特許 7566637 混合物からポリペプチドを調製するための複数の疎水性相互作用クロマトグラフィーの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-10-04

(45)【発行日】2024-10-15

(54)【発明の名称】混合物からポリペプチドを調製するための複数の疎水性相互作用クロマトグラフィーの使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/20 20060101AFI20241007BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20241007BHJP

   G01N 30/46 20060101ALI20241007BHJP

   G01N 30/38 20060101ALI20241007BHJP

   B01D 15/32 20060101ALI20241007BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20241007BHJP

【ＦＩ】

C07K1/20

G01N30/88 J

G01N30/46 A

G01N30/38

B01D15/32

C07K16/00

【請求項の数】 18

(21)【出願番号】P 2020572544

(86)(22)【出願日】2019-07-01

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-11-04

(86)【国際出願番号】 US2019040148

(87)【国際公開番号】W WO2020010004

(87)【国際公開日】2020-01-09

【審査請求日】2022-05-26

(31)【優先権主張番号】62/693,024

(32)【優先日】2018-07-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】597160510

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100152489

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 美樹

(72)【発明者】

【氏名】リヴィーニ、イザベル

(72)【発明者】

【氏名】マクダーモット、ステファニー

(72)【発明者】

【氏名】ライリー、ジェームズ

(72)【発明者】

【氏名】マッティラ、ジョン

【審査官】植原 克典

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１５－５２０６６７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１０－５３００６８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００９－５１１９００（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

ＰｕｂＭｅｄ

Ｇｏｏｇｌｅ／Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

標的ポリペプチドを含む混合物から標的ポリペプチドを調製する方法であって、
標的ポリペプチドを含む混合物を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）装置の１つ以上のクロマトグラフィーカラム及び出口を有する第１のゾーンに接触させること、
標的ポリペプチドを含む流出物をＨＩＣ装置の第１のゾーンからＨＩＣ装置の第２のゾーンに通過させること、
１つ以上の移動相を、ＨＩＣ装置の１つ以上のクロマトグラフィーカラム及び出口を有する第２のゾーンに接触させること、及び、
標的ポリペプチドを、ＨＩＣ装置の少なくとも第１及び第２のゾーンの出口に通すこと
を含み、
第１のゾーンにおける標的ポリペプチドを含む混合物の滞留時間及び第２のゾーンにおける標的ポリペプチドを含む混合物の滞留時間の合計は、第２のゾーンにおける前記１つ以上の移動相の滞留時間と実質的に同じになるように構成される方法。

【請求項2】

標的ポリペプチドはモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記１つ以上の移動相は平衡化バッファー及び洗浄バッファーを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記１つ以上の移動相をＨＩＣ装置の第２のゾーンに接触させることは、
洗浄バッファーをＨＩＣ装置の第２のゾーンに接触させること、及び
洗浄バッファーをＨＩＣ装置の第２のゾーンに接触させた後、第２のゾーンを再生することを含み、第２のゾーンを再生させることは、
水をＨＩＣ装置の第２のゾーンに接触させること、
アルカリ溶液をＨＩＣ装置の第２のゾーンに接触させること、
アルコール溶液をＨＩＣ装置の第２のゾーンに接触させること、及び
平衡化バッファーをＨＩＣ装置の第２のゾーンに接触させることを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

洗浄バッファーをＨＩＣ装置の第２のゾーンに接触させた後、標的ポリペプチドをＨＩＣ装置の第２のゾーンの出口に通す、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

滞留溶液の紫外線吸収率、電気伝導率、又はｐＨのうちの１つ以上が、第１のゾーン又は第２のゾーンのいずれかの出口で測定される、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

標的ポリペプチドは、５０ｇ／Ｌ・時以上の生産性で調製される、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

第１のゾーン又は第２のゾーンは２つ以上のクロマトグラフィーカラムを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

ＨＩＣ装置は、１つ以上のクロマトグラフィーカラム及び出口を有する第３のゾーンをさらに含み、前記方法は、
第３のゾーンで再生サイクルを実行することをさらに含み、再生サイクルを実行することは、１つ以上の移動相を第３のゾーンに接触させることを含み、再生サイクルの持続時間は、標的ポリペプチドを含む混合物の第１のゾーンにおける滞留時間と実質的に同じになるように構成される、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

標的ポリペプチドを含む混合物から標的ポリペプチドを調製する方法であって、
標的ポリペプチドを含む混合物を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）装置の複数のクロマトグラフィーカラムであって、複数のカラムのそれぞれは、複数のカラムのうちの別のカラムに接続可能な出口を含む複数のクロマトグラフィーカラムのうちの第１のカラムに通すこと、
第１のカラムからの標的ポリペプチドを含む流出物を、複数のカラムのうちの第２のカラムに通すこと、
１つ以上の移動相を、複数のカラムのうちの第３のカラムに通すこと、及び、
標的ポリペプチドを、複数のカラムのそれぞれの出口に通すことを含み、第１のカラム及び第２のカラムにおける標的ポリペプチドを含む混合物の滞留時間の合計は、第３のカラムにおける前記１つ以上の移動相の滞留時間の合計と実質的に同じである方法。

【請求項11】

１つ以上の移動相を複数のカラムのそれぞれに通すことをさらに含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

１つ以上の移動相をカラムに通すことは、
洗浄バッファーをカラムに通すこと、及び
洗浄バッファーをカラムに通した後、カラムを再生することを含み、カラムを再生することは、水、アルカリ性溶液、アルコール溶液、又は平衡化バッファーをカラムに通すことを含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

標的ポリペプチドをカラムの出口に通すステップは、洗浄バッファーをカラムに通した後に行われる、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

滞留溶液の紫外線吸収率、電気伝導率、又はｐＨのうちの１つ以上が、第１のカラム又は第２のカラムのいずれかの出口で測定される、請求項１０に記載の方法。

【請求項15】

標的ポリペプチドは５０ｇ／Ｌ・時以上の生産性で調製される、請求項１０に記載の方法。

【請求項16】

ＨＩＣ装置は４つのカラムを含み、第１のカラム及び第２のカラムにおける標的ポリペプチドを含む混合物の滞留時間の合計は、第３のカラム及び第４のカラムの再生時間の合計と実質的に同じである、請求項１２に記載の方法。

【請求項17】

複数のクロマトグラフィーカラムを使用して抗体を調製する方法であって、複数のクロマトグラフィーカラムのそれぞれは疎水性相互作用媒体を含み、前記方法は、
第１段階において、
抗体を含むある量の混合物を、複数のカラムのうちの第１のカラムに負荷すること、
第１のカラムを介して、ある量の前記混合物を複数のカラムのうちの第２のカラムに負荷すること、及び、
複数のカラムのうちの第３のカラムにおいて、洗浄、ストリッピング、及び平衡化プロセスのうちの少なくとも１つを含む非負荷ステップを実行すること；
第２段階において、
前記抗体を含むある量の前記混合物を第２のカラムに負荷すること、
第２のカラムを介して、ある量の前記混合物を第３のカラムに負荷すること、及び、
第１のカラムにおいて、洗浄、ストリッピング、及び平衡化プロセスのうちの少なくとも１つを含む非負荷ステップを実行すること；及び、
第３段階において、
前記抗体を含むある量の前記混合物を第３のカラムに負荷すること、
第３のカラムを介して、ある量の前記混合物を第１のカラムに負荷すること、及び、
第２のカラムにおいて、洗浄、ストリッピング、及び平衡化プロセスのうちの少なくとも１つを含む非負荷ステップを実行すること
を含み、
前記抗体は約５０ｇ／Ｌ・時以上の生産性で調製され、前記方法は、少なくとも約１．３の高分子量分子クリアランス率（ＨＭＷ ＣＦ）を有し、
負荷ステップのうちの１つの期間は、非負荷ステップの期間と実質的に同じになるように構成される、方法。

【請求項18】

前記第１、第２、及び第３段階をサイクル式に連続して繰り返すことをさらに含み、各段階は負荷ステップ及び非負荷ステップを同時に実行することを含む、請求項１７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、一般に、ポリペプチドを調製するための方法に関する。より具体的には、本開示は、クロマトグラフィー法を使用して混合物からポリペプチドを調製する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーは、医薬品調製プロセスの一部として実施することができる。場合によっては、クロマトグラフィーは、ポリペプチドを含む医薬品の調製に特に有用であり得る。しかし、標準バッチＨＩＣステップ又は他のバッチ式クロマトグラフィーステップに関する設備、材料、準備時間、及び実施時間は、医薬品調製プロセスのコストを追加したり、効率を低下させたりする可能性がある。具体的には、ＨＩＣ又は他のクロマトグラフィー分離プロセスの各ステップを実行するために必要な時間、使用されるバッファー及び／又は分離媒体の量、及びプロセスの自動化されていないあらゆる態様は、医薬品調製の効率を低下させる可能性がある。

【0003】

本明細書に開示される方法及びシステムは、ポリペプチド調製法の効率及び／又は生産性を改善し得る。本明細書に開示される方法及びシステムはまた、医薬品調製方法の効率及び／又は生産性を改善することができ、上記で特定した１つ以上の問題に対処し得る。

【発明の概要】

【0004】

本開示の実施形態は、標的ポリペプチドを含む混合物から標的ポリペプチドを調製する方法を対象とし得る。この方法は、標的ポリペプチドを含む混合物をＨＩＣ装置の第１のゾーンに接触させること、移動相をＨＩＣ装置の第２のゾーンに接触させること、及び、標的ポリペプチドをＨＩＣ装置の第１及び第２のゾーンの出口に通すことを含み得る。ここで、第１のゾーン及び第２のゾーンのそれぞれは、１つ以上のクロマトグラフィーカラム及び出口を有し得る。いくつかの実施形態では、第１のゾーンにおける標的ポリペプチドを含む混合物の滞留時間は、第２のゾーンにおける移動相の滞留時間と実質的に同じになるように構成され得る。

【0005】

いくつかの実施形態において、標的ポリペプチドはモノクローナル抗体であり得る。標的ポリペプチドは、５０ｇ／Ｌ・時以上の生産性で調製することができる。あるいは、又はさらに、移動相は平衡化バッファー及び洗浄バッファーを含み得る。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、標的ポリペプチドを含む流出物をＨＩＣ装置の第１のゾーンからＨＩＣ装置の第２のゾーンに通過させることをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、移動相をＨＩＣ装置の第２のゾーンに接触させることは、洗浄バッファーをＨＩＣ装置の第２のゾーンに接触させること、及び洗浄バッファーをＨＩＣ装置の第２のゾーンに接触させた後、第２のゾーンを再生することを含み得る。いくつかの実施形態では、第２のゾーンの再生は、水をＨＩＣ装置の第２のゾーンに接触させること、アルカリ溶液をＨＩＣ装置の第２のゾーンに接触させること、アルコール溶液をＨＩＣ装置の第２のゾーンに接触させること、及び平衡化バッファーをＨＩＣ装置の第２のゾーンに接触させることを含み得る。洗浄バッファーをＨＩＣ装置の第２のゾーンに接触させた後、標的ポリペプチドを、ＨＩＣ装置の第２のゾーンの出口に通すことができる。いくつかの実施形態では、滞留溶液の紫外線吸収率、電気伝導率、又はｐＨのうちの１つ以上を、第１のゾーン又は第２のゾーンのいずれかの出口で測定することができる。第１のゾーン又は第２のゾーンは、複数のクロマトグラフィーカラムを含み得る。いくつかの実施形態では、ＨＩＣ装置は、クロマトグラフィーカラム及び出口を有する第３のゾーンをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、第３のゾーンで再生サイクルを実行することをさらに含み得、再生サイクルを実行することは、移動相を第３のゾーンに接触させることを含み、再生サイクルの持続時間は、標的ポリペプチドを含む混合物の第１のゾーンにおける滞留時間と実質的に同じになるように構成される。

【0006】

本開示のいくつかの実施形態において、標的ポリペプチドを含む混合物から標的ポリペプチドを調製する方法は、標的ポリペプチドを含む混合物を、ＨＩＣ装置の複数のクロマトグラフィーカラムのうちの第１のカラムに通すこと、第１のカラムからの標的ポリペプチドを含む流出物を、複数のカラムのうちの第２のカラムに通すこと、１つ以上の移動相を、複数のカラムのうちの第３のカラムに通すこと、及び、標的ポリペプチドを、複数のカラムのそれぞれの出口に通すことを含んでもよく、ここで、複数のカラムのそれぞれは、複数のカラムのうちの別のカラムに接続可能な出口を含み、第１のカラム及び第２のカラムにおける標的ポリペプチドを含む混合物の滞留時間の合計は、第３のカラムにおける移動相の滞留時間の合計と実質的に同じである。

【0007】

いくつかの実施形態では、この方法は、１つ以上の移動相を複数のカラムのそれぞれに通すことをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の移動相をカラムに通すことは、洗浄バッファーをカラムに通すこと、及び洗浄バッファーをカラムに通した後、カラムを再生することを含んでもよく、ここでカラムの再生は、水、アルカリ性溶液、アルコール溶液、又は平衡化バッファーをカラムに通すことを含む。いくつかの実施形態において、標的ポリペプチドをカラムの出口に通すステップは、洗浄バッファーをカラムに通した後に起こり得る。いくつかの実施形態では、滞留溶液の紫外線吸収率、電気伝導率、又はｐＨのうちの１つ以上が、第１のカラム又は第２のカラムのいずれかの出口で測定される。いくつかの実施形態では、この方法は、５０ｇ／Ｌ・時以上の生産性で標的ポリペプチドを調製することを含み得る。さらなる実施形態において、ＨＩＣ装置は、４つのカラムを含み得、第１のカラム及び第２のカラムにおける標的ポリペプチドを含む混合物の滞留時間の合計は、第３のカラム及び第４のカラムの再生時間の合計と実質的に同じであり得る。

【0008】

本開示のさらなる実施形態は、複数のクロマトグラフィーカラムを使用して抗体を調製する方法を含んでもよく、複数のクロマトグラフィーカラムのそれぞれは疎水性相互作用媒体を含む。この方法は、第１段階において、抗体を含むある量の混合物を複数のカラムのうちの第１のカラムに負荷（ｌｏａｄ）すること、第１のカラムを介して、ある量の混合物を複数のカラムのうちの第２のカラムに負荷すること、及び、複数のカラムのうちの第３のカラムにおいて、洗浄、ストリッピング、及び平衡化プロセスのうちの少なくとも１つを含む非負荷ステップを実行すること；第２段階において、抗体を含むある量の混合物を第２のカラムに負荷すること、第２のカラムを介して、ある量の混合物を第３のカラムに負荷すること、及び、第１のカラムにおいて、洗浄、ストリッピング、及び平衡化プロセスのうちの少なくとも１つを含む非負荷ステップを実行すること；第３段階において、抗体を含むある量の混合物を第３のカラムに負荷すること、第２のカラムを介して、ある量の混合物を第３のカラムに負荷すること、及び、第２のカラムにおいて、洗浄、ストリッピング、及び平衡化プロセスのうちの少なくとも１つを含む非負荷ステップを実行することを含み得る。

【0009】

いくつかの実施形態では、この方法は、第１、第２、及び第３段階をサイクル式に連続して繰り返すことをさらに含んでもよく、ここで各段階は、負荷ステップ及び非負荷ステップを同時に実行することを含む。いくつかの実施形態では、負荷ステップのうちの１つの期間は、非負荷ステップの期間と実質的に同じになるように構成される。

【図面の簡単な説明】

【0010】

本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、様々な例示的な実施形態を示し、明細書とともに、開示された実施形態の原理を説明する役割を果たす。本明細書に記載の実施形態又は実施例の任意の特徴（例えば、組成物、配合物、方法など）は、他の任意の実施形態又は実施例と組み合わせることができ、そのようなすべての組み合わせは、本開示に包含される。さらに、記載されたシステム及び方法は、単一の態様又はその実施形態、あるいはそのような態様及び実施形態の任意の組み合わせ又は順列に限定されない。簡潔にするために、特定の順列及び組み合わせは、本明細書では別個に議論及び／又は図示されていない。

【図1】本開示のいくつかの実施形態による、クロマトグラフィー装置のゾーンの一部を示す模式図である。

【図2】本開示のいくつかの実施形態による、クロマトグラフィー装置の模式図である。

【図3A】本開示のいくつかの実施形態による、標的ポリペプチドを調製する例示的な方法をグラフで描いたものである。

【図3B】図３Ａに示されるように、標的ポリペプチドを調製する方法を示す簡略図である。

【図3C】図３Ａに示されるように、標的ポリペプチドを調製する方法を示す簡略図である。

【図3D】図３Ａに示されるように、標的ポリペプチドを調製する方法を示す簡略図である。

【図4】本開示のいくつかの実施形態による、クロマトグラフィー装置の模式図である。

【図5A】本開示のいくつかの実施形態による、標的ポリペプチドを調製するの例示的な方法をグラフで描いたものである。

【図5B】図５Ａに示されるように、標的ポリペプチドを調製する方法を示す簡略図である。

【図5C】図５Ａに示されるように、標的ポリペプチドを調製する方法を示す簡略図である。

【図5D】図５Ａに示されるように、標的ポリペプチドを調製する方法を示す簡略図である。

【図5E】図５Ａに示されるように、標的ポリペプチドを調製する方法を示す簡略図である。

【図6】本開示のいくつかの実施形態による、標的ポリペプチドを調製する方法のフローチャートである。

【図7A】本開示の一態様による、負荷の関数としての高分子量パーセンテージのプロットである。

【図7B】本開示の一態様による、負荷の関数としての宿主細胞タンパク質量のプロットである。

【図7C】本開示の一態様による、負荷濃度の関数としての高分子量パーセンテージのプロットである。

【図8A】 本開示の一態様による、クロマトグラフィーカラムの数の関数としての生 産性のプロットである。

【図8B】 本開示の一態様による、クロマトグラフィーカラムの数の関数としての生 産性のプロットである。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本明細書で使用される場合、「含む」又はその他の任意の活用形は、非排他的な包含を含むように、つまり、要素のリストを含むプロセス、方法、物品、又は装置は、それらの要素のみを含むのではなく、リストに明示的に挙げられていない他の要素や、そのようなプロセス、方法、物品、又は装置に固有の他の要素を含み得るように意図されている。「例示的」という用語は、「理想的」ではなく「例」の意味で使用される。「例えば」及び「そのような」という用語、及びそれらの文法上の同等物については、特に明記しない限り、「ただし限定するものではないが」という句が続くものと理解される。

【0012】

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、実験誤差による変動を説明することを意味する。数値に適用される場合、「約」という用語は、開示された数値からの＋／－１０％の変動を示し得る（異なる変動が指定されていない場合）。本明細書で使用される場合、単数形「１つの」、及び「その」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の指示対象を含む。

【0013】

本明細書に開示されるすべての数値（すべての開示される値、上限・下限、及び範囲を含む）は、開示される数値から（異なる変動が指定されない限り）＋／－１０％の変動を有し得ることに留意されたい。さらに、特許請求の範囲において、値、上限・下限、及び／又は範囲は、その値、上限・下限、及び／又は範囲＋／－１０％を意味する。同様に、本明細書で使用される「実質的に同じ」という句は、＋／－１０％の変動内で同等であることを意味し得る。さらに、すべての範囲は、端点を含むと理解され、例えば、１センチメートル（ｃｍ）から５ｃｍまでは、１ｃｍ、５ｃｍの長さ、及び１ｃｍから５ｃｍの間のすべての距離を含み得る。

【0014】

［詳細な説明］
本開示は、当業者の技術的範囲内で多くの変形が可能であるため、本明細書に開示される特定の組成物、製剤、材料製造業者、医薬品、デバイス、システム、実験条件、又は特定の方法に限定されない。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではない。

【0015】

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似の又は同等の任意の方法及び材料を、本開示の実施又は試験に使用することができるが、特定の方法がここに記載されている。言及されたすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0016】

本明細書で使用される「接触する」という用語は、２つ以上の表面、溶液、又は化合物同士の触れ合い、接合、界面、又は他の物理的相互作用を指す。特定の流体は、本明細書では、領域中に通す、領域から通過する、領域に通す、又は領域を通過させると説明され得るが、流体は、それが通される任意の領域に必然的に接触することが理解される。同様に、流体又は構成要素を領域に導入することは、その領域に接触する流体又は構成要素を構成することになる。

【0017】

本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、アミド結合を介して共有結合された約２０を超えるアミノ酸を有する任意のアミノ酸ポリマーを指す。タンパク質は、１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖（例えば、ポリペプチド）を含む。したがって、ポリペプチドはタンパク質であり得、タンパク質は、単一の機能的生体分子を形成する複数のポリペプチドを含み得る。

【0018】

翻訳後修飾は、ポリペプチドの構造をさらに修飾又は変更し得る。例えば、ジスルフィド架橋（例えば、システイン残基間のＳ－Ｓ結合）がいくつかのタンパク質に存在し得る。いくつかのジスルフィド架橋は、ポリペプチド、免疫グロブリン、タンパク質、補因子、基質などの適切な構造、機能、及び相互作用に不可欠である。ジスルフィド結合の形成に加えて、タンパク質は他の翻訳後修飾を受ける可能性がある。これらの修飾には、脂質化（例えば、ミリストイル化、パルミトイル化、ファルネソイル化（ｆａｒｎｅｓｏｙｌａｔｉｏｎ）、ゲラニルゲラニル化、及びグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー形成）、アルキル化（例えば、メチル化）、アシル化、アミド化、グリコシル化（例えば、アルギニン、アスパラギン、システイン、ヒドロキシリジン、セリン、スレオニン、チロシン、及び／又はトリプトファンでのグリコシル基の付加）、及びリン酸化（すなわち、セリン、スレオニン、チロシン、及び／又はヒスチジンへのリン酸基の付加）が含まれる。翻訳後修飾は、疎水性、静電表面特性、又はポリペプチドが関与する表面間相互作用を決定する他の特性に影響を与える可能性がある。

【0019】

本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、バイオセラピューティックタンパク質、研究又は治療に使用される組換えタンパク質、トラップタンパク質及び他のＦｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、抗体フラグメント、抗体様分子、ナノボディ、組換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどを含む。目的タンパク質（ＰＯＩ）には、単離、精製、又はその他の方法で調製することが望まれる任意のポリペプチド又はタンパク質が含まれ得る。ＰＯＩは、標的ポリペプチド、又は、細胞によって産生される抗体を含む他のポリペプチドを含み得る。

【0020】

本明細書で使用される「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に連結された２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖の４つのポリペプチド鎖から構成される免疫グロブリンを含む。典型的には、抗体は、１００ｋＤａを超える、例えば１３０ｋＤａ～２００ｋＤａ、例えば約１４０ｋＤａ、１４５ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１５５ｋＤａ、又は１６０ｋＤａの分子量を有する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと略される）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと略される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬを含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分化でき、超可変領域にはフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が点在する。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって次の順序で並んでいる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と略され、軽鎖ＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３と略される場合がある。

【0021】

例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）と呼ばれる免疫グロブリンのクラスは、ヒト血清で一般的であり、４つのポリペプチド鎖（２つの軽鎖と２つの重鎖）で構成されている。各軽鎖はシスチンジスルフィド結合を介して１つの重鎖に結合し、２つの重鎖は２つのシスチンジスルフィド結合を介して互いに結合している。他のクラスのヒト免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥが含まれる。ＩｇＧの場合、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４の４つのサブクラスが存在する。各サブクラスは定常領域が異なり、その結果、異なるエフェクター機能を有し得る。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ＰＯＩは、ＩｇＧを含む標的ポリペプチドを含み得る。少なくとも１つの実施形態において、標的ポリペプチドはＩｇＧ４を含む。

【0022】

本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、完全な抗体分子の抗原結合フラグメントを含む。本明細書で使用される、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」などの用語は、天然に存在する、酵素的に得られる、合成の、又は遺伝子操作された任意のポリペプチド又は糖タンパク質であって、抗原に特異的に結合して複合体を形成するポリペプチド又は糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、抗体可変ドメイン及び任意選択で定常ドメインをコードするＤＮＡを操作し発現させることを含む、タンパク質分解消化又は組換え遺伝子工学技術などの任意の適切な標準技術を使用して、完全な抗体分子から誘導され得る。そのようなＤＮＡは既知であり、かつ／又は、例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、又は合成することができる。ＤＮＡは配列決定され、化学的に、又は分子生物学技術を使用して、例えば、１つ以上の可変及び／又は定常ドメインを適切な構成に配置するため、又はコドンを導入するため、システイン残基を作成するため、アミノ酸を修飾、追加又は削除するためなどの目的で操作され得る。

【0023】

標的ポリペプチドは、昆虫バキュロウイルス系、酵母系（例えば、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）種）、哺乳動物系（例えば、ＣＨＯ細胞及びＣＨＯ－Ｋ１細胞などのＣＨＯ誘導体）などの組換え細胞ベース生産システムを使用して産生され得る。「細胞」という用語は、組換え核酸配列を発現させるのに適した任意の細胞を含む。細胞には、原核生物及び真核生物（単一細胞又は複数細胞）の細胞、細菌細胞（例えば、大腸菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種などの株）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ポンベ（ｐｏｍｂｅ）、Ｐ．パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｐ．メタノリカ（ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）など）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ－９、ＳＦ－２１、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞、キンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）など）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、又は例えば、ハイブリドーマ又はクアドローマなどの細胞融合物が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、又はマウスの細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は真核生物であり、以下の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ－１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ－７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ８０６５、ＨＬ－６０、（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ－１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、ＭＭＴ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、及び前述の細胞から誘導される細胞株。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のウイルス遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）を含む。細胞によって産生される標的ポリペプチド又はＰＯＩ以外のタンパク質又はポリペプチドは、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）と呼ばれることがある。ＰＯＩが宿主細胞で作られ及び／又は宿主細胞から精製される場合、ＨＣＰは製品及びプロセスに関連する汚染物質又は不純物として特徴付けられる場合がある。

【0024】

一部のＨＣＰ（例えば、酵素）はＰＯＩ（例えば、標的ポリペプチド）と共精製され、ＰＯＩを含む混合物、製剤、又は医薬品の成分に影響を与え得る。例えば、いくつかのＨＣＰの存在は、製品の安定性に影響を与えたり、医薬品の貯蔵寿命を縮めたり、製品が公定書又は規制上の粒子状物質の仕様（例えば、米国食品医薬品局の仕様）を満たさなくなったりさえする可能性がある。さらなる例として、いくつかのＨＣＰは、投与時の免疫原性反応などの臨床的影響を引き起こす可能性がある。ＨＩＣ又は他のクロマトグラフィーを単独又は組み合わせて使用して、ＰＯＩを精製及び／又は分離し、混合物、製剤、又は医薬品からＨＣＰを除去して、医薬品に対するＨＣＰの潜在的な影響を低減することができる。一方で、ＨＩＣ又はアフィニティークロマトグラフィーの工程を追加すると、設備、材料（例えば、疎水性相互作用媒体）、及び準備の追加が必要となる。これは、時間、資源、実験、及びコストの追加に相当する。したがって、１つ以上の同時精製されたＨＣＰ又は他の不純物からＰＯＩ（例えば、標的ポリペプチド）を分離するためのクロマトグラフィープロセスを実施する効率的な方法があることが望ましい。

【0025】

本明細書で使用される「クロマトグラフィー」という用語は、混合物の成分が異なる速度で媒体を通り抜けるように混合物を媒体に通すことによって、混合物の成分を分離する任意のプロセスを指し、カラムクロマトグラフィー、平面クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、置換クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、高速タンパク質液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、向流クロマトグラフィー、周期的向流クロマトグラフィー、又はキラルクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない。本明細書の実施形態は、例示的な種類のクロマトグラフィープロセス（例えば、ＨＩＣ）又は装置に関して開示され得るが、本明細書に開示される実施形態は任意の種類のクロマトグラフィーに適用可能であり得る。

【0026】

本明細書で使用される場合、「水」という用語は、脱イオン水又は注射用水など、任意の適切な種類の実験室グレードの水を指し得る。いくつかの実施形態では、例えば、クロマトグラフィー装置は、脱イオン水又は注射用水と接触させることができる。本明細書における「水」の使用への言及は、脱イオン水、注射用水、又は別の種類の実験室グレードの水を指し得る。

【0027】

本開示で使用される場合、「移動相」という用語は、分離又は精製プロセスの一部としてクロマトグラフィーゾーン又はカラムに接触するのに適した任意の流体を指し得る。移動相は、例えば、水、緩衝液、酸性溶液、アルカリ性溶液、及び／又はアルコールを含む溶液を含み得る。「洗浄バッファー」、「ストリッピングバッファー」、及び「平衡化バッファー」という用語は、本明細書でさらに説明されるように、特定の特性を有する移動相を説明するために使用され得る。

【0028】

いくつかの実施形態において、標的ポリペプチドを含む混合物から標的ポリペプチドを調製するための方法は、混合物をクロマトグラフィー装置に接触させることを含み得る。クロマトグラフィー装置は複数のゾーンを含むことができ、各ゾーンは１つ以上のクロマトグラフィーカラムを含み、１つ以上のクロマトグラフィーカラムは疎水性相互作用媒体を含む。このようなクロマトグラフィー装置には、事前に製造された装置（例えば、Ｃａｄｅｎｃｅ（登録商標）ＢｉｏＳＭＢ（Ｐａｌｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＢｉｏＳＣ（商標）（ｎｏｖａｓｅｐ）、Ｖａｒｉｃｏｌ（登録商標）（ｎｏｖａｓｅｐ）、又はＯｃｔａｖｅ（商標）（Ｓｅｍｂａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））、手作業で組み立てられた装置、又は直列で使用される、単に２つ以上のより標準的なバッチクロマトグラフィー装置が含まれ得る。

【0029】

本開示の態様は、標的ポリペプチド又は他の分子を調製するプロセスに様々な利益を提供し得る。例えば、クロマトグラフィー装置での複数のゾーンの同時使用は、個々のカラムのより効率的かつより完全な負荷、及び／又は標準的なクロマトグラフィープロセスよりも少ないクロマトグラフィー媒体を使用した分離プロセスの実行を可能にし得る。本開示の態様の追加の利益及び利点は、当業者には明らかであろう。

【0030】

ここで、本開示の図面を参照する。
図１は、本開示のいくつかの実施形態による、ＨＩＣ装置のクロマトグラフィーカラムのセクション１００を示す。クロマトグラフィーカラムは、疎水性相互作用媒体を含む。疎水性相互作用媒体は、支持構造１１０及び疎水性部分１２０を含み、疎水性部分１２０は、支持構造１１０に固定されている。媒体は、クロマトグラフィー媒体の形態、例えば、充填層カラムフォーマットで保持されたビーズ又は他の粒子、膜の形態、又は標的ポリペプチド（又はその他のＰＯＩ）及び汚染物質（例えばＨＣＰ）を含む混合物又は他の液体を収容することができる任意のフォーマットとすることができる。したがって、例示的な疎水性相互作用媒体は、アガロースビーズ（例えば、セファロース）、シリカビーズ、セルロース膜、セルロースビーズ、親水性ポリマービーズなどを含み得る。

【0031】

本開示のＨＩＣ装置のクロマトグラフィーカラムは、疎水性相互作用媒体が約０．５センチメートル（ｃｍ）～約４０ｃｍの深さ（例えば、ベッド高）を有するように構成され得る。いくつかの実施形態では、例えば、ＨＩＣ装置のクロマトグラフィーカラムは、約０．５ｃｍ～約３０ｃｍ、約０．５ｃｍ～約２０ｃｍ、約０．５ｃｍ～約１０ｃｍ、約０．５ｃｍ～約５ｃｍ、約１ｃｍ～２０ｃｍ、約１ｃｍ～約１０ｃｍ、又は約１ｃｍ～約５ｃｍのベッド高を有し得る。いくつかの実施形態において、クロマトグラフィーカラムは、クロマトグラフィーカラムの内径が約０．５ｃｍ～約１５０ｃｍであるように構成され得る。いくつかの実施形態では、例えば、クロマトグラフィーカラムの内径は、約０．５ｃｍ～約１４０ｃｍ、約０．５ｃｍ～約１２０ｃｍ、約０．５ｃｍ～約１００ｃｍ、約０．５ｃｍ～約８０ｃｍ、約０．５ｃｍ～約６０ｃｍ、約０．５ｃｍ～約４０ｃｍ、約０．５ｃｍ～約２０ｃｍ、約０．５ｃｍ～約１０ｃｍ、約０．７５ｃｍ～約８ｃｍ、約１ｃｍ～約６ｃｍ、約１ｃｍ～約５ｃｍ、約１ｃｍ～約３ｃｍ、約１．５ｃｍ～約５ｃｍ、約１．５ｃｍ～約３ｃｍ、又は約１ｃｍ～約２ｃｍである。例えば、いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーカラムの内径は、約０．５ｃｍ、約１ｃｍ、約５ｃｍ、約８ｃｍ、約１０ｃｍ、約１５ｃｍ、約２０ｃｍ、約３０ｃｍ、約４０ｃｍ、約５０ｃｍ、約６０ｃｍ、約８０ｃｍ、約１００ｃｍ、約１２５ｃｍ、又は約１５０ｃｍである。いくつかの実施形態では、本開示によるＨＩＣ装置のクロマトグラフィーカラムは、約０．４ミリリットル（ｍＬ）～約１７５Ｌの総容積（例えば、混合物、移動相、又は他の物質を保持するための総容量）を有する。いくつかの実施形態、例えば、本開示によるＨＩＣ装置のクロマトグラフィーカラムは、約０．５ｍＬ～約１５０Ｌ、約０．５ｍＬ～約１３０Ｌ、約０．５ｍＬ～約１１５Ｌ、約０．５ｍＬ～約１００Ｌ、約０．５ｍＬ～約８０Ｌ、約０．５ｍＬ～約６０Ｌ、約０．５ｍＬ～約４０Ｌ、約０．５ｍＬ～約２０Ｌ、約０．５ｍＬ～約１５Ｌ、約０．５ｍＬ～約１０Ｌ、約０．５ｍＬ～約５Ｌ、約０．５ｍＬ～約１Ｌ、約１ｍＬ～約７５０ｍＬ、約１ｍＬ～約６００ｍＬ、約１ｍＬ～約５００ｍＬ、約１ｍＬ～約３００ｍＬ、約１ｍＬ～約２５０ｍＬ、約１ｍＬ～約２００ｍＬ、又は約１ｍＬ～約１５０ｍＬの総容積を有する。例えば、いくつかの実施形態では、本開示によるクロマトグラフィーカラムは、約０．５ｍＬ、約１ｍＬ、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約５０ｍＬ、約１００ｍＬ、約１５０ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約１Ｌ、約５Ｌ、約１０Ｌ、約５０Ｌ、約８０Ｌ、約１００Ｌ、約１２０Ｌ、又は約１５０Ｌの総容積を有し得る。

【0032】

いくつかの実施形態では、疎水性部分１２０は、ポリペプチドの疎水性領域及び疎水性表面に結合する。疎水性表面は、ペプチドを構成するアミノ酸の構造の一部、前述の又は他の翻訳後修飾、又はそれらの組み合わせであり得る。疎水性相互作用媒体の疎水性の程度は、適切な疎水性部分１２０を選択することによって制御することができる。疎水性部分１２０は、特定の標的ポリペプチド又はＰＯＩに結合するように選択することができ、現在知られている、又は将来開発される任意の疎水性部分であり得る。いくつかの実施形態では、疎水性部分１２０は、メチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ヘキシル、オクチル、及び／又はフェニル基を含み得る。当業者は、選択された疎水性部分１２０の疎水性が、標的ポリペプチド及び／又はＨＣＰ／所与の用途の他の不純物、ならびにクロマトグラフィープロセスからの所望の分離又は精製の種類及び程度に基づいて変化し得ることを理解するであろう。

【0033】

疎水性相互作用媒体を使用して、標的ポリペプチド又は他のＰＯＩを製品及びプロセスに関連する汚染物質及び不純物（例えば、ＨＣＰ）から分離することができる。引き続き図１を参照すると、いくつかの実施形態では、標的ポリペプチド１４０及び汚染物質１３０など（例えば、不純物、ＨＣＰなど）の他の成分を含む混合物が、ＨＩＣ装置に負荷される。混合物は、標的ポリペプチド１４０の疎水性基が疎水性相互作用媒体の疎水性部分１２０に結合するのを促進するように設計された溶液（例えば、バッファー）を含み得る。一部の標的ポリペプチド１４０は、分子内力を介して疎水性部分１２０に結合することによって培地に付着する一方で、他の標的ポリペプチド１４０は、クロマトグラフィーカラムを通過し得る。加えて、又はこれに代えて、混合物がカラムを通過する間、混合物からのいくつかの汚染物質１３０は、分子内力を介して疎水性部分１２０に結合することによって疎水性相互作用媒体に付着し得るが、他の汚染物質１３０は疎水性部分１２０に結合できない。いくつかの実施形態において、標的ポリペプチド１４０は、構成アミノ酸からの、翻訳後修飾からの、又は、特定の汚染物質又は不純物（例えば、ＨＣＰ）よりも高い親和性で疎水性部分１２０に付着することを可能にするそれらの組み合わせからの特定の疎水性領域を含む。後でより詳細に説明するように、続いて追加の移動相をカラムに導入して、標的ポリペプチド１４０と疎水性部分１２０との間の親和性を低下させ、標的ポリペプチド１４０がＨＩＣ装置のクロマトグラフィーカラムを通過できるようにする。

【0034】

さらなる実施形態において、汚染物質１３０は、標的ポリペプチド１４０よりも高い親和性で疎水性部分１２０に付着し得る。続いて追加の移動相をカラムに導入して、汚染物質１３０と疎水性部分１２０との間の親和性を低下させ、汚染物質１３０がＨＩＣ装置のクロマトグラフィーカラムを通過できるようにすることができる。

【0035】

標的ポリペプチド１４０を含む混合物の組成は、例えば、ナトリウム、カリウム、リン酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、クエン酸塩、又は酢酸塩などの塩を含む添加剤の添加によって変更することができる。標的ポリペプチド１４０、汚染物質１３０、疎水性部分１２０、又はそれらの組み合わせの疎水性又は他の分子内相互作用を変更するために、他の添加剤を添加することができる。

【0036】

本明細書に記載のいくつかの実施形態による、例示的なＨＩＣ装置２００が図２に模式的に示されている。ＨＩＣ装置２００は、第１のゾーン２１０、第２のゾーン２２０、及び第３のゾーン２３０を含み得る。第１のゾーン２１０、第２のゾーン２２０、及び第３のゾーン２３０のそれぞれは、図１に関して説明したクロマトグラフィーカラムなどの１つ以上のクロマトグラフィーカラムを含み得る。第１のゾーン２１０は、標的ポリペプチド、１つ以上の移動相、又は他の液体を含む混合物を第１のゾーン２１０に通すことができるように構成された第１の入口２１２を有し得る。第１のゾーン２１０はまた、ＨＩＣ装置２００からの流出物（例えば、第１のゾーン２１０を通過した流体）を、収集又は廃棄のために通すことができる第１の出口２１４を有し得る。流出物はまた、第１の相互接続２１６を介して第１のゾーン２１０から第２のゾーン２２０に通すことができる。第１のゾーン２１０はまた、第３の相互接続２３６を介して第３のゾーン２３０からの流出物を受け取ることができる。

【0037】

第２のゾーン２２０は、第１の相互接続２１６を介して第１のゾーン２１０からの流出物を受け取ることができる。第２のゾーン２２０はまた、標的ポリペプチド、１つ以上の移動相、又は他の液体を含む混合物を第２のゾーン２２０に通すことができるように構成された第２の入口２２２を有し得る。第２のゾーン２２０はまた、ＨＩＣ装置２００からの流出物（例えば、第２のゾーン２２０を通過した流体）を、収集又は廃棄のために通すことができる第２の出口２２４を有し得る。流出物はまた、第２の相互接続２２６を介して第２のゾーン２２０から第３のゾーン２３０に通過することができる。

【0038】

第３のゾーン２３０は、第２の相互接続２２６を介して第２のゾーン２２０からの流出物を受け取ることができる。第３のゾーン２３０は、標的ポリペプチド、１つ以上の移動相、又は他の液体を含む混合物を第３のゾーン２３０に通すことができるように構成された第３の入口２３２を有し得る。第３のゾーン２３０はまた、ＨＩＣ装置２００からの流出物（例えば、第３のゾーン２３０を通過した流体）を、収集又は廃棄のために通すことができる出口２３４を有し得る。流出物はまた、第３の相互接続２３６を介して、第３のゾーン２３０から第１のゾーン２２０に通過することができる。

【0039】

当業者には理解されるように、クロマトグラフィー装置で使用されることが知られている様々な構成要素（例えば、フィルタ、センサ、ゲージ、温度計）をＨＩＣ装置２００に組み込むことができるが、図２の模式図には示されていない。いくつかの実施形態では、ＵＶ吸収率、電気伝導率、又はｐＨ又は滞留溶液のうちの１つ以上が、ＨＩＣ装置２００内の１つ以上の箇所で測定され得る。ＵＶ吸収率、電気伝導率、又はｐＨを測定するための適切な箇所には、入口２１２、２２２、２３２、ゾーン２１０、２２０、２３０内、相互接続２１６、２２６、２３６、又は出口２１４、２２４、２３４が含まれる。入口２１２、２２２、２３２、相互接続２１６、２２６、２３６、及び出口２１４、２２４、２３４は、開いた構成から閉じた構成に移動するように動作可能であってもよく、開いた構成は、流体が入口２１２、２２２、２３２、相互接続２１６、２２６、２３６、又は出口２１４、２２４、２３４を通過することを可能にし、閉じた構成は、流体が入口２１２、２２２、２３２、相互接続２１６、２２６、２３６、又は出口２１４、２２４、２３４を通過することを防止する。ＨＩＣ装置２００は、ゾーン２１０、２２０、２３０、入口２１２、２２２、２３２、相互接続２１６、２２６、２３６、及び出口２１４、２２４、２３４の間で流体を伝達するための圧力を提供する１つ以上のポンプを含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の相互接続２１６、２２６、２３６を移動させて、異なるゾーン２１０、２２０、２３０に結合することができる。例えば、ＨＩＣ装置２００を使用するプロセス中に、相互接続２２６がゾーン２２０からの流出物を通す場所を再配置することが望ましい場合がある。これらの状況では、相互接続２２６は、クロマトグラフィープロセスを中断することなく、ゾーン２２０からゾーン２１０に流出物を通すように再構成され得る。これはほんの一例である。大抵の場合、相互接続２１６、２２６、２３６は、進行中のクロマトグラフィープロセスを中断することなく、異なるゾーンを接続するように再構成することができる。

【0040】

図３Ａは、本開示のいくつかの実施形態による方法をグラフで描いたものである。グラフの左軸では、３つの別個の行が、ＨＩＣ装置の第１のカラム、第２のカラム、及び第３のカラムを表すラベルＣ_１、Ｃ_２、及びＣ_３によって定義されている。上軸は時間を表し、左右に無限に伸びる。各カラムの連続的な占有期間は、本明細書に記載の実施形態の例示である。この配置は、従来のＨＩＣ法と比較して、カラムのアイドルタイム（例えば「デッドタイム」）を減少又は排除する。図３Ａの全体に示される時間のセグメントは、繰り返しパターンの１つの例示的なサイクルを表し、これは、図３Ａに示される時間セグメントの前及び／又は後に繰り返され得る。４つの時間が、Ｔ_１、Ｔ_２、Ｔ_３、及びＴ_４としてラベル付けされており、これらはグラフを通して縦に描くことができる任意の線Ｔ_０の例である。いくつかの実施形態では、Ｔ_１とＴ_２との間の間隔は、Ｔ_２とＴ_３との間の間隔と実質的に同じであり、いくつかの実施形態では、Ｔ_３とＴ_４との間の間隔と実質的に同じである。いくつかの実施形態では、隣接するラベル付けされた時間の間の間隔（例えば、Ｔ_１とＴ_２の間、又はＴ_３とＴ_４の間）は、３０秒（ｓ）以上、９０分（ｍｉｎ）以下、３０秒～６０分、３０秒～３０分、３０秒～１５分、３０秒～１０分、３０秒～８分、３０秒～７分、３０秒～６分、３０秒～５分、３０秒～４分、３０秒～３分、１分～５分、又は２分～５分であり得る。ボックス４１０、４１２、４１４、４１５、４１７、４１９、４２４、４２０、４２２、４２４、４２５、４２７、４２９、４３０、４３２、４３４、４３５、４３７、及び４３９は、各ボックスが現れる時間間隔で、Ｃ_１、Ｃ_２、及びＣ_３の各カラム内で発生するイベントを表す。例えば、各ボックスは、混合物、移動相、又はそれが現れるカラムの行内の他の滞留液体の存在を表し得る。

【0041】

図３Ａを左から右へ横切って、時間的に「先へ」進行してＴ_１からＴ_２へと移動すると、混合物の２回目の負荷は、第１のカラムＣ_１（ボックス４１０）であり得る。Ｔ_２からＴ_３まで、混合物の初回負荷は、第１のカラムＣ_１（ボックス４１２）であり得、Ｔ_３からＴ_４まで、１つ以上の移動相は、第１のカラムＣ_１（ボックス４１４）であり得る。いくつかの実施形態では、カラムは、混合物の初回負荷又は混合物の２回目の負荷のいずれかを受けることができる。混合物の「初回負荷」とは、先にＨＩＣ装置の別のカラムに最初に通すことなく、ＨＩＣ装置のカラムに通される混合物の負荷を指す。混合物の「２回目の負荷」は、所与のカラムに導入される前にＨＩＣ装置の別のカラムに通された混合物の負荷を指す（例えば、混合物の初回負荷からの流出物は、別のカラムに混合物の２回目の負荷として導入される）。あるカラムから別のカラムに標的ペプチドを含む流出物を通過させると、オーバーフローを無駄にする心配なくカラムを完全に負荷でき、各カラムの使用効率を向上させ、消費される疎水性相互作用媒体の量を減少させることができる。標的ポリペプチドを含む混合物の初回負荷を受けた、又は受けることのできる疎水性相互作用媒体上にオーバーフローを通すことにより、処理される負荷混合物の量に対する消費される疎水性相互作用媒体の量を減らすことができる。

【0042】

いくつかの実施形態において、１つ以上の移動相をカラムに接触させることは、洗浄バッファーをカラムに接触させること、ストリッピングバッファーをカラムに接触させること、及び／又は平衡化バッファーをカラムに接触させることを含み得る。いくつかの実施形態では、洗浄バッファーは、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、硫酸塩、トリス、又は他の塩などの１つ以上の塩を含み得る。

【0043】

いくつかの実施形態では、ストリッピングバッファーは、水、アルカリ性溶液、又はアルコールを含む溶液を含み得る。例えば、脱イオン水は、５体積パーセント（ｖｏｌ．％）未満の溶存イオン、１ｖｏｌ．％未満の溶存イオン、０．１ｖｏｌ．％未満の溶存イオン、又は０．０１ｖｏｌ．％未満の溶存イオンを含み得る。いくつかの実施形態によれば、アルカリ性溶液は、ＬｉＯＨ、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）_２、ＮＨ_４ＯＨ又は他のアルカリ性化合物などの１つ以上のアルカリイオン性化合物を含み得る。ストリッピングバッファー中のアルカリ性化合物の濃度は、例えば、約０．１Ｎ～約１．５Ｎ、約０．１Ｎ～約１Ｎ、約０．１Ｎ～約１．５Ｎ、約０．５Ｎ～約１．５Ｎ、約０．１Ｎ～約０．８Ｎ、約０．１Ｎ～約０．６Ｎ、約０．１Ｎ～約０．５Ｎ、約０．１Ｎ～約０．４Ｎ、又は約０．１Ｎ～約０．３Ｎの範囲であり得る。例えば、ストリッピングバッファー中のアルカリ性化合物の濃度は、約０．１Ｎ、約０．２Ｎ、約０．３Ｎ、約０．４Ｎ、約０．５Ｎ、約０．６Ｎ、約０．７Ｎ、約０．８Ｎ、約０．９Ｎ、約１Ｎ、約１．１Ｎ、約１．２Ｎ、約１．３Ｎ、約１．４Ｎ、又は約１．５Ｎであり得る。アルコールを含むストリッピングバッファーは、メタノール、エタノール、プロパノール、ベンジルアルコール、又は他のアルコールを含み得る。ストリッピングバッファー中のアルコールの濃度は、ストリッピングバッファーの総重量に基づいて、約０．１ｖｏｌ．％～約３０ｖｏｌ．％、例えば約０．５ｖｏｌ．％～約３０ｖｏｌ．％、約０．５ｖｏｌ．％～約２５ｖｏｌ．％、約０．５ｖｏｌ．％～約２５ｖｏｌ．％、約０．５ｖｏｌ．％～約２５ｖｏｌ．％、約１ｖｏｌ．％～約２０ｖｏｌ．％、約１ｖｏｌ．％～約１５ｖｏｌ．％、約１ｖｏｌ．％～約１０ｖｏｌ．％、約１０ｖｏｌ．％～約５０ｖｏｌ．％、約１０ｖｏｌ．％～約４０ｖｏｌ．％、約１０ｖｏｌ．％～約３０ｖｏｌ．％、約１０ｖｏｌ．％～約２５ｖｏｌ．％、約１５ｖｏｌ．％～約２５ｖｏｌ．％、又は約２０ｖｏｌ．％～約２５ｖｏｌ．％の範囲であり得る。例えば、ストリッピングバッファー中のアルコールの濃度は、約０．１ｖｏｌ．％、約０．５ｖｏｌ．％、約１ｖｏｌ．％、約２ｖｏｌ．％、約３ｖｏｌ．％、約５ｖｏｌ．％、約１０ｖｏｌ．％、約１５ｖｏｌ．％、約２０ｖｏｌ．％、又は約２５ｖｏｌ．％であり得る。

【0044】

いくつかの実施形態において、平衡化バッファーは、組成において洗浄バッファーと類似又は同一であり得る。他の実施形態では、平衡化バッファーは、洗浄バッファーと比較して組成が異なり得る。いくつかの実施形態において、平衡化バッファーは、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、硫酸塩、トリス、又は他の塩などの１つ以上の塩を含み得る 図３Ａを参照すると、第１のカラム４１４における１つ以上の移動相との接触は、第１のカラムの洗浄バッファー（ボックス４１５）、第１のカラムのストリッピングバッファー（ボックス４１７）、及び第１のカラムの平衡化バッファー（ボックス４１９）を含むそれぞれ別個の相に分割され得る。次の行（Ｃ_２を表す）では、Ｔ_１からＴ_２まで、１つ以上の移動相は第２のカラム（ボックス４２４）にあり得る。これもまた、第２のカラムの洗浄バッファー（ボックス４２５）、第２のカラムのストリッピングバッファー（ボックス４２７）、及び第２のカラムの平衡化バッファー（ボックス４２９）を含むそれぞれ別個の相に分割され得る。右に移動すると、Ｔ_２からＴ_３まで、混合物の２回目の負荷は第２のカラム（ボックス４２０）であってもよく、Ｔ_３からＴ_４まで、混合物の初回負荷は第２のカラム（ボックス４２２）であってもよい。

【0045】

次の行では、Ｔ_１からＴ_２まで、混合物の初回負荷は第３のカラム（ボックス４３２）であってもよい。次に、Ｔ_２からＴ_３まで、１つ以上の移動相は第３のカラム（ボックス４３４）にあってもよく、Ｔ_３からＴ_４まで、混合物の２回目の負荷は第３のカラム（ボックス４３０）であってもよい。第３のカラム（ボックス４３４）の１つ以上の移動相は、第３のカラムの洗浄バッファー（ボックス４３５）、第３のカラムのストリッピングバッファー（ボックス４３７）、及び第３のカラムの平衡化バッファー（ボックス４３９）を含むそれぞれ別個の相に分割され得る。

【0046】

所与の時間Ｔ_０において、Ｔ_０からの縦線が接触する各番号付きボックスがその時点でのカラムの溶液を表すように、グラフを通して縦線を引くことができる。したがって、例えば、Ｔ_１において２回目の負荷混合物が第１のカラムＣ_１に導入されているとき（ボックス４１０）、１つ以上の移動相が第２のカラムＣ_２に通されている（ボックス４２４）。例えば、洗浄バッファーがＣ_２に通され（ボックス４２５）、初回負荷混合物が第３のカラムＣ_３に通されている（ボックス４３２）。例えば、細分４２５、４２７、及び４２９などのより広い相の細分は、第２のカラム４２４の１つ以上の移動相の等分を占めるように見えるが、いくつかの実施形態では、細分は、より広い相の不等分を占めることができる。図３Ａに示される方法はまた、本開示の実施形態による１つの例示的な進行にすぎないことが理解されるべきである。他の順序、構成、及びステップは、本開示の範囲内であると考えられる。

【0047】

図３Ｂ～３Ｄは、前述のように、標的ポリペプチドを含む混合物から標的ポリペプチドを調製する方法の例示的なサイクルを示す。図３Ｂは、図３Ａの時間間隔Ｔ_１からＴ_２の間に発生し得る一連のイベントを示す。したがって、図３Ｂは第１段階３０１にあるＨＩＣ装置を示しており、ここでは第１のゾーン３１０が、標的ポリペプチドを含む混合物３０６の２回目の負荷を受け取り、収集又は廃棄され得る２回目の負荷３０７の流出物を溶出している。第２のゾーン３２０は、１つ以上の移動相３１５を受け取り、収集又は廃棄され得る１つ以上の移動相３１６の流出物を溶出している。第３のゾーン３３０は、混合物３０５の初回負荷を受け取り、混合物３０６の２回目の負荷を別のカラムに通している。

【0048】

図３Ｃは、第２段階３０２（図３Ａに示されるように、間隔Ｔ_２からＴ_３にわたって）にあるＨＩＣ装置を示しており、ここでは第１のゾーン３１０は、混合物３０５の初回負荷を受け取り、混合物３０６の２回目の負荷を別のカラムに通している。第２のゾーン３２０は、混合物３０６の２回目の負荷を受け取り、収集又は廃棄され得る２回目の負荷３０７の流出物を溶出している。第３のゾーン３３０は、１つ以上の移動相３１５を受け取り、収集又は廃棄され得る１つ以上の移動相３１６の流出物を溶出している。

【0049】

図３Ｄは、第３段階３０３（図３Ａに示されるように、間隔Ｔ_３からＴ_４にわたって）にあるＨＩＣ装置を示しており、ここでは第１のゾーン３１０が１つ以上の移動相３１５を受け取り、収集又は廃棄され得る１つ以上の移動相３１６の流出物を溶出している。第２のゾーン３２０は、混合物３０５の初回負荷を受け取り、混合物３０６の２回目の負荷を別のカラムに通している。第３のゾーン３３０は、１つ以上の移動相３１５を受け取り、収集又は廃棄され得る１つ以上の移動相３１６の流出物を溶出している。

【0050】

本明細書に記載のいくつかの実施形態による別の例示的なＨＩＣ装置５００が、図４に模式的に示されている。ＨＩＣ装置５００は、第１のゾーン５１０、第２のゾーン５２０、第３のゾーン５３０、及び第４のゾーン５４０を含み得る。第１のゾーン５１０は、標的ポリペプチド、１つ以上の移動相、又は他の液体を含む混合物を第１のゾーン５１０に通すことができるように構成された第１の入口５１２を有し得る。第１のゾーン５１０はまた、ＨＩＣ装置５００からの流出物（例えば、第１のゾーン５１０を通過した流体）を収集又は廃棄のために通すことができる第１の出口５１４を有し得る。流出物はまた、第１の相互接続５１６を介して第１のゾーン５１０から第２のゾーン５２０に通すことができる。第１のゾーン５１０はまた、第４の相互接続５４６を介して第４のゾーン５４０からの流出物を受け取ることができる。

【0051】

第２のゾーン５２０は、第１の相互接続５１６を介して第１のゾーン５１０からの流出物を受け取ることができる。第２のゾーン５２０はまた、標的ポリペプチド、１つ以上の移動相、又は他の液体を含む混合物を第２のゾーン５２０に通すことができるように構成された第２の入口５２２を有し得る。第２のゾーン５２０はまた、ＨＩＣ装置５００からの流出物（例えば、第２のゾーン５２０を通過した流体）を収集又は廃棄のために通すことができる第２の出口５２４を有し得る。流出物はまた、第２の相互接続５２６を介して、第２のゾーン５２０から第３のゾーン５３０に通すことができる。

【0052】

第３のゾーン５３０は、第２の相互接続５２６を介して第２のゾーン５２０からの流出物を受け取ることができる。第３のゾーン５３０は、標的ポリペプチド、１つ以上の移動相、又は他の液体を含む混合物を第３のゾーン５３０に通すことができるように構成された第３の入口５３２を有し得る。第３のゾーン５３０はまた、ＨＩＣ装置５００からの流出物（例えば、第３のゾーン５３０を通過した流体）を収集又は廃棄のために通すことができる出口５３４を有し得る。流出物はまた、第３の相互接続５３６を介して、第３のゾーン５３０から第４のゾーン５２０に通すことができる。

【0053】

第４のゾーン５４０は、第３の相互接続５３６を介して第３のゾーン５３０からの流出物を受け取ることができる。第４のゾーン５４０は、標的ポリペプチド、１つ以上の移動相、又は他の液体を含む混合物を第４のゾーン５４０に通すことができるように構成された第４の入口５４２を有し得る。第４のゾーン５４０はまた、ＨＩＣ装置５００からの流出物（例えば、第４のゾーン５４０を通過した流体）を収集又は廃棄のために通すことができる出口５４４を有し得る。流出物はまた、第４の相互接続５４６を介して、第４のゾーン５４０から第１のゾーン５１０に通すことができる。

【0054】

クロマトグラフィー装置で使用されることが知られている様々な構成要素（例えば、フィルタ、センサ、ゲージ、温度計）をＨＩＣ装置５００に組み込むことができるが、図４の簡略化した模式図には示されていない。いくつかの実施形態では、ＵＶ吸収率、電気伝導率、又はｐＨの１つ以上、又は滞留溶液を、ＨＩＣ装置５００の１つ以上の箇所で測定することができる。ＵＶ吸収率、電気伝導率、又はｐＨを測定するための適切な箇所には、ゾーン５１０、５２０、５３０、５４０内の入口５１２、５２２、５３２、５４２、相互接続５１６、５２６、５３６、５４６、又は出口５１４、５２４、５３４、５４４が含まれる。入口５１２、５２２、５３２、５４２、相互接続５１６、５２６、５３６、５４６及び出口５１４、５２４、５３４、５４４は、開いた構成から閉じた構成に移動するように動作可能であり得る。開いた構成は、流体が入口５１２、５２２、５３２、５４２、相互接続５１６、５２６、５３６、５４６、又は出口５１４、５２４、５３４、５４４を通過することを可能にし、閉じた構成は、流体に入口５１２、５２２、５３２、５４２、相互接続５１６、５２６、５３６、５４６又は出口５１４、５２４、５３４、５４４を通過させない。ＨＩＣ装置５００は、ゾーン５１０、５２０、５３０、５４０、入口５１２、５２２、５３２、５４２、相互接続５１６、５２６、５３６、５４６、及び出口５１４、５２４、５３４、５４４の間で流体を伝達するための圧力を提供する１つ以上のポンプを含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の相互接続５１６、５２６、５３６、５４６は、異なるゾーン５１０、５２０、５３０、５４０を結合させるように移動され得る。例えば、ＨＩＣ装置５００を用いた１つ以上のクロマトグラフィープロセス中に、相互接続５３６がゾーン５３０からの流出物を通す場所を再配置することが望ましい場合がある。これらの状況では、相互接続５３６は、クロマトグラフィープロセスを中断することなく、ゾーン５３０からゾーン５２０に流出物を通すように再構成され得る。これは単なる一例であり、大抵の場合、相互接続５１６、５２６、５３６、５４６はいずれも、進行中のクロマトグラフィープロセスを中断することなく、異なるゾーン５１０、５２０、５３０、５４０を接続するように再構成することができる。

【0055】

図５Ａは、本開示による１つ以上の方法をグラフで描いたものである。グラフの左軸では、ＨＩＣ装置の第１のカラム、第２のカラム、第３のカラム、及び第４のカラムを表すラベルＣ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、及びＣ_４によって４つの別個の行が定義されている。上軸は時間を表し、左右に無限に伸びる。各カラムの連続的な占有期間は、本明細書に記載の実施形態の例示であり、この配置は、従来のＨＩＣ法と比較して、カラムのアイドルタイム（例えば、「デッドタイム」）を低減又は排除する。示される時間のセグメントは、繰り返しパターンの１サイクルを表し、以下に説明される番号付けされたボックスのパターンを理解することは、図５Ａに示されるセグメントの両側で繰り返され得る。５つの時間が、Ｔ_１、Ｔ_２、Ｔ_３、Ｔ_４、及びＴ_５としてラベル付けされており、これらはグラフを通して縦に描くことができる任意の線Ｔ_０の例である。いくつかの実施形態では、Ｔ_１とＴ_２との間の間隔は、Ｔ_２とＴ_３との間の間隔と実質的に同じであり、いくつかの実施形態では、Ｔ_３とＴ_４との間の間隔と実質的に同じであり、いくつかの実施形態では、Ｔ_４とＴ_５との間の間隔と実質的に同じである。いくつかの実施形態では、これらの時間のそれぞれの間の間隔は異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、隣接するラベル付けされた時間の間の間隔（例えば、Ｔ_１とＴ_２の間又はＴ_４とＴ_５の間）は、３０秒以上、９０分以下、３０秒～６０分、３０秒～３０分、３０秒～１５分、３０秒～１０分、３０秒～８分、３０秒～７分、３０秒～６分、３０秒～５分、３０秒～４分、３０秒～３分、１分～５分、又は２分～５分であり得る。ボックス７１０、７１２、７１４、７２４、７２０、７２２、７３４、７３０、７３２、７４２、７４４、及び７４０は、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、及びＣ_４の各カラム内の混合物、バッファー、又は他の滞留液体を表す。

【0056】

図５Ａを左から右へ横切って、第１の行（第１のカラムＣ_１を表す）をＴ_１からＴ_２へと移動すると、混合物の２回目の負荷は、第１のカラム（ボックス７１０）であり得る。Ｔ_２からＴ_３まで、混合物の初回負荷は、第１のカラム（ボックス７１２）であり得、Ｔ_３からＴ_５まで、１つ以上の移動相は、第１のカラム（ボックス７１４）であり得る。

【0057】

引き続き図５Ａを参照すると、第１のカラム７１４における１つ以上の移動相は、第１のカラムの洗浄バッファー（ボックス７１５）、第１のカラムのストリッピングバッファー（ボックス７１７）、及び第１のカラムの平衡化バッファー（ボックス７１９）を含むそれぞれ別個の相に分割され得る。次の行（第２のカラムＣ_２を表す）では、Ｔ_１からＴ_２まで、１つ以上の移動相は第２のカラム（ボックス７２４）にあってもよく、前のサイクルのＴ_４からＴ_５まで継続する。これもまた、第２のカラムの洗浄バッファー（ボックス７２５）、第２のカラムのストリッピングバッファー（ボックス７２７）、及び第２のカラムの平衡化バッファー（ボックス７２９）を含むそれぞれ別個の相に分割され得る。右に移動すると、Ｔ_２からＴ_３まで、混合物の２回目の負荷は第２のカラム（ボックス７２０）であってもよく、Ｔ_３からＴ_４まで、混合物の初回負荷は第２のカラム（ボックス７２２）であってもよい。

【0058】

次の行（カラムＣ_３を表す）では、Ｔ_１からＴ_３まで、１つ以上の移動相は第３のカラム（ボックス７３４）であってもよい。第３のカラム７３４の１つ以上の移動相は、第３のカラムの洗浄バッファー（ボックス７３５）、第３のカラムのストリッピングバッファー（ボックス７３７）、及び第３のカラムの平衡化バッファー（ボックス７３９）を含むそれぞれ別個の相に分割され得る。次に、Ｔ_３からＴ_４まで、２回目の負荷は第３のカラム（ボックス７３０）であってもよく、Ｔ_４からＴ_５まで、混合物の初回負荷は第３のカラム（ボックス７３２）であってもよい。

【0059】

次の行（カラムＣ_４を表す）では、Ｔ_１からＴ_２まで、混合物の初回負荷は第４のカラム（ボックス７３２）であってもよい。次に、Ｔ_２からＴ_４まで、１つ以上の移動相は第４のカラム（ボックス７４４）にあってもよく、Ｔ_４からＴ_５まで、混合物の２回目の負荷は第３のカラム（ボックス７４０）であってもよい。第４のカラム７４４の１つ以上の移動相は、第３のカラムの洗浄バッファー（ボックス７４５）、第３のカラムのストリッピングバッファー（ボックス７４７）、及び第３のカラムの平衡化バッファー（ボックス７４９）を含むそれぞれ別個の相に分割され得る。

【0060】

所与の時間Ｔ_０において、Ｔ_０からの縦線が接触する各番号付きボックスがその時点でのカラムの溶液を表すように、グラフを通して縦線を引くことができる。したがって、例えば、時間Ｔ_１において２回目の負荷混合物が第１のカラム７１０に導入されているとき、１つ以上の移動相、例えばストリッピングバッファー７２７は第２のカラム７２４にあり、初回負荷混合物は第３のカラム７３２に通されている。例えば、細分７２５、７２７、及び７２９などのより広い相の細分は、第２のカラム７２４の１つ以上の移動相の等分を占めるように見えるが、いくつかの実施形態では、細分は、より広い相の不等分を占めることができる。図５Ａに示される方法はまた、本開示の実施形態の方法の一例にすぎないことが理解されるべきである。他の順序、構成、及びステップは、本開示の範囲内であると考えられる。

【0061】

図５Ｂ～５Ｅは、前述のように、標的ポリペプチドを含む混合物から標的ポリペプチドを調製する方法の例示的なサイクルを示す。図５Ｂは、図５Ａの時間間隔Ｔ_１からＴ_２の間に発生し得る一連のイベントを示す。図５Ｂは第１段階６０１にあるＨＩＣ装置を示しており、ここでは第１のゾーン６１０が、標的ポリペプチドを含む混合物６０６の２回目の負荷を受け取り、収集又は廃棄され得る２回目の負荷６０７の流出物を溶出している。第２のゾーン６２０は、１つ以上の移動相６１５を受け取り、収集又は廃棄され得る１つ以上の移動相６１６の流出物を溶出している。第３のゾーン６３０は、１つ以上の移動相６１５を受け取り、収集又は廃棄され得る１つ以上の移動相６１６の流出物を溶出している。第４のゾーン６４０は、混合物６０５の初回負荷を受け取り、混合物６０６の２回目の負荷を別のカラムに通している。

【0062】

図５Ｃは、第２段階６０２（図５Ａに示されるように、間隔Ｔ_２からＴ_３にわたって）にあるＨＩＣ装置を示しており、ここでは第１のゾーン６１０が混合物６０５の初回負荷を受け取り、収集又は廃棄され得る標的ポリペプチドを含む混合物６０６の２回目の負荷を別のカラムに通している。第２のゾーン６２０は、標的ポリペプチドを含む混合物６０６の２回目の負荷を受け取り、収集又は廃棄され得る２回目の負荷６０７の流出物を溶出している。第３のゾーン６３０は、１つ以上の移動相６１５を受け取り、収集又は廃棄され得る１つ以上の移動相６１６の流出物を溶出している。第４のゾーン６４０は、１つ以上の移動相６１５を受け取り、収集又は廃棄され得る１つ以上の移動相６１６の流出物を溶出している。

【0063】

図５Ｄは、第３段階６０３（図５Ａに示されるように、間隔Ｔ_２からＴ_３にわたって）にあるＨＩＣ装置を示しており、ここでは第１のゾーン６１０が１つ以上の移動相６１５を受け取り、収集又は廃棄され得る１つ以上の移動相６１６の流出物を溶出している。第２のゾーン６２０は、混合物６０５の初回負荷を受け取り、混合物６０６の２回目の負荷を、収集又は廃棄され得る標的ポリペプチドを含む別のカラムに通す。第３のゾーン６３０は、標的ポリペプチドを含む混合物６０６の２回目の負荷を受け取り、収集又は廃棄され得る２回目の負荷６０７の流出物を溶出している。第４のゾーン６４０は、１つ以上の移動相６１５を受け取り、収集又は廃棄され得る１つ以上の移動相６１６の流出物を溶出している。

【0064】

図５Ｅは、第４段階６０４（図５Ａに示されるように、間隔Ｔ_２からＴ_３にわたって）にあるＨＩＣ装置を示しており、ここでは第１のゾーン６１０が１つ以上の移動相６１５を受け取り、収集又は廃棄され得る１つ以上の移動相６１６の流出物を溶出している。第２のゾーン６２０は、１つ以上の移動相６１５を受け取り、収集又は廃棄され得る１つ以上の移動相６１６の流出物を溶出している。第３のゾーン６３０は、混合物６０５の初回負荷を受け取り、混合物６０６の２回目の負荷を、収集又は廃棄され得る標的ポリペプチドを含む別のカラムに通す。第４のゾーン６４０は、標的ポリペプチドを含む混合物６０６の２回目の負荷を受け取り、収集又は廃棄され得る２回目の負荷６０７の流出物を溶出している。

【0065】

図６は、標的ポリペプチドを含む混合物から標的ポリペプチドを調製する例示的な方法８００のフローチャートを示す。この方法は、標的ポリペプチドを含む混合物を複数のカラムのうちの第１のカラム（例えば、図３Ａのボックス４１０）に通すことを含み得る（ステップ８１０）。この方法は、標的ポリペプチドを含む流出物を、複数のカラムのうちの第１のカラムから第２のカラムに通すことをさらに含み得る（例えば、図３Ｂに示されるような混合物３０６の第２の負荷）（ステップ８２０）。この方法は、１つ以上の移動相を第１のカラム（例えば、ボックス４１４）に通すことをさらに含み得る（ステップ８３０）。いくつかの実施形態では、この方法は、標的ポリペプチドを複数のカラムのそれぞれの出口に通すことをさらに含み得る（例えば、図３Ｂ～３Ｄに示されるような１つ以上の移動相３１６の流出物）（ステップ８４０）。図３Ａ～３Ｄに関して比較しているが、当業者には、図５Ａ～５Ｅに関する比較も行われ得ることが明らかであろう。

【0066】

本開示の実施形態において、標的ポリペプチドを含む混合物はまた、１つ以上のＨＣＰを含み得る。１つ以上の実施形態の方法を使用して混合物から標的ポリペプチドを調製した後、いくつかの流出物サンプルを得ることができる。サンプルは、混合物の１つ以上の負荷の流出物及び／又は１つ以上の移動相の流出物から収集することができる。例えば、サンプルは、混合物の初回負荷又は混合物の２回目の負荷（又は混合物の他の任意の負荷）の流出物から収集され得る。いくつかの実施形態では、サンプルは、１つ以上の洗浄バッファーの流出物からのみ収集され得る。他の実施形態では、サンプルは、他の移動相の流出物及び／又は混合物の初回又は２回目の負荷から収集され得る。標的ポリペプチドを含む収集されたすべてのサンプルの収集物を集めたものは、プールと呼ばれる。

【0067】

いくつかの実施形態では、１つ以上の測定を行って、標的ポリペプチドを調製するために使用される方法の効率を確認することができる。本開示で使用される場合、効率とは、高分子量分子クリアランス率（ＨＭＷ ＣＦ）、収率、及び生産性の３つの異なる要因の組み合わせを指す。いくつかの実施形態において、効率の高い方法であるほど、効率の低い方法よりも高いＨＭＷ ＣＦ、高い収率、及び高い生産性を有する。他の実施形態では、より効率的な方法は、効率の低い方法よりも高い生産性を有しつつ、１．３以上のＨＭＷ ＣＦを維持し、８０％以上の収率を維持する。さらなる実施形態では、より効率的な方法は、効率の低い方法よりも高い生産性を有しつつ、１．５以上のＨＭＷ ＣＦを維持し、９０％以上の収率を維持する。

【0068】

高分子量分子クリアランス率（ＨＭＷ ＣＦ）は、負荷された混合物と比較した、収集されたプール中の相対的なタンパク質含有量の近似値である。いくつかの実施形態では、分析的サイズ排除クロマトグラフィーを実施して、高分子量分子（例えば、タンパク質）に起因するサンプルのパーセンテージ（ＨＭＷ％）を決定することができる。他の実施形態では、遠心分離技術を使用することができる。サンプルを遠心分離すると、サンプルの構成成分の質量に基づいて階層に分離し、最も重い層である下澄は、一般に、タンパク質を含む最も重い分子を含む。ＨＭＷ％は、遠心分離したサンプルの下澄をひとまとめにし、サンプルの総質量で割ることによって計算できる。どちらの方法を使用しても、ＨＭＷ ＣＦは、以下に示すように、式１に従って計算できる。

【0069】

【数1】

【0070】

式（１）に示すように、ＨＭＷ ＣＦは、負荷された混合物のＨＭＷ％をプールのＨＭＷ％で割ることによって計算できる。いくつかの実施形態において、混合物から標的ポリペプチドを調製する方法は、１．３以上のＨＭＷ ＣＦを有する。他の実施形態では、混合物から標的ポリペプチドを調製する方法は、１．４以上、１．５以上、１．６以上、１．８以上、又は２．０以上のＨＭＷ ＣＦを有する。

【0071】

収率は、負荷混合物中にあった標的ポリペプチドの量と比較した、プールに収集された標的ポリペプチドの量の測定値である。サンプル中の標的ポリペプチドの量は、ＵＶ吸収率、電気伝導率、又は酵素免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって定量化することができる。収率は、以下に示すように、式２に従って計算できる。

【0072】

【数2】

【0073】

式２に示すように、収率は、ＨＩＣ装置に負荷された標的ポリペプチドの質量を、プールに収集された標的ポリペプチドの質量で割ることによって計算され得る。サンプル中の標的ポリペプチドの質量は直接測定できないため、濃度（ＵＶ吸収率、電気伝導率、又は酵素免疫測定法によって計算される）を体積と掛けて質量を決定することができる。いくつかの実施形態において、混合物から標的ポリペプチドを調製する方法は、５５％以上の収率を有する。他の実施形態において、混合物から標的ポリペプチドを調製する方法は、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の収率を有する。

【0074】

生産性は、ある量の標的ポリペプチドを調製するために必要な時間とコストの定量化である。生産性は、以下に示すように、式３に従って計算できる。

【0075】

【数3】

【0076】

式３に示すように、生産性は、プールに収集された標的ポリペプチドの質量を、使用した疎水性相互作用媒体の体積とプールに収集されたポリペプチドの質量を調製するために費やした時間（例えば、サイクルタイム）との積で割ることによって計算できる。いくつかの実施形態において、混合物から標的ポリペプチドを調製する方法は、約３５ｇ／Ｌ・時以上の生産性を有する。他の実施形態では、混合物から標的ポリペプチドを調製する方法は、約４０ｇ／Ｌ・時以上、約５０ｇ／Ｌ・時以上、約７５ｇ／Ｌ・時以上、約１００ｇ／Ｌ・時以上、約１２５ｇ／Ｌ・時以上、約１５０ｇ／Ｌ・時以上、以上約１７５ｇ／Ｌ・時、約２００ｇ／Ｌ・時以上、又は約２２０ｇ／Ｌ・時以上の生産性を有する。。

【0077】

実施例
以下の実施例は、本質的に限定することなく、本開示を説明することを意図している。本開示は、前述の説明及び以下の例と矛盾しない追加の態様及び実施形態を包含することが理解される。

【0078】

以下の実施例において、標的ポリペプチドは、標的ポリペプチド及びＨＣＰを含む混合物から調製された。標的ポリペプチドは、本開示の実施形態による３つの異なる方法を使用して調製された。標的ポリペプチドはまた、比較例として従来のバッチ処理法を使用して調製された。

【0079】

実施例１
最初の例では、標的抗体を調製した。標的抗体を含む１２．２ｇ／Ｌの混合物３００ｍＬを、負荷流量１．６７ｍＬ／分で３カラムＨＩＣ装置に負荷した。各カラムのベッド高は２．５ｃｍ、内径は１．６ｃｍ、カラム容積は５ｍＬであった。負荷バッファー／混合物は、クエン酸ナトリウムの３０ミリモーラー（ｍＭ）溶液を含み、２Ｍ酢酸溶液でｐＨ６．０に調整された。負荷バッファー／混合物を、３つのカラムのうちの第１及び第２のカラムに負荷した。第２のカラムには第１のカラムを介して負荷した（つまり、第１のカラムからの出口により、負荷バッファーが第２のカラムに通されるようにした）。混合物をＨＩＣ装置の第１及び第２のカラムに負荷した後、混合物を３つのカラムのうちの第２及び第３に負荷し、ただし第３のカラムには第２のカラムを介して負荷した（つまり、第２のカラムからの出口により、負荷バッファーが第３のカラムに通されるようにした）。

【0080】

負荷バッファー／混合物が第２及び第３のカラムに負荷されている間に、一連の移動相をＨＩＣ装置の第１のカラムに通して、第１のカラムにおいて標的抗体を混合物の他の成分から分離し、標的抗体を収集した。続いて、カラムを再生するために一連のストリッピングバッファーを第１のカラムに通した。第２及び第３のカラムの負荷は、第１のカラムの洗浄及びストリッピングと同時に行った。このステップの後、負荷バッファー／混合物を第３及び第１のカラムに負荷し、ただし第１のカラムには第３のカラムを介して負荷した（つまり、第３のカラムからの出口により負荷バッファーが第１のカラムに通されるようにした）。この間、バッファーを第２のカラムに通して、第２のカラムに負荷した混合物から標的抗体を分離及び収集した後、一連のストリッピングバッファーを第２のカラムに通して第２のカラムを再生した。第３及び第１のカラムの負荷は、第２のカラムの洗浄及びストリッピングと同時に行った。最後に、負荷バッファー／混合物を第１及び第２のカラムに再度負荷し、前述のように第２のカラムを第１のカラムから負荷し、その間にバッファーを第３のカラムに通して、混合物から標的抗体を分離及び収集した。その後、一連のストリッピングバッファーを第３のカラムに通して第３のカラムを再生した。第１及び第２のカラムの負荷は、第３のカラムの洗浄及びストリッピングと同時に行った。このプロセスを周期的に２回繰り返した。

【0081】

一連の移動相は、洗浄バッファー、一連のストリッピングバッファー、及び平衡化バッファーを含んでいた。洗浄バッファーは４０ｍＭトリス及び３０ｍＭクエン酸ナトリウムを含み、ｐＨ６．０に調整された。各カラムを洗浄するために、４カラム容積の洗浄バッファーをカラムに加えた。

【0082】

洗浄バッファーを適用し、標的抗体を含む流出液をプールの一部としてカラムから収集した後、一連のストリッピングバッファーをカラム再生プロセスの一部としてカラムに通した。最初のストリッピングバッファーは脱イオン水を含み、２カラム容量分のこのバッファーを各カラムに添加した。本明細書で使用される場合、カラム容量は、所与のカラムが保持できる液体の量を指す。次のストリッピングバッファーは１Ｎ ＮａＯＨを含み、最初のストリッピングバッファーの後に２カラム容量分のこのバッファーを各カラムに添加した。次のストリッピングバッファーは脱イオン水を含み、前回のアルカリ性ストリッピングバッファーの後に２カラム容量分のこのバッファーを各カラムに添加した。次のストリッピングバッファーは２０ｖｏｌ．％のエタノールを含み、前回の脱イオン水ストリッピングバッファーの後に、２カラム容量分のこのバッファーを各カラムに添加した。脱イオン水を含む最後のストリッピングバッファーをカラムに添加した（２カラム容量に等しい量）。ストリッピングバッファーを適用した後、４カラム容量分の平衡化バッファーをカラムに添加した。平衡化バッファーは、４０ｍＭトリス及び３０ｍＭクエン酸ナトリウムを含み、ｐＨ６．０に調整された。

【0083】

実施例１で実行した方法からプールを収集した後、この方法のＨＭＷ ＣＦ、収率、及び生産性を、本明細書で前述したように測定及び計算した。結果を下記の表１にまとめる。

【0084】

実施例２
第２の例では、標的抗体を調製した。標的ポリペプチドを含む７２９ｍＬの１２．４ｇ／Ｌ混合物を、１．６７ｍＬ／分の負荷流量で３カラムＨＩＣ装置に負荷した。各カラムのベッド高は２．５ｃｍ、内径は１．６ｃｍ、カラム容積は５ｍＬであった。負荷バッファー／混合物は、クエン酸ナトリウムの３０ミリモーラー（ｍＭ）溶液を含み、２Ｍ酢酸溶液でｐＨ６．０に調整された。負荷バッファー／混合物を、３つのカラムのうちの第１及び第２のカラムに負荷した。第２のカラムには第１のカラムを介して負荷した（つまり、第１のカラムからの出口により負荷バッファーが第２のカラムに通されるようにした）。混合物をＨＩＣ装置の第１及び第２のカラムに負荷した後、混合物を３つのカラムのうちの第２及び第３に負荷し、ただし第３のカラムには第２のカラムを介して負荷した（つまり、第２のカラムからの出口により負荷バッファーが第３のカラムに通されるようにした）。

【0085】

負荷バッファー／混合物を第２及び第３のカラムに負荷している間に、一連の移動相をＨＩＣ装置の第１のカラムに通して、標的抗体を第１のカラムの混合物の他の成分から分離し、標的抗体を収集した。続いて、一連のストリッピングバッファーを第１のカラムに通してカラムを再生した。第２及び第３のカラムの負荷は、第１のカラムの洗浄及びストリッピングと同時に行った。このステップの後、負荷バッファー／混合物を第３及び第１のカラムに負荷し、ただし第１のカラムには第３のカラムを介して負荷した（つまり、第３のカラムからの出口により負荷バッファーが第１のカラムに通されるようにした）。この間、バッファーを第２のカラムに通して、第２のカラムに負荷した混合物から標的抗体を分離及び収集し、その後、一連のストリッピングバッファーを第２のカラムに通して第２のカラムを再生した。第３及び第１のカラムの負荷は、第２のカラムの洗浄及びストリッピングと同時に行った。最後に、負荷バッファー／混合物を第１及び第２のカラムに再度負荷し、ただし第２のカラムには前述のように第１のカラムから負荷し、その間にバッファーを第３のカラムに通して、第３のカラムに負荷した混合物から標的抗体を分離及び収集した。その後、一連のストリッピングバッファーを第３のカラムに通し、第３のカラムを再生した。第１及び第２のカラムの負荷は、第３のカラムの洗浄及びストリッピングと同時に行った。このプロセスを周期的に４回繰り返した。

【0086】

一連の移動相は、洗浄バッファー、一連のストリッピングバッファー、及び平衡化バッファーを含んでいた。洗浄バッファーは４０ｍＭトリス及び３０ｍＭクエン酸ナトリウムを含み、ｐＨ６．０に調整された。各カラムを洗浄するために、４カラム容量分の洗浄バッファーをカラムに添加した。

【0087】

洗浄バッファーを適用し、標的抗体を含む流出液をプールの一部としてカラムから収集した後、一連のストリッピングバッファーをカラム再生プロセスの一部としてカラムに通した。最初のストリッピングバッファーは脱イオン水を含み、２カラム容量分のこのバッファーを各カラムに添加した。本明細書で使用される場合、カラム容量は、所与のカラムが保持できる液体の量を指す。次のストリッピングバッファーは１Ｎ ＮａＯＨを含み、最初のストリッピングバッファーの後に２カラム容量分のこのバッファーを各カラムに添加した。次のストリッピングバッファーは脱イオン水を含み、前回のアルカリ性ストリッピングバッファーの後に２カラム容量分のこのバッファーを各カラムに添加した。次のストリッピングバッファーは２０ｖｏｌ．％のエタノールを含み、前回の脱イオン水ストリッピングバッファーの後に、２カラム容量分のこのバッファーを各カラムに添加した。脱イオン水を含む最後のストリッピングバッファーをカラムに添加した（２カラム容量に等しい量）。ストリッピングバッファーを適用した後、４カラム容量分の平衡化バッファーをカラムに添加した。平衡化バッファーは、４０ｍＭトリス及び３０ｍＭクエン酸ナトリウムを含み、ｐＨ６．０に調整された。

【0088】

実施例２で実行した方法からプールを収集した後、ＨＭＷ ＣＦ、収率、及び生産性を、本明細書で前述したように測定及び計算した。結果を下記の表１にまとめる。
実施例３
第３の例では、標的ポリペプチドを調製した。標的ポリペプチドを含む７２６ｍＬの１２．４ｇ／Ｌ混合物を、６．７０ｍＬ／分の負荷流量で３カラムＨＩＣ装置に負荷した。各カラムのベッド高は２．５ｃｍ、内径は１．６ｃｍ、カラム容積は５ｍＬであった。負荷バッファー／混合物は、クエン酸ナトリウムの３０ミリモーラー（ｍＭ）溶液を含み、２Ｍ酢酸溶液でｐＨ６．０に調整された。負荷バッファー／混合物を、３つのカラムのうちの第１及び第２のカラムに負荷した。第２のカラムには第１のカラムを介して負荷した（つまり、第１のカラムからの出口により負荷バッファーが第２のカラムに通されるようにした）。混合物をＨＩＣ装置の第１及び第２のカラムに負荷した後、混合物を３つのカラムのうちの第２及び第３に負荷し、ただし第３のカラムには第２のカラムを介して負荷した（つまり、第２のカラムからの出口により負荷バッファーが第３のカラムに通されるようにした）。

【0089】

負荷バッファー／混合物を第２及び第３のカラムに負荷している間に、一連の移動相をＨＩＣ装置の第１のカラムに通して、標的抗体を第１のカラムの混合物の他の成分から分離し、標的抗体を収集した。続いて、一連のストリッピングバッファーを第１のカラムに通してカラムを再生した。第２及び第３のカラムの負荷は、第１のカラムの洗浄及びストリッピングと同時に行った。このステップの後、負荷バッファー／混合物を第３及び第１のカラムに負荷し、ただし第１のカラムには第３のカラムを介して負荷した（つまり、第３のカラムからの出口により負荷バッファーが第１のカラムに通されるようにした）。この間、バッファーを第２のカラムに通して、第２のカラムに負荷した混合物から標的抗体を分離及び収集し、その後、一連のストリッピングバッファーを第２のカラムに通して第２のカラムを再生した。第３及び第１のカラムの負荷は、第２のカラムの洗浄及びストリッピングと同時に行った。最後に、負荷バッファー／混合物を第１及び第２のカラムに再度負荷し、ただし第２のカラムには前述のように第１のカラムから負荷し、その間にバッファーを第３のカラムに通して、第３のカラムに負荷した混合物から標的抗体を分離及び収集した。その後、一連のストリッピングバッファーを第３のカラムに通し、第３のカラムを再生した。第１及び第２のカラムの負荷は、第３のカラムの洗浄及びストリッピングと同時に行った。このプロセスを周期的に４回繰り返した。

【0090】

一連の移動相は、洗浄バッファー、一連のストリッピングバッファー、及び平衡化バッファーを含んでいた。洗浄バッファーは４０ｍＭトリス及び３０ｍＭクエン酸ナトリウムを含み、ｐＨ６．０に調整された。各カラムを洗浄するために、４カラム容量分の洗浄バッファーをカラムに添加した。

【0091】

洗浄バッファーを適用し、標的抗体を含む流出液をプールの一部としてカラムから収集した後、一連のストリッピングバッファーをカラム再生プロセスの一部としてカラムに通した。最初のストリッピングバッファーは脱イオン水を含み、２カラム容量分のこのバッファーを各カラムに添加した。本明細書で使用される場合、カラム容量は、所与のカラムが保持できる液体の量を指す。次のストリッピングバッファーは１Ｎ ＮａＯＨを含み、最初のストリッピングバッファーの後に２カラム容量分のこのバッファーを各カラムに添加した。次のストリッピングバッファーは脱イオン水を含み、前回のアルカリ性ストリッピングバッファーの後に２カラム容量分のこのバッファーを各カラムに添加した。次のストリッピングバッファーは２０ｖｏｌ．％のエタノールを含み、前回の脱イオン水ストリッピングバッファーの後に、２カラム容量分のこのバッファーを各カラムに添加した。脱イオン水を含む最後のストリッピングバッファーをカラムに添加した（２カラム容量に等しい量）。ストリッピングバッファーを適用した後、４カラム容量分の平衡化バッファーをカラムに添加した。平衡化バッファーは、４０ｍＭトリス及び３０ｍＭクエン酸ナトリウムを含み、ｐＨ６．０に調整された。

【0092】

実施例３で実行した方法からプールを収集した後、ＨＭＷ ＣＦ、収率、及び生産性を、本明細書で前述したように測定及び計算した。結果を下記の表１にまとめる。
比較例
実施例１～３の方法との比較として、標的ポリペプチドを、本明細書に記載の従来のバッチプロセスを使用して混合物から調製した。負荷添加剤、洗浄バッファー、ストリッピングバッファー、及び平衡化バッファーは、実施例の方法で使用したものと同じであったが、従来のバッチ方法を採用した。１３．１ｇ／Ｌの負荷混合物５９０ｇをクロマトグラフィーカラムに添加した。混合物がカラムを通過した後、４カラム容量分の洗浄バッファーをカラムに添加し、流出物を収集した。比較例の方法からプールを収集した後、ＨＭＷ ＣＦ、収率、及び生産性を特性評価した。結果を表１にまとめる。

【0093】

【表1】

【0094】

表１のデータからわかるように、実施例２及び３は、比較例のバッチ法よりも高い生産性を有する。さらに、実施例３は、１．５以上のＨＭＷ ＣＦを維持し、９０％以上の収率を維持しながら、他の実施例よりも高い生産性を達成することができた。

【0095】

実施例４
様々な速度での不純物破過を比較するために、３つの異なる負荷速度でＨＩＣを使用して標的抗体を調製した。表２に記載するようにカラムを調製した。

【0096】

【表2】

【0097】

負荷速度は、実行した順に、３００ｃｍ／時（３．９３ｍＬ／分、すなわちカラム内の滞留時間４．０分）、２００ｃｍ／時（２．６２ｍＬ／分、すなわちカラム内の滞留時間６．０分）、及び４００ｃｍ／時（５．２４ｍＬ／分、すなわちカラム内の滞留時間３．０分）であった。すべて同じカラムで実行した。４００ｃｍ／時を実行する前に、０．５Ｎ ＮａＯＨ中で一晩の浸漬を行った。

【0098】

図７Ａに示すように、高分子量パーセンテージ（ＨＭＷ％）を負荷の関数としてプロットした。負荷材料のＨＭＷ％は１．７８％であった。２００ｇ／Ｌ－樹脂及び４００ｇ／Ｌ－樹脂での累積プールＨＭＷ％を以下の表３に示す。

【0099】

【表3】

【0100】

各負荷速度について、宿主細胞タンパク質を、Ｆ６６５ ＣＨＯ ＨＣＰ ＥＬＩＳＡキット（Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して百万分率で定量化した。得られた量を、図７Ｂに示すように、負荷の関数としてプロットした。比較として、宿主細胞タンパク質を、同じ負荷材料の陰イオン交換クロマトグラフィープールから定量化し、５４９．６１ｐｐｍで存在することがわかった。

【0101】

実施例５
標的抗体を、異なるベッド高（実施例４で使用したような２０ｃｍ、及び２．５ｃｍ）を有する２つのカラムにおいてＨＩＣを使用して調製した。両方の実行は、各カラムでの滞留時間が３分になるように行われた（つまり、ベッド高２０ｃｍのカラムでの線流速は４００ｃｍ／時）。負荷材料のＨＭＷ％は２．２％であった。図７Ｃに示すように、各カラムのプールのＨＭＷ％を、負荷濃度の関数としてプロットした。

【0102】

当業者は、本開示の基礎となる概念が、本開示の解決策及び目的を実行するための他の方法及びシステムを設計するための基礎として容易に使用できることを理解するであろう。したがって、特許請求の範囲は、前述の説明によって制限されると見なされるべきではない。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】