特許 7566378 アニソマイシン誘導体、アニソマイシン及びその誘導体をＧＬＰ－１Ｒ作動薬としての使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-10-04

(45)【発行日】2024-10-15

(54)【発明の名称】アニソマイシン誘導体、アニソマイシン及びその誘導体をＧＬＰ－１Ｒ作動薬としての使用方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/40 20060101AFI20241007BHJP

   A61K 31/155 20060101ALI20241007BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20241007BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20241007BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241007BHJP

【ＦＩ】

A61K31/40

A61K31/155

A61K45/00

A61P3/10

A61P43/00 105

A61P43/00 121

【請求項の数】 1

(21)【出願番号】P 2023544598

(86)(22)【出願日】2021-05-27

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-28

(86)【国際出願番号】 CN2021096473

(87)【国際公開番号】W WO2022160530

(87)【国際公開日】2022-08-04

【審査請求日】2023-08-22

(31)【優先権主張番号】202110103556.3

(32)【優先日】2021-01-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】518383024

【氏名又は名称】山西医科大学

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＸＩ ＭＥＤＩＣＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．５６ Ｘｉｎｊｉａｎ Ｓｏｕｔｈ Ｒｏａｄ Ｔａｉｙｕａｎ， Ｓｈａｎｘｉ ０３０００１ Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110002262

【氏名又は名称】ＴＲＹ国際弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】章 毅

(72)【発明者】

【氏名】薛 歓

(72)【発明者】

【氏名】張 敏

(72)【発明者】

【氏名】路 志紅

(72)【発明者】

【氏名】支 淋萍

(72)【発明者】

【氏名】温 芝潼

(72)【発明者】

【氏名】崔 麗娟

(72)【発明者】

【氏名】白 涛

(72)【発明者】

【氏名】劉 云峰

【審査官】愛清 哲

(56)【参考文献】

【文献】特開昭６２－０８９６５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０７－１９６６０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】Syntheses and biological evaluation of 1-heteroaryl-2-aryl- 1H-benzimidazole derivatives as c-Jun N-terminal kinase inhibitors with neuroprotective effects，Bioorganic & Medicinal Chemistry，2013年，21，pp.2271-2285，http://dx.doi.org/10.1016/j.bmc.2013.02.021

【文献】Paracrine neuroprotective effect of nitric oxide in the developing retina，Journal of Neurochemistry，2001年，76，pp.1233-1241

【文献】Astragaloside IV as Potential Antioxidant Against Diabetic Ketoacidosis in Juvenile Mice Through Activating JNK/Nrf2 Signaling Pathway，Archives of Medical Research，2020年，51，pp.654-663，https://doi.org/10.1016/j.arcmed.2020.06.013

【文献】Systems Approach to Pathogenic Mechanism of Type2 Diabetes and Drug Discovery Design Based on Deep Learning and Drug Design Specifcations，Int.J.Mol.Sci.，2020年12月26日，22,166，pp.1-33，https://doi.org/10.3390/ijms22010166

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／８０

Ａ６１Ｐ ３／００－ ３／１４

Ａ６１Ｐ ４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＧＬＰ－１Ｒ作動薬であって、アニソマイシン、化合物1、化合物2またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有し、

Ｒａ及びＲｂは独立に、Ｃ１－Ｃ６アルキル、及びＣ６－Ｃ２０アリールから選ばれることを特徴とするＧＬＰ－１Ｒ作動薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、医学の技術分野に属し、具体的には、アニソマイシン誘導体、アニソマイシン及びその誘導体をＧＬＰ－１Ｒ作動薬としての使用に関する。

【背景技術】

【0002】

グルカゴン様ペプチド－１（ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ－１、ＧＬＰ－１）は、消化管内のＬ細胞によって分泌され、グルコース及びその他の栄養素を摂取した後に血糖降下効果を発揮する。ＧＬＰ－１の生理学的効果に関する研究では、β細胞のインスリン分泌を促進するだけでなく、α細胞に作用することでグルカゴンの分泌を低減させ、それによってグリコーゲンの生産量を減少させ、中枢神経系や胃に作用して食欲を抑制し、胃内容排出を遅らせることによって、β細胞負荷が軽減することなどができる。しかし、ＧＬＰ－１は生体内でジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ－４）によって急速に分解されるため、その作用の持続時間が制限される。したがって、現在、血糖コントロールを改善するためのＧＬＰ－１ベースの方法には、外因性ＧＬＰ－１作用を模擬し、内因性ＧＬＰ－１の活性を延長する薬物が含まれる。ＧＬＰ－１受容体作動薬はこれに基づいて血糖降下効果を発揮する。

【0003】

これまでのところ、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）の治療に臨床で使用されているインスリンやスルホニル尿素などの従来の薬剤は、高血糖を効果的に軽減できるが、血糖を正常範囲に制御した後も血糖降下作用を発揮し続けることができ、Ｔ２ＤＭ患者に低血糖のリスクをもたらす。研究によると、ＧＬＰ－１受容体作動薬は、ＧＬＰ－１受容体（ＧＬＰ－１Ｒ）を介してグルコース濃度依存的にインスリン分泌を刺激することは、他の血糖降下薬に対するＧＬＰ－１受容体作動薬の最大の利点であり、低血糖のリスクが避けられる。さらに、ＧＬＰ－１受容体作動薬には、体重減少、心血管のベネフィット、アルツハイマー病や脂肪肝の改善など、血糖降下以外にもいくつかの効果がある。

【0004】

インクレチンは、食物刺激に応答して腸管細胞から分泌されるホルモンとして、食事に対するインスリンの反応を調節することができ、また、そのインスリン分泌促進作用は食後の総インスリン分泌量の約６０％を占め、血糖値の調節に重要な役割を果たしている。ＧＬＰ－１とグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）は２つの主要なインクレチンである。そのうち前者の分泌は、２型糖尿病患者（ひいては耐糖能異常患者）では著しく減少するため、重要な治療ターゲットとなっている。ＧＬＰ－１の生理的作用に関する研究では、β細胞の反応を増強させるだけでなく、α細胞に作用してグルカゴンの分泌を低下させ、それによってグリコーゲンの生産量を減少させ、摂食中枢や胃に作用して食欲を抑制し、胃内容排出を遅らせることによって、β細胞負荷を軽減することなどができる。しかし、ＧＬＰ－１は生体内でジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ－４）によって急速に分解されるため、その作用時間は制限される。したがって、現在、血糖コントロールを改善するためのＧＬＰ－１ベースの方法には、外因性ＧＬＰ－１作用を模擬し、内因性ＧＬＰ－１の活性を延長する薬物が含まれる。ＧＬＰ－１受容体作動薬はこれに基づいて血糖降下作用を発揮する。

【0005】

ＧＬＰ－１（７－３６）アミドはＧＬＰ－１の主な活性形態として、ＧＬＰ－１（７－３６）アミドが血液循環に入ると、血液及び細胞膜上のジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ－ＩＶ）によって急速に不活性型ＧＬＰ－１（９－３６）に分解され、その半減期はわずか１～２ｍｉｎであるため、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）の長期治療には適さない。さらに、科学的な研究では、半減期を延長し、生体内での生物学的効果を延長するために、ＧＬＰ－１の構造に対応する改造と修飾が行われている。糖尿病は、インスリン分泌（相対的または絶対的）不足またはインスリン作用障害による高血糖を特徴とする慢性疾患である。２型糖尿病は時間の経過とともに病状が悪化する進行性の疾患であり、通常の薬物治療を行っても長期間にわたって血糖を良好にコントロールすることは困難である。メトホルミン、スルホニル尿素、またはインスリン単剤で治療しても、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）の目標を継続的に達成することは困難である。その理由を探ると、β細胞の機能の進行的な減退と関係している。また、ＧＬＰ－１は、生体内でのインスリン合成を増加させ、β細胞の増殖と分化を促進し、β細胞のアポトーシスを抑制することができ、これらの特性は糖尿病の逆転または予防に役立つ可能性がある。

【0006】

糖尿病の治療または予防のための従来技術で知られているＧＬＰ－１Ｒ作動薬は、一般的に、リキシセナチド、リラグルチド、及びエクセナチドなどの高分子ポリペプチドであるが、これらは合成及び調製が難しく、コストが高く、注射による投与が必要なため患者のコンプライアンスが悪いが、小分子ＧＬＰ－１Ｒ作動薬の開発は患者のコンプライアンス、投薬の利便性を改善し、薬剤コストを削減するという点で、幅広い臨床市場の見通しを持っている。したがって、小分子構造に基づくＧＬＰ－１Ｒ作動薬の開発は、非常に重要な研究意義とビジネス価値がある。

【0007】

アニソマイシン（Ａｎｉｓｏｍｙｃｉｎ）の化学構造は次のとおりである。

【0008】

ＣＡＳ番号：２２８６２－７６－６、分子量：２６５．３０、化学名は（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）－２－［（４－メトキシフェニル）メチル］－３，４－ピロリジンジオール３－酢酸メチルエステルであり、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓから単離されたピロリジン系抗生物質である。アニソマイシンはタンパク質合成阻害剤であり、一部の真菌や病原体に対して優れた阻害効果を持ち、トリコモナスによる膣炎やアメーバなどによる赤痢の治療に臨床で使用され成功している。また、植物の真菌性疾患の防除にも広く使用されている。この研究では、アニソマイシンがＴリンパ球の反応性を明らかに抑制することができ、細胞毒性の現象は見られないことがわかった。アニソマイシンは、マウス皮膚移植の拒絶反応を抑制する効果があり、免疫抑制剤であるシクロスポリンＡよりも免疫抑制効果が高く、毒性が低いため、自己免疫疾患を治療するための免疫抑制剤の開発に試行可能である。さらに、アニソマイシンはｐ３８ＭＡＰＫ及びＪＮＫを活性化することができ、ｐ３８及びＪＮＫシグナル伝達経路は細胞の増殖と分化、アポトーシスなどのさまざまな細胞活動に関与し、アニソマイシンには潜在的な抗腫瘍活性があり、抗腫瘍薬の開発に使用できることが示唆されている。発明者は、アニソマイシンがＧＬＰ－１Ｒを作動させる効果を有し、インスリン分泌の促進、血糖降下、糖尿病の治療などＧＬＰ－１Ｒ作動薬として医療に使用できること、およびＧＬＰ－１Ｒ作動薬としての他の効果を有することを予想外に発見した。アニソマイシン及びその誘導体がＧＬＰ－１Ｒを作動させる作用があることはこれまで報告されていない。

【発明の概要】

【0009】

ＧＬＰ－１Ｒ受容体作動薬はすべて高分子ポリペプチドであるため、その合成及び応用に不利である従来技術の欠点を克服するために、本発明は、ＧＬＰ－１Ｒ作動薬の調製におけるアニソマイシンの使用を提供する。

【0010】

本発明の目的は、以下の技術的解決策によって実現される。

【0011】

一般式（Ｉ）で表されるアニソマイシン誘導体またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物及び立体異性体である。

【0012】

Ｒ_１は、水素、任意に置換されたＣ１－６アルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｒ_４から選ばれ；Ｒ_２は、水素、任意に置換されたＣ１－６アルキル、任意に置換されたＣ１－６アルコキシ、－ＮＨ－Ｒ４から選ばれ；Ｒ_３は、水素、任意に置換されたＣ１－６アルキル、任意に置換されたＣ１－６アルキル、任意に置換されたＣ６－１２アリール、任意に置換されたヘテロアリール、－Ｃ（Ｏ）Ｒ_４から選ばれ；Ｒ_４は、Ｈ、任意に置換されたＣ１－６アルキル、任意に置換されたＣ１－６アルコキシから選ばれ；Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８は独立して、ハロゲン原子、ニトロ、－ＣＯＯＲ_９、ＣＯＮＨＲ_９、任意に置換されたＣ１－６アルキル、任意に置換されたＣ１－６アルコキシから選ばれ；Ｒ_９は、Ｈ、任意に置換されたＣ１－６アルキルから選ばれ；一般式（Ｉ）の化合物がアニソマイシンではないことが条件である。

【0013】

好ましくは、本発明により提供されるアニソマイシン誘導体は、以下の化合物１及び化合物２である。

【0014】

Ｒａ、Ｒｂは、任意に置換されたＣ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ６－Ｃ２０アリールから独立に選ばれる。

【0015】

前記Ｃ１－Ｃ６アルキルは、メチル、エチル、プロピル、ブチルから選ばれ、Ｃ６－２０アリールはフェニル、ナフチル、アントラセニルから選ばれ、前記任意の置換とは、任意のＨ原子がヒドロキシル基、ハロゲン原子、ニトロ基、Ｃ１－４アルキル基、またはＣ１－４アルコキシ基で置換されることを意味する。

【0016】

ＧＬＰ－１Ｒ作動薬であって、アニソマイシン、式（１）に表されるアニソマイシン誘導体、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体の少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする。

【0017】

前記誘導体には、アニソマイシンを母体としていくつかの基置換または反応して得られた生成物、例えば、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、アリール基またはヘテロアリール基で置換されたもの、または反応性官能基を有する他の物質と反応することにより得られる生成物、例えば、エステル化、エーテル化、アミド化、エステル交換などの反応生成物、またはその塩、例えば第四級アンモニウム塩、あるいはその重水素化誘導体を含み、重水素化水素は特に限定されないが、アミン基上の水素や水酸基上の水素などの活性水素が好ましい。

【0018】

ＧＬＰ－１Ｒ作動薬の調製におけるアニスマイシン、式（Ｉ）で表されるアニスマイシン誘導体またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体の少なくとも１種の使用。

【0019】

さらに、本発明は、ＧＬＰ－１Ｒが媒介する疾患を治療する薬剤の調製におけるアニソマイシン、式（Ｉ）で表されるアニソマイシン誘導体、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、及び立体異性体の少なくとも１種の使用を提供する。

【0020】

前記ＧＬＰ－１Ｒが媒介する疾患としては、肥満、糖尿病、体重減少、収縮圧低下、てんかん、脳虚血性疾患、アルツハイマー病、脂肪肝、脂質異常症の改善、及び神経保護などが含まれるが、これらに限定されない。

【0021】

本発明はまた、糖尿病、脂質異常症、メタボリックシンドローム、高インスリン血症、夜間低血糖、肥満、体重減少、収縮圧の低下アルツハイマー病の改善、脂肪肝、神経保護の治療薬を調製するためのアニソマイシン、式（Ｉ）で表されるアニソマイシン誘導体、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、及び立体異性体の少なくとも１種の使用を提供する。

【0022】

好ましくは、前記糖尿病は２型糖尿病から選ばれる。

【0023】

本発明者は、アニソマイシン及びその誘導体がＧＬＰ－１Ｒ作動薬としての作用を有し、糖尿病の治療薬として使用できることを予想外に発見した。ＧＬＰ－１受容体（ＧＬＰ－１Ｒ）を介してグルコース濃度依存的にインスリン分泌を刺激し、つまり、インスリン分泌の促進作用は特定の血糖濃度では発揮し、より低い血糖濃度では発揮しない。そのため、糖尿病の治療と同時に低血糖も避けられる。これが、通常の薬剤と比べ、糖尿病治療薬としてのＧＬＰ－１Ｒ作動薬の利点である。

【0024】

さらに、本発明は、アニソマイシン、式（Ｉ）で表されるアニソマイシン誘導体、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体の少なくとも１種を有効成分とするＧＬＰ－ＧＬＰ１Ｒ作動薬を提供し、有効量が０．５－５０ｍｇ／ｋｇで、好ましくは、有効量は５－３０ｍｇ／ｋｇである。

【0025】

本発明はまた、アニソマイシン、式（I）で表されるアニソマイシン誘導体、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体の少なくとも１種を有効成分として含有するＧＬＰ－１Ｒ作動薬活性を有する医薬組成物を提供する。

【0026】

さらに、本発明はアニソマイシン、式（I）で表されるアニソマイシン誘導体、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、立体異性体の少なくとも１種を有効成分として含有する糖尿病の治療または予防のための医薬組成物を提供する。

【0027】

前記医薬組成物はさらに、メトホルミン、ＳＧＬＴ－２阻害剤など及び補助物質を含むことができる。

【0028】

前記医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、注射剤などの当該技術分野で周知の剤形で使用される。

【0029】

特に、本発明は、血中のグルコースレベルを低下させる方法を提供し、具体的にはアニソマイシンまたはその誘導体、塩、及び溶媒和物の少なくとも１種の有効用量を投与する。

【0030】

本発明のアニソマイシン及びその誘導体のＧＬＰ－１Ｒ作動薬効果は血糖濃度依存性があるため、本発明の上記方法は、糖尿病の治療又は予防のみならず、低血糖の発生を効果的に軽減することができる。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1】ラットのインスリン分泌に対するアニソマイシンの影響である。

【図2】ラットのインスリン分泌に対する異なる用量のアニソマイシンの影響である。

【図3】異なるグルコース濃度下でのラットのインスリン分泌に対するアニソマイシンの影響である。

【図4】ＧＬＰ－１ＲブロッカーＥｘｅｎｄｉｎ（９－３９）の存在下または非存在下でのラットのインスリン分泌に対するアニソマイシンの影響である。

【図5】アニソマイシンとＧＬＰ－１Ｒの親和性のＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ分子相互作用検出である。

【図6】Ａは経口グルコース負荷試験における血糖値の経時変化であり；Ｂは血糖曲線下面積である。

【発明を実施するための形態】

【0032】

調製例
アニソマイシンを原料として、以下の合成ルートに従ってさまざまなアニソマイシン誘導体を得た。

【0033】

実施例１
以下、本発明で使用される材料及び方法を説明する。

【0034】

１．１実験動物
体重１８０～２５０ｇの雄のＷｉｓｔａｒラットを山西省人民病院の実験動物センターから購入し、２０～２２℃の温度で飼育し、標準的なげっ歯類の餌と飲料水を備えている。すべての操作手順は、山西医科大学の実験動物の管理及び使用ガイドラインに適合している。

【0035】

１．２主な薬剤と試薬

【0036】

２．主な実験器具

【0037】

３．ラット膵島組織の単離及び培養は、当業者の通常の実験操作である。

【0038】

４．データ処理と統計
関連するデータはＳｉｇｍａＰｌｏｔ１２．５ソフトウェアで処理され、±ＳＥＭで表される。Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ‐ｔｅｓｔ、ｏｎｅ‐ｗａｙ ＡＮＯＶＡまたはｐａｉｒｅｄｔ‐ｔｅｓｔを用いて統計分析を行い、ｐ＜０．０５の場合に統計学的意義があると考えられる。

【0039】

具体的な操作
５．１ラットのインスリン分泌に対するアニソマイシンの影響

【0040】

実験前の準備：１）実験は４群に分けられ、Ｅｐ（エッペンドルフ）チューブに番号を付け（各群に７個）、２）ＫＲＢＨ溶液を調製し、インキュベーター内で３０分間インキュベートし、ＮａＯＨでｐＨを７．４まで調整し、３）テストするサンプルの２．８ｍｍｏｌ／Ｌグルコース溶液（２．８Ｇ）、２．８Ｇ＋１０μＭアニソマイシン、１１．１ｍｍｏｌ／Ｌグルコース溶液（１１．１Ｇ）、１１．１Ｇ＋１０μＭアニソマイシンを調製する。

【0041】

実験手順：１）各Ｅｐチューブに５００μＬの２．８Ｇを加え、実体顕微鏡下で５個の膵島（均一なサイズで、滑らかなエッジ）をＥｐチューブに採取し、インキュベーター内に３０分間インキュベートし、２）膵島を吸い取らないようにピペットガンを使用して上澄み液を吸引して廃棄し、その後５００μＬ２．８Ｇ、２．８Ｇ＋１０μＭアニソマイシン、１１．１Ｇ、１１．１Ｇ＋１０μＭアニソマイシンを各群に順番に加え、インキュベーター内で３０分間インキュベートし、３）ピペットガンを使用して上澄み液をあらかじめマークされたＥｐチューブに吸い出し、よく混合し、密封し、４°Ｃで保存する。インスリン放射免疫により各群のインスリン含有量を測定する。

【0042】

実験結果を図１に示すように、ラットのインスリン分泌に対するアニソマイシンの影響としては、＋アニソマイシンはアニソマイシンを一定量添加することを意味し、以下の図も同様の意味を示す。ラット膵島を、それぞれ低グルコース（２．８Ｇ）及び高グルコース（１１．１Ｇ）下でアニソマイシン（１０μＭ）でインキュベートする。ｎ＝７．＊＊＊Ｐ＜０．００１である。基礎グルコース濃度（２．８Ｇ）下では、アニソマイシンはインスリン分泌の促進に役割を果たさなかった。高グルコース濃度（１１．１Ｇ）では、アニソマイシンによるインスリン分泌促進作用が顕著である促進効果。これは、アニソマイシンが高血糖下でインスリン分泌を促進することを示している。

【0043】

５．２ラットのインスリン分泌に対する異なる用量のアニソマイシンの影響

【0044】

実験前の準備：１）実験は４群に分けられ、Ｅｐ（エッペンドルフ）チューブに番号を付け（各群に７個）、２）テストするサンプルの２．８ｍｍｏｌ／Ｌグルコース溶液（２．８Ｇ）、１１．１ｍｍｏｌ／Ｌグルコース溶液（１１．１Ｇ）、１１．１Ｇ＋０．１μＭアニソマイシン、１１．１Ｇ＋１μＭアニソマイシン、１１．１Ｇ＋１０μＭアニソマイシンを調製する。

【0045】

実験手順：１）２．８Ｇで３０分間プレインキュベーションし、２）Ｅｐチューブを取り出し、上澄み液を捨て、５００μＬ１１．１Ｇ、１１．１Ｇ＋０．１μＭアニソマイシン、１１．１Ｇ＋１μＭアニソマイシン、１１．１Ｇ＋１０μＭアニソマイシンを各群に順番に加え、インキュベーター内で３０分間インキュベートし、３）上澄み液をあらかじめマークされたＥｐチューブに吸い出し、よく混合し、密封し、４°Ｃで保存する。インスリン放射免疫により各群のインスリン含有量を測定する。

【0046】

実験結果を図２に示すように、ラットのインスリン分泌に対する異なる用量のアニソマイシンの影響である。ラット膵島を、１１．１ｍｍｏｌ／Ｌグルコース（１１．１Ｇ）の濃度で異なる濃度のアニソマイシン（０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ）でインキュベートした。ｎ＝７．＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１である。１１．１ｍｍｏｌ／Ｌグルコース（１１．１Ｇ）単独の投与と比較し、アニソマイシン濃度の増加に伴い、アニソマイシンのインスリン促進効果は徐々に強化され、さらにアニソマイシンの濃度が１μＭ及び１０μＭである場合、顕著なインスリン分泌促進効果が見られた。したがって、アニソマイシンは、高グルコース（１１．１Ｇ）において濃度依存的なインスリン分泌促進効果を示す。

【0047】

５．３異なるグルコース濃度下でのラット島におけるインスリン分泌に対するアニソマイシンの影響

【0048】

実験前の準備：１）実験は３群に分けられ、Ｅｐ（エッペンドルフ）チューブに番号を付け（各群に７個）、３）テストするサンプルの２．８ｍｍｏｌ／Ｌグルコース溶液（２．８Ｇ）、２．８Ｇ＋１０μＭアニソマイシン、１１．１ｍｍｏｌ／Ｌグルコース溶液（１１．１Ｇ）、１１．１Ｇ＋１０μＭアニソマイシン、１６．７ｍｍｏｌ／Ｌグルコース溶液（１６．７Ｇ）、１６．７Ｇ＋１０μＭアニソマイシンを調製する。

【0049】

実験手順：１）２．８Ｇで３０分間プレインキュベーションし、２）Ｅｐチューブを取り出し、上澄み液を捨て、５００μＬの２．８Ｇ、１１．１Ｇ、１６．７Ｇを各群に順番に加え、インキュベーター内で３０分間インキュベートし、３）上澄み液をあらかじめマークされたＥｐチューブに吸引し、よく混合し、密封して４°Ｃで保存し、前回の投薬順に５００μＬの２．８Ｇ＋１０μＭアニソマイシン、１１．１Ｇ＋１０μＭアニスマイシン、１６．７Ｇ＋１０μＭアニソマイシンを加え、インキュベーター内で３０分間インキュベートし、４）Ｅｐチューブを取り出し、上澄み液を番号の付いたＥｐチューブに吸い出し、よく混ぜて密閉し、４℃で保存する。インスリ（ＩＮＳ）ン放射免疫により各群のインスリン含有量を測定する。

【0050】

実験結果を図３に示すように、異なるグルコース濃度下でのラットのインスリン分泌に対するアニソマイシンの効果である。ラット島を、２．８ｍｍｏｌ／Ｌグルコース溶液（２．８Ｇ）、１１．１ｍｍｏｌ／Ｌグルコース溶液（１１．１Ｇ）及び１６．７ｍｍｏｌ／Ｌグルコース溶液（１６．７Ｇ）の濃度で、１０μＭアニソマイシンでインキュベートし、ｎ＝７，＊ｐ＜０．５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１である。基礎グルコース濃度（２．８Ｇ）では、アニソマイシンにはインスリン促進効果がないが、１１．１ｍｍｏｌ／Ｌグルコース溶液（１１．１Ｇ）の濃度では、アニソマイシンはインスリン分泌を顕著に促進した。グルコース濃度の増加に伴い、１６．７ｍｍｏｌ／Ｌグルコース溶液（１６．７Ｇ）の濃度では、アニソマイシンはインスリン分泌をさらに促進することができ、かつ有意な差が見られる。したがって、アニソマイシンはグルコース濃度依存的なインスリン促進効果を示す。アニソマイシンは血糖濃度に依存するため、糖尿病の治療または予防時に低血糖の発生を回避できることも説明できる。

【0051】

実施例２ラットにおけるインスリン分泌のアニソマイシン調節におけるＧＬＰ－１Ｒの役割

【0052】

１．１検査試薬

【0053】

１．２主な実験装置

【0054】

２．１アニソマイシンによるインスリン分泌の調節におけるＧＬＰ－１Ｒの役割

【0055】

実験前の準備：１）実験は４群に分けられ、Ｅｐ（エッペンドルフ）チューブに番号を付け（各群に７個）、２）テストするサンプルの２．８ｍｍｏｌ／Ｌグルコース溶液（２．８Ｇ）、１１．１ｍｍｏｌ／Ｌグルコース溶液（１１．１Ｇ）、１１．１Ｇ＋１００ｎＭＥｘｅｎｄｉｎ（９－３９）、１１．１Ｇ＋１０μＭアニソマイシン、１１．１Ｇ＋１００ｎＭＥｘｅｎｄｉｎ（９－３９）＋１０μＭアニソマイシンを調製する。

【0056】

実験手順：１）２．８Ｇで３０分間プレインキュベーションを行い、２）Ｅｐチューブを取り出し、上澄み液を捨て、５００μＬ１１．１Ｇ、１１．１Ｇ＋０．１μＭアニソマイシン、１１．１Ｇ＋１μＭアニソマイシン、１１．１Ｇ＋１０μＭアニソマイシンを各群に順番に加え、インキュベーター内で３０分間インキュベートし、３）ピペットガンを使用して上澄み液をあらかじめマークされたＥｐチューブに吸い出し、よく混合し、密封し、４°Ｃで保存する。インスリン放射免疫により各群のインスリン含有量を測定する。

【0057】

実験結果は図４に示すように、アニソマイシンによるインスリン分泌の調節におけるＧＬＰ－１Ｒの役割を示している。ラット膵島を、１１．１ｍｍｏｌ／Ｌグルコース溶液（１１．１Ｇ）の濃度で１０μＭアニソマイシン及び１００ｎＭエキセンジン（９－３９）でインキュベートし、ｎ＝７，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１である。Ｅｘｅｎｄｉｎ（９－３９）は、ＧＬＰ－１Ｒに対するＧＬＰ－１Ｒ作動薬の作動薬効果をブロックできる、特異的な競合的ＧＬＰ－１Ｒアンタゴニストである。１１．１ｍｍｏｌ／Ｌグルコース溶液（１１．１Ｇ）の濃度では、Ｅｘｅｎｄｉｎ（９－３９）がアニソマイシンのインスリン促進効果を遮断し、アニソマイシンのインスリン促進効果がＧＬＰ－１Ｒの刺激に関連していることが示された。

【0058】

２．２アニソマイシンとＧＬＰ－１Ｒの親和性のＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ分子相互作用検出

【0059】

無細胞ＧＬＰ－１Ｒタンパク質の発現：１）ラットＧＬＰ－１Ｒベクターを構築する。ラットＧＬＰ－１Ｒの配列断片をＰＣＲ増幅技術により取得し、ＧＬＰ－１Ｒラット遺伝子断片をアガロースゲルにより回収し、標的遺伝子ＧＬＰ－１ＲをベクターｐＥＸ－３にクローニングし、ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ二重酵素切断であるｐＥＸ－３を用いて、電気泳動し、ベクターｐＥＸ－３を回収し、ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓRＥｎｔｒｙＯｎｅＳｔｅｐＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを使用して、増幅されたフラグメントをｐＥＸ－３ベクターに組換えクローニングする。組換えライゲーション産物をコンピテントセルに変換し、クローン化されたコロニーを選択し、少量抽出してプラスミドを取得し、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ二重酵素切断で同定し、電気泳動を行い、陽性クローンを選択する。組換えプラスミドの配列を決定して検証した後、大量の抽出を実施し、陽性クローンを取り、組換えプラスミドの配列測定検証後に大量抽出を行い、陽性クローンに対応する菌液の配列測定を行い、残りの菌液はグリセリンで保存した。配列決定結果を標的遺伝子配列と比較し、検証が正しければ、グリセロール細菌溶液をＬＢ培地に接種し、大量のプラスミドを抽出し、十分な量の組換えプラスミドを取得し、２）無細胞ＧＬＰ－１Ｒタンパク質の発現：Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｊｉｎ Ａｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．Ｚ１ハイフィディリティＤＮＡポリメラーゼＧ－ＰＯＬ－００１またはＺ２ウルトラフィディリティＤＮＡポリメラーゼＧ－ＰＯＬ－００２を使用して標的遺伝子を増幅し、タンパク質発現の成功率を向上させるために、それぞれ大腸菌透析型無細胞タンパク質発現系、ＴＯＢ透析型無細胞タンパク質発現系、酵母透析型無細胞タンパク質発現系を用いて発現し、最終的に発現結果をＳＤＳ－ＰＡＧＥで観察する。

【0060】

ＧＬＰ－１Ｒタンパク質の精製と濃縮：１）Ｈｉｓｔｒａｐカラムを使用して標的タンパク質を精製し、２）精製サンプルを取得し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを実行して精製結果を観察する。

【0061】

ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ分子相互作用の実験手順：１）モル比１：１により、ＧＬＰ－１Ｒタンパク質をビオチン化し、適量のビオチン化試薬を加え、３０℃のウォーターバス中で２時間反応させ、反応後、重力脱塩カラムを用いて余分なビオチンを除去し、ＰＢＳで溶出し、ＳＳＡチップの固化に使われ、２）化合物をＤＭＳＯで溶解し、完全に溶解した後、ＰＢＳＴで１００倍に希釈し、その後の検出のために１％ＤＭＳＯ＋ＰＢＳＴで２１．２μＭ、４２．４μＭ、８４．８μＭ、１６９．５μＭ、３３９μＭにそれぞれ希釈し、３）上記のサンプルと試薬をサンプルプレートに順番に加え、４）プログラムを設定し、テストを実行する。

【0062】

Ｋｏｎは分子間の結合の速度を表す結合速度定数であり、Ｋｏｆｆは分子間の解離速度を表す解離速度定数であり、Ｋｄは解離定数であり、標的に対する化合物の親和性を反映し、値が小さいほど親和性が強くなる（Ｋｄ＝Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）。低分子（＜２ｋＤａ）に対し、Ｋｄ値は１０－４～１０－７Ｍにあれば、強い親和性を示す。結果を図５に示すように、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ分子相互作用の結果は、アニソマイシンＫｄ＝２．４１×１０－０４Ｍを示し、アニソマイシンがＧＬＰ－１Ｒと強い親和性を有することを示している。

【0063】

実施例１及び実施例２のデータから、アニソマイシンはより高い血糖濃度で効果的にインスリン分泌を促進することができ、一定の血糖濃度依存性を有することがわかった。さらに、ＧＬＰ－１Ｒアンタゴニストの作用下では、インスリン分泌促進効果が低下または消失することから、ＧＬＰ－１Ｒがアニソマイシンのインスリン分泌促進効果を媒介していることが示された。本発明はまた、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ分子相互作用検出を通じて、アニソマイシンとＧＬＰ－１Ｒとの間に明らかな相互作用及び強い親和性が存在することを証明した。上記のデータは、アニソマイシンが有効な小分子ＧＬＰ－１Ｒ作動薬であることを十分に説明できる。

【0064】

実施例３Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける血糖に対するアニソマイシンの影響

【0065】

１．材料と方法
１．１実験動物
体重１８～２２ｇの雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスは山西省人民病院の実験動物センターから購入し、飼育温度が２０～２２℃であり、標準的なげっ歯類の餌と飲料水を備えている。すべての操作手順は、山西医科大学の実験動物の管理及び使用ガイドラインに適合している。

【0066】

１．２主な薬剤と試薬

【0067】

１．３主な実験装置

【0068】

１．４データ処理と統計
関連するデータはＳｉｇｍａＰｌｏｔ１２．５ソフトウェアで処理され、±ＳＥＭで表される。Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ‐ｔｅｓｔ、ｏｎｅ‐ｗａｙ ＡＮＯＶＡまたはｐａｉｒｅｄｔ‐ｔｅｓｔを用いて統計分析を行い、ｐ＜０．０５の場合に統計学的意義があると考えられる。

【0069】

２実験結果
２．１経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）
薬剤の調製：アニソマイシンをＤＭＳＯに溶解し、次にＰＥＧ２００を添加し、最後に生理食塩水で希釈する（ＤＭＳＯ：ＰＥＧ２００：生理食塩水＝１：４：５）。

【0070】

ＳＰＦグレードの６週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス２１匹を１週間適応的に飼育したら、ランダムに以下の３群に分ける。対照群：溶媒の腹腔内注射（ＤＭＳＯ：ＰＥＧ２００：生理食塩水＝１：４：５）、５ｍｇ／ｋｇアニソマイシン群：５ｍｇ／ｋｇアニソマイシン溶液の腹腔内注射、１５ｍｇ／ｋｇ群アニソマイシン：アニソマイシン溶液１５ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射、投与体積は０．１ｍｌ／１０ｇで、各群７匹で、自由に飲み食いさせる。実験前に各群のマウスは１２時間断食して水を禁止せず、実験当日、各群のマウスは投与後４０％グルコース溶液（２ｍｇ／ｋｇ）を胃内注入し、胃内注入後０ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎで尾静脈採血を行い、血糖値を血糖計で測定し、血糖曲線下面積（ＡＵＣ）を算出する。

【0071】

実験結果は図６に示すように、Ａは経口グルコース耐量試験（ＯＧＴＴ）血糖の経時変化グラフを示し、Ｂは血糖曲線下面積図である。アニスマイシン投与群は、対照群と比較してグルコース経口投与後、糖負荷への耐性が異なる程度に向上し、そのうち１５ｍｇ／ｋｇアニスマイシンは５ｍｇ／ｋｇアニスマイシンよりも降糖効果が顕著であることがわかる（ｎ＝７，＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。

【0072】

実施例４ラットにおけるインスリン分泌に対するアニソマイシン誘導体の影響
化合物１－１、１－２、２－１、２－２は調製例で調整した。

【0073】

実験前の準備：１）実験は４群に分けられ、Ｅｐ（エッペンドルフ）チューブに番号を付け（各群に７個）、２）ＫＲＢＨ溶液を調製し、インキュベーター内で３０分間インキュベートし、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整し、３）テストするサンプルの２．８ｍｍｏｌ／Ｌグルコース溶液（２．８Ｇ）、２．８Ｇ＋１０μＭ化合物１－１、２．８＋１０μＭ化合物１－２、２．８Ｇ＋１０μＭ化合物２－１、２．８Ｇ＋１０μＭ化合物２－２、１１．１ｍｍｏｌ／Ｌグルコース溶液（１１．１Ｇ）、１１．１Ｇ＋１０μＭ化合物１－１、１１．１Ｇ＋１０μＭ化合物１－２、１１．１Ｇ＋１０μＭ化合物２－１、１１．１Ｇ＋１０μＭ化合物２－２を調製する。

【0074】

実験手順：１）各Ｅｐチューブに５００μＬの２．８Ｇを加え、実体顕微鏡下で５個の膵島（均一なサイズ、滑らかなエッジ）をＥｐチューブに採取し、インキュベーター内で３０分間インキュベートし、２）ピペットガンを使用して上澄み液を吸引して捨て、膵島を吸い取らないように注意し、５００μＬ２．８Ｇ、２．８Ｇ＋１０μＭ化合物１－１、２．８＋１０μＭ化合物１－２、２．８Ｇ＋１０μＭ化合物２－１、２．８Ｇ＋１０μＭ化合物２－２、１１．１Ｇ、１１．１Ｇ＋１０μＭ化合物１－１、１１．１Ｇ＋１０μＭ化合物１－２、１１．１Ｇ＋１０μＭ化合物２－１、１１．１Ｇ＋１０μＭ化合物２－２を加え、インキュベーターに入れて３０分間インキュベートし、３）ピペットガンを使用して上澄み液をあらかじめマークされたＥｐチューブに吸い出し、よく混合し、密封し、４°Ｃで保存する。インスリン放射免疫により各群のインスリン含有量を測定する。

【0075】

実験結果を表１に示すように、ラットのインスリン分泌に対するアニソマイシン誘導体の効果である。２．８Ｇ群と比較して、各アニソマイシン誘導体（１０μＭ）は低血糖下（２．８Ｇ）でインスリン促進効果を示さなかった。１１．１ Ｇ群と比較して、各アニスマイシン誘導体（１０μＭ）は高糖（１１．１ Ｇ）下でインスリン分泌促進作用が顕著であった。（ｎ＝７．＊＊Ｐ＜０．０１，＊Ｐ＜０．０５）
表１

【0076】

表１のデータから、高血糖濃度下でのインスリン分泌促進に対するアニソマイシンの明らかな効果に加え、一部のアニソマイシン誘導体も同様の生理活性を有することがわかった。本出願は、限られた数の誘導体、すなわちいくつかの基置換を具体的に実施したが、本発明の実質は、アニソマイシン及び同じ親核を有するその誘導体が高血糖濃度でインスリン分泌を促進する効果を有するという創造的な発見にある。さらにこの効果はＧＬＰ－１Ｒの作動によって発揮されることから、このような化合物は効果的な小分子ＧＬＰ－１Ｒ作動薬の一種であることが示されており、化合物への保護は上記の特定の誘導体に限定されるべきではない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】