関節液を示す。縦軸は、アクチビンＡの濃度を示す。
【図5B】関節液中のアクチビンＡの濃度と、関節液を１４％の割合で添加した通常増殖培地を用いて２週間培養した後のＭＳＣ数との関係を示す、ドットプロット図である。図中、縦軸は、アクチビンＡの濃度を示し、横軸は、関節液存在下培養後のＭＳＣ数を示す。
【図5C】アクチビンＡ非含有通常増殖培地（図中「１０％ＦＢＳ」）、並びにアクチビンＡのリコンビナントタンパク質（ｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡ）含有通常増殖培地（図中、各「１０％ＦＢＳ＋ｒｈ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ ＥＤ５０×１０」及び「１０％ＦＢＳ＋ｒｈ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ ＥＤ５０×１００」にて培養した、ＭＳＣ数の経時変化を示す、グラフである。なお、図中の表記については図３Ｃのそれらと同様である。
【図5D】アクチビンＡ非含有血清低濃度増殖培地（図中「０．５％ＦＢＳ」）、並びにｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡ含有血清低濃度増殖培地（図中、各「０．５％ＦＢＳ＋ｒｈ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ ＥＤ５０×１０」及び「０．５％ＦＢＳ＋ｒｈ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ ＥＤ５０×１００」にて培養した、ＭＳＣ数の経時変化を示す、グラフである。なお、図中の表記については図３Ｃのそれらと同様である。
【図5E】アクチビンＡ非含有血清低濃度増殖培地（図中「０．５％ＦＢＳ」）、ｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡ含有血清低濃度増殖培地（図中、各「０．５％ＦＢＳ＋ｒｈ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ」）、並びに各阻害剤（Ａｋｔ、Ｋｕ００６３７９４、ＬＹ２９４００２又はＰＤ９８０５０）及びｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡ含有血清低濃度増殖培地（図中、各「０．５％ＦＢＳ＋ｒｈ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ＋各阻害剤」）にて培養した、ＭＳＣ数の経時変化を示す、グラフである。なお、図中の表記については図３Ｃのそれらと同様である。
【図5F】ｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡ等を培地に添加した後のＭＳＣにおける、各タンパク質のリン酸化をウェスタンブロッティングにより検出した結果を示す、写真である。図中、「分（ｍｉｎ）」は、ｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡ等を培地に添加してからの経過時間を示す。「Ａ」、「Ｐ」、「ＡＰ」及び「Ｎ」は、ｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡ添加後の結果、ＰＤＧＦ－ＡＡ添加後の結果、ｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡ及びＰＤＧＦ－ＡＡ添加後の結果、並びにそれら生理活性物質を添加していない場合の結果を各々示す。「ｐＡｋｔ」及び「ｐｐＡｋｔ」は、Ａｋｔタンパク質の非リン酸化及びリン酸化状態を各々検出した結果を示す。「ｐ４４／４２」及び「ｐｐ４４／４２」は、ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）タンパク質の非リン酸化及びリン酸化状態を各々検出した結果を示す。
【図6A】幹細胞抗原であるＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５及びＣＤ４４が陽性であるＭＳＣを、フローサイトメーターを用いて解析した結果を示す、グラフである。図中、「ｒｈ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ」は、ｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡ存在下にて２週間培養したＭＳＣを解析した結果を示し、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は、ｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡ非存在下にて培養したＭＳＣを解析した結果を示す。縦軸は、各抗原の陽性率を示す。１回の実験で１００００個の細胞をスキャンし、その中で、対象とする抗原を発現している細胞の存在比率を百分率で示している。独立した４回の実験を行い、図は、平均値とＳＤで示している。
【図6B】ｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡ存在下（図中「ｒｈ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ」）又は非存在下（図中「コントロール」）にて２週間培養した後、ｉｎ ｖｉｔｒｏにてＭＳＣを軟骨、骨、脂肪細胞方向に分化誘導した結果を示す、顕微鏡写真である。図中、「マクロ」は、軟骨の凝集塊形成を誘導した結果を観察した結果を示す。「トルイジンブルー」は、前記凝集塊の切片をトルイジンブルーにて染色し、軟骨基質を検出した結果を示す。「石灰化」は、細胞外基質へのカルシウム沈着をアリザリンレッドにて染色し、石灰化骨基質産生をするコロニーを検出した結果を示す。「脂肪生成」は、脂肪生成を誘導し、そのコロニーをオイルレッドＯ溶液にて染色し、脂肪組織を検出した結果を示す。
【図6C】図６Ｂ同様に、ＭＳＣを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて軟骨凝集塊に分化誘導した結果を示す、図である。図中、「ｒｈ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ」、「ｒｈ ＰＤＧＦ－ＢＢ」及び「ｒｈ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ／ｒｈ ＰＤＧＦ－ＢＢ」は、各々ｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡ、ｒｈＰＤＧＦ－ＢＢ（リコンビナントＰＤＧＦ－ＢＢタンパク質）又はｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡ及びｒｈＰＤＧＦ－ＢＢを添加した軟骨分化誘導培地を用いて２週間ペレットカルチャーを行なった結果、得られた軟骨凝集塊の湿重量の測定結果を示している。コントロールは、通常に軟骨分化誘導培地を用いて軟骨凝集塊を形成させた結果を示す。図は平均値とＳＤを示しており、実験に供したスフェロイドの数（ｎ数）を横軸かっこ内に示す。真ん中の写真は、各コンドロジェニックスフェロイドの外観を観察した結果を示す。組織像において、上段の各写真は、スフェロイドの切片をヘマトキシリン／エオジンにて染色して観察した結果を示し、下の各写真においては、前記スフェロイドの切片をトルイジンブルーにて染色して観察した結果を示す。
【図7A】マウス内側半月板前方１／２を切除後７日目にｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡ等を投与し（投与量：４２ｎｇ／膝）、その３日後（半月板切除後１０日目）に関節組織を観察した結果を示す写真である。図中、「ｒｈ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ」はｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡを投与したモデルを示す。比較対象として「ｒｈ ＰＤＧＦ－ＡＡ」はｒｈＰＤＧＦ－ＡＡ（リコンビナントＰＤＧＦ－ＡＡタンパク質）を投与したモデル、「ｒｈ ＰＤＧＦ－ＡＡ＋ｒｈ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ／ｒｈＰＤＧＦ－ＡＡ」は、ｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡ及びｒｈＰＤＧＦ－ＡＡを同時投与したモデル、及び「ＰＢＳ／コントロール」は、生理活性物質を投与せず、ベヒクル（リン酸緩衝生理食塩水：Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）のみを投与したモデルを示す。右下の概略図は、各組織像における写真を説明するものであり、各群において、「Ｍａｃｒｏ」は、関節部の切片をサフラニンＯ／ファストグリーンにて染色して観察した結果の弱拡写真を示している。写真の上部は大腿骨の遠位端、下部は脛骨の近位端、左側が前方、右側が後方である。図中の四角で囲った領域（半月板再生部位）の強拡大が、他の４枚のパネルとなっている。「ＳａｆＯ」は、再生半月板領域（四角で囲った領域）における軟骨基質（プロテオグリカン）の蓄積部位（サフラニンＯ染色）を示し、「ＨＥ」は、半月板再生領域における細胞の分布（ヘマトキシリン／エオジン染色）を示している。「Ｃｏｌ Ｉ ＩＨＣ」及び「Ｃｏｌ ＩＩ ＩＨＣ」は、半月板再生領域（四角で囲った領域）の切片をI型コラーゲン及びII型コラーゲン各々に対する免疫組織染色（ＩＨＣ）を施して観察した結果を示す。
【図7B】内側半月板前方１／２切除モデルにおいて、半月板切除後７日目にｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡ等を投与し、その１４日後（半月板切除後２１日目）に関節組織を観察した結果を示す写真である。図中の表記については、図７Ａと同様である。
【図7C】内側半月板前方１／２切除モデルにおいて、半月板切除後７日目にｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡ等を投与し、その４９日後（半月板切除後５６日目）に関節組織を観察した結果を示す写真である。図中の表記については、図７Ａと同様である。
【図7D】内側半月板前方１／２切除モデルにおいて、半月板切除後７日目にｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡ等を投与し、その７７日後（半月板切除後８４日目）に関節組織を観察した結果を示す写真である。図中の表記については、図７Ａと同様である。
【図7E】内側半月板前方１／２切除モデルにおいて、半月板切除後７日目にｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡ等を投与し、半月板切除後１０日目（１０ｄ）、２１日目（３Ｗ）、５６日目（８Ｗ）及び８４日目（１２Ｗ）に、半月板再生の程度を、ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐａｕｌｉ’ｓ スコアを用いて評価した結果を示す、グラフである。図中の表記については、図７Ａと同様である。
【図8】ラット関節軟骨全層欠損モデルにおいて、関節軟骨全層欠損を施してから１週間後にｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡ（投与量：１８０ｎｇ／膝）又はｒｒＰＤＧＦ－ＡＡ（投与量：９００ｎｇ／膝）を関節内に注射し、その３週間後（関節軟骨全層欠損後４週目）に関節組織を観察した結果を示す写真である。図中、「Ｓａｆ Ｏ」及び「Ｔｏｌ Ｂｌｕｅ」は、関節組織の切片を各々サフラニンＯ及びトルイジンブルーにて染色して観察した結果を示す。
【図9A】モノヨード酢酸（ＭＩＡ）誘導関節炎モデルにおいて、ｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡ投与による疼痛緩和効果を検討するための、実験スキームを示す、概略図である。
【図9B】ＭＩＡ誘導関節炎モデルにおいて、ラット後肢の荷重量の左右差を測定した結果を示すグラフである。図中、「ｒｈ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ」は、ＭＩＡを左膝関節内に注入してから１４日後にｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡを同関節内に投与したラット（投与量：２００ｎｇ／膝）を解析した結果を示す。「ｃｏｎｔｒｏｌ」は、ＭＩＡを左膝関節内に注入してから１４日後にｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡの代わりにそのベヒクルであるＰＢＳを同関節内に投与したラットを解析した結果を示す。
【図10】ＡＣＬ－Ｒ３～４日目の患者の関節液におけるアクチビンＡの濃度と、当該患者の術後２ヶ月後の患者立脚型の膝回復度のスコア（ＩＫＤＣスコア）との関係を示す、ドットプロット図である。なお、ＩＫＤＣスコアの評価については、ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＫＮＥＥ ＤＯＣＵＭＥＮＴＡＴＩＯＮ ＣＯＭＭＩＴＴＥＥ－ＩＫＤＣ（国際膝記録委員会）の膝評価用紙（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｐｏｒｔｓｍｅｄ．ｏｒｇ／ＡＯＳＳＭＩＭＩＳ／ｍｅｍｂｅｒｓ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ＩＫＤＣＪａｐａｎｅｓｅ．ｐｄｆ〉参照のほど。
【発明を実施するための形態】
【0020】
（アクチビンを有効成分とする組成物）
後述の実施例に示すとおり、アクチビンＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて分化多能性に影響を与えることなく、ＭＳＣの増殖を促進することを、本発明者らは明らかとした。さらに、マウス半月板切除後の再生モデル、ラット関節軟骨全層欠損モデルを用いて検証した結果、アクチビンＡを投与することによって、半月板組織の再生が誘導されること、損傷部における軟骨組織の再生が促進されること、損傷軟骨周囲の正常軟骨の退行変性が抑制されることも明らかになった。さらに、ラットを用いた関節炎誘発性の膝疼痛モデルにおいて、アクチビンＡの関節内投与によって、ラットの疼痛回避行動の緩和がもたらされることも明らかになった。
後述の実施例に示すとおり、アクチビンＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて分化多能性に影響を与えることなく、ＭＳＣの増殖を促進することを、本発明者らは明らかとした。さらに、マウス半月板切除後の再生モデル、ラット関節軟骨全層欠損モデルを用いて検証した結果、アクチビンＡを投与することによって、半月板組織の再生が誘導されること、損傷部における軟骨組織の再生が促進されること、損傷軟骨周囲の正常軟骨の退行変性が抑制されることも明らかになった。さらに、ラットを用いた関節炎誘発性の膝疼痛モデルにおいて、アクチビンＡの関節内投与によって、ラットの疼痛回避行動の緩和がもたらされることも明らかになった。
【0021】
したがって、本発明は、アクチビンを有効成分とする、ＭＳＣの増殖を促進するための組成物、軟骨組織の再生を促進するための組成物、軟骨組織の退行変性を抑制するための組成物、及び、半月板損傷又は軟骨障害を治療又は予防するための組成物を提供する。
【0022】
「アクチビン」とは、２つのインヒビンβ鎖（βＡ，βＢ鎖）のホモダイマー（アクチビンＡ、アクチビンＢ）又はヘテロダイマー（アクチビンＡＢ）を意味する。インヒビンβＡ鎖は、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００２１８３にて特定されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、インヒビンβＢ鎖は、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００２１８４にて特定されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【0023】
本発明において、「アクチビン」は、好ましくは、Ｎ末端ペプチドが切断された成熟型インヒビンβＡ鎖のホモダイマー（活性型アクチビンＡ）、Ｎ末端ペプチドが切断された成熟型インヒビンβＢ鎖のホモダイマー（活性型アクチビンＢ）、Ｎ末端ペプチドが切断された成熟型インヒビンβＡ鎖とＮ末端ペプチドが切断された成熟型インヒビンβＢ鎖とのヘテロダイマー（活性型アクチビンＡＢ）であり、より好ましくは、Ｎ末側１～３１０位のアミノ酸が除去された、３１１～４２６位からなるインヒビンβＡ鎖のホモダイマー、Ｎ末側１～２９２位のアミノ酸が除去された、２９３～４０７位からなるインヒビンβＢ鎖のホモダイマー、３１１～４２６位からなるインヒビンβＡ鎖と２９３～４０７位からなるインヒビンβＢ鎖とのヘテロダイマーであり、さらに好ましくは、３１１～４２６位からなるインヒビンβＡ鎖の断片がジスルフィド結合したホモダイマー、２９３～４０７位からなるインヒビンβＢ鎖の断片がジスルフィド結合したホモダイマー、３１１～４２６位からなるインヒビンβＡ鎖の断片と２９３～４０７位からなるインヒビンβＢ鎖の断片とがジスルフィド結合したヘテロダイマーである。また、本発明のアクチビンは、グリコシル化されているものであってもよく、グリコシル化されていないものであってもよい。
【0024】
なお、本発明に係るインヒビンβ鎖は、前記ＮＣＢＩアクセッション番号にて特定されるアミノ酸配列からなる各ポリペプチドに限定されることなく、その活性を維持する限り、前記典型的なアミノ酸配列に対する改変体、相同体も含み得る。また、かかる改変体、相同体は、典型的なアミノ酸配列に対し、通常高い相同性を有する。高い相同性は、通常６０％以上であり、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）である。
【0025】
アクチビンは、多種の動物、多数の細胞種において産生されることが知られている。そのため、これら細胞等から、公知の手法に沿って、分離・抽出・精製して得ることができる。また、前記アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の情報に基づき、大腸菌、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、無細胞タンパク質合成系（例えば、網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液）等を用い遺伝学的手法によって、アクチビンを生合成することもできる。さらに、前記アミノ酸配列の情報に基づき、ペプチド合成機等を用いて、化学的に合成することもできる。また、後述の実施例において示すとおり、アクチビンの組換えタンパク質は、既に市販されている。そのため、かかる市販品（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．アクチビン組換え体（リコンビナント）タンパク質、味の素株式会社 アクチビンＡ溶液 ヒト リコンビナント等）も、本発明において好適に用いられる。
【0026】
さらに、本発明においては、アクチビンの代わりに、アクチビン様活性を持つ物質を用いることもできる。かかる物質としては、例えば、アクチビンの構造を基に設計して合成される、アクチビン模倣体が挙げられる。
【0027】
また、後述の実施例に示すとおり、アクチビンはその下流のシグナル伝達経路を活性化して、ＭＳＣの増殖促進を促進する。そのため、アクチビンシグナル伝達経路を活性化する物質（タンパク質、核酸、低分子化合物等）、アクチビンシグナルを不活性化する物質に対し、抑制的に機能する物質（タンパク質、核酸、低分子化合物（阻害剤）等）も、前記アクチビン様活性を持つ物質として用いることができる。「アクチビンシグナル伝達経路」としては、アクチビンが関与するシグナル伝達経路であれば特に制限はないが、例えば、Ｐｌ３Ｋ－Ａｋｔ／ＰＫＢのシグナル伝達経路が挙げられる。また、「アクチビンシグナル伝達経路を活性化する物質」としては、例えば、アクチビンにより活性化される細胞内伝達物質（カノニカル、ノンカノニカルシグナル伝達経路を構成する細胞内伝達物質、より具体的には、Ｓｍａｄ２又はＳｍａｄ３とＳｍａｄ４との複合体、ＴＡＫ１等の細胞内ＭＡＰＫカスケードに関わるリン酸化酵素）、及びそれら各タンパク質の活性化剤が挙げられる。さらに、アクチビンシグナルに対して抑制的に作用するＳｍａｄ（Ｓｍａｄ６、Ｓｍａｄ７等）に対する阻害剤、並びにそれらに対して抑制的に機能する核酸及びタンパク質が挙げられる。かかる核酸及びタンパク質としては、前記Ｓｍａｄを標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム活性を有するＲＮＡ（リボザイム）、ｄｓＲＮＡ、ゲノム編集系、抗体、ドミナントネガティブの形質を有するペプチド等が挙げられる。
【0028】
また、アクチビンは、細胞膜受容体としてＩ型受容体（Ａｌｋ２、Ａｌｋ４等）とII型受容体（ＡｃｔＲＩＩａ又はＡｃｔＲＩＩｂ）のヘテロダイマーに結合して細胞内情報伝達経路を活性化することが知られている。そのため、前記受容体ヘテロダイマーに結合可能な物質（タンパク質、核酸、低分子化合物等）も、前記アクチビン様活性を持つ物質として用いることができる。
【0029】
また、アクチビン様活性を持つ物質は、合成低分子化合物ライブラリーから、アクチビンが奏し得る活性を指標としたスクリーニング方法によって選択することにより、得ることもできる。
【0030】
本発明において「アクチビンの活性」は、ＭＳＣの増殖促進活性、軟骨再生促進活性、退行変性抑制活性及び疼痛緩和効果のうちの少なくとも１の活性等を意味する。上記アクチビンの改変体及び相同体、並びに低分子化合物が、当該活性を奏し得るかは、後述の実施例に示すように、ＭＳＣの培養系及び／又は軟骨損傷モデル動物を用いることによって評価することができる。また、本発明において「アクチビンの活性」には、前記本発明者らが見出したアクチビンの新たな活性のみならず、従前から知られている公知の活性も含まれ得る。かかる公知の活性としては、ヘモグロビン合成誘導能等が挙げられ、例えば、ヒト慢性骨髄性白血病細胞（Ｋ５６２細胞）の培養系を用いることにより評価することができる（Ｒａｌｐｈ Ｈ．Ｓｃｈｗａｌｌ，Ｃｏｒａ Ｌａｉ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９９１年、１９８巻、３４０～３４６ページ 参照）。
【0031】
「間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＭＳＣ）」とは、中胚葉性組織（間葉）に由来し、間葉系に属する細胞への分化能を有する体性幹細胞を意味する。かかる細胞は、骨髄（Ｐｒｏｃｋｏｐ，Ｄ．Ｊ．，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７６：７１－４）、間葉系組織、例えば、滑膜（Ｓｅｋｉｙａ Ｉ．ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｃｌｉｎ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｌａｔ Ｒｅｓ、４７３（７）：２３１６～２３２６、Ｄｅ Ｂａｒｉ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２００１，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４４：１９２８－４２）、骨膜（Ｆｕｋｕｍｏｔｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ．１１：５５－６４）、脂肪組織（Ｚｕｋ，Ｐ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ．１３：４２７９－９５）、筋肉組織（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：６４０－６）から単離することにより得ることができる。また、「間葉系幹細胞（ＭＳＣ）」は、ヒト又はヒト以外の動物（例えば、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、カモ、ダチョウ、アヒル、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、マウス、ラット、サル）に由来するものであり、さらには、これら動物の体内（例えば、滑膜、関節内、関節液、骨膜、脂肪組織、筋肉組織、骨髄）に存在する細胞であってもよく、体外に存在する細胞（例えば、培養ＭＳＣ）であってもよい。
【0032】
「軟骨組織」とは、軟骨細胞又は軟骨細胞様細胞、及び細胞外基質（例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン及びデルマタン硫酸プロテオグリカン等のプロテオグリカン、Ｉ型、II型、IX型及びXI型コラーゲン）を含む結合組織を意味し、硝子軟骨組織（関節軟骨組織）、線維軟骨組織（半月板等）、弾力軟骨組織が挙げられる。また「軟骨組織」は、ヒト又はヒト以外の動物に由来するものであり、さらには、これら動物の体内（例えば、関節、半月板、腱・靭帯の付着部、椎間板、胸郭壁、喉頭、気道、耳）に存在する組織であってもよく、体外に存在する組織（例えば、培養軟骨組織）であってもよい。なお、本発明において「軟骨組織」とは、該組織を構成する細胞（軟骨細胞、軟骨細胞様細胞等）を含む概念である。また、「軟骨組織の再生」とは、後述の障害を受けた軟骨組織を、物理的及び／又は機能的に、本来の正常な状態に近付ける又は戻すことを意味し、軟骨組織の修復も含まれる。また、「軟骨組織の退行変性」とは、軟骨組織の形態的、量的変化（軟骨のすり減りや断裂等の構造変化）を意味し、細胞外基質の構成成分（コラーゲンやプロテオグリカン等）の質的変化（例えば、コアプロテインに対する糖鎖修飾の変化やＡＧＥ（Ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の蓄積、プロテオグリカンの減少等の軟骨基質の組成比率の変化）も、軟骨組織の退行変性に含まれる。なお、本発明において、「抑制」には、部分的な抑制のみならず、完全な抑制（阻害）も含まれる。
【0033】
「軟骨障害」とは、加齢、外傷、その他様々な要因によって、軟骨組織が障害を受けている状態をいい、例えば、軟骨欠損、軟骨損傷、軟骨変性、軟骨摩耗、軟骨消失、軟骨分解、軟骨変形の状態が挙げられる。また、軟骨障害の具体的な例（疾患）としては、半月板損傷（部分断裂を含む）、半月板欠損（半月板切除術後の状態も含む）、関節軟骨の欠損、関節軟骨の退行変性、変形性関節症（変形性膝関節症、変形性股関節症、変形性肩関節症等）、外傷性軟骨損傷、離断性骨軟骨炎、無腐性骨壊死、椎間板損傷、顎関節症等が挙げられる。
【0034】
「半月板損傷」とは、膝関節内にある半月板が損傷を受け、さまざまな障害を引き起こす状態をいい、具体的な疾患としては、半月板損傷（事故又はスポーツ外傷の伴う半月板損傷、又は加齢に伴う半月板損傷を含む）、半月板断裂、半月板変性（温存適応の半月板変性を含む）、半月板欠損等が挙げられる。
【0035】
本発明の組成物（医薬組成物を含む）は、半月板縫合術又は半月板修復術の術前、術中、及び／又は術後に投与することもできる。
【0036】
本発明において「組成物」は、上述のアクチビンを有効成分として含んでいればよく、該組成物は、ＭＳＣの増殖促進により疾患を治療又は予防するための医薬組成物、ＭＳＣの増殖を促進するための試薬として用いることができる。また、本発明の組成物は、ＭＳＣの増殖促進及び／又は軟骨組織の再生を介した、軟骨障害の治療又は予防のための医薬組成物、軟骨組織の退行変性を抑制するための医薬組成物として用いることができる。さらに、軟骨障害に伴う疼痛を緩和するための医薬組成物（例えば、変形性関節症に伴う慢性疼痛の緩和剤）として用いることもできる。また、本発明の組成物は、半月板損傷の治療又は予防のための医薬組成物として用いることもできる。
【0037】
本発明の組成物における、アクチビンの有効成分としての含有量は、用いるアクチビンの形態、該組成物の用途（例えば、医薬組成物用途、試薬用途）等によって、前述のアクチビンの活性等を指標として適宜調整され得るが、少なくとものアクチビンのＥＤ５０の１倍量（例えば、０．２～１．２ｎｇ／ｍＬ）、好ましくはＥＤ５０の１０倍量以上（例えば、２～２０ｎｇ／ｍＬ）、より好ましくはＥＤ５０の５０倍量以上（例えば、１０～１００ｎｇ／ｍＬ）、さらに好ましくはＥＤ５０の１００倍量以上（例えば、２０～２００ｎｇ／ｍＬ）、より好ましくはＥＤ５０の５００倍量以上（例えば、１００～１０００ｎｇ／ｍＬ）である。なお、アクチビンのＥＤ５０は、ヒト慢性骨髄性白血病細胞（Ｋ５６２細胞）の培養系を用いたヘモグロビン合成誘導能等に基づく（Ｒａｌｐｈ Ｈ．Ｓｃｈｗａｌｌ，Ｃｏｒａ Ｌａｉ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９９１年、１９８巻、３４０～３４６ページ 参照）。
【0038】
本発明の組成物を医薬組成物として用いる場合、当該医薬組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、注射剤、ゲル剤、塗布剤等として、通常非経口的に使用することができるが、投与部位（関節内等）の流動性を妨げないという観点から、膝関節等の治療においては、注射剤が好ましい。また、股関節等の治療においては、手術時に関節内に留置するといった態様をとり得るから、ゲル剤（より好ましくは、徐放性のゲル剤）が好適に用いられる。
【0039】
注射剤は、アクチビン等を溶剤に溶解、懸濁又は乳化して調製することができる。溶剤として、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水、滅菌水（注射用蒸留水等）、培地（例えば、ＭＳＣ培養用培地）、植物油、アルコール類、及びそれらの組み合わせが用いられる。また、固形剤（例えば、凍結乾燥品）として製造し、その使用前に前述の溶剤に溶解して使用することもできる。
【0040】
ゲル剤は、アクチビン等をポリマーと混合して調製することができる。かかるポリマーとして、例えば、ヒアルロン酸、コラーゲン（I型、II型、IV型、XI型のコラーゲン等）、ゼラチン、セルロース、アガロース、デキストラン、キシログルカン、キトサン、キチン、デンプン、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、及びそれらの組み合わせが用いられる。
【0041】
塗布剤は、アクチビン等を基剤に研和、または溶解させて調製される。基剤として、例えば、高級脂肪酸又は高級脂肪酸エステル、ロウ類、界面活性剤、高級アルコール、シリコン油、炭化水素類（ワセリン、流動パラフィン等）、グリコール類、植物油、動物油、及びそれらの組み合わせが用いられる。
【0042】
さらに、生分解性であり徐々に溶解する重合物質を含有させることにより、徐放性を持たすことができる。重合物質としては、例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチル澱粉、メタクリル酸ジビニルベンゼンカリウムコポリマー、シクロデキストリンが挙げられる。
【0043】
また、これら製剤化においては更に、薬理学上許容される担体、具体的には、無痛化剤、吸収促進剤、滅菌水、生理食塩水、ＰＢＳ、植物油、動物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、粘稠剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等を、適宜組み合わせてもよい。
【0044】
また、本発明の医薬組成物は、必要に応じて、他の医薬活性成分を含んでいてもよく、例えば、ヘパリン硫酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン、グルコサミン、コラーゲン、ゼラチン、ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、軟骨細胞成長促進因子（ＢＭＰ、デキサメタゾン、ＴＧＦ－β、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ－1、ＰＤＧＦ、ＣＤＭＰ、ＣＳＰ、ＥＰＯ、ＩＬ、ＯＰ、ＣＯＰ等）が挙げられる。
【0045】
さらに、本発明の医薬組成物は、後述の投与用器具（例えば、注射器、ゲル用ピペット、シリンジ）等と併せて、半月板損傷又は軟骨障害の治療又は予防用キットの形態もとり得る。
【0046】
また、本発明の組成物を、試薬として用いる場合には、薬理学上許容される担体、具体的には、培地（例えば、ＭＳＣ培養用培地）、ＰＢＳ、生理食塩水、滅菌水、植物油、動物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、緩衝剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等を、適宜組み合わせて調製することができる。なお、本発明の組成物を、ＭＳＣの増殖促進用試薬として用いる場合には、その分化多能性を維持するという観点から、軟骨細胞成長促進因子は含有していないことが望ましい。
【0047】
本発明の組成物の製品（医薬品、試薬）又はその説明書は、ＭＳＣの増殖の促進、軟骨組織の再生を促進、半月板損傷又は軟骨障害を治療又は予防するために用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品又は説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装等に表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物等に表示を付したことを意味する。
【0048】
（半月板損傷又は軟骨障害の治療又は予防方法）
後述の実施例等において示すとおり、アクチビンＡを用いることによって、半月板又は軟骨の再生を促進し、また軟骨の変性を抑制し、さらには半月板損傷又は軟骨障害に伴う疼痛を緩和することができる。したがって、本発明は、対象の半月板損傷又は軟骨障害部位に、アクチビンを投与する工程を含む、半月板損傷又は軟骨障害を治療又は予防する方法を、提供する。
後述の実施例等において示すとおり、アクチビンＡを用いることによって、半月板又は軟骨の再生を促進し、また軟骨の変性を抑制し、さらには半月板損傷又は軟骨障害に伴う疼痛を緩和することができる。したがって、本発明は、対象の半月板損傷又は軟骨障害部位に、アクチビンを投与する工程を含む、半月板損傷又は軟骨障害を治療又は予防する方法を、提供する。
【0049】
半月板損傷又は軟骨障害については、上述のとおりである。また、半月板損傷部位又は軟骨障害部位については、半月板損傷又は軟骨障害の疾患の種類に基づき、当業者であれば理解できる。また、半月板損傷又は軟骨障害の治療又は予防の対象は、ヒト又はヒト以外の動物とすることができるが、特にヒトに好適に用いられる。また、ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物等を対象とすることができる。具体的には、ブタ、ウシ、ウマ（例えば、競走馬）、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、カモ、ダチョウ、アヒル、イヌ（例えば、愛玩犬）、ネコ、ウサギ、ハムスター、マウス、ラット、サルが挙げられるが、これらに制限されない。また、半月板損傷又は軟骨障害を既に患っているものに限らず、発症するおそれのあるもの、半月板損傷又は軟骨障害が再発したもの又はそのおそれがあるものも、本発明の対象となり得る。
【0050】
対象に投与されるアクチビンは、上述のアクチビンのみであってもよいが、上述の医薬組成物の形態が好適に用いられる。アクチビン又は医薬組成物を投与する場合、その投与量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の剤型、投与部位、投与等の形態（注射、塗布等）等に応じて、適宜選択されるが、ヒト（成人）を対象とした場合、１日に、好ましくは、０．０５～１００μｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、０．１～５０μｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは、０．５～１０μｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１～５μｇ／ｋｇ体重（例えば、１．６μｇ／ｋｇ体重）のアクチビン、又はそれを含む組成物を１回若しくは数回に分けて投与される。投与時期は、投与部位、症状、各剤型等に応じ適宜選択されるが、関節侵襲後に生じる炎症が消退した時期（例えば、関節侵襲後７～２１日目、好ましくは関節侵襲後１０～１８日目、より好ましくは関節侵襲後１２～１６日目、さらに好ましくは１４日目）が挙げられる。また、投与方法は、投与部位、症状、各剤型等に応じ適宜選択されるが、例えば、注射器、ゲル用ピペット、シリンジを用いることにより、患部（半月板損傷部位又は軟骨障害部位）に容易に適用することができる。
【0051】
さらに、上述のとおり、本発明においては、アクチビンと併せて他の医薬活性成分を投与してもよい。また、半月板損傷又は軟骨障害をより効果的に治療等し易くなるという観点から、ＭＳＣも併せて投与することが望ましい（ＭＳＣを用いた軟骨障害の治療方法については、特表２０１０－５０１５４７、特開２０１４－１９６３５４等を参照のほど）。ＭＳＣについては、上述のとおりであるが、より高い軟骨形成能を有することから、滑膜由来のＭＳＣを用いることが好ましい。なお、本発明における「併せて」の投与は、アクチビンと同時に投与することのみならず、アクチビンの投与前又は投与後に、他の医薬活性成分及び／又はＭＳＣを投与することも含まれる。
【0052】
（軟骨障害の予後予測法）
後述の実施例に示すとおり、アクチビンＡの関節内濃度が高い患者ほど軟骨障害の予後が良好であることが明らかになった。したがって、本発明は、対象の関節内のアクチビンの濃度を測定する工程と、前記工程にて得られた濃度が参照値より高ければ、前記対象における軟骨障害の予後は良好であると予測する工程とを含む、関節における軟骨障害の予後を予測する方法を、提供する。
後述の実施例に示すとおり、アクチビンＡの関節内濃度が高い患者ほど軟骨障害の予後が良好であることが明らかになった。したがって、本発明は、対象の関節内のアクチビンの濃度を測定する工程と、前記工程にて得られた濃度が参照値より高ければ、前記対象における軟骨障害の予後は良好であると予測する工程とを含む、関節における軟骨障害の予後を予測する方法を、提供する。
【0053】
対象及び軟骨障害については上述のとおりである。対象の関節内のアクチビンの濃度の「測定」は、通常、関節内にある関節液を対象として行なわれる。「測定時点」としては、特に制限はないが、後述の実施例に示すとおり、アクチビンの濃度は急性炎症期に向上し易く、より検出し易いという観点から、当該時期が好ましく、より具体的には、関節侵襲後（例えば、関節手術後）であり、関節侵襲後１日目～１週間がより好ましく、関節侵襲後３～４日目がより好ましい。「測定方法」としても、特に制限はないが、アクチビンに特異的に結合する抗体による検出方法（免疫学的手法）が通常用いられる。より具体的には、免疫アッセイ（酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫アッセイ、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、免疫クロマト法及びウエスタンブロット法が挙げられる。さらには、アクチビンに特異的に結合する化合物を固定化した金属薄膜を用いる、表面プラズモン共鳴現象を利用した検出装置（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（ＧＥヘルスケア社製））を利用する方法も挙げられる。
【0054】
本発明における「参照値」としては、軟骨障害の予後予測を判断する際の指標となる値（カットオフ値等）であり、具体的には、参照値として、関節液内のアクチビンの濃度が、５５０ｐｇ／ｍＬ、好ましくは７５０ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは９５０ｐｇ／ｍＬであることが挙げられる。そして、本発明の方法において、前記測定値は、かかる参照値より有意に高ければ、軟骨障害の予後（術後等）が良好となる傾向にあると予測され、一方、低ければ、予後が不良となる傾向にあると予測される。
【0055】
また、このようにして予後不良と予測された対象には、アクチビンを補充する（例えば、参照値の濃度になるまでアクチビンを補充する）ことによって、当該対象の関節内における軟骨再生能を向上させ、予後を好転させることも可能となる。
【0056】
したがって、本発明は、対象の関節内のアクチビンの濃度を測定する工程と、前記工程にて得られた濃度が参照値より低い場合、対象の軟骨障害部位に、アクチビン、又はアクチビン及びＭＳＣを投与する工程とを含む、軟骨障害を治療又は予防する方法も提供する。
【実施例】
【0057】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、本実施例は、以下の材料及び方法を用いて行なった。
【0058】
（材料）
組み換えヒトＩＬ１ｂ，ＩＬ６，ＩＬ８，ＰＤＧＦ－ＡＡ及びアクチビンＡは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）から購入した。ＭＥＭ－ａｌｐｈａ（改変イーグル培地）、ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、抗生－抗真菌溶液（以下「抗生物質」とも称する）及びトリプシン－ＥＤＴＡ溶液は、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（ＭＡ，ＵＳＡ）より購入した。コラゲナーゼＤはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＭＯ，ＵＳＡ）より購入した。ＭＴＴ（３－（４，５－ジメチル－２－チアゾリル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）は、Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）より購入した。
組み換えヒトＩＬ１ｂ，ＩＬ６，ＩＬ８，ＰＤＧＦ－ＡＡ及びアクチビンＡは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）から購入した。ＭＥＭ－ａｌｐｈａ（改変イーグル培地）、ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、抗生－抗真菌溶液（以下「抗生物質」とも称する）及びトリプシン－ＥＤＴＡ溶液は、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（ＭＡ，ＵＳＡ）より購入した。コラゲナーゼＤはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＭＯ，ＵＳＡ）より購入した。ＭＴＴ（３－（４，５－ジメチル－２－チアゾリル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）は、Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）より購入した。
【0059】
（倫理）
全てのヒトに関する研究は、東京医科歯科大学の倫理委員会によって承認を受けたものである（承認番号：Ｎｏ．４５５及びＮｏ．２１２１）。本研究に関する全ての患者から、当該研究に参加することにつき、告知に関する同意を完全な書面にて得ている。全ての動物に関する研究は、東京医科歯科大学の動物実験委員会の承認を受けたものである（承認番号：Ｎｏ．０１６０２７４）。全ての動物実験は、所属組織のガイドラインに従って行った。
全てのヒトに関する研究は、東京医科歯科大学の倫理委員会によって承認を受けたものである（承認番号：Ｎｏ．４５５及びＮｏ．２１２１）。本研究に関する全ての患者から、当該研究に参加することにつき、告知に関する同意を完全な書面にて得ている。全ての動物に関する研究は、東京医科歯科大学の動物実験委員会の承認を受けたものである（承認番号：Ｎｏ．０１６０２７４）。全ての動物実験は、所属組織のガイドラインに従って行った。
【0060】
（関節穿刺及びタンパク質解析のための関節液調製）
関節液は、膝前十字靱帯再建術（ＡＣＬ－Ｒ，Ｉｎｏｕｅ Ｍ，ら、Ｊ Ｅｘｐ Ｏｒｔｈｏｐ．２０１６ Ｄｅｃ；３（１）：３０ 参照のほど）の直前、及び３～４日後に関節穿刺を行い、採取した。
関節液は、膝前十字靱帯再建術（ＡＣＬ－Ｒ，Ｉｎｏｕｅ Ｍ，ら、Ｊ Ｅｘｐ Ｏｒｔｈｏｐ．２０１６ Ｄｅｃ；３（１）：３０ 参照のほど）の直前、及び３～４日後に関節穿刺を行い、採取した。
【0061】
ＡＣＬ－Ｒの直前及び３～４日後に採取した関節液の増殖促進活性及びサイトカイン／ケモカインの濃度の初期評価（図２Ａ及び図３Ａ 参照）を行なうため、凍結保存した関節液中から遠心によりデブリを除去後、関節液を超音波処理し（Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ Ｓｅｔｔｉｎｇｓ ａｔ ４０％，Ｑ１２５ Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ，ＱＳＯＮＩＣＡ ＬＬＣ．，Ｎｅｗｔｏｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）、粘度を低下させ、実験に供した（図１Ａ 参照）。
【0062】
また、関節液中から生理活性物質を同定する実験（図２Ｂ～Ｄ、３Ｂ及び４Ａ～Ｃ 参照）においては、関節液中に含まれる細胞成分由来の物質の影響をより厳密に除外する目的で、関節液採取後、直ちに８６０ｘｇ、１０分間の遠心分離処理（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ａｔ ２，０００ｒｐｍ ｆｏｒ １０ｍｉｎ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に供し、細胞画分を除去した。そして、粘度を低下させるため、上清を１０秒間超音波処理し、７０μｍナイロンメッシュに通すことによりデブリを除去した（図１Ｂ 参照）。その後、凍結保存を行なった関節液を実験に用いた。
【0063】
なお、図には示していないが、関節液におけるサイトカイン／ケモカインレベルを解析し、試験したそれらにおいて、ＩＬ－８レベルのみが、凍結保存前に遠心分離して細胞成分を除外した関節液において有意に低減した。また、本研究に参加した患者の情報を、表１に示す。
【0064】
【表1】
【0065】
（滑膜間葉系幹／間質細胞の単離及び拡大培養）
Ｓｅｋｉｙａ Ｉ.ら、Ｃｌｉｎ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｌａｔ Ｒｅｓ、２０１５年、４７３（７）、２３１６～２３２６ページに記載のとおり、初代ヒト滑膜細胞を、全人工膝関節置換術（ＴＫＡ）を行なった患者より得た滑膜組織より単離した。すなわち、先ず、膝蓋骨上滑液包を切開して得た滑膜０．５～１ｍｇをコラゲナーゼＤ処理（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ，ＵＳＡ、３７℃で３時間）に供し、有核細胞を分散させた。細胞分散液を７０μｍナイロンメッシュに通し、デブリを除去した。有核細胞を１５ｃｍディッシュに５．７ｘ１０２細胞／ｃｍ２になるよう播種し、１０％ＦＢＳ及び抗生物質（Ｇｉｂｃｏ，ＭＡ，ＵＳＡ）を添加したＭＥＭ－ａｌｐｈａ培地にて、１４日間維持培養した。そして、細胞を、ＴｒｉｐＬＥ溶液（Ｇｉｂｃｏ）にてディッシュより分離させ、実験に供するのに十分な細胞数を得るため、新たなディッシュに更に２回播種した。なお、全ての実験には、６継代以内の細胞を用いた。
Ｓｅｋｉｙａ Ｉ.ら、Ｃｌｉｎ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｌａｔ Ｒｅｓ、２０１５年、４７３（７）、２３１６～２３２６ページに記載のとおり、初代ヒト滑膜細胞を、全人工膝関節置換術（ＴＫＡ）を行なった患者より得た滑膜組織より単離した。すなわち、先ず、膝蓋骨上滑液包を切開して得た滑膜０．５～１ｍｇをコラゲナーゼＤ処理（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ，ＵＳＡ、３７℃で３時間）に供し、有核細胞を分散させた。細胞分散液を７０μｍナイロンメッシュに通し、デブリを除去した。有核細胞を１５ｃｍディッシュに５．７ｘ１０２細胞／ｃｍ２になるよう播種し、１０％ＦＢＳ及び抗生物質（Ｇｉｂｃｏ，ＭＡ，ＵＳＡ）を添加したＭＥＭ－ａｌｐｈａ培地にて、１４日間維持培養した。そして、細胞を、ＴｒｉｐＬＥ溶液（Ｇｉｂｃｏ）にてディッシュより分離させ、実験に供するのに十分な細胞数を得るため、新たなディッシュに更に２回播種した。なお、全ての実験には、６継代以内の細胞を用いた。
【0066】
（関節液の増殖促進活性の評価）
関節液の増殖促進活性を評価するため（図２Ａ～Ｄ、３Ａ、３Ｂ及び５Ｂ 参照）、滑膜由来のＭＳＣを、６ｃｍディッシュに５ｘ１０３細胞数になるよう播種し、１４％関節液を添加した通常増殖培地（ＭＥＭ－ａｌｐｈａ，１０％ＦＢＳ及び抗生物質）、３７℃、２週間、維持培養を行なった。そして、細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡにてディッシュより分離させ、自動細胞数計測機（ＴＣ－２０；Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）にて、細胞数を計測した。また、死細胞は、トリパンブルー染色にて除去した。
関節液の増殖促進活性を評価するため（図２Ａ～Ｄ、３Ａ、３Ｂ及び５Ｂ 参照）、滑膜由来のＭＳＣを、６ｃｍディッシュに５ｘ１０３細胞数になるよう播種し、１４％関節液を添加した通常増殖培地（ＭＥＭ－ａｌｐｈａ，１０％ＦＢＳ及び抗生物質）、３７℃、２週間、維持培養を行なった。そして、細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡにてディッシュより分離させ、自動細胞数計測機（ＴＣ－２０；Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）にて、細胞数を計測した。また、死細胞は、トリパンブルー染色にて除去した。
【0067】
（関節液における、サイトカイン、補体及び増殖因子の定量）
関節液におけるサイトカイン／ケモカイン及び補体のレベルは、サイトメトリック ビーズ アレイ システム（ＣＢＡキット，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用い、その使用説明書に従って、測定した。また、シグナルを検出するため、ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅフローサイトメトリー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、データ解析ソフトウェア、及びＢＤ ＦＣＡＰ アレイソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。ヒトＩＬ８（ＣＸＣＬ８），ＩＬ１ｂ，ＩＬ６，ＩＬ１０，ＴＮＦａ及びＩＬ１２を定量するため、ヒト炎症性サイトカインＣＢＡキットを使用した。さらに、ヒトケモカインＣＢＡキットを、ヒトＭＩＧ（ＣＸＣＬ９），ＩＰ１０（ＣＸＣＬ１０），ＭＣＰ１（ＣＣＬ２）及びＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）を解析するために用いた。ヒトアナフィラトキシンキットは、ヒトＣ３ａ，Ｃ４ａ及びＣ５ａを定量するために用いた。関節液におけるＰＤＧＦ－ＡＡ，ＰＤＧＦ－ＢＢ及びアクチビンＡのレベルを決定するため、ＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）を用い、その使用説明書に従って、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）を行なった。
関節液におけるサイトカイン／ケモカイン及び補体のレベルは、サイトメトリック ビーズ アレイ システム（ＣＢＡキット，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用い、その使用説明書に従って、測定した。また、シグナルを検出するため、ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅフローサイトメトリー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、データ解析ソフトウェア、及びＢＤ ＦＣＡＰ アレイソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。ヒトＩＬ８（ＣＸＣＬ８），ＩＬ１ｂ，ＩＬ６，ＩＬ１０，ＴＮＦａ及びＩＬ１２を定量するため、ヒト炎症性サイトカインＣＢＡキットを使用した。さらに、ヒトケモカインＣＢＡキットを、ヒトＭＩＧ（ＣＸＣＬ９），ＩＰ１０（ＣＸＣＬ１０），ＭＣＰ１（ＣＣＬ２）及びＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）を解析するために用いた。ヒトアナフィラトキシンキットは、ヒトＣ３ａ，Ｃ４ａ及びＣ５ａを定量するために用いた。関節液におけるＰＤＧＦ－ＡＡ，ＰＤＧＦ－ＢＢ及びアクチビンＡのレベルを決定するため、ＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）を用い、その使用説明書に従って、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）を行なった。
【0068】
（組換えタンパク質による滑膜ＭＳＣｓの増殖アッセイ）
組換えタンパク質（ＩＬ６，ＩＬ８，ＩＬ１０及びアクチビンＡ）の増殖促進活性を評価するため、ＭＴＴアッセイを行なった（図３Ｃ及び５Ｃ～Ｅ 参照）。滑膜ＭＳＣｓを、組換えタンパク質処理に供する１日前、９６ウェルプレートに、１ｘ１０３細胞／ウェルになるよう播種し、０．２ｍＬの通常増殖培地にて培養した。その翌日に、培地を、新鮮なもの（通常増殖培地、又はＦＢＳの濃度を０．５％に低減し、組換えタンパク質（ＥＤ５０の１０倍の濃度 又は ＥＤ５０の１００倍の濃度）を添加した培地）に置換した。ＭＴＴアッセイは、Ｄｅｎｉｚｏｔ Ｆ.ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９８６年、８９（２）、２７１～２７７ページに記載の方法に沿って、０，１，３，５及び７日目に行なった。
組換えタンパク質（ＩＬ６，ＩＬ８，ＩＬ１０及びアクチビンＡ）の増殖促進活性を評価するため、ＭＴＴアッセイを行なった（図３Ｃ及び５Ｃ～Ｅ 参照）。滑膜ＭＳＣｓを、組換えタンパク質処理に供する１日前、９６ウェルプレートに、１ｘ１０３細胞／ウェルになるよう播種し、０．２ｍＬの通常増殖培地にて培養した。その翌日に、培地を、新鮮なもの（通常増殖培地、又はＦＢＳの濃度を０．５％に低減し、組換えタンパク質（ＥＤ５０の１０倍の濃度 又は ＥＤ５０の１００倍の濃度）を添加した培地）に置換した。ＭＴＴアッセイは、Ｄｅｎｉｚｏｔ Ｆ.ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９８６年、８９（２）、２７１～２７７ページに記載の方法に沿って、０，１，３，５及び７日目に行なった。
【0069】
（抗体によるタンパク質アレイ）
関節液に存在し、滑膜ＭＳＣｓの増殖を有意に促進する、新規生理活性化合物を同定するため、発現差異アッセイを行なった。ガラスチップベース ヒトサイトカイン抗体アレイシステムＧ（ＲａｙＢｉｏ Ｓｅｒｉｅｓ Ｇ－２０００ Ｓｅｒｉｅｓ，ｓｌｉｄｅｓ ＡＡＨ－ＣＹＴ－Ｇ２０００－８，ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ，ＵＳＡ）を用い、その使用説明書に従って、関節液における１７４タンパク質の発現レベルを定量化した。さらに、高い増殖促進活性を示す関節液（ｎ＝４）と低いそれを示す関節液（ｎ＝４）とにて、発現に差異が認められるタンパク質を解析した。そして、統計上発現レベルに差があるものとして、全１３のタンパク質を選抜した。
関節液に存在し、滑膜ＭＳＣｓの増殖を有意に促進する、新規生理活性化合物を同定するため、発現差異アッセイを行なった。ガラスチップベース ヒトサイトカイン抗体アレイシステムＧ（ＲａｙＢｉｏ Ｓｅｒｉｅｓ Ｇ－２０００ Ｓｅｒｉｅｓ，ｓｌｉｄｅｓ ＡＡＨ－ＣＹＴ－Ｇ２０００－８，ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ，ＵＳＡ）を用い、その使用説明書に従って、関節液における１７４タンパク質の発現レベルを定量化した。さらに、高い増殖促進活性を示す関節液（ｎ＝４）と低いそれを示す関節液（ｎ＝４）とにて、発現に差異が認められるタンパク質を解析した。そして、統計上発現レベルに差があるものとして、全１３のタンパク質を選抜した。
【0070】
（ウェスタンブロッティング）
滑膜ＭＳＣｓを、２ｘ１０５細胞数になるよう、６ｃｍディッシュに播種し、通常増殖培地にて１日培養した。培地を、ＦＢＳ量を減らした新鮮な培地（（ＭＥＭ－ａｌｐｈａ，０．５％ＦＢＳ及び抗生物質）に換え、もう一日培養した。細胞を、ｒｈＡｃｔｉｖｉｎ Ａ及び／又はＰＤＧＦ－ＡＡ（ＥＤ５０の３倍量）にて、最長３０分間処理した。そして、それら細胞を、細胞溶解バッファー（＃９８０３Ｓ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＭＡ）にて溶解し、全細胞溶解液を調製した。
滑膜ＭＳＣｓを、２ｘ１０５細胞数になるよう、６ｃｍディッシュに播種し、通常増殖培地にて１日培養した。培地を、ＦＢＳ量を減らした新鮮な培地（（ＭＥＭ－ａｌｐｈａ，０．５％ＦＢＳ及び抗生物質）に換え、もう一日培養した。細胞を、ｒｈＡｃｔｉｖｉｎ Ａ及び／又はＰＤＧＦ－ＡＡ（ＥＤ５０の３倍量）にて、最長３０分間処理した。そして、それら細胞を、細胞溶解バッファー（＃９８０３Ｓ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＭＡ）にて溶解し、全細胞溶解液を調製した。
【0071】
ウェスタンブロッティングは、Ｕｏｍｉｚｕ，Ｍ．ら、Ｊ Ｍｅｄ Ｄｅｎｔ Ｓｃｉ．６５巻、７３～８２ページに記載の方法にて行なった。抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより購入したものを用いた（ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ４４／４２（＃４３７０），ｐ４４／４２（＃９１０２），ｐｈｏｓｐｈｏ－Ａｋｔ（＃９２７１）及びＡｋｔ（＃９２７２））。
【0072】
（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ分化アッセイ）
Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ分化アッセイは、Ｃｏｌｔｅｒ ＤＣ.ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２００１年、９８、７８４１～７８４５ページに記載の方法に従って行なった。
Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ分化アッセイは、Ｃｏｌｔｅｒ ＤＣ.ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２００１年、９８、７８４１～７８４５ページに記載の方法に従って行なった。
【0073】
コンドロジェニック スフェロイドを形成させるため、２．５ｘ１０５個の細胞を、１５ｍＬポリプロピレンチューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移し、４５０ｘｇ、１０分間遠心分離処理に供した。そして、１０００ｎｇ／ｍＬ ｒｈＢＭＰ－２（Ｉｎｆｕｓｅ Ｂｏｎｅ Ｇｒａｆｔ；Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ，ＴＮ，ＵＳＡ），１０ｎｇ／ｍＬ トランスフォーミング増殖因子－β３及び１００ｎＭ デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含む、コンドロジェニック培地にて、１４日間培養した。
【0074】
石灰化のため、細胞を、１ｎＭ デキサメタゾン、２０ｍＭ β－グリセロリン酸及び５０μｇ／ｍＬ アスコルビン酸－２－リン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した通常増殖培地にて、２１日間培養した。石灰化結節形成は、アリザリンレッド染色（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）にて可視化した。
【0075】
脂肪生成のため、１０％ ＦＢＳ、１００ｎＭ デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．５ｍＭ ＩＢＭＸ（イソブチル－１－メチルキサンチン；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び５０μＭインドメタシン（Ｗａｋｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を添加したＭＥＭ－ａｌｐｈａにて、２１日間培養した。脂肪生成培養物は、固定化し、オイルレッドＯ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）により染色した。
【0076】
（表面抗原の発現解析）
細胞は、ＴｒｙｐＬＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ，ＵＳＡ）にて５分間処理することにより分離させ、Ｔｓｕｊｉ Ｋ.ら、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、２０１７年、２６（６）、１０８９～１１０２ページに記載のとおり、抗体にて染色した。そして、表面抗原陽性細胞画分を、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い測定した。なお、細胞表面マーカー（ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５及びＣＤ４４）を解析するための、蛍光色素標識抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＮＪ）より購入したものを用いた。
細胞は、ＴｒｙｐＬＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ，ＵＳＡ）にて５分間処理することにより分離させ、Ｔｓｕｊｉ Ｋ.ら、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、２０１７年、２６（６）、１０８９～１１０２ページに記載のとおり、抗体にて染色した。そして、表面抗原陽性細胞画分を、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い測定した。なお、細胞表面マーカー（ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５及びＣＤ４４）を解析するための、蛍光色素標識抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＮＪ）より購入したものを用いた。
【0077】
（内側半月板前方切除）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの雄マウス２０匹（８週齢、体重：約２５ｇ）を本研究に用いた（各グループ５匹ずつ。ＯＲＩＥＮＴＡＬ ＹＥＡＳＴ Ｃｏ．Ｌｔｄ．Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）。イソフルラン吸入により麻酔にかけ、左の前膝部を真っ直ぐ切開し、関節包の前中央側を切った。次いで、膝蓋腱を横方向に脱臼させ、内側半月板前角を露出させた（Ｈｉｙａｍａ Ｋ.ら、Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ．、２０１７年、３５（９）、１９５８～１９６５ページ 参照）。半月板前角を切り、鉗子を用いて前方に脱臼させた。内側半月板を、内側側副靭帯の位置で垂直に切り、外科用顕微鏡を用いた顕微鏡下手術にて、内側半月板の前方を切除した。非吸収性縫合糸にて、皮膚を重ねて閉じた。なお、右膝は、偽手術に供した。また、マウスは、１２時間の明暗サイクル下、自由に行動、自由摂食及び飲水にて、飼育した。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの雄マウス２０匹（８週齢、体重：約２５ｇ）を本研究に用いた（各グループ５匹ずつ。ＯＲＩＥＮＴＡＬ ＹＥＡＳＴ Ｃｏ．Ｌｔｄ．Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）。イソフルラン吸入により麻酔にかけ、左の前膝部を真っ直ぐ切開し、関節包の前中央側を切った。次いで、膝蓋腱を横方向に脱臼させ、内側半月板前角を露出させた（Ｈｉｙａｍａ Ｋ.ら、Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ．、２０１７年、３５（９）、１９５８～１９６５ページ 参照）。半月板前角を切り、鉗子を用いて前方に脱臼させた。内側半月板を、内側側副靭帯の位置で垂直に切り、外科用顕微鏡を用いた顕微鏡下手術にて、内側半月板の前方を切除した。非吸収性縫合糸にて、皮膚を重ねて閉じた。なお、右膝は、偽手術に供した。また、マウスは、１２時間の明暗サイクル下、自由に行動、自由摂食及び飲水にて、飼育した。
【0078】
組換えヒトＡｃｔｉｖｉｎ Ａ（４２ｎｇ／６μＬ ｉｎ ＰＢＳ）及び／又はｒｈＰＤＧＦ－ＡＡ （１７４ｎｇ／６μＬ ｉｎ ＰＢＳ）は、術後７日目に関節内に注入した（Ｈｏｓｈｉｎｏ Ｔ．ら、ＢＭＣ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔ Ｄｉｓｏｒｄ．、２０１８年、１９（１）：２９１ 参照）。マウスは、術後１０日目又は２１日目に二酸化炭素により安楽死させ、左膝を解剖した。
【0079】
（組織学及び免疫組織学）
組織サンプルを、４％パラホルムアルデヒドにて３～４日間固定し、２０％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液にて２１日間脱灰処理に供した。次いで、パラフィンワックスに包埋した。そして、検体を矢状面にて５μｍの厚さに切り、半月板再生を組織学的に評価するため、サフラニンＯ／ファストグリーン、又はヘマトキシリン／エオジン（Ｈ＆Ｅ）にて染色した。組織学的切片は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５３顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にて観察した。
組織サンプルを、４％パラホルムアルデヒドにて３～４日間固定し、２０％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液にて２１日間脱灰処理に供した。次いで、パラフィンワックスに包埋した。そして、検体を矢状面にて５μｍの厚さに切り、半月板再生を組織学的に評価するため、サフラニンＯ／ファストグリーン、又はヘマトキシリン／エオジン（Ｈ＆Ｅ）にて染色した。組織学的切片は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５３顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にて観察した。
【0080】
半月板再生を組織学的に定量化するため、修正されたＰａｕｌｉ’ｓ スコアシステムを用いた（Ｈｉｙａｍａ Ｋ.ら、Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ．２０１７年、３５（９）、１９５８～１９６５ページ 参照）。組織学的評価は、２人の研究者による盲検によって行なった。
【0081】
I型及びII型コラーゲン免疫染色は、Ｔｓｕｊｉ Ｋ.ら、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、２０１７年、２６（６）、１０８９～１１０２ページに記載のとおり、行なった。すなわち、切片を、キシレン（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）による脱パラフィン処理に供し、アルコールにて段階的に再水和処理し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて飽和させた。II型コラーゲン染色のため、サンプルを０．４ｍｇ／ｍｌプロテナーゼＫ（Ｄａｋｏ，Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）含有５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）にて１０分間、前処理した。I型コラーゲン染色においては、プロテナーゼＫによる消化処理は行なわなかった。
【0082】
次に、０．３％過酸化水素含有メタノールにて３０分間処理し、内在性ペルオキシダーゼの活性を抑制した。一次抗体として、抗I型コラーゲン抗体（１：２００希釈；Ａｂｃａｍ ｃａｔ．＃ａｂ３４７１２，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）又は抗II型コラーゲン抗体（１：１０００希釈；Ａｂｃａｍ ｃａｔ．＃ａｂ３４７１２，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を、切片に添加し、４℃にて一晩インキュベートした。次いで、切片を、０．１％ ＰＢＳ－ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ，ＵＳＡ）にてリンスし、１：２００に希釈した二次抗体［ビオチン化ヤギ由来抗ウサギイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ］にインキュベートした。そして、切片をリンスした後、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にてシグナルを可視化し、ジアミノベンジジン染色（ＤＡＢ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を施した。また、ヘマトキシリン（Ｍｕｔｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）による切片の対比染色を行なった。
【0083】
（ＭＩＡ誘導関節炎ラットモデル）
１０週齢、体重３３０～３４５ｇのＷｉｓｔａｒラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｊａｐａｎ）を本研究に用いた。ラットは、２群（モノヨード酢酸（ＭＩＡ）注入後アクチビンＡを注入するものと、ＭＩＡ注入後ベヒクルを注入するもの（コントロール））に分け、以下の実験に供した。
１０週齢、体重３３０～３４５ｇのＷｉｓｔａｒラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｊａｐａｎ）を本研究に用いた。ラットは、２群（モノヨード酢酸（ＭＩＡ）注入後アクチビンＡを注入するものと、ＭＩＡ注入後ベヒクルを注入するもの（コントロール））に分け、以下の実験に供した。
【0084】
先ず、イソフラン吸入によりラットを麻酔し、Ｈｏｓｈｉｎｏ Ｔ.ら、ＢＭＣ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔ Ｄｉｓｏｒｄ．、２０１８年、１９（１）：２９１に記載のとおり、左膝関節内に、１．０ｍｇＭＩＡ含有生理食塩水３０μＬを注入した。そして、ＭＩＡ注入後１４日目に、組換えヒトＡｃｔｉｖｉｎ Ａ（４００ｎｇ／３０μＬ ｉｎ ＰＢＳ）又はベヒクルとしてＰＢＳのみ３０μＬを注入した。そして、左肢（ＭＩＡ注入側）及び右肢（ＭＩＡ非注入側）間における、痛み回避行動（荷重の非対称性）を、０日目（注入前）、注入後１，３，７，１４，１７，１９，２１、２４及び２８日目に評価した。
【0085】
荷重の非対称性は、両足圧力差痛覚測定装置（Ｌｉｎｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ， Ｎｏｒｆｏｌｋ，ＵＫ）を用い、その角柱プレキシガラスケース内にラットを入れ、左及び右の後肢を独立したフォースプレートに載せ、検出した。各積載量を１００回測定し、左膝（ＭＩＡ投与側）後肢にかかる重量の割合（％）の変化は、下記式に基づき算出した（Ｈｏｓｈｉｎｏ Ｔ.ら、ＢＭＣ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔ Ｄｉｓｏｒｄ．２０１８年、１９（１）：２９１、Ｉｎｏｍａｔａ Ｋ.ら、ＢＭＣ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔ Ｄｉｓｏｒｄ．２０１９年、２０（１）：８、Ｏｎｕｍａ Ｈら、Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ．２０２０年、Ｊａｎ ５．ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｏｒ．２４５８０ 参照）。
左膝後肢における荷重の割合（％）＝左膝後肢における荷重／（左膝後肢における荷重＋右膝後肢における荷重）×１００ そして、投与前における荷重割合の差からの変化を経時的に評価した。
左膝後肢における荷重の割合（％）＝左膝後肢における荷重／（左膝後肢における荷重＋右膝後肢における荷重）×１００ そして、投与前における荷重割合の差からの変化を経時的に評価した。
【0086】
（統計解析）
全ての統計解析はＳＰＳＳソフトウェアを用い行なった。統計解析には、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ’ｓ Ｕ－検定及びＳｔｕｄｅｎｔ Ｔ検定を用いた。Ｐ値が０．０５未満の場合、有意差があると判定した。
全ての統計解析はＳＰＳＳソフトウェアを用い行なった。統計解析には、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ’ｓ Ｕ－検定及びＳｔｕｄｅｎｔ Ｔ検定を用いた。Ｐ値が０．０５未満の場合、有意差があると判定した。
【0087】
（実施例１） ＭＳＣの増殖促進活性を有する物質の同定
図１Ａ及びＢに示すとおり、前十字靭帯再建術（ＡＣＬ－Ｒ）持に採取された関節液を１４％の割合でＭＳＣの培養系に添加し、細胞増殖活性の計測を行った。その結果、図２Ａに示すとおり、非常に大きな個人差があるものの、関節液中にＭＳＣの細胞増殖を活性化する生理活性物質が存在することが明らかになった。また、ＡＣＬ－Ｒ直前の患者から採取した関節液における増殖促進活性は僅かであった。そのため、これらの物質は、侵襲（ＡＣＬ－Ｒ）後の関節液において特に増加しているように見受けられる（例えば、ＡＣＬ－Ｒ後３～４日、急性炎症期）。
図１Ａ及びＢに示すとおり、前十字靭帯再建術（ＡＣＬ－Ｒ）持に採取された関節液を１４％の割合でＭＳＣの培養系に添加し、細胞増殖活性の計測を行った。その結果、図２Ａに示すとおり、非常に大きな個人差があるものの、関節液中にＭＳＣの細胞増殖を活性化する生理活性物質が存在することが明らかになった。また、ＡＣＬ－Ｒ直前の患者から採取した関節液における増殖促進活性は僅かであった。そのため、これらの物質は、侵襲（ＡＣＬ－Ｒ）後の関節液において特に増加しているように見受けられる（例えば、ＡＣＬ－Ｒ後３～４日、急性炎症期）。
【0088】
図２Ａの結果を踏まえて、関節液中に存在し、ＭＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖活性化を支持する生理活性物質の解析を行なった。その結果、関節液を非動化（５６℃、３０分間の加熱による不活性化）することにより細胞増殖促進作用は有意に減少したことから、目的とする分子は、熱感受性であること、補体であることが示唆された（図２Ｂ 参照）。しかしながら、図２Ｃに示すとおり、関節液中の、補体タンパク質（Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、Ｃ５ａ）の濃度と細胞増殖活性との間に正の相関は観察されなかったこと。そのため、これら分子は目的とするものではないと結論づけた。
【0089】
また、血清中に存在し、滑膜ＭＳＣの増殖因子として既に同定されているＰＤＧＦＡＡ，ＰＤＧＦＢＢについても解析した。その結果、図２Ｄに示すとおり、関節液中のＰＤＧＦ量は、関節液のＭＳＣ増殖活性と正の相関を示したことから、これら分子は、求める生理活性物質の候補となり得ることが示された。
【0090】
さらに、関節侵襲により濃度が上昇すると考えられる種々のサイト力イン、ケモカインとの相関解析を行った。その結果、図３Ａに示すとおり、ＩＬ１β、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ８、ＭＩＧ、ＩＰ－１０が関節侵襲により発現量が増大することが明らかとなった。さらに、図３Ｂに示すとおり、検討を行なった分子の中で、ＩＬ１β、ＩＬ６、ＩＬ８の関節液中の濃度とＭＳＣ増殖賦活化能との間に有意な正の相関を認められた。しかしながら、ＩＬ６、ＩＬ８及びＩＬ１０のリコンビナントタンパク質を各々通常増殖培地に添加し、ＭＳＣを培養した結果、図３Ｃに示すとおり、用いたサイトカイン、ケモカインのリコンビナントタンパク質を、ＥＤ５０の１００倍量になるよう培地に加えても、ＭＳＣの増殖賦活化は観察されなかった。すなわち、ＩＬ１β，ＩＬ６，ＩＬ１０，ＩＬ１２，ＴＮＦａ，ＣＸＣＬ８，ＣＸＣＬ９，ＣＸＣＬ１０，ＣＬ２，ＣＣＬ５の中に目的とするものは存在しなかった。
【0091】
そこで、関節液の増殖活性を指標に２群に分け、同時に１７４種類のタンパクを定量解析できる抗体アレイ（Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｒｒａｙ）を用いて存在量の異なるタンパク質を解析した。
【0092】
その結果、Ｕ検定により２群間で有意な差を持って発現量に差があると判断されたものは、図４Ａ～Ｂに示すとおり、１３種類存在した。その中で最も興味深いと考えられた１分子（アクチビンＡ）に関して、以下のとおり更なる解析を行なった。
【0093】
＜アクチビンによるＭＳＣの増殖促進等についての評価＞
図５Ａに示すとおり、アクチビンＡは、侵襲後の関節液中で濃度の有意な上昇が観察された。また図５Ｂに示すとおり、関節液中の濃度とその関節液の細胞増殖活性作用との間に有意な正の相関が認められたことから、アクチビンはＭＳＣの増殖因子として機能することが示唆された。
図５Ａに示すとおり、アクチビンＡは、侵襲後の関節液中で濃度の有意な上昇が観察された。また図５Ｂに示すとおり、関節液中の濃度とその関節液の細胞増殖活性作用との間に有意な正の相関が認められたことから、アクチビンはＭＳＣの増殖因子として機能することが示唆された。
【0094】
次に、より詳細に、アクチビンの生理活性の解析を行うため、ＭＳＣの通常増殖培地に、アクチビンＡのリコンビナントタンパク質（ｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡ）を添加したところ、図５Ｃ及びＤに示すとおり、血清濃度に依存せず、有意にＭＳＣの増殖が活性化されることが明らかとなった。このことから、アクチビンによる増殖の活性化に補因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）の存在は必須でないことが示唆される。
【0095】
さらに、アクチビンＡによるＭＳＣの増殖活性化の分子機構を明らかにすることを試みた。ＭＳＣの増殖にはＥＲＫ及びＰＩ３Ｋのシグナル伝達経路が活性化されるという報告がある（Ｕｏｍｉｚｕ，Ｍ．ら、Ｊ Ｍｅｄ Ｄｅｎｔ Ｓｃｉ．、２０１８年、６５巻、７３～８２ページ 参照のほど）。そこで、ＰＩ３Ｋ－ＰＫＢ／Ａｋｔ及びＥｒｋ１／Ｅｒｋ２、これら各シグナル伝達経路に対する特異的阻害剤存在下、滑膜ＭＳＣにアクチビンＡ（ｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡ）を作用させ、細胞数をＭＴＴアッセイにより計測した。
【0096】
その結果、図５Ｅに示すとおり、ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ経路の阻害剤である、ＬＹ２９４００２、Ａｋｔ１／２又はＫＵ００６３７９４を添加した場合には、アクチビンＡによる増殖促進活性が完全に解消されることが明らかになった。一方、Ｅｒｋ１／Ｅｒｋ２阻害剤 ＰＤ９８０５９を添加した場合には、アクチビンＡ非添加時よりも更に細胞数が低減することも明らかになった。これらの結果から、アクチビンＡの増殖促進活性には、ＰＩ３Ｋ－ＰＫＢ／Ａｋｔ及びＥｒｋ１／２の活性化が必要であることが示唆された。
【0097】
さらに、２４時間、血清飢餓状態においたＭＳＣに対し、早期の細胞内タンパクのリン酸化の解析を行ったところ、図５Ｆに示すとおり、アクチビンＡ処理後の３０分間において、Ａｋｔ及びＥｒｋ１／２のリン酸化は検出されなかった。しかしながら、ＰＤＧＦによるＡｋｔのリン酸化をアクチビンＡは増強することが明らかとなった。これに対して、細胞内Ｅｒｋのリン酸化の増強は観察されなかった。
【0098】
以上のことから、アクチビンは、Ｐｌ３Ｋ－Ａｋｔ／ＰＫＢのシグナル伝達経路に対して相加的に作用して、細胞増殖の活性化を誘導することが示唆された。
【0099】
（実施例２） アクチビンによるＭＳＣの未分化性への影響についての解析
ＭＳＣの幹細胞性へのアクチビンの影響を評価するため、ｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡの存在下、２週間培養を行い、ＭＳＣ表面抗原の発現量の変化を、フローサイトメトリー解析により調べた。
ＭＳＣの幹細胞性へのアクチビンの影響を評価するため、ｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡの存在下、２週間培養を行い、ＭＳＣ表面抗原の発現量の変化を、フローサイトメトリー解析により調べた。
【0100】
その結果、図６Ａに示すとおり、アクチビンＡによる幹細胞抗原の発現量の変化は観察されなかった。このことから、アクチビンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系においてＭＳＣの表現型に変化を与えることなく増殖の賦活化を行うことが示唆された。
【0101】
また、アクチビンＡ存在下２週間培養を行った後、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける軟骨、骨、指筋細胞方向への分化誘導を行ったところ、図６Ｂに示すとおり、コントロール（アクチビンＡを加えずに培養した細胞）に比べて、有意な変化は観察されなかった。このように、軟骨、骨、脂肪細胞方向への分化誘導に変化は観察されなかったことから、前述の図６Ａに示した結果と併せて、アクチビンはＭＳＣの幹細胞性を損なうことなく、増殖を活性化することが示唆された。
【0102】
さらに、軟骨分化培地にアクチビンＡ等を添加したところ、図６Ｃに示すとおり、ＰＤＧＦの添加により、共に軟骨の凝集塊の形成を促進する（湿重量を増大させる）効果は観察されたが、アクチビンによる有意な軟骨基質の産生促進効果は観察されなかった。
【0103】
以上の解析結果から、アクチビンは、ＭＳＣの幹細胞性を損なうことなくｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞増殖促進効果を有する分子であることが明らかになった。
【0104】
（実施例３） 内側半月板前方１／２切除モデル
次に、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるアクチビンの生理作用を検討するため、組織再生実験を行なった。アクチビンＡが、ＭＳＣの増殖を促進するという上記ｉｎ ｖｉｔｒｏの結果を踏まえて、先ず、組織の欠損後の再生モデル（内側半月板前方１／２切除モデル）に対するアクチビンＡ（ｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡ）の投与効果の検討を行なった。
次に、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるアクチビンの生理作用を検討するため、組織再生実験を行なった。アクチビンＡが、ＭＳＣの増殖を促進するという上記ｉｎ ｖｉｔｒｏの結果を踏まえて、先ず、組織の欠損後の再生モデル（内側半月板前方１／２切除モデル）に対するアクチビンＡ（ｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡ）の投与効果の検討を行なった。
【0105】
その結果、図７Ａに示すとおり、切除後１０日後（アクチビンＡ投与後３日目〉において、アクチビンＡ投与群においては、均一な肉芽の形成、すなわち、より均一な再生半月板組織が誘導されていることが判明した。また、特記すべきこととして、コントロールやＰＤＧＦ投与群において観察された再生領域における血管侵入が、アクチビンＡ投与群においてほぼ完全に抑制できていた。また、軟骨基質であるプロテオグリカンを染色するサフラニンＯの染色性もコントロールやＰＤＧＦ群に比して亢進していた。
【0106】
また、図７Ｂに示すとおり、切除後２１日後（アクチビンＡ投与後１４日）において、アクチビンＡ投与群において、均一な軟骨様組織の再生が認められた。軟骨基質であるII型コラーゲンの均一な発現も観察された。硝子軟骨の形成に対して、血管侵入は抑制的に働くことが報告されている。そのため、アクチビンが、これまでにない硝子軟骨の誘導因子として機能することが示唆された。
【0107】
また、図７Ｃに示すとおり、切除後５６日後〈アクチビンＡ投与後４９日〉において、アクチビンＡ投与群においては、均一な軟骨様組織の中心に、マウスの正常半月板でも観察される骨髄様組織の形成が認められた。
【0108】
さらに、図７Ｄに示すとおり、切隙後８４日後〈アクチビンＡ投与後７７日〉において、アクチビンＡ投与群においては、正常半月板に非常に近い再生組織像を認められた。特記すべきこととして、マウスを含む齧歯類の半月板は、ヒトと異なり前節部分の深層に骨髄腔が形成されることが明らかとなっている（ヒトでは骨髄腔の形成は観察されず線維軟骨様の組織となる）。アクチビンＡ投与群においては、再生半月板の表層が全体に渡ってサフラニンＯで濃染されるプロテオグリカンに富んだ軟骨組織が観察され、深層部に骨髄腔の形成が観察されている。この組織像は、マウスの半月板前節の正常な組織像に酷似していることから、アクチビンは、マウスにおいて切除後の再生を有意に促進する物質であるとともに、長期にわたって変性を抑制できる分子であることが示唆された。また、アクチビン投与による再生組織において、骨誘導は認められなかった。このように、軟骨再生能を有しながら内軟骨骨化が懸念されているＦＧＦ１８とは異なり、アクチビンは、異所性の骨誘導が抑制され、副作用少なく、軟骨組織を再生できることが示唆される。
【0109】
また、各ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔにおける半月板の組織像を修正されたＰａｕｌｉ’ｓスコアを用いて半定量評価を行なった。その結果、図７Ｅに示すとおり、アクチビンＡ投与により、再生のプロセスが有意に促進されていることが明らかとなった。
【0110】
（実施例４） 関節軟骨全層欠損モデル
次に、関節軟骨の損傷に対する再生、退行変性抑制効果について検証すべく、関節軟骨全層欠損モデルを作製し、ｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡの投与効果の検討を行なった。具体的には、エアトームを用いて大腿骨顆間部に１．４ｍｍφの関節軟骨全層欠損を作製し、一週間後にアクチビンＡ（ｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡ）を、１８０ｎｇ関節内注射を行なった。
次に、関節軟骨の損傷に対する再生、退行変性抑制効果について検証すべく、関節軟骨全層欠損モデルを作製し、ｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡの投与効果の検討を行なった。具体的には、エアトームを用いて大腿骨顆間部に１．４ｍｍφの関節軟骨全層欠損を作製し、一週間後にアクチビンＡ（ｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡ）を、１８０ｎｇ関節内注射を行なった。
【0111】
その結果、図８に示すとおり、欠損後４週間（アクチビンＡ投与後３週間）において、関節軟骨欠損部への線維軟骨様組織の形成に関し、アクチビンＡ、ＰＤＧＦは共に、コントロール（ＰＢＳ）に比して促進することが観察されたが、形成された組織の軟骨分化に有意な促進作用は観察されなかった。しかしながら、特記すべきこととして、欠損作成部位周囲の関節軟骨の退行変性が、アクチビンＡ投与群において有意に抑制された（サフラニンＯ染色性の低下が観察されなかった）。この結果は、アクチビンが、軟骨組織の再生促進効果を有しているだけでなく、変形性膝関節症で観察される軟骨の退行変性に対して抑制効果を有することを示唆している。
【0112】
（実施例５） ＭＩＡ誘導関節炎モデル
アクチビンを関節症に対する新規治療薬として開発するためには、上述の軟骨変性に対する抑制だけでなく、関節症の最大の愁訴である疼痛に対する緩和効果を有していることが望ましい。
アクチビンを関節症に対する新規治療薬として開発するためには、上述の軟骨変性に対する抑制だけでなく、関節症の最大の愁訴である疼痛に対する緩和効果を有していることが望ましい。
【0113】
そこで、モノヨード酢酸（ＭＩＡ）の関節内注射による関節炎モデルを作製し、当該関節炎に伴う膝疼痛に対するアクチビンＡの緩和効果について、検討を行なった。具体的には、図９Ａに示すとおり、ＭＩＡ投与後１４日目（炎症消退期）にアクチビンＡ（ｒｈＡｃｔｉｖｉｎＡ）の関節内投与を行い、投与前、投与後１日目から経時的にラット後肢の荷重量の左右差を測定した（Ｉｎｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ ｔｅｓｔ）。
【0114】
その結果、図９Ｂに示すとおり、ＭＩＡの関節内注射（左膝）により、荷重量は、速やかに減少するが、１４日目にアクチビンＡを投与したところ、コントロール群に比して有意な荷重量の改善が観察された。このことから、アクチビンＡの関節内投与は、疼痛緩和に対して有効であることが明らかになった。
【0115】
（実施例６） 関節内アクチビン濃度による予後予測
上述のとおり、関節侵襲後のアクチビンの関節内濃度が高い患者ほど予後が良くなる可能性が高いことが示唆される。そこで、前十字靭帯再建術患者の関節液を使用して、関節内アクチビンＡ濃度と予後の相関解析をおこなった。
上述のとおり、関節侵襲後のアクチビンの関節内濃度が高い患者ほど予後が良くなる可能性が高いことが示唆される。そこで、前十字靭帯再建術患者の関節液を使用して、関節内アクチビンＡ濃度と予後の相関解析をおこなった。
【0116】
その結果、術後３～４日目に穿刺された関節液中のアクチビンＡ濃度が高い患者ほど、術後２ヶ月における患者立脚型の膝の快復度（ＩＫＤＣ）の指標が高いことが明らかになった。このように、関節侵襲後早期の関節液中のアクチビン濃度が、その後の患者立脚型の膝機能回復度指数を上昇させることから、関節液中のアクチビン濃度を指標とした関節病変の予後予測法として、臨床検査分野における新たな診断ツールの提供が可能となる。
【産業上の利用可能性】
【0117】
以上説明したように、本発明によれば、分化多能性に影響を与えることなく、ＭＳＣの増殖を促進すること、半月板又は軟骨組織の再生を促進することが可能となる。また、本発明によれば、軟骨の退行変性及び疼痛の抑制も含め、半月板損傷又は軟骨障害を治療及び予防することが可能となる。さらに、軟骨障害の予後を予測することも、本発明によれば可能となる。したがって、本発明は、半月板損傷、半月板欠損、関節軟骨の欠損、関節軟骨の退行変性、変形性関節症等の軟骨障害に関する医薬品分野等において、極めて有用である。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10】
