7566125 ミドルダウン抗体特徴付けのための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-10-03

(45)【発行日】2024-10-11

(54)【発明の名称】ミドルダウン抗体特徴付けのための方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/37 20060101AFI20241004BHJP

   G01N 27/62 20210101ALI20241004BHJP

   C07K 1/12 20060101ALI20241004BHJP

   C07K 1/16 20060101ALI20241004BHJP

   C07K 1/26 20060101ALI20241004BHJP

   C07K 1/34 20060101ALI20241004BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20241004BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/37 ZNA

G01N27/62 X

G01N27/62 V

C07K1/12

C07K1/16

C07K1/26

C07K1/34

C07K16/00

【請求項の数】 46

(21)【出願番号】P 2023502690

(86)(22)【出願日】2021-07-19

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-22

(86)【国際出願番号】 US2021042164

(87)【国際公開番号】W WO2022020232

(87)【国際公開日】2022-01-27

【審査請求日】2023-03-07

(31)【優先権主張番号】63/053,899

(32)【優先日】2020-07-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509012625

【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド

(73)【特許権者】

【識別番号】509163824

【氏名又は名称】ユニベルシテイト ユトレヒト ホールディング ビー．ブイ．

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】サンドバル， ウェンディ ノエル

(72)【発明者】

【氏名】カヴァル， トミスラヴ

(72)【発明者】

【氏名】ヘック， アルベルト ジェー．アール．

(72)【発明者】

【氏名】ヘクト， エリザベス サラ

【審査官】福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】ANAL. CHEM.，2014年，86，P.3005-3012

【文献】MABS，2016年，8(2)，P.318-330

【文献】INT. J. MOL. SCI.，2019年，20 4843，P.1-19

【文献】PARASITOLOGY，2001年， 122，P.415-421

【文献】J. IMMUNOL.，1970年，105(4)，P.973-983

【文献】BIOTECHNOL. PROG.，2019年，35(1)，P.1-12

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ

Ｃ１２Ｑ

Ｃ１２Ｎ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗体の配列を分析するための方法であって、
ａ．前記抗体をカテプシンＬ、カテプシンＤ、又はカテプシンＬとカテプシンＤとの組み合わせによって切断して、１つ又は複数の抗体断片を得ることであって、前記抗体が、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む軽鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）を含む重鎖とを含み、前記カテプシンＬ及び／又は前記カテプシンＤが、前記ＶＬ領域と前記ＣＬ領域との間及び／又は前記ＶＨ領域と前記ＣＨ領域との間で前記抗体を切断して、ＶＬ抗体断片及び／又はＶＨ抗体断片並びにＣＬ抗体断片及び／又はＣＨ抗体断片を作製する、１つ又は複数の抗体断片を得ること、
ｂ．任意に、前記切断後に前記抗体断片の１つ又は複数を単離すること、並びに
ｃ．前記１つ又は複数の抗体断片の質量分析（ＭＳ）を行うこと
を含み、
切断が、前記抗体を、前記カテプシンＬ、前記カテプシンＤ、又は前記カテプシンＤとカテプシンＬとの組み合わせとともに、ｐＨ２～８で、室温～５０°Ｃの温度で、５０％以下の有機溶媒の存在下でインキュベートすることによって行われ、
前記抗体が天然の状態にある、方法。

【請求項2】

前記抗体が、ＩｇＧ抗体、例えばヒトのＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ２Ａ抗体、ＩｇＧ２Ｂ抗体又はＩｇＧ４抗体である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

切断が、ＶＬ断片及び／又はＶＨ断片を生成する、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記ＶＬ断片及び／又はＶＨ断片に対してＭＳ分析を行う、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記重鎖定常領域が少なくともＣＨ１領域を含み、任意に、ヒンジ、ＣＨ２領域及び／又はＣＨ３領域をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

抗体重鎖定常領域が、少なくともＣＨ１領域、ヒンジ及びＣＨ２領域を含み、前記カテプシンＬとカテプシンＤとの組み合わせが、前記ＣＨ１領域と前記ヒンジとの間で前記抗体をさらに切断する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記抗体が、カテプシンＬとカテプシンＤとの組み合わせによって切断される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記抗体をカテプシンＬ及びカテプシンＤの両方と同時にインキュベートすることを含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

切断が、前記ＶＬ領域と前記ＣＬ領域との間及び前記ＶＨ領域と前記ＣＨ領域との間で少なくとも５０％の切断を達成するように行われる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

切断が、前記ヒンジにおいて、又は前記ヒンジより下で、少なくとも５０％の切断を達成するように行われる、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

切断が、抗体に対するカテプシンＬ及び／又はカテプシンＤの比：１：２０～１：２０００、１：２０～１：５００、１：５０～１：５００、１：１００～１：５００、１：２００～１：１０００、１：２００～１：２０００、１：５００～１：２０００、１：１０００～１：２０００、又は１：２０、１：５０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、若しくは１：１０００で行われる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記抗体がＩｇＧ抗体であり、カテプシンＬとカテプシンＤとの組み合わせによって切断され、前記切断が、ＶＬ断片、ＶＨ断片、ＣＬ断片、ＣＨ１断片、ＣＨ２断片、ＣＨ３断片、ＣＨ２－ＣＨ３断片、ＣＬ＋ＣＨ１（結合）断片、Ｆ（ａｂ’）断片及びＦ（ａｂ’）２断片をもたらす、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記有機溶媒が、アセトニトリル、メタノール、エタノール又はイソプロピルアルコールである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記ｐＨが、３～５である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記ｐＨが３．５～４．５である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記ｐＨが４である、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

３０％以下の有機溶媒が存在する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

切断が１０～３０％の有機溶媒の存在下で行われる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

１０％以下の有機溶媒が存在する、請求項１～１３いずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記温度が３７°Ｃ～５０°Ｃである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

抗体の配列を分析するための方法であって、
ａ．前記抗体をカテプシンＬとカテプシンＤとの組み合わせによって切断して、少なくとも軽鎖可変領域（ＶＬ）断片及び／又は重鎖可変領域（ＶＨ）断片を含む１つ又は複数の抗体断片を得ることであって、
ｉ．前記抗体が天然の状態にあり、
ｉｉ．前記抗体が、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む軽鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）を含む重鎖とを含み、前記カテプシンＬ及び前記カテプシンＤが、前記ＶＬ領域と前記ＣＬ領域との間及び／又は前記ＶＨ領域と前記ＣＨ領域との間で前記抗体を切断して、ＶＬ抗体断片及び／又はＶＨ抗体断片並びにＣＬ抗体断片及び／又はＣＨ抗体断片を作製し、
ｉｉｉ．前記切断が、２５°Ｃ～５０°Ｃの温度かつ３～５のｐＨで、３０％以下の有機溶媒の存在下で行われる、１つ又は複数の抗体断片を得ること、
ｂ．任意に、前記切断後に前記抗体断片の１つ又は複数を単離すること、並びに
ｃ．前記１つ又は複数の抗体断片の質量分析（ＭＳ）を行うこと
を含む、方法。

【請求項22】

切断が、抗体に対するカテプシンＬ及び／又はカテプシンＤの比：１：２０～１：２０００、１：２０～１：５００、１：５０～１：５００、１：１００～１：５００、１：２００～１：１０００、１：２００～１：２０００、１：５００～１：２０００、１：１０００～１：２０００、又は１：２０、１：５０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、若しくは１：１０００で行なわれる、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

切断後、前記１つ又は複数の抗体断片を、緩衝液交換、クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィーなどの液体クロマトグラフィー、若しくはキャピラリー電気泳動）、濾過（例えば、分子量カットオフ濾過）、ジスルフィド結合の還元、塩酸グアニジンへの曝露、又はアルキル化のうちの１つ又は複数に供する、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

切断後の前記１つ又は複数の抗体断片が、クロマトグラフィー又は濾過によって単離される、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記１つ又は複数の抗体断片が液体クロマトグラフィーによって単離される、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記質量分析（ＭＳ）が、ＬＣ－ＭＳ又はＬＣ－ＭＳ／ＭＳを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記１つ又は複数の抗体断片が切断後に単離されない、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記質量分析が、直接注入質量分析（ＤＩＭＳ）、静的スプレー注入質量分析、又はフローインジェクション質量分析を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記質量分析のデータが、１つの抗体断片の少なくとも１０アミノ酸ストレッチのアミノ酸配列を決定するために使用される、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

１つの抗体断片の少なくとも１５アミノ酸ストレッチの前記アミノ酸配列が決定される、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

１つの抗体断片の少なくとも２０アミノ酸ストレッチの前記アミノ酸配列が決定される、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

少なくとも１つの抗体ＣＤＲ領域の前記アミノ酸配列が決定される、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記ＶＨ及び／又は前記ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列が決定される、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

ＶＨ断片及び／又はＶＬ断片などの少なくとも１つの抗体断片の完全なアミノ酸配列が決定される、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記配列がトップダウン分析によって決定される、請求項２９～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記配列がさらに分析されるか、又はボトムアップ分析によって確認される、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

抗体ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列が未知である、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記抗体のアミノ酸配列が未知である、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記抗体の前記ＣＬ領域及び／又は前記ＣＨ領域、例えば、前記切断から生成されたＣＬ断片、ＣＨ１断片、ＣＨ２断片及び／又はＣＨ３断片に対してＭＳを実施することを含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

少なくとも１つの抗体断片に対してエドマン分解を実施することをさらに含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記抗体が前記切断後に天然の状態のままである、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記抗体が、前記切断中又は前記切断後に、変性剤又はジスルフィド結合を還元する薬剤で処理されない、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記抗体が、前記切断中及び前記切断後に、そのジスルフィド結合を保持する、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記切断後に１つ又は複数の抗体断片の質量分析（ＭＳ）を実施することを含み、前記抗体が天然の状態のままであり、前記ＭＳ分析の前に変性剤又はジスルフィド結合を還元する薬剤で処理されない、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

抗体の配列を分析するためのキットであって、カテプシンＬ、カテプシンＤ、又はカテプシンＬとカテプシンＤとの組み合わせを含み、
前記抗体が、カテプシンＬ、カテプシンＤ、又はカテプシンＬとカテプシンＤとの組み合わせによって切断されて、１つ又は複数の抗体断片が得られ、
前記抗体が、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む軽鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）を含む重鎖とを含み、前記カテプシンＬ及び／又は前記カテプシンＤが、前記ＶＬ領域と前記ＣＬ領域との間及び／又は前記ＶＨ領域と前記ＣＨ領域との間で前記抗体を切断して、ＶＬ抗体断片及び／又はＶＨ抗体断片並びにＣＬ抗体断片及び／又はＣＨ抗体断片を作製し、
キットが、任意に、切断後に前記抗体断片の１つ又は複数を単離するための手段を含み、
前記１つ又は複数の抗体断片の質量分析（ＭＳ）が行われ、
切断が、前記抗体を、前記カテプシンＬ、前記カテプシンＤ、又は前記カテプシンＤとカテプシンＬとの組み合わせとともに、ｐＨ２～８で、室温～５０°Ｃの温度で、５０％以下の有機溶媒の存在下でインキュベートすることによって行われ、
前記抗体が天然の状態にある、キット。

【請求項46】

抗体の配列を分析するためのキットであって、カテプシンＬとカテプシンＤとの組み合わせを含み、
前記抗体がカテプシンＬとカテプシンＤとの組み合わせによって切断されて、少なくとも軽鎖可変領域（ＶＬ）断片及び／又は重鎖可変領域（ＶＨ）断片を含む１つ又は複数の抗体断片が得られ、
ｉ．前記抗体が天然の状態にあり、
ｉｉ．前記抗体が、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む軽鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）を含む重鎖とを含み、前記カテプシンＬ及び前記カテプシンＤが、前記ＶＬ領域と前記ＣＬ領域との間及び／又は前記ＶＨ領域と前記ＣＨ領域との間で前記抗体を切断して、ＶＬ抗体断片及び／又はＶＨ抗体断片並びにＣＬ抗体断片及び／又はＣＨ抗体断片を作製し、
ｉｉｉ．前記切断が、２５°Ｃ～５０°Ｃの温度かつ３～５のｐＨで、３０％以下の有機溶媒の存在下で行われ、
キットが、任意に、切断後に前記抗体断片の１つ又は複数を単離するための手段を含み、
前記１つ又は複数の抗体断片の質量分析（ＭＳ）が行われる、
キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年７月２０日に出願された米国仮出願第６３／０５３，８９９号の優先権を主張し、その内容全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

分野
本開示は、例えば、デノボ抗体のシーケンシング、試料中の既知の抗体の同定、又は試料中の抗体の配列の検証のための、ミドルダウン抗体特徴付け及びシーケンシングなどの抗体特徴付けシーケンシングのための新しい方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法は、抗体をカテプシンＤ、カテプシンＬ及び／又はカテプシンＤ及びカテプシンＬに曝露し、続いて質量分析並びに配列同定及びデコンボリューションを行うことを含む。

【背景技術】

【0003】

背景
試料中の抗体配列などのタンパク質配列を同定するために現在使用されているアプローチには、ボトムアップ分析、ミドルダウン分析、及びトップダウン分析が含まれる。大部分の場合に使用されるボトムアップ分析では、多くの場合、いくつかの異なるプロテアーゼを使用して（例えば４～５種のプロテアーゼ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）及び質量分析（ＭＳ）のための比較的短い重複ペプチド（例えば、９～３０アミノ酸長又は約１～５ｋＤａ）を生成することができる。そのようなプロトコルを未知の抗体の配列を決定するために行う場合（すなわち、デノボシーケンシング）、例えば、多数の質量スペクトルを生成し、次いで、プロダクトイオンピーク間の抽出されたマスシフトに関する情報を使用する特殊なシーケンシングプログラムを使用して組み立てる必要がある。このアプローチの１つの制限は、配列分析の精度が、非常に高品質のＭＳ（例えば、タンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）断片化効率及び低質量誤差）データを得ること、及びタンパク質全体に及ぶペプチドを検出することに依存し得ることである。さらに、ボトムアップ分析は、多数の小さなペプチドから完全なタンパク質配列に配列情報を正しくつなぎ合わせることを必要とし得るため、ソフトウェアの課題を生じ得る。より少数のペプチド又はタンパク質断片を使用するミドルダウンアプローチは、これらのソフトウェアの課題を軽減するのに役立ち得る。

【0004】

ミドルダウンアプローチは、例えば、抗体が最初に重鎖のＣＨ１領域とＣＨ２領域との間のヒンジ領域の近く又はヒンジ領域内で切断されて、例えばＦ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆｃ断片、Ｆｄ断片、ＶＬ－ＣＬ断片を生成する抗体に使用することができる。最も一般的に使用される酵素は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のシステインプロテイナーゼ（ＩｄｅＳ）であり、これはヒンジ領域の後で切断してＦ（ａｂ’）２断片及びＦｃ／２断片を生成する。ジスルフィド結合の還元後、軽鎖（ＬＣ）断片、Ｆｄ’断片、及びＦｃ断片が生じ得、それぞれ、約２５ｋＤａのサイズ及び約２００アミノ酸の長さである。

【0005】

これらの比較的長い断片は、一般的なＭＳ機器を使用して分析した場合、完全に断片化することは困難であり、したがってデノボシーケンシングには適していない可能性がある。例えば、現在一般的なＭＳ機器としては、衝突誘起解離を用いた飛行時間、又は高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）を用いたＯｒｂｉｔｒａｐ（商標）の機器が挙げられるが、これらは、電子誘起解離（非常に効率的で直交する断片化手法）がなく、紫外線光解離（非常に大きなポリペプチドにも適している）がない。したがって、限定されたカバレッジのみを提供するミドルダウンアプローチは、デノボ抗体シーケンシングのためのボトムアップシーケンシング法で補完する必要があり得る。したがって、一般に使用されている業界標準のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ ＣＩＤ及びＨＣＤ機器により適した、したがってより実用的なタンパク質断片を生成する代替ミドルダウンメソッドが必要とされている。

【発明の概要】

【0006】

概要
本開示は、とりわけ、抗体を切断するための方法であって、抗体をカテプシンＬ、カテプシンＤ、又はカテプシンＬとカテプシンＤとの組み合わせと混合して、１つ又は複数の抗体断片を得ることを含み、抗体は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む軽鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）を含む重鎖とを含み、カテプシンＬ及び／又はカテプシンＤは、ＶＬ領域とＣＬ領域との間及び／又はＶＨ領域とＣＨ領域との間で抗体を切断して、ＶＬ抗体断片及び／又はＶＨ抗体断片並びにＣＬ抗体断片及び／又はＣＨ抗体断片を作製する。いくつかの実施形態では、本方法はまた、切断後に抗体断片の１つ又は複数を単離することを含む。いくつかの実施形態では、抗体断片は、切断後に単離されない。いくつかの実施形態では、切断後、１つ又は複数の抗体断片は、質量分析によって分析される。

【0007】

例えば、本開示はまた、抗体の配列を分析するための方法であって、（ａ）抗体をカテプシンＬ、カテプシンＤ、又はカテプシンＬとカテプシンＤとの組み合わせによって切断して、１つ又は複数の抗体断片を得ることであって、抗体が、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む軽鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）を含む重鎖とを含み、カテプシンＬ及び／又はカテプシンＤが、ＶＬ領域とＣＬ領域との間及び／又はＶＨ領域とＣＨ領域との間で抗体を切断して、ＶＬ抗体断片及び／又はＶＨ抗体断片並びにＣＬ抗体断片及び／又はＣＨ抗体断片を作製する、１つ又は複数の抗体断片を得ること、（ｂ）任意に、切断後に抗体断片の１つ又は複数を単離すること、並びに（ｃ）該１つ又は複数の抗体断片の質量分析（ＭＳ）を行うこと、を含む方法も包含する。

【0008】

任意の上記方法において、いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体、例えばヒトＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ２Ａ抗体、ＩｇＧ２Ｂ抗体又はＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、切断は、ＶＬ断片及び／又はＶＨ断片を生成する。いくつかのこのような実施形態では、ＭＳ分析は、ＶＬ断片及び／又はＶＨ断片に対して行われる。本明細書のいくつかの方法では、重鎖定常領域は、少なくともＣＨ１領域を含み、任意に、ヒンジ、ＣＨ２領域及び／又はＣＨ３領域をさらに含む。本明細書のいくつかの方法では、抗体重鎖定常領域は、少なくともＣＨ１領域、ヒンジ及びＣＨ２領域を含み、カテプシンＬ及び／又はカテプシンＤは、ＣＨ１領域とヒンジとの間で抗体をさらに切断する。

【0009】

いくつかの実施形態では、抗体はカテプシンＬによって切断される。いくつかの実施形態では、抗体はカテプシンＤによって切断される。いくつかの実施形態では、抗体は、カテプシンＬとカテプシンＤとの組み合わせによって切断される。いくつかの場合では、ＩｄｅＳ又は別のプロテアーゼなどの追加の酵素も使用される。他の場合では、切断に使用される酵素は、カテプシンＬからなるか、カテプシンＤからなるか、又はカテプシンＬとカテプシンＤとの組み合わせからなる。いくつかの場合では、本方法は、抗体をカテプシンＬ及びカテプシンＤの両方と同時にインキュベートすることを含む。

【0010】

いくつかの実施形態では、切断は、ＶＬ領域とＣＬ領域との間及びＶＨ領域とＣＨ領域との間で少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％の切断を達成するように行われる。いくつかの場合では、切断は、ヒンジにおいて、又はヒンジより下で、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は１００％の切断を達成するように行われる。いくつかの場合では、抗体は、ＩｇＧ抗体であり、カテプシンＬとカテプシンＤとの組み合わせによって切断され、切断は、ＶＬ断片、ＶＨ断片、ＣＬ断片、ＣＨ１断片、ＣＨ２断片、ＣＨ３断片、ＣＨ２－ＣＨ３断片、ＣＬ＋ＣＨ１（結合）断片、Ｆ（ａｂ’）断片及びＦ（ａｂ’）２断片をもたらす。いくつかの実施形態では、切断は、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、及び軽鎖ＣＤＲ３のそれぞれを含む断片、例えばＶＬ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、又はＦ（ａｂ’）２断片、及び／又は重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３のそれぞれを含む断片、例えばＶＨ、Ｆ（ａｂ’）、又はＦ（ａｂ’）２断片をもたらす。

【0011】

本明細書のいくつかの方法では、切断は、抗体をカテプシンＬ、カテプシンＤ、又はカテプシンＤとカテプシンＬとの組み合わせとともに、ｐＨ２～８（例えば、ｐＨ２～７、ｐＨ２～６、ｐＨ３～６、ｐＨ３～５、ｐＨ２、ｐＨ２．５、ｐＨ３、ｐＨ３．５、ｐＨ４、ｐＨ４．５、ｐＨ５、ｐＨ５．５、ｐＨ６、ｐＨ７又はｐＨ８）で、室温～５０°Ｃの温度で、５０％以下の有機溶媒（例えば、アセトニトリル、メタノール、エタノール又はイソプロピルアルコール）の存在下でインキュベートすることによって行われ、抗体は天然の状態にある。本明細書のいくつかの方法では、切断は、０～５０％、５～５０％、５～３０％、０～３０％、１０～３０％、０～１０％、５～１５％、１０～２０％、１５～２５％、又は２０～３０％の濃度の１つ又は複数の有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、又はアセトニトリル）の存在下で行われる。０～５０％、５～５０％、５～３０％、０～３０％、１０～３０％、０～１０％、５～１５％、１０～２０％、１５～２５％、又は２０～３０％の濃度の１つ又は複数の有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、又はアセトニトリル）を含む方法を含む本明細書のいくつかの方法では、ｐＨは、３～５、例えば３、３．５、４、４．５、又は５である。いくつかのそのような場合では、ｐＨは３．５～４．５である。いくつかのそのような場合では、ｐＨは４である。いくつかの切断反応では、３０％以下の有機溶媒が存在する。いくつかのそのような場合では、切断は、１０～３０％の有機溶媒（例えば、１０～３０％アセトニトリル、１０～３０％メタノール、１０～３０％エタノール又は１０～３０％イソプロピルアルコール）の存在下で行われる。いくつかの切断反応では、１０％以下の有機溶媒が存在する。いくつかの切断反応では、温度は３７°Ｃ～５０°Ｃである。

【0012】

本明細書の開示はまた、抗体の配列を分析するための方法であって、（ａ）抗体をカテプシンＬとカテプシンＤとの組み合わせによって切断して、少なくとも軽鎖可変領域（ＶＬ）断片及び／又は重鎖可変領域（ＶＨ）断片を含む１つ又は複数の抗体断片を得ることであって、（ｉ）抗体が天然の状態にあり、（ｉｉ）抗体が、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む軽鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）を含む重鎖とを含み、カテプシンＬ及びカテプシンＤが、ＶＬ領域とＣＬ領域との間及び／又はＶＨ領域とＣＨ領域との間で抗体を切断して、ＶＬ抗体断片及び／又はＶＨ抗体断片並びにＣＬ抗体断片及び／又はＣＨ抗体断片を作製し、（ｉｉｉ）切断が、２５°Ｃ～５０°Ｃの温度かつ３～５のｐＨで、３０％以下の有機溶媒の存在下で行われる、１つ又は複数の抗体断片を得ること、（ｂ）任意に、切断後に抗体断片の１つ又は複数を単離すること、並びに（ｃ）１つ又は複数の抗体断片の質量分析（ＭＳ）を行うこと、を含む方法も含む。

【0013】

本明細書の任意の方法では、切断後、１つ又は複数の抗体断片を、緩衝液交換、クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィーなどの液体クロマトグラフィー、又はキャピラリー電気泳動）、濾過（例えば、分子量カットオフ濾過）、ジスルフィド結合の還元、塩酸グアニジンへの曝露、又はアルキル化のうちの１つ又は複数に供してもよい。例えば、これらの工程のうちの１つ又は複数は、ＭＳ分析の前に、又はＭＳ分析を受けている試料の一部に対して実行され得る（例えば、試料の一部の還元又はアルキル化により、これらの変更を伴うＭＳ割り当てと伴わないＭＳ割り当てとを比較することができる）。いくつかの実施形態では、切断後の１つ又は複数の抗体断片は、クロマトグラフィー又は濾過によって単離される。いくつかのそのような場合では、１つ又は複数の抗体断片は、液体クロマトグラフィーによって単離される。

【0014】

いくつかの実施形態では、ＭＳ分析が行われる場合、ＭＳはＬＣ－ＭＳ又はＬＣ－ＭＳ／ＭＳを含む。他の場合では、１つ又は複数の抗体断片は、切断後に単離されない。いくつかの実施形態では、質量分析が実行される場合、質量分析は、直接注入質量分析（ＤＩＭＳ）、静的スプレー注入質量分析、又はフローインジェクション質量分析を含む。

【0015】

いくつかの実施形態では、質量分析が行われる場合、質量分析のデータが、１つの抗体断片の少なくとも１０アミノ酸ストレッチのアミノ酸配列を決定するために使用される。いくつかの実施形態では、１つの抗体断片の少なくとも１５アミノ酸ストレッチのアミノ酸配列が決定される。いくつかの実施形態では、１つの抗体断片の少なくとも２０アミノ酸ストレッチのアミノ酸配列が決定される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗体ＣＤＲ領域のアミノ酸配列が決定される。いくつかの実施形態では、ＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列が決定される。いくつかの実施形態では、ＶＨ断片及び／又はＶＬ断片などの少なくとも１つの抗体断片の完全なアミノ酸配列が決定される。いくつかの実施形態では、配列は、トップダウン分析によって決定される。いくつかの実施形態では、配列は、さらに分析されるか、又はボトムアップ分析によって確認される。いくつかの実施形態では、抗体ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列は、未知である。いくつかの実施形態では、抗体のアミノ酸配列は、未知である。いくつかの実施形態はまた、抗体のＣＬ領域及び／又はＣＨ領域、例えば、切断から生成されたＣＬ断片、ＣＨ１断片、ＣＨ２断片及び／又はＣＨ３断片に対してＭＳを実施することも含む。いくつかの場合では、本明細書の任意の方法は、少なくとも１つの抗体断片に対してエドマン分解を実施することをさらに含む。本明細書のいくつかの方法では、切断は、抗体に対するカテプシンＬ及び／又はカテプシンＤの比：１：２０～１：２０００、１：２０～１：５００、１：５０～１：５００、１：１００～１：５００、１：２００～１：１０００、１：２００～１：２０００、１：５００～１：２０００、１：１０００～１：２０００、又は１：２０、１：５０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、若しくは１：１０００で行なわれる。本明細書のいくつかの方法では、抗体は、切断後に天然の状態のままである。本明細書のいくつかの方法では、抗体は、切断中又は切断後に、変性剤又はジスルフィド結合を還元する薬剤で処理されない。本明細書のいくつかの方法では、抗体は、切断中又は切断後に、そのジスルフィド結合を保持する。本明細書のいくつかの方法は、切断後に１つ又は複数の抗体断片の質量分析（ＭＳ）を実施することを含み、抗体は天然の状態のままであり、ＭＳ分析の前に変性剤又はジスルフィド結合を還元する薬剤で処理されない。

【0016】

本開示はまた、上記の方法に従って生成された抗体断片を含む組成物を含む。いくつかの場合では、組成物は、カテプシンＬ、カテプシンＤ、又はカテプシンＬとカテプシンＤとの組み合わせによる切断から生成されたＩｇＧ抗体断片を含み、抗体断片は、ＶＨ断片及びＶＬ断片の一方又は両方と、以下の断片：ＣＬ断片、ＣＨ１断片、ＣＨ２断片、ＣＨ３断片、ＣＨ２－ＣＨ３断片、ＣＬ＋ＣＨ１（結合）断片、Ｆ（ａｂ’）断片及びＦ（ａｂ’）２断片の少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つを含む。いくつかの場合では、ＶＨ断片及び／又はＶＬ断片は、９０～１５０アミノ酸、例えば９５～１４０アミノ酸、例えば１００～１４０アミノ酸、又は例えば１００～１２０アミノ酸の長さを含む。いくつかのそのような場合では、ＶＨ断片及び／又はＶＬ断片は、１０～１６ｋＤａ、例えば１０～１３ｋＤａ、例えば１０～１２ｋＤａ、例えば１０～１１ｋＤａ、又は例えば１１～１２ｋＤａの分子質量を有する。

【0017】

本開示はまた、カテプシンＬ、カテプシンＤ、又はカテプシンＬとカテプシンＤとの組み合わせによってタンパク質を消化するのに使用するためのキットを含み、該キットは、（ａ）カテプシンＬ及び／又はカテプシンＤ、（ｂ）１つ又は複数の反応緩衝液、並びに任意に（ｃ）タンパク質の消化に使用するための説明書を含む。いくつかの場合では、キットは、上記の方法に従って抗体を切断するのに使用するための試薬を提供する。いくつかのキットでは、反応緩衝液は、ｐＨ２～８、ｐＨ２～７、ｐＨ２～６、ｐＨ２～５、ｐＨ３～６、ｐＨ３～５、ｐＨ３～４、ｐＨ４～５、ｐＨ２、ｐＨ２．５、ｐＨ３、ｐＨ３．５、ｐＨ４、ｐＨ４．５、ｐＨ５、ｐＨ５．５、ｐＨ６、ｐＨ７又はｐＨ８であり、反応緩衝液は、１つ又は複数の有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、反応緩衝液は、０～５０％、５～５０％、５～３０％、０～３０％、１０～３０％、０～１０％、５～１５％、１０～２０％、１５～２５％、又は２０～３０％の濃度の１つ又は複数の有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、又はアセトニトリル）を含む。いくつかの場合では、反応緩衝液はｐＨ３、ｐＨ３．５、ｐＨ４、ｐＨ４．５又はｐＨ５である。いくつかのキットでは、反応緩衝液はｐＨ４である。

【0018】

前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明の両方は、例示的かつ説明的なものにすぎず、特許請求の範囲を限定するものではないことを理解されたい。本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、特定の実施形態又は態様を示し、説明とともに、本明細書に記載の原理を説明するのに役立つ。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】図１Ａ～図１Ｄは、カテプシンＬに曝露されたリツキシマブのスペクトルを示す。図１Ａ～図１Ｂは、カテプシンＬに曝露された全スペクトルのリツキシマブを示し、約１０ｋＤａの質量のＣＤＲ Ｌ３クリップ、約４７ｋＤａの「１アーム」クリップ、約１００ｋＤａの１アームクリップの相補体（例えば、１００，２３８は、１４７，４００のＧ１Ｆ／Ｇ１Ｆを有する完全モノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、水の１８と一緒に４７，１７８を欠損している）、及び約１４７ｋＤａのインタクトｍＡｂを示す。図１Ｃ～図１Ｄは、１アームクリップのｍ／ｚ範囲（３０００～４０００）及びｍ範囲（４５０００～４９０００）に注目して、カテプシンＬスペクトルに曝露された同じリツキシマブの電荷デコンボリューションを示す。

【0020】

【図2】図２Ａ～図２Ｄは、カテプシンＤに曝露されたリツキシマブのスペクトルを示す。図２Ａ～図２Ｂは、１アームクリップを示す。図２Ｃ～図２Ｄは、Ｆ（ａｂ’）２クリップを示す。

【0021】

【図3】図３Ａ～図３Ｄは、カテプシンＬに曝露されたオビヌツズマブのスペクトルを示す。図３Ａ～図３Ｂは、完全なｍＡｂピークを示す。１４８６３０．４Ｄａは、Ｇ０／Ｇ０グリコシル化を有するｍＡｂについて良好な一致であり、１４８，８３４．１は余分なＧｌｃＮＡｃについて良好な一致であり、１４９０３８．０は２つの余分なＧｌｃＮＡｃを有する。オビヌツズマブは、大部分がフコシル化グリカンを有するように糖鎖工学的に改変されている。図３Ｃ～図３Ｄは、１アームクリップを示す。

【0022】

【図4】図４Ａ～図４Ｈは、カテプシンＤに曝露されたオビヌツズマブのスペクトルを示す。図４Ａ～図４Ｂは、全スペクトルを示す。図４Ｃ～図４Ｄは、完全なｍＡｂピークを示す。１４８６２８．３Ｄａは、Ｇ０／Ｇ０グリコシル化を有するｍＡｂについて良好な一致であり、１４８，８３２．９は余分なＧｌｃＮＡｃについて良好な一致であり、１４９０３４．７は２つの余分なＧｌｃＮＡｃを有する。図４Ｅ～図４Ｆは、完全な１アームクリップを示す。図４Ｇ～図４Ｈは、Ｆ（ａｂ’）２クリップを示す。

【0023】

【図5】図５Ａ～図５Ｄは、カテプシンＬに曝露されたエクリズマブのスペクトルを示す。図５Ａ～図５Ｂは、全スペクトルを示す。図５Ｃ～図５Ｄは、ＣＤＲ Ｈ３クリップを示す。

【0024】

【図6】図６Ａ～図６Ｄは、カテプシンＤに曝露されたエクリズマブのスペクトルを示す。図６Ａ～図６Ｂは、全スペクトルを示す。図６Ｃ～図６Ｄは、Ｆ（ａｂ’）２クリップを示す。

【0025】

【図7】図７Ａ～図７Ｂは、カテプシンＤによって消化されたリツキシマブのネイティブ質量スペクトルを示す。図７Ａは、完全なｍ／ｚ範囲のデコンボリューションが９～９８ｋＤａのペプチドを与えることを示し、有意な量のインタクトＡｂ（約１４７ｋＤａ）を示す。９７，６８４のピークは、ＬＬＧＧＰＳＶＦ．Ｌのヒンジの下での切断から生成される。Ｆ（ａｂ’）ＬＬＧＧＰＳＶＦ．Ｌ＋Ｆ（ａｂ’）ＬＬＧＧＰＳＶ．Ｆによって形成された９７，５３８などの非対称クリップも観察され、挿入図に示されている。図７Ｂは、４７ｋＤａ領域にわたるデコンボリューションが、ＩｇＧ１結晶構造（ＰＤＢ１ＨＺＨ）上に示される特定の部位位置、Ｆ（ａｂ’）で観察されるクリップの多重度を明らかにすることを示す。

【0026】

【図8】図８は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２－Ｂ及びＩｇＧ１抗体上のカテプシンＬ（灰色の線）及びカテプシンＤ（黒色の無地の線）単独及び組み合わせの好ましい切断部位を示す。ＩｇＧ１クラスでは、カテプシンＬ及びＤはそれぞれ、重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ３、ヒンジの上方（Ｆ（ａｂ’））、及び重鎖ヒンジ領域全体（灰色及び黒色の破線）で切断を生じた。カテプシンＤのみが配列ＰＳＶＦＬ．Ｆを独特に切断してＦ（ａｂ’）２を得た。（黒実線。）カテプシンＬ及びカテプシンＤの組み合わせは、各末端に菱形を有する黒い線によって示される位置でさらなる切断を生じた。エクリズマブ（ＩｇＧ２－Ｂ）では、ジスルフィドパターンが異なるためヒンジ部における切断は観察されなかった。ＩｇＧ１二重特異性では、抗Ｈｅｒ２（ノブ）アームで観察されたものと比較して、Ｆｃ抗ＣＤ３アーム（ホール）における切断は観察されなかった。

【0027】

【図9】図９Ａ～図９Ｂは、異なる処理にわたるカテプシンＬ及びカテプシンＤの消化効率の比較を示す。図９Ａは、表３及び１１に報告されているすべての同定されたポリペプチドを示す。ポリペプチドを合計し、インタクトなトラスツズマブの強度に対して取得した。図９Ｂは、主Ａｂピークに対する比として得られたすべてのペプチドピークのＵＶピーク面積（ＥＩＣ溶出時間に対応する）を示す。エラーバーは、測定値の標準偏差を表す。

【0028】

【図10】図１０Ａ～図１０Ｅは、ワンポットのカテプシンＬ及びカテプシンＤ消化物のＵＶ及びＴＩＣ測定の例を示す。インセットは、それらの溶出時間ウィンドウにわたって平均化され、インタクト質量でデコンボリューションされた選択されたＭＳスペクトルを示す（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ）。正確な質量は、時間、質量、及びｍ／ｚ範囲、並びに電荷デコンボリューションに使用される他のパラメータに依存するため、これらの図の質量は、本明細書に開示された表に与えられた質量からわずかに変化し得る。

【0029】

【図11】図１１Ａ～図１１Ｄは、カテプシンｐＨ４試料の静的注入のスペクトルを示す。Ｂｉｏｒａｄ Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ（登録商標）カラムを使用して、超高質量範囲（ＵＨＭＲ）質量分析計で、試料を５０ｍＭ酢酸アンモニウムに緩衝液交換した。ＭＳ１スペクトルは２００ｍ／ｚで１７，５００分解能で得られ、電荷状態は５０Ｋ又は１００Ｋ分解能でＳＩＭモードで確認された。図１１Ａは、Ｒｆ設定が高質量（＞４０００ｍ／ｚ）に対して調整及び最適化されたことを示す。図１１Ｂは、Ｒｆ設定が中範囲質量（１５００～４０００ｍ／ｚ）に対して調整及び最適化されたことを示す。図１１Ｃ及び図１１Ｄは、それぞれ１２．１ｋＤａ種及び４７ｋＤａ種の高分解能質量スペクトルを示す。

【0030】

【図12】図１２は、カテプシンＬ及びカテプシンＤ最適化消化物のエドマン分解の割り当てを示す。「（）」中のアミノ酸は、良好な信頼性で同定されたものより信頼性が低い。

【0031】

【図13】図１３Ａ～図１３Ｃは、選択されたカテプシン消化産物のＭＳ２スペクトルを示す。図１３Ａは、１２．１ｋＤａ種の質量スペクトルを示す。図１３Ｂは、４７ｋＤａ種の質量スペクトルを示す。図１３Ｃは、９８ｋＤａ種の質量スペクトルを示す。

【0032】

【図14】図１４Ａ～図１４Ｂは、選択されたポリペプチドの上から下への注釈を示す。（図１４Ａ）１２，１２１．５Ｄａ及び（図１４Ｂ）９８ｋＤａの生成物のカバレッジを示す。薄い灰色のｙイオンはＧで終わるＨＣ配列、濃い灰色はＧＧ、三角はｙイオン＋特定されない共有結合性架橋修飾に対応している。黒色は、ＨＣ ｂイオン又はＬＣ ｂ／ｙイオンを表す。スペクトルをｎＥＳＩ注入により収集し、Ｘｔｒａｃｔアルゴリズムを使用してデコンボリューションし、ＰｒｏＳｉｇｈｔ Ｌｉｔｅ及び社内プログラムを使用して１０ｐｐｍの許容範囲で断片にマッチングさせた。

【0033】

【図15】図１５Ａ～図１５Ｃは、アミノ酸濃縮モチーフを示す。図１５Ａは、カテプシンＬを示す。図１５Ｂは、カテプシンＤを示す。図１５Ｃは、ワンポットのカテプシンＬ及びカテプシンＤ消化物を示す。ｐ４＝ｐ４’に対するアミノ酸選択性を、Ｓｅｑ２Ｌｏｇｏ ２．０［７１］において評価した。

【0034】

【図16】図１６は、最適化された消化プロトコル後に観察されたトラスツズマブ及び切断部位の分子モデルを示す。トラスツズマブ（ＰＤＢ ６ＢＩ２）ＬＣを右／上側（底面方向）に示し、ＨＣ ＡＡ １－２２１を左／上側（底面方向）に示す。ＨＣ ＣＨ２及びＣＨ３領域は黒色で示され組み合わされており、示されている構造は単一のＡｂアーム（抗体の半分）である。社内プログラムＧＹＳＴを使用して、完全長ＩｇＧ１結晶構造（ＰＤＢ １ＨＺＨ）の残基１～２１４にトラスツズマブＦ（Ａｂ’）をアライメントし、ＰｙＭｏｌ ２．３．５でモデル化した。アライメントしたＩｇＧ１（ＡＡ２２８～４７８）のＣＨ１、ＣＨ２、及びヒンジ領域は、トラスツズマブと９０．９％の同一性を有し、すべての切断部位が同一の相同性の領域上にあった。ジスルフィド結合は示さず、Ｆｃグリカンは白色の棒として示されている。任意の切断部位が球モデルとして示されており、黒色に着色されている。

【発明を実施するための形態】

【0035】

特定の実施形態のさらなる説明
定義
別段の定義がない限り、本発明に関連して使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。

【0036】

本出願では、「又は」の使用は、特に明記しない限り、「及び／又は」を意味する。多数項従属請求項の文脈では、「又は」の使用は、１つよりも多くの先行する独立請求項又は従属請求項のいずれかのみを指す。また、「要素」又は「構成成分」などの用語は、特に明記しない限り、１つの単位を含む要素及び構成成分と、１つよりも多くのサブユニットを含む要素及び構成成分の両方を包含する。

【0037】

本明細書に記載の場合、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率の範囲、又は整数範囲は、別段示されない限り、列挙された範囲内のあらゆる整数、及び適切な場合、それらの分数（整数の１０分の１及び１００分の１など）の値を含むと理解されるべきである。

【0038】

単位、接頭辞、及び記号は、国際単位系（ＳＩ）で受け入れられている形式で示されている。数値範囲は、範囲を定義する数を含む。本明細書で提供される見出しは、全体として本明細書を参照することによって有することができる本開示の様々な態様の限定ではない。したがって、以下ですぐ下に定義される用語は、本明細書をその全体で参照することによってより完全に定義される。

【0039】

本開示に従って利用される場合、以下の用語は、他に別段の指示がない限り、以下の意味を有するものと理解すべきである。

【0040】

本明細書で使用される「試料」は、分析を必要とするタンパク質又は抗体を含み得る任意の検体を指す。

【0041】

「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。このようなアミノ酸残基のポリマーは、天然及び／又は非天然アミノ酸残基を含有し得、限定されないが、アミノ酸残基のペプチド、オリゴペプチド、二量体、三量体、及び多量体が挙げられる。この用語はまた、例えば、グリコシル化、シアリル化などの修飾を有するか、又は他の分子と複合体化したアミノ酸のポリマーを含む。

【0042】

本明細書における「ペプチド」は、４～５０アミノ酸程度などのアミノ酸の比較的短いポリマーである。

【0043】

「抗体」又は「Ａｂ」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、限定されるものではないが、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ポリクローナル抗体、及び多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を含めた、様々な抗体構造を包含する。本明細書で使用される場合、この用語は、少なくとも重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と、少なくとも軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３とを含む分子であって、抗原に結合することができる分子を指す。抗体という用語には、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及びマウス、カニクイザルなどの様々な種の抗体も含まれるが、これらに限定されない。この用語は、抗原結合断片も包含する。「抗原結合断片」という用語は、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及び（Ｆａｂ’）_２などの抗原に結合することができる抗体の断片を含むが、これらに限定されない。対照的に、「完全長抗体」は、その正常な可変領域部分及び定常領域部分のすべてを含む抗体分子を指す。他のタンパク質及びペプチドと同様に、いくつかの実施形態では、抗体は、グリコシル化などの様々なタイプの翻訳後修飾を含み得る。

【0044】

タンパク質、ポリペプチド又は抗体の「断片」（「抗体断片」）は、一般に、タンパク質から酵素によって切断された抗体又はペプチドのＦｃ又はＦ（ａｂ’）２断片など、より大きな分子の一部又は領域を指す。例えば、抗体断片などのタンパク質断片は、本開示に記載の方法における酵素的切断によって生成され得る。又は、質量分析プロセス中に生成され得る。

【0045】

本明細書における「天然の状態」にあるタンパク質又は抗体は、その天然の折り畳まれた構造及びジスルフィド結合を保持し、変性されていない、アンフォールディングされていない、又は還元されてジスルフィド結合が除去されていないものを意味する。天然の状態にあるタンパク質は、例えば、タンパク質を変性又はアンフォールディングさせることなく天然の折り畳みを弛緩させるのに十分な有機溶媒の存在下にあり得る。

【0046】

「重鎖」又は「ＨＣ」という用語は、リーダー配列の有無にかかわらず、少なくとも重鎖可変領域を含むポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、重鎖は、重鎖定常領域の少なくとも一部を含む。「完全長重鎖」という用語は、リーダー配列の有無にかかわらず、及びＣ末端リジン（Ｋ）の有無にかかわらず、完全長重鎖可変領域及び完全長重鎖定常領域を含むポリペプチドを指す。「成熟完全長重鎖」という用語は、リーダー配列を含まず、Ｃ末端リジン（Ｋ）を含む又は含まない、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含むポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、重鎖は、ピログルタミン酸修飾などの翻訳後修飾を含むが、他の場合では、重鎖はそのような修飾を含まない。

【0047】

「重鎖可変領域」又は「ＶＨ」という用語は、重鎖の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、フレームワーク領域（ＦＲ）２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、及びＣＤＲ３を含む領域を指す。いくつかの場合では、ＶＨはまた、ＣＤＲ１の前にＦＲ１の一部又は全部を含み、及び／又は、ＣＤＲ３の後にＦＲ４の一部又は全部を含む。「完全長ＶＨ」は、ＣＤＲ１、ＦＲ、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３セグメントにそれぞれ先行する及び続く完全ＦＲ１及び完全ＦＲ４を含むＶＨである。本明細書で使用される場合、第２のセグメントの「前（ｐｒｉｏｒ ｔｏ）」又は「先行する（ｐｒｅｃｅｄｅｓ）」第１のタンパク質セグメントは、第１のセグメントが第２のセグメントに対してＮ末端であることを意味する。第２のセグメントの「後」の第１のセグメントは、第２のセグメントのＣ末端である。ヒトＩｇＧ抗体のＶＨは、ＥＵナンバリングで、典型的には重鎖のアミノ酸１～１１７を含む。

【0048】

「軽鎖」又は「ＬＣ」という用語は、リーダー配列の有無にかかわらず、少なくとも軽鎖可変領域を含むポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、軽鎖は、軽鎖定常領域の少なくとも一部を含む。「完全長軽鎖」という用語は、リーダー配列の有無にかかわらず、完全長軽鎖可変領域及び完全長軽鎖定常領域を含むポリペプチドを指す。「成熟完全長軽鎖」という用語は、リーダー配列を含まない、軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含むポリペプチドを指す。いくつかの場合では、軽鎖は翻訳後修飾を含み得るが、他の場合では含まない。

【0049】

「軽鎖可変領域」又は「ＶＬ」という用語は、軽鎖ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＨＶＲ２、ＦＲ３、及びＨＶＲ３を含む領域を指す。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域はまた、ＦＲ１及び／又はＦＲ４の少なくとも一部を含む。「完全長ＶＬ」は、ＣＤＲ１、ＦＲ、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３セグメントにそれぞれ先行する及び続く完全ＦＲ１及び完全ＦＲ４を含むＶＬである。ヒト抗体のＶＬは、ＥＵナンバリングで、典型的には重鎖のアミノ酸１～１０７を含む。

【0050】

本明細書で使用される「重鎖定常領域」又は「ＣＨ」という用語は、重鎖可変領域に続き、１、２、又は３つの重鎖定常領域、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３、並びにそれらの領域を連結する任意のセグメントを包含する領域を指す。ＩｇＧ抗体の重鎖の定常領域は、典型的には、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３と呼ばれる３つの領域を有し、ＣＨ１とＣＨ２との間に短い「ヒンジ」領域を有する。ＣＨ２及びＣＨ３領域は集合的に抗体の「Ｆｃ」断片を形成する。ＩｇＧクラスの抗体の「ヒンジ」領域は、抗体の天然の状態にある比較的柔軟な重鎖のＣＨ１部分とＣＨ２部分との間の短いアミノ酸配列領域を指す。ＥＵナンバリングでは、ヒトＩｇＧ抗体のヒンジ領域は重鎖の約アミノ酸２１６～２３０に見られ、ＣＨ１領域は約アミノ酸１１８～２１５に見られ、ＣＨ２は約アミノ酸２３１～３４０に見られ、ＣＨ３は約アミノ酸３４１～４４７に見られる。

【0051】

非限定的な例示的重鎖定常領域には、γ、δ及びαが含まれる。非限定的な例示的重鎖定常領域には、ε及びμも含まれる。また、γ定常領域を含む抗体はＩｇＧ抗体であり、δ定常領域を含む抗体はＩｇＤ抗体であり、α定常領域を含む抗体はＩｇＡ抗体である。さらに、μ定常領域を含む抗体はＩｇＭ抗体であり、ε定常領域を含む抗体はＩｇＥ抗体である。特定のアイソタイプは、サブクラスにさらに細分することができる。例えば、ＩｇＧ抗体には、ＩｇＧ１抗体（γ_１定常領域を含む）、ＩｇＧ２抗体（γ_２定常領域を含む）、ＩｇＧ３抗体（γ_３定常領域を含む）、及びＩｇＧ４抗体（γ_４定常領域を含む）が含まれるが、これらに限定されない。ＩｇＡ抗体には、ＩｇＡ１抗体（α_１定常領域を含む）及びＩｇＡ２抗体（α_２定常領域を含む）が含まれるが、これらに限定されない。ＩｇＭ抗体には、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２が含まれるが、これらに限定されない。

【0052】

いくつかの実施形態では、重鎖定常領域、フレームワーク領域、又は軽鎖定常領域は、抗体に所望の特徴を付与する１つ又は複数の突然変異（又は置換）、付加又は欠失を含む。例えば、非限定的な例示的突然変異は、ＩｇＧ４モチーフＣＰＳＣＰをＩｇＧ１の対応するモチーフに類似するＣＰＰＣＰに変更する、ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域（定常ドメインＣ_Ｈ１とＣ_Ｈ２との間）のＳ２４１Ｐ突然変異である。その突然変異は、より安定なＩｇＧ４抗体をもたらし得る。例えば、Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５－１０８（１９９３）；Ｂｌｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．６：４０７－４１５（１９９７）；Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：１－８（２００１）を参照のこと。

【0053】

本明細書で使用される「軽鎖定常領域」又は「ＣＬ」という用語は、ＶＬ領域の後の領域を指し、略して「ＣＬ」と呼ばれ得る。非限定的な例示的な軽鎖定常領域には、λ及びκが含まれる。ヒト抗体のＣＬは、ＥＵナンバリングで、典型的には重鎖のアミノ酸１０８～２１４を含む。

【0054】

「ＩｇＧ」又は「免疫グロブリンＧ」抗体は、いくつかの哺乳動物抗体クラスの１つであり（他は、例えばＩｇＡ、ＩｇＭなどである）、γ定常領域を含む。これは、２つの重鎖及び２つの軽鎖から形成される四量体タンパク質である。軽鎖は、典型的には、可変領域及び軽鎖定常領域（それぞれＶＬ及びＣＬ）を含む。重鎖は、典型的には、重鎖可変領域（ＶＬ）と、それに続くＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３定常領域とを含む。

【0055】

本明細書で使用される場合、カテプシンＤ又はＬなどのプロテアーゼは、ＶＬ及びＣＬ又はＶＨ及びＣＨ（すなわちＣＨ１）などの２つの領域の「間で」抗体を切断し得る。そのような場合では、例えば、ＶＬとＣＬとの間又はＶＨとＣＨとの間の切断の場合、これは、切断が、ＣＤＲ３の直前、ＣＤＲ３内、又はＶＬ若しくはＶＨのＦＲ４内であるが、抗体のＣＬ又はＣＨ（すなわちＣＨ１）セグメント中の２０番目のアミノ酸の前に起こることを意味する。これは、例えば、本明細書の実施例に示されている。例えば、ＣＨ１領域とＣＨ２領域との間に生じる切断は、ＣＨ１領域の大部分を含有する１つの断片及びＣＨ２領域の大部分を含有する別の断片をもたらすように、ヒンジ領域の前、ヒンジ領域内、又はヒンジ領域の後に同様に起こり得る。

【0056】

本明細書で使用される場合、特定のアミノ酸領域又は位置「に先行する（ｐｒｅｃｅｄｉｎｇ）」、「の前（ｐｒｉｏｒ ｔｏ）」、「の前（ｂｅｆｏｒｅ）」又は「の上（ａｂｏｖｅ）」のプロテアーゼ切断部位は、切断がその領域又は位置に対してＮ末端で起こることを意味する。特定の位置又は領域「に続く（ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ）」又は「の後（ａｆｔｅｒ）」又は「の下（ｂｅｌｏｗ）」に生じる切断は、その位置又は領域に対してＣ末端の切断を意味する。同様に、別のアミノ酸領域又は位置「に先行する（ｐｒｅｃｅｄｅｓ）」又は「の前（ｐｒｉｏｒ ｔｏ）」、「の前（ｂｅｆｏｒｅ）」又は「の上（ａｂｏｖｅ）」の領域又はアミノ酸位置は、その他のアミノ酸領域又は位置に対してＮ末端である。別の領域又は位置に続く（ｆｏｌｌｏｗｓ）」又は「の後（ａｆｔｅｒ）」又は「の下（ｂｅｌｏｗ）」の領域又はアミノ酸位置は、その他の領域又は位置に対してＣ末端である。

【0057】

「カテプシンＬ」は、真核細胞で発現されるリソソームプロテアーゼを含み、天然又は組換え生産され得る。カテプシンＬは、ヒト又は他の哺乳動物などの様々な真核生物に由来し得る。カテプシンＬはまた、カテプシンＬ活性を保持するが、例えば、活性、収量、貯蔵寿命又は安定性を改善し得る天然カテプシンＬの遺伝子操作されたバリアントを含み得る。カテプシンＬは、カテプシンＬ１としても知られている。いくつかの実施形態では、カテプシンＬはヒトカテプシンＬ、例えば組換えヒトカテプシンＬである。哺乳動物カテプシンＬは、ＣＴＳＬ１遺伝子から発現される。例示的なヒトカテプシンＬは、配列番号１０の配列を含み、Ｓｉｇｍａ（カタログ番号Ｃ６８５４）から購入することもできる。

【0058】

「カテプシンＤ」は、真核細胞で発現されるリソソームプロテアーゼを含み、天然又は組換え生産され得る。カテプシンＤは、ヒト又は他の哺乳動物などの様々な真核生物に由来し得る。カテプシンＤはまた、カテプシンＤ活性を保持するが、例えば、活性、収量、貯蔵寿命又は安定性を改善し得る天然カテプシンＤの遺伝子操作されたバリアントを含み得る。いくつかの実施形態では、カテプシンＤは、組換えヒトカテプシンＤなどのヒトカテプシンＤである。哺乳動物のカテプシンＤは、ＣＴＳＤ遺伝子から発現される。例示的なヒトカテプシンＬは、配列番号９の配列を含み、Ｓｉｇｍａ（カタログ番号Ｃ８６９６）から購入することもできる。

【0059】

タンパク質又はタンパク質断片の「デノボ」シーケンシングは、完全長抗体分子又は抗原結合断片又は他の抗体断片などのそのタンパク質又は断片の配列を決定することを指し、配列は他の手段によって事前には知られていない。言い換えれば、シーケンスは、いかなる以前に知られているシーケンス情報にも依存せずに「最初から」決定される。

【0060】

「ボトムアップ」タンパク質シーケンシング方法は、タンパク質を消化して、典型的には長さ又はサイズが短い（例えば、約３～５ｋＤａ又は約５～３０アミノ酸長）ペプチドを、例えばトリプシンなどの酵素により形成し、ペプチドを質量分析によって分析し、次いで、重複するペプチドの分析及び既知のタンパク質配列との比較などによって、ソフトウェアを介して組み立てる方法を指す。

【0061】

「トップダウン」シーケンシングは、インタクトなタンパク質又はポリペプチドの質量を測定し、次いで質量分析によってタンパク質全体を一連のプロダクトイオンに断片化することを含み、そこから配列情報を得ることができる。

【0062】

「ミドルダウン」シーケンシングは、タンパク質をより大きなサイズの断片（例えば約５～２５ｋＤａ）に分割することを含み、次いで、それを分離し、トップダウン及び／又はボトムアップアプローチによってさらに分析することができる。このアプローチは、典型的にはプロテアーゼを使用して断片を生成する。

【0063】

本明細書で使用される場合、酵素切断反応後に１つ又は複数のタンパク質断片を「単離すること」は、汚染タンパク質からの干渉なしに断片に対して配列又は構造分析が行われ得るように、少なくとも部分的に所望のタンパク質断片を他の断片から分離すること、及び／又は少なくとも部分的に断片を酵素から分離することを指す。いくつかの場合では、所望の断片は、質量分析中に単離することができるが、他の場合では、クロマトグラフィー、濾過、又は他の方法によって少なくとも部分的に単離され得る。

【0064】

「液体クロマトグラフィー」又は「ＬＣ」は、固定相（例えば、粒状材料のカラム）及び移動相（すなわち、流体）とのそれぞれの相互作用によって試料の成分を分離するプロセスを指す。ＬＣは、１つの分離プロセスが実行されることを意味する一次元（１Ｄ－ＬＣ）で実施されてもよく、又は第１の分離の溶出液又はその一部が異なる移動相を使用するなどの異なる分離手段を使用して第２の分離工程でさらに分離されることを意味する二次元（２Ｄ－ＬＣ）で実施されてもよい。ＬＣは、例えば、ＨＰＬＣ及び逆相ＨＰＬＣ法を包含する。「高速液体クロマトグラフィー」又は「ＨＰＬＣ」は、移動相が加圧下でカラムなどの固定相に流されるＬＣシステムのタイプを指す。ＨＰＬＣシステムは、質量分析計などの検出器に連結されてもよい。ＨＰＬＣプロセスは、「順相」（「ＮＰ」又は「ＮＰ－ＨＰＬＣ」）又は「逆相」（「ＲＰ」又は「ＲＰ－ＨＰＬＣ」又は「ＲＰＬＣ」）で実施することができる。ＲＰＬＣプロセスでは、固定相（例えば、カラム）は非極性であり、移動相は極性であり、例えば水／極性有機溶媒混合物又は勾配である。順相ＨＰＬＣでは、固定相（例えば、カラム）は極性であり、移動相は非極性である。ＬＣ法はまた、ポリペプチドをサイズによって分離するためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、並びに疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、強陽イオン交換（ＳＣＸ）、強陰イオン交換（ＳＡＸ）、ＷＳＸ及び他の電荷－バリアント相互作用相などの電荷又は等電点（ｐＩ）によって分離する相を使用する方法を含む。

【0065】

「質量分析」又は「ＭＳ」は、試料中の１つ又は複数の分子の質量電荷比（ｍ／ｚ）を測定する技術を指す。本明細書で使用される場合、「タンデムＭＳ」又は「ＭＳ／ＭＳ」は、単一イオン、複数イオン、又は質量エンベロープ全体（前駆体）が断片化チャンバに移動され、次いで断片化された生成物が質量分析器に送られるプロセスを指す。質量分析計の設計に応じて、断片化事象は、単一の質量分析器の前、２つ又は複数の異なる分析器の間、又は単一の質量分析器内で起こり得る。

【0066】

ＭＳ分析には様々な選択肢があり得る。いくつかの実施形態では、ＭＳ機器は四重極分析器を備えない。いくつかの実施形態では、ＭＳ機器は少なくとも１つの四重極を備える。いくつかの実施形態では、ＭＳ機器は少なくとも２つの四重極分析器を備える。いくつかの実施形態では、ＭＳ機器は少なくとも３つの四重極分析器を備える。いくつかのＭＳでは、検出器はイオントラップ、四重極、ｏｒｂｉｔｒａｐ、又はＴＯＦである。いくつかの実施形態では、ＭＳ機器又は方法は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、単一イオンモニタリング（ＳＩＭ）、三段四重極（ＴＳＱ）、四重極／飛行時間（ＱＴＯＦ）、四重極線形イオントラップ（ＱＴＲＡＰ）、ハイブリッドイオントラップ／ＦＴＭＳ、飛行時間／飛行時間（ＴＯＦ／ＴＯＦ）、Ｏｒｂｉｔｒａｐ機器、イオントラップ機器、並列反応モニタリング（ＰＲＭ）、データ依存型取得（ＤＤＡ）、データ非依存型取得（ＤＩＡ）、多段断片化又は時間タンデムＭＳ／ＭＳである。
抗体切断

【0067】

本明細書のいくつかの実施形態では、抗体は、カテプシンＬ、カテプシンＤ、又はカテプシンＬ若しくはカテプシンＤの組み合わせにより切断される。いくつかの実施形態では、抗体はカテプシンＬのみで消化され、他の酵素では消化されない。いくつかの実施形態では、抗体はカテプシンＤのみで消化され、他の酵素では消化されない。いくつかの実施形態では、抗体は、カテプシンＬ及びカテプシンＤの両方で消化されるが、他の酵素では消化されない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの他のプロテアーゼ、例えばＩｄｅＳもまた、抗体を消化するために使用される。カテプシンＬ及びカテプシンＤ酵素の両方を使用する場合、酵素を抗体と同時に（すなわち、ワンポット反応において）、又は順次交互に、インキュベートしてよい。

【0068】

いくつかの実施形態では、抗体はＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＧ４抗体などのヒトＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、完全長ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、完全長ヒトＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体又はＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、完全長軽鎖及び／又は完全長重鎖を有する。他の実施形態では、抗体は、完全長軽鎖を有さず、及び／又は完全長重鎖を有さない。いくつかのそのような場合では、抗体は、ＶＬ領域と少なくとも一部のＣＬ領域とを含む軽鎖を含む。いくつかのそのような場合、抗体は、ＶＨ領域及び少なくとも一部のＣＨ１領域、例えばＣＨ１、ヒンジ及び少なくとも一部のＣＨ２セグメント、又はＣＨ１及びヒンジのみ、又はＣＨ１のみ、又はＣＨ１のＮ末端部分のみを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、例えばＦ（ａｂ’）２断片又はＦａｂ断片などの抗原結合断片である。

【0069】

いくつかの実施形態では、切断反応は、天然の状態にある抗体に対して行われ、すなわち、天然の抗体折り畳みパターンが維持され、任意のジスルフィド結合がインタクトであり、還元されない。したがって、いくつかの実施形態では、抗体は還元又は変性に供されていない。しかし、いくつかの実施形態では、抗体の状態を最適な切断のためにある程度緩和するために、最大５０％の有機溶媒を添加してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、５～３０％、１０～３０％、０～１０％、５～１５％、１０～２０％、１５～２５％、又は２０～３０％などの０～３０％の有機溶媒を添加してもよい。有機溶媒は、例えば、アセトニトリル、メタノール、エタノール又はイソプロピルアルコールを含んでもよい。

【0070】

ヒトＩｇＧ１抗体及びＩｇＧ２Ｂ抗体上の抗体の切断部位を図８に概略的に示す。本明細書の方法では、カテプシンＬ及びカテプシンＤの両方が、ＶＨ領域とＣＨ領域との間並びにＶＬ領域とＣＬ領域との間を含む１つ又は複数の位置で抗体を切断して、それにより、少なくともＶＨ領域の大部分及びＶＬ領域の大部分をそれぞれ含むＶＨ抗体断片及びＶＬ抗体断片を抗体から切り落とすことができる。この切断はまた、切断部位に対してＣ末端のＣＬ領域及びＣＨ領域を含むＣＬ断片及びＣＨ断片を残す。例えば、抗体がヒトＩｇＧ１であるいくつかの実施形態では、カテプシンＬ及びカテプシンＤの両方がまた、抗体のヒンジ領域の上で切断して、２つのＦ（ａｂ’）断片（それぞれＶＬ＋ＣＬ及びＶＨ＋ＣＨ１を含む）並びにヒンジ領域とＣＨ２領域及びＣＨ３領域由来の追加の定常領域配列セグメントとを含む重鎖由来のさらなる断片を生じる。切断がこれらの位置の両方で、可変領域と定常領域との間及びヒンジの上で起こる場合、一組の断片は、ＶＬ断片、ＣＬ断片、ＶＨ断片、ＣＨ１断片、並びに残りの重鎖ヒンジ及び定常領域配列を含み、切断が不完全である場合はＦａｂ断片も含む。ここでも、切断の正確な位置に応じて、ＣＨ１断片は、ＶＨ領域のＣ末端からのアミノ酸配列を含み得、ＥＵナンバリングによって定義されるＣＨ１のＣ末端までずっと延在し得ない。したがって、断片は、ＣＨ１領域の大部分を含んでよい。抗体がヒトＩｇＧ２Ｂ抗体又はＩｇＧ４抗体である他の実施形態では、例えば、カテプシンＬ又はカテプシンＤは、抗体中の異なるジスルフィド結合構造のためにヒンジの上で切断しない可能性がある。（図８を参照されたい。）カテプシンＬ及びＤの両方は、図８に示されるように、ＩｇＧ１抗体をＦｃ部分のＣＨ２領域とＣＨ３領域との間でさらに切断し、切断位置の両側にＣＨ２断片及びＣＨ３断片を残し得る。本明細書の方法では、カテプシンＤはまた、ヒンジ領域のすぐ下で切断し、その結果、Ｆ’（ａｂ）２断片を生成し、切断部位の下にＦｃ領域配列の全部又は大部分を有するＦｃ断片を生成し得る。（図８を参照されたい。）両方の酵素がヒトＩｇＧ１抗体を切断するために使用される場合、例えば、ＶＬ断片、ＶＨ断片、ＣＬ断片、ＣＨ１断片、ＣＨ２断片、ＣＨ３断片、ＣＬ＋ＣＨ１（ジスルフィド結合）断片及びＦ（ａｂ’）２断片に対応する一連の断片が生じ得る。いくつかの実施形態では、カテプシンＤ及びカテプシンＬを組み合わせて、ヒトＩｇＧ１抗体由来のＶＬ断片、ＶＨ断片、ＣＬ断片、ＣＨ１断片、ＣＨ２断片、ＣＨ３断片、ＣＬ＋ＣＨ１（結合）断片及びＦ（ａｂ’）断片を生成する。いくつかの実施形態では、カテプシンＬ若しくはカテプシンＤ又はカテプシンＤ及びカテプシンＬの両方による切断は、約８～１６ｋＤａ、例えば約１０～１６ｋＤａ、１０～１３ｋＤａ、１０～１２ｋＤａ、１０～１１ｋＤａ又は１１～１２ｋＤａのＶＨ断片及びＶＬ断片を残す。いくつかの場合では、ＶＨ及びＶＬ断片は、９０～１２０アミノ酸程度の長さ、例えば約９５～１１０アミノ酸の長さを有する。いくつかの場合では、同時切断又は切断ミスは、ＶＬ断片、ＶＨ断片、ＣＬ断片、ＣＨ１断片、ＣＨ２断片、ＣＨ３断片、ＣＬ＋ＣＨ１断片及びＦ（ａｂ’）２断片の様々な組み合わせを含む断片をもたらす。

【0071】

本明細書の実施例は、カテプシンＬ及び／又はカテプシンＤによる既知の抗体の切断を示すデータを提供する。表５ａに示すように、オビヌツズマブは、ＶＨ ＣＤＲ３において、重鎖の可変部分の末端でカテプシンＬによって切断された。そして、酵素は、重鎖ヒンジ領域において、いくつかの位置で切断した。これにより、例えば１０～１６ｋＤａの質量を有するアミノ酸１～９９及び１～１３５、１～１３６、１～１３７、１～１３８及び１～１３９のＶＨ断片、並びに、より長い軽鎖断片及び重鎖断片、例えば、アミノ酸１～２０６及び１～２１８のＬＣ断片とアミノ酸１～２２０のＨＣ断片並びにＬＣ＋ＨＣ断片（２０～２５ｋＤａ及び４５～５０ｋＤａの質量をそれぞれ有する）が得られた。（表５ａを参照されたい。）以下の表５ｂに示すように、カテプシンＤへの曝露は、重鎖ヒンジ領域においてオビヌツズマブを切断する。例えば、この切断は、約２２０～２４５アミノ酸の長さのＬＣ＋ＨＣ断片及びＦ（ａｂ’）２断片をもたらす。表７、８及び１０は、オビヌツズマブと同様にヒトＩｇＧ１抗体であるトラスツズマブの切断位置を示す。カテプシンＬで切断されたトラスツズマブは、アミノ酸１～１４０及び１～１０２の重鎖断片（すなわち、ＶＨ断片）並びにアミノ酸１～２１３及び１～２１４及び９～１９６の軽鎖断片、並びにアミノ酸１００～２２３の重鎖断片（ＣＨ１領域を含む）及びＣＬ領域のアミノ酸残基１１７～２１４の軽鎖断片を生成した。（表８。）カテプシンＤによる切断は、同様のセットの断片、残基１～２１４、１～２１３の軽鎖断片、並びに１～１４０及び１～１０２の重鎖断片、並びに残基２～２２２及び１１～１１０を含む重鎖断片をもたらした。（表９。）両方の酵素による切断は、残基１～１０７、１～１１１及び１～１１６を含むいくつかのＶＬ断片、残基１～２０２のより長いＬＣ断片、並びに１～１１５位を含むＶＨ断片、並びにアミノ酸２４１～３４９及び２４３～３４１のＨＣ定常領域断片をもたらした。ＬＣ領域と重鎖ＣＨ１領域とを合わせた断片、並びにＦ（ａｂ’）断片及びＦ（ａｂ’）２断片も生成された。（表１０。）カテプシンＬに曝露されたヒトＩｇＧ２Ｂ抗体であるエクリズマブは、オビヌツズマブと同様に、重鎖ＣＤＲ３で終わる、重鎖配列のアミノ酸１～１０２から１～１０６のＶＨ断片をもたらす。表６は、カテプシンＤが、ＶＨ ＣＤＲ３においてもエクリズマブを切断し、ＦｃからＦ（ａｂ’）２をヒンジ領域の下で切断することを示す。

【0072】

したがって、いくつかの実施形態では、カセプシンＬ又は／及びＤは、ヒトＩｇＧ１抗体に作用すると、ＶＨとＣＨとの間及び／又はＶＬとＣＬとの間、特にＨＣ及びＬＣ ＣＤＲ３の内部又は直後で切断し、ＣＤＲ３の内部又は直後で終わるＶＨ断片及びＶＬ断片を生成する。いくつかの実施形態では、カテプシンＬ又は／及びＤはまた、第１及び第２の鎖間ジスルフィド結合の間で抗体を切断してＦ（ａｂ’）を生じる。いくつかの実施形態では、カテプシンＤは、重鎖ヒンジ領域内又はそのすぐ下で切断してＦ（ａｂ’）２断片を与え、これはその後、例えばＶＨ部分とＣＨ１部分との間及び／又はＶＬ部分とＣＬ部分との間でさらに切断され得る。さらに、いくつかの実施形態では、両方のプロテアーゼはＣＨ２とＣＨ３との間でも切断して、ＣＨ２断片及びＣＨ３断片をＣＨ２ドメインに沿って生成する。したがって、いくつかの実施形態では、一方又は両方の酵素による切断は、それぞれのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＨ含有断片及び／又はＶＬ含有断片をもたらす。

【0073】

いくつかの実施形態では、切断条件は、１つ又は複数の位置におけるより大きい切断効率のために最適化される。切断効率（消化効率とも呼ばれる）は、タンパク質又は抗体の消化に言及する場合、一般に、切断される出発抗体のパーセントを指す。抗体のＶＨ及びＶＬの後などの特定の位置又は部位での切断効率も評価することができる。いくつかの実施形態では、予想される各切断部位における比較的低い切断効率（例えば、少なくとも１％～５０％など）が、ある範囲の断片サイズをもたらすために許容され得る。また、分析すべき抗体が比較的多い場合には、全体的な切断効率が低いことも許容され得る。他の場合では、ＶＨ抗体断片及びＶＬ抗体断片の生成を最大化するために、特にＶＨとＣＨとの間の部位及び例えばＶＬとＣＬとの間の部位について、より高い切断効率が望ましい。いくつかの実施形態では、全体的な切断効率は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、又は１００％である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬの後の切断に関する切断効率は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、又は１００％である。切断効率は、反応の時間、温度、ｐＨ、及び有機溶媒の存在、並びに抗体の三次構造などの因子によって影響され得る。

【0074】

本開示は、ＶＬ断片、ＶＨ断片、ＣＬ断片、ＣＨ１断片、ＣＨ２断片、ＣＨ３断片、ＣＨ２－ＣＨ３断片、ＣＬ＋ＣＨ１（結合）断片、Ｆ（ａｂ’）断片及びＦ（ａｂ’）２断片を含む１つ又は複数の断片を生成するカテプシンＤ及び／又はＬによる切断反応、並びにそれらの断片を含む得られた組成物を包含する。したがって、例えば、本明細書の酵素的切断反応は、９０～１５０アミノ酸の長さ、例えば９５～１４０アミノ酸、１００～１４０アミノ酸又は１００～１２０アミノ酸の長さを含むＶＬ断片及び／又はＶＨ断片を生成し得る。そのようなＶＨ断片及び／又はＶＬ断片は、例えば１０～１６ｋＤａ、例えば１０～１３ｋＤａ、１０～１２ｋＤａ、１０～１１ｋＤａ又は１１～１２ｋＤａの分子量を有し得る。天然抗体の様々な位置での切断効率に応じて、２００～２５０アミノ酸サイズのより大きな断片（例えば、結合した軽鎖及び重鎖断片）も生成され得る。いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）断片及び／又はＦ（ａｂ’）２断片も生成され得る。いくつかの場合では、これらの断片のすべての混合物が生じ得る。したがって、いくつかの切断反応は、以下の１０種類の断片のうちの少なくとも２つを含む組成物をもたらし得る：ＶＬ断片、ＶＨ断片、ＣＬ断片、ＣＨ１断片、ＣＨ２断片、ＣＨ３断片、ＣＨ２－ＣＨ３断片、ＣＬ＋ＣＨ１（結合）断片、Ｆ（ａｂ’）断片及びＦ（ａｂ’）２断片。いくつかの切断反応は、以下の１０種類の断片のうちの少なくとも３つを含む組成物をもたらし得る：ＶＬ断片、ＶＨ断片、ＣＬ断片、ＣＨ１断片、ＣＨ２断片、ＣＨ３断片、ＣＨ２－ＣＨ３断片、ＣＬ＋ＣＨ１（結合）断片、Ｆ（ａｂ’）断片及びＦ（ａｂ’）２断片。いくつかの切断反応は、以下の４種類の断片のうちの少なくとも２つを含む組成物をもたらし得る：ＶＬ断片、ＶＨ断片、ＣＬ断片、ＣＨ１断片、ＣＨ２断片、ＣＨ３断片、ＣＨ２－ＣＨ３断片、ＣＬ＋ＣＨ１（結合）断片、Ｆ（ａｂ’）断片及びＦ（ａｂ’）２断片。いくつかの切断反応は、例えば９０～１５０アミノ酸のＶＬ断片及び／又はＶＨ断片並びに以下のさらなる断片の少なくとも２つを含む組成物をもたらし得る：ＣＬ断片、ＣＨ１断片、ＣＨ２断片、ＣＨ３断片、ＣＨ２－ＣＨ３断片、ＣＬ＋ＣＨ１（結合）断片、Ｆ（ａｂ’）断片及びＦ（ａｂ’）２断片。

【0075】

例えば、いくつかの実施形態では、反応は、ｐＨ２～８、ｐＨ２～７、ｐＨ２～６、ｐＨ２～５、ｐＨ３～６、ｐＨ３～５、ｐＨ３～４、ｐＨ４～５、ｐＨ２、ｐＨ２．５、ｐＨ３、ｐＨ３．５、ｐＨ４、ｐＨ４．５、ｐＨ５、ｐＨ５．５、ｐＨ６、ｐＨ７又はｐＨ８で行われる。いくつかの実施形態では、反応緩はｐＨ３～５、例えばｐＨ３、ｐＨ３．５、ｐＨ４、ｐＨ４．５又はｐＨ５で行なわれる。いくつかの実施形態では、反応はｐＨ４で行なわれる。ｐＨの選択はまた、カテプシンＬ、カテプシンＤ、又はカテプシンＤとカテプシンＬの両方が使用されるかどうかに依存し得る。

【0076】

いくつかの実施形態では、反応は、室温（約１８～２５°Ｃ）～５０°Ｃで行われる。いくつかの実施形態では、反応は、３０～５０℃、３０～４５℃、３０～３７℃、３７～４５℃、４０～５０℃又は３７～５０℃の温度で行われる。例えば、より高い温度は、反応時間の短縮を可能にし得る。いくつかの実施形態では、反応は、４～３０時間、例えば４～１２時間、１２～２４時間又は１２～１８時間行なわれる。いくつかの実施形態では、反応緩はｐＨ３～５、例えばｐＨ３、ｐＨ３．５、ｐＨ４、ｐＨ４．５又はｐＨ５及び３７～５０℃で行なわれる。いくつかの実施形態では、反応は、ｐＨ４、３７℃で、１２～２４時間行われる。

【0077】

いくつかの実施形態では、カテプシンＤは、例えば配列番号９のアミノ酸配列を含むヒトカテプシンＤである。いくつかの実施形態では、カテプシンＬは、例えば配列番号１０のアミノ酸配列を含むヒトカテプシンＬである。いくつかの実施形態では、切断反応は、１：２０～１：２０００の比のカテプシンＤ及び／又はカテプシンＬ酵素対タンパク質で行われる。いくつかの実施形態では、１：２０～１：５００、１：５０～１：５００、１：１００～１：５００、１：２００～１：１０００、１：２００～１：２０００、１：５００～１：２０００、１：１０００～１：２０００、又は１：２０、１：５０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、若しくは１：１０００の比が使用される。比を変化させることは、いくつかの実施形態において、切断の程度を変化させ得、ある特定の場合において、異なる切断部位の効率に影響を及ぼし得る。例えば、理論に束縛されるものではないが、酵素の量を減少させると、より低い全体的な切断効率をもたらすだけでなく、特定のよりアクセスしやすい切断部位を他のものに対して優先させることによって、得られる切断産物にも影響を及ぼし得る。したがって、いくつかの実施形態では、酵素対タンパク質の比を変化させることは、得られる切断産物の分布に影響を及ぼし得る。

【0078】

本明細書のデータは、予想外にも、カテプシンＬ及びカテプシンＤの切断が抗体の三次構造に依存することを示した。例えば、特定の部位における切断効率は、それらの部位の近くの分子の折り畳みに応じて、又はジスルフィド結合パターンに起因して変化し得る。三次構造は、変性抗体において切断されるであろう位置での切断を遮断し得る。例えば、図８に示すように、カテプシンＤ切断は、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ領域の下で起こるが、その切断は、ジスルフィド結合パターンの違いにより、ヒトＩｇＧ２Ｂ抗体又はＩｇＧ４抗体では起こらない。

【0079】

したがって、いくつかの実施形態では、抗体は天然の状態において切断される。「天然の状態」にある抗体は、その一般的な天然の折り畳まれた構造及びジスルフィド結合を保持する抗体であり、すなわち、抗体は変性されていないか又はアンフォールディングされておらず、ジスルフィド結合は還元されていない。対照的に、ボトムアップ切断は、典型的には、タンパク質から小さなペプチドが容易に生成され得るように、分析されるタンパク質を変性状態で消化することによって行われる。いくつかの実施形態では、上記のように、例えば、最適な切断のために抗体の状態をある程度緩和するが、抗体が天然の状態のままであるように抗体を変性又はアンフォールディングすることを回避するために、有機溶媒を５０％まで添加することができる。例えば、いくつかの実施形態では、５～３０％、１０～３０％、０～１０％、５～１５％、１０～２０％、１５～２５％、又は２０～３０％などの０～３０％の有機溶媒を添加してもよい。有機溶媒は、例えば、アセトニトリル、メタノール、エタノール又はイソプロピルアルコールを含んでもよい。いくつかの実施形態では、反応緩衝液は、５０％以下の有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、反応緩衝液は、３０％以下の有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、反応緩衝液は、１０％以下の有機溶媒を含む。ここでもまた、先にも述べたように、いくつかの実施形態において、抗体は、その天然のジスルフィド結合パターンとの干渉を回避するために還元されていない。

【0080】

カテプシンＤ及びカテプシンＬの両方が使用されるいくつかの実施形態では、酵素は抗体に次々に曝露されるが、他の実施形態では、同じ反応条件下で同時に抗体とインキュベートされる。いくつかの実施形態では、両方の酵素を、ｐＨ３～５、例えばｐＨ３、ｐＨ３．５、ｐＨ４、ｐＨ４．５又はｐＨ５の緩衝液中、及び３０～５０°Ｃ、例えば３７°Ｃの温度で抗体に同時に添加する。いくつかのそのような場合では、１０～３０％の有機溶媒も反応混合物に添加される。予想外にも、抗体のＶＬとＣＬとの間及びＶＨとＣＨとの間の最大１００％の切断効率（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％、又は１００％）が、カテプシンＤ及びカテプシンＬの両方をｐＨ３～５、例えばｐＨ３、ｐＨ３．５、ｐＨ４、ｐＨ４．５又はｐＨ５の緩衝液中及び３０～５０°Ｃの温度で同時に使用した場合に観察された。

【0081】

本明細書におけるいくつかの方法では、例えば、カテプシンＬ／Ｄ切断は三次構造依存性であるように見えるので、抗体は切断中に天然の状態のままであり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、切断中並びに切断後及びＭＳ分析中に天然の状態のままである。本明細書のいくつかの方法では、抗体は、切断中又は切断後に、変性剤又はジスルフィド結合を還元する薬剤で処理されない。本明細書のいくつかの方法では、抗体は、切断中又は切断後に、そのジスルフィド結合を保持する。本明細書のいくつかの方法は、切断後に１つ又は複数の抗体断片の質量分析（ＭＳ）を実施することを含み、抗体は天然の状態のままであり、ＭＳ分析の前に変性剤又はジスルフィド結合を還元する薬剤で処理されない。したがって、いくつかの実施形態では、カテプシンＬ及び／又はカテプシンＤによる反応で生成し得る抗体断片、例えばＶＬ、ＶＨ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、又は重鎖若しくは軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む他の断片の好ましい選択に加えて、得られた抗体断片中のジスルフィド結合を変性又は還元することなく、切断直後にＭＳ分析を実施し得る。

【0082】

抗体の切断後、抗体を処理して酵素（単数又は複数）を除去し、緩衝液を交換し、及び／又は特定の断片を単離することができる。
切断後の任意の処理

【0083】

切断中に生成された抗体断片は、質量分析の前に様々な方法でさらに処理することができる。

【0084】

いくつかの実施形態では、抗体断片を処理してジスルフィド結合を還元することができる。ジスルフィド結合が還元されると、例えば、ジスルフィド結合によって連結された２つのポリペプチドセグメントを含む特定の断片は、２つの別個の種に解離し得る。いくつかの場合では、切断された抗体の一部は、Ｓ－Ｓ結合を還元することなく質量分析によって評価され得るが、別の部分は、評価される前に還元され得、例えば、さらなるデータを得るために、還元された断片及び還元されていない断片の両方のトップダウン分析を可能にする。いくつかの実施形態では、得られた断片は、アルキル化されてもよく、そうでなければ化学的に修飾されてもよい。

【0085】

いくつかの実施形態では、切断後、得られた断片は、様々な方法で酵素反応混合物から単離され得る。例えば、断片は、クロマトグラフィー又はサイズ濾過によって単離することができる。例えば、断片は、キャピラリー電気泳動又は液体クロマトグラフィーを介して分離され得る。又は、断片は、より高分子量の種を保持するが、特定の切断断片などのより小さな種が流れることを可能にする分子量カットオフフィルタを使用するなど、濾過によって他の成分から分離することができる。いくつかの実施形態では、例えば、所望の断片が、例えば２５ｋＤａ未満、例えば約１０～１４ｋＤａである場合、例えば２０ｋＤａ又は３０ｋＤａの分子量カットオフフィルタを使用して、所望の断片をより大きな断片から分離することができ、この工程には、任意に、目的の断片を保持するＭＷフィルタ上でのフロースルーの濃縮工程が続く。所望であれば、比較的低分子量のカットオフフィルタを使用して、所望の断片をより小さい断片又は緩衝夾雑物から分離することもでき、例えば、３ｋＤａ超又は１０ｋＤａ超の分子を保持するフィルタである。

【0086】

切断された抗体断片はまた、例えばｐＨ及び他の緩衝液条件を変更するために緩衝液を交換することによって酵素反応混合物から単離され得る。これは、例えば、クロマトグラフィー又は濾過プロセス中に起こり得る。いくつかの実施形態では、断片は、それらの配列を得るための、又はそれらの配列を検証するための代替手段として、任意に、さらなる酵素的切断又はＭＳ切断と組み合わせて、エドマン分解によって分析され得る。

【0087】

本明細書の実施形態では、上記の処理の任意の組み合わせを使用することができる。
質量分析

【0088】

抗体断片に関する配列又は構造情報を得るために、少なくとも１つの断片に対して質量分析を行うことができる。いくつかの実施形態では、ＭＳ分析は、カテプシンＬ若しくはＤ又はカテプシンＬとＤの両方による切断から得られたＶＨ断片及び／又はＶＬ断片に対して行われる。いくつかの実施形態では、トップダウン分析方法は、生成された断片の少なくとも１つに対して実行される。いくつかの実施形態では、ボトムアップアプローチが実行される。いくつかの実施形態では、トップダウン及びボトムアップアプローチの組み合わせが使用される。

【0089】

いくつかの実施形態では、断片の少なくとも１つの完全な配列が得られる。他の実施形態では、少なくとも１０アミノ酸ストレッチの配列が得られる。いくつかの実施形態では、少なくとも１５アミノ酸ストレッチの配列が得られる。いくつかの実施形態では、少なくとも２５アミノ酸ストレッチの配列が得られる。いくつかの場合では、少なくとも５０アミノ酸ストレッチの配列が得られる。いくつかの場合では、１０～５０、１５～５０、２５～５０又は１０～２５アミノ酸ストレッチのストレッチの配列が得られる。いくつかの場合では、ＣＤＲ３配列は、ＶＨ断片又はＶＬ断片について得られる。いくつかの場合では、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及び／又はＣＤＲ３配列は、ＶＨ断片又はＶＬ断片について得られる。いくつかの実施形態では、抗体断片の配列は、本方法の前に未知であったものであり、したがって、本方法は、その断片の配列又は部分配列をデノボで得る。

【0090】

ＭＳは、試料中の１つ又は複数の分子の質量電荷比（ｍ／ｚ）を測定する。タンデムＭＳは、いくつかの実施形態で使用されてもよく、単一イオン、複数イオン、又は質量エンベロープ全体（前駆体）が断片化チャンバに移動され、次いで断片化された生成物が質量分析器に送られるプロセスである。質量分析計の設計に応じて、断片化事象は、単一の質量分析器の前、２つ又は複数の異なる分析器の間、又は単一の質量分析器内で起こり得る。

【0091】

ＭＳ分析には様々な選択肢があり得る。いくつかの実施形態では、ＭＳ機器は四重極分析器を備えない。いくつかの実施形態では、ＭＳ機器は少なくとも１つの四重極を備える。いくつかの実施形態では、ＭＳ機器は少なくとも２つの四重極分析器を備える。いくつかの実施形態では、ＭＳ機器は少なくとも３つの四重極分析器を備える。いくつかのＭＳでは、検出器はイオントラップ、四重極、Ｏｒｂｉｔｒａｐ（商標）、又は飛行時間（ＴＯＦ）である。いくつかの実施形態では、ＭＳ機器又は方法は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、単一イオンモニタリング（ＳＩＭ）、三段四重極（ＴＳＱ）、四重極／飛行時間（ＱＴＯＦ）、四重極線形イオントラップ（ＱＴＲＡＰ）、ハイブリッドイオントラップ／ＦＴＭＳ、飛行時間／飛行時間（ＴＯＦ／ＴＯＦ）、Ｏｒｂｉｔｒａｐ機器、イオントラップ機器、並列反応モニタリング（ＰＲＭ）、データ依存型取得（ＤＤＡ）、データ非依存型取得（ＤＩＡ）、多段断片化又は時間タンデムＭＳ／ＭＳである。いくつかの実施形態では、質量分析計は、少なくとも１つの四重極を含み、衝突誘起解離（ＣＩＤ）、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）、電子捕獲解離（ＥＣＤ）、電子移動解離（ＥＴＤ）、電子移動／高エネルギー衝突解離（ＥＴｈｃＤ）、又は光解離、例えばＵＶ光解離（ＵＶＰＤ）から選択される解離手段を使用する。

【0092】

いくつかの実施形態では、直接注入又は静的スプレー注入又はフローインジェクション分析質量分析を使用して、１つ又は複数の抗体断片を分析する。いくつかの場合では、注入は、酵素的切断反応の直後に、又は切断反応後の緩衝液交換工程の後に行われる。いくつかの場合では、例えば、注入は、クロマトグラフィー、引き続いてＬＣ－ＭＳなどの質量分析などの技術を介して所望の断片を単離する代替法である。注入法では、抗体の断片（単数又は複数）を含む試料を、エレクトロスプレー又はナノスプレーイオン化による断片化のために質量分析計の装置に直接投入することができる。次いで、前駆体イオンは、任意に、質量測定及び分析のために四重極質量フィルタによって分離され、アミノ酸配列予測のために断片化され得る。
トップダウン及び／又はボトムアップ分析

【0093】

本明細書のいくつかの実施形態では、質量分析はトップダウンシーケンス分析に使用される。例えば、質量分析計を使用して、切断された抗体断片を一連のプロダクトイオンにさらに断片化することができ、それに関して配列予測が行われ得る。一例を、例えば以下の表１３に示す。関連するソフトウェアを使用して、予測シーケンスをアライメントすることができる。一例を例えば図１４Ａ及び図１４Ｂに示す。例えば、ＶＨ断片又はＶＬ断片の場合、それらの断片は典型的には、分析される抗体の天然のＮ末端アミノ酸で始まるので、質量分析配列情報は、断片のＮ末端から開始してデコンボリューション及びアラインメントされ得る。したがって、Ｎ末端は、質量分析中に生成されたプロダクトイオンのアライメントのための基準点として機能し得る。例えば、ＶＨ断片又はＶＬ断片を分析する場合、それらの断片は抗体ポリペプチド鎖のＮ末端にあるので、ＭＳ分析で生成されたそれらのプロダクトイオンをＮ末端からアライメントすることができる。この理由及び他の理由から、酵素が単一のアミノ酸で特異的に切断して断片のＣ末端を形成する必要はない。

【0094】

様々なソフトウェアパッケージを使用して、トップダウンＭＳ分析からの配列情報をデコンボリューション及びアラインメントすることができる。例としては、ＰＥＡＫｓ（商標）（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）及びＢｙｏｓ（商標）及びその構成要素ソフトウェア（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）が挙げられる。

【0095】

いくつかの実施形態では、本明細書中の方法は、さらなる配列分析のためのさらなるミドルダウン法及びボトムアップ法と組み合わされ得る。例えば、カテプシンＬ及び／又はカテプシンＤによる切断は、抗体のヒンジ領域内又はその付近で切断する他の酵素、例えばプロテアーゼＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＩｄｅＳ）（例えば、ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（商標）（Ｇｅｎｏｖｉｓ，Ｉｎｃ．））又はＧｉｎｇｉｓＫｈａｎ（商標）（Ｇｅｎｏｖｉｓ）による切断と組み合わされ得る。いくつかの実施形態では、カテプシンＬ、カテプシンＤ、又はカテプシンＬとカテプシンＤの組み合わせは、ＩｄｅＳ又はＧｉｎｇｉｓＫｈａｎ（商標）（Ｇｅｎｏｖｉｓ）と組み合わせられ得る。いくつかの実施形態では、トリプシン、パパイン、キモトリプシンなどの他のプロテアーゼを、カテプシンＬ、カテプシンＤ、又はカテプシンＬとカテプシンＤの両方と組み合わせてもよい。次いで、そのような切断反応からの生成物を、例えばトップダウン又はボトムアッププロセスによって分析することができる。

【0096】

いくつかの実施形態では、カテプシンＬ及び／又はカテプシンＤ切断反応から生成された断片は、ボトムアップ法によってさらに分析され得る。したがって、いくつかの実施形態では、例えば、得られた断片を還元又は変性させ、次いで、トリプシン又はパパインなどのプロテアーゼでさらに切断して、ＭＳ分析のためのより小さな断片を生成することができる。いくつかの実施形態では、例えば、配列情報を検証及び照合する手段として、トップダウン分析をボトムアップ分析と組み合わせることができる。
デノボ抗体シーケンシングワークフロー

【0097】

いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、１つ又は複数の抗体断片の部分的又は完全なデノボ配列分析に使用することができる。一般に、デノボで配列ストレッチを決定するには、質量分析中にその配列ストレッチの完全な断片化、すなわち配列ストレッチ中の各後続アミノ酸の後の断片化が必要であり、その結果、断片化により、各連続アミノ酸残基の質量を決定することができ、したがってアミノ酸残基を同定することができる。選択された断片化方法に応じて、特定のアミノ酸ストレッチの完全な断片化を確実にするために、ジスルフィド結合の還元が質量分析の前に行われ得る。例えば、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）を用いたＯｒｂｉｔｒａｐ（商標）が断片化に使用される場合、各連続残基の後に断片化を得るために還元が必要とされ得る。他の場合では、ジスルフィド結合を事前に還元せずに、デノボ配列決定を行うことができる。他の実施形態では、抗体断片を含有する試料の一部を還元することなく分析することができ、試料の別の部分を還元後に分析することができる。

【0098】

例えば、図１４Ａは、ＭＳ断片化後のトラスツズマブ軽鎖可変領域の描写を示す。その図に示すように、連続したｙイオンのスパンが残基Ｈ９１～Ｅ１０５に生じる。したがって、ＣＤＲ３領域にほぼ対応するＶＬのこの部分の配列は、トップダウン分析によって決定することができる。そのようなトップダウン分析は、ＰＥＡＫＳ（商標）（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）又はＳｕｐｅｒｎｏｖｏ（商標）（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ）又はオープンソースのプログラムなどの、質量データ及び断片のアラインメントからアミノ酸配列を決定するための市販のソフトウェアを使用することができる。ＶＬ断片などの抗体断片のさらなる部分の配列を決定するために、断片分子内のすべて又はほぼすべてのアミノ酸残基の後に断片化が起こるように、さらなる断片化頻度を使用することができる。さらに、ジスルフィド結合が断片化を妨害しないように、抗体切断産物を処理してジスルフィド結合を還元してもよい。抗体断片のより大きなセグメントをシーケンシングするために、市販のソフトウェアパラメータを調整して、例えば最大約１２ｋＤａの断片の配列のデノボ決定を可能にすることができる。例えば、プログラム内で許容される総ペプチド長を延長することができ、ＭＳ１レベルで許容される誤差許容範囲を増加させることができ、例えばｐスコア又はＡスコアを修正して、ジスルフィド規則の組み込みを可能にすることができる。さらに、いくつかの実施形態では、候補デノボ配列は、１つよりも多くのソフトウェアプログラムを使用して配列を決定することによって検証され得る。
キット及び製品

【0099】

本開示はまた、抗体に対して最適化されたカテプシンＬ、カテプシンＤ又はカテプシンＬ及びカテプシンＤ切断反応を行うためのキット及び製品を包含する。いくつかの実施形態では、キットは、カテプシンＬを含む。いくつかの実施形態では、キットは、カテプシンＤを含む。いくつかの実施形態では、キットは、カテプシンＬ及びカテプシンＤの両方を含む。いくつかの実施形態では、キットは、カテプシンＬ及び／又はカテプシンＤに加えて、ＩｄｅＳ、パパイン、トリプシン、キモトリプシン、又はＧｉｎｇｉｓＫｈａｎ（商標）などの１つ又は複数の追加の酵素を含む。いくつかの実施形態では、キットは、カテプシンＬ及び／又はカテプシンＤ切断反応のための１つ又は複数の反応緩衝液を含む。例えば、いくつかの実施形態では、反応は、ｐＨ２～８、ｐＨ２～７、ｐＨ２～６、ｐＨ２～５、ｐＨ３～６、ｐＨ３～５、ｐＨ３～４、ｐＨ４～５、ｐＨ２、ｐＨ２．５、ｐＨ３、ｐＨ３．５、ｐＨ４、ｐＨ４．５、ｐＨ５、ｐＨ５．５、ｐＨ６、ｐＨ７又はｐＨ８で行われる。いくつかの実施形態では、反応緩衝液はｐＨ３～５、例えばｐＨ３、ｐＨ３．５、ｐＨ４、ｐＨ４．５又はｐＨ５である。いくつかの実施形態では、反応緩衝液はｐＨ４である。いくつかの実施形態では、反応緩衝液は、１つ又は複数の有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、有機溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール又はアセトニトリルである。いくつかの実施形態では、反応緩衝液は、５～５０％の有機溶媒、例えば５～３０％、１０～３０％、０～１０％、５～１５％、１０～２０％、１５～２５％又は２０～３０％を含む。いくつかの実施形態では、反応緩衝液は、５０％以下の有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、反応緩衝液は、３０％以下の有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、反応緩衝液は、１０％以下の有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、製品又はキットはまた、抗体組成物に対してカテプシンＤ及び／又はカテプシンＬ切断反応を行う際に使用するための説明書を含む。

【実施例】

【0100】

実施例１．
タンパク質シーケンシングにおけるプロテオミクスの大きな成功にもかかわらず、抗体（Ａｂ）の完全なシーケンシングは依然としてかなりの課題を呈する［１，２］。すべてのアミノ酸（及び任意のバリアント）の位置及び順序を注釈付け及び検証する目的で行われており、現在、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）－質量分析（ＭＳ）ボトムアップ・プロテオミクス分析のための重複した理想的な長さのペプチドを生成するために、４～５種類の異なるプロテアーゼを使用することが必要である。これは、インタクト分析、又は一般的に消化に単一の酵素を使用するタンパク質検証で行われる単純な単クローン性チェックと比較して、より高い分析基準である。注釈がデノボである場合、これらの質量スペクトルは、プロダクトイオンピーク間の抽出された質量シフトに関する情報を使用する特殊なＡｂシーケンシングプログラムによって処理されなければならない。割り当ては、許容される質量誤差を制限する計算規則に基づいて行われ、そのような分析の成功は、ＭＳ／ＭＳスペクトルの優れた品質に大きく依存する［３－７］。

【0101】

あるいは、抗体が最初にヒンジ領域の上又は下で切断されて、トップダウン及び／又はミドルダウンプロテオミクスによるシーケンシングのために修正可能なＡｂタンパク質断片を生成するミドルダウン酵素プロテオミクスアプローチが研究され始めている［８－１０］。これらの方法では、使用されるプロテアーゼ又は変性剤に応じて、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆｃ断片、Ｆｄ断片、軽鎖（ＬＣ）断片及び重鎖（ＨＣ）断片を選択的に生成することができ、それによって特にプロテアーゼＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＩｄｅＳ）（例えば、ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（商標）（Ｇｅｎｏｖｉｓ，Ｉｎｃ．））が非常に普及した［１０－１３］。ＩｄｅＳは、ヒンジの直下の特定の部位で抗体を消化し、Ｆ（ａｂ’）２断片及びＦｃ／２断片の均一なプールを生成するプロテアーゼである［１２，１３］。

【0102】

ミドルダウンの主な違いは、シーケンシングのためのボトムアップアプローチと比較した場合、比較的高分子量（ＨＭＷ）の前駆体（５～２５ｋＤａ）を使用することである。これらのタンパク質断片前駆体は、すべての断片イオンがマッピングされ得る、及びマッピングされるべき対応する配列を提供する。異なる断片に関するＭＳ１インタクト情報と組み合わせると、特に高分解能で決定される場合、トップダウン及びミドルダウンのプロテオミクスアプローチは非常に強力であり得る［８－１１、１４－２１］。

【0103】

ネイティブ質量分析［２２－２８］とトップダウンのプロテオミクス［１４、１６、２０、２９、３０］との組み合わせは、生物治療薬の分析にさらなる利点を提供することができる。消化された複合混合物のＬＣ分離はしばしば不十分であり、種の共溶出をもたらし、変性条件下では、これらの質量はしばしば重なり合い、シグナル対ノイズを低減し、正確な質量デコンボリューションを制限する。同様に、より高い電荷状態は、トップダウン分析において、より高い衝突エネルギー解離（ＨＣＤ）断片化効率の増加をもたらすが、ネイティブ質量分析は、タンパク質がより混雑していないｍ／ｚ空間に移動するときに、複数の電荷状態を包含する大きな分離幅の使用を可能にすることができる［３１，３２］。これにより、プロダクトイオンのシグナル対ノイズが増加し、カバレッジが高くなり、ワークフローを簡素化できる。一般に、還元されていないジスルフィド結合を有する大きなインタクトなタンパク質（＞２５ｋＤａ）のトップダウンは、従来は衝突誘起解離を伴う飛行時間又はＨＣＤ機器を伴うＯｒｂｉｔｒａｐである、産業界で見出される現在のＭＳ「有力な」機器へのデノボ適用のための十分なカバレッジを欠いている［３１］。これらは、非常に効率的で直交的な断片化アプローチである電子誘導解離［１４、１８、３３－３６］、及び非常に大きなポリペプチドにも適している紫外線光解離［１６、１７、３０］を欠く。複数の断片化方法がなければ、不完全なカバレッジはトップダウン及びミドルダウンの適用を制限する。したがって、これまであまり研究されていないプロテアーゼを使用して、標準的なＬＣ－ＭＳ／ＭＳ ＨＣＤ実験により適したタンパク質断片を生成する、より多くの代替的なミドルダウンワークフローを確立する未だ満たされていない必要性が存在する。

【0104】

ＩｇＧ分析の分野では、最も一般的に使用されるミドルダウンタンパク質分解酵素は、ヒンジ領域の下の単一部位で優先的に切断する前述のＩｄｅＳ［１２，１３］、及びヒンジのすぐ上で切断するＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ（商標）（Ｇｅｎｏｖｉｓ，Ｉｎｃ．）［３７］である。ほとんどの代替的なミドルダウン消化は、ポリペプチドのサイズがタンパク質の酵素への曝露時間に関連するように、無差別の酵素的又は化学的分解の速度を制御することを試みてきた。ごく最近では、オンラインペプチドマッピングにおける用途のために、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ酸プロテイナーゼがエレクトロスプレーエミッタに固定化された［３８，３９］。調査研究では、３～１５ｋＤａのペプチドを１：５の比で０～２分の曝露時間の間に生成した。同様に、ペプシン活性は、ｐＨの最適化解除によって意図的に制限されており、ミドルダウンサイズ断片及びＦ（ａｂ’）２ドメインが得られている［４０］。また、プロテアーゼＯｍｐＴ［４１］及びＳａｐ９［４２］によって生成されるペプチドは、一般に、サイズが１．５～１５ｋＤａの範囲であり、これは平均トリプシンペプチドサイズよりも大きい。

【0105】

市販のリソソームエンドペプチダーゼであるカテプシンＬ［４３，４４］及びＤ［４５］は、予測不可能な切断部位を有する２つのプロテアーゼとして文献に報告されている。カテプシンは、タンパク質骨格の加水分解によるタンパク質分解に関与するリソソームに見られる酵素のファミリーの代表である［４６］。カテプシンＬはペプチダーゼＣ１ファミリーのメンバーであり、Ｆ、Ｒ又はＲの後で、Ｐ２及びＰ１のＲ部位を切断することが報告されており［４７－５２］、アスパルチル・プロテイナーゼであるカテプシンＤは、疎水性残基、特にＬｅｕとＰｈｅとの間で切断することが報告されているが、これらの選好は引用文献全体を通して矛盾している［４７、５３－５７］。これらの研究は、主にＳＤＳ－ＰＡＧＥ、タンパク質シーケンサー、又はペプチド基質マイクロアレイによるタンパク質標準、抽出物及びペプチドに対して行われている。これらの研究にわたる一貫性の１つは、酵素の無差別性にもかかわらず、驚くほど限られた数の断片を生じることである。プロテアーゼ分解速度は、酵素アイソフォーム、タンパク質配列、二次及び三次構造、緩衝成分（特に銅などの金属）及び貯蔵条件に応じて大きく異なる［５８］。

【0106】

新しい酵素の評価は、特に消化部位の制限がほとんどない場合、標的タンパク質に見られる任意の位置及び任意のサイズで生成され得る多数の内部断片のために困難である。この大きな計算空間は、鎖間の可能性のあるジスルフィド結合又はＦｃ上に見出されるグリカンなどの翻訳後修飾を含む場合、さらに拡張される。Ａｂのカテプシン消化を特異的にマッピングするための本明細書に記載の研究は、クリップされた種の自動アノテーション機能を含むように２０１９年に更新されたＩｎｔａｃｔ Ｍａｓｓ（商標）アルゴリズム［５９］を利用することによって可能になった。このアルゴリズムは、方法セクションでさらに詳細に説明される。

【0107】

ここで、本発明者らは、単一の標準的な消化条件を使用して、３つのＩｇＧ１抗体（トラスツズマブ、リツキシマブ、及びオビヌツズマブ）、１つのＩｇＧ２／４抗体、エクリズマブ、及びノブ・イントゥ・ホール修飾を含む１つのＩｇＧ１二重特異性抗体（抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３）を標的とする場合のカテプシンＬ及びＤの切断部位を探索することを始める。形成されたＡｂ断片を、高分解能ネイティブ質量分析及び変性ＬＣ－ＭＳインタクト分析によって直接分析した。カテプシンＬ及びＤの切断部位を、異なるｐＨ、温度及び変性（有機パーセント）条件下で調査し、その後、Ａｂの可変領域と定常領域との間の切断を最大化するように最適化した。本発明者らの最も興味深い知見は、本発明者らがＡｂ軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）領域を包含する約１２ｋＤａの断片を特異的に生成できることである。本発明者らが知る限り、これは、Ａｂの高可変領域を直接標的とするミドルダウン技術の最初の実証であり、この１２ｋＤａ断片を標準的なＨＣＤで断片化することによって、本発明者らはこの領域にわたるカバレッジを最大化することができた。
Ａ．結果
Ａ．１．抗体のクラスにわたるカテプシンＬ及びカテプシンＤ切断部位のマッピング

【0108】

カテプシンＬ及びカテプシンＤの切断部位を、共通の消化モチーフを探し、ＩｇＧ１サブタイプとＩｇＧ２サブタイプとの間の差異を評価するために、５つの（ｆｆｉｖｅ）抗体（Ａｂ）にわたって評価した。本発明者らが知る限り、これは、インタクトＡｂのカテプシンＬ及びカテプシンＤ消化の最初の報告であり、類似又は非類似の相同性のものに及ぶ部位を調べるための最初の協調的努力である。

【0109】

消化物中に見出されるタンパク質断片の同定は、Ｉｎｔａｃｔ Ｍａｓｓを用いて行い、手動で検証した。デコンボリューションされたタンパク質断片ピークは、カテプシンプロテアーゼの両方について、すべてのＡｂにわたって、分子量が９～９８ｋＤａの範囲であった（表１～９、図１～６）。カテプシンＤによって切断された場合のリツキシマブの自動割り当ての例を図７及び図１に示す。最初に選んだ条件（ｐＨ７、２日間のインキュベーション）では、カテプシンＬ及びカテプシンＤの酵素効率はかなり低い約１％であることが分かった。タンパク質断片のサイズ分布は大きな分子量（ＭＷ）範囲に及んだが、ＶＬとＣＬとの間、ＶＨ１とＣＨ１との間、１番目の鎖間結合と２番目の鎖間結合の間のＣＨ１の間、及びヒンジ領域の直後（ＩｄｅＳ切断部位とほぼ同一の位置）の切断に対応する４つの一次種のみが観察された。より少ない存在量で、ＨＣ全体に複数の切断が観察された（表１）。

【0110】

正確な平均質量は、時間、質量、分解能、シグナル対ノイズ、及びｍ／ｚ範囲、並びに電荷デコンボリューションに使用される他のパラメータに依存するので、図１に示されている質量は、本明細書に開示されている表に与えられている質量からわずかに変化し得る（例えば、上記９９６４．１は表２の９９６３．４５と同じピークである）ことに留意されたい。同様に、正確な質量は、時間、質量、及びｍ／ｚ範囲、並びに電荷デコンボリューションに使用される他のパラメータに依存するため、図２～図６の質量も、本明細書に開示された表に与えられた質量からわずかに変化し得る。

【0111】

すべての低強度シグナルを含む場合、多数の総ピークがデコンボリューションされ、これは局所的対全体的な切断部位多様性を反映した。例えば、図７Ｂでは、カテプシンＤがおよそ１４個の、異なるが連続したアミノ酸で切断してＦ（ａｂ’）を生成し得、それらの多くは、それらの相対シグナル強度に基づいてほぼ等しい尤度で生成されたことが示されている（表２及び３）。この特定の領域では、Ｃ、Ｄ、Ｋ、Ｔ又はＨの後に切断が起こることが示された。局所的な切断多様性をさらに反映して、特定の生成物は、単純な単一部位切断とは対照的に、非対称クリップの結果であることがわかった。例えば、図７Ａに示すように、９７，５３８Ｄａのピークは、２つのＬＣと、第２のＨＣ（Ｅ１－Ｖ２４３）に対して１つのアミノ酸差でクリップされた１つの重鎖（Ｅ１－Ｆ２４４）との複合体に割り当てられる。非対称的な切断の割り当てのサポートは、トップダウン分析セクションにおいて提供される。－４個～＋４個の切断部位モチーフ内のすべての同定されたペプチドにわたってアミノ酸濃縮が見られなかったことを考慮すると（表１～３）、これは、カテプシンＤ特異性が一次配列と同程度に二次及び三次構造によって影響され得るという仮説に適しており、この役割は消化最適化実験中に論じられる。図１～図６と同様に、正確な質量は、時間、質量、及びｍ／ｚ範囲、並びに電荷デコンボリューションに使用される他のパラメータに依存するため、図７に示される質量も、本明細書に開示された表に与えられた質量からわずかに変化し得る。

【0112】

図８は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２－Ｂジスルフィド結合パターンを有する抗体の概略図にマッピングされたときに観察されたクリップの位置のグラフによる概要を提供する。クリップの部位は、使用されるＡｂ及びカテプシンプロテアーゼによって変化したが（表１～９）、すべてのＩｇＧ１にわたって例外なくいくつかの規則が保持された。（１）切断は、カテプシンＬ及びカテプシンＤによるＨＣ及びＬＣ ＣＤＲ３の直後に起こり、（２）カテプシンＤは、１^番目及び２^番目の鎖間ジスルフィドの間で切断してＦ（ａｂ’）を得たが、カテプシンＬは切断せず、（３）重鎖ヒンジは、ヒンジ領域の直下で両方のプロテアーゼによる可変クリッピングを起こしやすく、Ｆ（ａｂ’）２を生じ、（４）ＣＨ２とＣＨ３との間にカテプシンＬ及びカテプシンＤの両方について同定された切断部位があった。

【0113】

ＩｇＧ１と比較した場合、エクリズマブは同じパターンのＦ（ａｂ’）切断を示したが、ヒンジ内に切断部位を明らかに欠いていた。したがって、Ｆ（ａｂ’）に対するＦ（ａｂ’）２のみが観察された。この違いは、カテプシンＤ及びカテプシンＬの消化産物を媒介する際の三次構造の役割をさらに支持する。
Ａ．２．消化効率の定量的最適化及び断片の割り当て

【0114】

カテプシンＤ及びカテプシンＬが特定の部位でタンパク質を切断するかどうか、又はこれらの酵素がより無差別であるかどうかは予測不可能であったが、本発明者らは、カテプシンＬ及びカテプシンＤが４つの主要部位でＡｂを特異的に切断することを見出した。この特異性は、ミドルダウン・シーケンシング・ワークフローでカテプシンＤ及びカテプシンＬを使用する高い可能性を示した。しかしながら、消化効率は、標準条件下ではかなり劣っていた。消化効率を改善するために、消化変数としてｐＨを選択した［６０，６１］。同様に、Ａｂの３次構造が切断に影響すると考えられることから、有機溶媒のレベルも評価した。最後に、３７°Ｃ又は５０°Ｃの温度で消化を試験した。３回の反復実験を行い、インタクトなトラスツズマブの電荷状態と消化断片との合計強度の比を比較した（図９Ａ）。ＬＣ－ＵＶ－ＭＳを使用して、共イオン化種からのイオン抑制を最小限に抑え、ｎＥＳＩ注入と比較して、相対定量を改善した。結果が一貫していることを確実にするために、ポリペプチド溶出領域にわたって合計されたＵＶピーク面積対Ａｂピーク（図９Ｂ）の比をとることによっても定量を行った。

【0115】

カテプシンＬの最適ｐＨ効率はｐＨ３であり、カテプシンＤについてはｐＨ５であることが決定され（図９Ａ及び図９Ｂ参照）、傾向はＭＳ及びＵＶデータによって支持された。５０％メタノールでのランは、両方の酵素について増加した効率を示したが、他の条件と比較して有意に増加した変動性を有し、これはおそらくこれらの条件下でのＡｂの相対的不安定性によるものであった。物理的な観察は、５０％メタノール試料の一部に濁りを示し、Ａｂは沈殿するが、タンパク質断片は可溶化するため、消化比が膨らみ、変動性が増加した可能性がある。より低いメタノールレベル（１０又は３０％）では、対照と比較して消化効率の差はＭＳ又はＵＶによって観察されなかった。ＵＶ及びＭＳからのデータはカテプシンＬ及びカテプシンＤデータについて互いに直接矛盾しており、温度の影響について結論を出すことはできなかった。すべての条件にわたって、観察されたタンパク質断片は、ＩｇＧ１対照研究で報告されたものとよく一致していた。例えば、１１，１９７Ｄａの質量は、すべてのＩｇＧ１試料にわたって検出され、ＨＣペプチドＥ１－Ｄ１０２に対応する低豊富な種（＜１ｅ４）である。

【0116】

ｐＨ、温度、及び有機物の割合の条件にわたって観察された傾向に基づいて、最適化のための単一の方法を試験した。トラスツズマブのカテプシンＬ及びカテプシンＤによるワンポット消化を３７°Ｃで１８時間、ｐＨ４で準備した。図１０に示すように、１００％の消化効率が達成された。試料中の最も豊富な種は、ＣＨ２＋ＣＨ３領域の喪失に対応し、Ｆ（ａｂ’）２（約９８ｋＤａ）を生成した。５０ｋＤａ未満の種については２Ｄａ以内、１００ｋＤａ未満の種については４Ｄａ以内に割り当てを行った（３１．８ｐｐｍの平均誤差に相当する）。観察されたペプチドは、１Ｄａ以内のすべての消化複製物にわたって出現した（Ｎ＝６）。観察された最も豊富なより小さいＭＷペプチドは、ＶＨ１領域、ＶＬ領域及びＣｌ領域にマッピングされた（表１０）。

【0117】

興味深いことに、対照研究で特徴付けられた４７ｋＤａ種（図７Ｂ）は、最適化された消化のＬＣ－ＭＳ分析では観察されなかったが、後で、トップダウン分析のためのｎＥＳＩ注入中に観察された（図１１Ｄ）。Ｆ（ａｂ’）２は広い溶出幅（約１分）を有し、フロントを示すので、Ｆ（ａｂ’）共溶出物が可能である。

【0118】

ＬＣ－ＭＳによってタンパク質全体に非常に特異的な切断部位が観察された。これにより、９８ｋＤａ種を含む９つのポリペプチドが得られ、これは、すべてのデコンボリューションされたＬＣピーク（割り当てられた＋割り当てられていない）にわたって取られた合計強度の約７０％を含む。観察されたが割り当てられていないタンパク質断片の残りは、主に４～５ｋＤａの低分子量種に属していた。より大きなポリペプチドは抗体の１００％のカバレッジを提供したので、完全なリストを表１１に示すが、４～５ｋＤａ種の割り当ては試みなかった。さらに、より小さい分子量では、内部消化産物を考慮するため、可能な配列割り当ての数が著しく増加し、同定された部位の完全性を維持することが重要であった。

【0119】

同定された９つのペプチドの特異性を確認するために、エドマン分解を行った。同定された７／９のタンパク質断片について配列が明確に確認された（図１２）。２２，５１７．１３Ｄａの種をもたらす架橋質量に対応する、「ＰＴ」及び「ＡＰｘｘＫ」で始まるモチーフが観察された。低い存在量及び重複するゲルバンドは、１２，４８８．７７質量の確認を不可能にしたが、少なくともＧｌｙで始まるタンパク質断片が予想される分子量で同定されることが観察された。
Ａ．３．クリップされたタンパク質断片のトップダウン分析

【0120】

トップダウン分析を行って、断片化に対するポリペプチドサイズ及び構造の適合性を実証し、注釈付きトラスツズマブタンパク質断片のさらなる検証を提供した（表１０）。ＭＳ２スペクトルのシグナル対ノイズを増強するために、最適化されたトラスツズマブ試料を、ＬＣに対してｎＥＳＩによってＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＵＨＭＲに注入し、前駆体を少なくとも１００回のスキャンについて平均した（図１１）。プロダクトイオンを２００，０００の分解能の設定で同位体的に分解した（図１３）。

【0121】

プロダクトイオンの割り当ては、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ １．６（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）においてＸｔｒａｃｔアルゴリズムによって単同位体質量を抽出し、それらをＰｒｏＳｉｇｈｔ Ｌｉｔｅ［６２］におけるそれぞれの予測配列（表１０）と１０ｐｐｍ以内で一致させることによって行われ、システインは、ジスルフィド結合の存在を説明するためにＨ損失を伴っているとみなされた。続いて、ｙイオンＮＨ３損失及び水損失を説明する社内データベースを構築し、残りの抽出質量と一致させた（表１２）。図１４Ａに示されるように、良好な配列カバレッジが１２，１２１．５Ｄａ前駆体のＮ末端及びＣ末端で得られ、断片化効率はジスルフィド結合間で低下した。配列の割り当てを検証するために、非常に大きなプロダクトイオンを保存した（Ｙ１０４及びＢ１０９）。全体として、２９．４％の配列カバレッジが得られた。

【0122】

９７，６３０Ｄａ種については、サブユニット中の多数のジスルフィド結合によって割り当てが複雑化した。鎖間及び／又は鎖内を減少させてカバレッジを改善することができたが、非対称ＨＣ切断の存在を証明するためにその結合形態のポリペプチドを検証することが重要であった（ＰＡＰＥＬＬＧ．ＧとＰＡＰＥＬＬＧＧ．ＰＳＶとのペアリング）。図１４Ｂに示すように、かなりの数のｙイオンが各ＨＣ形態に特異的に対応していた。標準的なｙ、ｂ、アンモニア及び水分損失イオンの割り当て後、相互連結鎖からの架橋種の存在を評価した（表１３）。ＬＣについては、ＨＣ配列ＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴから構築された修飾を考慮し、Ｃ２４は架橋部位としてすべての部分配列に含まれていた。考慮されるＮ及びＣ末端結合は、それぞれＨＣ鎖内ジスルフィド（Ｃ１４８～Ｃ２０４）又はＨＣ鎖間ジスルフィド（鎖１、Ｃ２３０鎖２、Ｃ２３０）の開始を表した。ＨＣについては、最後のジスルフィド内結合システインの後のアミノ酸で始まり、次いでＣ末端で架橋されるＬＣ配列ＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣから架橋修飾を検討した。これらの種から検出されたイオンは、カテプシンＬ／Ｄ消化物から生成された非対称Ｃ末端の存在を確認した（図１４Ｂ）。合計で２２８個の総イオンが検出され、３３．７％の総カバレッジが得られ、ＬＣのカバレッジは２６．６％、ＨＣのカバレッジは４０％であった。
Ａ．４ 最適化されたカテプシンＬ及びＤプロトコルの二重特異性抗体への適用

【0123】

最適化されたプロトコルを確立し、カテプシンの適用を二重特異性ＩｇＧ１抗体（抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３）でさらに試験した。二重特異性抗体はＩｇＧ１と同一のジスルフィド結合構造を有するが、有意な構造差を示す。Ｆｃ領域中の様々なアミノ酸を突然変異させることによって、「ノブアンドホール」構造が作り出され、それによってｘＨｅｒ２及びｘＣＤ３鎖が増強され、ヘテロ二量体が生成される［６３］。一次構造変化はこのプロセスを促進し、アミノ酸２６～１１０の間（可変領域、ＣＤ３結合）、位置３７１及び４０８（ノブ／ホール）及び２９７（グリコシル化を防止する）に複数の突然変異が見られる。さらに、新たに発現された研究抗体と協働して、ほとんどの臨床的に使用される薬物製品には見られない新たな変動源（４％の二量体の存在）を導入した。

【0124】

カテプシンプロテアーゼは、Ｆ（ａｂ’）全体を通して予想通りに挙動した（表４）。ｘＨｅｒ２及びｘＣＤ３ ＬＣ及びＨＣの両方において、切断がＣＤＲ３の直後及びジスルフィド結合領域の外側に観察された。ＬＣ及びＣＨ１定常領域は相同であり、単一のタンパク質断片を両鎖の消化産物として割り当てた。ヒンジ後の切断により５つのタンパク質断片が得られ、高度に優先され保存されたＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫ配列に沿って非対称切断が生じた。興味深いことに、ｘＣＤ３ ＣＨ２又はＣＨ３領域内に他の切断は観察されなかった。抗Ｈｅｒ２（ノブ）鎖では、ヒンジの後ろで消化が起こり、Ｆ（ａｂ’）２（ＡＡ１－２３９）が得られ、数アミノ酸後にＣＨ２＋ＣＨ３断片（ＡＡ２６１－４３６）が得られた。ＣＨ３中の複数のタンパク質断片もノブ鎖中に生成された。しかしながら、ｘＣＤ３鎖上で切断された唯一のＦｃ領域は、両方の鎖にわたって同時に生じた。カテプシンプロテアーゼがかなり無差別であることを考慮すると、この違いについての最も可能性の高い説明は、二重特異性抗体の特異的三次構造である。ノブと比較して、ホールの形状又は構造の剛性が、ｘＨｅｒ２鎖の切断によって少なくとも部分的に露出されるまで、カテプシンがこの領域で「作用」することを困難にする可能性がある。この特定のノブ／ホール効果の検証は、この研究の範囲外である多数の二重特異性の試験を必要とする。これらの構造的意味もまた、消化効率に影響を及ぼし得る。最適化されたプロトコルは、トラスツズマブの１００％の消化をもたらしたが、インタクトな二重特異性の２０％が残存した（デコンボリューションされたピーク強度に基づく）。これは、独特な構造の結果としてのより遅い消化を反映し得るか、又は最終消化物において４から０％に減少した二量体のより遅い消化によって部分的に引き起こされ得る。
Ｂ．考察

【0125】

ＭＳシーケンシングのための理想的なサイズのポリペプチドをもたらすミドルダウンアプローチの開発は、トップダウン抗体シーケンシングのワークフローを前進させるために重要である。カテプシンＬ及びカテプシンＤプロテアーゼは、このワークフローを直接可能にするために、効率的で市販されている安価なワンポット消化を提供する。

【0126】

すべての消化条件下で、ＶＬ断片、ＶＨ断片、ＣＬ断片、ＣＨ１断片、ＣＨ２断片、ＣＨ３断片、ＣＬ＋ＣＨ１（結合）断片及びＦ（ＡＢ’）断片のカバレッジを与えるペプチドを個々に観察した。エドマン分解（Ｎ末端確認）、インタクト質量（＜４０ｐｐｍマッチング）及びトップダウンデータの組み合わせは、最適化された試料中の総タンパク質シグナルの７０％を含む、消化物から得られた主な切断産物のシーケンシングに明確に成功した。ＶＬ領域及びＶＨ領域は高存在量で生成され、切断はＣＤＲ３の直後で生じた。この領域は、短い領域にわたるその高い変動性のために、シーケンシングにとって最も困難な部分を表す。トップダウン・シーケンシングのための理想的なサイズでありＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を包含するロングリードを直接シーケンシングする能力は、提示されるミドルダウンアプローチの重要な特徴である。

【0127】

最も広く採用されているＩｄｅＳプロトコルと比較して、両方の処置はＦ（ａｂ’）を直接生成することができ、ヒンジの切断部位は２つのプロトコル間でほぼ同一である。還元試薬は、遊離ＬＣ又はＨＣを生成するためにＩｄｅＳプロトコルで使用され得るが、これらは、ＣＩＤ又はＨＣＤによる完全なトップダウン・シーケンシングのためのサイズ関連の課題を提起するのに対して、カテプシンのプロトコルでは、タンパク質断片の生成は直接的なアプローチを提供する。既存のデノボボトムアップ技術と組み合わせると、タンパク質断片の生成により、インタクトＡｂ全体ではなくＡｂ上で局所的に、配列の質量をチェックすることが可能になる。これは、問題のある割り当てを迅速に見つけて位置特定する機会を提供する。計算ツールがトップダウンのデノボ配列に発展するにつれて、カテプシンのアプローチはシーケンシング・アラインメントの課題の多くを解決し、消化物はサイズ範囲内に留まり、高品質のプロダクトイオンスペクトルが得られる。

【0128】

ＨＣＤは、ジスルフィド結合にわたるＡｂの限られた配列カバレッジをもたらすことが知られている［２０］。電子捕獲解離（ＥＣＤ）などの代替的な断片化技術は、このシーケンシングの課題を解決し、消化混合物の直接分析を可能にすることができるが、多くの質量分析計には見られない。トップダウンＨＣＤは、ジスルフィド結合が存在しない場合、より小さな分子量種の１００％のカバレッジを達成することができる。したがって、この方法をＡｂデノボシーケンシングに使用すると、この論文で実証されている配列検証に対して、クロマトグラフィー又は分子量カットオフフィルタのいずれかによる試料の分画、それに続くグアニジン塩酸の処理及び浄化は、共イオン化ピークの数を制限しながら詳細な配列を可能にする。さらに、グアニジンの適用は、前駆体をより高い電荷状態に遷移させ、断片化効率をさらに改善する。

【0129】

ＡｂにわたるカテプシンＬ及びカテプシンＤの評価は、特にモチーフの無差別性の文脈で考慮した場合、すべてのＩｇＧ１にわたる切断部位について顕著な一貫性を示した。試験したすべての抗体（トラスツズマブ、リツキシマブ、オビヌツズマブ、エクリズマブ、及び二重特異性抗体）にわたって、組み合わせたＬ／Ｄ消化物を含めて、５０個の独特な切断部位が同定された。カテプシンＬは２７部位で切断し、カテプシンＤは２８部位で切断した。中性部位が切断に好まれるという明確な証拠がある一方で、それ以外では両方のカテプシスプロテアーゼはｐ４からｐ４’の特定のアミノ酸に対してほとんど優先性を示さなかった（図１５）。文献は一般に、カテプシンＬによる切断部位としてＦ及びＲを報告し、これらの末端が存在したが、それらは全切断産物の１０％以下を構成した。ｐ３－ｐ３’部位あたり濃縮された４～６個のアミノ酸間で等しい濃縮を見出したＨＥＫ２９３タンパク質抽出物に対するカテプシンＬ活性の２０１１年の研究と比較して、Ａｂはモチーフ優先性の有意な低下を示し、二次構造に対して高次構造が最も重要であり得ることを示している［４８］。これは、カテプシンＬ及びカテプシンＤタンパク質活性を調べた個々の研究が、それらの報告された切断部位においてこれらの規則に対する多くの例外を特定する理由であり得る［４７－５７］。代替的な可能性は、それらの研究が、異なる生成物をもたらすことが知られている異なるカテプシンＬ及びカテプシンＤアイソフォームを使用していることである［５２］。さらに、カテプシンＬ及びカテプシンＤはプロリンで切断する能力を有することが示されたが、これはすべてのプロテアーゼにわたって比較的まれであり、プロテアーゼＥｎｄｏＰｒｏ（登録商標）は顕著な例外である［６４］。

【0130】

二次及び三次構造の潜在的な役割を調べるために、Ａｂ上のカテプシン誘導切断部位をその結晶構造と比較した（図１６）。いかなるアルファヘリックス内にも切断は観察されず、大部分はランダムコイル内に位置していた。切断部位の残りは、ランダムコイルの末端から１～２アミノ酸の距離内であるが、ベータシートの開始部内で観察された。これらの部位の性質は、カテプシンＬ及びカテプシンＤがＡｂｓの秩序領域内で切断する能力が限られているが、柔軟で無秩序な領域内のほぼすべてのアミノ酸モチーフに結合し得ることを強く示唆している。切断部位は、ジスルフィド結合パターンによってさらに拘束される。ジスルフィド結合は、最終三次構造に大きな制約を与え、非結合領域と比較して、かなり低い柔軟性を示す［６５］。カテプシン酵素は局所アミノ酸レベルでは無差別であり得るが、ジスルフィド結合領域の外側に見出される局所柔軟性が、切断される抗体配列を酵素ポケットの内側に配置するために必要とされる可能性がある。興味深いことに、この結論は、異なるｐＨ、熱及び有機条件下で行われた消化効率の比較によって支持される。異なる効率が観察されたが、切断された部位は条件全体にわたって一貫していることが分かった。二次構造レベルで起こり得る変性にもかかわらず、各処理はジスルフィド結合パターンに影響を及ぼさず、この制約が切断位置を決定する際の主要な要因であることを示している。消化が二重特異性抗体にまで拡張されたとき、抗ＣＤ３アームにおけるＣＨ２／ＣＨ３消化は、抗Ｈｅｒ２アームにわたって見出される標準的なＩｇＧ１カテプシンＬ＋Ｄ消化パターンとは対照的に、ヒンジ領域を超えて防止された。抗Ｈｅｒ２切断は、抗ＣＤ３鎖と相同な一次配列及び二次構造を有する場所で生じ、カテプシンＬ及びカテプシンＤ消化を決定する際の配列の局所的柔軟性、ドメイン配向、又は他の三次（ホール）効果の役割を示唆している。

【0131】

標準条件（ｐＨ７、３７^ｏＣ、２日間、１：２０の比）と最適化された条件を使用したトラスツズマブにおいて同定されたタンパク質断片の比較は、それらの相対存在量の興味深い差を示した（表８～１０）。例えば、ｐＨ７で最も豊富な低分子量ポリペプチドは１１，１９７Ｄａ（ＨＣ：１－１０２（ＹＹＣＳＲＷＧＧＤ．Ｆ））断片であるが、最適ｐＨ４では、２０ｋＤａ未満の最も豊富な断片は１２，１２１Ｄａ（ＬＣ：１－１１０（ＲＴＶＡ．Ａ））産物である。１つの可能性は、カテプシンＬ及びカテプシンＤが、単一のプール中で組み合わされると、Ａｂに結合したときに、他の酵素をクリッピングすることによって、又は化学量論効果を介して、互いの活性に影響を及ぼすことである。デコンボリューション中にカテプシンＬ又はカテプシンＤのインタクトな質量は観察されなかった。しかしながら、観察された約２５ｋＤａの質量の一部は、カテプシンＬの小さなクリップ（３０ｋＤａ）又は約４５ｋＤａのカテプシンＤの高度にクリップされた形態に対応し得る。これは、クリッピング評価においてデコンボリューションされた未同定種の一部を説明し得る。

【0132】

カテプシンＬ及びカテプシンＤを使用した場合に観察されたクリッピングパターンは、カテプシン処理が、Ａｂ中のジスルフィド結合をチェックするための比較的単純なアッセイとしても使用され得ることを示唆している。両方のカテプシンは、ＩｇＧ１について約４８ｋＤａの「単一アーム」断片を生成する可能性が高いが、別個のジスルフィド結合パターンを含むＩｇＧ２－Ｂ Ａｂについてはこれらの断片を生成しない。ＩｇＧ２－Ｂパターンは、非還元ペプチドマッピングでは確認が困難であり、最も一般的にはＬｙｓ－Ｃによって行われる［６６，６７］。

【0133】

ここで、本発明者らは、直接注入された非還元Ａｂに対して高分解能のネイティブＭＳ及び変性ＬＣ－ＭＳを並行して使用した。このアプローチは、単純さ、最小限の試料調製、及び供給源内断片化がほとんど又は全くない温和な供給源条件という利点を有する。ジスルフィド結合の還元及び脱グリコシル化は、感度を改善し、質量スペクトル及びデータ分析を単純化することができるが、提示された方法に追加の工程を追加する。インタクトな割り当てを自動化する能力を有するソフトウェアの使用は、新しいプロテアーゼの評価を迅速化するのに役立ち、細胞内又は抗体副産物内の天然のクリッピングを評価するための計算資源として有望である。この方法は、シーケンシングのための理想的なサイズのタンパク質断片を生成し、限られた数のタンパク質断片（９種）にわたって分布するＡｂの１００％のカバレッジを達成し、市販の酵素を使用し、このワークフローを堅牢で再現性のあるミドルダウン・シーケンシング・ワークフローとして適したものにする。
Ｃ．方法
Ｃ．１．化学物質及び材料

【0134】

治療用Ａｂ、リツキシマブ（ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標））、オビヌツズマブ（Ｇａｚｙｖａ（登録商標））及びエクリズマブ（Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標））はＧｅｎｍａｂ（オランダ）からの譲渡物であり、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））及び抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性はＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．の社内で供給された。二重特異性を除いて、すべてのＡｂ試料は期限切れのバッチからのものであった。使用前に、Ａｂ完全性をネイティブＭＳによってチェックして、あらゆる翻訳後修飾又は構造変化に対して確認し（荷電状態分布によってチェック）、Ａｂは高い完全性を有すると予想された。検索されたすべてのアミノ酸配列は、Ｎ末端シグナルペプチドを欠いており、表１４に提供されている。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）、酢酸アンモニウム（ＡＭＡＣ）、酢酸、ギ酸（ＦＡ）、８Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、メタノール（ＭｅＯＨ）及びカテプシンＬ及びＤは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、リン酸緩衝液はＬｏｎｚａ Ｇｒｏｕｐ ＡＧ（Ｂａｓｅｌ，ＣＨ）から購入した。アセトニトリル（ＡＣＮ）は、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ ＢＶ（Ｎｏｒｔｈ Ｂｒａｂａｎｔ，ＮＬ）及びＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ）から購入した。
Ｃ．２．カテプシンＬ及びカテプシンＤによる抗体消化

【0135】

カテプシンＬ及びカテプシンＤによる切断に適したＡｂモチーフを評価するために、単一の対照条件ですべての治療用Ａｂ（リツキシマブ、オビヌツズマブ、エクリズマブ、トラスツズマブ）にわたって消化を行った。ＡｂｓをＭｉｌｌｉ－Ｑ水中５μＭで調製し、酵素対抗体の比１：２００でカテプシンＬ又はＤで個別に処理した。試料を３７℃で中性ｐＨにて２日間インキュベートした。消化したＡｂ試料を、１０ｋＤａカットオフフィルタ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を使用した遠心分離によって１５０ｍＭ水性ＡＭＡＣ（ｐＨ７．５）に緩衝液交換した。最終タンパク質濃度を２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって測定した。消化物を２～３μＭに調整し、ネイティブＭＳ分析に直接使用するか、又は標準的な天然のネイティブ・プロトコルを使用して４単位のＰＮＧａｓｅ Ｆとともに一晩インキュベートした［２２］。ＰＮＧａｓｅ Ｆ処理試料を、ネイティブＭＳ測定の前に１５０ｍＭ ＡＭＡＣ（ｐＨ７．５）に２回目に緩衝液交換した。

【0136】

次いで、２ｍｇ／ｍＬのストック溶液の単一Ａｂであるトラスツズマブを使用して、異なる消化条件下で各カテプシンの切断効率を調査した。各カテプシンを１ｍｇ／ｍＬの水に再懸濁し、異なるｐＨ、ＭｅＯＨ及び温度条件を三連で試験した（表１５）。消化物を、０．２ｍｇ／ｍＬの最終Ａｂ濃度を有する１：２００の酵素対タンパク質比で調製した。ｐＨ調整調製物のために、所望のｐＨの５０ｍＭ酢酸アンモニウムの希釈緩衝液を添加し、溶液の７９％を構成した。ＬＣ－ＵＶ－ＭＳ分析のために、ＤＡＤ検出器（２５４ｎｍ）及びＥｘａｃｔｉｖｅ（商標）ＥＭＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に連結されたＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＬＣ上の２．１×５０ｍｍ ＭＡｂＰａｃ（商標）ＲＰ ＨＰＬＣカラム（８０°Ｃ）に１５μＬを注入した。流量を３００μＬ／分に設定し、移動相Ａ（ＭＰＡ）は９９．８８％水及び０．１％ギ酸及び０．０２％トリフルオロ酢酸であり、Ｂ（ＭＰＢ）は９０％ ＡＣＮ、９．８８％水、０．０２％トリフルオロ酢酸及び０．１％ギ酸であった。ＭＰＢを１分で５から２０％に、９．５分で６５％に、１０分で９０％に増加させ、再平衡化前に９０％で２分間保持した。

【0137】

Ｌ＋Ｄの最終的なワンポット反応を、ｐＨ４．０及び温度３７℃で１８時間、トラスツズマブについて評価した。ＬＣ－ＵＶ－ＭＳを使用して、上記のようにインタクトな質量を評価した。ＭｉｃｒｏＢｉｏ－Ｓｐｉｎカラムを製造者の指示に従って使用して、５０ｍＭ酢酸アンモニウムに直接緩衝液交換した試料に対して、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）ＵＨＭＲのトップダウン分析を行った。設定は、以下の静的ｎＥＳＩ ＭＳセクションに記載されるように調整した。
Ｃ．３．カテプシンＬ及びＤ断片の静的ｎＥＳＩ ＭＳ

【0138】

試料は、５００～１２，０００のいずれかのｍ／ｚ範囲を使用して、拡張質量範囲（ＥＭＲ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）［６８］又はＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）ＵＨＭＲ［６９］を有する修正されたＥｘａｃｔｉｖｅ（商標）Ｐｌｕｓ Ｏｒｂｉｔｒａｐ機器で分析した。輸送多極及びイオンレンズの電圧オフセットを手動で調整して、高いｍ／ｚでのタンパク質イオンの最適な透過を達成した。窒素を３－７×１０^－１０バールのガス圧で高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）セルに使用した。使用したＭＳパラメータ：スプレー電圧１．２～１．３Ｖ、ソース温度２５０°Ｃ、ソース断片化及び衝突エネルギーを５０から８０Ｖに変化させ、すべてのＡｂについて分解能（ｍ／ｚ２００）３５，０００又は７０，０００を変化させた。機器を、ＣｓＩ溶液を使用して前述のように質量較正した［２２］。
Ｃ．３．エドマン分解

【0139】

ワンポットトラスツズマブＬ＋Ｄ消化物からのカテプシン切断抗体を４～２０％Ｎｏｖｅｘ（商標）Ｔｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分離し、ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットし、次いで、クーマシーブリリアントブルーＲ－２５０染色で可視化した。目的のバンドを切り出し、４９４ Ｐｒｏｃｉｓｅ（商標）シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてＮ末端配列分析に供した。得られた配列の混合物を、シーケンサー関連６１０ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して分析し、手動で検証した。
Ｃ．４．抗体消化産物のデータ分析

【0140】

Ｉｎｔａｃｔ Ｍａｓｓ（商標）ｖ３．２－４２４（２０１８年１０月）を電荷デコンボリューションに使用した（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）。初期デコンボリューションでは、ｍ／ｚ範囲６００～９，０００、ｍ範囲１０，０００～１６０，０００、ｍ／ｚ間隔０．０４、ｍ／ｚ平滑化シグマ０．０２、０．２電荷間隔、並びにｍ間隔０．５及びｍ平滑化シグマ３．０を含むデフォルトパラメータを使用した。その後のデコンボリューションのために、パラメータを調整して最高品質の結果を得た。すべての場合において、質量ピークの最小差分は１５であり、ピーク検出器シグマは５（質量ピークの最小差分の１／３）となった。自動ピークアノテーションには４Ｄａの質量マッチング許容度を適用した。

【0141】

２０１９年に市販されたＩｎｔａｃｔ Ｍａｓｓ（商標）プログラムの詳細は、クリップされた種のマッチングアルゴリズムが科学文献に記載されていないので、ここで要約する。電荷デコンボリューション［２７，５９］の後、アルゴリズムは、「メキシカンハット」ピーク検出フィルタを使用して、強度の降順で、ピークの密集した肩に見られる質量の優先順位付けを解除して、中性質量スペクトルのピークを選ぶ。選択されたピークのピーク検出器幅（フィルタの正の部分の標準偏差、デフォルト＝５Ｄａ）、質量範囲、最大数、最小質量間隔、ベースピークの最小パーセンテージ、及び最小シグナル対ノイズ比を指定する設定をカスタマイズすることができる。

【0142】

デコンボリューション及び選出されたピークは、入力されたアミノ酸配列（複数の鎖を含む）及び天然同位体存在量の表から計算された理論平均同位体質量と一致した。生物源に特徴的な^１３Ｃ存在量（１．０７９％）を特定した。平均質量を使用して、モノアイソトピック質量のオフ・バイ・ワン・ダルトン誤差を回避し、アイソトープ分解質量と未分解質量との混合物を含み得る質量スペクトルにわたって均一性を提供した。

【0143】

軽鎖又は重鎖のいずれかのペプチド結合はすべて、切断を好ましいアミノ酸に制限するのではなく、潜在的なクリップ部位と考えられた。マッチングアルゴリズムにおいて、Ｑで始まる接尾辞（鎖のＣ末端を含むがＮ末端を含まない配列）はｐｙｒｏ－Ｇｌｕで始まるとは仮定されず、一方、接頭辞（鎖のＮ末端を含むがＣ末端を含まない配列）配列は仮定された。Ｃ（システイン）は、デフォルトではジスルフィド結合されていると仮定され、奇数番号の単一のＣは還元されたままであり、インタクト質量はパターンを予測しようとすることなく約１Ｄａ減算する。アルゴリズムは単純な貪欲アルゴリズムである［７０］：選択された各ピークは、設定された質量許容範囲内で最も近い理論質量に一致する。同じ位置で切断された同一の鎖の特別な場合を除いて、Ｉｎｔａｃｔ Ｍａｓｓは、単一の鎖のみを切断し、それを他のインタクトな第２の鎖と合計することによって接頭辞又は接尾辞配列を計算する。インタクトなｍＡｂの場合、２つのＬＣ及び２つのＨＣは、インタクト質量が単鎖をクリッピングし、他の３つの鎖をインタクトなままにすることによって接頭辞及び接尾辞を生成するように連結された。ソフトウェアはまた、同じ位置で切断された２つの同一の鎖、例えばＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ．ＧＰＳにおけるＧ間で切断するＩｄｅＳプロテアーゼによって生成されたＦ（ａｂ’）２断片も考慮する。クリッピングのために単一のＬＣ＋ＨＣによって形成された「半Ａｂ」が自動的に考慮される。

【0144】

すべての割り当てを手動で検証し、割り当てられていないすべての種を手動で評価して、アルゴリズムが割り当てを逃したかどうかを判定した。
Ｄ．参考文献
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１７．Ｃａｎｎｏｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｃａｍｍａｒａｔａ，Ｍ．Ｂ．，Ｒｏｂｏｔｈａｍ，Ｓ．Ａ．，Ｃｏｔｈａｍ，Ｖ．Ｃ．，Ｓｈａｗ，Ｊ．Ｂ．，Ｆｅｌｌｅｒｓ，Ｒ．Ｔ．，Ｅａｒｌｙ，Ｂ．Ｐ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｐ．Ｍ．，Ｋｅｌｌｅｈｅｒ，Ｎ．Ｌ．＆Ｂｒｏｄｂｅｌｔ，Ｊ．Ｓ．（２０１４）Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｐｈｏｔｏｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｏｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ａ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｔｉｍｅ ｓｃａｌｅ，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．８６，２１８５－２１９２．
１８．Ｓｈａｗ，Ｊ．Ｂ．，Ｍａｌｈａｎ，Ｎ．，Ｖａｓｉｌ’ｅｖ，Ｙ．Ｖ．，Ｌｏｐｅｚ，Ｎ．Ｉ．，Ｍａｋａｒｏｖ，Ａ．，Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｊ．Ｓ．＆Ｖｏｉｎｏｖ，Ｖ．Ｇ．（２０１８）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｇｒａｄｅ Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ Ｔｏｐ－Ｄｏｗｎ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｕｓｉｎｇ Ｈｙｂｒｉｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ａ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．９０，１０８１９－１０８２７．
１９．Ｓｈａｗ，Ｊ．Ｂ．，Ｌｉ，Ｗ．，Ｈｏｌｄｅｎ，Ｄ．Ｄ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｇｒｉｅｐ－Ｒａｍｉｎｇ，Ｊ．，Ｆｅｌｌｅｒｓ，Ｒ．Ｔ．，Ｅａｒｌｙ，Ｂ．Ｐ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｐ．Ｍ．，Ｋｅｌｌｅｈｅｒ，Ｎ．Ｌ．＆Ｂｒｏｄｂｅｌｔ，Ｊ．Ｓ．（２０１３）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｏｐ－ｄｏｗｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｐｈｏｔｏｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．１３５，１２６４６－１２６５１．
２０．Ｃａｔｈｅｒｍａｎ，Ａ．Ｄ．，Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｏ．Ｓ．＆Ｋｅｌｌｅｈｅｒ，Ｎ．Ｌ．（２０１４）Ｔｏｐ Ｄｏｗｎ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ｆａｃｔｓ ａｎｄ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．４４５，６８３－６９３．
２１．Ｔｒａｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｚａｍｄｂｏｒｇ，Ｌ．，Ａｈｌｆ，Ｄ．Ｒ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｅ．，Ｃａｔｈｅｒｍａｎ，Ａ．Ｄ．，Ｄｕｒｂｉｎ，Ｋ．Ｒ．，Ｔｉｐｔｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｖｅｌｌａｉｃｈａｍｙ，Ａ．，Ｋｅｌｌｉｅ，Ｊ．Ｆ．，Ｌｉ，Ｍ．，Ｗｕ，Ｃ．，Ｓｗｅｅｔ，Ｓ．Ｍ．Ｍ．，Ｅａｒｌｙ，Ｂ．Ｐ．，Ｓｉｕｔｉ，Ｎ．，ＬｅＤｕｃ，Ｒ．Ｄ．，Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｐ．Ｄ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｐ．Ｍ．＆Ｋｅｌｌｅｈｅｒ，Ｎ．Ｌ．（２０１１）Ｍａｐｐｉｎｇ ｉｎｔａｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｉｎ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｍｏｄｅ ｕｓｉｎｇ ｔｏｐ－ｄｏｗｎ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，Ｎａｔｕｒｅ．４８０，２５４－２５８．
２２．Ｒｏｓａｔｉ，Ｓ．，Ｙａｎｇ，Ｙ．，Ｂａｒｅｎｄｒｅｇｔ，Ａ．＆Ｈｅｃｋ，Ａ．Ｊ．Ｒ．（２０１４）Ｄｅｔａｉｌｅｄ ｍａｓｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｎａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．９，９６７－９７６．
２３．Ｂａｉｌｅｙ，Ａ．Ｏ．，Ｈａｎ，Ｇ．，Ｐｈｕｎｇ，Ｗ．，Ｇａｚｉｓ，Ｐ．，Ｓｕｔｔｏｎ，Ｊ．，Ｊｏｓｅｐｈｓ，Ｊ．Ｌ．＆Ｓａｎｄｏｖａｌ，Ｗ．（２０１８）Ｃｈａｒｇｅ ｖａｒｉａｎｔ ｎａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｂｅｎｅｆｉｔｓ ｍａｓｓ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｔａｃｔ ｍａｓｓ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｍａｂｓ－Ａｕｓｔｉｎ．１０，１２１４－１２２５．
２４．Ｐｈｕｎｇ，Ｗ．，Ｈａｎ，Ｇ．，Ｐｏｌｄｅｒｄｉｊｋ，Ｓ．Ｇ．Ｉ．，Ｄｉｌｌｏｎ，Ｍ．，Ｓｈａｔｚ，Ｗ．，Ｌｉｕ，Ｐ．，Ｗｅｉ，Ｂ．，Ｓｕｒｅｓｈ，Ｐ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．，Ｓｐｉｅｓｓ，Ｃ．，Ｂａｉｌｅｙ，Ａ．，Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．Ｊ．，Ｌｉｌｌ，Ｊ．Ｒ．＆Ｓａｎｄｏｖａｌ，Ｗ．（２０１９）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｍｉｓｐａｉｒｅｄ ＩｇＧｓ ｂｙ ｎａｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅ－ｖａｒｉａｎｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｉｎｔ Ｊ Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍ．４４６，１１６２２９．
２５．Ｃａｖａｌ，Ｔ．，Ｔｉａｎ，Ｗ．，Ｙａｎｇ，Ｚ．，Ｃｌａｕｓｅｎ，Ｈ．＆Ｈｅｃｋ，Ａ．Ｊ．Ｒ．（２０１８）Ｄｉｒｅｃｔ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｖａｒｉａｎｔｓ，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．９，３３４２．
２６．Ｗｏｈｌｓｃｈｌａｇｅｒ，Ｔ．，Ｓｃｈｅｆｆｌｅｒ，Ｋ．，Ｆｏｒｓｔｅｎｌｅｈｎｅｒ，Ｉ．Ｃ．，Ｓｋａｌａ，Ｗ．，Ｓｅｎｎ，Ｓ．，Ｄａｍｏｃ，Ｅ．，Ｈｏｌｚｍａｎｎ，Ｊ．＆Ｈｕｂｅｒ，Ｃ．Ｇ．（２０１８）Ｎａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｕｎｒａｖｅｌｓ ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．９，１７１３．
２７．Ｃａｍｐｕｚａｎｏ，Ｉ．Ｄ．Ｇ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ｈ．，Ｈｕｉ，Ｊ．Ｏ．，Ｓｈｉ，Ｓ．Ｄ．Ｈ．，Ｎｅｔｉｒｏｊｊａｎａｋｕｌ，Ｃ．，Ｎｓｈａｎｉａｎ，Ｍ．，Ｅｇｅａ，Ｐ．Ｆ．，Ｌｉｐｐｅｎｓ，Ｊ．Ｌ．，Ｂａｇａｌ，Ｄ．，Ｌｏｏ，Ｊ．Ａ．＆Ｂｅｒｎ，Ｍ．（２０１９）Ｎａｔｉｖｅ ａｎｄ Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ＭＳ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｔｏ Ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｂｅｙｏｎｄ，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．９１，９４７２－９４８０．
２８．Ｍａｒｃｏｕｘ，Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｃ．，Ｐｏｌｉｔｉｓ，Ａ．，Ｒｅａｄｉｎｇ，Ｅ．，Ｍａ，Ｊ．，Ｂｉｇｇｉｎ，Ｐ．Ｃ．，Ｚｈｏｕ，Ｍ．，Ｔａｏ，Ｈ．，Ｚｈａｎｇ，Ｑ．，Ｃｈａｎｇ，Ｇ．，Ｍｏｒｇｎｅｒ，Ｎ．＆Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｃ．Ｖ．（２０１３）Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｒｅｖｅａｌｓ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｌｉｐｉｄｓ，ａｎｄ ｄｒｕｇｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ａ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｅｆｆｌｕｘ ｐｕｍｐ，Ｐ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１１０，９７０４－９７０９．
２９．Ｙａｎｇ，Ｙ．，Ｌｉｕ，Ｆ．，Ｆｒａｎｃ，Ｖ．，Ｈａｌｉｍ，Ｌ．Ａ．，Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ，Ｈ．＆Ｈｅｃｋ，Ａ．Ｊ．Ｒ．（２０１６）Ｈｙｂｒｉｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｉｎ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓａｇｅ ｉｎ ｓｃｏｒｉｎｇ ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．７，１３３９７．
３０．Ｇｒｅｉｓｃｈ，Ｊ．－Ｆ．，Ｔａｍａｒａ，Ｓ．，Ｓｃｈｅｌｔｅｍａ，Ｒ．Ａ．，Ｍａｘｗｅｌｌ，Ｈ．Ｗ．Ｒ．，Ｆａｇｅｒｌｕｎｄ，Ｒ．Ｄ．，Ｆｉｎｅｒａｎ，Ｐ．Ｃ．，Ｔｅｔｔｅｒ，Ｓ．，Ｈｉｌｖｅｒｔ，Ｄ．＆Ｈｅｃｋ，Ａ．Ｊ．Ｒ．（２０１９）Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｍａｓｓ ｒａｎｇｅ ｆｏｒ ＵＶＰＤ－ｂａｓｅｄ ｎａｔｉｖｅ ｔｏｐ－ｄｏｗｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ．１０，７１６３－７１７１．
３１．Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｐ．Ｄ．，Ｚａｍｄｂｏｒｇ，Ｌ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｐ．Ｍ．＆Ｋｅｌｌｅｈｅｒ，Ｎ．Ｌ．（２０１１）Ｏｎ ｔｈｅ ｓｃａｌａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｗｈｏｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．８３，６８６８－６８７４．
３２．ＭｃＬｕｃｋｅｙ，Ｓ．Ａ．＆Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．（１９９８）Ｉｏｎ／ｉｏｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｍａｓｓ ｍｕｌｔｉｐｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ ｉｏｎｓ，Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ Ｒｅｖ．１７，３６９－４０７．
３３．Ｇｅ，Ｙ．，Ｌａｗｈｏｒｎ，Ｂ．Ｇ．，ＥｌＮａｇｇａｒ，Ｍ．，Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｅ．，Ｐａｒｋ，Ｊ．－Ｈ．，Ｂｅｇｌｅｙ，Ｔ．Ｐ．＆ＭｃＬａｆｆｅｒｔｙ，Ｆ．Ｗ．（２００２）Ｔｏｐ Ｄｏｗｎ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｒｇｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（４５ ｋＤａ）ｂｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．１２４，６７２－６７８．
３４．Ｒｅｉｄ，Ｇ．Ｅ．，Ｗｕ，Ｊ．，Ｃｈｒｉｓｍａｎ，Ｐ．Ａ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍ．＆ＭｃＬｕｃｋｅｙ，Ｓ．Ａ．（２００１）Ｃｈａｒｇｅ－Ｓｔａｔｅ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｏｎａｔｅｄ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｉｏｎｓ ｖｉａ Ｉｏｎ Ｔｒａｐ Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．７３，３２７４－３２８１．
３５．Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｃｕｉ，Ｗ．，Ｗｅｎ，Ｊ．，Ｂｌａｎｋｅｎｓｈｉｐ，Ｒ．Ｅ．＆Ｇｒｏｓｓ，Ｍ．Ｌ．（２０１１）Ｎａｔｉｖｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ－Ｃａｐｔｕｒｅ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ＦＴＩＣＲ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ Ｔｏｐ－Ｄｏｗｎ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．８３，５５９８－５６０６．
３６．Ｓｙｋａ，Ｊ．Ｅ．Ｐ．，Ｃｏｏｎ，Ｊ．Ｊ．，Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｓｈａｂａｎｏｗｉｔｚ，Ｊ．＆Ｈｕｎｔ，Ｄ．Ｆ．（２００４）Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｐ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０１，９５２８－９５３３．
３７．Ｍｏｅｌｌｅｋｅｎ，Ｊ．，Ｅｎｄｅｓｆｅｌｄｅｒ，Ｍ．，Ｇａｓｓｎｅｒ，Ｃ．，Ｌｉｎｇｋｅ，Ｓ．，Ｔｏｍａｓｃｈｅｋ，Ｓ．，Ｔｙｓｈｃｈｕｋ，Ｏ．，Ｌｏｒｅｎｚ，Ｓ．，Ｒｅｉｆｆ，Ｕ．＆Ｍｏｌｈｏｊ，Ｍ．（２０１７）ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ（商標）ｐｒｏｔｅａｓｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｌｌｏｗｓ ａ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ Ｆａｂ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｅｎａｂｌｉｎｇ ｄｉｒｅｃｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｄｕｒｉｎｇ ｌｅａｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｄ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ１ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍａｂｓ－Ａｕｓｔｉｎ．９，１０７６－１０８７．
３８．Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，Ｅｎｇｌｉｓｈ，Ａ．Ｍ．，Ｂａｉ，Ｄ．Ｌ．，Ｕｇｒｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｓｈａｂａｎｏｗｉｔｚ，Ｊ．，Ｒｏｓｓ，Ｍ．Ｍ．，Ｈｕｎｔ，Ｄ．Ｆ．＆Ｗａｎｇ，Ｗ．－Ｈ．（２０１６）Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｂｙ Ｔｉｍｅ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ＭＣＰ．１５，１４７９－１４８８．
３９．Ｍａｏ，Ｙ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，Ｋｌｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．，Ｘｉａ，Ｑ．，Ｄａｌｙ，Ｔ．Ｊ．＆Ｌｉ，Ｎ．（２０１９）Ｆａｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｙ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｎ ｅｍｉｔｔｅｒ ｄｕｒｉｎｇ ｎａｎｏｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ，Ｍａｂｓ－Ａｕｓｔｉｎ．１１，７６７－７７８．
４０．Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ｇ．Ａ．＆Ｌａｎｄｏｎ，Ｊ．（２００２）Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｐｓｉｎ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆ（ａｂ’）２ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ ｆｒｏｍ ｓｅｒｕｍ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２６３，５７－７４．
４１．Ｗｕ，Ｃ．，Ｔｒａｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｚａｍｄｂｏｒｇ，Ｌ．，Ｄｕｒｂｉｎ，Ｋ．Ｒ．，Ｌｉ，Ｍ．，Ａｈｌｆ，Ｄ．Ｒ．，Ｅａｒｌｙ，Ｂ．Ｐ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｐ．Ｍ．，Ｓｗｅｅｄｌｅｒ，Ｊ．Ｖ．＆Ｋｅｌｌｅｈｅｒ，Ｎ．Ｌ．（２０１２）Ａ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｆｏｒ ’ｍｉｄｄｌｅ－ｄｏｗｎ’ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．９，８２２－８２４．
４２．Ｓｒｚｅｎｔｉｃ，Ｋ．，Ｆｏｒｎｅｌｌｉ，Ｌ．，Ｌａｓｋａｙ，Ｕ．Ａ．，Ｍｏｎｏｄ，Ｍ．，Ｂｅｃｋ，Ａ．，Ａｙｏｕｂ，Ｄ．＆Ｔｓｙｂｉｎ，Ｙ．Ｏ．（２０１４）Ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｂｏｔｔｏｍ－Ｕｐ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｕｓｉｎｇ Ｓａｐ９ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．８６，９９４５－９９５３．
４３．Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．Ｍ．＆Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｍ．Ｍ．（１９８９）Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６４，２０４８７－９５．
４４．Ｋｉｒｓｃｈｋｅ，Ｈ．，Ｋｅｍｂｈａｖｉ，Ａ．Ａ．，Ｂｏｈｌｅｙ，Ｐ．＆Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．（１９８２）Ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｌ ｏｎ ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ，Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ．２０１，３６７－３７２．
４５．Ｐｒｅｓｓ，Ｅ．Ｍ．，Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．＆Ｃｅｂｒａ，Ｊ．（１９６０）Ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ，ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｄ，ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｓｐｌｅｅｎ，Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ．７４，５０１－５１４．
４６．Ｂｒｉｘ，Ｋ．（２００５）Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ：Ｒｅｖｉｖａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ．ｉｎ Ｍａｄａｍｅ Ｃｕｒｉｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｓａｆｔｉｇ，Ｐ．，ｅｄ），Ｌａｎｄｅｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｕｓｔｉｎ（ＴＸ）．
４７．Ｄｕｎｎ，Ａ．Ｄ．，Ｃｒｕｔｃｈｆｉｅｌｄ，Ｈ．Ｅ．＆Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｔ．（１９９１）Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｂｙ ｔｈｙｒｏｉｄａｌ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．Ｍａｊｏｒ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ｃａｔｈｅｐｓｉｎｓ Ｂ，Ｄ，ａｎｄ Ｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６６，２０１９８－２０４．
４８．Ｂｉｎｉｏｓｓｅｋ，Ｍ．Ｌ．，Ｎａｇｌｅｒ，Ｄ．Ｋ．，Ｂｅｃｋｅｒ－Ｐａｕｌｙ，Ｃ．＆Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ，Ｏ．（２０１１）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｓｉｔｅｓ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｓ Ｐｒｉｍｅ ａｎｄ Ｎｏｎ－ｐｒｉｍｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｃａｔｈｅｐｓｉｎｓ Ｂ，Ｌ，ａｎｄ Ｓ，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．１０，５３６３－５３７３．
４９．Ｇｏｓａｌｉａ，Ｄ．Ｎ．，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｃ．Ｍ．，Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．＆Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｓ．Ｌ．（２００５）Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ Ｓｅｒｉｎｅ ａｎｄ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ－ｐｈａｓｅ Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆ａｍｐ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．４，６２６－６３６．
５０．Ｐｕｚｅｒ，Ｌ．，Ｃｏｔｒｉｎ，Ｓ．Ｓ．，Ａｌｖｅｓ，Ｍ．Ｆ．Ｍ．，Ｅｇｂｏｒｇｅ，Ｔ．，Ａｒａｕｊｏ，Ｍ．Ｓ．，Ｊｕｌｉａｎｏ，Ｍ．Ａ．，Ｊｕｌｉａｎｏ，Ｌ．，Ｂｒｏｍｍｅ，Ｄ．＆Ｃａｒｍｏｎａ，Ａ．Ｋ．（２００４）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｖ ａｎｄ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｌ，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．４３０，２７４－２８３．
５１．Ｈｕ，Ｙ．，Ｍｏｒｉｏｋａ，Ｋ．＆Ｉｔｏｈ，Ｙ．（２００７）Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｌ ａｎｄ ｉｔｓ Ｃｈｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｒｅｄ Ｂｕｌｌｅｙｅ Ｓｕｒｉｍｉ．，Ｐａｋｉｓｔａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．１０，７８－８３．
５２．Ｌｕｏ，Ｈ．Ｂ．，Ｔｉｅ，Ｌ．，Ｃａｏ，Ｍ．Ｙ．，Ｈｕｎｔｅｒ，Ａ．Ｋ．，Ｐａｂｓｔ，Ｔ．Ｍ．，Ｄｕ，Ｊ．Ｌ．，Ｆｉｅｌｄ，Ｒ．，Ｌｉ，Ｙ．Ｌ．＆Ｗａｎｇ，Ｗ．Ｋ．（２０１９）Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｌ Ｃａｕｓｅｓ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ－Ｈａｍｓｔｅｒ－Ｏｖａｒｙ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｄｕｒｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｓｔｏｒａｇｅ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇｒ．３５．
５３．Ｔａｎｇ，Ｊ．＆Ｗｏｎｇ，Ｒ．Ｎ．Ｓ．（１９８７）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｐａｒｔｉｃ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３，５３－６３．
５４．Ｓｕｎ，Ｈ．，Ｌｏｕ，Ｘ．，Ｓｈａｎ，Ｑ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｚｈｕ，Ｘ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｘｉｅ，Ｙ．，Ｘｕ，Ｎ．＆Ｌｉｕ，Ｓ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｄ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ Ｉｔｓ Ｔａｒｇｅｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＰＬＯＳ ＯＮＥ．８，ｅ６５７３３．
５５．ｖａｎ Ｎｏｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．＆ｖａｎ ｄｅｒ Ｄｒｉｆｔ，Ａ．Ｃ．（１９８９）Ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｄ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ａｎ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６４，１４１５９－１４１６４．
５６．Ｗｏｅｓｓｎｅｒ Ｊｒ．，Ｊ．（１９７７）Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｄ．，Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．９５，３１３－３２７．
５７．Ｂｅｅ，Ｊ．Ｓ．，Ｔｉｅ，Ｌ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．，Ｄｉｍｉｔｒｏｖａ，Ｍ．Ｎ．，Ｊｕｓｉｎｏ，Ｋ．Ｃ．＆Ａｆｄａｈｌ，Ｃ．Ｄ．（２０１５）Ｔｒａｃｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＨＯ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｄ ｃａｕｓｅｄ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇｒ．３１，１３６０－１３６９．
５８．Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｐａｎ，Ｈ．＆Ｃｈｅｎ，Ｘ．（２００９）Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ Ｒｅｖ．２８，１４７－１７６．
５９．Ｂｅｒｎ，Ｍ．，Ｃａｖａｌ，Ｔ．，Ｋｉｌ，Ｙ．Ｊ．，Ｔａｎｇ，Ｗ．，Ｂｅｃｋｅｒ，Ｃ．，Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｅ．，Ｋｌｅｔｔｅｒ，Ｄ．，Ｓｅｎ，Ｋ．Ｉ．，Ｇａｌｙ，Ｎ．，Ｈａｇｅｍａｎｓ，Ｄ．，Ｆｒａｎｃ，Ｖ．＆Ｈｅｃｋ，Ａ．Ｊ．Ｒ．（２０１８）Ｐａｒｓｉｍｏｎｉｏｕｓ Ｃｈａｒｇｅ Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｎａｔｉｖｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．１７，１２１６－１２２６．
６０．Ｔｅｒｒａ，Ｗ．Ｒ．，Ｄｉａｓ，Ｒ．Ｏ．＆Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｃ．（２０１９）Ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｅｎｚｙｍｅｓ ａｓ ｍａｊｏｒ ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ．４７，６１５－６２３．
６１．Ｈｏｎｅｙ，Ｋ．＆Ｒｕｄｅｎｓｋｙ，Ａ．Ｙ．（２００３）Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．３，４７２－４８２．
６２．Ｆｅｌｌｅｒｓ，Ｒ．Ｔ．，Ｇｒｅｅｒ，Ｊ．Ｂ．，Ｅａｒｌｙ，Ｂ．Ｐ．，Ｙｕ，Ｘ．，ＬｅＤｕｃ，Ｒ．Ｄ．，Ｋｅｌｌｅｈｅｒ，Ｎ．Ｌ．＆Ｔｈｏｍａｓ，Ｐ．Ｍ．（２０１５）ＰｒｏＳｉｇｈｔ Ｌｉｔｅ：ｇｒａｐｈｉｃａｌ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｏｐ－ｄｏｗｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｄａｔａ，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．１５，１２３５－１２３８．
６３．Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，Ｚｈｕ，Ｚ．，Ｙｕａｎ，Ｊ．Ｑ．，Ｇｏｄｄａｒｄ，Ａ．，Ａｄａｍｓ，Ｃ．Ｗ．，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．＆Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．（１９９８）Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｏｕｔｅ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６，６７７－６８１．
６４．ｖａｎ ｄｅｒ Ｌａａｒｓｅ，Ｓ．Ａ．Ｍ．，ｖａｎ Ｇｅｌｄｅｒ，Ｃ．Ａ．Ｇ．Ｈ．，Ｂｅｒｎ，Ｍ．，Ａｋｅｒｏｙｄ，Ｍ．，Ｏｌｓｔｈｏｏｒｎ，Ｍ．Ｍ．Ａ．＆Ｈｅｃｋ，Ａ．Ｊ．Ｒ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐｒｏｌｉｎｅ ｉｎ（ｐｈｏｓｐｈｏ）ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，Ｔｈｅ ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ．ｎ／ａ．
６５．Ｉｓｅｎｍａｎ，Ｄ．Ｅ．，Ｄｏｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｋ．Ｊ．＆Ｐａｉｎｔｅｒ，Ｒ．Ｈ．（１９７５）Ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｄｏｍａｉｎｓ，ＩＩ Ｔｈｅ Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｃｈａｉｎ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｂｏｎｄｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｏｓｓｉｂｌｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ａｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ．１１４，１７２６－１７２９．
６６．Ｗｙｐｙｃｈ，Ｊ．，Ｌｉ，Ｍ．，Ｇｕｏ，Ａ．，Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｔ．，Ａｌｌｅｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．，Ｋｅｌｎｅｒ，Ｄ．Ｎ．，Ｆｌｙｎｎ，Ｇ．Ｃ．，Ｌｉｕ，Ｙ．Ｄ．，Ｂｏｎｄａｒｅｎｋｏ，Ｐ．Ｖ．，Ｒｉｃｃｉ，Ｍ．Ｓ．，Ｄｉｌｌｏｎ，Ｔ．Ｍ．＆Ｂａｌｌａｎｄ，Ａ．（２００８）Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ２ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｉｓｐｌａｙ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｓｏｆｏｒｍｓ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２８３，１６１９４－１６２０５．
６７．Ｒｅｓｅｍａｎｎ，Ａ．，Ｌｉｕ－Ｓｈｉｎ，Ｌ．，Ｔｒｅｍｉｎｔｉｎ，Ｇ．，Ｍａｌｈｏｔｒａ，Ａ．，Ｆｕｎｇ，Ａ．，Ｗａｎｇ，Ｆ．，Ｒａｔｎａｓｗａｍｙ，Ｇ．＆Ｓｕｃｋａｕ，Ｄ．（２０１８）Ｒａｐｉｄ，ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ ａｎｄ ＩｇＧ２ ｉｓｏｆｏｒｍ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，Ｍａｂｓ－Ａｕｓｔｉｎ．１０，１２００－１２１３．
６８．Ｒｏｓｅ，Ｒ．Ｊ．，Ｄａｍｏｃ，Ｅ．，Ｄｅｎｉｓｏｖ，Ｅ．，Ｍａｋａｒｏｖ，Ａ．＆Ｈｅｃｋ，Ａ．Ｊ．Ｒ．（２０１２）Ｈｉｇｈ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ｍａｓｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．９，１０８４－１０８６．
６９．ｖａｎ ｄｅ Ｗａｔｅｒｂｅｅｍｄ，Ｍ．，Ｆｏｒｔ，Ｋ．Ｌ．，Ｂｏｌｌ，Ｄ．，Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ－Ｓｚｙｂａ，Ｍ．，Ｒｏｕｔｈ，Ａ．，Ｍａｋａｒｏｖ，Ａ．＆Ｈｅｃｋ，Ａ．Ｊ．Ｒ．（２０１７）Ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｍａｓｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｎｖｅｉｌｓ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ ｉｎｔａｃｔ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１４，２８３－２８６．
７０．Ｔｅｍｌｙａｋｏｖ，Ｖ．（２００８）Ｇｒｅｅｄｙ Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｃｔａ Ｎｕｍｅｒｉｃａ（Ｉｓｅｒｌｅｓ，Ａ．，ｅｄ）ｐｐ．２３５－４０９，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ．
７１．Ｔｈｏｍｓｅｎ，Ｍ．Ｃ．Ｆ．＆Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．（２０１２）Ｓｅｑ２Ｌｏｇｏ：ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆｓ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｓｅｕｄｏ ｃｏｕｎｔｓ ａｎｄ ｔｗｏ－ｓｉｄｅｄ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４０，Ｗ２８１－Ｗ２８７．
Ｅ．表

【表1】

【表2】

【表3】

【表4】

【表5a】

【表5b】

【表6】

【表7】

【表8】

【表9】

【表10】

【表11】

【表12】

【表13】

【表14】

【表15】

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図4H】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図14A】

【図14B】

【図15】

【図16】

【配列表】

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