特許 7566762 陰イオン交換クロマトグラフィーを使用した生物学的分子、例えばプラスミドＤＮＡなどのための精製プロセス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-10-04

(45)【発行日】2024-10-15

(54)【発明の名称】陰イオン交換クロマトグラフィーを使用した生物学的分子、例えばプラスミドＤＮＡなどのための精製プロセス

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/10 20060101AFI20241007BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20241007BHJP

【ＦＩ】

C12N15/10 112Z

C12M1/00 A

【請求項の数】 32

(21)【出願番号】P 2021550323

(86)(22)【出願日】2020-02-28

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-22

(86)【国際出願番号】 EP2020055285

(87)【国際公開番号】W WO2020174085

(87)【国際公開日】2020-09-03

【審査請求日】2023-01-05

(31)【優先権主張番号】19160132.7

(32)【優先日】2019-02-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】521381439

【氏名又は名称】ロンザ・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ツルブリッゲン，アンドレアス

(72)【発明者】

【氏名】コサンデイ，リュドビク

(72)【発明者】

【氏名】バルマー，イブ

【審査官】坂井田 京

(56)【参考文献】

【文献】特表２００１－５２６０２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００２－５４３９８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１１－５１２１２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】J. Chromatogr. B，2004年，Vol.804，PP.327-335

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

混合物から目的のプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を単離又は精製するための方法であって、
陰イオン交換材料への目的のプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の選択的結合を可能にする濃度のコスモトロピック塩を含む溶液の存在において、混合物を陰イオン交換材料と接触させる工程であって、
前記コスモトロピック塩が、硫酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びそれらの混合物からなる群より選択され、及び、前記コスモトロピック塩の濃度が、少なくとも０．５Ｍである工程；並びに
精製されたプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を含む溶離液を提供する濃度のカオトロピック塩を含む溶出剤で目的のプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を溶出する工程であって、
前記カオトロピック塩が、塩化アンモニウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩酸グアニジニウム、及びそれらの混合物からなる群より選択される工程；
を含む方法。

【請求項2】

（ｉ）溶離液中に前記プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を含む画分を収集する；及び／又は
（ｉｉ）目的の前記プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）が、収集された画分のいずれか１つ又は全てから単離される；及び／又は
（ｉｉｉ）方法が、有機溶媒、界面活性剤、グリコール、ヘキサミンコバルト、スペルミジン、ポリビニルピロリドンの非存在において実施される；
請求項１に記載の方法。

【請求項3】

（ｉ）プラスミドＤＮＡがスーパーコイルプラスミドＤＮＡ（ｓｃ ｐＤＮＡ）である；及び／又は
（ｉｉ）プラスミドＤＮＡが、哺乳動物ＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、非コードＤＮＡ、又はウイルスＤＮＡを含む；及び／又は
（ｉｉｉ）混合物が、スーパーコイルプラスミドＤＮＡ、開環状プラスミドＤＮＡ、線状プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、リポ多糖、エンドトキシン、タンパク質、又はそれらの任意の組み合わせを含む；
請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記プラスミドＤＮＡが、目的のポリペプチドを発現することが可能なＤＮＡを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

精製及び／又は単離プラスミドＤＮＡの純度が少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

（ｉ）陰イオン交換材料へのプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の選択的結合を可能にするコスモトロピック塩の濃度が、０．８Ｍから４．０Ｍである；及び／又は
（ｉｉ）精製されたプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を含む溶離液を提供するカオトロピック塩の濃度が、０．２５Ｍから４．０Ｍである；及び／又は
（ｉｉｉ）溶出工程が、溶出剤中のカオトロピック塩の濃度を変動させることによる勾配溶出を含む；
請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

溶出工程が、溶出剤中のカオトロピック塩の濃度を増加させる、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

溶出工程が、他のプラスミドＤＮＡ形態からのスーパーコイルプラスミドＤＮＡの画分を含む、請求項３から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

他のプラスミドＤＮＡ形態が、線状プラスミドＤＮＡ及び開環状プラスミドＤＮＡである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

溶出工程が、他のプラスミドＤＮＡ形態、及び他の核酸分子からのスーパーコイルプラスミドＤＮＡの画分を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項11】

（ｉ）コスモトロピック塩が硫酸アンモニウムである；及び／又は
（ｉｉ）カオトロピック塩が硫酸マグネシウムである；及び／又は
（ｉｉｉ）コスモトロピック塩を含む溶液が、５．０から１０．０の、又は５．０から８．０の、又は６．０から８．０の範囲のｐＨ、あるいはｐＨ７を有する；
請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

（ｉ）前記硫酸アンモニウムの濃度が０．５Ｍから２．０Ｍである；及び／又は
（ｉｉ）前記硫酸マグネシウムの濃度が０．５Ｍから１．０Ｍである；
請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

陰イオン交換材料が、陰イオン交換膜、イオン交換樹脂、三次元微孔性ヒドロゲル構造、超多孔性ビーズの充填床、大孔性ビーズ、モノリス、アガロースビーズ、架橋アガロース、シリカビーズ、大孔径ゲル、メタクリレートベースのビーズ、ポリスチレンベースのビーズ、セルロースベースのビーズ、デキストランベースのビーズ、ビスアクリルアミドベースのビーズ、ポリビニルエーテルベースのビーズ、セラミックベースのビーズ、又はポリマーベースのビーズより選択される、
請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

陰イオン交換材料が、
（ｉ）３．０μｍから５．０μｍの平均孔径を有する陰イオン交換膜；又は
（ｉｉ）３０μｍから３００μｍの平均粒子径を有するイオン交換樹脂；
である、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

陰イオン交換材料が、３．０μｍの平均孔径を有する陰イオン交換膜である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

方法が、陰イオン交換材料へのプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の選択的結合を可能にする濃度のコスモトロピック塩を含む溶液の存在において混合物を陰イオン交換材料と接触させる前に、目的のプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を含む混合物から固体成分を分離することをさらに含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

固体成分の前記分離が、ろ過又は相分離により達成される、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

固体成分の前記分離が、二相分離を介して達成される、請求項１６又は１７に記載の方法。

【請求項19】

固体成分の前記分離が、二相分離を介して達成され、
（ｉ）緩衝液を加えて、混合物の密度を１．１ｋｇ／Ｌより大きく増加させる；及び／又は
（ｉｉ）上相よりも高い密度を有する二相混合物の下相が、深層ろ過に供される；
請求項１６又は１７に記載の方法。

【請求項20】

前記緩衝液がコスモトロピック塩を含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記コスモトロピック塩が硫酸アンモニウムである、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

方法が以下の工程：
（ｉ）溶離液からプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を沈殿させる工程；及び／又は
（ｉｉ）プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を単離するための接線流ろ過により溶離液をろ過する工程；及び／又は
（ｉｉｉ）目的の精製されたプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の凍結乾燥工程；及び／又は
（ｉｖ）陰イオン交換材料へのプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の選択的結合を可能にする濃度のコスモトロピック塩を含む溶液の存在において混合物を陰イオン交換材料と接触させる工程に続くフロースルーを収集する工程；及び／又は
（ｖ）目的のプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の溶出前に、陰イオン交換材料を洗浄緩衝液で洗浄する工程；
をさらに含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

方法が以下の工程：
（ｉｉ）プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を単離するための接線流ろ過により溶離液をろ過する工程であって、前記接線流ろ過工程において使用されるろ過膜の平均孔径が、０．２μｍ以下である工程；及び／又は
（ｉｉｉ）目的の精製されたプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の凍結乾燥工程であって、前記凍結乾燥工程が糖の存在において行われる工程；及び／又は
（ｉｖ）陰イオン交換材料へのプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の選択的結合を可能にする濃度のコスモトロピック塩を含む溶液の存在において混合物を陰イオン交換材料と接触させる工程に続くフロースルーを収集する工程であって、フロースルーがＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、タンパク質、細胞画分、又はそれらの組み合わせを含む工程；及び／又は
（ｖ）目的のプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の溶出前に、陰イオン交換材料を洗浄緩衝液で洗浄する工程であって、前記洗浄緩衝液が、目的のプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の溶出のために要求される濃度よりも低い濃度のカオトロピック塩を含む工程；
をさらに含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記フロースルーがＲＮＡを含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

方法が、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を溶出する工程に続く精製工程をさらに含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

方法が、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を溶出し、単離する工程に続くさらなる精製工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

第２の精製工程が、スーパーコイルプラスミドＤＮＡを開環状及び／又は線状ＤＮＡから分離することを可能にする選択性を有するチオフィリック芳香族吸着クロマトグラフィー媒体の使用を含む、請求項２５又は２６に記載の方法。

【請求項28】

方法が以下の工程：
（ｉ）プラスミドＤＮＡを使用して目的のポリペプチドを発現させる工程；又は
（ｉｉ）プラスミドＤＮＡを使用して目的のポリペプチドを産生及び回収する工程；
をさらに含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

方法が、目的のポリペプチドを医薬組成物中に製剤化する工程をさらに含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

方法が、目的のプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を含む、結果として得られた混合物を陰イオン交換材料と接触させる前に、細胞の回収及び洗浄、細胞溶解、中和、及び凝集物の除去の工程を含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

方法が、ＲＮＡを除去するためのＣａＣｌ_２沈殿工程を含まない、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

請求項１６から２１のいずれか一項に記載の方法のためのチューリップ型容器の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、目的の生物学的分子、例えばプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）などの精製又は単離のための新たな、改善された方法を提供する。この方法は、不純物、例えばＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、タンパク質、細胞画分、又はそれらの組み合わせなどの単純で効果的な除去を含む。本発明の新規方法は、大規模な生産プラントについて特に適しており、優れた品質及び良好な収量を伴う精製ｐＤＮＡを提供し、また、より速い処理時間及び低下した費用を可能にする。

【0002】

精製された生物学的分子、特に本発明の方法により得られたｐＤＮＡは、分野、例えば合成的な一過性産生、エクスビボ遺伝子治療、ＲＮＡ治療薬、ＤＮＡワクチン、ＤＮＡ抗体、非ウイルス遺伝子治療、及びウイルスベクターなどにおける適用のために特に適している。本発明の方法を介して得られた、精製された生物学的分子はまた、例えば、ワクチン、ウイルス治療、遺伝子及び細胞治療、インビボ又はインビトロでの分子、例えばＲＮＡ及びポリペプチドなどの産生において、あるいはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞治療において使用されうる。

【0003】

本発明はまた、目的の生物学的分子を含むサンプルの清澄化の間に好適に使用されうるチューリップ型容器の新規使用について記載する。チューリップ型容器又はタンクは、生物学的分子を含む混合物から固体成分を分離するために、相分離の間に有利に使用してもよい。より具体的には、本発明は、相分離の間に生物学的分子を含む混合物のより低い（即ち、より高密度の）相を回収するためのチューリップ型容器又はタンクの新規使用を提供する。

【背景技術】

【0004】

プラスミドＤＮＡは、染色体ＤＮＡから物理的に分離された小分子であり、独立的に複製することができる。プラスミドＤＮＡは典型的には３つの異なる立体構造で存在する：スーパーコイルｐＤＮＡ、開環状ｐＤＮＡ、及び線状ｐＤＮＡ。ｐＤＮＡの種々の治療的適用（合成的な一過性産生、エクスビボ遺伝子治療、ＲＮＡ治療薬、ＤＮＡワクチン、ＤＮＡ抗体、非ウイルス遺伝子治療、及びウイルスベクターなどを含むが、これらに限定しない）を仮定すると、ｐＤＮＡの精製又は単離の改善された方法が非常に望ましいということが当業者により理解されるであろう。

【0005】

ｐＤＮＡの高い負電荷を考慮し、陰イオン交換クロマトグラフィーは、ｐＤＮＡを精製又は単離するための方法において頻繁に使用される。陰イオン交換材料は、正荷電基を含む。このように、陰イオン交換クロマトグラフィーによって、陰イオン交換材料の使用を通じて、溶液に含まれる分子、例えばタンパク質などをそれらの電荷に従って分離する。当業者が理解するように、陰イオン交換クロマトグラフィーの間に使用される塩の濃度は、溶出される物質に依存して変動しうる。典型的な陰イオン交換材料の例は、種々の種類の陰イオン交換膜、ビーズ、及び樹脂を含む。陰イオン交換材料に結合したタンパク質を次に、適切な緩衝液を用いて、含まれる塩の増加濃度の勾配の使用を通じて溶出させる。このように、公知の陰イオン交換クロマトグラフィー方法では、サンプルの充填は、典型的には、低塩濃度を有する緩衝液を用いて行い、塩濃度はその後、溶出工程の間に増加される。

【0006】

陰イオン交換クロマトグラフィーを使用してｐＤＮＡを精製する場合、特に工業規模では、陰イオン交換カラムにｐＤＮＡを含む溶液を充填する前に典型的に生じるいくつかの上流工程がある。これらの工程には通常、流加発酵、細胞の回収及び洗浄、連続的な細胞溶解、中和、ＲＮＡ除去、凝集物除去用の深層ろ過、プラスミド濃縮、及び透析ろ過を含む。その後、ｐＤＮＡ精製プロセスは、典型的には、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）の使用を含み、それには、低い伝導度を有する塩を使用して陰イオン交換材料にｐＤＮＡを結合させ、それに続く、高い伝導度を有する塩を用いたｐＤＮＡの溶出、緩衝液交換を伴う接線流ろ過、及び、次に、画分を含むｐＤＮＡをさらなる精製工程に供し、例えば、ＰｌａｓｍｉｄＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ（登録商標）（ＰＳＸ）クロマトグラフィー（例、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙなどから入手可能）により、スーパーコイルｐＤＮＡをさらに濃縮すること、しばしば、それに続き、エンドフィル緩衝液を使用した緩衝液交換を伴うさらなる接線流ろ過工程を含む。陰イオン交換クロマトグラフィーを使用してｐＤＮＡを精製又は単離するためのこれらの公知の方法では、溶出工程は、典型的には、溶出緩衝液中の塩濃度を徐々に増加させることにより達成する。

【0007】

最初の結合工程及び溶出工程に続き、さらなる工程が、上記のように、許容可能な純度及び収量でｐＤＮＡを得るために要求される。さらに、ｐＤＮＡを精製する既存の方法が、不良な選択性及び不良な回収を招くことは公知である。公知の方法は、このように、ｐＤＮＡの効率的で費用効果の高い分離を提供することはできない。これらの公知の方法の多くは、それらが追加の分離、廃棄、及び品質管理の工程を要求するため、プラスミドＤＮＡの調製において望まれないであろう、ＰＥＧ又は他の添加剤を使用するという欠点に悩まされていることは注意に値する。これらは困難で、時間がかかり、より高価になりうる。これらの追加工程により、精製プロセスに費用が追加され、精製のために必要な時間が増加するため、精製の間に追加工程の多くについての必要性を排除し、それにより、ｐＤＮＡの純度又は収量を損なうことなく、精製のために要求される時間を低下させる、ｐＤＮＡの精製又は単離のための方法についての必要性が存在する。

【0008】

当業者により理解されるように、生体分子（例えばｐＤＮＡなど）の精製のための公知のプロセスに対するさらに別の欠点は、そのような方法を大規模生産、特に医薬品グレードのｐＤＮＡの大規模生産に適用するための困難である。大規模生産には、多くの既存の制約、例えば、個人の安全性の問題及び有害廃棄物の考慮事項などがある。さらに、大規模でのｐＤＮＡのベンチスケール精製プロセスの適用は、ほとんど常に、精製ｐＤＮＡの減少した収量を招く。これらの制限を仮定すると、改善された純度を伴い、高収量でｐＤＮＡを提供するだけでなく、しかし、大規模生産のためにも使用してもよい、ｐＤＮＡの精製又は単離の方法を提供することが望ましいであろう。

【発明の概要】

【0009】

本発明の第１の態様は、混合物から目的の生物学的分子を単離又は精製するための方法に関し、この方法は、陰イオン交換材料への目的の生物学的分子の選択的結合を可能にする濃度の塩を含む溶液の存在において、目的の生物学的分子を含む混合物を陰イオン交換（ＡＥＸ）材料と接触させること；及び、目的の生物学的分子を、精製された生物学的分子を含む溶離液を提供する濃度の塩を含む溶出剤で溶出することを含む。一部の実施形態では、溶離液中の当該目的の生物学的分子を含む画分又は画分を、場合により収集する。目的の精製された生物学的分子は、一部の例では、その後、収集された画分のいずれか１つ又は全てから単離されうる。

【0010】

一部の実施形態では、ＡＥＸ材料への目的の生体分子の選択的結合を可能にする濃度で使用される塩は、コスモトロピック塩、例えば、クエン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、又は当該塩の混合物である。

【0011】

一部の実施形態では、精製された生物学的分子を含む溶離液を提供する濃度で溶出剤中に存在している塩は、カオトロピック塩、例えば塩化アンモニウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硝酸マグネシウム、グアニジニウム塩酸塩、又はそれらの混合物などである。

【0012】

本発明の方法により精製される生物学的分子は、典型的には、高極性／荷電生体分子、例えば核酸などである。本明細書中に記載する新規方法は、細菌のゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、及びエンドトキシンを含んではならない、プラスミドＤＮＡ、特に医薬品グレードのスーパーコイルプラスミドＤＮＡ（ｓｃ ｐＤＮＡ）の高速で非常に効果的な精製のために特に適していることが見出された。

【0013】

別の態様では、本発明は、目的の生体分子を含む混合物をＡＥＸ材料と接触させる前に有利に使用することができる、有利なサンプル調製工程を提供する。

【0014】

この態様では、目的の生物学的分子を含む混合物の固体成分（例えば細胞破片又は緩衝系中に不溶性の他の材料など）は、相分離及び／又はろ過により便利に分離される。この態様の一部の実施形態では、固体成分の除去は、単純な二相分離を介して達成され、それにおいて緩衝液が加えられ、混合物の密度を約１．１ｋｇ／Ｌより大きくなるまで増加させる。混合物の密度における増加によって、固体成分が上部に浮遊し、混合物の液体部分（目的の生物学的分子を含む）は次に、ろ過工程を要求することなく（又は、有意に低下した固体材料の含量に起因して、より高いろ過能力を少なくとも提供し、それにより、プロセスの拡張が可能になる、即ち、大規模生産のために有用となる）便利に排出することができる。このサンプル調製工程は、一部の実施形態では、本明細書中に記載する新規精製方法と有利に組み合わせることができる。

【0015】

本発明の別の関連する態様は、上記の相分離工程のためのチューリップ型容器又はタンクの使用に関する。チューリップ型容器は、目的の生物学的分子（例えばプラスミドＤＮＡなど）を含む混合物の液体部分からの固体成分の便利で効果的な分離のために特に有利であることが見出された。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】作業例において精製されるサンプルの生物学的分子として使用されるプラスミドベクターｐＵＣ１９の概略図を描写する。

【図2A】ＡＥＸ材料としてＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑを使用した結合緩衝液スクリーニングの結果に関するアガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）データを示す。

【図2B】同上。

【図2C】同上。

【図2D】同上。

【図3A】ＡＥＸ材料としてＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑを使用した溶出緩衝液スクリーニングの結果に関するアガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）データを示す。

【図3B】同上。

【図3C】同上。

【図3D】同上。

【図4】溶出勾配を拡大したＡＥＸクロマトグラフィーユニット（Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ）のクロマトグラフィープロファイルを描写する。

【図5】ＡＥＸクロマトグラフィー工程（Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ）からの画分のアガロースゲル電気泳動データを示す。

【図6】図３（破線）及びスタンダード（実線）において描写するＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ溶出プール１からのＡＥＸ－ＨＰＬＣトレースを示す。

【図7】Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑクロマトグラフィー工程からの添加及び溶出プールのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析データを示す。

【図8】ＡＥＸクロマトグラフィー工程を含む一次回収プロセスの概略図を含む。

【図9】Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑを使用したＡＥＸユニットのクロマトグラフィープロファイルを描写する。

【発明を実施するための形態】

【0017】

当業者により理解されるように、プラスミドＤＮＡについての種々の治療的適用を考慮して、優れた純度で大量にプラスミドＤＮＡを精製するための単純で拡張可能な方法を開発することが非常に望ましく、特に、なぜなら、典型的には小規模生産、例えば実験室及びベンチスケールの生産などのために適している多くの公知の分離／精製工程を大規模で十分に変換できないためである。

【0018】

本発明は、生物学的分子、例えば、プラスミドＤＮＡの単離又は精製のための方法を提供する。特に、本発明は、定義された異常な条件下での陰イオン交換クロマトグラフィーの使用を介した、開環状ｐＤＮＡ、線状ｐＤＮＡ、エンドトキシン、ＲＮＡ、リポ多糖、ゲノムＤＮＡ、タンパク質、及び／又はそれらの組み合わせを含む不純物を含まないプラスミドＤＮＡ、さらにより具体的にはスーパーコイルプラスミドＤＮＡの精製又は単離の方法を含む。本発明の方法は、生物学的分子、例えばプラスミドＤＮＡ（特にスーパーコイルプラスミドＤＮＡ）などの限られた数の工程での、高純度及び優れた収量を伴う大規模な単離又は精製のために特に適している。特に、本発明の精製方法は、最大１０，０００リットルの発酵作業容量での大規模生産のために有利に使用することができる。

【0019】

用語「目的の生物学的分子」、「目的の生体分子」、「標的分子」は全て同義語として使用され、精製方法に供される混合物中に存在する他の成分又は不純物から精製される分子を指すことが理解されるであろう。

【0020】

不純物は、宿主細胞タンパク質、エンドトキシン、宿主細胞ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含むが、これらに限定しない。不純物と見なされるものは、本発明の方法が実行される状況に依存しうることが理解されるであろう。「不純物」は、宿主細胞由来である場合と、そうでない場合がある、即ち、それは、宿主細胞の不純物である場合と、そうでない場合がある。

【0021】

目的の生物学的分子（例えばプラスミドＤＮＡなど）を「単離」又は「精製」することは、標的分子が最初に関連付けられる他の成分からの標的分子の濃縮を意味する。所望の及び／又は入手可能な精製の程度を本明細書中で提供する。好ましくは、本発明の方法は、約５倍濃縮、好ましくは約１０倍濃縮、好ましくは約２０倍濃縮、好ましくは約５０倍濃縮、好ましくは約１００倍濃縮、好ましくは約２００倍濃縮、好ましくは約５００倍濃縮、好ましくは約１０００倍濃縮をもたらす。あるいは、精製の程度は、別の成分に関する、又は結果としての調製物に関する第１の成分のパーセンテージとして表現してもよい。そのようなパーセンテージの例を本明細書中に提供する。

【0022】

本発明者らは、驚くべきことに、目的の生物学的分子、例えば（スーパーコイル）プラスミドＤＮＡなどを、迅速、単純、及び容易な様式で精製することが可能であることを見出した。これは、目的の生体分子を含む混合物を、精製される生物学的分子の高度に選択的な結合をもたらす条件下で陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー材料と接触させることにより達成されるが、混合物中の他の成分はＡＥＸ材料に結合しない。

【0023】

この点で、本発明者らは、かなり高濃度の特定の塩を有する溶液中でＡＥＸ材料を用いて精製される生体分子を含む混合物を添加することによって、ＡＥＸ材料への所望の生体分子の非常に特異的な結合がもたらされること、即ち、溶液中の大半の成分がＡＥＸ材料に結合されていないことを見出した。これらの添加条件は、ＡＥＸクロマトグラフィーではかなり珍しいと考えられており、それにおいて精製されるサンプルを、典型的には、低イオン強度の条件下でＡＥＸ材料と接触させ、その後に溶出緩衝液の塩濃度／イオン強度を（徐々に又は段階的に）増加させることにより溶出される。言い換えれば、本発明者らにより特定された特定の添加条件によって、ＡＥＸクロマトグラフィー工程の添加段階の間に既に標的分子の効果的な濃縮が可能になり、本明細書中で以下に詳細に記載するように、適切に選択された溶出条件の間でのさらなる精製が可能である。

【0024】

このように、ＡＥＸクロマトグラフィー工程によって、本発明者により特定された条件下で用いられる場合、単一の精製工程において本質的に全ての不要な混入物から所望の生体分子を分離することが可能になる。実際に、本発明者らにより見出された条件によって、ＡＥＸ材料への標的分子のその効果的で高度に選択的な結合に起因して、目的の生体分子の精製において一般に適用される多くの準備の前精製工程を省くことさえ可能になるが、なぜなら、本明細書中で以下でより詳細に説明するように、混入物の多くは、それらの注意深く選択された条件下では単に結合しないためである。

【0025】

本発明は、一般的に、混合物から目的の生物学的分子を単離又は精製するための方法に関し、それにおいて、この方法は、陰イオン交換材料への目的の生物学的分子の選択的結合を可能にする濃度の塩を含む溶液の存在において、目的の生物学的分子を含む混合物を陰イオン交換（ＡＥＸ）材料と接触させることを含み；及び、ＡＥＸ材料から目的の生物学的分子を、精製された目的の生物学的分子を含む溶離液を提供する濃度の塩を含む溶出剤で溶出する。

【0026】

本発明の文脈における「選択的結合」は、混合物中の他の成分の大部分が、適切な濃度の塩を含む溶液中で接触した場合に、ＡＥＸ材料に結合しないことを意味する。当業者は、生物学（及び化学）において、結合、溶出などが１００％排他的であることは決してないことを理解するであろうが、しかし、本発明の目的のために、「選択的結合」は、塩溶液の存在における他の成分（「混入物」）の少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、又はさらに９５％が、接触時にＡＥＸ材料に結合しないであろうことを意味する。便宜のために、混合物とＡＥＸ材料との接触はまた、本明細書中で「添加工程」（カラムクロマトグラフィーにおいて一般に使用されるが、本方法は無論、カラムクロマトグラフィーに限定されない）として言及してもよく、及び精製される混合物を含む塩溶液はまた、「添加緩衝液」又は「添加溶液」として言及する。塩溶液自体は、本明細書中で「結合緩衝液」として言及してもよい。

【0027】

典型的には、溶離液中の目的の精製された生物学的分子を含む画分又は画分を収集するが、これは（例えば、目的の分子の濃度／純度を、例えば、ＵＶ分光法により、溶液中で直接測定できる分析精製の実行において）常に必要なわけではない。同様に、大半の場合で、目的の生物学的分子が、本明細書中で以下に概要を述べるように、収集された画分のいずれか１つ又は全てからさらなる使用のために単離される。

【0028】

大半の生体分子について、単離は必ずしも沈殿及び乾燥を意味しないが、しかし、むしろ、精製された分子を、分解に対する安定性を、例えば、長期保存において確実にする、典型的には緩衝化された溶液中に保つことを意味する。単離は、このように、また、濃縮、即ち、標的分子の濃度を増加させるための溶媒の一部の除去を含みうる。当技術分野において周知であるように、生体分子（タンパク質又は核酸ベースの生体分子でも）を含む溶液は、多くの場合で、凍結溶液中に有利に保存することができるが、一部の例では、溶媒も、例えば、凍結乾燥により除去してもよい。

【0029】

ＡＥＸクロマトグラフィーは、典型的には、精製される混合物を、塩を含む緩衝液／低いイオン強度を伴う、即ち、かなり低い塩濃度の緩衝液中のＡＥＸ材料上に添加することにより特徴付けられる。これらの条件によって、高い極性の分子及び／又は荷電分子がＡＥＸ材料上の荷電基に結合することが可能になり、より低い極性／親水性を有する成分は、そのような条件下では結合しない。目的の分子は次に、典型的には、塩／緩衝液の濃度を連続的に増加させることによりカラムから溶出させ、増加したイオン数は、ＡＥＸ材料に依然として結合している分子の結合と競合する。所望の高い程度の純度を達成するために、溶出緩衝液のイオン強度を増加させる勾配が、典型的には、ＡＥＸクロマトグラフィーを介した精製のために使用される。多くの場合では、しかし、従来のＡＥＸクロマトグラフィーによって、多過ぎる混入物（特に荷電した／高い極性の混入物）がまた、添加段階の間にＡＥＸ材料に結合するため、十分に高い純度が達成されず、次に、目的の分子と同時に溶出される。

【0030】

本発明者らは、驚くべきことに、比較的高い濃度の特定の塩を含む溶液中で、添加工程（即ち、混合物とＡＥＸ材料との最初の接触）を行うことが可能であることを見出した。一部の実施形態では、当該添加段階において使用される適切な塩は、コスモトロピック塩として特徴付けることができ、即ち、それらは、水分子を好適に相互作用させることにより、水－水相互作用（「秩序作り（ｏｒｄｅｒ－ｍａｋｉｎｇ）」）の安定性及び構造に寄与し、それによって高分子、例えばタンパク質などにおける分子内相互作用の安定化に導く。イオン性コスモトロピックは、典型的には、溶液の全体的な粘着性の増加に導く、強い溶媒和エネルギーにより特徴付けられる（溶液の粘度及び密度の増加によりしばしば示される）。対照的に、カオトロピック薬剤／塩（無秩序メーカー（ｄｉｓｏｒｄｅｒ－ｍａｋｅｒ））は逆の効果を有し、水構造を破壊し、無極性溶媒粒子の溶解度を増加させ、及び溶質凝集体を不安定化させる。

【0031】

本発明者らは、十分に高い濃度でＡＥＸ材料と接触させられる溶液中にそのようなコスモトロピック塩を使用することによって、特定の生体分子（特に高い電荷密度を有する生体分子、例えばプラスミドＤＮＡなど）の高度に選択的な結合に導かれ、他の成分が、当該ＡＥＸ材料への結合から防止されることを見出している。このように、一部の例では、十分に高い濃度のコスモトロピック塩を含む溶液中での添加工程の「フロースルー」は、目的の生体分子を含む混合物からの、本質的に全てではないが、大半の混入物を既に含むであろう。

【0032】

コスモトロピック又はカオトロピックであるという特性は、通常、塩（対イオンを含む）ではなく、特定のイオンに起因することが理解されるであろう。このように、塩はコスモトロピックであることが公知である陰イオンを含みうることが十分にありうるが、対イオンはむしろカオトロピックであることが公知である。そのような塩は、標的分子をＡＥＸ材料に選択的に結合する際に機能することがある（又はしないことがある）。しかし、当業者は、所与の塩が、高濃度で、ルーチンの実験を単に行うことにより、ＡＥＸ材料上の標的分子の選択的結合を確実にするか否かを見出すことができるであろう。

【0033】

大半の実施形態では、ＡＥＸ材料からの標的分子の溶出は、次に、目的の生物学的分子を溶出するために十分に高い濃度のカオトロピック塩を含む溶離液（即ち、ＡＥＸ材料に結合した成分を脱離させるために使用される溶液又は緩衝液）により達成することができる。溶出段階は、このように、多くの実施形態では、従来のＡＥＸクロマトグラフィーと実質的に異ならないが、しかし、添加段階の間でのＡＥＸ材料への結合におけるより高い特異性に起因して、溶離液の純度はしばしば有意に増加する。

【0034】

一部の実施形態では、本発明の方法により精製される生物学的分子は、核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡを含む）である。例えば、目的の生物学的分子がプラスミドＤＮＡである場合、好ましい結果が、本発明の方法を用いて達成された。プラスミドＤＮＡはしばしば異なる立体構造で存在する：「未変性」スーパーコイル（ＳＣ）立体構造とは別に、プラスミドＤＮＡは開環状（ＯＣ）で、又はさらに線状で存在しうる。スーパーコイルプラスミドＤＮＡ（ｓｃ ｐＤＮＡ）は、典型的には、プラスミドＤＮＡについて所望の（及び商業的に関連する）立体構造を表すため、本発明のこの態様の一部の実施形態における目的の生体分子は、ｓｃ ｐＤＮＡである。

【0035】

精製／単離されるプラスミドＤＮＡは、典型的には、哺乳動物ＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、非コードＤＮＡ、又はウイルスＤＮＡを含みうる。一部の例では、プラスミドＤＮＡは、目的のポリペプチドを発現することが可能なＤＮＡを含むであろう。精製方法は、一般的に、プラスミドＤＮＡのサイズに依存せず、即ち、わずか３５０ｂｐを伴うミニベクターならびに最大２０の遺伝子（３５ｋｂｐ）を含む大きなプラスミドベクター、及びその間の何でも、本明細書中に記載されている方法により効果的に精製されうる。

【0036】

本発明の方法は、他の混入物からのプラスミドＤＮＡの効果的な精製を可能にする。したがって、特定の実施形態では、結果として生じるプラスミドＤＮＡの純度は、少なくとも９０％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％である。

【0037】

一部の実施形態では、この方法によって、他のプラスミドＤＮＡ形態、例えば線状プラスミドＤＮＡ、開環状プラスミドＤＮＡ、及び、場合により、他の核酸分子などのからのスーパーコイルプラスミドＤＮＡの画分さえ達成される。

【0038】

目的の生体分子は、典型的には、生物学的プロセス（例えば細胞培養／発酵プロセスなど）により得られるため、標的分子を含む混合物は、多くの実施形態では、プラスミドＤＮＡ（スーパーコイルｐＤＮＡ、開環状ｐＤＮＡ、及び線状ｐＤＮＡを含む）、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、リポ多糖、エンドトキシン、タンパク質、又は先の成分の任意の組み合わせを含むであろう。

【0039】

添加工程の間にＡＥＸ材料への目的の生物学的分子の選択的結合を可能にする塩の濃度は、典型的には、標的分子及び選ばれたＡＥＸ材料の性質に依存することが理解されるであろう。一部の実施形態では、標的分子の高度に選択的な結合は、約０．５Ｍを上回る、又は０．６Ｍを上回る、又は０．８Ｍを上回る塩濃度で達成されている。特定の実施形態では、標的分子の選択的結合を可能にする溶液の塩濃度は、約０．５Ｍと約４．０Ｍの間、又は約０．８Ｍと約２．０Ｍの間、又は約１．０Ｍと約２．０Ｍの間、例えば１．５Ｍなどである。

【0040】

用語「約」は、本明細書中では、およそ、範囲中で、大まかに、又は前後を意味するために使用する。用語「約」が数値範囲との併用において使用される場合、それによって、示された数値を上回って及び下回って境界を拡張することによりその範囲が改変される。一般的に、用語「約」は、本明細書中では、１０％の分散により、述べた値を上回って及び下回って数値を変更するために使用する。

【0041】

以前に記述したように、上の濃度のコスモトロピック塩は、本発明の精製方法の添加工程のために好ましい。任意の事象で、添加工程のための塩の理想的な濃度は、標的分子及びＡＥＸ材料の実際の特性に依存的であるが、しかし、ルーチン実験を通じて当業者により簡単に決定されることができる。一度、適した濃度が決定されたら、それは、精製される標的分子を含む添加溶液と同じ濃度のコスモトロピック塩を含む緩衝液でＡＥＸ材料を平衡化するための一貫した再現可能な結合のために有用でありうる。

【0042】

任意の事象で、適したコスモトロピック塩の例は、硫酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、リン酸カリウム、クエン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、又はそれらの混合物を含むが、これらに限定しない。例えば、硫酸アンモニウムは、精製される標的分子がプラスミドＤＮＡである場合、添加段階のための特に有用なコスモトロピック塩であることが見出された。

【0043】

実施例１から分かるように、高濃度（＞０．５Ｍ）の硫酸アンモニウムを含む溶液中の、場合により事前に平衡化されたＡＥＸ膜上に混合物を添加することによって、ＡＥＸ材料へのｐＤＮＡの高度に選択的な結合が確実になり、ＲＮＡ及び他の混入物はＡＥＸ膜に結合しなかった（図２Ａ及び図２Ｂを参照のこと）。したがって、添加溶液中の硫酸アンモニウムの有用な濃度は、特定の実施形態では、約０．５Ｍから約２．０Ｍである。

【0044】

当業者は、他の要因が混合物中の成分の結合挙動に影響を与えうることを理解するであろう。これらの要因の１つは、溶液のｐＨである。生体分子については、精製のための利用可能なｐＨ範囲は自然とかなり限定される。標的分子の安定性に負の影響を与えうるｐＨ条件を回避するために（例、生体分子の加水分解を促進することによる）、目的の生体分子の添加及び溶出の間のｐＨ値は、典型的には、ｐＨ２からｐＨ１１の範囲であるが、中性に近いｐＨ値が、一般的には、特に酸性又はアルカリ性条件での分解に感受性である生体分子については好ましいであろう。例えば、一部の実施形態では、ＡＥＸ材料と接触したコスモトロピック塩を含む溶液（即ち、「添加緩衝液」）のｐＨは、ｐＨ４からｐＨ９の間、又はｐＨ５とｐＨ８の間、又はｐＨ６とｐＨ１０の間、又はｐＨ６．０から８．０の間、例えば、ｐＨ７．０前後である。当業者は、最適なｐＨ条件が、ルーチン実験により、当業者により決定されうることを理解するであろう。

【0045】

例えば、溶出工程の間でのｐＨ変化によって、ＡＥＸ材料に結合した生体分子の結合挙動／強度が変化しうるが、従って、一部の実施形態では、ＡＥＸ材料からの標的分子の制御された選択的放出のために使用されうることがさらに理解されよう。しかし、他の例では、ＡＥＸ材料への標的分子の結合は、本質的にｐＨに非依存的である。例えば、プラスミドＤＮＡの結合は、広いｐＨ範囲（ｐＨ２と低い）内では変化しなかった。

【0046】

標的分子の溶出のために選択された条件に関して、目的の精製された生物学的分子を含む溶離液を提供する塩、好ましくはカオトロピック塩の濃度は、典型的には、約０．２５Ｍから約４．０Ｍ、又は約０．４Ｍから約３．０Ｍ、又は約０．５Ｍから２．０Ｍである。当技術分野において公知であるように、溶出工程は、溶出剤中の（好ましくはカオトロピック）塩の濃度を変動させることによる勾配溶出を含みうるが、それは、典型的には、溶出剤中の塩の濃度を（継続的又は段階的に）増加させることを含む。

【0047】

一部の実施形態では、溶出工程のためのカオトロピック塩は、塩化アンモニウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩酸グアニジニウム、及びそれらの混合物からなる群より選択される。特にプラスミドＤＮＡの精製のための、特に有用な塩は硫酸マグネシウムである。これらの実施形態では、カオトロピック塩、例えば、硫酸マグネシウム又は塩化ナトリウムの濃度は、典型的には、少なくとも約０．５Ｍであり、一部の例では、０．５Ｍから約２．０Ｍ又は約０．５Ｍから約１．０Ｍの範囲でありうる。

【0048】

再び、添加緩衝液中に含まれるコスモトロピック塩の場合と同様に、標的分子の溶出のためのカオトロピック塩及びその最適な濃度は、目的の生物学的分子の性質及び精製のために選ばれた特定のＡＥＸ材料に依存し、ルーチン実験を通じて、当業者により簡単に決定されることができる（実施例を参照のこと）。ＡＥＸ材料は、典型的には、別の精製の実行用に再利用することができるため、最後に高塩濃度の溶出物を加えて（例、約２．０から４．０Ｍ ＮａＣｌで）、それによってＡＥＸ材料から任意の結合材料を本質的にストリッピングすることが有用でありうる。

【0049】

原則として、任意の利用可能なＡＥＸ材料を、本発明の方法の状況において使用してもよい。例えば、この方法は、異なるビーズ化学及び／又はリンカーを用いて、高及び低リガンド密度で、弱い及び強いＡＥＸ設定で適用することができる。適したＡＥＸ材料は、例えば、陰イオン交換膜、陰イオン交換樹脂、三次元微孔性ヒドロゲル構造、超多孔性ビーズの充填床、マクロ多孔性ビーズ、モノリス、アガロースビーズ、架橋アガロース、シリカビーズ、大孔径ゲル、メタクリレートベースのビーズ、ポリスチレンベースのビーズ、セルロースベースのビーズ、デキストランベースのビーズ、ビスアクリルアミドベースのビーズ、ポリビニルエーテルベースのビーズ、セラミックベースのビーズ、又はポリマーベースのビーズとして利用可能である。商業的に利用可能なＡＥＸ材料の例は、とりわけ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ（登録商標）、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ（登録商標）、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｅ（登録商標）、Ｐｏｒｏｓ ＸＱ（登録商標）、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ（登録商標）、Ｎｕｖｉａ Ｑ（登録商標）、Ｃａｐｔｏ Ｑ（登録商標）、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＰｏｌｙＱｕａｔ（登録商標）、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、ＮＨ２－７５０Ｆ（登録商標）、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、Ｇｉｇａ Ｃａｐ（登録商標）Ｑ－６５０Ｍ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ ＣＯＯ、ＮａｔｒｉＦｌｏ（登録商標）ＨＤ－Ｑ、及び３Ｍ（商標）Ｅｍｐｈａｚｅ（商標）ＡＥＸ Ｈｙｂｒｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ（全て登録商標名）を含む。

【0050】

特により大きな、工業規模の精製のために、この方法は、ＡＥＸ膜クロマトグラフィー又は樹脂床クロマトグラフィーを使用して行ってもよい。一部の実施形態では、陰イオン交換膜は、約３．０μｍから約５．０μｍの平均孔径を有し、好ましくは、平均孔径は約３．０μｍである。

【0051】

あるいは、この方法は、ＡＥＸカラムクロマトグラフィーを使用して行ってもよい。これらの実施形態では、陰イオン交換樹脂は、好ましくは、約３０μｍから約３００μｍの平均粒子径を有する。

【0052】

任意の事象では、本明細書中に記載する方法は、ＡＥＸ材料が特定の形態であることを要求せず、即ち、形態を問わない、他のＡＥＸ材料、例えば上記の他の代替物なども、本明細書中に記載する精製方法における精製薬剤として用いてもよいことが当業者により理解されるであろう。

【0053】

この方法は優れた精製能力を提供するため、それは、典型的には、任意の有機溶媒、界面活性剤、グリコール、ヘキサミンコバルト、スペルミジン、及び／又はポリビニルピロリドンの非存在において行ってもよく、それにより、最終的な標的分子を単離形態で提供する前でのそのような薬剤の除去をもはや必要としない。

【0054】

ＡＥＸ精製工程は本発明の主な態様を表すが、目的の生体分子のための精製方法は、典型的には、ＡＥＸクロマトグラフィー工程の前に行われる工程を含む、さらなる方法の工程、しかしまた、場合により、ＡＥＸクロマトグラフィー工程に続いて行われる追加の工程を含む。

【0055】

以前に記述したように、目的の生物学的分子は、しばしば、いわゆる細胞培養物中で成長させた細胞から得られる。目的の生物学的分子は、特定の場合では、分子が細胞により周囲の細胞培養培地中に分泌される場合、かなり容易な方法で細胞培養物から得られうる。しかし、大半の場合では、標的分子は、当技術分野において周知のように、物理的及び／又は化学的手段により達成されうる細胞溶解を介して細胞を破壊することにより細胞から放出される必要がある。細胞溶解によって、典型的には、多数の宿主細胞由来の水溶性及び不溶性の混入物、例えば細胞膜、細胞小器官、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、及び宿主細胞タンパク質などと一緒に標的分子がもたらされる。このように、標的分子の精製では、典型的には、これらの混入物の除去が要求され、特に、固体（即ち、不溶性）混入物は、典型的には機械的手段により、ＡＥＸクロマトグラフィー工程の前に除去される。

【0056】

したがって、本発明の一部の実施形態では、この方法は、混合物をＡＥＸ材料と接触させる前に、目的の生物学的分子を含む混合物から固体成分を分離することをさらに含む。

【0057】

精製される混合物からの固体成分の除去は、例えば、ろ過又は相分離により達成されうる。一部の例では、この方法の工程によって、二相分離、例えば固液相分離などを介して固体成分の除去が達成される。

【0058】

より良好な分離を達成するために、固体成分を含む混合物は、一部の実施形態では、例えば、混合物の密度を、例えば、約１．１ｋｇ／Ｌよりも大きな密度まで増加させることにより改変してもよい。混合物の密度におけるこの増加によって、混合物の上部に浮遊する固体成分（例えば細胞破片又は他の沈殿物など）がもたらされる。目的の生物学的分子、例えばプラスミドＤＮＡなどを含む溶液を次に、混合物を含む容器／タンクの底部から便利に排出することができる。密度の調整、例えば少なくとも約１．１ｋｇ／Ｌなどによって、従って、その後にＡＥＸクロマトグラフィーに供することができる清澄化された混合物を得るためにろ過が要求されない混合物がもたらされる。溶液の密度は、一般的に、種々の操作により増加させることができる。例えば、水溶性塩、糖（例、グルコース、スクロース、グリセロールなど）、尿素、又は水溶液の密度を増加させる他の成分。特に、本発明の精製方法の状況において、それは、しかし、ＡＥＸクロマトグラフィー工程の添加工程のために適したコスモトロピック塩、例えば本明細書中に記載する例示的なコスモトロピック塩のいずれかなどを用いることが有利でありうる。

【0059】

あるいは、不溶性混入物を除去するための相分離技術はまた、他の方法において混合物の密度を変更することにより達成されうる。例えば、混合物にアルコール（例、エタノール、メタノール、イソプロパノールなど）を加えることにより、密度が減少し、固体成分が容器又はタンクの底に沈降しうる（場合により、沈降は遠心分離により支援されうる）。別の選択肢は、液体／液体二相系、例えば、不溶性粒子がＰＥＧ相中にあり及び標的分子（例えばプラスミドＤＮＡなど）が塩相中にあるＰＥＧ／塩二相系を確立するように、混合物に液体非水性化合物を加えることでありうる。

【0060】

さらに、軽いろ過、例えば、深層ろ過が、一部の場合では、混合物の液体の排出部分及び／又は混合物の最終的な残りの容積のいずれかについて（収量を最大化するために）依然として適用されうることが理解されよう。任意の追加のろ過工程によって、混合物の液体部分中の残っている固体粒子の除去が確実になる。任意の事象では、そのようなろ過はずっと急速であり、混合物中のずっと低い固形分に起因して、フィルターが詰まらないことが理解されるであろう。深層ろ過装置は、例えば、Ｍｅｒｃｋ－ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＣｌａｒｉｓｏｌｖｅ（登録商標）深層フィルターの名称の下で商業的に利用可能である。

【0061】

この方法の工程はまた、他の精製方法の準備段階において使用することができるため、本開示の別の態様は、上の二相分離自体に関係し、即ち、その後に本発明のＡＥＸクロマトグラフィー工程が続かない、又は必ずしも続かない。

【0062】

本発明者らはまた、特に密度が、固体成分が固体／液体二相混合物の上部に浮遊することを確実にする、少なくとも約１．１ｋｇ／Ｌに調整された場合、即ち、容器／タンクの直径が、液相が排出される容器の底部の直径よりも大きい場合（例えば、図８中のチューリップ型容器を参照のこと）、チューリップ型容器又はタンクが混合物中の固体成分の除去のために特に有用であることを見出している。したがって、上に記載する二相分離のためのチューリップ型のタンク又は容器の使用は、本開示の別の態様を表す。

【0063】

上に記載する二相分離は、任意のその後の精製工程、例えば本発明のＡＥＸクロマトグラフィー工程などのために目的の生物学的分子を含む溶液を調製するための非常に効果的で、高速で、再現性のある、経済的な方法を表す。特に、密度調整が、その後のＡＥＸクロマトグラフィー工程において使用される比較的高濃度のコスモトロピック塩（例、硫酸アンモニウム）を用いて既に達成されている場合、二相分離は、細胞上清を回収した後に要求される（恐らくは、混合物をＡＥＸ材料と接触させる前に深層ろ過と組み合わされる）唯一の工程でありうる。コスモトロピック塩の一部は緩衝剤として作用するため、当該コスモトロピック塩との混合物の密度を調整する別の利点は、より少ない中和緩衝液（標的分子の起こりうる分解を防止するため）が細胞溶解の直後に要求されることである。

【0064】

さらに、標的分子を含むより高密度の溶液の単純な排出による固体成分の便利な除去は、その後の（任意であるが）深層ろ過のために非常に有利であり、なぜなら、とりわけ、不溶性粒子の小さな画分だけがフィルター上で処理されるため、要求されるろ過面積が大きく低下するためである。

【0065】

本発明のＡＥＸクロマトグラフィー方法は、一部の実施形態では、目的の精製された生物学的分子の溶出後のさらなる工程を含みうる。例えば、一部の場合では、この方法は、溶離液から目的の生物学的分子を沈殿させる工程をさらに含む。沈殿は、当技術分野で一般的に公知である種々の方法、例えば標的分子を含む溶離液画分のｐＨを変化させる、又は溶離液に貧溶媒又は他の添加剤を加えて、それにより、標的分子を溶離液から沈殿させる、などにより達成されうる。

【0066】

沈殿後、この方法は、一部の例では、接線流ろ過により溶離液をろ過し、沈殿した生物学的分子を単離することをさらに含みうる。例えば、一部の場合では、接線流ろ過工程において使用されるろ過膜の平均孔径は、≦０．４５μｍ又は≦０．２μｍである。

【0067】

一部の例では、この方法は、場合により、保存の間に凍結乾燥形態でプラスミドＤＮＡを安定化しうる糖の存在における、目的の精製された生物学的分子の凍結乾燥をさらに含みうる。多くの単糖又は二糖を、当技術分野において一般的に公知であるように、当該目的のために使用することができる。

【0068】

他の実施形態では、この方法は、精製された標的分子を含む画分の希釈、濃縮、又は緩衝液交換をさらに含む。特定の場合では、標的分子は、化学的に修飾されうる（例、ビオチン化、メチル化、アセチル化）、又はより小さな小片に切断されうる（例、核酸の場合での制限酵素による消化）。

【0069】

特定の精製問題、及び標的分子のための供給源に依存し、一部の場合では、添加工程（即ち、陰イオン交換材料への生物学的分子の選択的結合を可能にする濃度の塩を含む溶液の存在において混合物をＡＥＸ材料と接触させる工程）からフロースルーをさらに収集することが有用でありうる。

【0070】

本明細書中で考察するように、ＡＥＸクロマトグラフィー工程は、目的の生体分子をＡＥＸ材料に選択的に結合させることが可能である、即ち、混合物中の不要な成分の大半は、これらの添加条件下でＡＥＸ材料に結合しない。例えば、細胞培養物からのプラスミドＤＮＡの精製のために、フロースルーは、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、タンパク質、細胞画分、又はそれらの組み合わせを含みうる。一部の実施形態では、フロースルーは、ＡＥＸ材料と接触させた混合物中に存在した実質的に全て（即ち、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％）のＲＮＡを含む。

【0071】

精製は、一部の例では、洗浄工程をさらに含めることにより改善させてもよい。このように、一部の実施形態では、この方法は、目的の生物学的分子の溶出の前に、洗浄緩衝液でＡＥＸ材料を洗浄することをさらに含む。一部の例では、洗浄を、追加の清浄な「添加」緩衝液（即ち、典型的には、比較的高濃度のコスモトロピック塩を含む）で継続してもよい。他の例では、洗浄緩衝液は、目的の生物学的分子の溶出のために要求される濃度よりも低い濃度のカオトロピック塩を含みうる。

【0072】

これらの場合では、洗浄緩衝液はコスモトロピック塩（恐らくは、添加緩衝液中よりも低濃度）を含みうる、又はそれはカオトロピック塩だけを含みうる。洗浄緩衝液用のカオトロピック塩は、好ましくは、塩化アンモニウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硝酸マグネシウム、及びそれらの混合物からなる群より選択する。特に、カオトロピック塩が緩衝能力を有さない場合、洗浄緩衝液は、ｐＨを所望のレベルに維持するための適した緩衝物質をさらに含みうる。単純化のために、洗浄緩衝液は、多くの場合で、溶出剤と同じカオトロピック塩を含むが、これは精製効率の点からは要求されないであろう。

【0073】

特に、標的分子の精製によって、非常に高レベルの純度で産物を産生しなければならない場合、本発明の方法は、典型的にはＡＥＸクロマトグラフィー工程から生物学的分子を溶出する及び、場合により、単離する工程に続く、追加の精製工程をさらに含みうることがさらに理解されるであろう。精製される標的分子がスーパーコイルプラスミドＤＮＡである一部の実施形態では、第２の精製工程は、従って、例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから商品名ＰｌａｓｍｉｄＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ（登録商標）、又は短く「ＰＳＸ」の下で入手可能なチオフィリック芳香族吸着クロマトグラフィー媒体の使用を含みうる。この特定の樹脂は、開環状及び／又は線状プラスミドＤＮＡからスーパーコイルプラスミドＤＮＡを分離する優れた選択性を有することが公知であり、従って、医薬品グレードのＤＮＡのスーパーコイル立体構造の最終的な濃縮のために使用してもよい。

【0074】

一部の実施形態では、この方法は、核酸、例えばプラスミドＤＮＡなどの精製及び単離後に、当該核酸によりコードされる目的のポリペプチドの発現のために当該核酸を使用するさらなる工程をさらに含むであろう。核酸は、これらの例では、好ましくはプラスミドＤＮＡである。核酸を介して産生されたポリペプチド、好ましくはプラスミドＤＮＡが、典型的には回収され、場合により精製されるであろう。最後に、この方法は、一部の場合では、場合により１つ又は複数の医薬的に許容可能な賦形剤を含みうる医薬組成物中へのポリペプチド（精製された核酸の発現を介して得られる）の製剤化さえ含みうる。

【0075】

あるいは、核酸、例えばプラスミドＤＮＡなどが、医薬的使用を直接的に意図される場合、この方法は、医薬組成物中への核酸の製剤化を含みうるが、それは再び、場合により、１つ又は複数の医薬的に許容可能な賦形剤を含みうる。本発明の方法により精製されたプラスミドＤＮＡは、ＤＮＡベースのワクチンとして使用されうる、又はプラスミドが次に細胞の転写及び翻訳装置を含み、治療実体をインサイチュで生合成する「プロドラッグ」として使用されうる。

【0076】

さらに他の実施形態では、この方法は、より短いオリゴヌクレオチド、例えばｓｉＲＮＡ又はアプタマー（短い一本鎖核酸セグメント（典型的には２０～６０ヌクレオチド））などの産生のための、又はＤＮＡｚｙｍｅ（ＲＮＡ骨格が、改善された生物学的安定性を付与するＤＮＡモチーフにより置換されたリボザイム類似体）の産生のための、ＲＮＡベースの薬物を含む、ＲＮＡの産生のための、精製された血漿ＤＮＡの使用をさらに含むであろう。

【0077】

ＡＥＸクロマトグラフィーを含む精製方法の好ましい変形は、ＡＥＸクロマトグラフィー工程の前に、目的の生物学的分子を含む溶液をＡＥＸ材料と接触させる前の細胞回収及び洗浄、細胞溶解、中和、及び凝集物除去の工程を含む。

【0078】

上に記述するように、ＡＥＸ添加工程により特定された条件によって、ＡＥＸ材料へのプラスミドＤＮＡの選択的結合が可能になる。このように、ＲＮＡは、典型的には標準的な低塩条件下でもＡＥＸ材料に結合するが、本明細書中に記載する添加条件下ではＡＥＸ材料に結合せず、又は実質的に結合せず、このように、単一工程において標的分子から定量的に除去することができる。

【0079】

本明細書中に記載する方法は、このように、ＲＮＡを塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）沈殿工程により除去する必要がないという大きな利点を有する。追加の精製工程を回避することは、無論、精製方法全体の収量、費用、及び期間の点で有益である。したがって、この方法は、特定の実施形態では、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）沈殿工程を含まないという点でさらに特徴付けられる。

【0080】

同じことが、本明細書中で特定した条件下でもＡＥＸ材料に結合しないタンパク質について言えます。開環状ｐＤＮＡ、線状ｐＤＮＡ、及びゲノムＤＮＡは全て、スーパーコイルプラスミドＤＮＡと比較してＡＥＸリガンドとの異なる相互作用の強度を有するため、それらのレベルをＡＥＸクロマトグラフィー工程の間に大きく低下させることができる。したがって、本明細書中で記載する及び特許請求する方法によって、目的の生体分子、例えばＡＥＸリガンドを有する材料を含む本質的に単一のクロマトグラフィー工程だけを含むプラスミドＤＮＡなどの単純で、迅速で、高度に効果的で経済的な精製が可能になる。

【0081】

先行技術において記載されているプラスミドＤＮＡ精製手順で一般に必要とされる多くの追加工程、例えば緩衝液交換、（複数の）深層ろ過、ＣａＣｌ_２沈殿、又は追加のクロマトグラフィー工程、例えばＰＳＸクロマトグラフィーなどを（要求されるｓｃ ｐＤＮＡの含量に依存して）回避することができる。最後に、本明細書中で記載する方法によって、大規模な生産プラント用に拡大することができる。

【0082】

本発明の種々の態様を一般的な用語で記載してきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、多くの改変及びわずかなバリエーションが可能であることは当業者には明らかであろう。本発明を、以下の非限定的な、番号付けした実施形態及び実施例への参照によりさらに記載する：
１．混合物から目的の生物学的分子を単離又は精製するための方法であって、以下を含む方法：
陰イオン交換材料への目的の生物学的分子の選択的結合を可能にする濃度の塩を含む溶液の存在において、混合物を陰イオン交換材料と接触させること；及び
精製された生物学的分子を含む溶離液を提供する濃度の塩を含む溶出剤で目的の生物学的分子を溶出すること；
場合により、溶離液中に当該生物学的分子を含む画分を収集し、さらに場合により、目的の当該生物学的分子が、収集された画分のいずれか１つ又は全てから単離される。
２．陰イオン交換材料への生物学的分子の選択的結合を可能にする濃度の塩が、コスモトロピック塩である、実施形態１の方法。
３．精製された生物学的分子を含む溶離液を提供する濃度の塩が、カオトロピック塩である、実施形態１又は実施形態２の方法。
４．精製される生物学的分子が核酸である、実施形態１から３の方法。
５．核酸がプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）であり、場合によりプラスミドＤＮＡがスーパーコイルプラスミドＤＮＡ（ｓｃ ｐＤＮＡ）である、実施形態４の方法。
６．プラスミドＤＮＡが、哺乳動物ＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、非コードＤＮＡ、又はウイルスＤＮＡを含む；場合により、プラスミドＤＮＡは、目的のポリペプチドを発現することが可能なＤＮＡを含む、実施形態５の方法。
７．精製及び／又は単離プラスミドＤＮＡの純度が少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％である、実施形態５又は実施形態６の方法。
８．混合物が、スーパーコイルプラスミドＤＮＡ、開環状プラスミドＤＮＡ、線状プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、リポ多糖、エンドトキシン、タンパク質、又はそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態１から７のいずれか１つの方法。
９．陰イオン交換材料への目的の生物学的分子の選択的結合を可能にする塩の濃度が、約０．５Ｍより大きく、場合により、陰イオン交換材料への生物学的分子の選択的結合を可能にする塩の濃度が、約０．８Ｍから約４．０Ｍである、先行する実施形態のいずれか１つの方法。
１０．精製された生物学的分子を含む溶離液を提供する塩の濃度が、約０．２５Ｍから約４．０Ｍである、先行する実施形態のいずれか１つの方法。
１１．溶出工程が、溶出剤中のカオトロピック塩の濃度を変動させることによる勾配溶出を含み、場合により、溶出剤中のカオトロピック塩の濃度を増加させる、先行する実施形態のいずれか１つの方法。
１２．生物学的分子がプラスミドＤＮＡであり、溶出工程が、他のプラスミドＤＮＡ形態、例えば線状プラスミドＤＮＡ及び開環状プラスミドＤＮＡなど、ならびに場合により、他の核酸分子からのスーパーコイルプラスミドＤＮＡの画分を含む、実施形態１１の方法。
１３．コスモトロピック塩が、硫酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びそれらの混合物からなる群より選択される、実施形態２から１２のいずれか１つの方法。
１４．コスモトロピック塩が硫酸アンモニウムである、実施形態１３の方法。
１５．硫酸アンモニウムの濃度が約０．５Ｍから約２．０Ｍである、実施形態１４の方法。
１６．コスモトロピック塩を含む溶液が、約５．０から約１０．０の、又は約５．０から約８．０の、又は約６．０から約８．０の範囲のｐＨ、あるいはｐＨ７を有する、実施形態２から１５のいずれか１つの方法。
１７．カオトロピック塩が、塩化アンモニウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩酸グアニジニウム、及びそれらの混合物からなる群より選択される、実施形態３から１６のいずれか１つの方法。
１８．カオトロピック塩が硫酸マグネシウムである、実施形態１７の方法。
１９．硫酸マグネシウムの濃度が約０．５Ｍから約１．０Ｍである、実施形態１８の方法。
２０．陰イオン交換材料が、陰イオン交換膜、イオン交換樹脂、三次元微孔性ヒドロゲル構造、超多孔性ビーズの充填床、大孔性ビーズ、モノリス、アガロースビーズ、架橋アガロース、シリカビーズ、大孔径ゲル、メタクリレートベースのビーズ、ポリスチレンベースのビーズ、セルロースベースのビーズ、デキストランベースのビーズ、ビスアクリルアミドベースのビーズ、ポリビニルエーテルベースのビーズ、セラミックベースのビーズ、又はポリマーベースのビーズより選択される、先行する実施形態のいずれか１つの方法。
２１．陰イオン交換材料が陰イオン交換膜である、実施形態２０の方法。
２２．陰イオン交換膜が、約３．０μｍから約５．０μｍの平均孔径を有し、好ましくは、平均孔径が約３．０μｍである、実施形態２１の方法。
２３．イオン交換樹脂が約３０μｍから約３００μｍの平均粒子径を有する、実施形態２０の方法。
２４．方法が、有機溶媒、界面活性剤、グリコール、ヘキサミンコバルト、スペルミジン、ポリビニルピロリドンの非存在において実施される、先行する実施形態のいずれか１つの方法。
２５．方法が、膜クロマトグラフィーを使用して行われる、先行する実施形態のいずれか１つの方法。
２６．方法が、カラムクロマトグラフィーを使用して行われる、実施形態１から２４のいずれか１つの方法。
２７．方法が、陰イオン交換材料への生物学的分子の選択的結合を可能にする濃度の塩を含む溶液の存在において混合物を陰イオン交換材料と接触させる前に、目的の生物学的分子を含む混合物から固体成分を分離することをさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つの方法であって
場合により、固体成分の当該除去が、ろ過又は相分離により達成される。
２８．固体成分の除去が二相分離を介して達成され、緩衝液を加えて、混合物の密度を約１．１ｋｇ／Ｌより大きく増加させる、実施形態２７の方法。
２９．緩衝液がコスモトロピック塩を含み、好ましくはコスモトロピック塩が硫酸アンモニウムである、実施形態２７又は実施形態２８の方法。
３０．上相よりも高い密度を有する二相混合物の下相が、深層ろ過に供される、実施形態２７から２９のいずれか１つの方法。
３１．実施形態２６から３０のいずれか１つの方法のためのチューリップ型容器の使用。
３２．方法が、溶離液から生物学的分子を沈殿させる工程をさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つの方法。
３３．方法が、生物学的分子を単離するための接線流ろ過により溶離液をろ過する工程をさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つの方法。
３４．接線流ろ過工程において使用されるろ過膜の平均孔径が、０．２μｍ以下である、実施形態３３の方法。
３５．方法が、目的の精製された生物学的分子の凍結乾燥の工程をさらに含み、場合により、凍結乾燥が糖の存在において行われる、先行する実施形態のいずれか１つの方法。
３６．方法が、陰イオン交換材料への生物学的分子の選択的結合を可能にする濃度の塩を含む溶液の存在において混合物を陰イオン交換材料と接触させる工程に続くフロースルーを収集する工程をさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つの方法。
３７．フロースルーがＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、タンパク質、細胞画分、又はそれらの組み合わせを含み、好ましくはフロースルーがＲＮＡを含む、実施形態３６の方法。
３８．目的の生物学的分子の溶出前に、陰イオン交換材料を洗浄緩衝液で洗浄することをさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つの方法。
３９．洗浄緩衝液が、目的の生物学的分子の溶出のために要求される濃度よりも低い濃度のカオトロピック塩を含み、カオトロピック塩が、好ましくは、塩化アンモニウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硝酸マグネシウム、及びそれらの混合物からなる群より選択される、実施形態３８の方法。
４０．方法が、生物学的分子を溶出し、場合により、単離する工程に続くさらなる精製工程をさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つの方法であって；
場合により、第２の精製工程が、スーパーコイルプラスミドＤＮＡを開環状及び／又は線状ＤＮＡから分離することを可能にする選択性を有するチオフィリック芳香族吸着クロマトグラフィー媒体の使用を含む。
４１．方法が、核酸を使用して目的のポリペプチドを発現させる工程をさらに含み、好ましくは、核酸がプラスミドＤＮＡである、実施形態４から４０のいずれか１つの方法。
４２．方法が、核酸を使用して目的のポリペプチドを産生及び回収する工程をさらに含み、好ましくは、核酸がプラスミドＤＮＡである、実施形態４から４１のいずれか１つの方法。
４３．方法が、目的のポリペプチドを医薬組成物中に製剤化する工程をさらに含む、実施形態４２の方法。
４４．方法が、目的の生物学的分子を含む、結果として得られた混合物を陰イオン交換材料と接触させる前に、細胞の回収及び洗浄、細胞溶解、中和、及び凝集物の除去の工程を含む、先行する実施形態のいずれか１つの方法。
４５．方法が、ＲＮＡを除去するためのＣａＣｌ_２沈殿工程を含まない、先行する実施形態のいずれか１つの方法。

【実施例】

【0083】

実施例１：サンプルプラスミドＤＮＡ（ｐＵＣ１９）用の陰イオン交換材料Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑを用いた結合及び溶出のための条件のスクリーニング。
プロセスを通じて使用する全ての緩衝液を、使用前に０．２μｍフィルターを通してろ過した。プラスミドｐＵＣ１９（このプラスミドＤＮＡの概略図は、図１において見出される）を保持する大腸菌細胞を、以下でより詳細に記載するように、ろ過方法を通じて成長、溶解、及び清澄化させた。

【0084】

細胞を、６００ｎｍ（ＯＤ_６００）で測定された６５～９０の光学密度まで、流加条件で、小規模バイオリアクター中で成長させた。細胞を遠心分離（４’４００－４’８００、４５分）により回収した。細胞成長の終了時に回収した細胞をＰ１緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ７．４）中に再懸濁させた。次に、細胞のアルカリ溶解を実施するために、Ｐ２緩衝液（０．２Ｍ ＮａＯＨ、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）を１：１の比率（ｖ／ｖ）で加えた。混合物を穏やかに均質化し、室温で５分間にわたり静置した。細胞溶解を停止し、混合物を中和するために、適切な量の冷Ｐ３緩衝液（５Ｍ酢酸カリウム、酢酸、４℃）を、他の緩衝液の約２５％の容量で加えた。穏やかな均質化後、溶液の密度を変化させるために、３Ｍ硫酸アンモニウムを含む調整緩衝液を１：１の比率（ｖ／ｖ）で加えて、それにより細胞破片を溶液の上部に浮遊させた。溶液を次に、最終的な深層ろ過（Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ深層ろ過フィルター、Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、孔径４０～０．５μｍ）に供して、全ての残存する細胞破片、ならびに一部の沈殿したゲノムＤＮＡ及びタンパク質を除去した。ろ過後、ろ過された溶液のｐＨを、適切な容量の１Ｍ ＮａＯＨをろ液に加えることによりｐＨ７．０に調整した。

【0085】

結合及び溶出条件のスクリーニングを、液体処理ロボット（Ｆｒｅｅｄｏｍ Ｅｖｏ １５０；Ｔｅｃａｎ）で実施し、９６のクロマトグラフィー工程を並行して実行することを可能にした。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ ９６ウェルプレート（カタログ番号：９９ＩＥＸＱ４２ＧＣ－－－－－Ｖ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）をスクリーニングのために使用した。添加調整を、Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ脱塩プレート（カタログ番号８９８０８、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びそれぞれの結合緩衝液を用いて緩衝液を交換することにより実施した。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑユニットを、２．０ｍＬの添加溶液を適用する前に、結合緩衝液で平衡化した。メンブレンを１ｍＬのそれぞれの結合緩衝液及び１ｍＬの洗浄緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）で洗浄した。材料を、１ｍＬの溶出緩衝液を適用し、それに続く１ｍＬの４Ｍ ＮａＣｌでのストリッピング工程により溶出させた。サンプル分析を、アガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）により実施し、そこでは量及び質を推定することができる。

【0086】

ａ）結合緩衝液スクリーニング。
初回では、異なる濃度のいくつかの結合緩衝液をスクリーニングし、溶出を、ｐＨ７．５の２０ｍＭリン酸ナトリウム中に２Ｍ ＮａＣｌを含む溶出緩衝液で実施した。アガロースゲルに、以下の表１に従って、溶出液を添加した。表中に列挙する結合緩衝塩は、他に示さない限り、ｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸ナトリウムとの併用において使用した。

【表1-1】

【表1-2】

【0087】

結合緩衝液スクリーニングの結果を図２Ａから図２Ｄにおいて示すが、ここで、上部及び下部パネルは、異なる露光時間後の同じゲルを示す（上部パネル＝短い露光時間、下部パネル＝長い露光時間）。ゲルの右側の標識は、アガロースゲル内の開環状（ｏｃ）及びスーパーコイル（ｓｃ）ｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡ及びＲＮＡ不純物のバンドを描写する。

【0088】

結果は、高塩濃度での結合が、特にコスモトロピック塩（例、クエン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、クエン酸カリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなど）を使用する場合に実現可能であり、結合緩衝液のｐＨに本質的に非依存的であることを示唆する。結果はまた、特により高い塩濃度では、ＲＮＡの結合が、添加物と比較して著しく低下する（レーン５０及び１０１を参照のこと）、又はまったく結合しない（例、レーン１０～１５）ことを示す。

【0089】

ｂ）溶出緩衝液スクリーニング
２回目では、いくつかの溶出緩衝液を異なる濃度でスクリーニングし、サンプル混合物の結合を、ｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸ナトリウム及び１．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む結合緩衝液で達成した。アガロースゲルに、以下の表２に従って、溶出液を添加した。表中に列挙する溶出緩衝塩は、他に示さない限り、ｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸ナトリウムと一緒に使用した。

【表2-1】

【表2-2】

【0090】

溶出緩衝液のスクリーニングの試みの結果を図３Ａから図３Ｄに示すが、ここで、上部パネルと下部パネルは、異なる露光時間後の同じゲルを示す（上部パネル＝短い露光時間、下部パネル＝長い露光時間）。ゲルの右側の標識は、アガロースゲル内の開環状（ｏｃ）及びスーパーコイル（ｓｃ）ｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡ及びＲＮＡ不純物のバンドを描写する。

【0091】

結果は、カオトロピック塩（例、塩化アンモニウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硝酸マグネシウムなど）を使用する場合、溶出緩衝液の導電性が結合緩衝液の導電率よりも有意に低い場合でさえ、プラスミドＤＮＡをＡＥＸ樹脂から溶出できることを示す。さらに、テストした溶出緩衝液の大半が、ｓｃ ｐＤＮＡをｏｃ ｐＤＮＡよりも良好に溶出し、ＲＮＡを溶出しない。しかし、特定のカオトロピック塩、例えば、硝酸マグネシウムは、ｓｃ ｐＤＮＡよりも優先的にｏｃ ｐＤＮＡを溶出することが観察された（図３Ｃを参照のこと）。

【0092】

実施例２：リン酸緩衝系での溶出のためにＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ及び硫酸マグネシウムを使用したｐＵＣ１９精製。
ａ）精製手順
プロセスを通じて使用する全ての緩衝液を、０．２μｍフィルターを通してろ過した。プラスミドｐＵＣ１９を保持する大腸菌細胞を、実施例１において記載するように成長及び溶解させた。

【0093】

ｐＵＣ１９を含む１５０ｍＬの溶液を、１５０ｍＬの調整緩衝液（４０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、３Ｍ硫酸アンモニウム）で調整した。クロマトグラフィーユニットを、２０カラム容量（ＣＶ）の２０ｍＭリン酸ナトリウム、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０で、４ＣＶ／分の流速で平衡化させた。調整された添加物を次に、陰イオン交換ユニットに適用した。ユニットを、２０ＣＶの平衡化緩衝液を適用することにより洗浄し、２０ＣＶの洗浄緩衝液２（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ硫酸マグネシウム、ｐＨ７．０）での２回洗浄が続き、それによってＲＮＡ不純物が除去されることが見出された。プラスミドＤＮＡを次に、２５ＣＶ中の洗浄緩衝液２から溶出緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１．０Ｍ硫酸マグネシウム、ｐＨ７．０）までの勾配を適用することにより溶出した。最後に、クロマトグラフィーユニットを、３０ＣＶの４Ｍ ＮａＣｌを適用することによりストリッピングした。

【0094】

陰イオン交換ユニット（Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ）の代表的なクロマトグラフィープロファイルを、溶出勾配の拡大を伴い、図４に示す。２つのプールを確立した：画分１Ｃ２から２Ｂ４を含むプール１（薄い灰色ボックス）及び画分１Ｃ４から２Ｂ２を含むプール２（濃い灰色ボックス）。

【0095】

ｂ）残留不純物の評価。
Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑを用いたＡＥＸクロマトグラフィー工程からの画分をアガロースゲル電気泳動により分析し（アガロースゲルの添加スキームについては、以下の表３を参照のこと）、結果を図５において示す。

【表3】

【0096】

多量をアガロースゲルに添加し、不純物を可視化した。図５は、ＲＮＡが、２番目の洗浄工程の間にほとんど除去されたことを示す（例、レーン４を参照のこと；洗浄緩衝液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓベース／ＴＡＰＳ（［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパンスルホン酸）、０．５Ｍ硫酸マグネシウム、ｐＨ７．０）。選んだ条件下での勾配溶出については、ｏｃ ｐＤＮＡがＳＣ ｐＤＮＡよりも短い保持時間を有することが観察された（再び図５を参照のこと）。

【0097】

ＡＥＸクロマトグラフィー工程（Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ）からの画分もＨＰＬＣにより分析した。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ溶出プール１（図４を参照のこと；破線）及びスタンダード（実線）からのＡＥＸ－ＨＰＬＣトレースを図６において示し、結果を以下の表４において要約する。添加及び溶出プール１内の残留ＲＮＡを測定するために、ｐＤＮＡを、接線流ろ過工程（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ３カセット、３０ｋＤａ、Ｃスクリーン、Ｕｌｔｒａｃｅｌメンブレン、カタログ番号：Ｐ３Ｃ０３０Ｃ００、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を実施することにより水に移した。プール２はプール１のサブセットであったため、残留ＲＮＡはプール２について測定しなかった。

【表4】

【0098】

上記の表４において要約した結果は、ＲＮＡが定量的に除去されたことを実証する。ｏｃ ｐＤＮＡ及び線状ｐＤＮＡは、プール１及びプール２についてそれぞれ４％及び３％の低レベルまで低下した。まとめると、勾配溶出によって、スーパーコイルプラスミドＤＮＡ（ｓｃ ｐＤＮＡ）からのＲＮＡ、ならびに開環状プラスミドＤＮＡ（ｏｃ ｐＤＮＡ）の分離が可能になった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（図７）によって、タンパク質性不純物がＡＥＸクロマトグラフィー工程により同様に定量的に除去されたことが確認された（ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの添加スキームについては表５を参照のこと）。

【表5】

【0099】

実施例３：Ｔｒｉｓ緩衝系での溶出のためにＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ及び硫酸マグネシウムを使用した、改善された一次回収プロセス及びｐＤＮＡ ｐＵＣ１９精製。
プラスミドｐＵＣ１９を保持する大腸菌細胞を、以下でより詳細に記載するように成長及び溶解させた。プロセスを通じて使用する全ての緩衝液を、０．２μｍフィルターを通してろ過した。ＡＥＸクロマトグラフィー工程を含む一次回収プロセスの概略図を図８において描写する。

【0100】

一次回収のために、プラスミドｐＵＣ１９を保持する大腸菌の７６．４ｇのペレットを、７６４ｍＬの懸濁緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）で１時間にわたり懸濁した。７６４ｍＬの溶解緩衝液（１％ＳＤＳ、０．２Ｍ ＮａＯＨ）の添加によって、細胞の溶解を開始させた。溶解プロセスを、４分後に、１９８ｍＬの中和緩衝液（３Ｍ酢酸カリウム、２Ｍ酢酸、５℃で冷却）を加えることにより停止させた。０．２６容量が中和のために十分であることが見出された。

【0101】

１８００ｍＬの中和溶液を、１８００ｍＬの調整緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓベース／ＴＡＰＳ、３Ｍ硫酸アンモニウムｐＨ７．０）を加えて溶液の密度を増加させることにより、チューリップ型タンク中で調整した。チューリップ型タンクによって、不溶性粒子の除去が促進され、深層ろ過フィルター（Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ；カタログ番号：ＣＳ４０ＭＳ０１Ｌ３；４０μｍ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に適用した場合に、調整溶液のろ過挙動が改善される。ろ液のｐＨ値を、１９４ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨを加えることにより７．０に調整した。

【0102】

クロマトグラフィーユニットを、２０カラム容量（ＣＶ）の５０ｍＭ Ｔｒｉｓベース ／ＴＡＰＳ、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０で、４ＣＶ／分の流速で平衡化した。深層ろ液を次に、ＡＥＸユニット（Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ；カタログ番号９６ＩＥＸＱ４２ＥＵＣ１１－Ａ；３ｍＬベッドボリューム；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）に適用した。プラスミドＤＮＡの結合を、１．５Ｍ硫酸アンモニウムの濃度で実施した。添加物のフロースルーは高い吸光度値を示し、タンパク質及び有意な量のＲＮＡ種がこれらの添加条件下でＡＥＸ材料に結合しなかったことを示している。ユニットを次に、２０ＣＶの平衡化緩衝液を適用することにより洗浄し、それに続き、２０ＣＶの洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓベース／ＴＡＰＳ、０．５Ｍ硫酸マグネシウム、ｐＨ７．０）での２回目の洗浄によりＲＮＡ不純物を除去した。プラスミドＤＮＡを、２５ＣＶ中の洗浄緩衝液から溶出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓベース／ＴＡＰＳ、１．０Ｍ硫酸マグネシウム、ｐＨ７．０）までの勾配を適用することにより溶出した。勾配溶出によって、主に２つの種の分離が可能になり、最初のピークはｏｃ ｐＤＮＡを含み、２番目のピークはｓｃ ｐＤＮＡを含んだ。クロマトグラフィーユニットを最後に、３０ＣＶの４Ｍ ＮａＣｌを適用することによりストリッピングした。陰イオン交換ユニット（Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ）の代表的なクロマトグラフィープロファイルを図９において示す。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】