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▶ バイオアフィニティ テクノロジーズ，インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-03
(45)【発行日】2024-10-11
(54)【発明の名称】肺の健康状態を決定するシステム及び方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20241004BHJP
G01N 33/533 20060101ALI20241004BHJP
G01N 33/483 20060101ALI20241004BHJP
G01N 21/78 20060101ALI20241004BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 D
G01N33/533
G01N33/483 C
G01N21/78 C
【請求項の数】
41
(21)【出願番号】P 2021505631
(86)(22)【出願日】2019-04-15
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-08-26
(86)【国際出願番号】 US2019027550
(87)【国際公開番号】W WO2019200403
(87)【国際公開日】2019-10-17
【審査請求日】2022-04-14
(31)【優先権主張番号】62/657,584
(32)【優先日】2018-04-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】520398696
【氏名又は名称】バイオアフィニティ テクノロジーズ，インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＡＦＦＩＮＩＴＹ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ，ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】２２２１１ Ｗｅｓｔ Ｉｎｔｅｒｓｔａｔｅ １０，Ｓｕｉｔｅ １２０６，Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ ７８２５７（ＵＳ）
(74)【代理人】
【識別番号】110000659
【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】レベル，ヴィヴィアン，アイ．
【審査官】川野 汐音
(56)【参考文献】
【文献】特表２００４－５３６２７５（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１１／０１８９６７０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】SHIOTA, Y. et al.，Flow cytometric analysis of lymphocytes and lymphocyte subpopulations in induced sputum from patients with asthma，ALLERGOLOGY INTERNATIONAL，JAPANESE SOCIETY OF ALLERGOLOGY，2000年05月31日，Vol.49/No.2，p.125-133
【文献】UEI Y. AND NOGUCHI, Y.，COMPARISON OF CYTOLOGIC MARKERS FOR AUTOMATED LUNG CANCER SCREENING，ANALYTICAL AND QUANTITATIVE CYTOLOGY AND HISTOLOGY，SCIENCE PRINTERS AND PUBLISHERS, INC，1990年10月，Vol.12/No.5，p.327-332
【文献】TYRER H.W. et al.，AUTOMATIC CELL INDENTIFICATION AND ENRICHMENT IN LUNG CANCER: V. ADENOCARCINOMA AND LARGE CELL UNDIFFERENTIATED CARCINOMA，CYTOMETRY，1985年，Vol.6/No.1，p.37-46
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験者の肺癌の可能性を予測するための方法であって、ｅｘ－ｖｉｖｏ喀痰サンプルを、以下のプローブの組み合わせ、すなわち、
ｉ）喀痰細胞の白血球集団に発現するバイオマーカに結合する第１の標識プローブ、
ｉｉ）喀痰細胞の顆粒球細胞集団に発現するバイオマーカに結合する顆粒球プローブ、喀痰細胞のＴ細胞細胞集団に発現するバイオマーカに結合するＴ細胞プローブ、喀痰細胞のＢ細胞細胞集団に発現するバイオマーカに結合するＢ細胞プローブ、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される第２の標識プローブ、
ｉｉｉ）マクロファージ細胞集団のバイオマーカに結合する第３の標識プローブ、
ｉｖ）前記喀痰サンプル中の肺癌関連細胞に結合する第４の標識プローブの組み合わせ、
または、
以下のプローブの組み合わせ、すなわち、
ｉ）喀痰細胞の白血球集団に発現するバイオマーカに結合する第１の標識プローブ、
ｉｖ）前記喀痰サンプル中の肺癌関連細胞に結合する第４の標識プローブ、
ｖ）喀痰細胞の上皮細胞集団に発現するバイオマーカに結合する第５の標識プローブ、
ｖｉ）喀痰細胞の上皮細胞集団に発現する細胞表面バイオマーカに結合する第６の標識プローブの組み合わせ、
で標識するステップと、
前記標識された喀痰サンプルをフローサイトメトリーで分析して、細胞ごとのサイトメトリーデータを含むデータを取得するステップと、
前記標識された喀痰サンプルから取得されたデータから、
バイオマーカ１を同定するための、ｉ）に対して陽性である喀痰細胞と比較して、ｉ）に対して陰性である前記標識された喀痰サンプルから収集されたデータ中の前記喀痰細胞の比率、
バイオマーカ２を同定するための、ｉ）に対して陰性かつｉｖ）及びｖ）に対して陽性の前記喀痰細胞、
バイオマーカ３を同定するための、ｉ）、ｉｉｉ）に対して陽性かつＦＩＴＣ自家蛍光を示す前記喀痰細胞、
バイオマーカ４を同定するための、ｉ）に対して陰性かつｖ）及びｖｉ）に対して陽性の前記喀痰細胞、
の少なくとも１つを決定するステップとを含み、
前記細胞ごとの標識データにおける標識プローブの存在又は不在のプロファイルが、前記細胞ごとのデータから被験者の肺癌の可能性を検出するためのものとなる方法。
【請求項2】
肺癌疾患を有する可能性が高い、中程度、又は低いとの前記喀痰サンプルの分類を生成するために、前記細胞ごとのサイトメトリーデータをプログラムされたコンピュータの訓練されたアルゴリズムに入力し、肺癌疾患に対する前記喀痰サンプルの分類を同定した報告書を電子的に出力するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
バイオマーカ１について、前記比率が２未満の場合、前記喀痰サンプルがバイオマーカ１に対して陽性であることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記バイオマーカ１が、少なくとも約８０％の感度及び少なくとも５０％の特異性を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
ｉ）に対して陰性かつｉｖ）及びｖ）に対して陽性の喀痰細胞の割合が０．０３％を超える場合、前記喀痰サンプルがバイオマーカ２に対して陽性であることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記バイオマーカ２が、少なくとも９０％の感度及び少なくとも５０％の特異性を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
バイオマーカ２を同定するために、前記標識された喀痰サンプルから収集されたデータから、ｉ）に対して陰性かつｉｖ）及びｖ）に対して陽性の前記喀痰細胞を決定するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項8】
ｉ）に対して陰性かつｉｖ）及びｖ）に対して陽性の喀痰細胞の割合が０．０３％を超える場合、前記喀痰サンプルがバイオマーカ２に対して陽性であることを示す、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記バイオマーカ１と前記バイオマーカ２との組み合わせが、少なくとも８０％の感度及び少なくとも８０％の特異性を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
ｉ）、ｉｉｉ）に対して陽性かつＦＩＴＣ自家蛍光を示す喀痰細胞の割合が０．０３％を超える場合、前記喀痰サンプルがバイオマーカ３に対して陽性であることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記バイオマーカ３が、少なくとも６０％の感度及び少なくとも７０％の特異性を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
バイオマーカ３を同定するために、前記標識された喀痰サンプルから収集されたデータから、ｉ）、ｉｉｉ）及びｖ）に対して陽性の前記喀痰細胞を決定するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項13】
ｉ）、ｉｉｉ）に対して陽性かつＦＩＴＣ自家蛍光を示す喀痰細胞の割合が０．０３％を超える場合、前記喀痰サンプルがバイオマーカ３に対して陽性であることを示す、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記バイオマーカ１、前記バイオマーカ２、及び前記バイオマーカ３の組み合わせが、少なくとも８０％の感度及び少なくとも８０％の特異性を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
ｉ）に対して陰性かつｖ）及びｖｉ）に対して陽性の細胞の割合が２％を超える場合、前記サンプルがバイオマーカ４に対して陽性であることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
前記バイオマーカ４が、少なくとも７０％の感度及び少なくとも７０％の特異性を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
バイオマーカ４を同定するために、前記標識された喀痰サンプルから収集されたデータから、ｉ）に対して陰性かつｖ）及びｖｉ）に対して陽性の前記喀痰細胞を決定するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項18】
ｉ）に対して陰性かつｖ）及びｖｉ）に対して陽性の細胞の割合が２％を超える場合、前記サンプルがバイオマーカ４に対して陽性であることを示す、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記バイオマーカ１、前記バイオマーカ２、前記バイオマーカ３、及び前記バイオマーカ４の組み合わせが、少なくとも７０％の感度及び少なくとも７５％の特異性を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記フローサイトメトリー分析が、直径が約５μｍ未満及び約３０μｍを超える細胞をデータ分析から除外するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項21】
前記フローサイトメトリー分析が、死細胞及び複数の細胞塊である細胞をデータ分析から除外するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項22】
喀痰細胞の白血球集団に発現するバイオマーカに結合する前記第１の標識プローブが、ＣＤ４５抗体又はそのフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項23】
前記第２の標識プローブが、喀痰細胞の顆粒球細胞集団に発現するバイオマーカに結合する顆粒球プローブであり、ＣＤ６６ｂ抗体又はそのフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項24】
前記第２の標識プローブが、喀痰細胞のＴ細胞細胞集団に発現するバイオマーカに結合するＴ細胞プローブであり、ＣＤ３抗体又はそのフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項25】
前記第２の標識プローブが、喀痰細胞のＢ細胞細胞集団に発現するバイオマーカに結合するＢ細胞プローブであり、ＣＤ１９抗体又はそのフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項26】
前記第２の標識プローブが、前記顆粒球プローブ、前記Ｔ細胞プローブ、及び前記Ｂ細胞プローブの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項27】
前記顆粒球プローブがＣＤ６６ｂ抗体又はそのフラグメントであり、前記Ｔ細胞プローブがＣＤ３抗体又はそのフラグメントであり、前記Ｂ細胞プローブがＣＤ１９抗体又はそのフラグメントである、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
喀痰細胞のマクロファージ細胞集団のバイオマーカに結合する前記第３の標識プローブが、ＣＤ２０６抗体又はそのフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項29】
前記喀痰サンプル中の肺癌関連細胞に結合する前記第４の標識プローブが、テトラ（４－カルボキシフェニル）ポルフィリン（ＴＣＰＰ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項30】
喀痰細胞の上皮細胞集団上に発現するバイオマーカに結合する前記第５の標識プローブが、ｐａｎＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ抗体又はそのフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項31】
喀痰細胞の上皮細胞集団に発現する細胞表面バイオマーカに結合する前記第６の標識プローブが、ＥｐＣａｍ抗体又はそのフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項32】
前記肺癌関連細胞が、肺癌細胞又は腫瘍関連免疫細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項33】
前記喀痰細胞が固定されているか、又は固定されていない、請求項１に記載の方法。
【請求項34】
前記ｉ）～ｖｉ）の標識プローブのいずれかの細胞ごとのサイトメトリーデータを含むデータが、喀痰サンプルシグネチャを生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項35】
前記喀痰サンプルシグネチャが、肺癌疾患を同定する、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記喀痰サンプルシグネチャが、コントロール喀痰サンプルシグネチャ（非罹患）及び肺癌サンプルシグネチャのデータベースと比較されて、肺癌が同定される、請求項３４に記載の方法。
【請求項37】
被験者の肺癌の可能性を予測するための方法であって、ｅｘ－ｖｉｖｏ喀痰サンプルを、ｉ）前記喀痰サンプル中の肺癌関連細胞に結合する蛍光性のポルフィリン、及びｉｉ）喀痰細胞のマーカに対して向けられた１つ以上の蛍光色素結合プローブで標識するステップと、
前記標識された喀痰サンプルをフローサイトメトリーで分析して、細胞ごとのサイトメトリーデータを含むデータを取得するステップとを含み、
前記細胞ごとの標識データにおけるｉ）及びｉｉ）の存在又は不在のプロファイルが、前記細胞ごとのデータから被験者の肺癌の可能性を検出するためのものとなる方法。
【請求項38】
前記ｉ）～ｉｉ）のいずれかの細胞ごとのサイトメトリーデータを含むデータが、喀痰サンプルシグネチャを生成する、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記喀痰サンプルシグネチャが、前記肺癌を同定する、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
前記喀痰サンプルシグネチャが、コントロール喀痰サンプルシグネチャ（非罹患）及び肺癌サンプルシグネチャのデータベースと比較されて、肺癌が同定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項41】
前記喀痰サンプル中の肺癌関連細胞に結合する前記蛍光性のポルフィリンが、テトラ（４－カルボキシフェニル）ポルフィリン（ＴＣＰＰ）である、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１８年４月１３日に出願された「肺の健康状態を決定するシステム及び方法」と題された米国仮特許出願第６２／６５７，５８４号の出願の優先権及び利益を主張し、その明細書及び特許請求の範囲は参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究又は開発に関する声明
この出願は、２０１８年４月１３日に出願された「肺の健康状態を決定するシステム及び方法」と題された米国仮特許出願第６２／６５７，５８４号の出願の優先権及び利益を主張し、その明細書及び特許請求の範囲は参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究又は開発に関する声明
【0002】
該当せず
共同研究契約の当事者
共同研究契約の当事者
【0003】
該当せず
コンパクトディスクで提出された資料の参照による組込み
コンパクトディスクで提出された資料の参照による組込み
【0004】
該当せず
発明者又は共同発明者による先行開示に関する陳述
発明者又は共同発明者による先行開示に関する陳述
【0005】
該当せず
著作権で保護された資料
著作権で保護された資料
【0006】
該当せず
【背景技術】
【0007】
以下の議論は、著者及び発行年による多数の刊行物に言及しており、最近の刊行日のために、特定の刊行物は、本発明に対する先行技術と見なされないことに留意されたい。本明細書におけるそのような刊行物の議論は、より完全な背景のために与えられており、そのような刊行物が特許性決定の目的のための先行技術であることを認めるものとして解釈されるべきではない。
【0008】
低線量コンピュータ断層撮影（ＬＤＣＴ）は、特に米国メディケア・メディケイドサービスセンター（ＣＭＳ）によって、５５歳～７５歳の、３０年間毎日１箱のタバコに相当する量を喫煙し、かつ１５年間禁煙していない個人として定義された高リスク集団において、早期診断の方法として肺癌をスクリーニングする現在の標準治療である。これまでで最大の肺癌検診スクリーニング試験である全米肺癌スクリーニング試験（ＬＣＳＴ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｔｒｉａｌ）によれば、ＬＤＣＴの感度は９３．８％である一方、その特異性は７３．４％であることが示されている。ＬＣＳＴによれば、調査した高リスク集団におけるＬＤＣＴの偽陽性率が３．８％であったことが示され、ＬＤＣＴで陽性と判定されたが肺癌を患っていない患者では、多くの不必要な、しばしば侵襲的な、潜在的に有害な事後手順につながった。したがって、ＬＤＣＴの特異性を改善し、それによってその偽陽性率を低下させることに差し迫った必要性がある。この必要性に対処するアプローチの１つは、ＬＤＣＴの補助として使用できる、肺癌に対する高い特異性を備えた追加のアッセイの開発である。蛍光性の高いテトラ（４－カルボキシフェニル）ポルフィリン（ＴＣＰＰ）は、正常細胞と比較して癌細胞に選択的に結合するため、癌細胞を周囲のバックグラウンド細胞から区別できる診断標識の開発に独自に適している。肺癌のリスクが高い個人をスクリーニングする標準治療は、ＬＤＣＴを使用した胸部の年次画像診断から構成される（１）。ＬＤＣＴは非常に感度が高いものの、偽陽性率が高く、最終的に癌の検査で陰性となる患者に対して関連するリスクを伴う複数の反射診断手順につながる。リスクには、追加の高線量放射線被曝、並びに胸腔穿刺、気管支鏡検査、及びコア針生検などの侵襲的手順による合併症及び罹患状態が含まれる。これらの手順に関連する有害事象のリスク及び追加の経済的負担は重大であり、ＬＤＣＴ結果の陽性判定後の、より安全でより侵襲性の低い反射検査の医学的必要性は明らかである（２）。代替の検査方法は、手頃な価格の補助検査を用いて、特異性を高め、偽陽性率を下げ、スクリーニングの陽性予測値を改善することによって、ＬＤＣＴの高感度を理想的に補完する。
【0009】
液体生検の形態の低侵襲技術が、ＬＤＣＴ結果の陽性判定後の、反射性肺癌検査のために提案されている。液体生検を使用して、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）及び遊離腫瘍核酸を患者の末梢血サンプルから収集することができる。ＣＴＣ及び核酸は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）などの分子技術を使用して検査し、癌の存在を予測できる癌関連遺伝子変異の存在と、特定の標的療法に対する患者の腫瘍の反応とを判定する（３）。これらの技術は肺癌の推定５０～７５％の突然変異を同定できるが（４、５）、腫瘍にそのような特定の遺伝子異常がないＬＤＣＴ陽性患者は、液体生検では陰性の結果となる。さらに、ＣＴＣはまれであり（１０９個の正常細胞あたり１細胞程度）、腫瘍の核酸濃度は、臨床的に利用可能なほとんどの分子検査法の検出限界を下回ることが多い（６）。したがって、液体生検は、患者の腫瘍ゲノムに関する貴重な治療情報を提供する可能性があるが、早期癌診断を目的とした検査よりも、肺癌診断アルゴリズムのより後の段階でより適切に利用される。
【0010】
気管支洗浄検体の液状化細胞診検査は、従来の喀痰スミアを使用した病理検査のために、潜在的な悪性細胞のサンプリングを提供する。患者の気道から細胞を回収するために使用される気管支鏡検査の手順は、コア針肺組織生検よりも侵襲性が低い。しかしながら、依然として出血などの有害事象のリスクがある（７）。さらに、関連する医療費は、特に入院患者ベースで実行される場合、多額になる可能性がある。ＬＤＣＴ陽性患者のごく少数（すなわち、４％未満）のみが実際に肺癌を患っていることが判明することを考えると、診断材料を提供するために、代替の、経済的で、よりアクセスしやすい肺の悪性細胞供給源に対する医学的必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
病理学者は、肺癌の非侵襲的で迅速かつ特異的な検出方法として、数十年にわたって喀痰の定期的な細胞学的検査を行ってきた。従来の喀痰細胞診では、サンプルを染色し、悪性細胞について顕微鏡でスクリーニングする。しかしながら、従来の喀痰細胞診は感度が低い（約６５％）という問題がある（８）。ＫＲＡＳ変異検査を含む、喀痰分析の感度を高めるさまざまな方法が試みられてきた。患者の腫瘍が実際にＫＲＡＳ変異している場合、ＫＲＡＳ検査は感度及び特異性の両方を有し得るが、実際にＫＲＡＳ遺伝子変異を有するのは肺癌の１５～２０％だけである。したがって、ＫＲＡＳ変異陰性腫瘍細胞はこの技術では検出されない（９）。自動喀痰サイトメトリーと呼ばれる代替のＤＮＡベースのアプローチは、悪性腫瘍に関連する変化について喀痰上皮細胞の核ＤＮＡ特性を評価するために、特別な染色及びコンピュータ支援画像分析を利用する。この技術は、従来の細胞診よりもやや感度が高いものの、その特異性は約５０％に過ぎない（１０）。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明の一実施形態は、被験者の肺疾患の可能性を予測する方法であって、ｅｘ－ｖｉｖｏ喀痰サンプルを、以下のプローブ、ｉ）喀痰細胞の白血球集団に発現するバイオマーカに結合する第１の標識プローブ、ｉｉ）喀痰細胞の顆粒球細胞集団に発現するバイオマーカに結合する顆粒球プローブ、喀痰細胞のＴ細胞細胞集団に発現するバイオマーカに結合するＴ細胞プローブ、喀痰細胞のＢ細胞細胞集団に発現するバイオマーカに結合するＢ細胞プローブ、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される第２の標識プローブ、ｉｉｉ）マクロファージ細胞集団のバイオマーカに結合する第３の標識プローブ、ｉｖ）前記喀痰サンプル中の疾患関連細胞に結合する第４の標識プローブ、ｖ）喀痰細胞の上皮細胞集団に発現するバイオマーカに結合する第５の標識プローブ、及びｖｉ）喀痰細胞の上皮細胞集団に発現する細胞表面バイオマーカに結合する第６の標識プローブの１つ以上で標識するステップを含む方法を提供する。標識された喀痰サンプルは、例えば、フローサイトメトリー分析されて、ｉ）～ｖｉ）の標識プローブのいずれかの平均蛍光シグネチャに基づく細胞ごとのサイトメトリーデータを含むデータが取得される。細胞ごとのデータは、細胞ごとの標識データにおける標識プローブの存在又は不在のプロファイルに基づいて、被験者の肺疾患の可能性を決定するために検出される。得られたデータをさらに分析して、喀痰サンプル中のバイオマーカの存在又は不在を同定することができる。例えば、疾患関連細胞は、肺癌細胞又は腫瘍関連免疫細胞であり得る。肺疾患は、喘息、ＣＯＰＤ、インフルエンザ、慢性気管支炎、結核、嚢胞性線維症、肺炎、移植片対宿主病、及び肺癌からなる群から選択され得る。さらに、標識された喀痰細胞は、固定されていても固定されていなくてもよい。
【0013】
標識された喀痰サンプルから収集されたデータは、細胞の集団及びそこから同定されたバイオマーカによって特徴付けることができる。例えば、バイオマーカ１を同定するために、ｉ）に対して陽性である痰細胞と比較して、ｉ）について陰性である、標識された喀痰サンプルから収集されたデータ中の喀痰細胞の比率が決定される。一例では、比率が２未満の場合、喀痰サンプルがバイオマーカ１に対して陽性であることを示す。一実施形態では、陽性バイオマーカ１は、バイオマーカ１を適用して、肺癌（ｃ）喀痰サンプルを高リスク（ＨＲ）喀痰サンプルから区別するために、少なくとも約８０％の感度及び少なくとも５０％の特異性を有する。感度は、少なくとも８５％、９０％、又は９５％であり、特異性は、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である。
【0014】
別の例では、バイオマーカ２を同定するために、標識された喀痰サンプルから収集されたデータから、ｉ）に対して陰性かつｉｖ）及びｖ）に対して陽性の喀痰細胞を同定する。例えば、ｉ）に対して陰性かつｉｖ）及びｖ）に対して陽性の喀痰細胞の割合が０．０３％を超える場合、喀痰サンプルがバイオマーカ２に対して陽性であることを示す。一実施形態では、陽性バイオマーカ２は、バイオマーカ２を適用して、肺癌（ｃ）喀痰サンプルを高リスク（ＨＲ）喀痰サンプルから区別するために、少なくとも９０％の感度及び少なくとも５０％の特異性を有する。感度は、少なくとも８０％、８５％、又は９５％であり、特異性は、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である。
【0015】
別の例では、喀痰細胞がｉ）、ｉｉｉ）に対して陽性かつＦＩＴＣ自家蛍光を示す場合、バイオマーカ３が同定される。例えば、ｉ）、ｉｉｉ）に対して陽性かつＦＩＴＣ自家蛍光を示す喀痰細胞の割合が０．０３％を超える場合、喀痰サンプルがバイオマーカ３に対して陽性であることを示す。一実施形態では、陽性バイオマーカ３は、バイオマーカ３を適用して、肺癌（ｃ）喀痰サンプルを高リスク（ＨＲ）喀痰サンプルから区別するために、少なくとも６０％の感度及び少なくとも７０％の特異性を有する。感度は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％であり、特異性は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である。
【0016】
別の例では、バイオマーカ４を同定するために、喀痰細胞がｉ）に対して陰性かつｖ）及びｖｉ）に対して陽性である場合、バイオマーカ４が同定される。例えば、ｉ）に対して陰性かつｖ）及びｖｉ）に対して陽性の細胞の割合が２％を超える場合、サンプルがバイオマーカ４に対して陽性であることを示す。一実施形態では、陽性バイオマーカ４は、バイオマーカ３を適用して、肺癌（ｃ）喀痰サンプルを高リスク（ＨＲ）喀痰サンプルから区別するために、少なくとも７０％の感度及び少なくとも７０％の特異性を有する。感度は、少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％であり、特異性は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である。
【0017】
別の実施形態では、陽性バイオマーカ１と陽性バイオマーカ２との組み合わせなど、複数のバイオマーカを組み合わせることにより、バイオマーカ１及び２を適用して肺癌（ｃ）喀痰サンプルを高リスク（ＨＲ）喀痰サンプルから区別するために、少なくとも８０％の感度及び少なくとも８０％の特異性を有することができる。さらに、陽性バイオマーカ１、２、及び３を組み合わせることにより、バイオマーカ１～３を適用して肺癌（ｃ）喀痰サンプルを高リスク（ＨＲ）喀痰サンプルから区別するために、少なくとも８０％の感度及び少なくとも８０％の特異性を生成する。さらに、陽性バイオマーカ１～４によって、バイオマーカ１～４を適用して肺癌（ｃ）喀痰サンプルを高リスク（ＨＲ）喀痰サンプルから区別するために、少なくとも７０％の感度及び少なくとも７５％の特異性を生成する。感度は、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％であり、特異性は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である。
【0018】
一実施形態では、フローサイトメトリー分析は、データ分析から、直径が約５μｍ未満及び約３０μｍを超える細胞を除外すること、死細胞及び複数の細胞塊である細胞を除外することの２つ以上を含み得る。
【0019】
別の実施形態では、喀痰細胞の白血球集団に発現するバイオマーカに結合する第１の標識プローブは、ＣＤ４５抗体又はそのフラグメントであり得る。
【0020】
別の実施形態では、第２の標識プローブは、喀痰細胞の顆粒球細胞集団に発現するバイオマーカに結合し、ＣＤ６６ｂ抗体又はそのフラグメントから選択され得る顆粒球プローブ、喀痰細胞のＴ細胞細胞集団に発現するバイオマーカに結合し、ＣＤ３抗体又はそのフラグメントであるＴ細胞プローブ、喀痰細胞のＢ細胞細胞集団に発現するバイオマーカに結合し、ＣＤ１９抗体又はそのフラグメントであるＢ細胞プローブの１つ以上であり、個別に又は組み合わせて、喀痰サンプルに添加される。
【0021】
別の実施形態では、喀痰細胞のマクロファージ細胞集団のバイオマーカに結合する第３の標識プローブは、ＣＤ２０６抗体又はそのフラグメントである。
【0022】
さらに別の実施形態では、喀痰サンプル中の疾患関連細胞に結合する第４の標識プローブは、テトラ（４－カルボキシフェニル）ポルフィリン（ＴＣＰＰ）である。
【0023】
さらに別の実施形態では、喀痰細胞の上皮細胞集団に発現するバイオマーカに結合する第５の標識プローブは、ｐａｎＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ抗体又はそのフラグメントである。
【0024】
さらなる実施形態において、喀痰細胞の上皮細胞集団に発現する細胞表面バイオマーカに結合する第６の標識プローブは、ＥｐＣａｍ抗体又はそのフラグメントである。
【0025】
収集されたデータは、喀痰サンプルシグネチャを生成するためのｉ）～ｖｉ）の標識プローブのいずれかの平均蛍光シグネチャに基づく細胞ごとのサイトメトリーデータを含み得る。喀痰サンプルのシグネチャは、肺及び／又は肺疾患の健康状態を同定する。肺疾患は、喘息、ＣＯＰＤ、インフルエンザ、慢性気管支炎、結核、嚢胞性線維症、肺炎、移植片対宿主病、及び肺癌からなる群から選択され得る。さらに、喀痰サンプルのシグネチャは、コントロール喀痰サンプルシグネチャ（非罹患）及び肺疾患サンプルシグネチャのデータベースと比較されて、肺疾患が同定される。本発明のいくつかの実施形態では、結果は、訓練されたアルゴリズムを使用して分類される。本発明の訓練されたアルゴリズムは、疾患を発症するリスクが高い被験者からの既知の喀痰サンプル、疾患を有すると認められた被験者の喀痰サンプル、及び正常であると同定された（疾患を有さないか、又は疾患を発症するリスクが高い）被験者からの喀痰サンプルの参照セットを使用して開発されたアルゴリズムを含む。サンプルの分類に適したアルゴリズムには、ｋ近傍アルゴリズム、概念ベクトルアルゴリズム、単純ベイズアルゴリズム、ニューラルネットワークアルゴリズム、隠れマルコフモデルアルゴリズム、遺伝的アルゴリズム、及び相互情報特徴選択アルゴリズム、又はそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。場合によっては、本発明の実施形態の訓練されたアルゴリズムには、細胞学者又は病理学者による診断又は被験者の病歴に関する情報などの、喀痰サンプルシグネチャ又は細胞ごとのサイトメトリーデータ又は平均蛍光シグネチャ以外のデータが組み込まれ得る。プログラムされたコンピュータでは、データは訓練されたアルゴリズムに入力され、肺疾患を有する可能性が高い、中程度、又は低いものに喀痰サンプルを分類し、肺疾患の上記喀痰サンプルの上記分類を同定するレポートを電子的に出力する。
【0026】
本発明の一実施形態は、肺疾患の可能性に関連する細胞集団内の１つ以上のバイオマーカを同定するための、被験者の喀痰サンプルからの喀痰細胞のフローサイトメトリー表現型分類のための第１の試薬組成物であって、ｉ）テトラ（４－カルボキシフェニル）ポルフィリン（ＴＣＰＰ）蛍光色素、並びにｉｉ）ＥｐＣＡＭ、及び／又はｐａｎＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ、及びｉｉｉ）ＣＤ４５、ＣＤ２０６、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ６６ｂ又はそれらの任意の組み合わせから選択される細胞のマーカに対して向けられた蛍光色素結合抗体又はそのフラグメントを含む、試薬組成物を提供する。
【0027】
本発明の別の実施形態は、肺疾患の可能性に関連する細胞集団内の１つ以上のバイオマーカを同定するための、被験者の喀痰サンプルからの喀痰細胞のフローサイトメトリー表現型分類のための第２の試薬組成物であって、ｉ）テトラ（４－カルボキシフェニル）ポルフィリン（ＴＣＰＰ）蛍光色素、並びに以下の細胞のマーカ、ｉｉ）ＥｐＣＡＭ及び／又はｐａｎＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ、及びｉｉｉ）ＣＤ４５に対して向けられた蛍光色素結合抗体を含む、試薬組成物を提供する。
【0028】
本発明の別の実施形態は、肺疾患の可能性に関連する細胞集団内の１つ以上のバイオマーカを同定するための、被験者の喀痰サンプルからの喀痰細胞のフローサイトメトリー表現型分類のための第３の試薬組成物であって、ｉ）テトラ（４－カルボキシフェニル）ポルフィリン（ＴＣＰＰ）蛍光色素、並びに以下の細胞のマーカ、ＣＤ４５、ＣＤ２０６、ＣＤ３、ＣＤ１９、及びＣＤ６６ｂの１つ以上に対して向けられた蛍光色素結合抗体を含む、試薬組成物を提供する。
【0029】
さらに別の実施形態は、被験者の肺疾患の可能性を予測する方法であって、ｅｘ－ｖｉｖｏ喀痰サンプルを、ｉ）喀痰サンプル中の疾患関連細胞に結合する標識プローブ、及びｉｉ）喀痰細胞のマーカに対して向けられた１つ以上の蛍光色素結合プローブで標識するステップを含む方法を提供する。標識された喀痰サンプルは、フローサイトメトリー分析されて、ｉ）～ｉｉ）の標識プローブのいずれかの平均蛍光シグネチャに基づく細胞ごとのサイトメトリーデータを含むデータが取得される。細胞ごとの標識データにおけるｉ）及びｉｉ）の存在又は不在のプロファイルに基づいて、細胞ごとのデータから、被験者の肺疾患の可能性が検出される。細胞ごとのサイトメトリーデータを含むデータは、ｉ）～ｉｉ）のいずれかの平均蛍光シグネチャに基づくことができ、喀痰サンプルシグネチャを生成する。一実施形態では、喀痰サンプルシグネチャは、例えば、肺疾患を同定し、肺疾患は、喘息、ＣＯＰＤ、インフルエンザ、慢性気管支炎、結核、嚢胞性線維症、肺炎、移植片対宿主病、及び肺癌からなる群から選択される。さらに、喀痰サンプルシグネチャは、コントロール喀痰サンプルシグネチャ（非罹患）及び肺疾患サンプルシグネチャのデータベースと比較されて、標識された喀痰サンプルから肺疾患が同定される。一実施形態では、喀痰サンプル中の疾患関連細胞に結合する標識プローブは、テトラ（４－カルボキシフェニル）ポルフィリン（ＴＣＰＰ）である。
【0030】
本発明の適用性のさらなる範囲は、添付の図面と併せて、以下の詳細な説明に部分的に示され、以下を検討することにより当業者には部分的に明らかになるか、又は本発明の実施により学習される。本発明の目的及び利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘される手段及び組み合わせによって実現及び達成され得る。
【図面の簡単な説明】
【0031】
本明細書に組み込まれ、その一部を成す添付の図面は、本発明の１つ以上の実施形態を示し、説明とともに、本発明の原理を説明するのに役立つ。図面は、本発明の１つ以上の実施形態を例示することのみを目的とし、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0032】
【図1A-B】解離した喀痰細胞のサイトスピンを示す。抗体又はＴＣＰＰで染色する前の、処理された喀痰細胞のライトギムザ染色サイトスピンスライド。
【0033】
【0034】
【0035】
【0036】
【0037】
【図5】ｙ（軸）上に、内部に「×」の付いた黒丸として示されるマクロファージ／スライドの数、及び黒丸として示されるＣＤ４５陽性／ＣＤ２０６陽性細胞、並びにｘ（軸）上にサンプル数を示すグラフであり、ＣＤ２０６陽性細胞集団の存在は、喀痰スミア上の多数のマクロファージの存在と一致する。
【0038】
【図6】分析のための喀痰サンプル調製のフローチャートを示す。ＨＣＣ１５癌細胞をＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎで標識し（ステップ１）、別のチューブで、解離した喀痰細胞をＰＥ標識抗ＣＤ４５抗体で染色した（ステップ２）。
【0039】
【0040】
【図8A-B】健康なボランティア及び肺癌の有無にかかわらず高リスクの患者から得られた喀痰サンプルの予備的な比較分析を示す。図６及び図７に詳述された実験と同様に、異なるドナーからの５つの喀痰サンプルが分析された。白抜きのドットは健康なボランティアからのサンプル（Ｈ）を表し、黒のドットは癌のない高リスク患者からのサンプル（ＨＲ）を表し、×の付いたドットは肺癌が認められた患者からのサンプル（Ｃ）を表す。図８Ａは、分析された各サンプル内のＣＤ４５陰性細胞（左）及びＣＤ４５陽性細胞（右）の総数を示す。図８Ｂは、分析された各サンプル内のＣＤ４５陰性細胞（左）及びＣＤ４５陽性細胞（右）内のＴＣＰＰ陽性細胞の割合を示す。
【0041】
【図9A-F】本発明の一実施形態による、ＴＣＰＰ陽性細胞の存在について喀痰細胞を分析する１つの戦略のドットプロットを示す。
【0042】
【0043】
【0044】
【図12A-C】チューブ＃６の喀痰サンプルのＣＤ４５陽性細胞分析を示す。すべてのプロファイルは、ＢＳＥ、ＬＣ、及びＳＣゲートを介して選択されたＣＤ４５陽性細胞を示す。
【0045】
【図13A-B】ＦＩＴＣ／Ａｌｅｘａ４８８（Ｆ／Ａ）のアイソタイプコントロール（チューブ＃５）、及び（Ｆ／Ａ）と結合されたＣＤ６６ｂ／ＣＤ３／ＣＤ１９細胞マーカのプローブで処理された細胞（チューブ＃６）のドットプロットを示す。
【0046】
【図14A-B】ＰＥ－ＣＦ５９４アイソタイプコントロール（チューブ＃５）、及びＰＥ－ＣＦ５９４と結合されたＣＤ２０６細胞マーカのプローブで処理された細胞のドットプロットを示す。
【0047】
【0048】
【0049】
【0050】
【図18】ｙ軸に喀痰サンプル中のすべての血液（ＣＤ４５陽性）細胞の割合（％）及びｘ軸にプロファイルタイプ１、２、及び３のグラフを示す。示されているシグネチャは、高リスク（ＨＲ）サンプルのＣＤ４５陽性細胞のプロファイル１のものである。
【0051】
【図19A-C】ＨＲ及び癌細胞からのＣＤ４５陽性喀痰細胞のシグネチャ１～３のグラフ、及びＨＲ及びＣ喀痰サンプルのすべてのＣＤ４５陽性血液細胞の割合としての集団６の分析を示す。
【0052】
【図20A-D】喀痰中の異なる上皮亜集団について描画されたゲートを有するＣＤ４５陰性喀痰サンプルのドットプロットを示す。
【0053】
【図21A-B】ＦＩＴＣ／Ａｌｅｘａ４８８及びＣＤ４５陰性喀痰細胞のアイソタイプコントロール（チューブ＃５）及びｐａｎＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ／Ａｌｅｘａｓ４８８で標識された喀痰細胞（チューブ＃７）のドットプロットを示す。ＣＤ４５－喀痰細胞における陽性ＦＩＴＣ／Ａｌｅｘａ４８８染色のカットオフが決定される。
【0054】
【図22A-B】ＰＥ－ＣＦ５９４及び喀痰細胞のアイソタイプコントロール（チューブ＃５）、及びＥｐＣＡＭ－ＰＥ－ＣＦ５９４で標識された喀痰細胞（チューブ＃７）のドットプロットを示す。ＣＤ４５陰性喀痰細胞及び喀痰における陽性ＰＥ－ＣＦ５９４染色のカットオフの決定。
【0055】
【0056】
【図24A-B】ＣＤ４５陰性細胞の集団２～９の喀痰細胞及びゲートのドットプロットを示す。
【0057】
【図25】集団１～９の異なるシグネチャを有するプロファイル１～４のＣＤ４５陰
性ドットプロットの別のグラフを示す。
【0058】
【図26】集団１、集団２、集団５、及びＰａｎＣＫ＋＋の中央値を横切るプロファイル１のシグネチャを示す。
【0059】
【図27】肺癌を発症するリスクが高いと分類された被験者からの喀痰サンプルからのＣＤ４５陰性細胞と、肺癌を有すると分類された被験者からの喀痰サンプルとのシグネチャ１～４の比較を示す。
【0060】
【図28A-B】喀痰サンプルからのすべてのＣＤ４５陰性細胞の割合（％）としてのＰａｎＣＫ＋＋（集団３＋４＋９）の量から生じるバイオマーカの適用に対する８０％の感度及び８５％の特異性を示す。
【0061】
【図29A-C】喀痰サンプル中の細胞のＣＤ４５陰性／ＣＤ４５陽性の比率（バイオマーカ１）を決定するための、ＨＲ及びＣ喀痰サンプルからの喀痰サンプル中の細胞の癌リスク分析を示す。
【0062】
【図30A-B】分析された喀痰サンプルにバイオマーカ１を適用して、肺癌患者又は肺癌を発症するリスクが高い被験者からのサンプルを同定する際の９０％の特異性及び５４％の感度を示す。
【0063】
【図31A-C】ＴＣＰＰで陽性に標識された喀痰サンプル（チューブ＃７）中のＣＤ４５陰性細胞（バイオマーカ２）の癌リスク分析を示す。
【0064】
【図32A-B】分析された喀痰サンプルにバイオマーカ２を適用して、肺癌患者又は肺癌を発症するリスクが高い被験者からのサンプルを同定する際の６３％の特異性及び１００％の感度を示す。
【0065】
【0066】
【図34A-C】サンプル中のすべてのＣＤ４５＋細胞の％として、ＨＲ及びＣ喀痰サンプルからの集団６中の細胞の量を特定するためのＣＤ４５陽性細胞（バイオマーカ３）のドットプロットを示す。
【0067】
【図35A-B】分析された喀痰サンプルにバイオマーカ３を適用して、肺癌患者又は肺癌を発症するリスクが高い被験者からのサンプルを同定する際の８８％の特異性及び６０％の感度を示す。
【0068】
【図36A-B】ＨＲ及びＣ喀痰サンプルからの集団３＋４及び９に見られる、ｐａｎＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ陽性でもある喀痰サンプルからのＣＤ４５陰性細胞（バイオマーカ４）の癌リスク分析を示す。
【0069】
【図37A-B】分析された喀痰サンプルにバイオマーカ４を適用して、肺癌患者又は肺癌を発症するリスクが高い被験者からのサンプルを同定する際の８３％の特異性及び８０％の感度を示す。
【0070】
【図38A-E】９８％の特異性及び７８％の感度を有する、ＨＲ及びＣ喀痰サンプルにバイオマーカ１～４を適用した、喀痰サンプルからの細胞の癌リスク分析を示す。
【0071】
【図39】本明細書に記載の肺から細胞集団を分画するシステム及び方法、並びに肺疾患について高リスク、中リスク、及び低リスクとして喀痰サンプルを分類するアルゴリズムを含む、被験者の肺の健康に関するスクリーニングフローチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【0072】
さらに、以下の用語の定義は以下のとおりである。特定の用語が本明細書で以下に定義されていない場合、その用語は、当業者による文脈内でのその典型的な使用の範囲内で意味を有するものとすることが理解される。
【0073】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「及び」及び「ｔｈｅ」は、文脈から明らかに別段でない限り、複数形の参照を含むことに留意されたい。
【0074】
「較正する」という用語は、コントロール試薬に対する機械の感度を設定することを意味する。
【0075】
「補正する」という用語は、サンプルをコントロールと比較してバックグラウンドを決定することを意味する。
【0076】
「分画する」又は「分画された」という用語は、さらに分析するためにイベントのサブセットを選択することを意味する。分画の一例は、分析中にデータを除外する／含めるための「ゲート」を使用することである。
【0077】
「ゲート」という用語は、これらの対象集団を調査及び定量化するために、通常は前方散乱、側方散乱、及びマーカ発現などの共通の特性を有する細胞集団の周囲に境界が配置されることを意味する。
【0078】
「プローブ」という用語は、細胞若しくは粒子の表面上のバイオマーカ又は細胞若しくは粒子内のマーカに親和性を有し、それらに結合するリガンド、ペプチド、抗体又はそれらのフラグメントを意味する。
【0079】
ポルフィリンはあらゆる種類の癌細胞に集中する。さらに、特定のポルフィリンは自然に蛍光を発し、特徴的な光子放出プロファイルを有する。ポルフィリン組成物は、癌細胞又は病状に関連する細胞を標識するポルフィリンの蛍光を周囲のバックグラウンド細胞から区別するためのハイスループットアッセイ（特にフローサイトメトリーアッセイ）で使用するために本明細書に記載されている（１１）。
【0080】
ここで図１Ａ～図１Ｂを参照すると、解離した喀痰細胞のサイトスピンが示されている。抗体又はＴＣＰＰで染色する前の、処理された喀痰細胞のライトギムザ染色サイトスピンスライドを図１Ａに示す。図１Ａには、頬上皮細胞（ＢＥＣ）が多すぎる（そのうちのいくつかは＊記号で示されている）。マクロファージは矢印で、デブリは矢印で示されている。図１Ｂは、スライド上のＢＥＣ及びマクロファージのより容易な同定を可能にする（矢尻で示される）より少ないデブリの存在を示す。
【0081】
フローサイトメトリーでは、各細胞又は粒子が流体力学的にフォトセルに集束される。細胞／粒子がフォトセルを通過するときに、各細胞又は粒子は１つ以上の光線を通過する。光散乱又は蛍光（ＦＬ）発光（細胞又は粒子がフルオロフォアで標識されている場合）は、細胞／粒子の特性に関する情報を提供する。レーザは、現代のフローサイトメトリーで最も一般的に使用される光源である。レーザは、離散周波数（コヒーレント光）で単一波長の光（レーザ線）を生成する。これらは、紫外から遠赤色までのさまざまな波長で利用可能であり、さまざまな範囲の電力レベル（光子出力／時間）を有する。前方方向に散乱された光（通常はレーザ光線軸から最大２０°ずれる）は、前方散乱（ＦＳＣ）チャネルと呼ばれる光電子増倍管（ＰＭＴ）又はフォトダイオードによって収集される。ＦＳＣは、細胞／粒子のサイズにほぼ等しい。通常、より大きい細胞はより小さい細胞よりも多くの光を屈折させる。励起線に対しておよそ９０°の角度で測定される光は、側方散乱（ＳＳＣ）と呼ばれる。ＳＳＣチャネルは、細胞又は粒子の相対的な複雑さ（例えば、粒度及び内部構造）に関する情報を提供する。ＦＳＣ及びＳＳＣは両方ともすべての細胞又は粒子に固有であり、この２つの組み合わせを使用して、例えば、これに限定されないが、血液、喀痰などの異種サンプルにおいて、細胞タイプを大まかに区別することができる。細胞又は粒子がレーザ光線を通過し、時間の関数として信号が生成されると、イベントが同定される。ＦＳＣ及びＳＳＣの場合、細胞又は粒子がレーザ中で費やす時間はイベントの幅「Ｗ」として測定され、一方、光電子増倍管によって測定される電流出力の最大高さは高さ「Ｈ」であり、面積「Ａ」は、細胞又は粒子がサイトメータのレーザ光線の照合点を通過することによって生成されるパルスの積分を表す。本明細書で使用されるように、細胞及び粒子はそれぞれ、フォトセル内の光線を通過するときのイベントとして記録され得る。
【0082】
ここで図１Ｃを参照すると、光散乱プロファイル（前方散乱（ＦＳＣ）は細胞サイズを表し、側方散乱（ＳＳＣ）は粒度を表す）が示されており、「Ａ」は、細胞又は粒子がサイトメータの照合点を通過することによって生成されるパルスの積分を表す。図１Ｄは、得られたヒストグラムであり、ｙ（軸）上にレーザパルス強度（Ｈ）、及びｘ（軸）上に時間（Ｗ）を有し、曲線の下の面積が（Ａ）として示されている。図１Ｅは、異なる粒度及びサイズを有する細胞のＳＳＣ－Ａ対ＦＳＣ－Ａプロットをプロット上に示す。光散乱プロファイル（前方散乱（ＦＳＣ）は細胞サイズを表し、側方散乱（ＳＳＣ）は粒度を表す）であって、「Ａ」は、細胞又は粒子がサイトメータの照合点を通過することによって生成されるパルスの積分を表す。
ＲＦＣを強化するために光散乱をゲートする。
ＲＦＣを強化するために光散乱をゲートする。
【0083】
気管支を裏打ちする特殊な気道上皮細胞及び腺細胞が粘液を分泌する。肺の深部で生成される粘液には、上皮細胞、肺胞細胞、マクロファージ、及びその他の造血（血液）細胞など、肺組織から再利用される多種多様な細胞が含まれ得る（１７）。粘液には非細胞性物質も含まれており、これらは、喫煙者、高度に汚染された地域に住んでいる人、又はその他の気道アレルゲン（花粉など）にさらされている人の肺で特に顕著である。肺の中から発生する粘液が吐き出されると、それは喀痰と呼ばれる。喀痰は、多くのＢＥＣ（又は頬細胞）を含む口腔内で生成される唾液と混合されることが多く、これにより、すでに複雑な組織サンプルに別の細胞成分が追加される（図１を参照）。
【0084】
顕微鏡検査とは対照的に、フローサイトメトリーは、サイズ、粒度、及び／又は蛍光マーカに基づいて関係のないデブリ及び細胞を除去することによって、対象の細胞のサンプルを濃縮することを可能にするため、喀痰の細胞集団に関する多次元情報及び／又はより正確な情報を提供することができる。喀痰細胞分析において赤色蛍光細胞（ＲＦＣ）を濃縮するための第１のステップは、ＲＦＣのサイズ（直径）を近づけることであり、より小さい又はより大きいものはすべて除外される。ＲＦＣは、ＴＣＰＰの取り込みが最も高い細胞、すなわち、癌細胞及び癌関連マクロファージであり、これは、どちらの細胞タイプも、他のどの細胞タイプよりも多くのＴＣＰＰを取り込むためである（１８～２２）。肺癌細胞のサイズは、癌の種類によって異なるが、培養された肺癌細胞と大きく異なることはあまりない。文献検索（表１）は、例えば、ＨＣＣ１５肺癌細胞の直径は２０～３０μｍであるのに対し、肺胞マクロファージの直径は２１μｍと測定されることを明らかにしている。特に興味深いのは、マクロファージ及びリンパ球であり、なぜなら、これらの細胞タイプの各々の特定の亜集団は、癌に関連する場合にそれらの機能を変化させることが知られているからである（２３～２６）。しかしながら、ＲＢＣ（６～８μｍ）及びそれより小さいもの（デブリ）、並びにＢＥＣ（６５μｍ）及びそれより大きいものは、以降の分析から除外することができる。
【表1】
【0085】
ここで図２Ａ～図２Ｉを参照すると、ＳＳＣ及びＦＳＣシグネチャを有する細胞を示すフローサイトメトリープロファイルが示されている。ビーズ（図２Ａ及び図２Ｇ）及び細胞（図２Ｂ～図２Ｆ、図２Ｈ、及び図２Ｉ）のフローサイトメトリードットプロット図２Ａ～図２Ｆ及び等高線プロット図２Ｇ～Ｉが示されている。図２Ａは、左から右へ５、１０、２０、３０及び５０μｍのビーズを示す光散乱プロットである。個々のビーズのサイズは、水平ＦＳＣ軸上に手動で描画され、図２Ｂ～図２Ｆに引き継がれる。ＳＳＣは当初は低く保たれていたため、予想よりも高いＳＳＣを有する細胞を視覚化することができた。図２Ｂは、ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｏｒａｎｇｅで染色された赤血球（ＲＢＣ）の光散乱プロットである。図２Ｃは、ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｆａｒ Ｒｅｄで染色された白血球（ＷＢＣ）の光散乱プロットである。図２Ｄは、ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｏｒａｎｇｅで染色された扁平上皮肺癌細胞（ＨＣＣ１５）細胞の光散乱プロットである。図２Ｅは、ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎで染色された頬上皮細胞（ＢＥＣ）の光散乱プロットである。図２Ｆは、分析のために１つのチューブにまとめられたＷＢＣ（図２Ｃのように配置される）、ＨＣＣ１５細胞（図２Ｄのように配置される）及びＢＥＣ（図２Ｅのように配置される）の光散乱プロファイルである。図２Ｆの縞模様のボックスは、対象の細胞を含む光散乱ゲートを示し、サイズが５～３０μｍのすべてが含まれる。図２Ｇは、ＦＳＣ－Ｗ×ＳＳＣ－Ｗ光散乱等高線プロットの５μｍ（下）及び３０μｍ（上）のビーズを示す。図２Ｈは、（図２Ｅのように）ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎで染色されたＢＥＣのＦＳＣ－Ｗ×ＳＳＣ－Ｗ光散乱等高線プロットである。図２Ｉは、組み合わされた細胞集団（ＦＳＣ－Ｗ×ＳＳＣ－Ｗ光散乱等高線プロットに表示されたＷＢＣ、ＢＥＣ及びＨＣＣ１５）を示す。ＢＥＣ（３０μｍより大きい、破線のボックスの外側に位置する細胞）と、対象の細胞（３０μｍより小さい、破線のボックスの内側に位置する細胞）との間の分離がはっきりと見える。破線のボックスは、Ｗ×Ｗゲートを示し、ほとんどのＢＥＣを簡単に除外できる対象の集団を同定する。
【0086】
一実施形態では、デブリ及びＢＥＣは、さらに分析される細胞の集団から除外される。標準サイズのビーズ（５、１０、２０、及び５０μｍ）が、光散乱プロファイルで使用される（前方散乱（ＦＳＣ）は細胞サイズを表し、側方散乱（ＳＳＣ）は粒度を表す；図２Ａ）。これらのビーズが実際に表１に示す情報に従って細胞サイズを予測することを確認するために、ビーズを健康なボランティアから分離されたＲＢＣ、ＷＢＣ及びＢＥＣ、並びに培養ＨＣＣ１５肺癌細胞と比較する。異なる細胞タイプは、異なる色のＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）色素で標識されているため、別々に（図２Ｂ～Ｅ）及び組み合わせて（図２Ｆ）分析することができる。図２Ｂに示され、文献（表１）から予測されるように、ＲＢＣは最小のビーズと一致する。同様に、ＷＢＣのサイズはおよそ１０～２０μｍの範囲であるが（図２Ｃ）、ＨＣＣ１５細胞の大部分は直径が３０μｍ未満である（図２Ｄ）。唾液をフローサイトメータ（主にＢＥＣで構成）で分析した場合、予想に反して、文献に記載されているように、ＢＥＣの大部分は３０μｍ以下の細胞として投影され（図２Ｅ）、５０μｍを超える細胞としては投影されない。これらの結果は、サイズを使用して（５μｍビーズ以下のサイズをすべて除去することによって）デブリを除外することができることを示すが、サイズを使用してＢＥＣを除外することはできない。
【0087】
ＢＥＣは、ＢＥＣをＷＢＣ及びＨＣＣ１５細胞と区別する非常に高いＳＳＣ特性を示す（図２Ｆ）。ＳＳＣ及びＦＳＣは、フローサイトメータによって、高さ（Ｈ）、幅（Ｗ）、及び曲線下面積（Ａ）の値を有する電子信号として変換される。ＳＳＣ及びＦＳＣパラメータのさまざまな組み合わせを調べることにより、ＳＳＣ－Ｗ及びＦＳＣ－Ｗは、３０μｍビーズよりも低いＳＳＣ－Ｗを示す細胞の周囲にゲートを設定することにより、ほとんどのＢＥＣの除去を可能にするプロファイルをもたらした（図２Ｇ～図２Ｉ）。
造血細胞の個別集団への細分画
造血細胞の個別集団への細分画
【0088】
フローサイトメトリーによる喀痰分析の別の態様は、さまざまな造血（血液）細胞集団の特性評価である。共通のＷＢＣマーカＣＤ４５は、すべてのＷＢＣの細胞表面に発現している。ＣＤ４５抗原に対して向けられた抗体などのプローブを使用すると、造血細胞（ＣＤ４５陽性細胞）を、正常な肺上皮細胞及び潜在的な肺癌細胞（ＣＤ４５陰性細胞）などの他の細胞と区別することができる。喀痰中の特定の造血亜集団を同定するために、追加のプローブ、例えば、顆粒球（ＣＤ６６ｂ）、マクロファージ（ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２０６）及びリンパ球（ＣＤ３及びＣＤ１９）に向けられた抗体を使用した。表２に、プローブ及びフルオロフォアの例を示す。
【表2】
【0089】
ここで図３Ａ～図３Ｋを参照すると、喀痰中の造血細胞の同定及び特性評価が示されている。図３Ａは、ＦＣＳ－Ａ対ＳＳＣ－Ａの光散乱プロットで提示された喀痰細胞を示す。ｘ軸上の数字が付いた黒球は、光散乱ゲートを設定するために使用されるビーズのサイズを表し、これは、デブリ及びＢＥＣ、すなわち、５μｍビーズよりも小さいものすべて（左側の垂直線）及び３０μｍを超えるものすべて（右側の垂直線）を除外する。図３Ｂは、図３Ａの光散乱ゲート内の細胞のＦＳＣ－Ｗ×ＳＳＣ－Ｗ等高線プロットを示す（「Ｗ」は、信号の幅を表す）。３０μｍのサイズ除外ゲートは、上側のボックスで検出される細胞がいずれも３０μｍより大きくなるような水平線として同定される。図３Ｃは、図３Ｂに示すＷ×Ｗゲートによって選択された細胞を有するＦＳＣ－Ａ対ＦＳＣ－Ｈドットプロットを示し、「Ｈ」は、サイトメータのレーザからの光を検出する光電子増倍管によって出力される電流の最大量を表す。示されたゲート長方形にはすべての単一細胞が含まれるが、細胞ダブレットは除外される。図３Ｄは、ＣＤ４５特異性のゲートを決定するためにＰＥアイソタイプコントロールで染色された、図３Ａ～Ｃに示される光散乱ゲートから以前に選択された喀痰細胞のドットプロットを示す（上側のボックスによって示される）。図３Ｅは、図３Ａ～図３Ｃに示される光散乱ゲートから以前に選択された喀痰細胞のドットプロットを示し、細胞は抗ＣＤ４５－ＰＥ抗体で染色されている。ＣＤ４５抗原を発現するすべての細胞（ＣＤ４５陽性細胞）は上側のボックスに捕捉される。次に、ＣＤ４５陽性の上側ボックス／ゲート内の細胞をＣＤ６６ｂの発現についてさらに分析した。抗ＣＤ６６抗体のバックグラウンド蛍光は、ＦＩＴＣ－アイソタイプコントロールでの染色に基づいて図３Ｆに示されている。図３Ｇは、抗ＣＤ６６ｂで染色されたＣＤ４５陽性細胞を示す。ＣＤ４５陽性ＣＤ６６ｂ陽性細胞は、上側のボックスで示されている。図３Ｈは、図３Ｇの上側のボックスから選別された細胞のライトギムザ染色である。図３Ｉは、ＢＳＥゲートを通してのみ選択された、未染色の喀痰細胞を示すドットプロットを示す。この特定のサンプルは、ＣＤ４５発現の検出に使用されるチャネルであるＰＥチャネルの中間染色を示すボックス内にある細胞の大きな亜集団を示す。この亜集団の存在は、サンプルをＣＤ４５陰性細胞とＣＤ４５陽性細胞に分離するカットオフをどこに設定するかを決定することを困難にする。図３Ｊは、図３Ｉと同じサンプルのＷ×Ｗゲートを示すドットプロットを示す。下側のボックス（Ｗ×Ｗゲート）の細胞は対象の細胞であり、一方、上側のボックスで捕捉された細胞はＳＥＣであり、対象の真の未染色の喀痰集団を明らかにするために除外する必要がある。図３Ｋは、ＢＳＥゲート及びＷ×Ｗゲートを介して選択された未染色の喀痰細胞を示し、陰性集団は明確に同定可能であり、ＣＤ４５陰性ゲートは、水平線「ゲート」を下回る平均蛍光強度を有する。
【0090】
図３は、肺癌を発症するリスクが高い患者から得られた代表的なサンプルを示す。上側のパネルの最初の２つのプロファイル（図３Ａ及び図３Ｂ）は、それぞれ、デブリ及びＢＥＣを除外するための光散乱ゲートを示す。細胞ダブレットを除外する追加のダブレット識別ゲート（図３Ｃ）も同様に適用された。対角上のボックス内にある細胞は単一細胞（ＳＣ）である。上側の最も右のプロファイル（図３Ｄ）は、ＰＥ標識ＣＤ４５抗体のバックグラウンド染色を決定するためにＰＥ標識アイソタイプコントロール抗体で染色された、前の３つの光散乱ゲート（デブリ、ＢＥＣ、及び細胞ダブレットの除去）を通じて選択された細胞を示す。このサンプルの特定のＣＤ４５－ＰＥ染色を図３Ｅに示し、ＣＤ４５陽性細胞は上側のボックスで同定される。ＦＩＴＣ標識アイソタイプコントロール抗体で共染色された喀痰細胞のＣＤ４５陽性集団を図３Ｆに示し、ＦＩＴＣ標識ＣＤ６６ｂ抗体で共染色された喀痰細胞のＣＤ４５陽性集団を図３Ｇに示す。ＣＤ６６ｂ陽性細胞は図３Ｇの上側のボックスで示される。これらの細胞が顆粒球であることを確認するために、ＣＤ４５陽性ＣＤ６６ｂ陽性細胞をＦＡＣＳＡｒｉａ機器を使用して選別し、細胞遠心分離によってスライドに移し、ライトギムザで染色した。図３Ｈに示すように、ＣＤ６６ｂ陽性抗体で同定された血液細胞は確かに顆粒球であった。
【0091】
残りのＣＤ４５陽性ＣＤ６６ｂ陰性細胞には、他のすべてのタイプの造血細胞が含まれ得るが、喀痰中の他の造血細胞は比較的まれであるため、マクロファージ及び単球、又はリンパ球である可能性が最も高い（１７、２７）。マクロファージの特異的マーカは、図４Ａの細胞集団の大部分は、ＨＬＡ－ＤＲ及び／又はＣＤ１１ｂを発現したので、ＣＤ４５陽性ＣＤ６６ｂ陰性マクロファージ／単球であることを確認した。
【0092】
ここで図４Ａ～図４Ｇを参照すると、ＣＤ６６ｂプローブ又はＣＤ２０６プローブのいずれかに曝露されたＣＤ４５陽性喀痰細胞が示されている。図４Ａ～図４Ｅは、さまざまなマクロファージ集団を含むＣＤ６６ｂ陰性集団を示す。図４ＡのＣＤ４５陽性ＣＤ６６ｂ陰性喀痰細胞は、ＨＬＡ－ＤＲを、場合によってＣＤ１１ｂを発現する。図４Ａは、抗ＨＬＡ抗体のバックグラウンド染色を決定するためにアイソタイプコントロールで染色されたＣＤ４５陽性ＣＤ６６ｂ陰性喀痰細胞を示すドットプロットを示す。同じアイソタイプコントロール染色はまた、図４Ｂのヒストグラムにおいて、薄い灰色の曲線（Ｉ）によって表されている。図４Ｂの濃い灰色の曲線（Ｃ）は、同じ細胞のＨＬＡ－ＤＲ染色を表す。薄い灰色の曲線と比較した濃い灰色の曲線の右側へのシフトは、細胞がＨＬＡ－ＤＲに対して陽性に染色されることを示す。抗ＣＤ１１ｂ抗体のバックグラウンド染色を決定するためのアイソタイプコントロールを図４Ｃに示す。ＣＤ４５陽性ＣＤ６６ｂ陰性細胞集団は、ＣＤ１１ｂ染色が図４Ｄ及び図４Ｅそれぞれの蛍光ヒストグラムでよりよく視覚化できるように、小さい（Ｓ）細胞と大きい（Ｌ）細胞とに分割された。アイソタイプコントロール（Ｉ）は、「Ｓ」及び「Ｌ」ヒストグラムの薄い灰色の曲線で表され、一方、抗ＣＤ１１ｂ抗体染色（Ｃ）は、「Ｓ」及び「Ｌ」ヒストグラムの濃い灰色の曲線で表される。小さい細胞のみがＣＤ１１ｂに対して陽性に染色される。図４Ｆ～図４Ｇは、ＣＤ４５陽性喀痰細胞のアイソタイプコントロール染色（左側のドットプロット）及びＣＤ２０６染色（右側のドットプロット）を示す。図４Ａ～図４Ｂは、さまざまなマクロファージ集団を含むＤ４５陽性ＣＤ６６ｂ陰性喀痰細胞を示す。図４ＡのＣＤ４５陽性ＣＤ６６ｂ陰性喀痰細胞は、ＨＬＡ－ＤＲエピトープを、場合によってＣＤ１１ｂを発現する。ＣＤ１１ｂマーカは、骨髄細胞に見られる。
【0093】
別の実施形態では、ＣＤ３／ＣＤ１９マーカをＣＤ６６ｂマーカと組み合わせると、識別可能なリンパ球集団を図らずも収容するサンプル中のマクロファージ／単球集団（細胞のＣＤ６６ｂ陰性／ＣＤ３陰性／ＣＤ１９陰性サブセット）における潜在的なリンパ球汚染の同定が可能になる（２８～３０）。ＴＣＰＰ信号について分析されたＣＤ４５陽性細胞集団からＣＤ３陽性／ＣＤ１９陽性／ＣＤ６６ｂ陽性細胞集団をゲーティングすることは、ＴＣＰＰ標識に関連する信号を改善するさらに別の方法である。
【0094】
ここで図５を参照すると、喀痰スミア上の多数のマクロファージの存在と一致するＣＤ２０６陽性細胞集団の存在が示されている。１５個の喀痰サンプルを、ライトギムザ染色した喀痰スミアとフローサイトメータでのＣＤ２０６染色とにより、マクロファージの存在について個別に分析した。喀痰スミアのライトギムザ染色は、ＰＡＰ染色で置き換え可能であることに留意されたい。プロットされているのは、スライドごとにカウントされたマクロファージの数（×の付いた実線のドット）、及び分析された１５個のサンプルごとのＣＤ４５陽性ＣＤ２０６陽性細胞の％（実線のドット）である。黒い点線は、データが同じサンプルを表すことを示すために付されている。スライド上にマクロファージがないことは白抜きのドットで表され、決定的でないＣＤ２０６プロファイルは×の付いた白抜きのドットで表される。図５に示すように、喀痰スミアで大量のマクロファージが同定された場合、フローサイトメトリーによってＣＤ４５陽性ＣＤ２０６陽性細胞の明確な集団も観察される。スライド上にマクロファージがないか、ほとんどない場合、ＣＤ４５陽性ＣＤ２０６陽性プロファイルは信頼できない。喀痰中のＣＤ４５陽性ＣＤ２０６陽性細胞の明確な集団の存在（サイズに関係なく）は、スライド上で観察された多数のマクロファージ（＞１３）と一致し、高品質（すなわち、肺深部）の喀痰サンプルを示す。ＣＤ４５陽性ＣＤ２０６陽性細胞集団が存在しない場合（サンプル２、１０、及び１１）、又は認識が困難な場合（サンプル３及び４）、喀痰スミアは０～少数のマクロファージ（≦１３）を示し、この喀痰サンプルの質が低いことを示す。１５個の喀痰サンプルを、ライトギムザ染色した喀痰スミアとフローサイトメータでのＣＤ２０６染色とにより、マクロファージの存在について個別に分析した。プロットされているのは、スライドごとにカウントされたマクロファージの数（×の付いた実線のドット）、及び分析された１５個のサンプルごとのＣＤ４５陽性ＣＤ２０６陽性細胞の割合（％）（実線のドット）である。黒い点線は、データが同じサンプルを表すことを示すために付されている。スライド上にマクロファージがないことは白抜きのドットで表され、決定的でないＣＤ２０６プロファイルは×の付いた白抜きのドットで表される。
ＣｙＰａｔｈ（登録商標）アッセイによる喀痰中の癌細胞の同定
ＣｙＰａｔｈ（登録商標）アッセイによる喀痰中の癌細胞の同定
【0095】
癌の早期発見のためのフローサイトメトリーに基づく喀痰分析の別の要素は、癌細胞のＣｙＰａｔｈ（登録商標）標識である。高リスク患者（おそらく肺癌がない）から得られた喀痰サンプルを分析し、サンプルにおよそ３％のＨＣＣ１５癌細胞をスパイクした。図６に概説されているこの実験では、ＨＣＣ１５肺癌細胞をＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎで標識し、この緑色で混合物中のすべての癌細胞を同定できるようにした。喀痰細胞を抗ＣＤ４５－ＰＥ抗体で染色したため、ＣＤ４５陰性のＨＣＣ１５細胞を含む非造血細胞から造血細胞を区別することができた（データ記載なし）。細胞固定後、細胞混合物をＴＣＰＰで標識し、フローサイトメトリーで細胞を分析した。
【0096】
図６を参照すると、肺癌細胞がスパイクされた喀痰分析の実験装置が示されている。ＨＣＣ１５癌細胞をＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎで標識し（ステップ１）、別のチューブで、解離した喀痰細胞をＰＥ標識抗ＣＤ４５抗体で染色した（ステップ２）。それぞれのチューブの過剰なＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎ及び抗ＣＤ４５抗体を洗い流した後、２つの細胞懸濁液を混合した（ステップ３）。次に、混合細胞懸濁液を固定し、蛍光成分としてＴＣＰＰを含むＣｙＰａｔｈ（登録商標）溶液とインキュベートした（ステップ４）。図６には、分析のための喀痰サンプル調製のフローチャートが示されている。ＨＣＣ１５癌細胞をＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎで標識し（ステップ１）、別のチューブで、解離した喀痰細胞をＰＥ標識抗ＣＤ４５抗体で染色した（ステップ２）。それぞれのチューブの過剰なＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎ及び抗ＣＤ４５抗体を洗い流した後、２つの細胞懸濁液を混合した（ステップ３）。次に、混合細胞懸濁液を固定し、蛍光成分としてＴＣＰＰを含むＣｙＰａｔｈ（登録商標）アッセイ溶液とインキュベートした（ステップ４）。
【0097】
ここで図７Ａ～図７Ｃを参照すると、ＣＤ４５－ＰＥマーカ、ｃｅｌｌ ｍａｓｋ ｇｒｅｅｎ及びＴＣＰＰで処理された喀痰細胞のドットプロットが示されており、サンプルは肺癌細胞（ＨＣＣ１５）でスパイクした。図７Ａは、約４％のＨＣＣ１５肺癌細胞がスパイクされた喀痰細胞におけるＣＤ４５発現の代表的なドットプロットである。ＨＣＣ１５細胞（ＣＤ４５陰性）は、以前に緑色蛍光色素ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎで標識されていた（図６を参照）。ＣＤ４５陽性細胞を示す上側のゲートは、適切なアイソタイプコントロールに基づいている（図７Ｄを参照）。下側のゲートは、非造血性のＣＤ４５陰性細胞を示す。図７Ｂは、ＴＣＰＰ（ｙ軸）及びＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎ染色（ｘ軸）に対するＣＤ４５陽性細胞のドットプロット分析を示す。ＣＤ４５陽性細胞の明確に同定可能な集団、おそらくマクロファージはＴＣＰＰに対して陽性に染色され、左上のボックス内にある。図７Ｃは、ＴＣＰＰ（ｙ軸）及びＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎ染色（ｘ軸）に対するＣＤ４５陰性細胞のドットプロット分析を示す。ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎ陽性細胞は、喀痰サンプルに追加されたＨＣＣ１５細胞であり、すべてＴＣＰＰに対して陽性に染色される（右上の象限）。ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎ陰性細胞は喀痰細胞であり、１．２％のバックグラウンド染色を示す（左下の象限）。図７Ａ～図７Ｃに示す３つの光散乱ゲートを、喀痰細胞とＨＣＣ１５細胞との混合物に適用した後、ＣＤ４５発現について細胞を分析した（図７Ａ）。次に、ＴＣＰＰの取り込みを、ＣＤ４５陽性（上側のボックスで概説された集団）とＣＤ４５陰性細胞集団（下側のボックスで概説された集団）との両方で決定した。ＣＤ４５陽性細胞の少数のみがＴＣＰＰの取り込みを示す（図７Ｂ）。対照的に、ＣＤ４５陰性細胞はＴＣＰＰ陽性細胞の非常に個別的な集団を示し、ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎに対しても陽性に染色される（図７Ｃの右上の象限）。ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎで処理された唯一の細胞はＨＣＣ１５肺癌細胞であるため、ＴＣＰＰ陽性ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎ陽性細胞は、スパイクされたＨＣＣ１５肺癌細胞である。ＴＣＰＰで染色されなかったＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎ陽性細胞はなく（図７Ｃ、右下の象限）、ＣｙＰａｔｈ（登録商標）が喀痰サンプルにスパイクされたすべての癌細胞を染色したことを示す。
【0098】
小規模なパイロット実験で５つの喀痰サンプルを分析した。１つは健康なボランティアから、３つは癌のない高リスク患者から、１つは肺癌患者からであった。分析は、図７に記載のように実施した。つまり、各サンプルにＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎ標識ＨＣＣ１５細胞をスパイクし、図７に記載のように分析した。サンプルにＨＣＣ１５細胞をスパイクする理由は、これらの細胞がＣｙＰａｔｈ（登録商標）染色の陽性コントロールとして機能するからである。分析した５つのサンプルのうちＣサンプルは１つのみであったが、データは、肺癌患者の喀痰サンプルが、疾患のない別の患者から得られたものとは異なることを示唆しており、Ｃ喀痰サンプルには、癌のない個人から採取されたサンプルよりもＣＤ４５陰性細胞が多く、ＣＤ４５陽性細胞が少ない（図８Ａ）。最も重要なのは、ＣサンプルがＣＤ４５陰性（上皮）細胞集団の中で最も多くのＴＣＰＰ陽性細胞を示したことである。ＣＤ４５陽性集団におけるＴＣＰＰ標識は、他の非癌サンプルからＣサンプルを一意に同定しなかった（図８Ｂ）。
【0099】
ここで図８Ａ～図８Ｂを参照すると、健康なボランティア及び癌の有無にかかわらず高リスクの患者から得られた喀痰サンプルの予備的な比較分析が示されている。図６及び図７に詳述された実験と同様に、異なるドナーからの５つのサンプルが分析された。白抜きのドットは健康なボランティアからのサンプル（Ｈ）を表し、黒のドットのサンプルは癌のない高リスク患者からのサンプル（ＨＲ）を表し、×の付いたドットは肺癌が認められた患者からのサンプル（Ｃ）を表す。図８Ａは、分析された各サンプル内のＣＤ４５陰性細胞（左）及びＣＤ４５陽性細胞（右）の総数を示す。図８Ｂは、分析された各サンプル内のＣＤ４５陰性細胞（左）及びＣＤ４５陽性細胞（右）内のＴＣＰＰ陽性細胞の割合を示す。
【0100】
ここで図９Ａ～図９Ｆを参照すると、本発明の一実施形態によれば、ＴＣＰＰ陽性細胞の存在について喀痰細胞を分析する１つの戦略が示されている。図９Ａは、喀痰細胞とその中に混合されたＨＣＣ１５細胞との混合物が抗ＣＤ４５－ＰＥ抗体で処理されたドットプロットを示す。上側のゲートにはＣＤ４５陽性細胞が含まれており、適切なアイソタイプコントロールに基づいている（図示せず）。下側のゲートは、非造血性のＣＤ４５陰性細胞を示す。図９Ｂは、ＴＣＰＰ及びＦＩＴＣ標識プローブのカクテルで処理された細胞を示す。ＦＩＴＣ標識プローブには、ＣＤ６６ｂ（顆粒球）、ＣＤ３、及びＣＤ１９（リンパ球）に対して向けられた抗体が含まれる。図９Ｂには４つの象限がある。水平線より上の細胞はＴＣＰＰに対して陽性に染色された細胞であり、垂直線より右の細胞はＦＩＴＣに対して陽性に染色された細胞である。円は、このサンプルに存在するさまざまな細胞集団を示すために描画されている。図９Ｃは、ＦＩＴＣ強度（ｙ軸）対ＦＳＣ－Ａ（ｘ軸；細胞サイズを表す）を示すドットプロットに描かれた、図９Ｂと同じ細胞の分析を表す。細胞集団は、図９Ｂと図９Ｃとの間で同定される。右下の象限からの細胞は顆粒球と一致するプロファイルを示し、図９Ｂの右上の象限からの細胞は肺胞マクロファージのプロファイルと一致するプロファイルを示す。図９Ｄは、サンプルにスパイクされたＨＣＣ１５細胞を含むＣＤ４５陰性喀痰細胞のＴＣＰＰ標識（ｙ軸）対ＦＩＴＣ蛍光強度（ｘ軸）を示す。喀痰細胞のＣＤ４５陰性画分にはＨＣＣ１５細胞が含まれているため、このパネルにはＴＣＰＰ陽性細胞の大集団が見られると予想される。このサンプルには、左上の象限の円と中央及び右上の象限の円とで示されるように、２つのＴＣＰＰ陽性集団がある。図９Ｅは、図９Ｄと同様のＣＤ４５陰性細胞のプロファイルを示すが、サンプルにスパイクされたＨＣＣ１５細胞を含まないコントロールサンプルに由来する。図９Ｄの左上の象限の細胞集団は、図９Ｅの左上の象限（空の円）のドットプロットプロファイルには存在しない。この空の円から欠落している細胞はＨＣＣ１５細胞である。図９Ｆは、図９Ｄと同じ細胞集団を表し、ドットプロットは、ＣＤ４５－ＰＥ強度（ｙ軸）対ＦＳＣ－Ａ（ｘ軸）を示す。図９Ｄ及び図９Ｅの左上の細胞集団並びに右上及び中央の細胞集団は、図９Ｆで同定される。
【0101】
図９は、ＣＤ４５陽性細胞におけるＴＣＰＰ染色が肺胞マクロファージ集団に関連することを示唆している。ＣＤ４５陽性（造血）細胞コンパートメント（図９Ａ）は、ＦＩＴＣチャネル及びＴＣＰＰの蛍光強度に基づいて、細胞の３つの亜集団に細分された（図９Ｂ）。ＣＤ６６ｂ／ＣＤ３／ＣＤ１９対ＦＳＣプロファイルでバックゲートした場合、ＴＣＰＰで染色されなかった図９Ｂの右下の丸で囲んだ細胞集団によって示される集団は、ＣＤ６６ｂ／ＣＤ３／ＣＤ１９カクテルで陽性に染色された比較的小さな細胞であるように見え（図９Ｃ）、これらの細胞はおそらく顆粒球である。図９Ｂの他のＦＩＴＣ陽性集団（右上の丸で囲まれた細胞集団及びＴＣＰＰに対して陽性に染色される）は、比較的大きな細胞であることが判明した。それらの緑色の蛍光は、自家蛍光によるものである可能性が最も高く、図３Ｆのアイソタイプコントロールプロファイルによって以前に示されたＣＤ６６／ＣＤ３／ＣＤ１９染色によるものではない。大きなサイズ及び高い自家蛍光は、右上の細胞集団が肺胞マクロファージである可能性が高いことを示唆している（３５、３６）。図９Ｂの左下の細胞集団は、比較的小さな細胞からなり、この亜集団もＣＤ６６／ＣＤ３／ＣＤ１９陰性であるため、マクロファージ及び／又は単球の異なるサブセットの細胞集団である可能性が高い。ＣＤ４５陰性細胞を同様に分析した（図９Ｃ～Ｅ）。ここで、サンプルに追加されたＨＣＣ１５細胞を、追加されたスパイクされたＨＣＣ１５細胞を含まないが、他の点では同様に処理されたアリコートと比較した（図９Ｃと図９Ｄとを比較）。スパイクされたＨＣＣ１５肺癌細胞のないサンプルに存在しない集団は丸で囲まれている。ＴＣＰＰに対して陽性に染色される細胞は、ＣＤ４５を発現しない中型の細胞であり、左上の空の円で表されるように、図９Ｅには存在しない。ＨＣＣ１５を含まないサンプルについて左上の円に細胞集団がないことによって、ＨＣＣ１５細胞集団のＴＣＰＰ染色プロファイルが確認される（図９Ｅ）。ＣＤ４５陰性喀痰細胞（中央／右上に丸で囲まれている）の中の他のＴＣＰＰ陽性細胞集団は、ＨＣＣ１５細胞と同様のサイズの細胞を含む（図９Ｆ）。これらの細胞もＣＤ４５陰性であるが、ＦＩＴＣチャネルでの低レベルの自家蛍光によってＨＣＣ１５細胞と区別することができる（図９Ｄ及び図９Ｅ）。
【0102】
ここで図１０Ａ～図１０Ｂを参照すると、品質管理（ＱＣ）ビーズを使用して、図１０Ｂのドットプロットにおいてビーズサイズ除外（ＢＳＥ）ゲートを確立する。図１０Ｂの喀痰サンプルは、約５μｍのビーズサイズ付近に配置されたゲートの左側及び約３０μｍのビーズサイズ付近に配置されたゲートの右側にある細胞を分析から除去するようにゲートされている。喀痰サンプル、コントロール、アイソタイプコントロール、及びビーズは、以下の実験プロトコルで説明されているように調製される。
【0103】
ここで図１１Ａ～図１１Ｆを参照すると、処理された及び処理されていない喀痰サンプルがフローサイトメトリーによって分析され、結果として得られるドットプロットが示されている。未処理の喀痰細胞は、まず、ＢＳＥゲートを使用してサイズをゲートし、さらに分析するために約５ｕｍより大きく約３０ｕｍより小さいサイズの細胞を選択する。図１１Ａは、サイズ範囲内にある喀痰細胞のドットプロットを示す。サイズゲートはＢＳＥゲートと呼ばれる。ＢＳＥゲートは、デブリ及び赤血球を除外するが、扁平上皮細胞（ＳＥＣ）は除外しない。ＳＥＣは死細胞であるため、生存率色素ＦＶＳ５１０を使用した喀痰サンプル分析から排除される。図１１Ｂ～図１１Ｃは、処理されていない（図１１Ｂ）及び処理された（図１１Ｃ）喀痰細胞の、ＢＶ５１０蛍光対前方側方散乱のドットプロットを示す。色素を取り込まない喀痰細胞は生細胞（ＬＣ）であり、図１１Ｃの線の下側に位置している。生細胞ゲートはＬＣゲートと呼ばれる。色素は死細胞を染色し、生細胞はＦＶＳ５１０で染色されない細胞である。本実施例では色素ＦＶＳ５２０を使用したが、他の生存率染色／色素もＬＣ集団を区別するために機能する。それを超えると細胞がＦＶＳ５１０に対して陽性である（したがって死細胞である）と見なされる閾値は、未染色のコントロールに基づく（図１１Ｂ）。未染色のコントロールの大部分の細胞（９５％以上）はＬＣゲート内にあり、５％未満の細胞（「バックグラウンド染色」）はＬＣゲートの外側にある。次に、このＬＣゲートをＦＶＳ５１０で染色された喀痰サンプルに適用すると、生細胞はＬＣゲート内の細胞であり、死細胞はゲート外にある。
【0104】
図１１Ｄは、単一細胞対ダブレット細胞を同定するための未染色の喀痰サンプルのドットプロットである。細胞ダブレットは、フローサイトメータによって１つのイベントと見なされ、１つのイベントには２つ以上の細胞を表すＴＣＰＰの量が含まれ得る。したがって、ダブレットは、人工的に高いＴＣＰＰ含有量のイベントを作成し、ＴＣＰＰが癌細胞のマーカとして使用されるため、癌細胞又は癌関連細胞であるという誤った示唆を与える可能性がある。ダブレットを排除するために、単一細胞（ＳＣ）集団を同定するためのゲートが描画される。ＦＳＣ－Ａ対ＦＳＣ－Ｈのドットプロットの喀痰細胞プロファイルが取得データから作成され、ＢＳＥ／ＬＣゲートがＳＣ集団の分析に適用される。２つの対角線が主な集団の軸に沿って、１つは上部に沿って（図１１Ｄでは「上側の対角線」として示され、もう１つは下部に（「下側の対角線」））描画される。下側の対角線は上側の対角線とやや平行に走り、そこから細胞が主な集団から離れて広がっているように見える集団の「ノッチ」から開始して右に延びるのが最適である（図示せず）。広がっている細胞（すなわち、対角上の集団に従わない細胞又はドットはダブレットであり、分析から除外する必要がある。ＳＣゲートには、対角線方向の集団を形成する細胞のみが含まれる。ＳＣ細胞は、図１１Ｄの対角ゲート内に示されている。ＳＣゲートは、２つの対角線、すなわち１つは主な集団の上部に沿って走る（「上側の対角線」で示される）、もう１つは下部の主な集団に従う（「下側の対角線」）対角線を接続することによって作成される。下側の対角線を配置するには、ドットプロットに「ノッチ」を見つける必要があり、これは、主な対角線方向の細胞集団に従わない細胞の開始を示す。下側の対角線（薄い灰色の領域）の下側及び右側には、ＳＣゲートから除外される細胞ダブレットが含まれる。下側の対角線は、主な対角線の集団に上下に従いながら、ノッチを横切る必要がある。
【0105】
図１１Ｅ～図１１Ｆは、ＰＥコントロール又はＰＥフルオロフォアに結合されたＣＤ４５プローブのいずれかで処理された喀痰細胞のドットプロットを示す。図１１Ｅは、アイソタイプコントロールである。図１１Ｆは、細胞をＣＤ４５陽性（血液細胞）又はＣＤ４５陰性（非血液細胞）のいずれかとして同定し、ＣＤ４５ゲートと呼ばれる。
【0106】
被験者からの最初の喀痰サンプルは、フルオロフォアに結合されたＣＤ４５プローブ、フルオロフォアに結合されたＣＤ６６ｂ、ＣＤ３、ＣＤ１９のカクテル、フルオロフォアに結合したＣＤ２０６、及びＴＣＰＰで処理する（チューブ＃６）。図１２Ａ～図１２Ｃは、ＣＤ６６ｂ／ＣＤ３／ＣＤ１９－ＦＩＴＣ－Ａｌｅｘａ４８８及びＣＤ２０６－ＰＥ－ＣＦ５９４マーカで処理されたＣＤ４５陽性喀痰細胞を選択するためのＢＳＥ、ＬＣ、ＳＣ及びＣＤ４５ゲートの適用によって選択された喀痰細胞のドットプロットを示す。適用されたゲートの基準を満たした細胞のみがさらに分析される。細胞の集団は、ＣＤ２０６抗体（ｘ軸）及びＣＤ６６ｂ／ＣＤ３／ＣＤ１９（ｙ軸）に沿ったフルオロフォア強度に基づいて同定された。各サンプルで、５～６個の集団を同定することができる。各集団の相対的なサイズは、サンプルごとに異なる。図１２Ａは、集団１が優勢であるプロファイル１を示す。図１２Ｂは、集団２が優勢であるプロファイル２を示す。図１２Ｃは、ＣＤ２０６陽性（ＣＤ２０６＋）細胞が優勢である、すなわち、集団３～６のプロファイル３を示す。各タイプのプロファイルの優勢な集団は、太線のボックスで示されている。ＣＤ４５陽性喀痰細胞の３つの異なるシグネチャが示されている。以下の図でさらに同定されるように、アイソタイプコントロール及びコントロール喀痰サンプルに照らして、５～６個の細胞集団が確立される。マクロファージの存在は、サンプルが肺深部からのものであることを示す。表３は、各集団に存在する細胞タイプを示す。
【表3】
【0107】
図１３Ａ～図１３Ｂを参照せずに、ＦＩＴＣ／ＡＬＥＸＡ－４８８のアイソタイプコントロール、及びＦＩＴＣ／ＡＬＥＸＡ－４８８に結合されたＣＤ６６ｂ／ＣＤ３／ＣＤ１９プローブで処理された喀痰細胞のドットプロットが示されている。図１３Ａは、ＦＩＴＣ／Ａｌｅｘａ４８８アイソタイプコントロールで染色されたＣＤ４５陽性細胞のドットプロットが、ｘ軸上のＦＳＣ対ｙ軸上のＦＩＴＣ／Ａｌｅｘａ４８８として表示されることを示す。図１３Ｂは、ＣＤ６６ｂ／ＣＤ３／ＣＤ１９－（ＦＩＴＣ／Ａｌｅｘａ４８８）及びＣＤ２０６－（ＰＥ－ＣＦ５９４）に対して向けられた抗体のカクテルで染色されたＣＤ４５陽性細胞のドットプロット（図１１Ａと同様）を示す。水平のＦＩＴＣ／Ａｌｅｘａ４８８ゲートは、バックグラウンド染色を超える細胞に基づいて設定される。アイソタイプコントロールの陰性ゲートは、アイソタイプコントロールの細胞の約９５％を含むように設定され、陽性ゲートは、約５％以下のバックグラウンドを含むように設定される。ほとんどのサンプルのＣＤ４５－細胞におけるＦＩＴＣ／Ａｌｅｘａ４８８陰性ゲートの最高値は、平均で４５０であり、１００～１０００の範囲である。
【0108】
ここで図１４Ａ～図１４Ｂを参照すると、ＰＥ－ＣＦ５９４のアイソタイプコントロール、及びＰＥ－ＣＦ５９４で標識されたマーカで処理された喀痰細胞のドットプロットが示されている。図１４Ａは、アイソタイプコントロールで染色されたＣＤ４５陽性細胞のドットプロットを示しており、ｘ軸上のＦＳＣ対ｙ軸上のＰＥ－ＣＦ５９４として表示されている。図１４Ｂは、ＰＥに結合され、ＣＤ２０６細胞マーカに対して向けられたプローブ／抗体で染色されたＣＤ４５陽性細胞のドットプロット（図１４Ａと同様）である。図１４Ｂは、それを超えてＣＤ２０６標識に陽性の細胞集団が見出されるゲートを同定する。ほとんどのサンプルのＣＤ４５－細胞のＰＥ－ＣＦ５９４陰性ゲートの最高値は、平均で２５０であり、９０～５００の範囲である。
【0109】
ここで図１５Ａ～図１５Ｂを参照すると、二重陰性ゲート又は集団１を設定するドットプロットが示されている。図１５Ａは、ＦＩＴＣ／Ａｌｅｘａ４８８及びＰＥ－ＣＦ５９４（Ｔｅｘａｓ－Ｒｅｄ）チャネルのアイソタイプコントロールで染色されたＣＤ４５陽性喀痰細胞を表示するドットプロットであり、ｙ軸上のＦＩＴＣ／Ａｌｅｘａ４８８対ｘ軸上のＰＥ－ＣＦ５９４（Ｔｅｘａｓ－Ｒｅｄ）として表示される。図１５Ｂは、図１５Ａに示されているものと同じドットプロットであり、アイソタイプコントロールからの疑似カラープロットとして示されており、ＢＳＥ、ＬＣ、及びＣＤ４５陽性細胞ゲートを介してゲートされている。水平の点線は、図１３で決定されたＦＩＴＣ／Ａｌｅｘａ４８８の陽性／陰性のカットオフを表し、垂直の点線は、図１４で決定されたＰＥ－ＣＦ５９４の陽性／陰性のカットオフから導出される。図１５で決定された集団１のゲートは、それぞれ図１６Ａ及び図１６Ｂに示されるＣＤ６６ｂ／ＣＤ３／ＣＤ１９（ＦＩＴＣ／Ａｌｅｘａ４８８－ｙ軸）及びＣＤ２０６（ＰＥ－ＣＦ５９４－ｘ軸）に対して向けられた抗体で染色されたＣＤ４５陽性喀痰細胞のフルドットプロット及び疑似カラープロットに転送される。ほとんどのサンプルにおけるＣＤ４５陽性細胞のＦＩＴＣ／Ａｌｅｘａ４８８陰性ゲートの最高値は、平均で６００であり、２００～１０５０の範囲である。ほとんどのサンプルにおけるＣＤ４５陽性細胞のＰＥ－ＣＦ５９４陰性ゲートの最高値は、平均で５００であり、２００～７５０の範囲である。
【0110】
ここで図１６Ａ～図１６Ｂを参照すると、図１５のような喀痰サンプルのドットプロットであり、ＣＤ４５陽性細胞は、ＦＩＴＣ／Ａｌｅｘａ４８８に結合されたＣＤ６６ｂ／ＣＤ３／ＣＤ１９抗体とＰＥ－ＣＦ５９４と結合したＣＤ２０６とのカクテルで染色され、細胞の異なる集団の存在について分析された。１～５として同定された細胞集団は、ＢＳＥ、ＬＣ ＳＣ、及びＣＤ４５陽性ゲートを適用した後も残る。図１６Ａの同じ集団１（ボックス）及びカットオフ（点線）は、図１５に描画されたものと同様であり、図１６Ａ～図１６Ｂに示されるプロファイルに適用される。
【0111】
図１６Ｂは、確立された集団２～６のゲートを示す。集団３、５、及び６はＦＩＴＣ自家蛍光であり、図１６Ａに示すように水平の点線より上にあるはずである。ＦＩＴＣにおける自家蛍光ではない集団４は、図１６Ａに示すように点線を下回るはずである。集団２は、（集団１と同様に）ＣＤ２０６に対して陰性だが、ＣＤ６６ｂ／ＣＤ３／ＣＤ１９に対して陽性の細胞として特徴付けられるため、集団２のゲートは集団１の上に描画され、図１６Ａの垂直の点線であるＰＥ－ＣＦ５９４カットオフの右側にある。実線及び点線で形成された集団１の上のボックスは、集団２として図１６Ｂに示される。集団５は、ＰＥ－ＣＦ５９４陽性及びＦＩＴＣ陽性の両方であるプロファイルの右側にある完全に隔離された集団として同定できる（図１６Ｂ、集団５ゲート）。場合によって、集団５は中間ＦＩＴＣ／Ａｌｅｘａ４５５陽性であり、その場合、集団５を隔離するためのゲートは、水平の赤い点線と交差する（図１７Ａを参照）。
【0112】
ここで図１７Ａ～図１７Ｃを参照すると、ＣＤ４５陽性であり、２つのサンプルからのＣＤ６６ｂ／ＣＤ３／ＣＤ１９－ＦＩＴＣ／Ａｌｅｘａ４８８のプローブで処理された喀痰サンプルからの疑似カラードットプロットである（図１７Ａ～図１７Ｂは同じサンプルであるが、異なるゲートを示す。すべてのプロットは、ＢＳＥ、ＬＣ、及びＳＣゲートを介してゲートされたＣＤ４５陽性喀痰細胞を示す。水平及び垂直の点線は、アイソタイプコントロール上に設定された（図示せず）。図１７Ａ～図１７Ｂは、集団５のＦＩＴＣ平均蛍光強度が中間であり、カットオフラインを横切るときのゲート４及びゲート５の描画を示す。図１７Ｃは、集団６の右上のボックスを示す。
【0113】
ここで図１８を参照すると、ｘ軸上の各（）は、図１２Ａ～図１２Ｃからのプロファイルを反映している。プロファイル１の場合、すべてのＣＤ４５陽性細胞の割合（％）としての各集団（集団１、集団２、集団１＋２、集団３＋４＋５＋６）の中央値が、高リスク（ＨＲ）喀痰サンプルに対してプロットされる。プロファイルグループの各集団の中央値は、直線で結ばれる。プロファイル１のシグネチャは、プロファイル１の図１８で同定された各集団の中央値間に線を引くことによって作成される。プロファイル２及び３のシグネチャは、肺癌を発症するリスクが高い被験者及び肺癌を有すると同定された被験者からの喀痰サンプルに対して同様に生成される。
【0114】
ここで図１９Ａ～図１９Ｃを参照すると、肺癌を発症するリスクが高い（ＨＲ）被験者と癌（Ｃ）を有すると同定された被験者とから収集された喀痰からの血液細胞シグネチャの比較が示されている。図１９Ａは、図１８からのプロファイル１のシグネチャ（シグネチャ１）を示す。図１９Ｂは、プロファイル２のシグネチャ（シグネチャ２）を示す。図１９Ｃは、プロファイル３のシグネチャ（シグネチャ３）を示す。集団６の細胞の割合（％）が、ＨＲ及びＣ喀痰サンプルの各シグネチャについて決定及び同定された。
【0115】
図２０Ａ～図２０Ｄは、チューブ＃７のようにＣＤ４５並びにｐａｎＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ－Ａｌｅｘａ４８８及びＥｐＣＡＭ－ＰＥ－ＣＦ５９４データのカクテル並びにＴＣＰＰで処理された喀痰細胞のドットプロットを示す。ドットプロットに示される細胞は、ＢＳＥ、ＬＣ、ＳＣ、ＣＤ４５ゲートが適用された後に残っている細胞である。（ＣＤ４５陰性）プロファイル１～４の細胞のドットプロットと、各集団が表す相対ＴＣＰＰ蛍光強度に加えて、各プロファイル１～４が表す各集団のすべてのＣＤ４５陰性細胞の割合とをさらに分析する。
【0116】
各サンプルにおいて、図２０Ａに示されるように、９つの集団を同定することができる。各プロファイル２～４について、同じ９つの集団が同定される。各亜集団の相対的なサイズはサンプルごとに異なり、それぞれが異なるプロファイルを示す（プロファイル１～４）。図２０Ａは、集団１が優勢であり、すべてのＣＤ４５陰性細胞の８０％超を含むタイプのプロファイルを示す。図２０Ｂは、集団１も同様に優勢であるが、すべてのＣＤ４５陰性細胞の８０％未満を含むタイプのプロファイルを示し、多くの場合、他のゲートの１つに明確な細胞集団がある。図２０Ｃは、依然として大きな集団１（ただし、８０％未満）が存在するが、２番目に大きい集団が集団２であるタイプのプロファイルを示す。図２０Ｄは、集団５が最も優勢な集団又は集団１に次いで２番目に優勢な集団であるプロファイルを示す。プロファイルごとに異なるシグネチャが存在する。シグネチャのタイプを決定するために最も重要な集団は、太線のボックスである。
【0117】
図２１Ａ～図２１Ｂは、ＦＩＴＣ／Ａｌｅｘａ４８８で処理されたか、又はｐａｎＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ／Ａｌｅｘａｓ４８８で処理されたＣＤ４５陰性喀痰細胞のアイソタイプコントロールのドットプロットを示す。分析の前に、ＢＳＥ、ＬＣ、ＳＣ、及びＣＤ４５陰性のゲートを分析のために集団に適用した。２つのプロファイルが生成され、１つはｘ軸に前方側方散乱Ａ（ＦＳＣ－Ａ）、ｙ軸にＦＩＴＣ／Ａｌｅｘａ４８８を有するＣＤ４５陰性細胞を表示し（図２１Ａ）、もう１つはｘ軸にＦＳＣ－Ａ、及びｙ軸にｐａｎＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ／Ａｌｅｘａ４８８を有するＣＤ４５陰性細胞を表示する（図２１Ｂ）。各プロファイルの陰性ゲートは、アイソタイプコントロールの細胞のおよそ９５％を含むように設定されている。各プロファイルの陽性ゲートには、陰性ゲートの上の残りのスペースが含まれ、バックグラウンド染色の５％以下を含むはずである。
【0118】
図２２Ａ～図２２Ｂは、ＰＥ－ＣＦ５９４のアイソタイプコントロール、並びにＢＳＥ、ＬＣ、ＳＣ及びＣＤ４５陰性細胞ゲートを介してゲートされたＣＤ４５陰性喀痰細胞のドットプロットを示す。分析の前に、ＢＳＥ、ＬＣ、ＳＣ、及びＣＤ４５陰性のゲートを分析のために集団に適用した。２つのプロファイルが生成され、１つはｘ軸に前方側方散乱Ａ（ＦＳＣ－Ａ）、ｙ軸にＰＥ－ＣＦ５９４を有するＣＤ４５陰性細胞を表示し（図２２Ａ）、もう１つはｘ軸にＦＳＣ－Ａ、ｙ軸にＥｐＣＡＭ－ＰＥ－ＣＦ５９４を有するＣＤ４５陰性細胞を表示する（図２２Ｂ）。各プロファイルの陰性ゲートは、アイソタイプコントロールの細胞のおよそ９５％を含むように設定されている。各プロファイルの陽性ゲートには、陰性ゲートの上の残りのスペースが含まれ、バックグラウンド染色の５％以下を含むはずである。
【0119】
ここで図２３Ａ～図２３Ｂを参照すると、ＣＤ４５陰性細胞の二重陰性ゲート又は集団１を有するドットプロットが示されている。図２３Ａはドットプロットであり、図２３Ｂはアイソタイプコントロールからの疑似カラープロットであり、処理された喀痰サンプルはフローサイトメータを介して分析され、細胞を表すイベントはＢＳＥ、ＬＣ、ＳＣ及びＣＤ４５陰性細胞ゲートを介してゲートされる。図２３Ａの水平の点線は、図２１で決定されたＦＩＴＣ／Ａｌｅｘａ４８８の陽性／陰性のカットオフを表し、垂直の点線は、図２２で決定されたＰＥ－ＣＦ５９４の陽性／陰性のカットオフから導出される。図２３で決定された集団１のカットオフラインは、すべてのサイトケラチン（Ａｌｅｘａ４８８－y軸）及びＥｐＣＡＭ（ＰＥ－ＣＦ５９４－ｘ軸）に対して向けられた抗体で染色されたＣＤ４５陰性細胞のフルドットプロット及び疑似カラープロットに組み込まれる。
【0120】
ここで図２４Ａ～図２４Ｂを参照すると、チューブ＃７のＣＤ４５陰性喀痰細胞の集団２～９のゲートが、図示のように設定されている。図２４Ａは喀痰細胞のドットプロットであり、図２４Ｂは図２３と同じ喀痰サンプルからの疑似カラープロットであるが、今回は、すべてのサイトケラチンに対して向けられたＡｌｅｘａ４８８標識抗体（y軸）、及びＥｐＣＡＭに対して向けられたＰＥ－ＣＦ５９４標識抗体（ｘ軸）で細胞を染色する。ＢＳＥ、ＬＣ、及びＳＣゲートを介しても選択されたＣＤ４５陰性細胞が示されている。図２３に描画されているのと同じ集団１（実線のボックス内の細胞）及びカットオフ（そこから延びる点線）が、これらのプロファイルに適用される。Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ＋＋細胞は、ｐａｎＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ抗体で高度に染色される細胞を示し、ＥｐＣＡＭ＋＋細胞はＥｐＣＡＭ抗体で高度に染色される細胞を示す。集団１、２、及び３はＥｐＣＡＭ陰性であるため、集団１の上に、集団１と６との間に存在する垂直の縞模様の線の左側にあるはずである。最初の３つの集団間の違いは、それらが異なるレベルのｐａｎＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎを発現することである。集団２と３との間のカットオフは、ｐａｎＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ－Ａｌｅｘａ４８８で高度に染色された細胞を同定することによって決定される。高度にＡｌｅｘａ４８８で染色されたＣＤ４５陰性細胞のカットオフは１０，０００～２０，０００の蛍光強度（平均１４，０００）の範囲であり、このカットオフは集団３、並びに集団４及び９の下側の線を決定する。図２４Ａは、集団２と集団３とを分離する水平の縞模様の線を示し、この線より上の細胞は、この特定のサンプルにおいて、抗ｐａｎＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ抗体で高度に染色されたと見なされる。カットオフは、１０，０００蛍光強度マークより上で明確な細胞集団が同定できる疑似カラープロットで決定された。集団１、６、及び７はｐａｎＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ陰性であり、集団６及び７は、水平の縞模様の線より下に、集団１の右側にある。集団１、６、及び７の間の違いは、これらの細胞で発現するＥｐＣＡＭのレベルである。集団７は、集団８及び９と同様に、ＥｐＣＡＭを高度に発現する細胞の集団として同定される。ＥｐＣＡＭを高度に発現する細胞のカットオフは、平均で３０００であり、１０００～６０００の範囲である。図１６Ａの垂直の縞模様の線は、高度にＥｐＣＡＭを発現する細胞のカットオフを示しており、それによって集団７、８、及び９の左側を同定する。特定の実施形態において、ＦＩＴＣ高発現細胞は、ＰＥ－ＣＦ５９４高発現細胞のカットオフ値として１０，０００を使用し、ＰＥ－ＣＦ５９４陰性ゲート（又は垂直、実線、縞模様の線）の最高値を同定する値の１０～１５倍を使用する。
【0121】
図２５は、ＢＳＥ、ＬＣ、ＳＣ、及びＣＤ４５陰性のゲートが適用された後に残っている高リスク被験者からのチューブ＃７の喀痰細胞のドットプロットを示す。ドットプロットは、図２０に示され、図２６でさらに分析されるように、肺癌を発症するリスクが高い被験者からのプロファイル１～４を示す。
【0122】
図２６は、プロファイル１の非血液細胞シグネチャ（非血液細胞シグネチャ１）を示し、各パネルに示されている同じプロファイルの各集団（集団１、集団２、集団５、及びＰａｎＣＫ＋＋（ＣＤ４５陰性）の中央値が同定され、プロファイル内の各集団の中央値から線を引くことによってシグネチャが生成される。各プロファイル１～４についてシグネチャが生成される。
【0123】
図２７は、疾患のない肺癌を発症するリスクが高い（ＨＲ）被験者からの喀痰サンプルの非血液細胞シグネチャを示す（ｌｄｃｔは、追跡Ｃ及び肺癌を有する被験者（Ｃ）を示さない）。シグネチャ４では、Ｃサンプルのシグネチャの場合、集団５の矢印は平均ＥｐＣＡＭ細胞発現の減少を示し、集団ｐＣＫの矢印はＨＲシグネチャ４と比較して平均ｐａｎＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ発現が増加したことを示す。
【0124】
図２８Ａ～図２８Ｂは、肺癌を発症するリスクが高い被験者及び肺癌を有すると同定された被験者からの喀痰サンプルについて分析されたすべてのＣＤ４５陰性細胞の割合としての集団３＋４＋９のＰａｎＣＫ＋＋細胞の存在に対する感度及び特異性を示す。ＰａｎＣＫ＋＋バイオマーカを喀痰サンプルに適用することにより、癌細胞を同定するための感度８０％、及び特異性８５％を得た。
【0125】
図２９Ａ～図２９Ｃは、喀痰サンプル中のＣＤ４５陰性／ＣＤ４５陽性細胞の比率（バイオマーカ１）を分析した後の、癌を発症するリスクが高い被験者及び癌を有する被験者から得られた喀痰サンプル中の細胞の分析を示す。図２９Ａは、高リスクの個体からの喀痰サンプル中のＣＤ４５陰性／ＣＤ４５陽性細胞の比率を示す。図２９Ｂは、癌を有することが知られている被験者からの喀痰サンプル中のＣＤ４５陰性／ＣＤ４５陽性細胞の比率を示す。図２９Ｃは、２人の被験者からの喀痰サンプル中のＣＤ４５陰性／ＣＤ４５陽性細胞の比率の分析である。
【0126】
図３０Ａ～図３０Ｂは、ＨＲ及びＣサンプルからの喀痰サンプルをバイオマーカ１（喀痰サンプル中のＣＤ４５陰性／ＣＤ４５陽性細胞の比率）について分析するときの特異性が５４％及び感度が９０％であることを示す。
【0127】
図３１Ａ～図３１Ｃは、チューブ＃７のＣＤ４５陰性喀痰細胞のドットプロットを示す。喀痰サンプルは、癌を発症するリスクが高い被験者と癌のある被験者とから採取し、ＢＳＥ、ＬＣ、ＳＣ、及びＣＤ４５陰性ゲートを適用した後に分析した。ｙ軸はＴＣＰＰ蛍光であり、ｘ軸はｐａｎＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ－Ａｌｅｘａ４８８である。バイオマーカ２のＣＤ４５陰性細胞のｐａｎＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ－Ａｌｅｘａ４８８に対して染色される細胞におけるＴＣＰＰの存在である。図３１Ａは、高リスクの個人からの喀痰サンプル中のＴＣＰＰ標識細胞のドットプロットを示す。図３１Ｂは、癌を有することが知られている被験者からの喀痰サンプル中のＴＣＰＰ標識細胞のドットプロットを示す。集団Ｂは、細胞のＴＣＰＰ集団を示す。図３１Ｃは、各被験者からの集団ＢにおいてＴＣＰＰ陽性である喀痰サンプル中のＣＤ４５陰性細胞の割合の分析である。
【0128】
図３２Ａ～図３２Ｂは、図３１のバイオマーカ２を適用して、肺癌（Ｃ）喀痰サンプルを高リスク（ＨＲ）（非肺癌）喀痰サンプルから区別する方法の一実施形態について、特異性が６３％及び感度が１００％であることを示す。
【0129】
図３３Ａ～図３３Ｃは、本発明の一実施形態に従って、肺癌を発症するリスクが高い被験者及び肺癌を有すると同定された被験者から得られた喀痰サンプルを分析するために、図３１及び図３２で同定されるように収集された喀痰サンプルに適用されるバイオマーカ１とバイオマーカ２との組み合わせを示す。図３３Ｃは、サンプルを癌を有する被験者又は癌を有さない被験者からのものとして同定するときの感度が９０％及び特異性が９０％であることを示す。
【0130】
図３４Ａ～図３４Ｃは、集団６中のＣＤ６６ｂ／ＣＤ３／ＣＤ１９＋＋及びＣＤ２０６＋＋細胞の量を決定するために、ＣＤ６６ｂ／ＣＤ３／ＣＤ１９及びＣＤ２０６で標識された喀痰サンプル中の細胞の癌リスク分析を示す。集団６の水平ゲートは、１０，０００～３０，０００（例えば、１０，０００～１５，０００、又は１５，０００～２０，０００、又は２０，０００～２５，０００、又は２５，０００～３０，０００）の平均蛍光強度に設定される。肺癌を発症するリスクが高い被験者（図３４Ａ）及び肺癌を有すると同定された被験者（図３４Ｂ）から得られた喀痰サンプルに存在するすべてのＣＤ４５陽性細胞と比較した集団６の細胞の総数（バイオマーカ３）が図３４Ｃに示されている。
【0131】
図３５Ａ～図３５Ｂは、図３４のバイオマーカを適用して、肺癌（Ｃ）喀痰サンプルを高リスク（ＨＲ）（非肺癌）喀痰サンプルから区別する方法の一実施形態について、特異性が８８％及び感度が６０％であることを示す。
図３６Ａ～図３６Ｂは、肺癌を発症するリスクが高い被験者及び肺癌を有すると同定された２人の被験者から収集された喀痰サンプルからのＣＤ４５陰性細胞の癌リスク分析を示す。集団３＋４＋９でｐａｎｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ陽性（又は高発現）であるＣＤ４５陰性細胞の割合は、バイオマーカ４として同定される。
図３６Ａ～図３６Ｂは、肺癌を発症するリスクが高い被験者及び肺癌を有すると同定された２人の被験者から収集された喀痰サンプルからのＣＤ４５陰性細胞の癌リスク分析を示す。集団３＋４＋９でｐａｎｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ陽性（又は高発現）であるＣＤ４５陰性細胞の割合は、バイオマーカ４として同定される。
【0132】
図３７Ａ～図３７Ｂは、図３６のバイオマーカを適用して、肺癌（Ｃ）喀痰サンプルを高リスク（ＨＲ）（非肺癌）喀痰サンプルから区別する方法の一実施形態について、特異性が８３％及び感度が８０％であることを示す。
【0133】
図３８Ａ～図３８Ｅは、バイオマーカ１、２、３、及び４の組み合わせを適用した、癌及び高リスク被験者からの喀痰サンプルからの細胞の癌リスク分析を示す。バイオマーカ１、２、３、及び４の組み合わせを喀痰サンプルに適用して、癌のないサンプルから癌サンプルを同定する場合、98％の特異性及び78％の感度が達成される。
【0134】
図３９は、本明細書に記載の肺から細胞集団を分画するシステム及び方法を含む、被験者の肺の健康のためのスクリーニングフローチャートを示す。この標識方法（ＣｙＰａｔｈ（登録商標）アッセイと呼ばれる）を使用した概念実証臨床研究では、ＴＣＰＰ標識肺喀痰中のＲＦＣの蛍光強度パラメータを、患者の喫煙歴に関するデータと組み合わせて、８１％の精度で研究参加者を癌対高リスクコホートに分類することができた（１２）。ＣｙＰａｔｈ（登録商標）強化喀痰細胞診の感度は従来の喀痰細胞診よりも高い（７７．９％）ことが示されたが、染色されたスライド（１２スライド／患者）からカウントされた細胞数（約６００，０００）がアッセイ感度の制限要因であった。癌サンプルのＲＦＣのポアソン分布を使用すると、検査する細胞の数を１００万を超えるように単純に倍増させると、ＲＦＣ検出が９５％に増加する可能性があると予測される（１２）。さらに、サンプルの妥当性を検証するためにマクロファージ定量化のための別個の喀痰スミアステップを含める必要性は、自動化又は拡張性の可能性が低いアッセイ設計に貢献した。したがって、ハイスループットフローサイトメトリーは、臨床的に適切な時間枠内で数百万の細胞イベントの検査をサポートするスライドベースの検査の代替手段である。
実験プロトコル
ヒト喀痰サンプル
実験プロトコル
ヒト喀痰サンプル
【0135】
３日間の喀痰サンプルを提供するためにボランティアを募集した。３つの異なる研究コホート：１）肺癌を発症するリスクが高いが、おそらく癌はない、２）肺癌と診断されるリスクの高い個人、３）癌と診断されておらず、肺癌を発症するリスクが高くない健康な個人（２２歳以上）が含まれていた。高リスクコホートと分類される被験者は、５５～７５歳で、３０パック年以上と定義される大量喫煙者とされた（１３）。（３０パック年の喫煙の例は、３０年間にわたって１年につき１日１箱、１５年間にわたって１年につき１日２箱などである。） 健康なコホートの場合、被験者は、喫煙が５パック年以内であった、及び／又は１５年以上前に禁煙しており、２２歳以上である者とされた。その他の除外基準（すべてのコホートに適用可能）は、重度の閉塞性肺疾患、制御不能な喘息、最小労作の狭心症、妊娠、又は鉱業での勤務の存在であった。
喀痰の収集
喀痰の収集
【0136】
すべての研究参加者は、製造元の指示に従って、ａｃａｐｅｌｌａ（登録商標）補助デバイス（Ｓｍｉｔｈｓ Ｍｅｄｉｃａｌ社、ミネソタ州セントポール）の使用について訓練を受けた。ａｃａｐｅｌｌａ（登録商標）装置は、肺の深部から粘液分泌物を薄くして移動させるのに役立つ、ＦＤＡ承認のハンドヘルドデバイスである。被験者は、デバイスを使用して、喀痰サンプルを滅菌収集カップに排出するように指示された。被験者は自宅でこの手順を繰り返し、２日目及び３日目の喀痰サンプルを収集した。被験者は、標本カップを冷暗所又は冷蔵庫に保管し、収集が完了してから１日以内に最初に収集した場所に戻すように指示された。完了した標本カップは冷凍輸送用アイスパックで梱包され、分析のために一晩で送られた。受領した３日間の収集サンプル（ｎ＝３８）の細胞生存率は、平均６４．３％（ＳＤ：２５．６％、範囲：２３．６～１００％）で、すべて死細胞である頬上皮細胞（ＢＥＣ又は頬細胞）は含まれない（１４）。
喀痰の解離
喀痰の解離
【0137】
喀痰栓は、綿棒を使用して汚染唾液から分離した（１５、１６）。栓の選択が不可能な場合は、サンプル全体を処理した。喀痰は、喀痰栓重量（ｗ／ｗ）で、予熱した０．１％ジチオスレイトール（ＤＴＴ）と１：４の比率で、及び０．５％Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）と１：１の比率で混合した。次に、混合物を室温で１５分間揺り動かした。ＧＩＢＣＯ（登録商標）ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州ウォルサム）を添加し（喀痰／ＤＴＴ／ＮＡＣ混合物の４倍量）、得られた細胞懸濁液を室温でさらに５分間揺り動かし、４０～１１０μｍのナイロン細胞ストレーナ（Ｆａｌｃｏｎ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ社）に通してろ過してデブリを除去し、８００ｘｇで１０分間遠心分離した。上澄みをデカントした後、細胞ペレットを１ｍＬのＨＢＳＳに再懸濁させた。総細胞数は、細胞生存率を決定するためにトリパンブルー除外法を使用してノイバウエル血球計算盤で決定した。
喀痰スミア
喀痰スミア
【0138】
処理のために喀痰栓を移すのに使用したのと同じ綿棒を使用して、喀痰細胞を１つのスライドに移した。追加のスライドを使用して、喀痰サンプルを２つのスライドの間に、両方のスライドの大部分を覆うように塗り付けた（１６）。スライドを風乾し、ライトギムザで染色した。片方又は両方のスライドを読み取り、病理学者がマクロファージの数をカウントした。
その他のヒトサンプル
血液
その他のヒトサンプル
血液
【0139】
２つの７ｍＬバイアルの末梢血を、健康なボランティアから入手した。血液の大部分は、ＢＤ ＰｈａｒｍＬｙｓｅ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンノゼ）で赤血球（ＲＢＣ）を溶解することにより、白血球（ＷＢＣ）を得るために使用した。残りはＲＢＣのソースに使用した。
唾液
唾液
【0140】
ＢＥＣは、健康なボランティアの口腔粘膜から、細胞スクレーパで頬の内側をこすることによって採取した。ＢＥＣを含む唾液は、喀痰細胞の解離と同じプロトコルを使用して処理した。
肺癌細胞
肺癌細胞
【0141】
ＨＣＣ１５肺癌細胞（ＡＴＣＣ社、バージニア州マナッサス）は、３７℃に設定された５％ＣＯ２インキュベータ内で、１０％ウシ胎児血清と１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０で増殖させた。
フローサイトメトリー用の抗体及び試薬
フローサイトメトリー用の抗体及び試薬
【0142】
喀痰細胞を染色するために使用できる抗体の例は、汎白血球細胞表面マーカＣＤ４５（抗ＣＤ４５－ＰＥ）に対して向けられたＰＥ標識抗体、顆粒球を同定するための抗ＣＤ６６ｂ－ＦＩＴＣ、マクロファージを標識するための抗ＣＤ２０６－ＦＩＴＣ、抗ＨＬＡ－ＤＲ－ＢＶ４２１、抗ＣＤ１１ｂ－ＢＶ６５０、抗ＣＤ１１ｂ－ＡＰＣ及び抗ＣＤ１１ｃ－ＢＶ６５０であり、抗ＣＤ３－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８及び抗ＣＤ１９－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８はそれぞれＴリンパ球及びＢリンパ球を標識するために使用できる。抗ＣＤ４５、抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ３、及び抗ＣＤ１９、並びにそれぞれのアイソタイプコントロールは、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入したが、抗ＣＤ１１ｃ、抗ＣＤ６６ｂ、抗ＣＤ２０６、抗ＨＬＡ－ＤＲ及びそれぞれのアイソタイプコントロールはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入した。追加の抗体を表２に示す。
【0143】
テトラ（４－カルボキシフェニル）ポルフィリン（ＴＣＰＰ）はＦｒｏｎｔｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（ユタ州ローガン）から購入し、ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）原形質膜染色はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。Ｍｅｇａｂｅａｄ ＮＩＳＴトレーサブル粒子サイズ標準（５、１０、２０、３０、４０、及び５０μｍ）は、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ社（ペンシルベニア州ワーリントン）から購入した。
【0144】
すべての抗体は、喀痰細胞、場合によっては血液細胞（ＣＤ３及びＣＤ１９）で滴定し、アイソタイプコントロールと比較した蛍光強度の最大差を反映する最適な染色濃度を決定した。ＴＣＰＰ及びＥｐＣＡＭの最適濃度は、喀痰細胞及びＨＣＣ１５細胞で滴定した。他の染色試薬及びビーズは、製造元の推奨に従って使用した。
フローサイトメトリー分析及び細胞選別
喀痰細胞集団の特性評価
フローサイトメトリー分析及び細胞選別
喀痰細胞集団の特性評価
【0145】
ここで図１Ｃを参照すると、各細胞がレーザからの光線を通過し、レーザからの光の散乱が前方散乱（ＦＳＣ）検出器及び側方散乱（ＳＳＣ）検出器で検出されるときに、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。細胞のサイズ及び粒度は、図１Ｅに示すように特徴付けることができる。
【0146】
喀痰サンプル中の細胞は、生細胞（ＬＣ）及び死細胞（ＤＣ）の存在、並びに本明細書に記載のイベントとして捕捉された単一細胞（ＳＣ）又は二重細胞があるかどうかに基づいて分画することができる。
【0147】
図２～９の解離した喀痰サンプルの単一細胞懸濁液のサンプルを、以下のプローブ：約１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ４５－ＰＥ、約３μｇ／ｍＬの抗ＣＤ６６ｂ－ＦＩＴＣ、並びに抗ＨＬＡ－ＤＲ－ＢＶ４２１（５μｇ／ｍＬ）、抗ＣＤ１１ｂ－ＡＰＣ（４μｇ／ｍＬ）、抗ＣＤ１１ｃ－ＢＶ６５０（５μｇ／ｍＬ）、又は抗ＣＤ３－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（２μｇ／ｍＬ）と抗ＣＤ１９－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（２μｇ／ｍＬ）との混合物のいずれかの１つ以上とともにインキュベートした。別のチューブで、解離した喀痰サンプルの単一細胞懸濁液を、喀痰の質を決定するために、約１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ４５－ＰＥ及び４μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２０６－ＦＩＴＣとインキュベートした。すべてのインキュベーションは、光から保護して、氷上で３５分間行った。細胞をＨＢＳＳで洗浄した後、細胞を１％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ペンシルベニア州ハットフィールド）で４℃で３０分間固定した。次に、細胞懸濁液を冷ＨＢＳＳで洗浄し、分析まで氷上に置いた。
ＨＣＣ１５スパイク喀痰サンプルのＴＣＰＰ／ＣｙＰａｔｈ標識
ＨＣＣ１５スパイク喀痰サンプルのＴＣＰＰ／ＣｙＰａｔｈ標識
【0148】
図１～図９を参照すると、解離した喀痰細胞は、抗ＣＤ４５抗体で標識され、上記のように固定されている。ＨＣＣ１５細胞をトリプシンで採取し、ＤＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で洗浄し、ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎ原形質膜染色で標識した。得られたＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎ標識ＨＣＣ１５細胞（ｃｍｇＨＣＣ１５）を１％パラホルムアルデヒドで４℃で３０分間固定し、ＨＢＳＳで洗浄した。特定の喀痰細胞懸濁液に３％ｃｍｇＨＣＣ１５細胞をスパイクした。次に、固定した細胞の混合物を、冷却したＴＣＰＰ（４μｇ／ｍＬ）とともに４℃で１時間インキュベートした。標識後、細胞を洗浄し、さらに分析するまで氷上に置いた。
【0149】
一実施形態では、サンプルは、４つのレーザ（４０４ｎｍ、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ、及び６３３ｎｍ）を備えたＢＤ ＬＳＲ－ＩＩフローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して分析した。喀痰全体、ＣＤ４５陽性ＣＤ２０６陽性、ＣＤ４５陽性ＣＤ６６ｂ陽性、又はＣＤ４５陽性ＣＤ６６陰性の亜集団の細胞選別を、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ細胞選別機（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で行った。収集後のデータ分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ社、オレゴン州アシュランド）を使用して行った。
細胞学
細胞学
【0150】
全喀痰サンプルは、上記の喀痰解離法を使用して調製した。Ｃｙｔｏｐｒｏ７６２０（Ｗｅｓｃｏｒ社、ユタ州ローガン）Ｈｅｔｔｉｃｈ３２Ａ（Ｒｏｔｏｆｉｘ社、マサチューセッツ州ビバリー）細胞遠心分離機を使用して、スライドあたり１及び２．５×１０５個の細胞でサイトスピンを調製した。スライドは、製造元のプロトコルに従って、ライト又はライトギムザ染色のいずれかで染色した。画像は、Ｎｉｋｏｎ社製Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ又はＯｌｙｍｐｕｓ社製ＢＸ４０顕微鏡で室温で作成した。Ｎｉｋｏｎ社製顕微鏡には、ＵＰｌａｎＡｐｏ２０Ｘ／０．７対物レンズ及びＤＳ－Ｒｉ２カメラ、Ｏｌｙｍｐｕｓ社製顕微鏡にはＰＬＡＰＯ６０Ｘ／１．４対物レンズ及びＳＤ１００カメラが装備されている。ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｎｉｋｏｎ社）及びＣｅｌｌＳｅｎｓ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｏｌｙｍｐｕｓ社）を使用して画像を保護した。
【0151】
マクロファージは、喀痰サンプルの妥当性を検証するために伝統的に使用されてきた。細胞診によって喀痰サンプルを評価するためのパパニコロウ細胞病理学会のガイドラインは次のように述べている。「マクロファージの数の数値的なカットポイントは、一貫して文献中に報告されていないが、適切な標本には、このタイプの簡単に同定できる細胞が多数あるはずである」（３１）。ＨＬＡ－ＤＲ及びＣＤ１１ｂ（又はＣＤ１１ｃ）は、ＣＤ１４及びＣＤ２０６とともに、肺内のマクロファージ及び単球のさまざまなサブセットのフローサイトメトリーによる同定に有用なマーカであることが示されている（３２、３３）。ＣＤ２０６は、胚発生中に肺に存在する長寿命の細胞である肺胞マクロファージに特異的なマーカである（３４）。ＣＤ２０６陽性マクロファージは、造血起源であるが、血液循環には見られない。このマクロファージの集団は肺組織に特異的であり（３４）、したがって、サンプルの妥当性を検証する手段として役立つ良い候補である。
喀痰サンプルの調製
喀痰サンプルの調製
【0152】
サンプルは、図１０～図３９に記載の分析用に調製される。簡単に言えば、喀痰サンプルを受領、処理、抗体標識し、１日目に色素標識を行う。サンプルはＴＣＰＰで処理し、２日目にフローサイトメトリーで分析する。図１０～図３９で分析された喀痰サンプルは、以下のように処理する。サンプルは、少なくとも１つのレーザ、又は少なくとも２つのレーザ、又は少なくとも３つのレーザ及び複数のチャネル、例えば５チャネル又は少なくとも５チャネルを有するがこれらに限定されないフローサイトメータで分析する。
喀痰の解離
喀痰の解離
【0153】
喀痰サンプルを秤量し、その重量に基づいて、解離試薬を以下のように添加する。１容量の０．５％ＮＡＣ溶液をサンプルに、４容量の０．１０％ＤＴＴ溶液をサンプルに添加する。サンプルをボルテックスし、室温で撹拌する。その後、現在の総量に基づいて４容量の１×ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）（喀痰＋ＮＡＣ＋ＤＴＴ溶液）を添加する。サンプルをろ過し、８００ｘｇで１０分間遠心分離する。上澄みを吸引し、サンプルサイズに応じてペレットをＨＢＳＳで再懸濁する（例えば、小（３ｇ以下）サンプルに２５０μｌ ＨＢＳＳを添加、中（３ｇ超８ｇ以下）サンプルに７６０μｌ ＨＢＳＳを添加、大（８ｇ超）サンプルに１４６０μｌ ＨＢＳＳを添加）。細胞収量の決定には１:１０希釈液を使用する。
【0154】
０．５％Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）溶液：０．８５ｇのクエン酸ナトリウム二水和物を４５ｍＬのｄｄＨ２Ｏ、５００μＬの３Ｍ ＮａＯＨ、０．２５ｇ ＮＡＣに添加し、溶解するまで撹拌する。ｐＨ溶液を約７．０～８．０に調整し、ｄｄＨ２０で容量を５０ｍＬに調整する。
【0155】
０．１０％ジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液：０．１０ｇのＤＴＴを１００ｍＬのｄｄＨ２Ｏに添加し、溶解するまで撹拌する。溶液を１０ｍＬのアリコートに分割し、使用するまで－２０℃で凍結／保存する。
【0156】
１ｍｇ／ｍＬ ＣｙＰａｔｈ ＴＣＰＰストック溶液は次のとおりである。２５ｍＬのイソプロパノールと０．２ｇの重炭酸ナトリウムとを２５ｍＬのｄｄＨ２Ｏに添加し、溶解するまで撹拌する。必要に応じて、溶液のｐＨを約９～１０に調整する。０．０５ｇのＴＣＰＰを添加し、溶液を光から保護し、溶解するまで撹拌する。
【0157】
表４は、カウント及び抗体標識のためにチューブに分注される細胞のμｌを示す。
【表4】
【0158】
抗体／ＦＶＳ標識
喀痰細胞は、表４に従って、表５で特定される試薬に分注され、この試薬は、解離した喀痰細胞を標識するための実験チューブ及びコントロールチューブを準備するために添加される。
喀痰細胞は、表４に従って、表５で特定される試薬に分注され、この試薬は、解離した喀痰細胞を標識するための実験チューブ及びコントロールチューブを準備するために添加される。
【表5】
【0159】
表６、及び表７、表９：ビーズサイズ、フローサイトメータの補正、アイソタイプコントロール、喀痰バックグラウンド、及び処理された喀痰のサンプルは、記載のように調製される。
【表6】
【表7】
【0160】
チューブ＃１～＃７を暗所で３５分間インキュベートする。抗体のインキュベーション後、各チューブに冷ＨＢＳＳを充填し、上澄みを８００ｘｇで１０分間４℃でスピンダウンする。上澄みを廃棄し、ペレットを以下のように再懸濁する。チューブ＃１～＃３に、０．５ｍＬの冷ＨＢＳＳをチューブに加え、フローサイトメトリーによるデータ取得まで4℃で氷上に保存する。 チューブ＃４及び＃５に、２ｍＬの冷１％ＰＦＡ固定液を添加する。チューブ＃６及び＃７に、１０ｍＬの冷１％ＰＦＡ固定液を添加する。ホイルで覆った氷上でチューブを１時間インキュベートする。固定インキュベーション後、各チューブに冷ＨＢＳＳを充填する。細胞を１６００ｘｇで１０分間４℃でスピンダウンする。ペレットを乱さずに、できるだけ上澄みを吸引する。ペレットを残留液に再懸濁する。チューブ＃４及び＃５を０．２ｍＬの冷ＨＢＳＳに再懸濁し、チューブ＃１～＃３とともに、フローサイトメトリーによるデータ取得まで4℃で氷上に保存する。チューブ＃６及び＃７について、次式に従って氷冷ＨＢＳＳを添加する。
各チューブの最終容量（ｍＬ）＝０．１５＊[総細胞／１０６]（式１）
各チューブの最終容量（ｍＬ）＝０．１５＊[総細胞／１０６]（式１）
【0161】
細胞＃については、トリパンブルーで１:４０に希釈した細胞懸濁液から細胞数を取得する。１０μＬの１:４０希釈液を血球計算盤に加え、４つの大きな象限すべての細胞を数える。正確な細胞数は、象限ごとに２５～６０個の細胞を構成する。
【0162】
２日目にＴＣＰＰ標識の準備ができるまで、チューブ＃６及び＃７は４℃で氷上に一晩置く。
【表8】
【0163】
ＣｙＰａｔｈアッセイＴＣＰＰワーキング溶液は、冷ＨＢＳＳを使用して２０μｇ／ｍＬ ＴＣＰＰ溶液（ストックの１:５０）として作成され、光から保護されている。ＦＶＳ及びＴＣＰＰ標識の未染色コントロールとして使用されるＡ５４９細胞を含むチューブ１本を入手する（チューブ＃８）。ＦＶＳ標識の補正チューブとして使用されるＡ５４９細胞を含むチューブ１本を入手する（チューブ＃９）。ＴＣＰＰ標識の補正チューブとして使用されるＡ５４９細胞を含むチューブ１本を入手する（チューブ＃１０）。ｐａｎＣＫ標識の補正チューブとして使用されるＡ５４９細胞を含むチューブ１本を入手する（チューブ＃１１）。
ＴＣＰＰ標識
ＴＣＰＰ標識
【0164】
表１０に従って、ＣｙＰａｔｈアッセイＴＣＰＰワーキング溶液の容量を添加する。
【表9】
【0165】
サンプルをＴＣＰＰで約１時間インキュベートし、チューブ＃６、＃７、及び＃１０に冷ＨＢＳＳを充填し、１０００ｘｇで１５分間４℃で遠心分離する。ペレットを乱さずに上澄みを吸引する。チューブ＃６、＃７、及び＃１０について、ペレットを冷ＨＢＳＳで洗浄し、遠心分離ステップと洗浄ステップとを繰り返す。チューブ＃６、＃７、及び＃１０について、ペレットを残留液に再懸濁し、３００μＬの冷ＨＢＳＳをチューブ＃１０に添加し、総細胞数が２０×１０６個未満の場合、２５０μＬの冷ＨＢＳＳをチューブ＃６及び＃７に添加し、１５ｍＬコニカルチューブからフローサイトメトリーチューブ（それぞれ＃６及び＃７のラベルが付いた）に細胞を移す。
【0166】
フローサイトメトリーデータ取得
以下の設定では、１０，０００イベント／秒以下のフローサイトメトリー取得率が推奨される。
ＬＳＲＩＩで使用されるパラメータは次のとおりである。閾値、ＦＳＣ電圧、ＳＳＣ電圧、ＢＶ５１０電圧であって、この電圧は、ＢＥＣ、ＰＥ電圧、ＦＩＴＣ電圧、ＰＥ－ＴｘＲｅｄ電圧、及びＡＰＣ電圧を含むすべての細胞で確かめる必要がある。同等のフローサイトメータを使用してアッセイを最適化するために、当業者には、同じ又は同様の結果を達成するための好ましい設定が知られているであろう。
以下の設定では、１０，０００イベント／秒以下のフローサイトメトリー取得率が推奨される。
ＬＳＲＩＩで使用されるパラメータは次のとおりである。閾値、ＦＳＣ電圧、ＳＳＣ電圧、ＢＶ５１０電圧であって、この電圧は、ＢＥＣ、ＰＥ電圧、ＦＩＴＣ電圧、ＰＥ－ＴｘＲｅｄ電圧、及びＡＰＣ電圧を含むすべての細胞で確かめる必要がある。同等のフローサイトメータを使用してアッセイを最適化するために、当業者には、同じ又は同様の結果を達成するための好ましい設定が知られているであろう。
【0167】
集団ゲートを決定する蛍光強度値の概要：
【表10】
【0168】
参照される設定はＬＳＲＩＩ機器に特有であり、他のフローサイトメータによって異なり得るが、さまざまな機器を補正して同等の範囲を生成する方法は、当業者には明らかであることに留意されたい。
【0169】
上記の例は肺癌検出の例示であるが、肺の他の疾患及び状態は、本明細書に開示されるシステム及び方法を用いて経時的に検出及び／又は監視することができる。例えば、被験者が喘息、ＣＯＰＤ、インフルエンザ、慢性気管支炎、結核、嚢胞性線維症、肺炎、移植片対宿主病、喀痰などの肺疾患に関連する症状を発症又は悪化する傾向があると疑われる場合、コントロール（非疾患）及び疾患サンプルプロファイルのデータベースと比較して、細胞集団の分布の変化について分析してもよい。
【0170】
明細書及び特許請求の範囲において、「約」又は「およそ」は、引用された数値の２０パーセント（２０％）以内を意味することに留意されたい。本明細書に開示されるすべてのコンピュータソフトウェアは、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ－ＲＯＭ、ハードドライブ（ローカル又はネットワークストレージデバイス）、ＵＳＢキー、他のリムーバブルドライブ、ＲＯＭ及びファームウェアを含むがこれらに限定されない任意のコンピュータ可読媒体（媒体の組み合わせを含む）上に具現化され得る。
【0171】
少なくとも１つの実施形態において、当技術分野における通常の技術の１つによって容易に理解されるように、本発明による装置は、上記のステップを実施するコンピュータソフトウェアでプログラムされた汎用又は特定目的のコンピュータ又は分散システムを含み、このコンピュータソフトウェアは、Ｃ＋＋、ＦＯＲＴＲＡＮ、ＢＡＳＩＣ、Ｊａｖａ（登録商標）、アセンブリ言語、マイクロコード、分散プログラミング言語など、適切なコンピュータ言語であり得る。本装置はまた、様々なハードウェア実装において、複数のそのようなコンピュータ／分散システム（例えば、インターネット及び／又は１つ以上のイントラネットを介して接続されている）を含み得る。例えば、データ処理は、適切にプログラムされたマイクロプロセッサ、コンピューティングクラウド、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）などによって、適切なメモリ、ネットワーク、及びバス要素と組み合わせて実行され得る。フローサイトメータを移動するときに分析された細胞及び粒子から記録された多次元データが記録され、多次元光学特性に基づいて細胞集団の分析及び分画が可能になる。
【0172】
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【0173】
本発明は、これらの実施形態を特に参照して詳細に説明されてきたが、他の実施形態は、同じ結果を達成することができる。本発明の変形及び改変は、当業者には明らかであり、添付の特許請求の範囲において、そのようなすべての改変及び同等物を網羅することを意図している。上記で引用されたすべての参考文献、出願、特許、及び刊行物の開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図1A-B】
【図1C-E】
【図2A-2I】
【図3A-H】
【図3I-K】
【図4A-G】
【図5】
【図6】
【図7A-C】
【図7D-F】
【図8A-B】
【図9A-F】
【図10A-B】
【図11A-F】
【図12A-12C】
【図13A-B】
【図14A-B】
【図15A-15B】
【図16A-16B】
【図17A-17C】
【図18】
【図19A-C】
【図20A-D】
【図21A-B】
【図22A-B】
【図23A-B】
【図24A-B】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28A-B】
【図29A-C】
【図30A-B】
【図31A-C】
【図32A-B】
【図33A-C】
【図34A-C】
【図35A-B】
【図36A-B】
【図37A-B】
【図38A-E】
【図39】
