特許 7565356 ヒドロゲル中のヒアルロン酸ナトリウム含有量を決定する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-10-02

(45)【発行日】2024-10-10

(54)【発明の名称】ヒドロゲル中のヒアルロン酸ナトリウム含有量を決定する方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/15 20060101AFI20241003BHJP

   G01N 21/27 20060101ALI20241003BHJP

【ＦＩ】

G01N33/15 Z

G01N21/27 Z

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2022532594

(86)(22)【出願日】2020-11-30

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-03

(86)【国際出願番号】 EP2020083926

(87)【国際公開番号】W WO2021110593

(87)【国際公開日】2021-06-10

【審査請求日】2023-11-20

(31)【優先権主張番号】102019000022626

(32)【優先日】2019-12-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT

(73)【特許権者】

【識別番号】522215045

【氏名又は名称】ウビ － ケア エッセ．エッレ．エッレ．

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】モッキ、ロベルト

【審査官】北条 弥作子

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１０８８０１９５２（ＣＮ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１１／０７０９４８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２００５－５０８８５４（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／１５

Ｇ０１Ｎ ２１／００～２１／１０

Ｇ０１Ｎ ２１／１７～２１／６１

Ｇ０１Ｎ ３１／００～３１／２２

Ｇ０１Ｎ １／００～ １／４４

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒドロゲルのヒアルロン酸含有量を決定する方法であって、前記方法は、以下の工程：
ａ．試薬Ａとして、硫酸中の四ホウ酸ナトリウムの溶液を調製する工程と、
ｂ．エタノール中にカルバゾールを溶解することで、試薬Ｂを調製する工程と、
ｃ．水性溶液中に前記ヒドロゲルを溶解することで、試験溶液を調製する工程と、
ｄ．前記試験溶液を超音波によって巨視的に均一な溶液を得るのに充分な期間処理する工程と、
ｅ．水性溶液中にグルクロン酸又はグルクロン酸含有物質を溶解することで、基準ストック溶液を調製する工程と、
ｆ．水性溶液中の基準ストック溶液の希釈液によって、０．０００５ｗ／ｖ％～０．０１００ｗ／ｖ％に包含される濃度で、少なくとも３つの基準溶液を調製する工程と、
ｇ．試薬Ａと、試薬Ｂと、基準溶液、試験溶液、水性溶液（ブランク）、及び場合により干渉用の溶液（架橋剤試料又は添加剤試料）のうちの１つとを混合することによって、試験管を調製し、各試験管を水浴上に少なくとも５分間置き、次いでそれらを室温まで冷却する工程と、
ｈ．前記ブランク及び場合により干渉用の前記試料に対して、５００～５８０ｎｍに包含される波長における工程ｇで調製された試験管の各々の吸光度を読み取る工程と、
を含む、方法。

【請求項2】

工程ｃの後に、以下の工程：
ｃ２．前記試験溶液を、室温より高い温度まで、少なくとも１５分間、加熱する工程
を更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

工程ｇにおいて、前記水浴が熱浴である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

工程ｄにおいて、超音波処理が、０．５Ｗ／ｋｇ～５０Ｗ／ｋｇの比出力で行われる、請求項１～３に記載の方法。

【請求項5】

超音波処理が、５００Ｊ／ｋｇ～３０ｋＪ／ｋｇに包含される比エネルギーで行われる、請求項１～４に記載の方法。

【請求項6】

試薬Ａが、硫酸中の０．９５ｗ／ｖ％の四ホウ酸二ナトリウムの溶液であり、試薬Ｂが、エタノール中の０．１２５ｗ／ｖ％のカルバゾールの溶液である、請求項１～５に記載の方法。

【請求項7】

工程ｃにおいて、前記試験溶液が、少なくとも二重に調製される、請求項１～６に記載の方法。

【請求項8】

工程ｇが、以下：
５部の試薬Ａを各試験管へ添加し、前記試験管内の前記試薬Ａの上へ、各試料（ブランク：水性溶液を１部、基準溶液：基準ストック溶液の各希釈液を１部、および、試料：各試験溶液を１部から選択されるもの）を積層し、前記管を振盪して、前記試料によって作成された二重相を溶解し、各試料を水浴中に少なくとも５分間置き、次いでそれらを室温まで冷却し、各管へ０．２部の試薬Ｂを添加し、前記管を振盪して前記二重相を溶解し、各管を温水浴中に少なくとも５分間置くこと、
の通りに実行される、請求項１～７に記載の方法。

【請求項9】

工程ｈの後に、ヒアルロン酸ナトリウムの含有率が、実験吸光度値を基準標準曲線で内挿することによって計算される、請求項１～８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒドロゲル中のヒアルロン酸ナトリウムの含有量を測定する方法を対象とする。本発明は、特に、充填剤として使用され、かつヒアルロン酸及び架橋ヒアルロン酸を含有する、ヒドロゲルを対象とする。

【背景技術】

【0002】

ヒアルロン酸はヒアルロナン又はヒアルロン酸塩（ＨＡ）とも呼ばれ、その様々な生理学的機能によって、重要なグリコサミノグリカンであると考えられている。このポリマーは、β１→３及びβ１→４グリコシド結合によって連結された、グルクロン酸（ＵＤＰ－ＧｌｃＵＡ）及びＮ－アセチルグルコサミン（ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ）の二糖の反復から構成される（Ｐｕｒｃｅｌｌ ＢＰ、Ｋｉｍ ＩＬ、Ｃｈｕｏ Ｖ、Ｇｕｉｎｅｎ Ｔ、Ｄｏｒｓｅｙ ＳＭ、Ｂｕｒｄｉｃｋ ＪＡ．（「Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｌｆａｔｅｄ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｍａｃｒｏｍｅｒｓ ｉｎｔｏ ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｏｒ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．」、Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ｓｃｉ．、２００９年；第２７巻：第４１７～２８１頁、Ｖｏｌｐｉ Ｎ、Ｓｃｈｉｌｌｅｒ Ｊ、Ｓｔｅｒｎ Ｒ、Ｓｏｌｔｅｓ Ｌ．Ｒｏｌｅ、「ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ．」Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．、２００９年；第１６巻：第１７１８～４５２頁）。

【0003】

他のグリコサミノグルカンとは対照的に、ＨＡとは唯一の非硫酸化ポリマーであって、これにより分子を剛直かつ真っ直ぐにすることができる。これは、全ての哺乳動物細胞、両生類及び細菌の原形質膜において（Ｃｈｅｎ ＷＹＪ、「Ａｂａｔａｎｇｅｌｏ Ｇ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ｉｎ ｗｏｕｎｄ ｒｅｐａｉｒ．」、Ｗｏｕｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｒｅｇｅｎ．、１９９９年；第７巻：第７９～８９３頁）、その産生生物に応じたいくつかのアイソフォームを有するヒアルロン酸合成酵素（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅｓ：ＨＡＳ）と呼ばれる膜内在性酵素によって産生される。ヒトにおいては、ＨＡは全ての器官に存在し、特に結合組織に豊富に存在する（Ｆｒａｓｅｒ ＪＲ、Ｌａｕｒｅｎｔ ＴＣ．、「Ｔｕｒｎｏｖｅｒ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ．」、Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ Ｓｙｍｐ．、１９８９年；第１４３巻（第４１～４９号）：第２８１～５頁）。ＨＡは硝子体液中の軟骨組織（Ｂｒｅｗｔｏｎ ＲＧ、Ｍａｙｎｅ Ｒ．、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｖｉｔｒｅｏｕｓ ｈｕｍｏｒ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｏｆ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ（Ｇ１）ｏｆ ａｇｇｒｅｃａｎ ａｎｄ ｌｉｎｋ ｐｒｏｔｅｉｎ．」、Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、１９９２年；第１９８巻：第２３７～４９頁）、関節の滑液（Ｅｎｇｓｔｒｏｍ－Ｌａｕｒｅｎｔ Ａ．、「Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ｉｎ ｊｏｉｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ．」、Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．、１９９７年；第２４２巻：第５７～６０６頁）、及び臍帯（Ｙａｎａｇｉｓｈｉｔａ Ｍ．、「Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ ａｎｄ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ｉｎ ｆｅｍａｌｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｏｒｇａｎｓ．」、ＥＸＳ．、１９９４年；第７０巻：第１７９～９０頁）において高濃度に達し、組織のホメオスタシスの維持に関与する（Ｆｒａｓｅｒ ＪＲ、Ｌａｕｒｅｎｔ ＴＣ、Ｌａｕｒｅｎｔ ＵＢ．、「Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ：ｉｔｓ ｎａｔｕｒｅ，ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｕｒｎｏｖｅｒ．」、Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．、１９９７年；第２４２巻：第２７～３３頁）。

【0004】

加齢に伴い、ＨＡ産生が減少することで、結果として皮膚の脱水及び弾力性の喪失が生じ、しわのある外観に寄与することが報告されている（Ｇｏｌｄ Ｍ．、「Ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ａｒｔ ｏｆ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｌｌｅｒ ｕｓｅ ｉｎ ｅｓｔｈｅｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．」Ｊ Ｃｏｓｍｅｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、２００９年；第８巻：第３０１～７頁）。ＨＡはいくつかの化学的特性を特徴とし、異なる用途（高い吸湿性、その粘弾性の性質、高い生体適合性、非免疫原性、及び分解された場合の毒性産物の欠如）に対して魅力的である。ＨＡの使用は、以下において結果を出している：眼科用化粧品において（Ｄｅ Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ ＥＳ、ｄｅ Ｍａｃｅｄｏ ＡＣ、ｄｅ Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ ＰＦＲ、ｄｅ Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ ＲＳ．、「Ｕｓｅ ｏｆ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．」、Ａｒｑ Ｂｒａｓ Ｏｆｔａｌｍｏｌ．、２０１０年；第７３巻：第９２～５頁）、外科手術において（Ｋｏｇａｎ Ｇ、Ｓｏｌｔｅｓ Ｌ、Ｓｔｅｒｎ Ｒ、Ｇｅｍｅｉｎｅｒ Ｐ．、「Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ａ ｎａｔｕｒａｌ ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ ｗｉｔｈ ａ ｂｒｏａｄ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ．、２００７年；第２９巻：第１７～２５頁）、薬物送達システムとして（Ｂｒｏｗｎ ＭＢ、Ｊｏｎｅｓ ＳＡ．、「Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ａ ｕｎｉｑｕｅ ｔｏｐｉｃａｌ ｖｅｈｉｃｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｄｒｕｇｓ ｔｏ ｔｈｅ ｓｋｉｎ．」、Ｊ Ｅｕｒ Ａｃａｄ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．、２００５年；第１９巻：第３０８～１８頁）、リウマチ学において（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ＤＤ、Ｓｔｏｋｅｒ Ａ、Ｋａｎｅ Ｓ、Ｃｏｃｋｒｅｌｌ Ｍ、Ｃｏｏｋ ＪＬ．、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｉｎ ａ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ．」、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ．、２００６年；第１４巻：第８１４～２２頁）、耳鼻咽喉科において（Ｒａｍｏｓ ＨＶＬ、Ｎｅｖｅｓ ＬＲ、Ｍａｒｔｉｎｓ ＪＲＭ、Ｎａｄｅｒ ＨＢ、Ｐｏｎｔｅｓ Ｐ．、「Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ａｇｉｎｇ ｏｎ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｖｏｃａｌ ｆｏｌｄｓ ｏｆ ｆｅｍａｌｅ ｒａｔｓ．」、２０１２年；第７８巻：第１４～８頁）、及び泌尿器科において（Ｓｃｈｉｒａｌｄｉ Ｃ．、Ｇａｔｔａ Ａ Ｌａ．、Ｒｏｓａ Ｍ Ｄｅ、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ｉｎ ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ」；２０１０年、第３８７～４１２頁）。しかしながら、前述の全ての用途のうち、皮膚充填剤における皮膚科学の分野では、ＨＡの使用はより頻繁である。そして、組織工学において、ＨＡは、アレルギー反応又は免疫応答を引き起こすことなく生物に移植することができる組織のための、機械的及び物理的に適切な支持体として使用される（Ｎｅｓｔｉ ＬＪ、Ｌｉ Ｗ－Ｊ、Ｓｈａｎｔｉ ＲＭ、Ｊｉａｎｇ ＹＪ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｗ、Ｆｒｅｅｄｍａｎ ＢＡ、Ｋｕｋｌｏ ＴＲ、Ｇｉｕｌｉａｎｉ ＪＲ、Ｔｕａｎ ＲＳ．、「Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ－ｎａｎｏｆｉｂｒｏｕｓ ｓｃａｆｆｏｌｄ（ＨＡＮＦＳ）ａｍａｌｇａｍ．」、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ａ．、２００８年；第１４巻：第１５２７～３７頁）。

【0005】

皮膚充填剤は、以前は手術でしか達成できなかった若返りと審美的改善を低コストかつ限られた回復時間なしに実現できるため、近年急速に人気が高まっている。米国美容外科学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ａｅｓｔｈｅｔｉｃ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ：ＡＳＡＰＳ）からのデータによれば、１６０万を超える皮膚充填剤処置が２０１１年に行われ、これらは神経調節物質に続き、米国で行われた２番目に人気のある非外科的美容手技となった。後者の手技は、皮膚充填剤注射と共同して行われることが多い（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ａｅｓｔｈｅｔｉｃ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ．、Ｃｏｓｍｅｔｉｃ ｓｕｒｇｅｒｙ ｎａｔｉｏｎａｌ ｄａｔａ ｂａｎｋ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ２０１２．、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｕｒｇｅｒｙ．ｏｒｇ／ｓｉｔｅｓ／ ｄｅｆａｕｌｔ／ｆｉｌｅｓ／ＡＳＡＰＳ－２０１１－Ｓｔａｔｓ．ｐｄｆ．より利用可能、２０１３年９月１３日に接続）。皮膚充填剤への公衆の認識及び受け入れが高まるにつれて、市場の規模も大きくなる。皮膚充填剤の主な適応症は、皺及び襞の充満、並びに疾患又は年齢に起因する軟組織損失の矯正である（Ｒｚａｎｙ Ｂ、Ｈｉｌｔｏｎ Ｓ、Ｐｒａｇｅｒ Ｗら、「Ｅｘｐｅｒｔ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｏｎ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｐｏｒ－ｃｉｎｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｉｎ ａｅｓｔｈｅｔｉｃ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．」、Ｊ Ｄｔｓｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｇｅｓ．、２０１０年；第８巻（第３号）：第２１０～２１７頁）。充填剤は、頬及び顎の増大、下瞼のくぼみ（ｔｅａｒ ｔｒｏｕｇｈ）矯正、鼻の再形成、顔面中央部のボリューム増大、口唇増大、手の若返り、及び顔面非対称の矯正を含む、ボリューム置換及び増強手技（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ＤＪ．、「Ｌｅｇａｌ ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｏｆｆ－ｌａｂｅｌ ｆｉｌｌｅｒ ｕｓｅ．」、Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｔｈｅｒ．、２００６年；第１９巻（第３号）：第１８９～１９３頁）に対して、ますます使用されている。

【0006】

中程度の持続時間である生分解性充填剤、例えば非架橋コラーゲン及びヒアルロン酸（ＨＡ）充填剤は、極めて迅速に身体へと再吸収されるため、これらの効果は比較的短命である。ＨＡ誘導体は、欧州及び米国の両方で最も広く使用されている生分解性充填剤であり（Ｚｉｅｌｋｅ Ｈ、Ｗｏｌｂｅｒ Ｌ．、Ｗｉｅｓｔ Ｌ、「Ｒｚａｎｙ Ｂ．Ｒｉｓｋ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ｆｉｌｌｅｒｓ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｆｉｌｌｅｒ Ｓａｆｅｔｙ Ｓｔｕｄｙ（ＩＦＳ Ｓｔｕｄｙ）．」、Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｓｕｒｇ．、２００８年；第３４巻（第３号）：第３２６～３３５頁）、概して、架橋の源及び程度、並びに各生成物の濃度及び粒径に応じて、６～１８ヶ月持続する効果を有する。ＨＡは、Ｎ－アセチルグルコサミン及びグルクロン酸の直鎖ポリマー二量体であり、それらの二量体を架橋するために使用される独自の方法、それらの鎖架橋の程度及び方法、それらの粒子の均一性及びサイズ、並びにそれらの濃度が異なる（Ｆｕｎｔ Ｄ、Ｐａｖｉｃｉｃ Ｔ．、「Ｄｅｒｍａｌ ｆｉｌｌｅｒｓ ｉｎ ａｅｓｔｈｅｔｉｃｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔｓ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．」、Ｃｌｉｎ Ｃｏｓｍｅｔ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、２０１３年：第６巻第２９５～３１６頁）。

【0007】

機械的特性を改善し、かつインビボでＨＡの持続時間を延長するために、架橋手順が広く行われている。一般的な方法は、異なる架橋剤を用いてＨＡポリマー鎖を三次元ネットワークへと共有結合的に架橋することによってヒドロゲルを形成することであり（Ａｇｅｒｕｐ，Ｂ．、Ｂｅｒｇ，Ｐ．、及びＡｋｅｒｍａｒｋ，Ｃ．（２００５年）、「Ｎｏｎ－ａｎｉｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ａ ｎｅｗ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ．」、ＢｉｏＤｒｕｇｓ．（２００５年）、第１９巻（第１号）第２３～３０頁；Ｅｄｓｍａｎ，Ｋ．、Ｈｊｅｌｍ，Ｒ．、Ｌａｒｋｎｅｒ，Ｈ．、Ｎｏｒｄ，Ｌ．Ｉ．、Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ａ．、Ｗｉｅｂｅｎｓｊｏ，Ａ．ら、「Ｉｎｔｒａ－ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｄｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＤｕｒｏｌａｎｅＴＭ ａｆｔｅｒ ｓｉｎｇｌｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｒａｂｂｉｔ ｋｎｅｅ．」、Ｃａｒｔｉｌａｇｅ．（２０１１年）、第２巻（第４号）第３８４～３８８頁）、なかでも最も一般的な方法は、１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧＤＥ）であると考えられる。架橋によって形成されたＨＡヒドロゲルは、多くの医学的及び審美的用途にとって重要になっている。ヒドロゲルの機械的及び物理的特性は、修飾及び架橋の程度に依存する（Ｌａ Ｇａｔｔａ，Ａ．、Ｓｃｈｉｒａｌｄｉ，Ｃ．、Ｐａｐａ，Ａ．、及びＤｅ Ｒｏｓａ，Ｍ．（２０１１年）、「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｌｌｅｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ：ｐｈｙｓｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．」、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．（２０１１年）、第９６巻（第４号）第６３０～６３６頁；Ｓｔｏｃｋｓ，Ｄ．、Ｓｕｎｄａｒａｍ，Ｈ．、Ｍｉｃｈａｅｌｓ，Ｊ．、Ｄｕｒｒａｎｉ，Ｍ．Ｊ．、Ｗｏｒｔｚｍａｎ，Ｍ．Ｓ．、及びＮｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ｂ．（２０１１年）、「Ｒｈｅｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｌｌｅｒｓ．」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ、第１０巻（第９号）第９７４～９８０頁）。機械的特性と生体適合性とに対する修飾及び架橋の程度の関係の確立において、架橋パラメータを決定するための方法及び定義を有することは極めて重要である。

【0008】

皮膚充填剤はクラスＩＩＩ医療機器として分類される。したがって皮膚充填剤は、認証機関を反映する４桁の数字を含む適切なＣＥマーキングを、それらの滅菌包装上に表示しなければならない。更に、これらの製品はまた、付属するリーフレット又はデジタルリーフレットへのリンクも備えていなければならない。製品指令に加えて、米国に在住する医療従事者は、これらの製品の使用を、列挙されている食品医薬品局（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ：ＦＤＡ）承認の注射可能な充填剤のみに制限しなければならない。残念ながらそのようなリストはＥＵには存在しないが、しかしながら、そのようなリストを作成するための努力がなされている。この欠点により、何が市場において合法的に存在するのかを正確に知ることが極めて困難になっている。それにもかかわらず、医薬品と同様に、違法なＨＡ含有製品はオンラインで購入することができ、税関、又は異なる出荷会社での定期点検中に持ち去られている。その結果、疑わしいＨＡ含有皮膚充填剤中のＨＡの割合を分析する品質検査機関による要求が高まっている。

【0009】

現在のＨＡ含有量の定量方法は、原料中に存在するＨＡの量を決定するための、ヨーロッパ薬局方で解説されている方法に基づく（Ｐｈ．Ｅｕｒ、ヨーロッパ薬局方、欧州評議会、ストラスブール、フランス、第８版、２０１６年）。この比色法では、カルバゾールは、ＨＡの酸加水分解後に得られるウロン酸と相互作用し、５３０ｎｍで吸収する青紫色を生成する。このアッセイは、ヒドロゲルに適用可能なほど特異的ではないと考えられる。したがって、ヒドロゲル中の直鎖状天然ＨＡを同定及び定量するための代替方法が開発されている。これらの方法としては、フォトダイオードアレイ検出器（Ｐｈｏｔｏ Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ：ＰＤＡ）、光散乱、蛍光又は質量分析（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＭＳ）検出器のいずれかを用いる、ＨＰＬＣベースの方法が挙げられる（Ｓ．Ｂ．Ｆｒａｚｉｅｒ、Ｋ．Ａ．Ｒｏｏｄｈｏｕｓｅ、Ｄ．Ｅ．Ｈｏｕｒｃａｄｅ、及びＬ．Ｚｈａｎｇ、「Ｏｐｅｎ Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．」、２００８年、第１巻第３１～３９頁；Ｎ．Ｖｏｌｐｉ、Ｆ．Ｇａｌｅｏｔｔｉ、Ｂ．Ｙａｎｇ、及びＲ．Ｊ．Ｌｉｎｈａｒｄｔ、「Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．」、２０１４年、第９巻第５４１～５５８頁）。加えて、酵素結合免疫吸着アッセイ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）ベースの方法及び比濁法もまた開発されている（Ｓ．Ｈａｓｅｒｏｄｔ、Ｍ．Ａｙｔｅｋｉｎ、及びＲ．Ａ．Ｄｗｅｉｋ、「Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ」、２０１１年、第２１巻第１７５～１８３頁；Ｎ．Ｏｕｅｓｌａｔｉ、Ｐ．Ｌｅｂｌａｎｃ、Ｃ．Ｈａｒｓｃｏａｔ－Ｓｃｈｉａｖｏ、Ｅ．Ｒｏｎｄａｇｓ、Ｓ．Ｍｅｕｎｉｅｒ、Ｒ．Ｋａｐｅｌ、及びＩ．Ｍａｒｃ、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｐｏｌｙｍ．」、２０１４年、第４巻第１０２～１０８頁）。しかしながら、比濁法及びカルバゾール法のみが架橋ＨＡの定量に適合することが報告されており、これは多くの場合、この分子が皮膚充填剤中に存在する好ましい形態である。第１の方法は、カルバゾールアッセイと同様に、他のＧＡＧからの干渉の可能性にもまた悩まされる。したがって、疑わしいＨＡ含有皮膚充填剤の日常的に分析するための、信頼性が高く、効率的で、低コストで、かつ容易に適用可能な架橋ＨＡの同定並びに定量化戦略を開発することが、公衆衛生部門にとって極めて重要である。

【0010】

近年、特異的かつ選択的なＨＡ同定及び定量法が提示されており、カルバゾールのマイクロアッセイより前の更なる抽出工程が、疑わしい違法試料を扱う際に遭遇する可能性のあった干渉問題を解決することができる（Ｖａｎｈｅｅ Ｃ．、Ｄｅｓｍｅｄｔ Ｂ．、Ｂａｕｄｅｗｙｎｓ Ｓ．、Ｋａｍｕｇｉｓｈａ Ａ．、Ｖａｎｈａｍｍｅ Ｍｅ Ｂｏｔｈｙ．、Ｊ．Ｌ．、Ｋｏｖａｃｋｏｖａ Ｓ．、Ｃｏｕｒｓｅｌｌｅ Ｐ．、Ｄｅｃｏｎｉｎｃｋ Ｅ．、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｌｌｅｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ．」、「Ａｎａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ」、２０１７年、第９巻第４１７５頁）。しかしながら、この方法はかなり長く、使用されるヒドロゲルの種類及び架橋ＨＡの種類に応じて、結果の広い変動性を依然として示す。

【0011】

信頼できる様式でヒドロゲルのＨＡ含有量を測定することができる、ヒドロゲル中のＨＡを定量するための信頼できる方法が、依然として必要とされている。

【発明の概要】

【0012】

本発明は、ヒドロゲルのＨＡ含有量を決定するための方法であって、超音波処理工程を含む方法を、対象とする。超音波処理工程は、ヒドロゲルを溶解し、ＨＡ含有量のより信頼性の高い決定を可能にする。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】図１は、例のＲ値及び標準曲線の式を報告する。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明は、ヒドロゲル中のＨＡ含有量を決定するための方法であって、超音波処理工程を利用する方法を、対象とする。驚くべきことに、ＨＡを含有する架橋ヒドロゲルを超音波処理することによって、ヒドロゲルのＨＡ含有量を再現可能な方法で低い標準偏差により決定することが可能であることが見出された。

【0015】

水溶液中のＨＡを決定するために最も一般的に使用される方法は、参照により本明細書に組み込まれる、ヨーロッパ薬局方５．０の第２４３４～７頁に定義されている。カルバゾールとの反応によるグルクロン酸の別の決定方法は、Ｔ．Ｂｉｔｔｅｒ及びＨ．Ｍ．Ｍｕｉｒにより開示されており（「Ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｕｒｏｎｉｃ Ａｃｉｄ Ｃａｒｂａｚｏｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」、Ａｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第４巻、第３３０～３３４頁（１９６２年））、これは参照により本明細書に組み込まれている。本発明は、ヒドロゲルに適用される、ヨーロッパ薬局方の方法及びＢｉｔｔｅｒらの方法の両方に対する重要な改善を示す。

【0016】

本発明の好ましい実施形態では、本方法は、以下の工程を含む：
ａ．試薬Ａとして、硫酸中の四ホウ酸ナトリウムの溶液を調製する工程。
ｂ．エタノール中にカルバゾールＲを溶解することで、試薬Ｂを調製する工程。
ｃ．試験する物質を水性溶液中に溶解することによって、試験溶液を少なくとも２倍に調製する工程。
ｃ２．場合により、試験溶液を、室温より高い温度、好ましくは７５℃～８５℃の温度まで、少なくとも１５分間、好ましくは少なくとも２時間、より好ましくは約３時間、好ましくは連続的に撹拌しながら、加熱する工程。
ｄ．試験溶液を超音波によって巨視的に均一な溶液を得るのに充分な期間処理する工程、
ｅ．水性溶液中にグルクロン酸又はグルクロン酸含有物質を溶解することで、基準ストック溶液（参照ストック溶液）を調製する工程、好ましくは、グルクロン酸又はグルクロン酸含有物質の濃度は、０．０５～０．１５重量％の間に含まれる。
ｆ．水性溶液中の基準ストック溶液の希釈液によって、好ましくは０．０００５ｗ／ｖ％～０．０１００ｗ／ｖ％に包含される濃度、好ましくは０．００１０ｗ／ｖ％～０．００５０ｗ／ｖ％に包含される濃度で、少なくとも３つの基準溶液（参照溶液）を調製する工程、
ｇ．試薬Ａと、試薬Ｂと、基準溶液、試験溶液、水性溶液（ブランク）、及び場合により干渉用の溶液（架橋剤試料又は添加剤試料）のうちの１つとを混合することによって、試験管（テストチューブ）を調製し、各試験管を水浴上に少なくとも５分間置き、次いでそれらを室温まで冷却する工程、好ましくは、水浴は沸騰水浴であり、持続時間は約１５分である。
ｈ．ブランク及び場合により干渉用の試料に対して、５００～５８０ｎｍに包含される波長、好ましくは約５３０ｎｍの波長における吸光度を読み取る工程。

【0017】

ヒアルロン酸ナトリウムの含有率は、既知の濃度である基質から開始して得られた、実験吸光度値を基準標準曲線（参照標準曲線）で内挿することによって計算された。計算詳細：
－ブランク試料の平均吸光度値を、各試料の平均吸光度値から引く、
－架橋剤試料の平均値（利用可能な場合）を、各試料の平均吸光度値から引く、
－重み付けされた試料中のヒアルロン酸ナトリウムの含有率を、各反復の実験吸光度値を基準標準曲線で内挿して計算する。

【0018】

架橋剤及び添加剤の干渉に関しては、２つの可能性が存在する。ヒドロゲルの組成（架橋剤の種類を含む）、その分量、及び他の添加剤の存在に関する情報が利用可能である場合、したがって、添加剤及び架橋剤をヒドロゲル中に存在する量で含む溶液を調製することが可能である（干渉溶液）。他の全ての場合において、ヒドロゲルの正確な組成を知ることはできない。したがって、架橋剤及び添加剤の干渉を考慮することは不可能である。分析の最後に得られたヒアルロン酸の割合値は、おそらく、試料中のＨＡの有効量よりも高いであろう。

【0019】

最終生成物中のヒアルロン酸ナトリウムの含有率を、ヒドロゲルの比率（ＮａＨＡ％×１００）／ｇに基づいて計算する。各反復の割合値は±２０％の許容限界に従う。モーダル値（ｍｏｄａｌ ｖａｌｕｅ）、平均値、及び標準偏差を計算する。

【0020】

工程ｃ２は、試験溶液を含む試料を７５～８５℃で３時間加熱する工程を導入する。この工程は必須ではなく、取り除くことができる。しかしながら、直後に続く超音波処理工程の効率を改善するのに役立つため好ましい。

【0021】

工程ｄ（試料の超音波処理）は、従来技術の方法に対する最も重要な貢献を示す。実際に、超音波処理の後、試料は以前よりもはるかに均一であり、これは分析のより高い再現性に反映されることが注目されている。工程ｃ２は有用であるが、ヒドロゲルの破壊を達成する必要はない。しかしながら、工程ｃ２が使用されない場合、ヒドロゲルを可溶化するために、より厳しい超音波処理条件を適用する必要がある。

【0022】

好ましい実施形態では、超音波処理工程は、０．５Ｗ／ｋｇ～５０Ｗ／ｋｇの間で含まれる出力を用いて行われ、より好ましくは、超音波処理は０．１～１０Ｗ／ｋｇの比出力で行われる。超音波処理中に使用される比エネルギーに関して、これは５００Ｊ／ｋｇ～３０ｋＪ／ｋｇ、好ましくは２ｋＪ／ｋｇ～２０ｋＪ／ｋｇに包含される。

【0023】

これらのパラメータは工程ｃ２の性能によってもまた影響を受ける。工程ｃ２を行う場合、より低い出力又はより低いエネルギーの超音波処理の使用が可能である。したがって、本方法が工程ｃ２を含む場合、エネルギーの好ましい範囲は、１ｋＪ／ｋｇ～１０ｋＪ／ｋｇである。工程ｃ２が行われない場合、好ましいエネルギー範囲は、３ｋＪ／ｋｇ～３０ｋＪ／ｋｇである。

【0024】

処理の出力及び持続時間に影響を及ぼす別の重要な因子は、架橋ヒドロゲルの化学的性質である。一般に、新しい各ゲルでは、ゲルの良好な溶解を起こす実験条件を決定するために、いくつかの試験を行う必要がある。

【0025】

工程ａ及び工程ｂは、好ましくはヨーロッパ薬局方に従って、すなわち、試薬Ａでは四ホウ酸二ナトリウム０．９５ｇを硫酸１００．０ｍｌ中に溶解し、試薬Ｂではカルバゾール０．１２５ｇをエタノール１００．０ｍｌに溶解して行う。

【0026】

工程ｅにおいて、基準ストック溶液は、５０．００～１５０．００ｍｇのグルクロン酸又はグルクロン酸含有物質を１００．００ｇの水中に溶解することによって調製される。グルクロン酸含有物質としては、ヒアルロン酸の使用が特に好ましい。

【0027】

実験の部
ヒドロゲルの分析
試薬Ａは、四ホウ酸ナトリウム０．９５ｇを、硫酸１００．００ｍｌ中に溶解することによって調製した。

【0028】

試薬Ｂは、カルバゾール０．１２５ｇを、エタノール１００．００ｍｌ中に溶解することによって調製した。

【0029】

約０．１７０ｇの量を水中に溶解し、追加の水で総重量を１００ｇにすることによって、ヒドロゲルの３つの独立した試料を調製する。ヒドロゲル重量を報告する：Ｓ１：０．１７２３ｇ、Ｓ２：０．１８０８ｇ、Ｓ３：０．１７２８ｇ。

【0030】

ヒドロゲル分散液を８５℃で３時間加熱する。次いで、０．２２Ｗに相当する３０％の増幅で、超音波処理機Ｑ５００（Ｑｓｏｎｉｃａ ＬＬＣ．）により超音波処理した。超音波処理後、ヒドロゲルを水中に分散させる。

【0031】

５０ｍｇのＨＡを１００ｇの水中に溶解することによって、基準溶液ストックを調製する。この溶液から、次の濃度（重量％）で５種の溶液を調製する：０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５。表１では、標準曲線から得られた、５３０ｎｍにて読み取った吸光度データを報告する。平均値及び標準偏差は、標準曲線の各点の反復について計算する。

【表1】

【0032】

ブランク（グルクロン酸を含有する物質の０．０００％）について得られた平均値を、標準曲線の各点について得られた平均値から引く（表２）。Ｒ値及び標準曲線の式を図１で計算する。

【表2】

【0033】

予め４℃まで冷却した各試験管に、５．０ｍｌの新たに調製した試薬Ａを添加した。各試料を、以下の通り、試験管内の試薬Ａ上へと慎重に積層させた（ブランク：１．０ｍｌの水Ｒ、基準溶液：１．０ｍｌの基準ストック溶液の各希釈液、試料：１．０ｍｌの各試験溶液）。管を穏やかに振盪して、試料により作成された二重相を溶解した。各試験管に０．２０ｍｌの試薬Ｂを添加した。管に再度蓋をし、シャックし（ｓｈａｃｋｅｄ）、再び正確に１５分間水浴中に置いた。管を室温まで冷却した。各試料を二重の吸光度について分析し、各々を８つの反復について分析した。試料の平均吸光度値を計算した（表３）。

【表3】

【0034】

試料について得られた各吸光度値では、ブランク試料の平均吸光度値を引いた（表４）。

【表4】

【0035】

本方法の点Ｃにて報告されているように、秤量されたヒドロゲル中に存在し、１００ｇの水中に希釈されたＮａＨＡを指す割合値を、試料の各吸光度値に対する標準曲線によって得られた式から計算した。例えば、０．０５１３／９．９７０５＝０．００５１４％。

【0036】

最終生成物中に存在するＮａＨＡの割合を、試料の各吸光度値について（表５）、次の比率により計算した：Ａ：１００＝Ｂ：ｘ；ｘ＝Ｂ・１００／Ａ
式中、
Ａ＝試料の調製に使用したヒドロゲルの重量、
Ｂ＝秤量したヒドロゲル中に存在し、水で希釈したＮａＨＡの割合値。
Ｂ＝０．００５１４と計算された最初の試料Ｓの場合、ｘ＝０．００５１４×１００／０．１７２３＝２．９８３２６である。

【表5】

【0037】

モーダル値を取得し、そのモーダル値に対して許容限界（±２０％）を計算する。
＊±２０％の許容限界を超える値。
モーダル値：２．８７％。

【表6】

【0038】

許容区間内に集めた値のうち、ＮａＨＡの平均値％及び標準偏差を計算した。例えば、平均値＝２．７６％、標準偏差：０．１６％。
なお、本発明に包含され得る諸態様または諸実施形態は、以下のとおり要約される。
［１］．
ヒドロゲルのヒアルロン酸含有量を決定する方法であって、前記方法は、以下の工程：
ａ．試薬Ａとして、硫酸中の四ホウ酸ナトリウムの溶液を調製する工程と、
ｂ．エタノール中にカルバゾールを溶解することで、試薬Ｂを調製する工程と、
ｃ．水性溶液中に前記ヒドロゲルを溶解することで、試験溶液を調製する工程と、
ｄ．前記試験溶液を超音波によって巨視的に均一な溶液を得るのに充分な期間処理する工程と、
ｅ．水性溶液中にグルクロン酸又はグルクロン酸含有物質を溶解することで、基準ストック溶液を調製する工程と、
ｆ．水性溶液中の基準ストック溶液の希釈液によって、好ましくは０．０００５ｗ／ｖ％～０．０１００ｗ／ｖ％に包含される濃度、好ましくは０．００１０ｗ／ｖ％～０．００５０ｗ／ｖ％に包含される濃度で、少なくとも３つの基準溶液を調製する工程と、
ｇ．試薬Ａと、試薬Ｂと、基準溶液、試験溶液、水性溶液（ブランク）、及び場合により干渉用の溶液（架橋剤試料又は添加剤試料）のうちの１つとを混合することによって、試験管を調製し、各試験管を水浴上に少なくとも５分間置き、次いでそれらを室温まで冷却する工程と、
ｈ．前記ブランク及び場合により干渉用の前記試料に対して、５００～５８０ｎｍに包含される波長、好ましくは約５３０ｎｍの波長における吸光度を読み取る工程と、
を含む、方法。
［２］．
工程ｃの後に、以下の工程：
ｃ２．前記試験溶液を、室温より高い温度、好ましくは７５～８５℃の温度まで、少なくとも１５分間、好ましくは少なくとも２時間、より好ましくは約３時間、好ましくは連続的に撹拌しながら、加熱する工程
を更に含む、上記項目１に記載の方法。
［３］．
工程ｇにおいて、前記水浴が熱浴であり、前記時間が好ましくは約１５分である、上記項目１又は２に記載の方法。
［４］．
工程ｄにおいて、超音波処理が、０．５Ｗ／ｋｇ～５０Ｗ／ｋｇの比出力で行われる、上記項目１～３に記載の方法。
［５］．
超音波処理が、５００Ｊ／ｋｇ～３０ｋＪ／ｋｇに包含される比エネルギーで行われる、上記項目１～４に記載の方法。
［６］．
試薬Ａが、硫酸中の０．９５ｗ／ｖ％の四ホウ酸二ナトリウムの溶液であり、試薬Ｂが、エタノール中の０．１２５ｗ／ｖ％のカルバゾールの溶液である、上記項目１～５に記載の方法。
［７］．
工程ｃにおいて、前記試験溶液が、少なくとも二重に調製される、上記項目１～６に記載の方法。
［８］．
工程ｇが、以下：
好ましくは予め冷却した、５部の試薬Ａを各試験管へ添加し、前記試験管内の前記試薬Ａの上へ、各試料を以下の通り（ブランク：水溶液を１部、基準溶液：基準ストック溶液の各希釈液を１部、試料：各試験溶液を１部）積層し、前記管を振盪して、前記試料によって作成された二重相を溶解し、各試料を水浴中に少なくとも５分間、好ましくは沸騰水浴中に１５分間置き、次いでそれらを室温まで冷却し、各管へ０．２部の試薬Ｂを添加し、前記管を振盪して前記二重相を溶解し、各管を温水浴中に少なくとも５分間、好ましくは沸騰水浴中に１５分間置くこと、
の通りに実行される、上記項目１～７に記載の方法。
［９］．
工程ｈの後に、ヒアルロン酸ナトリウムの含有率が、実験吸光度値を基準標準曲線で内挿することによって計算される、上記項目１～８に記載の方法。

【図1】