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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-03
(45)【発行日】2024-10-11
(54)【発明の名称】肥満合併症を処置および予防するための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
A23L 33/105 20160101AFI20241004BHJP
A23L 19/15 20160101ALI20241004BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20241004BHJP
A61K 9/19 20060101ALI20241004BHJP
A61K 31/19 20060101ALI20241004BHJP
A61K 31/352 20060101ALI20241004BHJP
A61K 31/353 20060101ALI20241004BHJP
A61K 36/185 20060101ALI20241004BHJP
A61K 36/23 20060101ALI20241004BHJP
A61K 36/31 20060101ALI20241004BHJP
A61K 36/39 20060101ALI20241004BHJP
A61K 36/42 20060101ALI20241004BHJP
A61K 36/48 20060101ALI20241004BHJP
A61K 36/73 20060101ALI20241004BHJP
A61K 36/736 20060101ALI20241004BHJP
A61K 36/752 20060101ALI20241004BHJP
A61K 36/81 20060101ALI20241004BHJP
A61K 36/87 20060101ALI20241004BHJP
A61K 36/8962 20060101ALI20241004BHJP
A61K 38/00 20060101ALI20241004BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20241004BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20241004BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20241004BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20241004BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20241004BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20241004BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20241004BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20241004BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20241004BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20241004BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20241004BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20241004BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20241004BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20241004BHJP
A61K 131/00 20060101ALN20241004BHJP
【ＦＩ】
A23L33/105
A23L19/15
A61K9/14
A61K9/19
A61K31/19
A61K31/352
A61K31/353
A61K36/185
A61K36/23 ZNA
A61K36/31
A61K36/39
A61K36/42
A61K36/48
A61K36/73
A61K36/736
A61K36/752
A61K36/81
A61K36/87
A61K36/8962
A61K38/00
A61K45/00
A61P1/00
A61P1/16
A61P3/00
A61P3/04
A61P3/06
A61P3/10
A61P9/00
A61P9/10 101
A61P19/08
A61P21/00
A61P25/28
A61P29/00
A61P37/02
A61K131:00
【請求項の数】
17
(21)【出願番号】P 2020568265
(86)(22)【出願日】2019-06-07
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-10-11
(86)【国際出願番号】 US2019035957
(87)【国際公開番号】W WO2019236947
(87)【国際公開日】2019-12-12
【審査請求日】2022-06-06
(31)【優先権主張番号】62/681,935
(32)【優先日】2018-06-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】303067548
【氏名又は名称】トラスティーズ オブ タフツ カレッジ
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】メイダニ，シミン ニクビン
(72)【発明者】
【氏名】メイダニ，モーセン
【審査官】二星 陽帥
(56)【参考文献】
【文献】特開２００８－０８６２１７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００９－５０８５０８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５０３６０５（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１６／０００７６３９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２００８／０２０６４０２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２００５／０００３０２６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２００３－５２６３５４（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ２３Ｌ １９／１５ － ３３／１０５
Ａ６１Ｋ ９／１４ － １３１／００
Ａ６１Ｐ １／００ － ３７／０２
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
果物種の混合物および野菜種の混合物を含み、前記果物種は、オレンジ、リンゴ、バナナ、ブドウ、スイカ、パイナップル、イチゴ、カンタロープ、レモン、グレープフルーツ、モモ、および、セイヨウナシの１２種の果物種を含み、
前記野菜種が、ジャガイモ、トマト、スイートコーン、タマネギ、タマヂシャ、ロマイン、ピーマン、ニンジン、キュウリ、キャベツ、豆、および、サツマイモの１２種の野菜種を含む、
肝セラミドを減少させるための組成物。
【請求項2】
前記混合物が乾燥粉末である、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記混合物が４０～６５グラムの乾燥粉末を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
ブルーベリー、チェリー、マンゴーおよびグリーンピースから選択される１種以上をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
前記混合物が、１５～２５％（ｗ／ｗ）のヘスペレチン、１５～２５％（ｗ／ｗ）のカフェオイルキナ酸、１０～２０％（ｗ／ｗ）のクエルセチン、および５～１５％（ｗ／ｗ）のマルビジンのポリフェノール含有量を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項6】
前記混合物が、２０．６％（ｗ／ｗ）のヘスペレチン、１９．１％（ｗ／ｗ）のカフェオイルキナ酸、１５．７％（ｗ／ｗ）のクエルセチン、および１０．３％（ｗ／ｗ）のマルビジンを含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項7】
前記混合物が、１～１０％（ｗ／ｗ）のナリンゲニン、１～１０％（ｗ／ｗ）のペラルゴニジン、１～５％（ｗ／ｗ）のカテキン、および１～５％（ｗ／ｗ）のプロシアニジンをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項8】
前記混合物が、６．５％（ｗ／ｗ）のナリンゲニン、５．８％（ｗ／ｗ）のペラルゴニジン、４．２％（ｗ／ｗ）のカテキン、および３．１％（ｗ／ｗ）のプロシアニジンを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
前記混合物が、カフェイン酸、ペオニジン、シアニジン、ピノレシノール、ｐ－クマロイル、ルテオリン、ペチュニジン、ダイゼイン、ゲニステイン、エラグ酸、および没食子酸から選択される１つ以上のポリフェノールをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項10】
タンパク質、炭水化物、または脂肪の１つ以上をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項11】
５～１５％（ｗ／ｗ）のタンパク質（ｋｃａｌ／ｋｃａｌ）、７５～８５％（ｗ／ｗ）の炭水化物（ｋｃａｌ／ｋｃａｌ）、および０～２０％（ｗ／ｗ）の脂肪（ｋｃａｌ／ｋｃａｌ）を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
１０～１２％（ｗ／ｗ）のタンパク質（ｋｃａｌ／ｋｃａｌ）、８０～８３％（ｗ／ｗ）の炭水化物（ｋｃａｌ／ｋｃａｌ）、および５～１０％（ｗ／ｗ）の脂肪（ｋｃａｌ／ｋｃａｌ）を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項13】
１１．６％（ｗ／ｗ）のタンパク質（ｋｃａｌ／ｋｃａｌ）、８１．２％（ｗ／ｗ）の炭水化物、および７．２％（ｗ／ｗ）の脂肪（ｋｃａｌ／ｋｃａｌ）を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項14】
前記乾燥粉末が凍結乾燥粉末である、請求項２に記載の組成物。
【請求項15】
栄養補助食品、食品、または飲料である、請求項１に記載の組成物。
【請求項16】
対象の、体重増加、肥満、炎症状態、脂肪肝疾患、高コレステロール、グルコース不耐性、インスリン抵抗性、腸内細菌叢の多様性の低下、心臓疾患、およびアテローム性動脈硬化症から選ばれる１つ以上の状態を処置および／または予防する方法であって、前記対象に請求項１に記載の組成物を投与する工程を含み、
前記対象がヒト以外の哺乳動物である、方法。
【請求項17】
対象の、脂肪量を減少する、筋肉量を増加する、炎症性サイトカインおよび／もしくはセラミドを減少する、組織炎症を減少する、コレステロールを減少する、グルコース耐性を改善する、免疫応答を改善する、腸内細菌叢の多様性を増加する、寿命を増加する、認知を改善する、ならびに／または骨の健康を改善する方法であって、前記対象に請求項１に記載の組成物を投与する工程を含み、
前記対象がヒト以外の哺乳動物である、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
本出願は、２０１８年６月７日に出願された米国仮特許出願第６２／６８１，９３５号の優先権を主張し、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
〔連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載〕
本発明は、米国農務省によって与えられた助成金番号５８－１９５０－４－００３の下で政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
本発明は、米国農務省によって与えられた助成金番号５８－１９５０－４－００３の下で政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【0003】
〔技術分野〕
本明細書は、肥満ならびに関連する疾患および状態の処置、予防、およびリスク低減のための組成物および方法を提供する。特に、本明細書は、果物および野菜の乾燥粉末を含む組成物、ならびにそれらの使用を提供する。
本明細書は、肥満ならびに関連する疾患および状態の処置、予防、およびリスク低減のための組成物および方法を提供する。特に、本明細書は、果物および野菜の乾燥粉末を含む組成物、ならびにそれらの使用を提供する。
【0004】
〔背景技術〕
肥満および代謝障害の有病率は、世界中で急速に増加している。代謝障害に加えて、肥満は、冠動脈性心疾患、２型糖尿病、ある種の癌、高血圧、脳卒中、肝臓および胆嚢疾患、睡眠時無呼吸および呼吸障害、変形性関節症、女性における婦人科的問題と関連している。
肥満および代謝障害の有病率は、世界中で急速に増加している。代謝障害に加えて、肥満は、冠動脈性心疾患、２型糖尿病、ある種の癌、高血圧、脳卒中、肝臓および胆嚢疾患、睡眠時無呼吸および呼吸障害、変形性関節症、女性における婦人科的問題と関連している。
【0005】
代謝障害とは、脂肪組織および肝臓などの代謝活性組織の機能障害と定義される。炎症の増加によって示される調節不全免疫応答は代謝障害の進行に対する主要な寄与因子の１つである（Ｅｈｅｉｍら、２０１４年；Ｓｉｔｔｉｐｏら、２０１８年）。かつては単にエネルギーリザーバとしてみなされていたが、脂肪組織は現在、代謝の調節において機能する内分泌器官として認識されている（Ｂｏｏｔｈら、２０１６年；Ｇａｌｉｃら、２０１０年）。食事による脂質負荷が機能不全脂肪組織の貯蔵容量を超えると、遊離脂肪酸のオーバーフローが循環中に流れ、肝臓などの他の組織における異所性脂質蓄積をもたらす（Ｂｏｓｙ－Ｗｅｓｔｐｈａｌら、２０１９年）。肝臓に脂肪が蓄積すると、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）になる。慢性肝疾患の主要な原因であるＮＡＦＬＤは肥満と関連するか（Ａｒｉａｓ－Ｌｏｓｔｅら、２０１５年；Ｐｏｌｙｚｏｓら、２０１７年）、または肥満とは無関係であり得る（Ｎａｋａｍｕｒａら、２０１８年；Ｙｏｕｓｅｆら、２０１７年）。動物実験において、食餌誘発性ＮＡＦＬＤは高脂肪食（典型的には脂肪からのカロリーの４５％～６０％）を与えられたマウスにおいてのみならず、標準的なＡＩＮ－９３食餌（脂肪からのカロリーの１６％）を与えられたマウスにおいても見出された（Ｆａｒｉａｓ Ｓａｎｔｏｓら、２０１５年；Ｓａｎｔｏｓら、２０１５年）。
【0006】
代謝障害および心血管障害などの肥満に関連する障害を処置および予防するための組成物の必要性が差し迫っている。
【0007】
〔要約〕
本開示は、肥満および関連する合併症を処置および予防するための組成物および方法を提供する。本明細書に記載される実験は、２４の果物および野菜（Ｆ＆Ｖ）を含むＦ＆Ｖ混合物を利用した。基礎食餌または高脂肪（ＨＦ）食餌でマウスに１５％のＦ＆Ｖ混合物（ｗ／ｗ）（ヒトに対して８～９人分のＦ＆Ｖ／日に相当）を補給すると、体重減少とは無関係に肝脂肪症が予防され、精巣上体脂肪組織の炎症が抑制された。これらの作用は、炎症誘発性サイトカインであるＴＮＦαおよびセラミド量の低下、ならびに腸内細菌叢の多様性の増加および腸内細菌組成の変化と相関していた。さらなる実験により、ＨＦ誘発性アテローム性動脈硬化症および肝脂肪症の予防が実証された。これは、脂質異常症の改善および炎症の低下を介して影響を受けている可能性がある。
本開示は、肥満および関連する合併症を処置および予防するための組成物および方法を提供する。本明細書に記載される実験は、２４の果物および野菜（Ｆ＆Ｖ）を含むＦ＆Ｖ混合物を利用した。基礎食餌または高脂肪（ＨＦ）食餌でマウスに１５％のＦ＆Ｖ混合物（ｗ／ｗ）（ヒトに対して８～９人分のＦ＆Ｖ／日に相当）を補給すると、体重減少とは無関係に肝脂肪症が予防され、精巣上体脂肪組織の炎症が抑制された。これらの作用は、炎症誘発性サイトカインであるＴＮＦαおよびセラミド量の低下、ならびに腸内細菌叢の多様性の増加および腸内細菌組成の変化と相関していた。さらなる実験により、ＨＦ誘発性アテローム性動脈硬化症および肝脂肪症の予防が実証された。これは、脂質異常症の改善および炎症の低下を介して影響を受けている可能性がある。
【0008】
したがって、本明細書では、果物種の混合物および野菜種の混合物を含む乾燥粉末（例えば、凍結乾燥粉末）を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、組成物は栄養補助食品（例えば、錠剤、粉末、カプセルなど）、食品、または飲料である。
【0009】
本開示は、特定の果物および野菜、またはＦ＆Ｖ組成物の成分に限定されない。いくつかの実施態様において、果物種は例えば、オレンジ、リンゴ、バナナ、ブドウ、スイカ、パイナップル、イチゴ、カンタロープ、レモン、グレープフルーツ、モモまたはセイヨウナシから選択される１種以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または全て）の果物種である。いくつかの実施形態において、野菜種は例えば、ジャガイモ、トマト、スイートコーン、タマネギ、タマヂシャ、ロマイン、ピーマン、ニンジン、キュウリ、キャベツ、豆、またはサツマイモから選択される１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または全て）である。いくつかの実施形態において、組成物は、特定の対象について少なくとも推奨される１日の量の果物および野菜を含む（例えば、推奨される１日の量の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５倍以上）。いくつかの実施形態において、１日の量を提供することを意図する組成物は、４０～６５グラムの乾燥粉末を含む。いくつかの実施形態においては、果物および野菜の混合物は、図１０ＡまたはＢに列挙される量の特定のＦ＆Ｖを含む。いくつかの実施形態において、果物種および野菜種の混合物は、１６～２０％のオレンジ、１４～１８％のトマト、８～１１％のリンゴ、１３～１６％のジャガイモ、３．０～５．５％のバナナ、３～４％のスイートコーン、３～４％のブドウ、２～３％のレタス、１～２％のキクヂシャ、１～２％の芽キャベツ、１～２％のキャベツ、１～２％のニンジン、１～３％のタマネギ、１～２％のグリーンピース、０．５～１．５％のスイカ、０．５～１．５％のハネデューメロン、０．５～１．５％のブロッコリー、１～２％のホウレンソウ、０．５～１．５％のピーマン、０．５～１．５％のサヤインゲン、０．５～１．５％のカンタロープ、０．４～１．２％のカリフラワー、０．５～１．０％のマンゴー、０．５～１．０％のパパイヤ、０．３～０．９％のセロリ、０．４～１．２％のキュウリ、０．５～１．０％のパイナップル、０．２５～０．７５％のタンジェリン、０．２５～０．７５％のライム、０．２５～０．７５％のイチゴ、０．２５～０．７５％のラズベリー、０．２５～０．７５％のグレープフルーツ、０．２５～０．７５％のレモン、０．２５～０．７５％のクランベリー、０．３～０．５％のプラム、０．３～０．５％のモモ、０．３～０．５％のチェリー、０．３～０．５％のブルーベリー、０．３～０．５％のアプリコット、０．１～０．１５％の乾燥エンドウ、０．１～０．１５％のグレートノーザンビーン、０．１～０．１５％の乾燥白インゲンマメ、０．１～０．１５％の乾燥レンズマメ、０．１～０．１５％のピントビーン、０．１～０．１５％のライマメ、０．１～０．１５％のレッドキドニービーン、および、０．１～０．１５％のブラックビーン（例えば、約１８．０７５％のオレンジ、１６．１６１％のトマト、９．５９５％のリンゴ、１４．４９３％のジャガイモ、４．３７３％のバナナ、３．５６４％のスイートコーン、３．３８３％のブドウ、２．５３７％のレタス、１．６５１％のキクヂシャ、１．３７５％の芽キャベツ、１．３７５％のキャベツ、１．３２９％のニンジン、２．０１７％のタマネギ、１．２９３％のグリーンピース、１．０５８％のスイカ、１．０５８％のハネデューメロン、０．８４％のブロッコリー、１．６５１％のホウレンソウ、１．０８７％のピーマン、１．０６１％のサヤインゲン、１．０５８％のカンタロープ、０．８４％のカリフラワー、０．７３２％のマンゴー、０．７３２％のパパイヤ、０．６２６％のセロリ、０．８１４％のキュウリ、０．７３２％のパイナップル、０．５５５％のタンジェリン、０．５５５％のライム、０．４３７％のイチゴ、０．４３７％のラズベリー、０．５５５％のグレープフルーツ、０．５５５％のレモン、０．４３７％のクランベリー、０．３８８％のプラム、０．３８８％のモモ、０．３８８％のチェリー、０．４３７％のブルーベリー、０．３８８％のアプリコット、０．１２１％の乾燥エンドウ、０．１２１％のグレートノーザンビーン、０．１２１％の乾燥白インゲンマメ、０．１２１％の乾燥レンズマメ、０．１２１％のピントビーン、０．１２１％のライマメ、０．１２１％のレッドキドニービーン、および０．１２１％のブラックビーン）を含む。
【0010】
いくつかの実施形態において、Ｆ＆Ｖ混合物は、１５～２５％のヘスペレチン、１５～２５％のカフェオイルキニン酸、１０～２０％のクエルセチン、および５～１５％のマルビジン（例えば、２０．６％のヘスペレチン、１９．１％のカフェオイルキニン酸、１５．７％のクエルセチン、および１０．３％のマルビジン）のポリフェノール含有量を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、１～１０％のナリンゲニン、１～１０％のペラルゴニジン、１～５％のカテキン、および１～５％のプロシアニジン（例えば、６．５％のナリンゲニン、５．８％のペラルゴニジン、４．２％のカテキン、および３．１％のプロシアニジン）をさらに含む。いくつかの実施形態において、組成物は例えば、カフェイン酸、ペオニジン、シアニジン、ピノレシノール、ｐ－クマロイル、ルテオリン、ペチュニジン、ダイゼイン、ゲニステイン、エラグ酸、または没食子酸から選択される１つ以上のポリフェノールをさらに含む。
【0011】
さらなる実施形態は、１６～２０％のオレンジ、１４～１８％のトマト、８～１１％のリンゴ、１３～１６％のジャガイモ、３．０～５．５％のバナナ、３～４％のスイートコーン、３～４％のブドウ、２～３％のレタス、１～２％のキクヂシャ、１～２％の芽キャベツ、１～２％のキャベツ、１～３％のニンジン、１～３％のタマネギ、１～２％のグリーンピース、０．５～１．５％のスイカ、０．５～１．５％のハネデューメロン、０．５～１．５％のブロッコリー、１～２％のホウレンソウ、０．５～１．５％のピーマン、０．５～１．５％のサヤインゲン、０．５～１．５％のカンタロープ、０．４～１．２％のカリフラワー、０．５～１．０％のマンゴー、０．５～１．０％のパパイヤ、０．３～０．９％のセロリ、０．４～１．２％のキュウリ、０．５～１．０％のパイナップル、０．２５～０．７５％のタンジェリン、０．２５～０．７５％のライム、０．２５～０．７５％のイチゴ、０．２５～０．７５％のラズベリー、０．２５～０．７５％のグレープフルーツ、０．２５～０．７５％のレモン、０．２５～０．７５％のクランベリー、０．３～０．５％のプラム、０．３～０．５％のモモ、０．３～０．５％のチェリー、０．３～０．５％のブルーベリー、０．３～０．５％のアプリコット、０．１～０．１５％の乾燥エンドウ、０．１～０．１５％のグレートノーザンビーン、０．１～０．１５％の乾燥白インゲンマメ、０．１～０．１５％の乾燥レンズマメ、０．１～０．１５％のピントビーン、０．１～０．１５％のライマメ、０．１～０．１５％のレッドキドニービーン、および、０．１～０．１５％のブラックビーンを含む乾燥粉末を含む、当該乾燥粉末から本質的に成る、または当該乾燥粉末から成る組成を提供する。
【0012】
特定の実施形態は、本明細書に記載の組成物を含む食品または飲料製品を提供する。いくつかの実施形態において、製品は、組成物の２％～２０％（例えば、５～１５％、５～２０％、または５～１０％）（ｗ／ｗ）を含む。いくつかの実施形態において、食品または飲料製品は、タンパク質、炭水化物、および脂肪（例えば、５～１５％のタンパク質（ｋｃａｌ／ｋｃａｌ）、７５～８５％の炭水化物（ｋｃａｌ／ｋｃａｌ）、および０～２０％の脂肪（ｋｃａｌ／ｋｃａｌ）；１０～１２％のタンパク質（ｋｃａｌ／ｋｃａｌ）、８０～８３％の炭水化物（ｋｃａｌ／ｋｃａｌ）、および５～１０％の脂肪（ｋｃａｌ／ｋｃａｌ）、または、１１．６％のタンパク質（ｋｃａｌ／ｋｃａｌ）、８１．２％の炭水化物、および７．２％の脂肪（ｋｃａｌ／ｋｃａｌ））の１つ以上を含む。
【0013】
さらなる実施形態は、本明細書に記載の組成物を含む栄養補助食品を提供する。
【0014】
さらに他の実施形態は例えば、体重増加、肥満、炎症状態、脂肪肝疾患、高コレステロール、グルコース不耐性、インスリン抵抗性、腸内細菌叢の多様性の低下、心臓疾患、またはアテローム性動脈硬化症から選択される１つ以上の状態を処置および／または予防する方法において使用される、本明細書に記載の組成物を提供する。
【0015】
さらに他の実施形態は、脂肪量の減少、筋肉量の増加、炎症性サイトカインおよび／またはセラミドの減少、組織炎症の減少、コレステロールの減少、耐糖能の改善、免疫応答の改善、腸内細菌叢の多様性の増加、寿命の増加、認知の改善、または骨の健康の改善のいずれか１つ以上の方法において使用される、本明細書に記載の組成物を提供する。
【0016】
本明細書はさらに、体重増加、肥満、炎症状態、脂肪肝疾患、高コレステロール、グルコース不耐性、インスリン抵抗性、腸内細菌叢の多様性の低下、心臓疾患、およびアテローム性動脈硬化症から選択される１つ以上の状態を処置および／または予防するための本明細書に記載の組成物の使用も提供する。
【0017】
本明細書にさらに、脂肪量の減少、筋肉量の増加、炎症性サイトカインおよび／またはセラミドの減少、組織炎症の減少、コレステロールの減少、耐糖能の改善、アテローム性動脈硬化症の処置または予防、免疫応答の改善、腸内細菌叢の多様性の増加、寿命の増加、認知の改善、および／または骨の健康の改善における、本明細書に記載の組成物の使用である。
【0018】
さらなる実施形態は、例えば、対象の、体重増加、肥満、炎症状態、脂肪肝疾患、高コレステロール、グルコース不耐性、インスリン抵抗性、腸内細菌叢の多様性の低下、心臓疾患、およびアテローム性動脈硬化症から選択される１つ以上の状態を処置および／または予防する方法であって、対象に本明細書に記載の組成物を投与する工程を含む。
【0019】
本開示の実施形態は、対象の、脂肪量を減少する、筋肉量を増加する、炎症性サイトカインおよび／もしくはセラミドを減少する、組織炎症を減少する、コレステロールを減少する、耐糖能を改善する、免疫応答を改善する、腸内細菌叢の多様性を増加する、寿命を増加する、認知を改善する、および／または骨の健康を改善する方法であって、本明細書に記載の組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
【0020】
いくつかの実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、対象は状態の１つ以上の徴候または症状を示し、投与は徴候または症状を軽減または除去する。いくつかの実施形態において、投与は対象に対して少なくとも５人分のＦ＆Ｖに等しい少なくとも１日の量（例えば、１日当たり４０～６５グラムの乾燥粉末）を投与することを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１週間（例えば、少なくとも１か月、少なくとも１年、複数年、または無期限）の期間、投与を１日に１回以上（例えば、１、２、３以上）繰り返す。
【0021】
追加の実施形態を本明細書に記載する。
【0022】
〔図面の説明〕
図１は、Ｆ＆Ｖ補給したＨＦ食餌を与えられたマウスがより少ない体重増加および脂肪組織質量を有したことを示す。６週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、それぞれ０％、５％、１０％または１５％のＦ＆Ｖ補給した基礎食餌（Ｂ、１６ｋｃａｌ％脂肪）または高脂肪食餌（ＨＦ、４５ｋｃａｌ％脂肪）を、２０週間与えた。調和のとれている対照食餌（ＭＣ、１０ｋｃａｌ％脂肪）を与えたマウスを、ＨＦ食餌の対照として使用した。（Ａ、Ｂ）体重；（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）脂肪組織；（Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ）脂肪なしの組織。データは、平均値± ＳＥＭとして示されている。＃ Ｐ＜０．０５、＃＃＃ Ｐ＜０．００１およびＮ．Ｓ 有意でない。
図１は、Ｆ＆Ｖ補給したＨＦ食餌を与えられたマウスがより少ない体重増加および脂肪組織質量を有したことを示す。６週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、それぞれ０％、５％、１０％または１５％のＦ＆Ｖ補給した基礎食餌（Ｂ、１６ｋｃａｌ％脂肪）または高脂肪食餌（ＨＦ、４５ｋｃａｌ％脂肪）を、２０週間与えた。調和のとれている対照食餌（ＭＣ、１０ｋｃａｌ％脂肪）を与えたマウスを、ＨＦ食餌の対照として使用した。（Ａ、Ｂ）体重；（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）脂肪組織；（Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ）脂肪なしの組織。データは、平均値± ＳＥＭとして示されている。＃ Ｐ＜０．０５、＃＃＃ Ｐ＜０．００１およびＮ．Ｓ 有意でない。
【0023】
図２は、Ｆ＆Ｖ補給が脂肪組織の炎症性の細胞浸潤を抑制し、ＮＡＦＬＤを予防したことを示している。Ｈ＆Ｅで染色したｅＡＴ切片の代表的な画像を示す。０％または１５％のＦ＆Ｖ（２Ｃ）を有する基礎食餌および０％または１５％のＦ＆Ｖを有する高脂肪食餌、ならびに調和のとれた対照食餌（２Ｆ）を与えたマウスにおけるｅＡＴの脂肪細胞サイズ分布を示す。写真（Ｈ－Ｉ、Ｋ－Ｌ、およびＮ）は、Ｈ／Ｅ染色された肝組織切片の代表的な画像である。脂肪肝面積は平均値±標準誤差として表わされている。（Ｏ）血清セラミドおよびＴＮＦαとの肝脂肪変性相関の表。＃ Ｐ＜０．０５、＃＃ Ｐ＜０．０１、＃＃＃ Ｐ＜０．００１。Ｎ．Ｓ． 有意でない。
【0024】
図３は、Ｆ＆Ｖ補給が血清および肝臓のセラミド濃度を低下させることを示している。（Ａ－Ｘ）総セラミドおよび示されているセラミド種の血清および肝臓の濃度を測定した。＃ Ｐ＜０．０５、＃ Ｐ＜０．０１、Ｎ．Ｓ 有意でない。
【0025】
図４は、肝臓のＦＸＲ発現レベル、ｎＳＭａｓｅ活性、全身および肝臓のＴＮＦαレベルに対するＦ＆Ｖ補給の効果を示している。血清および肝臓の炎症誘発性サイトカインＴＮＦαのレベル（４Ａ、４Ｅ、４Ｃ、および４Ｇ）をＥＬＩＳＡにより測定した。肝臓ＦＸＲ（４Ｂおよび４Ｆ）のｍＲＮＡレベルをＲＴｑＰＣＲによって定量した。肝臓ｎＳＭａｓｅ活性（４Ｄ－４Ｈ）を、Ｃ６‐ＮＢＤ－ＳＭを基質として用いて測定し、生成した蛍光生成物、ＮＢＤ－セラミドを逆相ＨＰＬＣでモニターした。
【0026】
図５は、基礎食餌またはＨＦ食餌のいずれかにおけるＦ＆Ｖ補給が腸内細菌多様性を増加させたことを示している。ＡおよびＣ：Ｆ＆Ｖ処理は基礎食餌（Ａ）およびＨＦ食餌（Ｂ）のアルファ－多様性を増加させた。ＢおよびＤ：重み付けなしのユニフラック距離による主座標分析プロットは、３つの食餌群の、差のある集積性を示す。＃ Ｐ＜０．０５；＃＃＃ Ｐ＜０．００１。Ｎ．Ｓ． 有意でない。
【0027】
図６は、Ｆ＆Ｖ補給が細菌群生組成を変化させたことを示す。異なる食餌における腸内細菌組成を、門レベル（Ａ）、網レベル（Ｂ）、目レベル（Ｃ）、科レベル（Ｄ）および属レベル（Ｅ）で示す。
【0028】
図７は、２つの食餌供給群を比較するＳｐｅａｒｍａｎの相関係数に基づく相関行列ヒートマップを示す。（Ａ）．０％または１５％のＦ＆Ｖを有する基礎食餌を与えたマウス。（Ｂ）．０％または１５％のＦ＆Ｖを有するＨＦ食餌。星の記号は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を用いて複数回の試験について補正した後の有意な相関を示す。
【0029】
図８は、ＨＦＤ＋１５％のＦ＆Ｖを与えたマウスが低い脾臓重量および脾臓重量指数を有したことを示す。
【0030】
【0031】
図１０Ａ～Ｃは、動物食餌の果物および野菜成分の例示的な組成を示す。
【0032】
図１１は、Ｆ＆Ｖ補給が糞便重量、糞便エネルギー密度、糞便エネルギー排泄量（Ａ－Ｊ）を増大させたことを示している。＃ Ｐ＜０．０５、＃＃ Ｐ＜０．０１。Ｎ．Ｓ．有意でない。
【0033】
図１２は、Ｆ＆Ｖ補給がｅＡＴにおける炎症誘発性のｍＲＮＡ発現を下方制御したことを示す。（Ａ～Ｄ）ｅＡＴにおける炎症誘発性のｍＲＮＡ発現のレベルをＲＴｑＰＣＲにより定量した。＃ Ｐ＜０．０５。Ｎ．Ｓ．有意でない。ＩＬ－１β：インターロイキン１β；ＩＬ－６：ＩＬ－６：インターロイキン６；ＭＣＰ－１：単球化学遊走物質タンパク質－１；ＴＮＦα：腫瘍壊死因子α。
【0034】
図１３は、Ｆ＆Ｖ補給が血清脂質プロファイリングに対する有意な効果を有しなかったことを示している。血清総コレステロール（Ａ、Ｂ）、ＬＤＬレベル（Ｃ、Ｄ）、ＨＤＬレベル（Ｅ、Ｆ）、ＶＬＤＬレベル（Ｇ、Ｈ）、ＴＧレベル（Ｉ、Ｊ）、血清－ｎｏｎ－ＨＤＬおよびｎｏｎ／ＨＤＬ／ＨＤＬ比率（Ｋ）は、平均値±標準誤差として表した。＃ Ｐ＜０．０５、＃ Ｐ＜０．０１、＃＃＃ Ｐ＜０．００１。Ｎ．Ｓ． 有意でない。
【0035】
図１４は、Ｆ＆Ｖ補給が肝臓セラミドシンターゼのｍＲＮＡ発現に有意な影響を及ぼさなかったことを示す。（Ａ－Ｃ）肝臓セラミドシンターゼのｍＲＮＡレベルをＲＴｑＰＣＲにより定量した。＃ Ｐ＜０．０５、Ｎ．Ｓ 有意でない。
【0036】
図１５は、Ｆ＆Ｖ補給が特定の細菌群生組成の存在比を有意に変化させたことを示す。（Ａ－Ｄ）群間の腸内細菌の差のある存在比をＤｅｓｅｑ２パッケージを用いて分析した。
【0037】
図１６は、Ｆ＆Ｖ補給がグルコース耐性ならびに食餌に誘導されるＴ細胞増殖およびＴ細胞増大の抑制を、改善したことを示している。（Ａ－Ｄ）腹腔内グルコース耐性試験（ＩＰＧＴＴ）を実施した。（Ｅ）３Ｈ－チミジン取り込みおよびＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の％。
【0038】
図１７は、ＬＤＬＲ ＫＯマウスにおいて、Ｆ＆Ｖ補給が高脂肪食餌に誘導される大動脈アテローム性動脈硬化症を抑制したことを示している。４週齢のオスのＬＤＬ受容体ノックアウトマウスに、低脂肪食餌（ＬＦ、脂肪に基づく１０％カロリー；５２ｍｇコレステロール／１０００ｋｃａｌ）、または高脂肪食餌（ＨＦ、脂肪に基づく２７％カロリー；１３０ｍｇコレステロール／１０００ｋｃａｌ）または１５％のＦ＆Ｖを補給したＨＦ食餌（ＨＦ１５）をそれぞれ２０週間与えた。（Ａ＿Oil Red Oによって直接に染色した大動脈の代表的な画像。（Ｂ）総大動脈面積に対するOil Red Oによって染色されたプラーク面積の比を定量した。＃＃＃ Ｐ＜０．００１。
【0039】
図１８は、ＬＤＬＲ ＫＯマウスにおける体重および肝重量に対するＦ＆Ｖ補給の効果を示す。（Ａ－Ｃ）肝臓重量を測定し、身体に対する肝臓重量の割合を計算した。＃＃ Ｐ＜０．０１、＃＃＃ Ｐ＜０．００１、Ｎ．Ｓ． 有意でない。
【0040】
図１９は、Ｆ＆Ｖ補給がＬＤＬＲ ＫＯマウスにおける高脂肪食餌に誘導される肝脂肪症を予防したことを示している。（Ａ）、ＨＦ０食餌（Ｂ）、ＨＦ１５食餌（Ｃ）。Ｄ、３つの食餌群の脂肪肝領域の定量。＃＃＃ Ｐ＜０．００１。
【0041】
図２０は、Ｆ＆Ｖ補給がＬＤＬＲ ＫＯマウスの脂質異常症を改善したことを示している。血漿脂質プロファイル（Ａ－Ｅ）を決定した。ＴＧ／ＨＤＬ （Ｆ）、ＬＤＬ／ＨＤＬ（Ｇ）、ｎｏｎ ＨＤＬ／ＨＤＬ（Ｈ）、および血漿ＶＬＤＬ（Ｉ）の割合を算出した。＃ Ｐ＜０．０５、＃＃ Ｐ＜０．０１、＃＃＃ Ｐ＜０．００１。Ｎ．Ｓ． 有意でない。
【0042】
図２１は、ＬＤＬＲ ＫＯマウスにおける血漿炎症誘発性サイトカインレベルに対するＦ＆Ｖ補給の効果を示す。（Ａ－Ｄ）血清サイトカイン濃度を、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＥＬＩＳＡプラットフォームを用いて決定した。＃ Ｐ＜０．０５、＃＃ Ｐ＜０．０１、＃＃＃ Ｐ＜０．００１。Ｎ．Ｓ 有意でない。
【0043】
図２２は、Ｆ＆Ｖ補給がＬＤＬＲ ＫＯマウスにおけるサイトカインの肝臓ｍＲＮＡレベルを低下させたことを示している。（Ａ－Ｄ）Ｆａｓｎ、ＩＬ－６、ＰＰＡＲｇ、ＳＲＥＢＦ１およびＴＮＦαの肝臓ｍＲＮＡレベルをＲＴｑＰＣＲを用いて定量した。＃ Ｐ＜０．０５。
【0044】
図２３は、Ｓｐｅａｒｍａｎ相関のヒートマップがＬＤＬＲ ＫＯマウスにおける、血漿ＴＮＦαおよび脂質プロファイルに対する大動脈アテローム性動脈硬化性の病変および肝脂肪変性の面積を示すことを示す。＃ Ｐ＜０．０５、＃＃ Ｐ＜０．０１、＃＃＃ Ｐ＜０．００１。
【0045】
図２４は、ＨＦ食餌におけるＦ＆Ｖ補給が腸内細菌多様性を増加させたことを示している。（Ａ）Ｆ＆Ｖ処理はアルファ－多様性を増加させた。（Ｂ）重み付けなしのユニフラック距離による主座標分析プロットは、ＬＦ食餌群およびＨＦ０群からのＨＦ１５食餌群の差異のある集積性を示す。＃＃ Ｐ＜０．０１。Ｎ．Ｓ． 有意でない。
【0046】
図２５は、Ｆ＆Ｖ補給が細菌群生組成を変化させたことを示す。異なる食餌における腸内細菌組成を門レベル（Ａ）、網レベル（Ｂ）、目レベル（Ｃ）、科レベル（Ｄ）および属レベル（Ｅ）で示す。
【0047】
図２６は、Ｆ＆Ｖ補給が細菌群集組成を変化させたことを示す。異なる食餌における腸内細菌組成を門レベル（Ａ）、網レベル（Ｂ）、目レベル（Ｃ）、科レベル（Ｄ）および属レベル（Ｅ）で示す。
【0048】
図２７は、Ｆ＆Ｖ補給がＬＤＬＲ ＫＯマウスにおける脂質異常症を改善したことを示している。（Ａ－Ｄ）（Ａ）コレステロール、（Ｂ）トリグリセリド、（Ｃ）ＨＤＬ、および（Ｅ）ＬＤＬの血漿脂質プロファイル。
【0049】
図２８は、Ｆ＆Ｖ補給がＬＤＬＲ ＫＯマウスにおける血漿サイトカインレベルを低下させたか、または血漿サイトカインレベルに効果しなかったことを示す。（Ａ－Ｈ）血清サイトカイン濃度を、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＥＬＩＳＡプラットフォームを用いて決定した。
【0050】
〔定義〕
本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料が本明細書に記載される実施形態の実施または試験において使用され得るが、いくつかの好ましい方法、組成物、および材料が本明細書に記載される。しかし、本発明の材料および方法を記載する前に、本発明は本明細書に記載される特定の分子、組成物、方法論またはプロトコルに限定されず、これらは日常的な実験および最適化に従って変化し得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は特定のバージョンまたは実施形態を説明することのみを目的としており、本明細書で説明される実施形態の範囲を限定することを意図していないことを理解されたい。
本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料が本明細書に記載される実施形態の実施または試験において使用され得るが、いくつかの好ましい方法、組成物、および材料が本明細書に記載される。しかし、本発明の材料および方法を記載する前に、本発明は本明細書に記載される特定の分子、組成物、方法論またはプロトコルに限定されず、これらは日常的な実験および最適化に従って変化し得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は特定のバージョンまたは実施形態を説明することのみを目的としており、本明細書で説明される実施形態の範囲を限定することを意図していないことを理解されたい。
【0051】
別途定義されない限り、本明細書に用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味をもつ。しかしながら、矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先する。したがって、本明細書に記載される実施形態の文脈において、以下の定義が適用される。
【0052】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は文脈が明らかにそわないことを指示しない限り、複数の参照を含む。
【0053】
本明細書で使用されるように、用語「約」は質量、重量、時間、体積、濃度、またはパーセンテージの値または量を指す場合、特定の量から、いくつかの実施形態では±２０％、いくつかの実施形態では±１０％、いくつかの実施形態では±５％、いくつかの実施形態では±１％、いくつかの実施形態では±０．５％、およびいくつかの実施形態では±０．１％のバリエーションを包含することを意味する。このようなバリエーションは、開示された方法を実行するのに適切である。
【0054】
本明細書で使用されるように、用語「備える」、「含む」、およびこれらの言語的バリエーションは、追加の特徴、素子、方法ステップなどの存在を除外せずに、列挙された特徴、素子、方法ステップなどの存在を意味し、逆に、用語「からなる」およびこれらの言語的バリエーションは、列挙された特徴、素子、方法ステップなどの存在を意味し、通常関連する不純物を除いて、任意の未列挙の特徴、素子、方法ステップなどを除外する。用語「から本質的になる」は列挙された特徴、素子、方法ステップなど、ならびに構成、システム、または方法の基本的性質に実質的に影響を及ぼさない任意の追加の特徴、素子、方法ステップなどを意味する。本明細書の実施形態は、オープンな「備える」なる用語を使用して説明され、そのような実施形態は、複数のクローズドな「からなる」および／または「本質的にからなる」実施形態を包含し、代替的に、そのような用語を使用して特許請求または説明され得る。
【0055】
本明細書中で使用される場合、用語「共投与」およびそのバリエーションは対象への少なくとも２つの薬剤または治療（例えば、本明細書中に開示される組成物および１つ以上の治療剤）の投与をいう。いくつかの実施形態において、２つ以上の薬剤または治療の共投与は同時である。他の実施形態では、第１の薬剤／治療が、第２の薬剤／治療の前に投与される。当業者は、使用される種々の薬剤または治療の製剤および／または投与経路が変化し得ることを理解する。共投与のための適切な投薬量は、当業者によって容易に決定され得る。いくつかの実施形態において薬剤または治療が共投与される場合、それぞれの薬剤または治療はそれらの単独投与に適切な用量よりも低い用量で投与される。したがって、２つ以上の薬剤の共投与が、他の薬剤との共投与を介する薬剤のうちの１つの有益な効果のために、対象に感作をもたらす実施形態においては、共投与が特に望ましい。
【0056】
本明細書中で使用される場合、用語「医薬組成物」は活性剤と担体、不活性または活性との組み合わせを指し、組成物を特に治療的用途に適したものにする。
【0057】
本明細書で使用される「薬学的に許容される」または「薬学的に許容される」という用語は対象に投与された場合に、有害反応、例えば、毒性、アレルギー性、または免疫学的反応を実質的に生じない組成物を指す。
【0058】
本明細書中で使用される場合、「予防する」、「予防」、および「予防すること」という用語は、特定の状態または疾患状態（例えば、代謝障害または肥満の他の合併症）を現在経験していないか、罹患していない対象において、当該特定の状態または疾患状態が生じる可能性を減少させることを意味し得る。例えば、前記用語は必ずしも完全なまたは絶対的な予防を意味しない。例えば、「代謝障害を予防する」という用語は、代謝障害及びその関連状態を現在経験していないか、または診断されていない対象において、代謝障害及びその関連状態が生じる可能性を減少させることを意味する。また、前記用語は特定の状態または疾患状態（例えば、代謝障害）を現在経験していないか、または罹患していない対象において、前記特定の状態または疾患状態の発症を遅延させることを意味し得る。「代謝障害を予防する」ために、組成物または方法は、代謝障害または関連状態の発症を減少させる、および／または遅延させることのみを必要とし、その可能性を完全に遮断するものではない。「予防する」は、（例えば、ヒトを含む哺乳動物において）発症する疾患の発症の可能性を、減少または遅延させるための治療または技術のいかなる投与または適用をも包含する。このような可能性は、集団または個体について評価され得る。
【0059】
本明細書で使用する場合、「治療する」、「治療」、および「治療すること」という用語は、特定の状態、病態（例えば、肥満の代謝障害または他の合併症）、及びそれらの兆候を、現在経験しているかまたは罹患している対象において、その状態又は症状の量または重症度を低減することを意味し、当該用語は必ずしも完全な治療（例えば、状態、疾患、またはその症状の完全な排除）を示すわけではなく、「治療」というタームは疾患に対する治療または技術の任意の投与または適用（例えば、ヒトを含む哺乳動物における）を包含し、疾患を阻害すること、その発症を止めること、疾患を緩和すること、疾患を退縮させること、または喪失、欠失、または欠損した機能を回復または修復すること、または非効率的なプロセスを刺激することを包含する。
【0060】
本明細書中で使用される場合、タームｗ／ｗ（重量／重量）は、重量基準での組成物中の所与の物質の量を指す。例えば、５０％ｗ／ｗのニンジンを含む組成物はニンジンの質量が組成物の全質量の５０％であることを手段する（すなわち、Ｆ＆Ｖの混合物などの組成物１００グラム中のニンジン５０グラム）。
【0061】
本明細書で使用されるとき、用語「食料」および「食品」は、口によって摂取される製品、および、ひいてはその成分を指し、その成分は身体およびその組織の栄養、リフレッシュおよび満足させる目的で、Ｇ．Ｉ．トラクト（Ｇ.Ｉ.ｔｒａｃｔ）中で活性であり、かつ／またはＧ．Ｉ．トラクトによって吸収される。その製品は、ヒトによる消費のために顧客に市販され、販売される。食品および食品および飲料製品の実施例には、茶；スプレッド；アイスクリーム；冷凍果物および野菜；ダイエット食品および飲料を含むスナック；調味料；ならびに料理用補助剤が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、「食品」がタンパク質、炭水化物および／または脂肪を含む材料であり、生育、修復および生命維持プロセスを維持し、エネルギーを供給するために、生物体の身体で使用される。食品はまた、ミネラル、ビタミンおよび調味料などの補助物質を含有してもよい。Ｍｅｒｒｉａｍ－Ｗｅｂｓｔｅｒ’ｓ Ｃｏｌｌｅｇｉａｔｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、１０ｔｈ 版、１９９３を参照されたい。
【0062】
本明細書で使用される「食品添加物」（例えば、２１ Ｃ．Ｐ．Ｒ．１７０．３のＦＤＡによって定義される）（ｅ）（ｌ））は、直接および間接添加剤を含む。
【0063】
本明細書中で使用される場合、「栄養補助食品」は、食事を補うことが意図される製品である。いくつかの実施形態では、栄養補助食品がカロリーをほとんどまたは全く含まない。
【0064】
本明細書中で使用される場合、用語「対象」は哺乳動物を含む動物界の全てのメンバーを含み、そして適切にはヒトをいう。
【0065】
〔発明の詳細な説明〕
肥満による脂肪組織（特に、内臓白色脂肪組織）の変化は、浸潤マクロファージおよび他の炎症細胞、単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）および腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）などのサイトカインおよびケモカインの放出、脂肪分解の亢進、脂肪細胞の死などを特徴とし、いずれもＮＡＦＬＤの病態形成に重要な役割を果たしている（Ｃｈｅｎｇら、２０１５年；Ｗｅｉら、２０１８年）。特に、ＴＮＦαは、マウスモデルにおけるＮＡＦＬＤの進展および進行において中心的な役割を果たすことが見出されている。ＴＮＦαの高循環量は病的肥満患者におけるＮＡＦＬＤの重症度と関連している（Ｋａｋｉｎｏら、２０１８年；Ｐａｒｅｄｅｓ－Ｔｕｒｒｕｂｉａｒｔｅら、２０１６年）。ＴＮＦαは肝臓セラミド生成を刺激し（Ｄｂａｉｂｏら、２００１年；Ｅｎｇｉｎ、２０１７年）、これはＮＡＦＬＤの病因に関与するスフィンゴ脂質シグナル伝達脂質分子のユニークなクラスであり（Ｎｉｋｏｌｏｖａ－Ｋａｒａｋａｓｈｉａｎ、２０１８年）、ＴＮＦαおよびセラミドがＮＡＦＬＤを相加的または相乗的に促進し得ることを示す。セラミドはｄｅ ｎｏｖｏ合成経路によって、またはセラミド合成酵素を用いたサルベージ経路を介して形成される。スフィンゴミエリンはまた、酵素スフィンゴミエリナーゼの機能を介してスフィンゴミエリンから産生され得、その活性は、酸化ストレスおよびＴＮＦαによって増加される。
肥満による脂肪組織（特に、内臓白色脂肪組織）の変化は、浸潤マクロファージおよび他の炎症細胞、単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）および腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）などのサイトカインおよびケモカインの放出、脂肪分解の亢進、脂肪細胞の死などを特徴とし、いずれもＮＡＦＬＤの病態形成に重要な役割を果たしている（Ｃｈｅｎｇら、２０１５年；Ｗｅｉら、２０１８年）。特に、ＴＮＦαは、マウスモデルにおけるＮＡＦＬＤの進展および進行において中心的な役割を果たすことが見出されている。ＴＮＦαの高循環量は病的肥満患者におけるＮＡＦＬＤの重症度と関連している（Ｋａｋｉｎｏら、２０１８年；Ｐａｒｅｄｅｓ－Ｔｕｒｒｕｂｉａｒｔｅら、２０１６年）。ＴＮＦαは肝臓セラミド生成を刺激し（Ｄｂａｉｂｏら、２００１年；Ｅｎｇｉｎ、２０１７年）、これはＮＡＦＬＤの病因に関与するスフィンゴ脂質シグナル伝達脂質分子のユニークなクラスであり（Ｎｉｋｏｌｏｖａ－Ｋａｒａｋａｓｈｉａｎ、２０１８年）、ＴＮＦαおよびセラミドがＮＡＦＬＤを相加的または相乗的に促進し得ることを示す。セラミドはｄｅ ｎｏｖｏ合成経路によって、またはセラミド合成酵素を用いたサルベージ経路を介して形成される。スフィンゴミエリンはまた、酵素スフィンゴミエリナーゼの機能を介してスフィンゴミエリンから産生され得、その活性は、酸化ストレスおよびＴＮＦαによって増加される。
【0066】
肝臓に豊富に発現する核内受容体であるファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）は、様々な肝代謝過程を制御する重要な調節因子である。肝臓ＦＸＲ活性化はＮＦκＢ活性化をブロックすることによって、ＴＮＦαの発現を含む炎症誘発性遺伝子の発現を阻害する（Ｋｉｍら、２０１５年；Ｗａｎｇら、２００８年）。さらに、肝臓ＦＸＲ発現量はＮＡＦＬＤ患者（Ｙａｎｇら、２０１０年）および食餌誘発マウスＮＡＦＬＤ（Ｎｉｅら、２０１７年）において低かった。ＦＸＲはＮＡＦＬＤ処置用の潜在的な薬物標的である（Ａｌｉら、２０１５年；Ｌｉら、２０１３年）。
【0067】
腸内細菌叢の多様性が低く、組成が変化していることを特徴とする腸内細菌叢障害（gut microbial dysbiosis）は、ヒトにおける肥満および代謝障害と関連することが示されており（Ｑｉｎら、２０１２年；Ｔｕｒｎｂａｕｇｈら、２００９年）、げっ歯類モデルにおけるこれらの障害と因果関係があることが示されている（Ｋｒｉｓｓら、２０１８年；Ｌｉら、２０１７年；Ｒｉｄａｕｒａら、２０１３年）。さらに、腸内細菌叢障害は、ＮＡＦＬＤの病因に寄与し得る（Ｂｉｂｂｏら、２０１８年；Ｓａｌｔｚｍａｎら、２０１８年；Ｗｉｅｌａｎｄら、２０１５年）。
【0068】
食事パターンは腸内細菌叢、酸化ストレス、炎症、および代謝に影響を及ぼす（Ｋｏｎｇら、２０１４年；Ｓｈｅｆｌｉｎら、２０１７年；Ｔｉｎｄａｌｌら、２０１８年；Ｗｏｎｇ、２０１４年）。本明細書中に記載される実験は、代謝障害およびその基礎となるメカニズムにおけるＦ＆Ｖの消費の増加に対する影響を測定した。結果は、様々なＦ＆Ｖの高摂取によって、体重減少とは無関係に、脂肪組織およびＮＡＦＬＤの代謝機能障害を完全に予防することを示した。さらに、これらのデータは、代謝障害に対するＦ＆Ｖのこれらの作用が腸内細菌叢の多様性の増加ならびに炎症誘発性サイトカインおよびセラミド量の減少と関連していることを示している。
【0069】
さらなる実験によって、ＨＦ飼料を与えたマウスがＬＦ飼料を与えたマウスよりも血漿ＴＧおよびＬＤＬ量が有意に高く、ＨＤＬ量が有意に低く、脂質異常症はＦ＆Ｖ補給により防止されることを実証した。さらに、ＨＦ＋ＦＶ群はＨＦ０群と比較して血漿ＴＮＦα量が低かった（ｐ＜０．０５）。Ｓｐｅａｒｍａｎ相関分析は大動脈アテローム性動脈硬化病変と脂肪肝面積が血漿ＨＤＬと負に相関し（ｐ＜０．００１）、ＴＮＦαならびにＬＤＬ／ＨＤＬ、ＴＧ／ＨＤＬ、およびｎｏｎ ＨＤＬ／ＨＤＬの割合と有意に正に相関していた。
【0070】
したがって、いくつかの実施形態において、本明細書では例えば、１２個の果物および１２個の野菜（例えば、図１０Ａ～Ｃに記載されている）の凍結乾燥混合物を含むＦ＆Ｖの製剤、ならびに代謝障害、肥満および関連疾患に関連する徴候、症状および合併症を治療、予防、およびそのリスクを低減する組成物を使用する方法、を提供する。
【0071】
本開示は、特定の果物および野菜、またはＦ＆Ｖ組成物の成分に限定されない。いくつかの実施態様において、果物種は例えば、オレンジ、リンゴ、バナナ、ブドウ、スイカ、パイナップル、イチゴ、カンタロープ、レモン、グレープフルーツ、モモまたはセイヨウナシから選択される１種以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または全て）の果物種である。いくつかの実施形態において、野菜種は例えば、ジャガイモ、トマト、スイートコーン、タマネギ、タマヂシャ、ロマイン、ピーマン、ニンジン、キュウリ、キャベツ、豆、またはサツマイモから選択される１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または全て）である。
【0072】
いくつかの実施形態において、果物種および野菜種の混合物は、１６～２０％のオレンジ、１４～１８％のトマト、８～１１％のリンゴ、１３～１６％のジャガイモ、３．０～５．５％のバナナ、３～４％のスイートコーン、３～４％のブドウ、２～３％のレタス、１～２％のキクヂシャ、１～２％の芽キャベツ、１～２％のキャベツ、１～２％のニンジン、１～３％のタマネギ、１～２％のグリーンピース、０．５～１．５％のスイカ、０．５～１．５％のハネデューメロン、０．５～１．５％のブロッコリー、１～２％のホウレンソウ、０．５～１．５％のピーマン、０．５～１．５％のサヤインゲン、０．５～１．５％のカンタロープ、０．４～１．２％のカリフラワー、０．５～１．０％のマンゴー、０．５～１．０％のパパイヤ、０．３～０．９％のセロリ、０．４～１．２％のキュウリ、０．５～１．０％のパイナップル、０．２５～０．７５％のタンジェリン、０．２５～０．７５％のライム、０．２５～０．７５％のイチゴ、０．２５～０．７５％のラズベリー、０．２５～０．７５％のグレープフルーツ、０．２５～０．７５％のレモン、０．２５～０．７５％のクランベリー、０．３～０．５％のプラム、０．３～０．５％のモモ、０．３～０．５％のチェリー、０．３～０．５％のブルーベリー、０．３～０．５％のアプリコット、０．１～０．１５％の乾燥エンドウ、０．１～０．１５％のグレートノーザンビーン、０．１～０．１５％の乾燥白インゲンマメ、０．１～０．１５％の乾燥レンズマメ、０．１～０．１５％のピントビーン、０．１～０．１５％のライマメ、０．１～０．１５％のレッドキドニービーン、および、０．１～０．１５％のブラックビーン（例えば、約１８．０７５％のオレンジ、１６．１６１％のトマト、９．５９５％のリンゴ、１４．４９３％のジャガイモ、４．３７３％のバナナ、３．５６４％のスイートコーン、３．３８３％のブドウ、２．５３７％のレタス、１．６５１％のキクヂシャ、１．３７５％の芽キャベツ、１．３７５％のキャベツ、１．３２９％のニンジン、２．０１７％のタマネギ、１．２９３％のグリーンピース、１．０５８％のスイカ、１．０５８％のハネデューメロン、０．８４％のブロッコリー、１．６５１％のホウレンソウ、１．０８７％のピーマン、１．０６１％のサヤインゲン、１．０５８％のカンタロープ、０．８４％のカリフラワー、０．７３２％のマンゴー、０．７３２％のパパイヤ、０．６２６％のセロリ、０．８１４％のキュウリ、０．７３２％のパイナップル、０．５５５％のタンジェリン、０．５５５％のライム、０．４３７％のイチゴ、０．４３７％のラズベリー、０．５５５％のグレープフルーツ、０．５５５％のレモン、０．４３７％のクランベリー、０．３８８％のプラム、０．３８８％のモモ、０．３８８％のチェリー、０．４３７％のブルーベリー、０．３８８％のアプリコット、０．１２１％の乾燥エンドウ、０．１２１％のグレートノーザンビーン、０．１２１％の乾燥白インゲンマメ、０．１２１％の乾燥レンズマメ、０．１２１％のピントビーン、０．１２１％のライマメ、０．１２１％のレッドキドニービーン、および０．１２１％のブラックビーン）を含む。割合はすべて、Ｆ＆Ｖ混合物のｗ／ｗ％である。
【0073】
いくつかの実施形態において、組成物は、平均的な成人に推奨されるＦ＆Ｖの１日量（例えば、１人分）の少なくとも５（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５以上）を提供する（例えば、health.gov/dietaryguidelines/dga2000/document/build.htm；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、いくつかの実施形態において、平均的な成人の１日量の１回投与であることが意図される組成物は、４０～６５ｇの乾燥粉末（例えば、±１、５、１０、１５、または２０％）を含む。量は、特定の食事の必要性がある小児または個人に合わせて調整される。
【0074】
いくつかの実施形態において、組成物は、複数のポリフェノールおよび他の有用な分子または化合物を含む。例えば、いくつかの実施形態において、Ｆ＆Ｖ混合物は、１５～２５％のヘスペレチン、１５～２５％のカフェオイルキニン酸、１０～２０％のクエルセチン、および５～１５％のマルビジン（例えば、２０．６％のヘスペレチン、１９．１％のカフェオイルキニン酸、１５．７％のクエルセチン、および１０．３％のマルビジン）のポリフェノール含有量を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、１～１０％のナリンゲニン、１～１０％のペラルゴニジン、１～５％のカテキン、および１～５％のプロシアニジン（例えば、６．５％のナリンゲニン、５．８％のペラルゴニジン、４．２％のカテキン、および３．１％のプロシアニジン）をさらに含む。割合はすべて、Ｆ＆Ｖ混合物のｗ／ｗ％である。いくつかの実施形態において、組成物は例えば、カフェイン酸、ペオニジン、シアニジン、ピノレシノール、ｐ－クマロイル、ルテオリン、ペチュニジン、ダイゼイン、ゲニステイン、エラグ酸、または没食子酸から選択される１つ以上のポリフェノールをさらに含む。
【0075】
いくつかの実施形態において、組成物は乾燥粉末として提供される。いくつかの実施形態において、粉末は凍結乾燥粉末（例えば、実施例１に記載されるように調製される）として提供される。
【0076】
粉末をカプセル化して、液体消耗品、乳製品および乳製品代替品、棒状の固形物、およびサッシ（sash）に添加するという様々な形態で使用されるが、これらに限定されない。また、異なる形状および一貫性を有する製品を作り出すために、３Ｄ印刷を使用して印刷してもよい。
【0077】
いくつかの実施形態において、組成物は粉末として提供され、使用者は粉末を飲料または食品に添加する。いくつかの実施形態において、組成物は、すぐに食べられる飲料または食品として提供される。
【0078】
いくつかの実施形態において、食品または飲料製品は、Ｆ＆Ｖ組成物の２％～２０％（例えば、５～１５％、５～２０％、または５～１０％（ｗ／ｗ））を含む。
【0079】
いくつかの実施形態において、飲料、栄養補助食品または食品は、０～６０％のタンパク質（ｋｃａｌ／ｋｃａｌ）、０～９９％の炭水化物（ｋｃａｌ／ｋｃａｌ）、および０～６０％の脂肪（ｋｃａｌ／ｋｃａｌ）（例えば、５～１５％のタンパク質（ｋｃａｌ／ｋｃａｌ）、７５～８５％の炭水化物（ｋｃａｌ／ｋｃａｌ）、および０～２０％の脂肪（ｋｃａｌ／ｋｃａｌ）；１０～１２％のタンパク質（ｋｃａｌ／ｋｃａｌ）、８０～８３％の炭水化物（ｋｃａｌ／ｋｃａｌ）、および５～１０％の脂肪（ｋｃａｌ／ｋｃａｌ）、または、１１．６％のタンパク質（ｋｃａｌ／ｋｃａｌ）、８１．２％の炭水化物、および７．２％の脂肪（ｋｃａｌ／ｋｃａｌ）を含む（全組成の割合）。
【0080】
いくつかの実施形態において、組成物は、経口デリバリー用の栄養補助食品または医薬製剤として提供される。
【0081】
いくつかの実施形態において、本開示は、薬学的に受容可能な担体と組み合わせて、１つ以上の前述の成分を含む、サプリメント組成物を提供する。担体の実際の形態、したがって組成物自体は重要ではない。担体は、液体、ゲル、ゲルキャップ、カプセル、粉末、固体錠剤（コーティングされたカプレットまたはコーティングされていない）、茶などであってもよい。この場合、組成物は好ましくは錠剤またはカプセルの形態であり、最も好ましくは軟質ゲルカプセルの形態である。適切な賦形剤および／または担体には、マルトデキストリン、炭酸カルシウム、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、微結晶セルロース、デキストロース、米粉、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、クロスカルメロースナトリウム、ナトリウムデンプングリコレート（ｓｏｄｉｕｍ ｓｔａｒｃｈ ｇｌｙｃｏｌａｔｅ）、クロスポビドン、スクロース、植物ガム、ラクトース、メチルセルロース、ポビドン、カルボキシメチルセルロース、トウモロコシデンプンなどが含まれる（これらの混合物を含む）。好ましい担体には、炭酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、マルトデキストリン、およびそれらの混合物が含まれる。種々の成分および賦形剤および／または担体は、従来の技術を用いて、混合され、所望の形態に形成される。錠剤またはカプセルは、約６．０～７．０のｐＨで溶解する腸溶コーティングでコーティングされてもよい。小腸では溶解するが、胃では溶解しない適切な腸溶コーティングは酢酸フタル酸セルロースである。製剤および投与のための技術についてのさらなる詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ）の最新版に見出され得る。
【0082】
栄養補助食品は、栄養補助食品によって食品に加えられるカロリーの数を制限することが望ましい場合は特に、１つ以上の不活性成分を含んでもよい。例えば、栄養補助食品はまた、例えば、ハーブ、ビタミン、ミネラル、エンハンサー、着色剤、甘味料、香味料、不活性成分などを含む任意の成分を含有する可能性がある。
【0083】
さらなる実施形態では、組成物がアセトアルデヒド、アセトイン（アセチルメチルカルビノール）、アネトール（パラプロペニルアニソール）、ベンズアルデヒド（ベンゾイックアルデヒド）、Ｎ酪酸（ブタン酸）、ｄ又はＩカルボン（カルボル）、ケイ皮アルデヒド（シナミックアルデヒド）、シトラール（２，６ジメチルオクタジエン ２，６ ａｌ ８、ゲラ ニアル ネラル）、デカナール（Ｎデシルアルデヒド、カプルアルデヒド（ｃａｐｒａｌｄｅｈｙｄｅ）、カプリックアルデヒド、カプリンアルデヒド、アルデヒドＣ １０）、エチルアセテート、エチルブチレート、３メチル３フェニルグリシジック酸エチルエステル（エチルメチルフェニルグリシデート、イチゴアルデヒド、Ｃ１６アルデヒド）、エチルバニリン、ゲラニオール（３，７ジメチル２，６および３，６オクタジエン １オール）、ゲラニルアセテート（ゲラニオールアセテート）、リモネン（ｄ，ｌ及びｄｌ）、リナロール（ｌｉｎａｌｏｌ、３，７ジメチル１，６オクタジエン３オール）、リナリルアセテート（ベルガモール）、メチルアントラニレート（２アミノベンゾエートメチル）、ピペロナール（３，４メチレンジオキシベンズアルデヒド、ヘリオトロピン）、バニリン、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ ｌ．）、アルスパイス（Ｐｉｍｅｎｔａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、アンブレット シード（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ）、アンジェリック（Ａｎｇｅｌｉｃａ ａｒｃｈａｎｇｅｌｉｃａ）、アンゴスツーラ（Ａｎｇｏｓｔｕｒａ）（Ｇａｌｉｐｅａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、アニス（Ｐｉｍｐｉｎｅｌｌａ ａｎｉｓｅ）、スターアニス（Ｉｌｌｉｃｉｕｍ ｖｅｒｕｍ）、バーム（ｂａｌｍ）（Ｍｅｌｉｓｓａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、バジル（Ｏｃｉｍｕｍ ｂａｓｉｌ）、ベイ（ｂａｙ）（Ｌａｕｒｕｓ ｎｏｂｉｌｉｓ）、カレンヅラ（ｃａｌｅｎｄｕｌａ）（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、（Ａｎｔｈｅｍｉｓ ｎｏｂｉｌｉｓ）、トウガラシ（ｃａｐｓｉｃｕｍ）（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、カラウェー（ｃａｒａｗａｙ） （Ｃａｒｕｍ ｃａｒｖｉ）、ｃａｒｄａｍｏｍ（Ｅｌｅｔｔａｒｉａ ｃａｒｄａｍｏｍｕｍ）、カッシア（ｃａｓｓｉａ）（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｃａｓｓｉａ）、粉末トウガラシ（ｃａｙｅｎｎｅ ｐｅｐｐｅｒ）（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、セロリーの種子（Ｃｅｌｅｒｙ ｓｅｅｄ）（Ａｐｉｕｍ ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）、チャービル（ｃｈｅｒｖｉｌ） （Ａｎｔｈｒｉｓｃｕｓ ｃｅｒｅｆｏｌｉｕｍ）、チャイブ（ｃｈｉｖｅｓ）（Ａｌｌｉｕｍ ｓｃｈｏｅｎｏｐｒａｓｕｍ）、コリアンダー（Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、クミン（Ｃｕｍｉｎｕｍ ｃｙｍｉｎｕｍ）、エルダーフラワー（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、フェンネル（Ｆｏｅｎｉｃｕｌｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、フェヌグリーク（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ ｆｏｅｎｕｍ ｇｒａｅｃｕｍ）、ジンジャー（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、ニガハッカ（Ｍａｒｒｕｂｉｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ホースラディッシュ（Ａｒｍｏｒａｃｉａ ｌａｐａｔｈｉｆｏｌｉａ）、ヒッソプ（Ｈｙｓｓｏｐｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、ラベンダー（Ｌａｖａｎｄｕｌａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、マセ（Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ ｆｒａｇｒａｎｓ）、マジョラム（Ｍａｊｏｒａｎａ ｈｏｒｔｅｎｓｉｓ）、マスタード（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎｉｇｒａ、 Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ、 Ｂｒａｓｓｉｃａ ｈｉｒｔａ）、ナツメグ（Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ ｆｒａｇｒａｎｓ））、パプリカ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）、ブラックペッパー（Ｐｉｐｅｒ ｎｉｇｒｕｍ）、ペパーミント（Ｍｅｎｔｈａ ｐｉｐｅｒｉｔａ）、ケシ種子（Ｐａｐａｙｅｒ ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）、ローズマリー（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、サッフェロン（Ｃｒｏｃｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、セージ（Ｓａｌｖｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、サボリー（Ｓａｔｕｒｅｉａ ｈｏｒｔｅｎｓｉｓ、Ｓａｔｕｒｅｉａ ｍｏｎｔａｎａ）、ゴマ（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）、スペアミント（Ｍｅｎｔｈａ ｓｐｉｃａｔａ）、タラゴン（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ）、タイム（Ｔｈｙｍｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｔｈｙｍｕｓ ｓｅｒｐｙｌｌｕｍ）、ターメリック（Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ）、バニラ（Ｖａｎｉｌｌａ ｐｌａｎｉｆｏｌｉａ）、ガジュツ（Ｃｕｒｃｕｍａ ｚｅｄｏａｒｉａ）、スクロース、グルコース、サッカリン、ソルビトール、マンニトール、アスパルテームなどの少なくとも１つの食品香料を含む。他の適切な風味剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ｐ．１２８８－１３００ （１９９０）、およびＦｕｒｉａ ａｎｄ Ｐｅｌｌａｎｃａ、Ｆｅｎａｒｏｌｉ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌａｖｏｒ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ、Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ、（１９７１）に開示されているようなものが当業者に知られている。
【0084】
他の実施形態では、組成物が少なくとも１つの合成または天然食品着色剤（例えば、アナット抽出物、アスタキサンチン、ビート粉末、ウルトラマリンブルー、カンタキサンチン、カラメル、カロテナール、ベータカロチン、カルミン、トーストされた綿実粉、グルコン酸第一鉄、乳酸鉄、ブドウ色抽出物、ブドウ皮抽出物、酸化鉄、果汁、野菜ジュース、乾燥藻類ミール、マンジュギクミール、ニンジン油、トウモロコシ内乳油、パプリカ、パプリカオレオレジン、リボフラビン、サフロン、ターメリック、ターメリックおよびオレオレジン）を含む。
【0085】
好ましい単位用量製剤は、本明細書中上記に列挙したような１日用量または単位、１日サブ用量、またはその適切な画分の薬剤を含有するものである。いくつかの実施形態では、特定の対象に対して、単位用量が１回以上の用量で提供される、少なくとも推奨される１日レベルの果物および野菜を含む（例えば、推奨される１日の食事回数の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５回、またはそれ以上）。
【0086】
特定の被験者に対する１日の要件は年齢、性別等に基づいて変化する（例えば、ｈｅａｌｔｈ．ｇｏｖ／ｄｉｅｔａｒｙｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ／ｄｇａ２０００／ｄｏｃｕｍｅｎｔ／ｂｕｉｌｄ．ｈｔｍを参照されたい）。例えば、１日当たりの推奨される野菜の提供回数は３～５回で変化し、果物の提供回数は２～４回で変化する。いくつかの実施形態では、１杯の生葉野菜、１／２カップの調理済みまたは生の他の野菜、３／４カップの野菜ジュース、１つのミディアムのリンゴ、バナナ、オレンジ、セイヨウナシ、１／２カップのみじん切りされたか、調理済みか、又は、缶詰のフルーツ、または３／４カップのフルーツジュースに相当する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物が２０～８０（例えば、３０～７０、３０～６０、または４０～６５ｇ／日）のＦ＆Ｖ混合物（例えば、８～９人分のＦ＆Ｖ）の日用量または単位用量として提供される。量は、特定の対象の食事の必要性に基づいて調節される。
【0087】
本開示の組成物および方法は、他の適切な組成物および治療法と組み合わせることも意図される。例えば、本明細書に記載の組成物は、代謝障害および肥満の他の合併症を処置および予防するために適切な１つ以上のさらなる薬剤と共投与され得る。
【0088】
本明細書に記載のＦ＆Ｖ組成物は、肥満および代謝障害に関連する多くの様々な状態の治療、予防、およびリスクの低減における使用される。例として、体重増加、肥満、炎症状態、脂肪肝疾患、高コレステロール、グルコース不耐性、インスリン抵抗性、低腸内細菌叢多様性、心疾患、およびアテローム性動脈硬化症が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、対象における脂肪量の減少、筋肉量の増加、炎症性サイトカインおよび／またはセラミドの減少、組織炎症の減少、コレステロールの減少、耐糖能の改善、免疫応答の改善、腸内細菌叢の多様性の増加、寿命の増加、認知の改善、および／または骨の健康の改善に、組成物は使用される。
【0089】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＦ＆Ｖ組成物が、本明細書に記載の障害または状態と診断されるか、またはその危険性があるか、または、さもなければ必要とされる対象に投与される。いくつかの実施形態では、対象は肥満であるかまたは肥満ではない。いくつかの実施形態では、対象は本明細書に記載の疾患または状態（例えば、家族歴、過体重など）の１つ以上の危険因子を有する。いくつかの実施形態では、対象が定期的に推奨される１日レベルのＦ＆Ｖを消費しない。
【0090】
いくつかの実施形態では、投与が本明細書に記載される、指数（例えば、兆候、症状、検査結果）または障害、状態、または合併症を減少させる。いくつかの実施形態では、投与が、そのような、兆候または症状を示さない個体において、前記兆候、症状、または検査結果が発症するリスクを予防又は低減する。
【0091】
いくつかの実施形態では、投与は、少なくとも１週間の期間（例えば、少なくとも１ヶ月、少なくとも１年、複数年、または無期限）、１日当たり１回以上（例えば、１、２、３、またはそれ以上）繰り返される。
【0092】
〔実施例〕
〔実施例１〕果物と野菜の混合物はマウスの食餌誘発性脂肪肝を予防する
〔実施例１〕果物と野菜の混合物はマウスの食餌誘発性脂肪肝を予防する
【0093】
＜方法＞
（動物および食餌）
食餌組成を表１～５に示す。４週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスをThe Jackson Laboratory（Bar Harbor, ME, USA）から購入し、Tufts UniversityのJean Mayer USDA Human Nutrition Research Centeron Agingの動物管理施設に収容した。順化してから１２日後、個々にケージに入れた動物を９つの体重対応群（weight-matched group）に割り当てた。当該群には、標準マウス食餌［Ｂａｓａｌ（Ｂ０）、１６ｋｃａｌ％脂肪、ＡＩＮ－９３Ｇ；Research Diets、＃Ｄ１００１２Ｇ）、高脂肪食餌（ＨＦ０、４５ｋｃａｌ％脂肪、Research Diets、＃Ｄ１２４５１Ｍ）、ＨＦ食餌用の低脂肪対応対照（match control）（ＭＣ、１０．０ｋｃａｌ％脂肪、Research Diets、＃Ｄ１２４５０Ｈ）、ならびに、５％、１０％、および１５％の果物および野菜（Ｆ＆Ｖ）混合物を補充したＢ０およびＨＦ０を含む（それぞれ下記参照）。Ｆ＆Ｖ粉末の有無にかかわらず、動物飼料の栄養素含量を表３に示す。マウスにそれぞれの食餌を２０週間自由に与え、その間、それぞれの時点で、体重、食物摂取量、および体組成を含む異なる結果変数を記録し、分析した。
（動物および食餌）
食餌組成を表１～５に示す。４週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスをThe Jackson Laboratory（Bar Harbor, ME, USA）から購入し、Tufts UniversityのJean Mayer USDA Human Nutrition Research Centeron Agingの動物管理施設に収容した。順化してから１２日後、個々にケージに入れた動物を９つの体重対応群（weight-matched group）に割り当てた。当該群には、標準マウス食餌［Ｂａｓａｌ（Ｂ０）、１６ｋｃａｌ％脂肪、ＡＩＮ－９３Ｇ；Research Diets、＃Ｄ１００１２Ｇ）、高脂肪食餌（ＨＦ０、４５ｋｃａｌ％脂肪、Research Diets、＃Ｄ１２４５１Ｍ）、ＨＦ食餌用の低脂肪対応対照（match control）（ＭＣ、１０．０ｋｃａｌ％脂肪、Research Diets、＃Ｄ１２４５０Ｈ）、ならびに、５％、１０％、および１５％の果物および野菜（Ｆ＆Ｖ）混合物を補充したＢ０およびＨＦ０を含む（それぞれ下記参照）。Ｆ＆Ｖ粉末の有無にかかわらず、動物飼料の栄養素含量を表３に示す。マウスにそれぞれの食餌を２０週間自由に与え、その間、それぞれの時点で、体重、食物摂取量、および体組成を含む異なる結果変数を記録し、分析した。
【0094】
（乾燥果物・野菜（Ｆ＆Ｖ）粉末製剤）
ＵＳＤＡ国勢調査データに基づいて最も一般的に消費されているＦ＆Ｖの２４の組み合わせを含むＦ＆Ｖ混合物をホモジナイズして、凍結乾燥粉末を調製した（Ｆ＆Ｖ組成物については表１０Ａ～Ｂを参照のこと）。米国の消費パターンを模倣するために、Ｆ＆Ｖ混合物中の個々の果物または野菜の割合を、米国における毎年のＦ＆Ｖ消費の相対的割合に基づいて計算した。新鮮な果物および野菜を食料品店から購入し、次いで洗浄し、食用部分のみを得るためにカットした。次に、食用部分を３００００ｒｐｍのミキサー中で毎回１５～２０秒、合計２分間混合させて、果物および野菜のホモジェネートを調製した。Ｆ＆Ｖホモジェネートをステンレス鋼容器に保存し、アルミニウム箔で包み、－８０℃の冷凍庫で一晩冷凍した。次いで、凍結Ｆ＆Ｖ混合物を、３００ｍＴｏｒｒの真空度および棚温度を－２０℃に設定した凍結乾燥機チャンバー（VirTis Freezemobile 35XL Freeze Dryer）に入れた。次に、棚温度を１時間毎に１０℃上昇させた。最大棚温度は２０℃である。Ｆ＆Ｖ混合物を４日間で完全に乾燥させた。乾燥混合物を同じ設定で同じミキサーで粉砕して微粉末を得た。動物用食餌調製に使用するまで－８０℃の冷凍庫において微粉末をプラスチックバッグ中に保存した。
ＵＳＤＡ国勢調査データに基づいて最も一般的に消費されているＦ＆Ｖの２４の組み合わせを含むＦ＆Ｖ混合物をホモジナイズして、凍結乾燥粉末を調製した（Ｆ＆Ｖ組成物については表１０Ａ～Ｂを参照のこと）。米国の消費パターンを模倣するために、Ｆ＆Ｖ混合物中の個々の果物または野菜の割合を、米国における毎年のＦ＆Ｖ消費の相対的割合に基づいて計算した。新鮮な果物および野菜を食料品店から購入し、次いで洗浄し、食用部分のみを得るためにカットした。次に、食用部分を３００００ｒｐｍのミキサー中で毎回１５～２０秒、合計２分間混合させて、果物および野菜のホモジェネートを調製した。Ｆ＆Ｖホモジェネートをステンレス鋼容器に保存し、アルミニウム箔で包み、－８０℃の冷凍庫で一晩冷凍した。次いで、凍結Ｆ＆Ｖ混合物を、３００ｍＴｏｒｒの真空度および棚温度を－２０℃に設定した凍結乾燥機チャンバー（VirTis Freezemobile 35XL Freeze Dryer）に入れた。次に、棚温度を１時間毎に１０℃上昇させた。最大棚温度は２０℃である。Ｆ＆Ｖ混合物を４日間で完全に乾燥させた。乾燥混合物を同じ設定で同じミキサーで粉砕して微粉末を得た。動物用食餌調製に使用するまで－８０℃の冷凍庫において微粉末をプラスチックバッグ中に保存した。
【0095】
Ｆ＆Ｖ粉末を、０％、５％、１０％または１５％の食餌と置き換えて、ｗ／ｗベースで実験食餌に組み込んだ。食餌に関する栄養情報を以下の表２～５に示す。表２は、Ｆ＆Ｖ粉末中のポリフェノールの算出量に関する。表３は、Ｆ＆Ｖ粉末を含むまたは含まない、動物食餌中の栄養素量に関する。表４は、Ｆ＆Ｖ粉末を含むまたは含まない、動物食餌中のポリフェノールおよび総抗酸化剤の量に関する。表５は、Ｆ＆Ｖ粉末を含むまたは含まない、動物食餌中の総繊維、可溶性繊維および不溶性繊維を含む繊維の量に関する。
【0096】
雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを９つの食餌群（１２マウス／群）の１つに割り当てた。食餌を２０週間自由に与え、マウスの体重を毎週測定し、食餌摂取量を記録した。
・１５週目に、総脂肪量および除脂肪体重をＭＲＩで測定した。
・マウスの糞便サンプルを１８週目に採取し、ボンベ熱量計によるエネルギー量の測定および細菌叢分析のために－８０℃フリーザーに保存した。
・２０週後にマウスを安楽死させた。血液試料を採取した。血清を分離し、さらなる分析のために－８０℃で保存した。肝臓および脂肪組織をホルマリン中で部分的に固定し、液体窒素中で部分的にまず凍結させ、次いで保存のために－８０℃に移した。固定した肝臓と脂肪組織を病理組織学的に処理し、脂質蓄積および炎症をそれぞれ測定した。
・凍結脂肪組織試料を用いて、ＲＴｑＰＣＲにより炎症誘発性分子のｍＲＮＡ量を分析した。
・１５週目に、総脂肪量および除脂肪体重をＭＲＩで測定した。
・マウスの糞便サンプルを１８週目に採取し、ボンベ熱量計によるエネルギー量の測定および細菌叢分析のために－８０℃フリーザーに保存した。
・２０週後にマウスを安楽死させた。血液試料を採取した。血清を分離し、さらなる分析のために－８０℃で保存した。肝臓および脂肪組織をホルマリン中で部分的に固定し、液体窒素中で部分的にまず凍結させ、次いで保存のために－８０℃に移した。固定した肝臓と脂肪組織を病理組織学的に処理し、脂質蓄積および炎症をそれぞれ測定した。
・凍結脂肪組織試料を用いて、ＲＴｑＰＣＲにより炎症誘発性分子のｍＲＮＡ量を分析した。
【0097】
（体組成分析）
体組成（％脂肪組織および％除脂肪組織）を、げっ歯類磁気共鳴イメージングシステム（Whole Body Composition Analyzer, EchoMRI, Houston, TX）を使用して１５週齢で評価した。
体組成（％脂肪組織および％除脂肪組織）を、げっ歯類磁気共鳴イメージングシステム（Whole Body Composition Analyzer, EchoMRI, Houston, TX）を使用して１５週齢で評価した。
【0098】
（糞便エネルギー密度測定法）
糞便エネルギー密度は、ＰＡＲＲ ６２００ Ｉｓｏｐｅｒｉｂｏｌ熱量計（Parr Instrument Company, Moline, IL, USA）を用いて、製造業者の指示に従って測定した。
糞便エネルギー密度は、ＰＡＲＲ ６２００ Ｉｓｏｐｅｒｉｂｏｌ熱量計（Parr Instrument Company, Moline, IL, USA）を用いて、製造業者の指示に従って測定した。
【0099】
（脂肪組織構造と脂肪細胞のサイズ決定）
精巣上体脂肪組織を切開および固定し、パラフィンに包埋して切片化した。切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。Ｈ＆Ｅ染色した精巣上体脂肪組織切片の脂肪細胞のサイズを、以前に報告された方法に基づいて測定した（Parleeら、２０１４年）。簡単に説明すると、Ｈ＆Ｅ染色した精巣上体脂肪組織のデジタル画像をオリンパスＦＳＸ１００光学顕微鏡で取得し、それぞれの脂肪細胞の面積（μｍ２）をタッチスクリーンラップトップコンピュータによって手動で決定した。データは、計数した脂肪細胞の総数（％合計）と比較した脂肪細胞の頻度（frequency）として表した。
精巣上体脂肪組織を切開および固定し、パラフィンに包埋して切片化した。切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。Ｈ＆Ｅ染色した精巣上体脂肪組織切片の脂肪細胞のサイズを、以前に報告された方法に基づいて測定した（Parleeら、２０１４年）。簡単に説明すると、Ｈ＆Ｅ染色した精巣上体脂肪組織のデジタル画像をオリンパスＦＳＸ１００光学顕微鏡で取得し、それぞれの脂肪細胞の面積（μｍ２）をタッチスクリーンラップトップコンピュータによって手動で決定した。データは、計数した脂肪細胞の総数（％合計）と比較した脂肪細胞の頻度（frequency）として表した。
【0100】
（肝組織構造と脂肪肝面積測定）
肝組織を切開および固定し、パラフィンに包埋して切片化した。切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。染色後、Tufts University and Tufts Medical CenterのAnimal Histology and Pathology Servicesで組織学分析を行った。Ｈ＆Ｅ染色した肝組織のデジタル画像を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＳＸ１００光学顕微鏡を用いて取得した。以前に報告されているように（McLaughlinら、２０１０年）、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、脂肪肝の面積を測定した。
肝組織を切開および固定し、パラフィンに包埋して切片化した。切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。染色後、Tufts University and Tufts Medical CenterのAnimal Histology and Pathology Servicesで組織学分析を行った。Ｈ＆Ｅ染色した肝組織のデジタル画像を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＳＸ１００光学顕微鏡を用いて取得した。以前に報告されているように（McLaughlinら、２０１０年）、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、脂肪肝の面積を測定した。
【0101】
（血清、肝臓および脂肪組織のリピドミックプロファイル）
VCU Massey Cancer Center Lipidomics Shared ResourceによるＬＣ－ＭＳ／ＭＳ技術を使用して、血清、肝臓および脂肪組織のリピドミックプロファイル（lipidomic profile）を分析した。
VCU Massey Cancer Center Lipidomics Shared ResourceによるＬＣ－ＭＳ／ＭＳ技術を使用して、血清、肝臓および脂肪組織のリピドミックプロファイル（lipidomic profile）を分析した。
【0102】
（肝臓ｎＳＭａｓｅ活性アッセイ）
肝臓ホモジェネートを調製し、報告されている方法に基づいて肝臓ｎＳＭａｓｅ活性を測定した（Empinadoら、２０１４年）。簡単に説明すると、肝臓ホモジェネートのｎＳＭａｓｅ活性を測定し、４０μｇを各アッセイに使用した。タンパク質濃度を、マイクロプレート手順に従って、Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay kitを使用して評価した。ｎＳＭａｓｅ活性アッセイは、４０μＬの最終量において、７．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０μＭのＣ６－ＮＢＤ－ＳＭ、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１５ｍＭのフッ化ナトリウム、プロテアーゼ阻害剤のカクテルおよび４０μｇのホモジェネートを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）反応緩衝液中で３０分間行った。０．５ｍＬのメタノールを添加することによって反応を停止させた。３７℃で３０分間さらにインキュベートした後、試料を１，０００×ｇで遠心分離し、透明な上清を透明なＨＰＬＣバイアルに移した。生成した蛍光生成物であるＮＢＤ－セラミドを逆相ＨＰＬＣによってモニターした。
肝臓ホモジェネートを調製し、報告されている方法に基づいて肝臓ｎＳＭａｓｅ活性を測定した（Empinadoら、２０１４年）。簡単に説明すると、肝臓ホモジェネートのｎＳＭａｓｅ活性を測定し、４０μｇを各アッセイに使用した。タンパク質濃度を、マイクロプレート手順に従って、Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay kitを使用して評価した。ｎＳＭａｓｅ活性アッセイは、４０μＬの最終量において、７．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０μＭのＣ６－ＮＢＤ－ＳＭ、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１５ｍＭのフッ化ナトリウム、プロテアーゼ阻害剤のカクテルおよび４０μｇのホモジェネートを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）反応緩衝液中で３０分間行った。０．５ｍＬのメタノールを添加することによって反応を停止させた。３７℃で３０分間さらにインキュベートした後、試料を１，０００×ｇで遠心分離し、透明な上清を透明なＨＰＬＣバイアルに移した。生成した蛍光生成物であるＮＢＤ－セラミドを逆相ＨＰＬＣによってモニターした。
【0103】
（遺伝子発現解析）
総ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen）を用いて肝臓および脂肪組織から抽出した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Super Script III First-Strand Synthesis System（Invitrogen）を使用して、１μｇの総ＲＮＡの逆転写によって生成した。目的の遺伝子発現レベルを、ＳＹＢＲ緑色試薬を使用することによって定量した。結果は、比較発現レベルの倍率変化として表す。
総ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen）を用いて肝臓および脂肪組織から抽出した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Super Script III First-Strand Synthesis System（Invitrogen）を使用して、１μｇの総ＲＮＡの逆転写によって生成した。目的の遺伝子発現レベルを、ＳＹＢＲ緑色試薬を使用することによって定量した。結果は、比較発現レベルの倍率変化として表す。
【0104】
（血清の炎症誘発性サイトカイン量の測定および結成の脂質プロファイリング）
マウス血清の炎症誘発性サイトカイン量を、電気化学発光マルチプレックスアッセイを使用して決定した。ＨＮＲＣＡのNutritional Evaluation Laboratoryで血清の脂質プロファイリングを行った。
マウス血清の炎症誘発性サイトカイン量を、電気化学発光マルチプレックスアッセイを使用して決定した。ＨＮＲＣＡのNutritional Evaluation Laboratoryで血清の脂質プロファイリングを行った。
【0105】
（１６ＳｒＤＮＡ細菌叢プロファイリング）
（ＤＮＡ抽出および１６ＳｒＤＮＡアンプリコン生成）
細菌ゲノムＤＮＡを、以下の改変を行ったQIAamp Stool DNA Kit（Qiagen, Germantown, MD）を用いて抽出した。試料を、５００ｍｇの０．１ｍｍシリカ／ジルコニウムビーズ（BioSpec Products, Bartlesville, OK）の存在下でＡＳＬバッファ（Qiagen kit）に再懸濁し、９５℃において１０分間インキュベートした。室温に冷却した後、試料をビーズ破砕機上に４℃において５分間置いた。糞便固体を微量遠心機でペレット化し、上清をＩｎｈｉｂｉｔｅｘ錠剤で処理した後、標準的なＱｉａｇｅｎプロトコルに従った。細菌の１６ＳリボソームＤＮＡのＶ４領域のアンプリコンをＰＣＲにより生成し、アンプリコンプールをＭｉＳｅｑシーケンサー（Illumina）で配列決定し、ＱＩＩＭＥ分析を行い、Tufts University Core Facility Genomics CoreによりＯＴＵ表を生成した。Ｓｈａｎｎｏｎ多様性指数およびＳｉｍｐｓｏｎ多様性指数を決定し、重みづけしないＵｎｉＦｒａｃ分析を行った。Bioconductor Workflowを用いてデータを分析した。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定を多様性測定ごとに行い、次いでＷｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定を行い、誤発見率（ＦＤＲ）補正（Ｃａｌｌａｈａｎら、２０１６年；Ｇｏｏｄｒｉｃｈら、２０１４年；ＬｏｚｕｐｏｎおよびＫｎｉｇｈｔ、２００８年）により一対比較を行った。
（ＤＮＡ抽出および１６ＳｒＤＮＡアンプリコン生成）
細菌ゲノムＤＮＡを、以下の改変を行ったQIAamp Stool DNA Kit（Qiagen, Germantown, MD）を用いて抽出した。試料を、５００ｍｇの０．１ｍｍシリカ／ジルコニウムビーズ（BioSpec Products, Bartlesville, OK）の存在下でＡＳＬバッファ（Qiagen kit）に再懸濁し、９５℃において１０分間インキュベートした。室温に冷却した後、試料をビーズ破砕機上に４℃において５分間置いた。糞便固体を微量遠心機でペレット化し、上清をＩｎｈｉｂｉｔｅｘ錠剤で処理した後、標準的なＱｉａｇｅｎプロトコルに従った。細菌の１６ＳリボソームＤＮＡのＶ４領域のアンプリコンをＰＣＲにより生成し、アンプリコンプールをＭｉＳｅｑシーケンサー（Illumina）で配列決定し、ＱＩＩＭＥ分析を行い、Tufts University Core Facility Genomics CoreによりＯＴＵ表を生成した。Ｓｈａｎｎｏｎ多様性指数およびＳｉｍｐｓｏｎ多様性指数を決定し、重みづけしないＵｎｉＦｒａｃ分析を行った。Bioconductor Workflowを用いてデータを分析した。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定を多様性測定ごとに行い、次いでＷｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定を行い、誤発見率（ＦＤＲ）補正（Ｃａｌｌａｈａｎら、２０１６年；Ｇｏｏｄｒｉｃｈら、２０１４年；ＬｏｚｕｐｏｎおよびＫｎｉｇｈｔ、２００８年）により一対比較を行った。
【0106】
（細菌叢データ解析）
細菌叢データを分析するために、Ｑｉｉｍｅ（具体的にはＱＩＩＭＥ１．８．０）と呼ばれるパイプラインを使用した。このパイプラインの基本は次のとおりである。すべての逆多重化されたｆａｓｔｑファイルを１つのファイルに結合する。このファイルには、対になったエンド読み取りを結合することと、すべてのファイルを一緒に連結することが含まれる（qiime.org/scripts/join_paired_ends.html）。各読み取りからバーコードが抽出される（qiime.org/scripts/extract_barcodes.html）。ライブラリは分割され、マッピングファイルから各配列が対応する識別子で識別されるファイルを生成する（qiime.org/scripts/split_libraries.html）。そこから、限定された参照（closed reference）を使用して、ＯＴＵ表を生成するＯＴＵ選択（OTU picking）を実行する。また、アルファ分析においてサンプリング深さを決定するときに使用される試料当たりの配列数を有する表も提供する（qiime.org/scripts/pick_closed_reference_otus.html）。参照ＯＴＵは、greengenesと呼ばれるデータベースから得られ、ｇｒｅｅｎｅｓ＿１３＿８（greengenes.secondgenome.com/downloads）である最新の放出（most recent release）が使用された。また、ＯＴＵを選択するときに０．９９の類似性が使用された。
細菌叢データを分析するために、Ｑｉｉｍｅ（具体的にはＱＩＩＭＥ１．８．０）と呼ばれるパイプラインを使用した。このパイプラインの基本は次のとおりである。すべての逆多重化されたｆａｓｔｑファイルを１つのファイルに結合する。このファイルには、対になったエンド読み取りを結合することと、すべてのファイルを一緒に連結することが含まれる（qiime.org/scripts/join_paired_ends.html）。各読み取りからバーコードが抽出される（qiime.org/scripts/extract_barcodes.html）。ライブラリは分割され、マッピングファイルから各配列が対応する識別子で識別されるファイルを生成する（qiime.org/scripts/split_libraries.html）。そこから、限定された参照（closed reference）を使用して、ＯＴＵ表を生成するＯＴＵ選択（OTU picking）を実行する。また、アルファ分析においてサンプリング深さを決定するときに使用される試料当たりの配列数を有する表も提供する（qiime.org/scripts/pick_closed_reference_otus.html）。参照ＯＴＵは、greengenesと呼ばれるデータベースから得られ、ｇｒｅｅｎｅｓ＿１３＿８（greengenes.secondgenome.com/downloads）である最新の放出（most recent release）が使用された。また、ＯＴＵを選択するときに０．９９の類似性が使用された。
【0107】
（定量および統計解析）
データは平均値±標準誤差で示す。両側の対応のないｔ検定またはＷｅｌｃｈ補正による両側の対応のないｔ検定を、それぞれ等しいまたは等しくない分散を有するＢ０とＢ１５との比較のために使用した。ＭＣ、ＨＦ０およびＨＦ１５データ間の違いを、一方向ＡＮＯＶＡ、続いてＤｕｎｎｅｔｔの事後検定により分析した。相関係数はノンパラメトリックＳｐｅａｒｍａｎの順位相関を用いて計算し、腸内細菌の存在度と臨床バイオマーカーのＳｐｅａｒｍａｎ相関分析からのｐ値は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ方法を用いて誤検出率について補正した。群間の腸内細菌の存在度の違いをＤｅｓｅｑ２パッケージを用いて分析した。有意性をｐ＜０．０５に設定した。
データは平均値±標準誤差で示す。両側の対応のないｔ検定またはＷｅｌｃｈ補正による両側の対応のないｔ検定を、それぞれ等しいまたは等しくない分散を有するＢ０とＢ１５との比較のために使用した。ＭＣ、ＨＦ０およびＨＦ１５データ間の違いを、一方向ＡＮＯＶＡ、続いてＤｕｎｎｅｔｔの事後検定により分析した。相関係数はノンパラメトリックＳｐｅａｒｍａｎの順位相関を用いて計算し、腸内細菌の存在度と臨床バイオマーカーのＳｐｅａｒｍａｎ相関分析からのｐ値は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ方法を用いて誤検出率について補正した。群間の腸内細菌の存在度の違いをＤｅｓｅｑ２パッケージを用いて分析した。有意性をｐ＜０．０５に設定した。
【0108】
【表1】
【0109】
【表2】
【0110】
【表3】
【0111】
【表4】
【0112】
【表5】
【0113】
〔結果〕
（Ｆ＆Ｖ補給はＨＦ食餌を与えた肥満マウスの体重増加を減少させたが、基本食餌を与えた、脂肪なしのマウスの体重増加に影響しなかった）
（Ｆ＆Ｖ補給はＨＦ食餌を与えた肥満マウスの体重増加を減少させたが、基本食餌を与えた、脂肪なしのマウスの体重増加に影響しなかった）
【0114】
肥満および代謝性疾患に対するＦ＆Ｖの効果を調べるために、ＵＳＤＡ国勢調査データ（１９９４～２００８年の１人当たりの１日平均消費量（グラム））に基づいて、最も一般的に消費されるＦ＆Ｖのうちの２４を含む独自のＦ＆Ｖ混合物を、調合した。消費の自然な様式を模倣するために、Ｆ＆Ｖ混合物における個々の果物または野菜の割合を、米国における年間Ｆ＆Ｖ消費の相対的な割合に基づいて計算した。１２の果物および１２の野菜の混合物を、凍結乾燥および粉砕し、０％、５％、１０％または１５％の食餌と置き換えて、ｗ／ｗにベースで実験食餌に取り込んだ。
【0115】
次に、標準食餌（Ｂａｓａｌ、Ｂ； ＡＩＮ－９３，１６ｋｃａｌ％脂肪）を与えた脂肪なしのマウスまたは肥満マウスにおけるＦ＆Ｖ補給の効果を計算した。肥満は、ＨＦ食餌（４５ｋｃａｌ％脂肪、マウスにおける肥満を誘導するための研究において典型的に使用される）を与えることによって誘導された。ＡＩＮ－９３と、使用したＨＦ食餌との間にはわずかな差しかないので、高脂肪食の対照として、調和のとれている微量栄養素の対照食餌（ＭＣ；１０ｋｃａｌ％脂肪）をマウスの追加群に与えた（Ｗａｒｄｅｎ ａｎｄ Ｆｉｓｌｅｒ，２００８）。マウスにそれぞれの食餌を２０週間与えた。
【0116】
ＨＦ食餌のみを与えた肥満マウス（ＨＦ０）は、２０週間で、ＭＣ食餌を与えたマウスよりも７７．１％の体重を増した。しかし、１５％のＦ＆Ｖ（ＨＦ１５）を補ったＨＦ食餌を与えたマウスは、Ｆ＆Ｖ（ＨＦ０）なしのＨＦ食餌を与えたマウス（図１Ｂ）と比較して、明らかに少ない体重を増した。より少ない（５％および１０％）レベルのＦ＆Ｖ補給を有するＨＦ食餌を与えたマウスにおける体重増加に有意な差は観察されず（図１Ｂ）、１５％ Ｆ＆Ｖが食餌誘発性肥満における体重増加の抑制に最も有効な量であることを示している。関心のある他の結果についても同様の観察がなされた。従って、１５％を補われた食餌からのデータを使用する。さらに、体組成（１７週齢でＭＲＩを用いて測定）は、ＭＣ食餌を与えたマウスと比較して、ＨＦ食餌を与えたマウスは、体重の百分率として、１０７％多い脂肪組織重量（図１Ｄ）および５８．３％多い総脂肪質量（図１Ｆ）を有することを示した。ＨＦ食餌（ＨＦ０）を与えたマウスにおける脂肪なしの組織塊の百分率は、ＭＣ食餌を与えたマウスのそれよりも１８．５％低かった（図１Ｈ）。１５％Ｆ＆Ｖを補ったＨＦ食餌を与えられたマウスは、ＨＦ食餌のみを与えられたマウス（ＨＦ０）と比較して、有意に少ない脂肪組織重量を有した（図１Ｄ）。
【0117】
基礎食餌のみを与えたマウス（Ｂ０）は、ＨＦ０食餌を与えたマウスより低い体重増加を有した（図１Ａ＆Ｂ）。基礎食餌を与えたマウスにおいて、体重増加（図１Ａ）および体組成（図１Ｃ、１Ｅ、１Ｇ、および１Ｉ）に対するＦ＆Ｖ補給の有意な影響はなかった。
【0118】
肥満マウスの食物エネルギー摂取レベル（図Ｓ１Ｄ）に対するＦ＆Ｖの有意な影響はなかった。基礎食餌およびＨＦ食餌の両方におけるＦ＆Ｖ補給は、糞便重量（図Ｓ１ＥおよびＳ１Ｆ）、糞便エネルギー密度（図Ｓ１ＧおよびＳ１Ｈ）、および糞便エネルギー排泄（図Ｓ１ＩおよびＳ１Ｊ）を有意に増加させ、ＨＦ食餌を与えたマウスの体重増加抑制に対するＦ＆Ｖの有益な効果が、エネルギー取り込みの低下によって媒介され得ることを示した。
【0119】
（食餌性のＦ＆Ｖ補給は脂肪組織の炎症を低減させ、食物摂取および体重減少と無関係にＮＡＦＬＤを抑制する）
【0120】
脂肪細胞死ならびに浸潤したマクロファージおよび他の炎症細胞によって特徴付けられる機能不全の脂肪組織、特に内臓の白色脂肪組織は、代謝性疾患の病因と関連している（Ｐａｎｉａｇｕａ、２０１６； ｖａｎ Ｇｒｅｅｖｅｎｂｒｏｅｋ ｅｔ ａｌ、２０１６）。瀕死の脂肪細胞の周囲に蓄積した炎症性免疫細胞により形成されると知られている、性腺脂肪組織におけるｓ冠状構造は、代謝障害の発症と関連している（ｖａｎ Ｂｅｅｋ ｅｔ ａｌ、 ２０１５）。免疫細胞濾過は、脂肪組織機能不全の顕著な特徴である（Ｇｕｚｉｋら、２０１７）。
【0121】
Ｆ＆Ｖ消費の増加が脂肪組織炎症を抑えるか否かを探るために、Ｆ＆Ｖを補った、または補わない基礎食餌またはＨＦ食餌を与えたマウスにおける精巣上体脂肪組織（ｅＡＴ）の組織学的分析を行った。冠状構造は、ＨＦ０食餌またはＢ０食餌のいずれかを与えられたマウスにおいて認められ、ＨＦ０と比較してＢ０においてはるかに低い密度であった（図２Ａおよび２Ｄ）。１５％のＦ＆Ｖを補給したＨＦ食餌または基礎食餌をマウスに与えると、冠状構造が排除された（図２Ｂおよび２Ｅ）。これらのデータは、ｅＡＴにおけるＦ＆Ｖの抗炎症作用は、１５％Ｆ＆Ｖありおよびなしの基礎食餌を与えたマウスの間で平均体重に差がなかったことから、その抗肥満作用と無関係であることを示している（図１Ａおよび１Ｂ）。以前の報告（Ｓｔｒｉｓｓｅｌら、２００７）と同様に、小脂肪細胞の有病率（＜２０００μｍ２）が、ＨＦ食餌を与えたマウスにおいて２０週目に観察された（図２Ｆ）。小脂肪細胞の有病率の増加は、再構築されたｅＡＴにおける死んだ脂肪細胞の特徴であり、脂肪組織の脂肪貯蔵能の低下によるＮＡＦＬＤとしばしば関連する。ＨＦ食餌に１５％のＦ＆Ｖを補給する、ＨＦ食餌によって誘導される小脂肪細胞の有病率が著しく低下した（図２Ｆ）。基礎食餌を与えたマウスでは、ｅＡＴ脂肪細胞サイズに対するＦ＆Ｖの有意な影響は認められなかった（図２Ｃ）。
【0122】
炎症誘導性サイトカイン遺伝子の発現レベルをマウスｅＡＴにおいて調べ、炎症誘導性サイトカイン、ＴＮＦα、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、およびＭＣＰ－１のｍＲＮＡレベルは、ＭＣ食餌を与えたマウスと比べて、ＨＦダ食餌単独を与えたマウスのｅＡＴにおいて高いことが分かった。１５％のＦ＆Ｖを有するＨＦＤを与えたマウスは、ｅＡＴにおける炎症誘発性サイトカインｍＲＮＡ発現を、ＨＦＤ単独と比較して有意に低く有していた（図Ｓ２Ａ－Ｓ２Ｄ）。Ｂ０食餌およびＢ１５食餌を与えたマウスの間の炎症誘導性サイトカインのｍＲＮＡレベルに有意差は、認められなかった。
【0123】
肝臓切片のＨ＆Ｅ組織学的染色は、ＭＣ食餌（１０ｋｃａｌ％脂肪）を与えたマウスにおいてＮＡＦＬＤの徴候を示さなかった（図３Ａ）。２０週間の基礎食餌（１６ｋｃａｌ％脂肪を含むＢ０、ＡＩＮ－９３）またはＨＦ食餌（ＨＦ０、４５ｋｃａｌ％脂肪）のいずれかを与えたマウスは、それぞれ、軽いＮＡＦＬＤおよび重篤なＡＦＬＤを生じた（図２Ｈおよび２Ｋ）。対照的に、基礎食餌およびＨＦ食餌の両方において１５％のＦ＆Ｖを受けているたマウスは、明らかにわずかな肝脂肪症を示した（ｐ＜０．０５、図２Ｉ、２Ｊ、２Ｌ、および２Ｍ）。これらのデータは、Ｆ＆Ｖの抗脂肪肝作用が１５％Ｆ＆Ｖなしおよびありの基礎食餌を与えたマウスの間で平均体重に差がなかった事実によって、その抗肥満作用と無関係であることを示している（図１Ａおよび１Ｂ）。
【0124】
脂質異常症はＮＡＦＬＤと強く関連するので（Ｃｈａｔｒａｔｈら、２０１２； Ｋａｔｓｉｋｉら、２０１６； ＺｈａｎｇおよびＬｕ、２０１５）、血清脂質プロファイリングを行った。結果は、Ｆ＆Ｖ補給が血清脂質プロファイルに対する有意な効果を有しなかったことを示す（図１３Ａ～１３Ｊ）。したがって、このモデルにおけるＦ＆Ｖの肝脂肪症に対する効果は、脂質プロファイルの変化を介して媒介されていない。
【0125】
ＨＦＤ単独を与えられたマウスと比較して、ＨＦＤ＋Ｆ＆Ｖを与えられたマウスは、低い脾臓重量および脾臓重量指数（ｍｇ脾臓／ｇ体重として計算された）を有した（図８）。
【0126】
（Ｆ＆Ｖ補給は、循環血中および肝組織中のセラミドならびに炎症誘発性サイトカインＴＮＦαを減少させた）
【0127】
循環スフィンゴ脂質、特にセラミドのレベルはＮＡＦＬＤ病因と密接に関連しているので（Ｉｌａｎ、２０１６； Ｎｉｋｏｌｏｖａ－Ｋａｒａｋａｓｈｉａｎ、２０１８； Ｒｅｇｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ、２０１８）、血清スフィンゴ脂質プロファイル分析を行った。その結果、Ｂ１５食餌（図３Ａ）またはＨＦ１５食餌（図３Ｂ）を与えたマウスは、それぞれＢ０またはＨＦ０と比較して、総セラミドの有意に低い血清レベルを有していた。
【0128】
同様に、Ｃ１６：０セラミド、Ｃ２４：０セラミド、およびＣ２４：１セラミドなどの他のセラミド種の、Ｂ１５食餌またはＨＦ１５食餌を与えたマウスにおける血清レベルは、それぞれＢ０またはＨＦ０と比較して、有意に低かった、または低い傾向にあった（下部３Ｅ－３Ｆ、３Ｑ－３Ｒ、３Ｕ－３Ｖ）。血清Ｃ１８：１セラミドおよびＣ１８：１セラミドのレベルの有意差は、Ｂ１５食餌を与えたマウスを、Ｂ０食餌を与えたマウスと比較したとき、またはＨＦ食餌を与えたマウスを、ＨＦ１５食餌を与えたマウスと比較したとき、認められなかった（図３Ｉ－３Ｊおよび３Ｍ－３Ｎ）。Ｓｐｅａｒｍａｎ相関分析は、基礎食餌またはＨＦ食餌のいずれかを与えたマウスにおけるＮＡＦＬＤが、それぞれ総血清セラミドおよびＴＮＦαと正に相関することを示した（表１）。Ｃ１６：０、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０、Ｃ２４：０、およびＣ２４：１セラミドを含む血清長鎖セラミド種も、基礎食餌またはＨＦ食餌のいずれかを与えたマウスにおいてＮＡＦＬＤと正に相関する（表１）。これらの結果は、ＮＡＦＬＤに対するＦ＆Ｖの影響がセラミドレベルの変化をによって媒介され得ることを示す。
【0129】
肝セラミド濃度を測定した。ＨＦ０を与えたマウスは、ＭＣ食餌を与えたマウスと比較して、肝臓の総セラミドおよび他のセラミド種の高いレベルを有していたことが分かった。ＨＦ食餌に対する１５％のＦ＆Ｖの添加は、ＨＦ食餌誘発性のより高いセラミドレベルを減弱させた（図３Ｄ，３Ｈ，３Ｌ，３Ｐ，３Ｔ，３Ｘ）。基礎食餌（図３Ｃ、３Ｇ、３Ｋ、３Ｏ、３Ｓ、３Ｗ）を与えたマウスの肝セラミドレベルに対するＦ＆Ｖの有意な影響は観察されず、セラミドの全身および組織レベルに対するＦ＆Ｖの影響の間に差があることを示した。
【0130】
Ｆ＆Ｖに誘導される、肝セラミドの減少の機序を決定するために、新規合成経路またはサルベージ経路のいずれかからのセラミド生成に必要な酵素である肝セラミドシンターゼ（ＣｅｒＳ）のｍＲＮＡレベルに対するその作用を、アッセイした。高脂肪食餌を与えたマウスにおいてＦ＆Ｖのより劇的な効果が観察されたので、ＨＦ０およびＨＦ１５食餌を与えたマウスのＣｅｒＳ ｍＲＮＡレベルを、定量した。肝臓のＣｅｒＳ２、ＣｅｒＳ５、ＣｅｒＳ６のｍＲＮＡレベルにおける差は、ＨＦ食餌単独を与えたマウスと１５％のＦ＆Ｖを補ったＨＦ食餌を与えたマウスとの間で認められず（図１４Ａ－１４Ｃ）、肝臓のセラミドレベルを低下させるＦ＆Ｖの作用は、ＣｅｒＳ遺伝子の転写物レベルの変化に起因しなかったことを示した。これらの結果はＦ＆ＶがＣｅｒＳ酵素タンパク質レベルおよび／または活性を変化させ得ることを除外できないが、セラミドレベルに対するＦ＆Ｖの影響はスフィンゴミエリンからのセラミドの放出を触媒する酵素である酵素スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭａｓｅ）の活性の低下によるものであると考えられる。この仮説にとっての裏付けは、Ｆ＆Ｖが抗酸化剤に豊富であり、ＳＭａｓｅが酸化還元ホメオスタシスによって調節されるという事実から生じる（Ｃｉｎｑ－Ｆｒａｉｓら、２０１３； Ｍａｒｔｉｎら、２００７）。肝臓の中性ＳＭａｓｅ（ｎＳＭａｓｅ）の活性を定量し、ＨＦ０食餌単独を与えたマウスは、ＭＣ食餌を与えたマウスと比べて高い肝臓のｎＳＭａｓｅ活性を有し、１５％のＦ＆Ｖを補ったＨＦ食餌を与えたマウスは、ＨＦ０に比べて有意に低いｎＳＭａｓｅ活性を有したことがわかった（図４Ｅ）。基礎食餌を与えたマウスでは、肝臓のｎＳＭａｓｅ活性に対する、増加したＦ＆Ｖ消費の影響は認められなかった（図４Ｄ）。これらの結果は、肝セラミド濃度に及ぼす肥満およびＦ＆Ｖの影響に関する結果と一致しており（図３）、肥満はセラミド濃度の増加を誘導すること、およびＦ＆Ｖによるその低下はｎＳＭａｓｅ活性の低下によって媒介されることいることを支持している。
【0131】
様々な肝代謝過程を制御する重要な調節因子である肝ＦＸＲの活性化は、ＴＮＦαを含むＮＦ－κＢ標的炎症遺伝子を阻害することによって、肝炎を抑える（ＹＤら、２００８）。一方、ＴＮＦαおよびＨＦＤ給餌は、肝臓ＦＸＲ発現を下方制御する（Ｇｅｉｅｒら、２００５；Ｋｉｍら、２００３年；Ｎｉｅら、２０１７年）。ＦＸＲアゴニストは、ＨＦＤに誘導されるＦＸＲ発現の下方制御を上方制御でき、ＴＮＦαおよびＮＦ－κＢシグナル伝達経路を阻害できた（Ｈｕら、２０１８）。ＴＮＦαは、中性原形質膜と関連するＳＭａｓｅ活性を刺激して、セラミド生成に導き（Ｓｃｈｕｔｚｅら、１９９４年）、かつＮＡＦＬＤの発生および進行の原因になると示されている（Ｄｅ Ｔａｅｙｅら、２００７年；Ｋａｋｉｎｏら、２０１８年）。さらに、ＴＮＦαおよびセラミドは、ＮＡＦＬＤおよび糖尿病を含む代謝障害の発生に重要な役割を果たすと示されている（Ｉｌａｎ、２０１６年；Ｒｅｈｍａｎら、２０１７年；Ｓｃｈｍｉｄｔ－ＡｒｒａｓおよびＲｏｓｅ－Ｊｏｈｎ、２０１６年）。炎症性サイトカインであるＴＮＦα、およびセラミドはまた、互いのレベルを調節に関与している。さらに、セラミドはＮＡＦＬＤなどの炎症および代謝障害をもたらす活性酸素種のミトコンドリア生成を増加させることができる（Ｐａｇａｄａｌａら、２０１２年）。このように、肥満、およびＦ＆Ｖに誘導される変化の、脂肪組織炎症およびＮＡＦＬＤにおける根本的な機序をより理解するために、１５％のＦ＆Ｖの補給ありまたはなしの基礎またはＨＦ食餌を与えたマウスならびにＭＣ食餌を与えたマウスの、循環および肝臓のＴＮＦαのレベル、ならびに肝臓のＦＸＲ ｍＲＮＡレベルを決定した。ＭＣ食餌を与えたマウスと比較して、ＨＦ食餌のみを与えたマウスは、有意に、高い循環および肝臓のＴＮＦαタンパク質レベル、低い肝臓のＦＸＲ ｍＲＮＡ、および高い肝臓のｎＳＭａｓｅ比活性を示すことがわかった（図４Ａ－４Ｄ）。マウスに１５％のＦ＆ＶのＨＦ食餌を与えることは、ＨＦ食餌による肝臓のＦＸＲ ｍＲＮＡ発現の低下（図４Ｂ）および肝臓のｎＳＭａｓｅ比活性の上昇（図４Ｄ）を抑さえ、血清および肝臓のＴＮＦαレベルを下げる傾向にあった（それぞれＰ＝０．０７６１およびＰ＝０．０９７１；図４Ａおよび４Ｃ）。１５％のＦ＆Ｖを有する基礎食餌を与えたマウスは、基礎食餌のみを与えたマウスと比較して、有意に低い血清ＴＮＦαレベルを有した（ｐ＜０．００１、図４Ｅ）が、Ｂ０ｌ食餌を与えたマウスとＢ１５食餌を与えたマウスとの間で、肝臓のＦＸＲ ｍＲＮＡレベル、肝臓のＴＮＦαタンパク質レベル、肝臓のｎＳＭａｓｅ比活性に劇的な差はなかった（図４Ｆ－４Ｇ）。これらの結果は、ＮＡＦＬＤに対するＦ＆Ｖ補給の予防効果が、抗炎症遺伝子 抗炎症遺伝子の発現、ＦＸＲ、ＴＮＦαおよびセラミドレベルを調節することによって部分的に媒介され得ることを示している。これは、以下に述べられている相関分析の結果によって支持されている。
【0132】
ＨＦＤのみを与えたマウスと比較して、Ｆ＆Ｖを補給したＨＦＤを与えたマウスは、有意に、高いＬＸＡ４および１４，１５－ＥＥＴの血清レベル（それぞれ２０３％および９６％）、低い２０－ＨＥＴＥおよびＤＨＧＬＡの血清レベルを有していた（それぞれ１４％および４１％）（図９）。
【0133】
Ｓｐｅａｒｍａｎ相関分析は、ＴＮＦαレベルと、総セラミドならびにＣ１６：０、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０、Ｃ２４：０、Ｃ２４：１セラミド種との間に有意な正の相関を示した（表１）。これは、ＴＮＦαがＨＦ食餌に誘導されるセラミドレベルの変化およびＦ＆Ｖに誘導されるセラミドレベルの変化の両方に関与し得ることを示す。ＴＮＦαとＮＡＦＬＤとの間にも有意な正の相関が観察され（表１）、ＴＮＦα、セラミドおよびＮＡＦＬＤの関連が裏付けている。
【0134】
（腸内微生物叢の腸内毒素症状は、Ｆ＆Ｖ補給によって軽減され、かつ生化学的および臨床的転帰と関連していた）
【0135】
腸内微生物叢に対するＦ＆Ｖ補給の影響を評価するために、われわれは１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に基づく分類学的プロファイリングを行った。基礎またはＨＦ食餌のみを与えたマウスと比較して、Ｆ＆Ｖを補った基礎またはＨＦ食餌を与えたマウスが、糞便微生物叢における有意に高いアルファ多様性有していることを、われわれは見出した（図５Ａおよび５Ｃ）。主座標分析は、両方の食餌におけるＦ＆Ｖ消費にほぼしたがって異なる糞便微生物叢組成をともなって、食餌にしたがった腸内微生物叢の組成の変化を示した（図５Ｂおよび５Ｄ）。
【0136】
さらに、われわれは、分類学的な全レベルにおいて腸内細菌組成の変化を観察した。
【0137】
ＭＣ食餌を与えたマウスと比較して、ＨＦ食餌を与えたマウスは、劇的に異なる腸内細菌組成を有していた。Ｆ＆Ｖを補ったＨＦ食餌を与えたマウスは、ＨＦ食餌を与えたマウスもより、ＭＣ食餌を与えたマウスの微生物組成とほぼ類似の微生物組成を有していた。Ｆ＆Ｖを補った基礎食餌を与えたマウスの微生物組成は、基礎食餌を与えたマウスの微生物組成と異なるパターンを示した（図６Ａ－６Ｅ）。
【0138】
示差存在比分析は、ＨＦ０食餌を与えたマウスと比較して、ＨＦ１５食餌を与えたマウスにおける以下の分類群の有意に高い存在比を明らかにした：Ａｎａｅｒｏｐｌａｓｍａ（１０ｘ）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ（７．５ｘ）、Ｔｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ（５ｘ）、Ｏｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａ（～１．５ｘ）、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に注釈されている２群（～２ｘ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門に注釈されている１群（２．５ｘ）、およびシアノバクテリア１群（７．５ｘ）。対照的に、ＨＦ１５食餌を与えたマウスにおけるいくつかの属は、ＨＦ０食餌を与えたマウスと比較して、低い存在比を有していた：Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ（－２．５ｘ）、ＳＭＢ５３（－８ｘ）、およびＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門からの、注釈されていない１群（－７ｘ）、およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門からの１群（－４ｘ）（図１５Ａ）。また、Ａｎａｅｒｏｐｌａｓｍａ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｔｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、およびシアノバクテリア門からの注釈されていない属も、ＨＦ１５食餌を与えたマウスにおいて、ＭＣ食餌を与えたマウスより多かった（それぞれ１０ｘ、７．５ｘ、６ｘ、７ｘ多い、図１５Ｂ）。同様に、Ａｎａｅｒｏｐｌａｓｍａ属およびＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属も、Ｂ０食餌を与えたマウスと比較して、Ｂ１５食餌を与えたマウスにおいて多かった（図１５Ｃ）。
【0139】
Ｓｐｅａｒｍａｎ相関分析は、基礎食餌（Ｂ０＆Ｂ１５）を与えたマウスにおけるＦ＆Ｖ摂取量と正に相関している腸内細菌が、炎症、セラミドと逆相関し、糞便エネルギー排泄量と正に相関することを示した（図７Ａ）。同様に、ＨＦ食餌を与えたマウスにおいて、Ｆ＆Ｖ摂取量と正に相関する細菌は、肝臓のＦＸＲ ｍＲＮＡ発現および除脂肪体重パーセントによってわかるように、より健全な代謝プロファイルと正に相関し、脂肪量、炎症およびセラミドと負に相関した（図７Ｂ）。
【0140】
（実施例１の参考文献）
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【0141】
〔実施例２〕
（食餌性果物および野菜の補給は、ＬＤＬ受容体ノックアウトマウスにおける食餌誘導性アテローム性動脈硬化症を抑制する）
（食餌性果物および野菜の補給は、ＬＤＬ受容体ノックアウトマウスにおける食餌誘導性アテローム性動脈硬化症を抑制する）
【0142】
＜材料および方法＞
（果物・野菜（Ｆ＆Ｖ）粉末製剤）
ＵＳＤＡ国勢調査データに基づいて最も一般的に消費されるＦ＆Ｖの２４の組み合わせを含有するＦ＆Ｖ混合物をホモジナイズして、実施例１に記載のように凍結乾燥粉末を調製した。
（果物・野菜（Ｆ＆Ｖ）粉末製剤）
ＵＳＤＡ国勢調査データに基づいて最も一般的に消費されるＦ＆Ｖの２４の組み合わせを含有するＦ＆Ｖ混合物をホモジナイズして、実施例１に記載のように凍結乾燥粉末を調製した。
【0143】
（動物および食餌）
４週齢のオスのＬＤＬ受容体ノックアウトマウス（Ｂ６．１２９Ｓ７－Ｌｄｌｒｔｍ１Ｈｅｒ／Ｊ、ストック番号００２２０７）を、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）から購入し、Ｊｅａｎ Ｍａｙｅｒ ＵＳＤＡ Ｈｕｍａｎ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｎ Ａｇｉｎｇ ａｔ Ｔｕｆｔｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物管理施設に収容した。順化の１２日後、個々にケージに入れた動物を、低脂肪食餌（ＬＦ）群、高脂肪食餌（ＨＦ０）群、および１５％のＦ＆Ｖ混合物（ＨＦ１５）を補った高脂肪食餌の群を含む、同等の体重の３群に割り当てた。ＬＦ食餌は、脂肪からの１０％ｋｃａｌカカオバターからの４．４％ ｋｃａｌ／大豆油からの５．６％ｋｃａｌ， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ、＃Ｄ１７０３０９１０Ｍおよび５２ｍｇのコレステロール／１０００ ｋｃａｌを添加した改変ＡＩＮ－９３Ｍ食餌で作られた。ＨＦ０食餌は、脂肪からの２７％ｋｃａｌ（カカオバターからの２４．２％ｋｃａｌ／大豆油からの２．８％ｋｃａｌ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ、＃Ｄ１７０３０９１１Ｍ）および１３０ｍｇのコレステロール／１０００ｋｃａｌを含む、改変ＡＩＮ－９３Ｍ食餌からなった。ＨＦ１５食餌は、１５％のＨＦ０食餌を１５％のＦ＆Ｖ混合物（ｗ／ｗ）（ヒトについては８～９人分のＦ＆Ｖ／日に相当する）で置き換えることによって調製した。マウスにそれぞれの食餌を２０週間自由に与えた。体重を毎週記録し、腸微生物分析のために糞便試料を採取した。
４週齢のオスのＬＤＬ受容体ノックアウトマウス（Ｂ６．１２９Ｓ７－Ｌｄｌｒｔｍ１Ｈｅｒ／Ｊ、ストック番号００２２０７）を、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）から購入し、Ｊｅａｎ Ｍａｙｅｒ ＵＳＤＡ Ｈｕｍａｎ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｎ Ａｇｉｎｇ ａｔ Ｔｕｆｔｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物管理施設に収容した。順化の１２日後、個々にケージに入れた動物を、低脂肪食餌（ＬＦ）群、高脂肪食餌（ＨＦ０）群、および１５％のＦ＆Ｖ混合物（ＨＦ１５）を補った高脂肪食餌の群を含む、同等の体重の３群に割り当てた。ＬＦ食餌は、脂肪からの１０％ｋｃａｌカカオバターからの４．４％ ｋｃａｌ／大豆油からの５．６％ｋｃａｌ， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ、＃Ｄ１７０３０９１０Ｍおよび５２ｍｇのコレステロール／１０００ ｋｃａｌを添加した改変ＡＩＮ－９３Ｍ食餌で作られた。ＨＦ０食餌は、脂肪からの２７％ｋｃａｌ（カカオバターからの２４．２％ｋｃａｌ／大豆油からの２．８％ｋｃａｌ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ、＃Ｄ１７０３０９１１Ｍ）および１３０ｍｇのコレステロール／１０００ｋｃａｌを含む、改変ＡＩＮ－９３Ｍ食餌からなった。ＨＦ１５食餌は、１５％のＨＦ０食餌を１５％のＦ＆Ｖ混合物（ｗ／ｗ）（ヒトについては８～９人分のＦ＆Ｖ／日に相当する）で置き換えることによって調製した。マウスにそれぞれの食餌を２０週間自由に与えた。体重を毎週記録し、腸微生物分析のために糞便試料を採取した。
【0144】
（動物採血および臓器分離）
２０週後、マウスを安楽死させた。血液サンプルを各動物から心臓穿刺によって収集し、血清を分離し、さらなる分析のために－８０℃で保存した。それから、以前に報告されている［１］通り、胸腔を開き、大動脈を分離した。肝臓を切開し、重さを量り、それから、２片（１片をホルマリンに、１片をホイルに入れた）に分け、それから液体窒素で凍結させ、それから保存のために－８０℃に移した。
２０週後、マウスを安楽死させた。血液サンプルを各動物から心臓穿刺によって収集し、血清を分離し、さらなる分析のために－８０℃で保存した。それから、以前に報告されている［１］通り、胸腔を開き、大動脈を分離した。肝臓を切開し、重さを量り、それから、２片（１片をホルマリンに、１片をホイルに入れた）に分け、それから液体窒素で凍結させ、それから保存のために－８０℃に移した。
【0145】
（大動脈病変の面積定量化）
分離した下行大動脈を１０％緩衝化ホルムアルデヒド溶液中に保存し、脂肪を除去し、長手方向に切断し、次いで昆虫ピンを用いてブラックワックスプラットフォーム上にピン留めした。大動脈病変を、イソプロパノール中の新しく調製したOil Red Oで染色することによって可視化した。得られた画像を解剖顕微鏡下で捕捉した。Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標） ＣＣ ２０１５ソフトウェア（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて大動脈アテローム病変の面積を評価し、大動脈領域の全面積に対するオイルレッドＯで染色したプラーク領域の割合を定量した。
分離した下行大動脈を１０％緩衝化ホルムアルデヒド溶液中に保存し、脂肪を除去し、長手方向に切断し、次いで昆虫ピンを用いてブラックワックスプラットフォーム上にピン留めした。大動脈病変を、イソプロパノール中の新しく調製したOil Red Oで染色することによって可視化した。得られた画像を解剖顕微鏡下で捕捉した。Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標） ＣＣ ２０１５ソフトウェア（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて大動脈アテローム病変の面積を評価し、大動脈領域の全面積に対するオイルレッドＯで染色したプラーク領域の割合を定量した。
【0146】
（肝脂肪症解析）
固定された肝組織を、組織病理学のために処理して、脂質蓄積を測定した。肝脂肪症の面積をホルマリン固定Ｈ＆Ｅ染色切片で定量し、全面積に対する脂質面積の割合をＩｍａｇｅＪ（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ １９９９）を用いて計算した。類洞、門脈路、肝静脈などの非肝細胞領域は、分析対象から除外された。
固定された肝組織を、組織病理学のために処理して、脂質蓄積を測定した。肝脂肪症の面積をホルマリン固定Ｈ＆Ｅ染色切片で定量し、全面積に対する脂質面積の割合をＩｍａｇｅＪ（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ １９９９）を用いて計算した。類洞、門脈路、肝静脈などの非肝細胞領域は、分析対象から除外された。
【0147】
（遺伝子発現解析）
全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて凍結肝組織から抽出した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、１μｇの全ＲＮＡの逆転写によって生成した。目的の遺伝子発現レベルを、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ試薬を使用することによって定量した。結果は、比較発現レベルの倍率変化として表される。順方向または逆方向オリゴヌクレオチドプライマーの配列を以下の表６に挙げる。
全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて凍結肝組織から抽出した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、１μｇの全ＲＮＡの逆転写によって生成した。目的の遺伝子発現レベルを、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ試薬を使用することによって定量した。結果は、比較発現レベルの倍率変化として表される。順方向または逆方向オリゴヌクレオチドプライマーの配列を以下の表６に挙げる。
【0148】
【表6】
【0149】
（血清の炎症誘発性サイトカインレベルおよび血清脂質プロファイリングの測定）
マウス血清の炎症誘発性サイトカインレベルを、電気化学発光多重アッセイを使用して決定し、そして血清脂質プロファイリングを、ＨＮＲＣＡのNutritional Evaluation Laboratoryによって実施した。
マウス血清の炎症誘発性サイトカインレベルを、電気化学発光多重アッセイを使用して決定し、そして血清脂質プロファイリングを、ＨＮＲＣＡのNutritional Evaluation Laboratoryによって実施した。
【0150】
（１６Ｓ ｒＤＮＡ微生物叢プロファイリング）
細菌ゲノムＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ Ｓｔｏｏｌ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を使用して、製造者の指示に従って抽出した。細菌の１６ＳリボソームＤＮＡのＶ４領域のアンプリコンをＰＣＲにより生成し、アンプリコンプールをＭｉＳｅｑシークエンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によって配列決定した。ＱＩＩＭＥ分析を行い、ＯＴＵ表をＴｕｆｔｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｒｅによって生成した。ＳｈａｎｎｏｎおよびＳｉｍｐｓｏｎ多様性指数を決定し、重み付けなしのＵｎｉＦｒａｃ分析を行った。Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｗｏｒｋｆｌｏｗを用いてデータを分析した。それぞれの多様性メトリックについてＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定を行い、その後Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を行い、偽発見率（ＦＤＲ）補正との対比較を行った［２－４］。
細菌ゲノムＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ Ｓｔｏｏｌ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を使用して、製造者の指示に従って抽出した。細菌の１６ＳリボソームＤＮＡのＶ４領域のアンプリコンをＰＣＲにより生成し、アンプリコンプールをＭｉＳｅｑシークエンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によって配列決定した。ＱＩＩＭＥ分析を行い、ＯＴＵ表をＴｕｆｔｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｒｅによって生成した。ＳｈａｎｎｏｎおよびＳｉｍｐｓｏｎ多様性指数を決定し、重み付けなしのＵｎｉＦｒａｃ分析を行った。Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｗｏｒｋｆｌｏｗを用いてデータを分析した。それぞれの多様性メトリックについてＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定を行い、その後Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を行い、偽発見率（ＦＤＲ）補正との対比較を行った［２－４］。
【0151】
（統計分析）
データを、平均値±標準誤差として示し、一元配置分散のあとに、Ｄｕｎｎｅｔｔのｐｏｓｔ－ｈｏｃ試験によって分析した。相関係数はノンパラメトリックＳｐｅａｒｍａｎの順位相関を用いて計算し；腸細菌の存在比および臨床バイオマーカーのＳｐｅａｒｍａｎ相関分析に基づくｐ値を、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ方法を用いて誤検出率について補正した。群間の腸内細菌の示差的な存在比、をＤｅｓｅｑ２パッケージを用いて分析した。有意性をｐ＜０．０５に設定した。
データを、平均値±標準誤差として示し、一元配置分散のあとに、Ｄｕｎｎｅｔｔのｐｏｓｔ－ｈｏｃ試験によって分析した。相関係数はノンパラメトリックＳｐｅａｒｍａｎの順位相関を用いて計算し；腸細菌の存在比および臨床バイオマーカーのＳｐｅａｒｍａｎ相関分析に基づくｐ値を、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ方法を用いて誤検出率について補正した。群間の腸内細菌の示差的な存在比、をＤｅｓｅｑ２パッケージを用いて分析した。有意性をｐ＜０．０５に設定した。
【0152】
〔結果〕
（Ｆ＆Ｖ補給はＬＤＬＲ ＫＯマウスにおける高脂肪食餌誘発性の大動脈アテローム性動脈硬化症を抑制した。）
（Ｆ＆Ｖ補給はＬＤＬＲ ＫＯマウスにおける高脂肪食餌誘発性の大動脈アテローム性動脈硬化症を抑制した。）
【0153】
ＬＤＬＲ ＫＯマウスにおけるアテローム性動脈硬化病変の形成に対するＦ＆Ｖ補給の有効性を決定するため、大動脈アテローム性動脈硬化の病変面積を直接のOil Red O染色により測定した。ＨＦ０食餌を与えたマウスは、ＬＦ食餌を与えたマウスよりも大動脈アテローム性動脈硬化の病変面積が大きかった（６．５倍の増加）。ＨＦ０を与えたマウスと比較して、ＨＦ１５食餌を与えたマウスの大動脈病変の脂肪変性は８０％以上減少した（図１７）。これらの結果は、Ｆ＆Ｖ補給がＬＤＬＲ ＫＯマウスにおける高脂肪食誘発性の大動脈アテローム性動脈硬化症を抑制したことを示す。
【0154】
（Ｆ＆Ｖ補給はＬＤＬＲ ＫＯマウスにおける高脂肪食誘発性の肝脂肪症を予防した）
【0155】
３群間で体重に有意差はなかった（図１８Ａ）。しかし、肝臓重量および最終体重に対する肝臓重量の比率は、ＨＦ０食餌を与えたマウスにおいて、ＬＦ食餌を与えたマウスより高かった。ＨＦ１５食餌を与えたマウスは、ＨＦ０食餌を与えたマウスと比較して、低い肝臓重量および最終体重に対する肝臓重量の比率を有していた（図１８Ｂおよび１８Ｃ）。
【0156】
脂肪肝に対するＦＶの効果を検討した。ＨＦ０食餌を与えたマウスは、ＬＦ食餌を与えたマウスより大きい肝脂肪の面積を有していた（１．９倍の増加）。ＨＦ０食餌を与えたマウスと比較して、ＨＦ１５食餌を与えたマウスの肝脂肪症の面積は８０％以上減少した（図１９）。
【0157】
（大動脈アテローム性動脈硬化症の抑制および肝脂肪症の予防に対するＦ＆Ｖ補給の効果は、ＬＤＬＲ ＫＯマウスにおける食餌誘発性の脂質異常症の改善および血清ＴＮＦαレベルの低下と関連する）
【0158】
脂質代謝の調節異常はアテローム性動脈硬化症の病原性と関連するので、血漿脂質プロファイルを評価した。ＨＦ０食餌を与えたマウスは、ＬＦ食餌を与えたマウスより、有意に高い血漿トリグリセリド（ＴＧ）および低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）コレステロールのレベルを有しており、かつ有意に低い高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）コレステロールのレベルを有していた。ＨＦ１５食餌を与えたマウスは、ＬＦ食餌を与えたマウスと同程度の水準まで脂質異常症を、有意に改善した（図２０Ａ－４Ｅ）。さらに、ＴＧ／ＨＤＬ（図２０Ｆ）、ＬＤＬ／ＨＤＬ（図２０Ｇ）、およびｎｏｎ ＨＤＬ／ＨＤＬ（図２０Ｈ）の比率は、ＬＦを与えたマウスよりＨＦ０を与えたマウスにおいて高かった。ＨＦ１５食餌を与えたマウスは、ＨＦ０食餌を与えたマウスより、低い比率のＴＧ／ＨＤＬ（図２０Ｆ）、ＬＤＬ／ＨＤＬ（図２０Ｇ）および非ＨＤＬ／ＨＤＬ（図２０Ｈ）を有しており、Ｆ＆ＶがＬＤＬＲ ＫＯマウスにおける食餌誘発性の脂質異常症を改善することが示された。
【0159】
ＬＤＬＲ ＫＯマウスにおける高脂肪食誘発性の大動脈アテローム性動脈硬化症の抑制および肝脂肪症の予防に対するＦ＆Ｖ補給の効果が、循環中の炎症誘発性サイトカインレベルの低下によって媒介されるかどうかを検討した。Ｆ＆Ｖ補給は血清ＴＮＦαレベルを有意に低下させた（図２１Ａ）。血清ＩＬ－６（図２１Ｂ）、ＩＬ－１β（図２１Ｃ）、およびＫＣ／ＧＲＯ（図２１Ｄ）のような他の炎症誘発性サイトカインレベルは、ＨＦ０食餌を与えたマウスのと比較して、ＨＦ１５食餌を与えたマウスにおいてより低い傾向にあった。
【0160】
Ｆ＆Ｖ補充は脂質異常症を軽減し、かつ血清ＴＮＦαレベルを低下させたので、新規脂質生合成に関与する重要な脂質生成酵素である肝脂肪酸合成酵素（Ｆａｓｎ）のｍＲＮＡレベル、および脂肪肝の病態形成に重要な役割を果たし、アテローム発生に関与しえるＴＮＦαのｍＲＮＡレベルを、決定した［５－８］。ＨＦ０食餌を与えたマウスは、ＬＦ食餌を与えたマウスより高い、肝組織中のＦａｓｎおよびＴＮＦαのｍＲＮＡレベルを有していることがわかった（図２２Ａおよび２２Ｂ）。ＨＦ０食餌を与えたマウスと比較して、ＨＦ１５食餌を与えたマウスは、これら２つの遺伝子の、有意に低い発現レベルを有していた（図２２Ａおよび２２Ｂ）。
【0161】
循環中の炎症誘発性サイトカインＴＮＦαレベルおよび脂質異常症は、アテローム性動脈硬化症［５、６、９－１１］および肝脂肪症［７、１２、１３］の病原性に重要な役割を果たすことが知られている。そこで、Ｓｐｅａｒｍａｎ相関解析を行った。大動脈アテローム性硬化病変および肝脂肪変性の面積は、血漿ＨＤＬと負の相関（それぞれｐ＜０．００１）を示し、ＴＮＦα、およびＬＤＬ／ＨＤＬ、ＴＧ／ＨＤＬおよびｎｏｎ ＨＤＬ／ＨＤＬの比率と、有意かつ正に相関することがわかった（図２２）。われわれの結果は、Ｆ＆Ｖ混合物が、血漿ＴＮＦαレベルの低下および脂質異常症の改善によって媒介され得るＨＦ誘発性のアテローム性動脈硬化症および肝脂肪症を予防することを示している。
【0162】
（Ｆ＆Ｖ補給は、ＬＤＬＲ ＫＯマウスにおける腸内微生物叢の腸内毒素症状を軽減した）
腸内微生物叢に対するＦ＆Ｖ補給の効果を評価するために、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に基づく分類学的プロファイリングを実施した。ＨＦ食餌を与えたマウスと比較して、Ｆ＆Ｖを補ったＨＦ食餌を与えたマウスは、糞便微生物叢において有意に高いアルファ多様性を有していることがわかった。Ｐｒｉｃｉｐａｌ Ｃｏｏｄｉｎａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓは、両方のＬＦ食餌およびＨＦ食餌と比較してＦ＆Ｖ消費の腸内微生物叢のシフトを示した（図２４Ｂ）。
腸内微生物叢に対するＦ＆Ｖ補給の効果を評価するために、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に基づく分類学的プロファイリングを実施した。ＨＦ食餌を与えたマウスと比較して、Ｆ＆Ｖを補ったＨＦ食餌を与えたマウスは、糞便微生物叢において有意に高いアルファ多様性を有していることがわかった。Ｐｒｉｃｉｐａｌ Ｃｏｏｄｉｎａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓは、両方のＬＦ食餌およびＨＦ食餌と比較してＦ＆Ｖ消費の腸内微生物叢のシフトを示した（図２４Ｂ）。
【0163】
（実施例２の参考文献）
1. Meydani, M., et al., Long-term vitamin E supplementation reduces atherosclerosis and mortality in Ldlr-/- mice, but not when fed Western style diet. Atherosclerosis, 2014. 233(1): p. 196-205.
2. Callahan, B.J., et al., Bioconductor Workflow for Microbiome Data Analysis: from raw reads to community analyses. F1000Res, 2016. 5: p. 1492.
3. Goodrich, J.K., et al., Conducting a microbiome study. Cell, 2014. 158(2): p. 250-262.
4. Lozupone, C.A. and R. Knight, Species divergence and the measurement of microbial diversity. FEMS Microbiol Rev, 2008. 32(4): p. 557-78.
5. Ohta, H., et al., Disruption of tumor necrosis factor-alpha gene diminishes the development of atherosclerosis in ApoE-deficient mice. Atherosclerosis, 2005. 180(1): p. 11-7.
6. Branen, L., et al., Inhibition of tumor necrosis factor-alpha reduces atherosclerosis in apolipoprotein E knockout mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2004. 24(11): p. 2137-42.
7. Paredes-Turrubiarte, G., et al., Severity of non-alcoholic fatty liver disease is associated with high systemic levels of tumor necrosis factor alpha and low serum interleukin 10 in morbidly obese patients. Clin Exp Med, 2016. 16(2): p. 193-202.
8. Seo, Y.Y., et al., Tumor Necrosis Factor-alpha as a Predictor for the Development of Nonalcoholic Fatty Liver Disease: A 4-Year Follow-Up Study. Endocrinol Metab (Seoul), 2013. 28(1): p. 41-5.
9. Zhang, Y., et al., TNF-alpha promotes early atherosclerosis by increasing transcytosis of LDL across endothelial cells: crosstalk between NF-kappaB and PPAR-gamma. J Mol Cell Cardiol, 2014. 72: p. 85-94.
10. McKellar, G.E., et al., Role for TNF in atherosclerosis? Lessons from autoimmune disease. Nat Rev Cardiol, 2009. 6(6): p. 410-7.
11. Boesten, L.S., et al., Tumor necrosis factor-alpha promotes atherosclerotic lesion progression in APOE*3-Leiden transgenic mice. Cardiovasc Res, 2005. 66(1): p. 179-85.
12. Diehl, A.M., Tumor necrosis factor and its potential role in insulin resistance and nonalcoholic fatty liver disease. Clin Liver Dis, 2004. 8(3): p. 619-38, x.
13. Kakino, S., et al., Pivotal Role of TNF-alpha in the Development and Progression of Nonalcoholic Fatty Liver Disease in a Murine Model. Horm Metab Res, 2018. 50(1): p. 80-87.
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2. Callahan, B.J., et al., Bioconductor Workflow for Microbiome Data Analysis: from raw reads to community analyses. F1000Res, 2016. 5: p. 1492.
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5. Ohta, H., et al., Disruption of tumor necrosis factor-alpha gene diminishes the development of atherosclerosis in ApoE-deficient mice. Atherosclerosis, 2005. 180(1): p. 11-7.
6. Branen, L., et al., Inhibition of tumor necrosis factor-alpha reduces atherosclerosis in apolipoprotein E knockout mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2004. 24(11): p. 2137-42.
7. Paredes-Turrubiarte, G., et al., Severity of non-alcoholic fatty liver disease is associated with high systemic levels of tumor necrosis factor alpha and low serum interleukin 10 in morbidly obese patients. Clin Exp Med, 2016. 16(2): p. 193-202.
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10. McKellar, G.E., et al., Role for TNF in atherosclerosis? Lessons from autoimmune disease. Nat Rev Cardiol, 2009. 6(6): p. 410-7.
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12. Diehl, A.M., Tumor necrosis factor and its potential role in insulin resistance and nonalcoholic fatty liver disease. Clin Liver Dis, 2004. 8(3): p. 619-38, x.
13. Kakino, S., et al., Pivotal Role of TNF-alpha in the Development and Progression of Nonalcoholic Fatty Liver Disease in a Murine Model. Horm Metab Res, 2018. 50(1): p. 80-87.
【0164】
〔実施例３〕
基礎およびＨＦＤを与えたマウスの寿命に対する本明細書に記載のＦ＆Ｖ組成物の効果を決定するために実験を行う。組成物はマウスの寿命および健康期間を増加させ、その影響は食餌を与えられたマウスにおいてより劇的であると考えられる。肥満と同様に、加齢では、酸化ストレスの増加、炎症、セラミドの増加および腸内細菌叢の変化が認められる。加齢に伴う慢性・感染症の多くは肥満にも見られる。
基礎およびＨＦＤを与えたマウスの寿命に対する本明細書に記載のＦ＆Ｖ組成物の効果を決定するために実験を行う。組成物はマウスの寿命および健康期間を増加させ、その影響は食餌を与えられたマウスにおいてより劇的であると考えられる。肥満と同様に、加齢では、酸化ストレスの増加、炎症、セラミドの増加および腸内細菌叢の変化が認められる。加齢に伴う慢性・感染症の多くは肥満にも見られる。
【0165】
上記明細書に記載された全ての刊行物、特許、特許出願およびアクセッション番号は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明を特定の実施形態に関連して説明してきたが、請求項に係る発明はそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、記載された本発明の組成物および方法の種々の改変および変形は当業者に明らかであり、そして以下の特許請求の範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【0166】
【図1-1】Ｆ＆Ｖ補給したＨＦ食餌を与えられたマウスがより少ない体重増加および脂肪組織質量を有したことを示す。
【図2-1】Ｆ＆Ｖ補給が脂肪組織の炎症性の細胞浸潤を抑制し、ＮＡＦＬＤを予防したことを示している。
【図3-1】Ｆ＆Ｖ補給が血清および肝臓のセラミド濃度を低下させることを示している。
【図4】肝臓のＦＸＲ発現レベル、ｎＳＭａｓｅ活性、全身および肝臓のＴＮＦαレベルに対するＦ＆Ｖ補給の効果を示している。
【図5】基礎食餌またはＨＦ食餌のいずれかにおけるＦ＆Ｖ補給が腸内細菌多様性を増加させたことを示している。
【図6-1】Ｆ＆Ｖ補給が細菌群生組成を変化させたことを示す。
【図7】２つの食餌供給群を比較するＳｐｅａｒｍａｎの相関係数に基づく相関行列ヒートマップを示す。
【図8】ＨＦＤ＋１５％のＦ＆Ｖを与えたマウスが低い脾臓重量および脾臓重量指数を有したことを示す。
【図10A】動物食餌の果物および野菜成分の例示的な組成を示す。
【図10B】動物食餌の果物および野菜成分の例示的な組成を示す。
【図10C】動物食餌の果物および野菜成分の例示的な組成を示す。
【図11-1】Ｆ＆Ｖ補給が糞便重量、糞便エネルギー密度、糞便エネルギー排泄量（Ａ－Ｊ）を増大させたことを示している。
【図12】Ｆ＆Ｖ補給がｅＡＴにおける炎症誘発性のｍＲＮＡ発現を下方制御したことを示す。
【図13-1】Ｆ＆Ｖ補給が血清脂質プロファイリングに対する有意な効果を有しなかったことを示している。
【図14】Ｆ＆Ｖ補給が肝臓セラミドシンターゼのｍＲＮＡ発現に有意な影響を及ぼさなかったことを示す。
【図15-1】Ｆ＆Ｖ補給が特定の細菌群生組成の存在比を有意に変化させたことを示す。
【図16】Ｆ＆Ｖ補給がグルコース耐性ならびに食餌に誘導されるＴ細胞増殖およびＴ細胞増大の抑制を、改善したことを示している。
【図17】ＬＤＬＲ ＫＯマウスにおいて、Ｆ＆Ｖ補給が高脂肪食餌に誘導される大動脈アテローム性動脈硬化症を抑制したことを示している。
【図18】ＬＤＬＲ ＫＯマウスにおける体重および肝重量に対するＦ＆Ｖ補給の効果を示す。
【図19】Ｆ＆Ｖ補給がＬＤＬＲ ＫＯマウスにおける高脂肪食餌に誘導される肝脂肪症を予防したことを示している。
【図20-1】Ｆ＆Ｖ補給がＬＤＬＲ ＫＯマウスの脂質異常症を改善したことを示している。
【図21】ＬＤＬＲ ＫＯマウスにおける血漿炎症誘発性サイトカインレベルに対するＦ＆Ｖ補給の効果を示す。
【図22-1】Ｆ＆Ｖ補給がＬＤＬＲ ＫＯマウスにおけるサイトカインの肝臓ｍＲＮＡレベルを低下させたことを示している。
【図23】Ｓｐｅａｒｍａｎ相関のヒートマップがＬＤＬＲ ＫＯマウスにおける、血漿ＴＮＦαおよび脂質プロファイルに対する大動脈アテローム性動脈硬化性の病変および肝脂肪変性の面積を示すことを示す。
【図24】ＨＦ食餌におけるＦ＆Ｖ補給が腸内細菌多様性を増加させたことを示している。
【図25-1】Ｆ＆Ｖ補給が細菌群生組成を変化させたことを示す。
【図26】Ｆ＆Ｖ補給が細菌群集組成を変化させたことを示す。
【図27】Ｆ＆Ｖ補給がＬＤＬＲ ＫＯマウスにおける脂質異常症を改善したことを示している。
【図28-1】Ｆ＆Ｖ補給がＬＤＬＲ ＫＯマウスにおける血漿サイトカインレベルを低下させたか、または血漿サイトカインレベルに効果しなかったことを示す。
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11-1】
【図11-2】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図13-3】
【図14】
【図15-1】
【図15-2】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20-1】
【図20-2】
【図21】
【図22-1】
【図22-2】
【図23】
【図24】
【図25-1】
【図25-2】
【図26】
【図27】
【図28-1】
【図28-2】
【配列表】