知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-04
(45)【発行日】2024-10-15
(54)【発明の名称】ＲＡＲ活性化のための合成レチノイド
(51)【国際特許分類】
C07D 241/36 20060101AFI20241007BHJP
A61K 31/235 20060101ALI20241007BHJP
A61K 31/44 20060101ALI20241007BHJP
A61K 31/4965 20060101ALI20241007BHJP
A61K 31/498 20060101ALI20241007BHJP
A61K 31/505 20060101ALI20241007BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20241007BHJP
A61P 25/08 20060101ALI20241007BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20241007BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20241007BHJP
C07C 63/66 20060101ALI20241007BHJP
C07C 63/70 20060101ALI20241007BHJP
C07D 213/79 20060101ALI20241007BHJP
C07D 213/80 20060101ALI20241007BHJP
C07D 239/28 20060101ALI20241007BHJP
C07D 241/24 20060101ALI20241007BHJP
C07D 401/06 20060101ALI20241007BHJP
【ＦＩ】
C07D241/36 CSP
A61K31/235
A61K31/44
A61K31/4965
A61K31/498
A61K31/505
A61P21/00
A61P25/08
A61P25/16
A61P25/28
C07C63/66
C07C63/70
C07D213/79
C07D213/80
C07D239/28
C07D241/24
C07D401/06
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2021553136
(86)(22)【出願日】2020-03-11
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-27
(86)【国際出願番号】 GB2020050607
(87)【国際公開番号】W WO2020183173
(87)【国際公開日】2020-09-17
【審査請求日】2023-02-06
(31)【優先権主張番号】1903242.4
(32)【優先日】2019-03-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(73)【特許権者】
【識別番号】508341957
【氏名又は名称】ザ ユニバーシティ オブ ダラム
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100196298
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 高雄
(72)【発明者】
【氏名】アンドリュー ホワイティング
(72)【発明者】
【氏名】デイビッド チザム
(72)【発明者】
【氏名】イアン グレイグ
(72)【発明者】
【氏名】タバット カティブ
(72)【発明者】
【氏名】ピーター マキャフェリー
【審査官】藤代 亮
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／１５２７２５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開昭６３－２４３０７２（ＪＰ，Ａ）
【文献】Molecular Pharmacology，2002年，61(2)，Pages 334-342
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｄ ２４１／３６
Ａ６１Ｋ ３１／２３５
Ａ６１Ｋ ３１／４４
Ａ６１Ｋ ３１／４９６５
Ａ６１Ｋ ３１／４９８
Ａ６１Ｋ ３１／５０５
Ａ６１Ｐ ２１／００
Ａ６１Ｐ ２５／０８
Ａ６１Ｐ ２５／１６
Ａ６１Ｐ ２５／２８
Ｃ０７Ｃ ６３／６６
Ｃ０７Ｃ ６３／７０
Ｃ０７Ｄ ２１３／７９
Ｃ０７Ｄ ２１３／８０
Ｃ０７Ｄ ２３９／２８
Ｃ０７Ｄ ２４１／２４
Ｃ０７Ｄ ４０１／０６
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
レチノイン酸受容体（RAR）の活性化によって緩和される状態または疾病の治療に使用される、遊離したまたは塩の形態の式Iの化合物：【化1】
A1はNまたはCR6であり；
A2はNまたはCR7であり；
A3はNまたはCR8であり；
R6およびR8は、それぞれ独立して、水素、C1-C10アルキル、F、BrまたはClであり；
R7は、独立して、水素、C1-C10アルキル、F、Br、Clまたは-OCR9であり、R9はHまたはC1-C6アルキルであり；
R1～R4は、それぞれ独立して、C1-C10アルキルであるか、または、R1とR2および／もしくはR3とR4が結合して3員環を形成しており；
A4は、NまたはCR12であり、
A5はNまたはCR13であり、
A6はNまたはCR14であり、
A7はNまたはCR15であり、
各R12～R15は、独立して、H、ハロゲンまたはハロアルキルC1-C10であり；
R5は-C（=O）R16または-C（=O）OR16であり、R16は、HまたはC1-10アルキルである；
但し、A1～A３の少なくとも1つがNであることを条件とする］。
【請求項2】
A1とA3はNである、請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
A2はCR7である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項4】
R7は水素である、請求項３に記載の化合物。
【請求項5】
R5は-COOHである、請求項１～４の何れかに記載の化合物。
【請求項6】
A4、A5、A6の少なくとも一つはCFである、請求項１～５の何れかに記載の化合物。
【請求項7】
以下の：【化2】
【請求項8】
以下の：【化3】
【請求項9】
RARの活性化によって緩和される前記疾病または状態は、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、パーキンソン病、多発性硬化症（MS）、アルツハイマー病、早期アルツハイマー病、中期アルツハイマー病、後期アルツハイマー病、認知障害、記憶障害、記憶欠損、老人性認知症、認知機能障害、軽度認知機能障害、脳卒中、外傷性脳損傷、てんかん、および脊髄損傷から選択される、請求項１～８の何れかに記載の化合物。
【請求項10】
RARの活性化によって緩和される疾病または状態の治療に使用するための薬物の製造における、請求項１～９の何れかで定義される式Iの化合物。
【請求項11】
RARの活性化によって緩和される疾病または状態の治療に使用するための、請求項１～９のいずれか一項で定義した式Iの化合物を、任意に1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と組み合わせて含む、医薬組成物。
【請求項12】
遊離したまたは塩の形態の式Iの化合物：【化4】
A1はNまたはCR6であり；
A2はNまたはCR7であり；
A3はNまたはCR8であり；
R6およびR8は、それぞれ独立して、水素、C1-C10アルキル、F、BrまたはClであり；
R7は、独立して、水素、C1-C10アルキル、F、Br、Clまたは-OCR9であり、R9はHまたはC1-C6アルキルであり；
R1～R4は、それぞれ独立して、C1-C10アルキルであるか、または、R1とR2および／もしくはR3とR4が結合して3員環を形成しており；
A4はNまたはCR12であり、
A5はNまたはCR13であり、
A6はNまたはCR14であり、
A7はNまたはCR15であり、
各R12～R15は、独立して、H、ハロゲンまたはハロアルキルC1-C10であり；
R5は-C（=O）R16または-C（=O）OR16であり、R16は、HまたはC1-10アルキルである；
但し、A1～A3の少なくとも1つがNであるか、またはA4の少なくとも1つがCR12であるか、またはA5がCR13であり、R12／R13がFであることを条件とする］。
【請求項13】
A1からA3の少なくとも1つがNである、請求項１２に記載の化合物。
【請求項14】
A1およびA3の両方がNである、請求項１２または１３に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
RAR活性化のための合成レチノイド
本発明は、レチノイン酸受容体（RAR）の活性化によって緩和される状態または疾病の治療に使用するための、式Iの化合物：
［式I中、A1－A7およびR1からR5は本明細書で定義される］に関する。本発明は、そのような化合物を含む医薬化合物、および関連する治療方法にも関する。一態様では、本発明は、レチノイン酸受容体（RAR）の活性化によって緩和される状態または疾病の治療において、治療学的可能性がある化合物をスクリーニングする方法に関する。複数の態様では、本発明は、A1～A3の少なくとも1つがNであるか、またはA4の少なくとも1つがCR12であるか、またはA5がCR13であり、R12／R13はハロゲンである、式Iの新規化合物に関する。
本発明は、レチノイン酸受容体（RAR）の活性化によって緩和される状態または疾病の治療に使用するための、式Iの化合物：
【化1】
【0002】
より詳細には、本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、アルツハイマー病、パーキンソン病などの神経変性状態を含む神経学的状態や、脊髄損傷などの状態など、RARの活性化によって緩和される状態および／または疾病の治療における式Iの化合物の使用に関するものである。
【0003】
レチノイドは、ビタミンAおよびその誘導体の類似体である天然または合成化合物の一群である。レチノイドは多くの細胞活動に必須であり、シグナル伝達分子として、胚発生から成人の恒常性に至るまでの重要な生物学的経路の制御や、増殖、分化、およびアポトーシスなどの幹細胞の発達にも関与している。オールトランスレチノイン酸（ATRA）は最も豊富な内因性レチノイドであり、レチノイド研究のモデル化合物として用いられてきた。
【0004】
レチノイドは、レチノイン酸受容体（RAR）として知られる核内受容体群、つまり、ゲノムレベルで様々な生理学的メカニズムを制御する誘発性リガンド活性化転写因子に作用する。そのため、合成レチノイドは、RARが関与する、あるいは関与する可能性のあるさまざまな疾病や状態に使用するための治療薬として研究されてきた。しかし、これまでに知られている化合物は、効力や有効性が低いなどの欠点があるか、または水への溶解性が低いなど物性に乏しかった。
【0005】
神経学的状態とは、中枢および末梢神経系、つまり脳、脊髄、脳神経、末梢神経、神経根、自律神経系、神経筋接合部、および筋肉の疾患である。神経疾患には、脊髄損傷や脳卒中などの突発的状態、てんかんなどの断続的状態、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、アルツハイマー病、パーキンソン病などの神経変性状態、脳性麻痺などの安定的状態がある。これらの神経学的状態群は、慢性化しやすく、その多くが生命を脅かし、その全てが生活の質に大きな悪影響を及ぼすものである。合計すると、世界中で何億人もの人々が神経疾患の影響を受けていると推定されている（World Health Organisation, May 2016) 。
【0006】
筋萎縮性側索硬化症（ALS）は、ルー・ゲーリッグ病としても知られ、運動ニューロンが徐々に失われ、その結果、麻痺が生じることを特徴とする衰弱性の神経学的状態である。欧州では、人口10万人あたり年間1.7～2.3のALS症例があると推定されており［Logroscino et al. “Incidence of amyotrophic lateral sclerosis in Europe”. J Neurol Neurosurg. Psychiatry. (2009); 81(4)：385-90]、患者の約50%が症状発現後30ヶ月以内に死亡すると推定されている[Kiernan et al. "Amyotrophic lateral sclerosis". The lancet; Vol.377(9769); (2011)：942-955]。しかし、この病気の壊滅的な性質にもかかわらず、現在のところ治療法はなく、英国でALSの治療薬として承認されている唯一の薬剤は、患者の生命を平均2～3カ月延長することが示されている［Miller et al. "Riluzole for amyotrophic lateral sclerosis (ALS)/motor neuron disease (mND)".Cochrane Database of Systematic Reviews (2012), Issue 3.CD001447]。
【0007】
ALSには孤発性と家族性があり、C9ORF72やSOD1などの複数の遺伝子に原因となる変異がある。ALSの根本的な原因は、筋肉の動きをつかさどる運動ニューロンの死であるが、それが起きる正確なメカニズムは現在のところ不明である。しかし、(i)興奮毒性：神経伝達物質の毒性作用により神経細胞が過剰に発火すること、(ii)オートファジーの失敗：細胞内に蓄積された不溶性分子を除去する細胞の解毒システムが失われること、(iii)神経炎症：神経系の免疫細胞が運動神経細胞を誤って攻撃すること、(iv)軸索の無秩序化：神経細胞間のコミュニケーションに不可欠な相互接続繊維が失われること、などのいくつかのメカニズムが関与していると考えられている。したがって、ALSの治療に用いられる薬は、多面的な特性を示すことが理想的である。
【0008】
そのため、ALSやアルツハイマー病を含む神経変性疾患などの神経学的状態に用いられる新しい治療法に対する切実で満たされていないニーズがある。特に、水への良好な溶解性などの物理的特性に優れた化合物が有用であろう。
【0009】
ALS、アルツハイマー病、またはそれに関連した疾患を治すまたは予防する治療法は、多くの製薬会社の研究プロジェクトの最終目標であるが、より現実的には、疾患の発症を遅らせる、疾患の進行を遅くする、または止めることが可能な治療法があれば、大きな発展である。また、潜在的な治療用化合物をスクリーニングする方法も非常に有益である。
【発明の概要】
【0010】
したがって、本発明は、レチノイン酸受容体の活性化によって緩和される状態または疾病の治療に使用するための化合物に関するものである。態様においては、これはゲノム活性化を含む。本発明の態様では、化合物は、ゲノムおよび非ゲノムの両方の経路を活性化する。
【0011】
態様において、本発明は、斯かる化合物を含む医薬組成物、およびレチノイド酸受容体の活性化によって緩和される状態または疾病の治療における斯かる化合物および組成物の使用に関する。
【0012】
レチノイン酸受容体の活性化によって緩和される状態や疾病には、神経変性疾患などのRARが介在する状態のほか、脳卒中、外傷性脳損傷、てんかん、脊髄損傷などのRARの活性化によって緩和されるものが含まれる。
【0013】
態様において、本発明は、レチノイン酸受容体の活性化によって緩和される状態や疾患の治療において、治療能のある化合物をスクリーニングする方法に関するものです。
【0014】
本発明の態様は、新規化合物それ自体に関するものである。
【0015】
本発明のさらなる態様および実施形態は、特許請求の範囲で定義されているとおりであり、以下でより詳細に説明する。
【0016】
本発明の第1の態様によれば、レチノイン酸受容体（RAR）の活性化によって緩和される状態または疾病の治療に使用される、遊離したまたは塩の形態の式Iの化合物：
［式I中、
A1はNまたはCR6であり；
A2はNまたはCR7であり；
A3はNまたはCR8であり；
R6およびR8は、それぞれ独立して、水素、C1-C10アルキル、F、BrまたはClであり；
R7は、独立して、水素、C1-C10アルキル、F、Br、Clまたは-OCR9であり、R9はHまたはC1-C6アルキルであり；
R1～R4は、それぞれ独立して、C1-C10アルキルであるか、または、R1とR2および／もしくはR3とR4が結合して3員環を形成しており；
A4はNまたはCR12であり、
A5はNまたはCR13であり、
A6はNまたはCR14であり、
A7はNまたはCR15であり、
各R12～R15は、独立して、H、ハロゲンまたはハロアルキルC1-C10であり；
R5は-C（=O）R16または-C（=O）OR16であり、R16はHまたはC1-10アルキルである；
但し、A1～A7の少なくとも1つがNであるか、またはR12～R15の少なくとも1つがF、ClもしくはBrであることを条件とする］
およびその異性体を提供する。
【化2】
A1はNまたはCR6であり；
A2はNまたはCR7であり；
A3はNまたはCR8であり；
R6およびR8は、それぞれ独立して、水素、C1-C10アルキル、F、BrまたはClであり；
R7は、独立して、水素、C1-C10アルキル、F、Br、Clまたは-OCR9であり、R9はHまたはC1-C6アルキルであり；
R1～R4は、それぞれ独立して、C1-C10アルキルであるか、または、R1とR2および／もしくはR3とR4が結合して3員環を形成しており；
A4はNまたはCR12であり、
A5はNまたはCR13であり、
A6はNまたはCR14であり、
A7はNまたはCR15であり、
各R12～R15は、独立して、H、ハロゲンまたはハロアルキルC1-C10であり；
R5は-C（=O）R16または-C（=O）OR16であり、R16はHまたはC1-10アルキルである；
但し、A1～A7の少なくとも1つがNであるか、またはR12～R15の少なくとも1つがF、ClもしくはBrであることを条件とする］
およびその異性体を提供する。
【0017】
式Iの化合物において、A1～A7の少なくとも1つがNであるか、またはR12～R15の少なくとも1つがF、ClもしくはBrである。
【0018】
本明細書では、用語「アルキル」は、完全に飽和、分岐、非分岐、または環状の炭化水素部分、すなわち第一級、第二級、第三級アルキル、または適切な場合にはシクロアルキルもしくはシクロアルキルで置換されたアルキルを指す。特に断りのない限り、アルキル基は1～10個の炭素原子、好ましくは1～6個の炭素原子、より好ましくは1～4個の炭素原子を含む。アルキル基の代表例としては、メチル、エチル、n-プロピル、iso-プロピル、n-ブチル、sec-ブチル、iso-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、n-ヘキシル、3-メチルヘキシル、2，2-ジメチルペンチル、2，3-ジメチルペンチル、n-ヘプチル、n-オクチル、n-ノニル、およびn-デシルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0019】
本明細書で使用される用語「ハロゲン」または「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードを意味する。
【0020】
本明細書では、用語「ハロアルキル」は、1つまたは複数の水素原子がハロゲン原子で置換されているアルキル基を指す。
【0021】
レチノイン酸受容体の活性化によって緩和される状態または疾病としては、神経変性疾患などのRARが介在する状態のほか、脳卒中、外傷性脳損傷、てんかん、脊髄損傷などのRARの活性化によって緩和される状態が挙げられる。
【0022】
RARが介在する状態としては、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、神経筋疾患、パーキンソン病、多発性硬化症（MS）、アルツハイマー病、早期アルツハイマー病、中期アルツハイマー病、後期アルツハイマー病、認知障害、記憶障害、記憶欠損、老人性認知症、血管性認知症、認知機能障害、および軽度認知機能障害などの神経変性疾患が挙げられる。
【0023】
したがって、RARの活性化によって緩和される状態または疾病は、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、神経筋疾患、パーキンソン病、多発性硬化症（MS）、アルツハイマー病、早期アルツハイマー病、中期アルツハイマー病、後期アルツハイマー病、認知障害、記憶障害、記憶欠損、老人性認知症、血管性認知症、認知機能障害、軽度認知機能障害、脳卒中、外傷性脳損傷、てんかん、および脊髄損傷から選択され得る。
【0024】
状態は、神経学的状態であってもよい。実施形態では、神経学的状態は、ALS、パーキンソン病、またはアルツハイマー病などの神経変性状態であってもよい。
【0025】
一実施形態では、R5は-COOHである。
【0026】
一実施形態では、A1～A3のうち少なくとも1つがNであるか、またはA4のうち少なくとも1つがCR12であるか、またはA5がCR13であり、R12／R13はハロゲンである。R12／R13は、好ましくはFである。
【0027】
一実施形態では、A1からA3の少なくとも1つはNである。一実施形態では、A1とA3はともにNである。
【0028】
一実施形態では、A2はCR7であり、R7はHである。
【0029】
一実施形態では、A4、A5またはA6の少なくとも1つがCFである。
【0030】
本実施形態では、A4はCFであってもよい。あるいは、A5はCFであってA2はCR7であってもよい。
【0031】
一実施形態では、A5およびA6はCFである。
【0032】
一実施形態では、A4はCClである。
【0033】
一実施形態では、A1およびA3はともにNであり、A2は、式IAで表されるように、CR7であり、R7はHである。
【化3】
【0034】
好ましくは、式IAにおいて、R5は-COOHである。
【0035】
あるいは、一実施形態では、式Iにおいて、A4～A7の少なくとも1つがNである。
【0036】
一実施形態では、式Iにおいて、A4はNである。
【0037】
一実施形態では、式Iにおいて、A4またはA5はCFである。
【0038】
一般論として、式Iの化合物は、以下に示すように、疎水性領域、リンカー領域（-C≡C-）および極性領域を有する：
【化4】
【0039】
本発明者らは、有利なことに、疎水性領域の共役環に1つ、もしくは好ましくは2つの窒素原子が組み込まれている；または、極性領域の共役環に窒素原子が組み込まれている；および／または、極性領域の共役環がハロゲン化（もしくは好ましくはフッ素化）されている、式Iの化合物が、RARの活性化によって緩和される疾病または状態の治療に驚くほど有益であることを発見した。
【0040】
言及することができる式Iの例示的な化合物としては、以下からなる群から選択されるものが挙げられる：
【化5】
【0041】
特定の実施形態では、式Iの化合物は、以下から選択されてもよい：
【化6】
【0042】
実施形態では、式Iの化合物は、以下から選択されてもよい：
【化7】
【0043】
実施形態では、式Iの化合物は、以下から選択されてもよい：
【化8】
【0044】
本発明の別の態様では、RARの活性化によって緩和される疾病または状態の治療に使用するための薬物の製造における、本明細書で定義される式Iの化合物の使用が提供される。一実施形態では、前記薬物は式Iの化合物を含む。
【0045】
本発明の別の態様では、治療上有効な量の式Iの化合物を患者に投与するステップを含み、前記式Iの化合物は本明細書で定義したとおりである、RARの活性化によって緩和される疾病または状態を有する患者の治療方法が提供される。
【0046】
本発明の別の態様では、RARの活性化によって緩和される疾病または状態の治療に使用するための、本明細書で定義した式Iの化合物を、任意に1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と組み合わせて含む医薬組成物が提供される。該組成物は、任意に、1つまたは複数の追加の治療剤を含んでいてもよい。
【0047】
用語「治療上有効な」量、または「有効量」とは、所望の治療効果、改善効果、抑制効果、または予防効果をもたらすのに有効な本発明の化合物または組成物の量を意味する。
【0048】
用語「医薬組成物」とは、患者への投与に適した組成物を意味する。したがって、用語「医薬組成物」とは、本発明の化合物もしくはその混合物、またはその塩、溶媒和物、プロドラッグ、異性体、もしくは互変異性体を、任意に1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤と組み合わせて含む組成物を意味する。また、用語「医薬組成物」という用語は、バルク組成物（すなわち、個々の投与単位にまだ形成されていない形態）と個々の投与単位の両方を包含することが意図されている。このような個々の投与単位には、錠剤、ピル、カプレット、アンプルなどが含まれる。
【0049】
当業者であれば、本発明の化合物がプロドラッグおよび／または溶媒和物に変換され得る事例を認識するであろう。用語「プロドラッグ」とは、本発明の化合物または該化合物の薬学的に許容される塩、水和物もしくは溶媒和物を得るためにインビボで変換される化合物（例えば、薬物前駆体）を意味する。この変換は、例えば、血液中の加水分解など、様々なメカニズム（例えば、代謝または化学的プロセスによる）によって起きる可能性がある。
【0050】
本発明の化合物は、非溶媒和物であってもよいし、水やエタノールなどの薬学的に許容される溶媒で溶媒和されていてもよい。例えば、1つまたは複数の溶媒分子が結晶性固体の結晶格子に組み込まれている場合など、溶媒和物は単離可能であってもよいことが理解されるであろう。「溶媒和物」は、溶液相と単離可能な溶媒和物の両方を包含する。適切な溶媒和物としては、エタノール和物、メタノール和物、水和物などが含まれるが、これらに限定されない。
【0051】
本発明で使用する化合物には、その塩が含まれており、本発明の化合物への言及は、特に断らない限り、その塩への言及を含むことを意図している。適切な塩には、例えば、無機および／または有機酸で形成される酸性塩、無機および／または有機塩基で形成される塩基性塩、ならびに形成されてもよく、本明細書で使用される用語「塩」に含まれる双性イオン（「内塩」）が含まれる。薬学的に許容される（すなわち、毒性がなく、生理学的に許容される）塩が好ましいが、他の塩も特定の状況では有用であり得る。有用であり得る酸付加塩の例としては、酢酸塩、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、カンファー酸塩、カンファースルホン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、リン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、スクシン酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩（トシル酸塩とも呼ばれる）などが挙げられる。有用であり得る塩基性塩の例としては、アンモニウム塩、ナトリウム塩、リチウム塩、およびカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ジシクロヘキシルアミン、t-ブチルアミンなどの有機塩基（例えば、有機アミン）との塩、ならびにアルギニンおよびリジンなどのアミノ酸との塩などが挙げられる。塩基性窒素含有基は、低級アルキルハライド（例えば、メチル、エチル、およびブチルの塩化物、臭化物、ヨウ化物）、ジアルキルサルフェート（例えば、ジメチル、ジエチル、ジブチルサルフェート）、長鎖ハライド（例えば、デシル、ラウリル、およびステアリルの塩化物、臭化物、ヨウ化物）、アリールアルキルハライド（例えば、ベンジルおよびフェネチルの臭化物）などの薬剤で四級化してもよい。
【0052】
本発明で使用する化合物には、その薬学的に許容されるエステルが含まれ、水酸基のエステル化によって得られるカルボン酸エステルを含んでいてもよく、その際、エステル基のカルボン酸部分の非カルボニル部分は、直鎖または分岐鎖のアルキル（例えば、アセチル、n-プロピル、t-ブチル、またはn-ブチル）、アルコキシアルキル（例えば、メトキシメチル）、アラルキル（例えば、ベンジル）、アリールオキシアルキル（例えば、フェノキシメチル）、アリール（例えば、ハロゲン、C1-4アルキル、またはC1-4アルコキシ、またはアミノで任意に置換されたフェニルなど）；(2）アルキル-またはアラルキルスルホニル（例えば、メタンスルホニル）などのスルホン酸エステル；（3）アミノ酸エステル（例えば、L-バリルまたはL-イソロイシル）；（4）ホスホン酸エステル；および（5）モノ－、ジ－またはトリリン酸エステルから選択される。
【0053】
本発明の化合物の多形体、ならびに本発明の化合物の塩、溶媒和物、エステルおよびプロドラッグの多形体は、本発明に含まれることが意図されている。
【0054】
本発明の化合物を患者に投与する際の適切な投与量は、当業者、例えば主治医、薬剤師、またはその他の熟練者が決定することができ、患者の体重、健康状態、年齢、投与頻度、投与方法、他の有効成分の存在、および化合物が投与される状態などの要因に応じて変化する可能性がある。
【0055】
賦形剤、希釈剤、および担体の例としては、緩衝剤のほか、デンプン、セルロース、糖類、マンニトール、ケイ酸誘導体などの充填剤や拡張剤がある。また、結合剤が含まれる場合もある。また、アジュバントが含まれる場合もある。
【0056】
任意で、式Iの化合物は、1つまたは複数の追加の治療剤と組み合わせて投与してもよい。1つまたは複数の追加の治療剤と組み合わせて使用する場合、本発明の化合物は一緒に投与してもよいし、順次投与してもよい。
【0057】
本組成物は、経口、非経口（皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内を含む）、直腸、皮膚、経皮、胸腔内、肺内、粘膜、眼内、鼻腔内経路など様々な経路で投与することができる。
【0058】
適切な剤形は、当業者には認識され、数ある中でも、錠剤、カプセル、溶液、懸濁液、粉末、エアロゾル、アンプル、プレフィルドシリンジ、小容量輸液容器またはマルチドーズ容器、クリーム、ミルク、ゲル、分散液、マイクロエマルジョン、ローション、含浸パッド、軟膏、点眼薬、点鼻薬、トローチなどが挙げられる。
【0059】
本発明の態様は、A1からA3の少なくとも1つがNであるか、またはA4の少なくとも1つがCR12であるか、またはA5がCR13であり、R12／R13がハロゲンである、本明細書に記載された式Iの化合物に関する。このような態様は、新規化合物それ自体に関するものである。
【0060】
R12／R13は、好ましくはFである。
【0061】
一実施形態では、A1からA3の少なくとも1つはNである。
【0062】
一実施形態では、A1とA3はともにNである。
【0063】
一実施形態では、新規化合物は以下から選択される：
【化9】
【0064】
本発明の一態様では、レチノイン酸受容体の活性化によって緩和される状態または疾病の治療において、治療学的可能性がある化合物をスクリーニングする方法が提供され、該方法は以下の：
－ゲノム活性の指標として、RARの活性化における化合物の有効性（Emax）を測定するアッセイを行うステップと；
－非ゲノム活性の指標として、化合物の有効性（Emax）を測定するアッセイを行うステップと；
各アッセイにおいて、Emaxをベースライン値と比較するステップと；
－両アッセイにおいてEmaxがベースライン値を上回った化合物を、さらなる検討のために選択するステップとを含む。
－ゲノム活性の指標として、RARの活性化における化合物の有効性（Emax）を測定するアッセイを行うステップと；
－非ゲノム活性の指標として、化合物の有効性（Emax）を測定するアッセイを行うステップと；
各アッセイにおいて、Emaxをベースライン値と比較するステップと；
－両アッセイにおいてEmaxがベースライン値を上回った化合物を、さらなる検討のために選択するステップとを含む。
【0065】
RARが転写調節因子である核内受容体ファミリーの一員であることが発見されて以来（Petkovich M et al. "A human retinoic acid receptor which belongs to the family of nuclear receptors"; Nature (1987)：330, pp.444-450）、レチノイドの機能については、その遺伝子発現の制御に重点が置かれてきた。これに基づいて、合成レチノイドが生成され、そのゲノム活性化特性が調べられてきた。
【0066】
しかし、驚くべきことに、本発明者らは、レチノイド酸（RA）のゲノムおよび非ゲノムのメカニズムが、リガンド依存性のRARの関与に関して独立して制御されていることを突き止めた。「二重効用」、すなわち、非ゲノムとゲノムの両方のアッセイにおける活性は、神経突起の伸長促進や細胞数および生存率の増加と強い相関関係があることが判明しており、これは、これらの二重効用を持つ化合物が治療薬として重要であることを示唆するものである。
【0067】
一実施形態では、非ゲノム活性の指標として化合物のEmaxを決定するアッセイは、キナーゼリン酸化アッセイである。
【0068】
一実施形態では、キナーゼリン酸化アッセイは、ERK1/2リン酸化アッセイである。
【0069】
一実施形態では、ゲノム活性の指標となるベースライン値は、Emaxが170.1である。
【0070】
一実施形態では、非ゲノム活性の指標となるベースライン値は、Emaxが48.55である。
【0071】
ベースライン値の一方または両方は、実施形態では、ATRAなどの参照化合物を用いて決定することができる。
【0072】
例：
以下、添付の図を参照しながら、本発明を例示的に説明する。
以下、添付の図を参照しながら、本発明を例示的に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0073】
【図1A】カップリングパートナーの合成例を示す図である。
【図1B】カップリングパートナーの合成例を示す図である。
【図1C】カップリングパートナーの合成例を示す図である。
【図1D】カップリングパートナーの合成例を示す図である。
【図1E】カップリングパートナーの合成例を示す図である。
【図1F】カップリングパートナーの合成例を示す図である。
【図1G】カップリングパートナーの合成例を示す図である。
【図1H】カップリングパートナーの合成例を示す図である。
【図1I】カップリングパートナーの合成例を示す図である。
【図1J】カップリングパートナーの合成例を示す図である。
【図1K】カップリングパートナーの合成例を示す図である。
【図1L】カップリングパートナーの合成例を示す図である。
【図1M】カップリングパートナーの合成例を示す図である。
【図1N】カップリングパートナーの合成例を示す図である。
【図2】例示的なレチノイド化合物DC526、DC528、DC641およびDC645の合成を示す図である。
【図3】X-Galアッセイを用いてレチノイドのゲノム活性を示す図である。
【図4】ERK1/2のリン酸化を誘発する能力によって示される、レチノイドの非ゲノム活性を示す図である。
【図5】分化したSH-SY5Y細胞をレチノイドで処理した後の平均神経突起長を示す図である。
【図6】レチノイドのゲノム活性[転写活性：Emax(有効性)]と非ゲノム活性[ERK1/2活性：Emax(有効性)]の両方を誘導する能力と、神経突起伸長の誘導（10μMでの増加倍率）との関係を示す図であり、ハイライトされたレチノイドは両方の活性を示している。
【図7】ラットの混合初代ニューロン/グリア培養液をレチノイドで処理した後の、アルツハイマー病関連遺伝子の転写制御に関するデータを示す図である。
【図8】図８Ａは、例示的なレチノイドであるDC645の活性をATRAおよびEC23の活性と比較する図であり、X-Galアッセイによるレチノイドのゲノム活性を比較する図である。図８Ｂは、例示的なレチノイドであるDC645の活性をATRAおよびEC23の活性と比較する図であり、ERK1/2リン酸化を誘導する能力を測定することにより、レチノイドの非ゲノム活性を比較する図である。図８Ｃは、例示的なレチノイドであるDC645の活性をATRAおよびEC23の活性と比較する図であり、SH-SY5Y細胞における神経突起伸長を誘導する化合物の能力を比較する図である。図８Ｄは、例示的なレチノイドであるDC645の活性をATRAおよびEC23の活性と比較する図であり、レチノイド化合物によるアルツハイマー病関連遺伝子の制御を示す図である。
【実施例】
【0074】
実施例1：式Iの例示的な化合物の合成：
1.1カップリングパートナーの合成
1.1.1. 6-ヨード-1,1,4,4-テトラメチル-1,2,3,4-テトラヒドロナフタレン、1の合成
6-Iodoヨード-1,1,4,4-テトラメチル-1,2,3,4-テトラヒドロナフタレン（1）の合成を図１Ａに示す。1,1,4,4-テトラメチル-1,2,3,4-テトラヒドロナフタレン（11.46g、60.9mmol）、I2（7.77g、30.6mmol）およびH5IO6（3.49g、15.3mmol）を、エタン酸/酢酸（AcOH)（250mL）、H2O（25mL）、およびH2SO4（13mL）の混合液に加え、得られた溶液を70℃で6時間撹拌した。この溶液を冷却し、エタノイン酸エチル／酢酸エチル（EtOAc）で抽出した。有機物を飽和NA2S2O3、H2O、および鹹水で洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、蒸発させて、オレンジ色の粗油（17g）を得た。これをドライカラム真空クロマトグラフィー（ヘプタンで溶出）で精製し、化合物1を白色固体として得た（16.3g、85％）：1H NMR (700 MHz, CDCl3) δ 1.25 (s, 6H), 1.26 (s, 6H), 1.66 (s, 4H), 7.04 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.43 (dd, J = 8.4, 1.9 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 1.9 Hz, 1H); 13C NMR (176 MHz, CDCl3) δ 31.9, 32.0, 34.4, 34.6, 35.0, 35.1, 91.3, 128.9, 134.8, 135.8, 144.8, 147.9; その他のデータはすべて文献と一致した(V. B. Christie et al, Org. Biomol. Chem., 2008, 6, 3497-3507)。
1.1カップリングパートナーの合成
1.1.1. 6-ヨード-1,1,4,4-テトラメチル-1,2,3,4-テトラヒドロナフタレン、1の合成
6-Iodoヨード-1,1,4,4-テトラメチル-1,2,3,4-テトラヒドロナフタレン（1）の合成を図１Ａに示す。1,1,4,4-テトラメチル-1,2,3,4-テトラヒドロナフタレン（11.46g、60.9mmol）、I2（7.77g、30.6mmol）およびH5IO6（3.49g、15.3mmol）を、エタン酸/酢酸（AcOH)（250mL）、H2O（25mL）、およびH2SO4（13mL）の混合液に加え、得られた溶液を70℃で6時間撹拌した。この溶液を冷却し、エタノイン酸エチル／酢酸エチル（EtOAc）で抽出した。有機物を飽和NA2S2O3、H2O、および鹹水で洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、蒸発させて、オレンジ色の粗油（17g）を得た。これをドライカラム真空クロマトグラフィー（ヘプタンで溶出）で精製し、化合物1を白色固体として得た（16.3g、85％）：1H NMR (700 MHz, CDCl3) δ 1.25 (s, 6H), 1.26 (s, 6H), 1.66 (s, 4H), 7.04 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.43 (dd, J = 8.4, 1.9 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 1.9 Hz, 1H); 13C NMR (176 MHz, CDCl3) δ 31.9, 32.0, 34.4, 34.6, 35.0, 35.1, 91.3, 128.9, 134.8, 135.8, 144.8, 147.9; その他のデータはすべて文献と一致した(V. B. Christie et al, Org. Biomol. Chem., 2008, 6, 3497-3507)。
【0075】
1.1.2 6-エチニル-1,1,4,4-テトラメチル-1,2,3,4-テトラヒドロナフタレン、3の合成
6-エチニル-1,1,4,4-テトラメチル-1,2,3,4-テトラヒドロナフタレン(3)の合成を図1Ｂに示す。トリエチルアミン（Et3N）（150mL）をN2で1時間スパージして脱気する。次に、化合物1（10.0g、31.8mmol）、Pd(PPh3)2Cl2（0.223g、0.32mmol）、CuI（0.061g、0.32mmol）、およびトリメチルシリルアセチレン（5.29mL、38.2mmol）をN2下で加え、得られたスラリーを室温で20時間撹拌した、この混合物をヘプタンで希釈し、Celite/SiO2（ヘプタンで溶出）に通し、得られた溶液を蒸発させて、茶色の粗油（10.36g）を得た。これをSiO2クロマトグラフィー（ヘプタン100％）で精製し、化合物2を黄色の油として得た（9.99g、＞100％）。化合物2（9.99g、35.1mmol）をメタノール（MeOH)／メチルtert-ブチルエーテル（MTBE）（1：1、160mL）に溶解した。その後、水酸化ナトリウム（NaOH)（0.96g、24.0mmol）のH2O（15mL）溶液を加え、得られた溶液を室温で16時間撹拌した。この溶液をMTBEで希釈し、H2Oと鹹水で洗浄し、乾燥（MgSO4）して蒸発させ、黄色の粗油（6.6g）を得た。これをSiO2クロマトグラフィー（ヘプタン100％）で精製し、化合物3をゆっくりと固化した無色の油として得た（6.06g、2段階で90％）：すべてのデータは文献（V. B. Christie et al, Org. Biomol. Chem., 2008, 6, 3497-3507）と一致した。
6-エチニル-1,1,4,4-テトラメチル-1,2,3,4-テトラヒドロナフタレン(3)の合成を図1Ｂに示す。トリエチルアミン（Et3N）（150mL）をN2で1時間スパージして脱気する。次に、化合物1（10.0g、31.8mmol）、Pd(PPh3)2Cl2（0.223g、0.32mmol）、CuI（0.061g、0.32mmol）、およびトリメチルシリルアセチレン（5.29mL、38.2mmol）をN2下で加え、得られたスラリーを室温で20時間撹拌した、この混合物をヘプタンで希釈し、Celite/SiO2（ヘプタンで溶出）に通し、得られた溶液を蒸発させて、茶色の粗油（10.36g）を得た。これをSiO2クロマトグラフィー（ヘプタン100％）で精製し、化合物2を黄色の油として得た（9.99g、＞100％）。化合物2（9.99g、35.1mmol）をメタノール（MeOH)／メチルtert-ブチルエーテル（MTBE）（1：1、160mL）に溶解した。その後、水酸化ナトリウム（NaOH)（0.96g、24.0mmol）のH2O（15mL）溶液を加え、得られた溶液を室温で16時間撹拌した。この溶液をMTBEで希釈し、H2Oと鹹水で洗浄し、乾燥（MgSO4）して蒸発させ、黄色の粗油（6.6g）を得た。これをSiO2クロマトグラフィー（ヘプタン100％）で精製し、化合物3をゆっくりと固化した無色の油として得た（6.06g、2段階で90％）：すべてのデータは文献（V. B. Christie et al, Org. Biomol. Chem., 2008, 6, 3497-3507）と一致した。
【0076】
1.1.3 4-ブロモ-3-フルオロベンゾアート、4の合成
4-ブロモ-3-フルオロベンゾアート（4）の合成を図１Ｃに示す。4-ブロモ-2-フルオロ安息香酸(25.0g、114.2mmol)をMeOH(250mL)に懸濁させた後、濃縮H2SO4(4mL)を加え、得られた溶液を還流で一晩撹拌しました。その後、透明な溶液を冷却し、H2O（100mL）を加えたところ、白色の沈殿物が形成された。これをろ過し、H2Oで洗浄し、乾燥させて粗い白色固体を得た。これをヘプタンから再結晶し、化合物4を無色の結晶性固体として得た（21.34g、80％）：1H NMR (600MHz、CDCl3) δ 3.91 (s, 3H), 7.31 - 7.36 (m, 2H), 7.80 (t, J = 8.0 Hz, 1H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 52.4, 117.6 (d, J = 9.9 Hz), 120.6 (d, J = 25.6 Hz), 127.5 (d, J = 3.9 Hz), 127.9 (d, J = 9.6 Hz), 133.1, 161.56 (d, J = 264.9 Hz), 164.1 (d, J = 3.9 Hz); 19F NMR (376 MHz, CDCl3) δ -106.6；IR（ATR）vmax／cm-13104w, 3086w, 2961w, 1712s, 1599s, 1571m, 1403m, 1215s, 882s；MS（ASAP）：m／z = 233.0 [M+H]+；HRMS（ASAP）calcd. for C8H7O2BrF [M+H]+:232.9613, first：232.9621（Zimmerman et al,J. Med. Chem. 2014, 57:2334-2356) 。
4-ブロモ-3-フルオロベンゾアート（4）の合成を図１Ｃに示す。4-ブロモ-2-フルオロ安息香酸(25.0g、114.2mmol)をMeOH(250mL)に懸濁させた後、濃縮H2SO4(4mL)を加え、得られた溶液を還流で一晩撹拌しました。その後、透明な溶液を冷却し、H2O（100mL）を加えたところ、白色の沈殿物が形成された。これをろ過し、H2Oで洗浄し、乾燥させて粗い白色固体を得た。これをヘプタンから再結晶し、化合物4を無色の結晶性固体として得た（21.34g、80％）：1H NMR (600MHz、CDCl3) δ 3.91 (s, 3H), 7.31 - 7.36 (m, 2H), 7.80 (t, J = 8.0 Hz, 1H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 52.4, 117.6 (d, J = 9.9 Hz), 120.6 (d, J = 25.6 Hz), 127.5 (d, J = 3.9 Hz), 127.9 (d, J = 9.6 Hz), 133.1, 161.56 (d, J = 264.9 Hz), 164.1 (d, J = 3.9 Hz); 19F NMR (376 MHz, CDCl3) δ -106.6；IR（ATR）vmax／cm-13104w, 3086w, 2961w, 1712s, 1599s, 1571m, 1403m, 1215s, 882s；MS（ASAP）：m／z = 233.0 [M+H]+；HRMS（ASAP）calcd. for C8H7O2BrF [M+H]+:232.9613, first：232.9621（Zimmerman et al,J. Med. Chem. 2014, 57:2334-2356) 。
【0077】
1.1.4 4-エチニル-3-フルオロ安息香酸メチルの合成、6
4-ethynyl-3-フルオロ安息香酸メチル（6) の合成を図１Ｄに示す。Et3N（120mL）をN2で1時間スパージして脱気した。続いて、化合物4（5.0g、21.45mmol）、トリメチルシリルアセチレン（3.56mL、25.74mmol）、Pd(PPh3)2Cl2（301mg、0.429mmol）およびCuI（82mg、0.429mmol）をN2下で加え、得られた懸濁液を室温で16時間撹拌した。この懸濁液をヘプタンで希釈し、Celite（登録商標）/SiO2に通した後、抽出液を蒸発させて粗油（6.44g）を得た。これをドライカラム真空クロマトグラフィー（100%ヘプタンから9:1ヘプタン/EtOAcへ）で精製し、単離された生成物をクーゲルローア蒸留（150℃、7.4Torr）でさらに精製して、化合物5を黄色の油として得て（5.58g、＞100%）、これを直接次のステップに進めた：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.27 (s, 9H), 3.92 (s, 3H), 7.50 (dd, J = 8.0, 6.8 Hz, 1H), 7.71 (dd, J = 9.6, 1.5 Hz, 1H), 7.75 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 1H)。MeOH：MTBE溶液（5：50、55mL）に、化合物5（5.58g、22.3mmol）およびK2CO3（6.16g、44.6mmol）を加え、得られた混合物をN2下、室温で6時間撹拌した。この溶液をEtOAcで希釈し、飽和NH4Cl、H2O、Brで洗浄しました。NH4Cl、H2O、鹹水で洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、蒸発させて粗固体（3.6g）を得た。これをドライカラム真空クロマトグラフィー（100％ヘプタンから8：2ヘプタン／EtOAcへ）で精製し、化合物6を白色固体として得た（3.07g、2段階で80％）：1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 3.45 (s, 1H), 3.92 (s, 3H), 7.53 (dd, J = 8.0, 6.8 Hz, 1H), 7.72 (dd, J = 9.6, 1.6 Hz, 1H), 7.77 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 1H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 52.5, 76.3, 85.1 (d, J = 3.3 Hz), 115.3 (d, J = 16.0 Hz), 116.5 (d, J = 22.9 Hz), 124.9 (d, J = 3.7 Hz), 132.2 (d, J = 7.4 Hz), 133.9 (d, J = 1.3 Hz), 162.9 (d, J = 253.5 Hz), 165.3 (d, J = 2.7 Hz); 19F NMR (376 MHz, CDCl3) δ -109.3; IR (ATR) vmax/cm-1 3238m, 3090w, 2967w, 2111w, 1710s, 1564m, 1501m, 1440m, 1308s, 1212s, 766s; MS (ASAP) m/z = 179.0 [M+H]+; HRMS (ASAP) calcd. for C10H8O2F [M+H]+: 179.0508, found 179.0495.
4-ethynyl-3-フルオロ安息香酸メチル（6) の合成を図１Ｄに示す。Et3N（120mL）をN2で1時間スパージして脱気した。続いて、化合物4（5.0g、21.45mmol）、トリメチルシリルアセチレン（3.56mL、25.74mmol）、Pd(PPh3)2Cl2（301mg、0.429mmol）およびCuI（82mg、0.429mmol）をN2下で加え、得られた懸濁液を室温で16時間撹拌した。この懸濁液をヘプタンで希釈し、Celite（登録商標）/SiO2に通した後、抽出液を蒸発させて粗油（6.44g）を得た。これをドライカラム真空クロマトグラフィー（100%ヘプタンから9:1ヘプタン/EtOAcへ）で精製し、単離された生成物をクーゲルローア蒸留（150℃、7.4Torr）でさらに精製して、化合物5を黄色の油として得て（5.58g、＞100%）、これを直接次のステップに進めた：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.27 (s, 9H), 3.92 (s, 3H), 7.50 (dd, J = 8.0, 6.8 Hz, 1H), 7.71 (dd, J = 9.6, 1.5 Hz, 1H), 7.75 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 1H)。MeOH：MTBE溶液（5：50、55mL）に、化合物5（5.58g、22.3mmol）およびK2CO3（6.16g、44.6mmol）を加え、得られた混合物をN2下、室温で6時間撹拌した。この溶液をEtOAcで希釈し、飽和NH4Cl、H2O、Brで洗浄しました。NH4Cl、H2O、鹹水で洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、蒸発させて粗固体（3.6g）を得た。これをドライカラム真空クロマトグラフィー（100％ヘプタンから8：2ヘプタン／EtOAcへ）で精製し、化合物6を白色固体として得た（3.07g、2段階で80％）：1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 3.45 (s, 1H), 3.92 (s, 3H), 7.53 (dd, J = 8.0, 6.8 Hz, 1H), 7.72 (dd, J = 9.6, 1.6 Hz, 1H), 7.77 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 1H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 52.5, 76.3, 85.1 (d, J = 3.3 Hz), 115.3 (d, J = 16.0 Hz), 116.5 (d, J = 22.9 Hz), 124.9 (d, J = 3.7 Hz), 132.2 (d, J = 7.4 Hz), 133.9 (d, J = 1.3 Hz), 162.9 (d, J = 253.5 Hz), 165.3 (d, J = 2.7 Hz); 19F NMR (376 MHz, CDCl3) δ -109.3; IR (ATR) vmax/cm-1 3238m, 3090w, 2967w, 2111w, 1710s, 1564m, 1501m, 1440m, 1308s, 1212s, 766s; MS (ASAP) m/z = 179.0 [M+H]+; HRMS (ASAP) calcd. for C10H8O2F [M+H]+: 179.0508, found 179.0495.
【0078】
1.1.5 5-ブロモピリジン-2-カルボン酸メチル、8の合成
5-ブロモピリジン-2-カルボン酸メチル（8）の合成法を図１Ｅに示す。
5-ブロモピリジン-2-カルボン酸（20.0g、99.0mmol）をMeOH（150mL）に懸濁し、そこに濃縮H2SO4（5mL）を注意深く加え、得られた溶液を還流で6時間撹拌した。この溶液を冷却し、EtOAcで希釈し、H2Oおよび鹹水（50mL）で洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、蒸発させて粗い無色の固体を得た。これをクーゲルロール（200℃、7.4Torr）を用いて真空蒸留し、得られた白色固体をさらにヘプタン／MeOH（10：1）から再結晶させて、化合物8を白色固体として得た（17.21g、80％）：1H NMR (700 MHz, CDCl3) δ 3.90 (s, 4H), 7.86-7.93 (m, 3H), 8.68 (d, J = 2.0 Hz, 1H); 13C NMR (176 MHz, CDCl3) δ 52.8, 124.8, 126.0, 139.5, 146.0, 150.7, 164.7; vmax/cm-1 3059w, 3008w, 2957w, 1710s, 1571w, 1558w, 1436m, 1305s, 1131s, 696s; MS (ASAP)：m/z = 216.0 [M+H]+; HRMS (ASAP) calcd. for C10H9NOI [M+H]+:215.9660, found：215.9664 (Tung et al,Eur. J. Med. Chem. 2017, 126, 1011-1020).
5-ブロモピリジン-2-カルボン酸メチル（8）の合成法を図１Ｅに示す。
5-ブロモピリジン-2-カルボン酸（20.0g、99.0mmol）をMeOH（150mL）に懸濁し、そこに濃縮H2SO4（5mL）を注意深く加え、得られた溶液を還流で6時間撹拌した。この溶液を冷却し、EtOAcで希釈し、H2Oおよび鹹水（50mL）で洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、蒸発させて粗い無色の固体を得た。これをクーゲルロール（200℃、7.4Torr）を用いて真空蒸留し、得られた白色固体をさらにヘプタン／MeOH（10：1）から再結晶させて、化合物8を白色固体として得た（17.21g、80％）：1H NMR (700 MHz, CDCl3) δ 3.90 (s, 4H), 7.86-7.93 (m, 3H), 8.68 (d, J = 2.0 Hz, 1H); 13C NMR (176 MHz, CDCl3) δ 52.8, 124.8, 126.0, 139.5, 146.0, 150.7, 164.7; vmax/cm-1 3059w, 3008w, 2957w, 1710s, 1571w, 1558w, 1436m, 1305s, 1131s, 696s; MS (ASAP)：m/z = 216.0 [M+H]+; HRMS (ASAP) calcd. for C10H9NOI [M+H]+:215.9660, found：215.9664 (Tung et al,Eur. J. Med. Chem. 2017, 126, 1011-1020).
【0079】
1.1.6 2,2,5,5-テトラメチルヘキサン二酸、9の合成
2,2,5,5-テトラメチルヘキサン二酸(9)の合成法を図１Fに示す。メカニカルスターラーを備えた2L三口フラスコに、H2O（600mL）、濃縮H2SO4（7.5mL）、ピバル酸（51.0g、500mmol）の順に加え、得られたスラリーを0℃に冷却した。15分かけて、H2O2（30％、43mL）と、FeSO4.7H2O（139.0g、500mmol）のH2O（288mL）および濃縮H2SO4（27.5mL）溶液を、激しく撹拌しながら滴下した。添加完了後、懸濁液をさらに15分間撹拌した後、溶液を約250mLまで濃縮した。析出した固体をろ過し、ロータリーエバポレーターを用いて真空下でさらに乾燥させ、粗い残渣を得た。これをAcOHから再結晶させて、9を無色の結晶性固体として得た（3.39g、3%）：1H NMR (400MHz、DMSO-d6) δ1.06 (s, 12H), 1.37 (s, 4H), 12.05 (s, 2H).
2,2,5,5-テトラメチルヘキサン二酸(9)の合成法を図１Fに示す。メカニカルスターラーを備えた2L三口フラスコに、H2O（600mL）、濃縮H2SO4（7.5mL）、ピバル酸（51.0g、500mmol）の順に加え、得られたスラリーを0℃に冷却した。15分かけて、H2O2（30％、43mL）と、FeSO4.7H2O（139.0g、500mmol）のH2O（288mL）および濃縮H2SO4（27.5mL）溶液を、激しく撹拌しながら滴下した。添加完了後、懸濁液をさらに15分間撹拌した後、溶液を約250mLまで濃縮した。析出した固体をろ過し、ロータリーエバポレーターを用いて真空下でさらに乾燥させ、粗い残渣を得た。これをAcOHから再結晶させて、9を無色の結晶性固体として得た（3.39g、3%）：1H NMR (400MHz、DMSO-d6) δ1.06 (s, 12H), 1.37 (s, 4H), 12.05 (s, 2H).
【0080】
1.1.7 1,6-ジエチルl 2,2,5,5-テトラメチルヘキサンジオエート、10の合成
1,6-ジエチル2,2,5,5-テトラメチルヘキサンジオエート(10)の合成を図１Ｇに示す。9（3.39g、16.76mmol）のEtOH（40mL）溶液に濃縮H2SO4（2mL）を加え、得られた懸濁液を還流で16時間撹拌した。この溶液を冷却し、溶媒を蒸発させて粗残渣を得、これをEtOAcに溶解した。有機物を飽和NaHCO3、H2O、および鹹水で洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、蒸発させて、粗油（3.8g）を得た。これをSiO2クロマトグラフィー（95：5、ヘプタン／EtOAc）で精製し、10を無色の油として得た（3.41g、79％）：1H NMR (700 MHz, CDCl3) δ 1.14 (s, 11H), 1.24 (t, J = 7.1Hz, 6H), 4.11 (q, J = 7.1 Hz, 4H); 13C NMR (176 MHz, CDCl3) δ 14.2, 25.0, 35.5, 41.8, 60.2, 177.7; IR (ATR) vmax/cm-1 2978m, 2934w, 2880w, 1726s, 1475m, 1308m, 1176s, 1110m, 771w; MS(ES)：m/z = 259.5 [M+H]+.
1,6-ジエチル2,2,5,5-テトラメチルヘキサンジオエート(10)の合成を図１Ｇに示す。9（3.39g、16.76mmol）のEtOH（40mL）溶液に濃縮H2SO4（2mL）を加え、得られた懸濁液を還流で16時間撹拌した。この溶液を冷却し、溶媒を蒸発させて粗残渣を得、これをEtOAcに溶解した。有機物を飽和NaHCO3、H2O、および鹹水で洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、蒸発させて、粗油（3.8g）を得た。これをSiO2クロマトグラフィー（95：5、ヘプタン／EtOAc）で精製し、10を無色の油として得た（3.41g、79％）：1H NMR (700 MHz, CDCl3) δ 1.14 (s, 11H), 1.24 (t, J = 7.1Hz, 6H), 4.11 (q, J = 7.1 Hz, 4H); 13C NMR (176 MHz, CDCl3) δ 14.2, 25.0, 35.5, 41.8, 60.2, 177.7; IR (ATR) vmax/cm-1 2978m, 2934w, 2880w, 1726s, 1475m, 1308m, 1176s, 1110m, 771w; MS(ES)：m/z = 259.5 [M+H]+.
【0081】
1.1.8 トリメチル（{3,3,6,6-テトラメチル-2-[(トリメチルシリル)オキシ]シクロヘックス-1-エン-1-イル}オキシ）シラン、11の合成
トリメチル（{3,3,6,6-テトラメチル-2-[(トリメチルシリル)オキシ]シクロヘックス-1-エン-1-イル}オキシ）シラン、11の合成を図１Ｈに示す。無水トルエン（50mL）に、N2下でナトリウム（1.20g、52.1mmol）を加え、得られた混合物をナトリウムが溶けるまで加熱還流した。その後、フラスコを加熱から外し、10（2.69g、10.41mmol）とクロロトリメチルシラン（6.72mL、53.0mmol）を加え、その後、得られた懸濁液を還流で一晩攪拌した。その後、紫色の懸濁液を冷却し、N2を流しながらろ過し、トルエン、テトラヒドロフラン（THF）の順で洗浄した。その後、濾液を蒸発させて、淡黄色の粗油（3.2g）を得た。これをクーゲルローア蒸留（120℃、3.6Torr）で精製して、11を透明な油として得た（2.64g、81%）：1H NMR (400MHz、CDCl3) δ 0.19 (s, 18H), 1.03 (s, 12H), 1.44 (s, 4H)。その他のデータはすべて文献と一致した（Kikuchi et al. J. Med. Chem. 2000; 43：pp.409-419）。
トリメチル（{3,3,6,6-テトラメチル-2-[(トリメチルシリル)オキシ]シクロヘックス-1-エン-1-イル}オキシ）シラン、11の合成を図１Ｈに示す。無水トルエン（50mL）に、N2下でナトリウム（1.20g、52.1mmol）を加え、得られた混合物をナトリウムが溶けるまで加熱還流した。その後、フラスコを加熱から外し、10（2.69g、10.41mmol）とクロロトリメチルシラン（6.72mL、53.0mmol）を加え、その後、得られた懸濁液を還流で一晩攪拌した。その後、紫色の懸濁液を冷却し、N2を流しながらろ過し、トルエン、テトラヒドロフラン（THF）の順で洗浄した。その後、濾液を蒸発させて、淡黄色の粗油（3.2g）を得た。これをクーゲルローア蒸留（120℃、3.6Torr）で精製して、11を透明な油として得た（2.64g、81%）：1H NMR (400MHz、CDCl3) δ 0.19 (s, 18H), 1.03 (s, 12H), 1.44 (s, 4H)。その他のデータはすべて文献と一致した（Kikuchi et al. J. Med. Chem. 2000; 43：pp.409-419）。
【0082】
1.1.9 3,3,6,6-テトラメチルシクロヘキサン-1,2-ジオン、12の合成
3,3,6,6-テトラメチルシクロヘキサン-1,2-ジオンの合成方法を図１Jに示す。11（2.6g、8.2mmol）のジクロロメタン（DCM）溶液に、臭素（0.42mL、8.2mmol）を5分かけて滴下して加えた。得られた黄色の溶液を室温で1時間撹拌した後、DCMで希釈し、飽和NA2S2O3で処理した後、H2Oで洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、蒸発させて、粗い黄色固体（1.5g）を得た。これをヘプタンから再結晶させて精製し、12を黄色の結晶性固体として得た（1.07g、78%）:1H NMR (700 MHz, CDCl3) δ 1.14 (s, 4H), 1.85 (s, 12H); 13C NMR (176 MHz, CDCl3) δ 22.9, 34.7, 48.6, 207.3; IR (ATR) vmax/cm-12973m, 2940w, 2870w, 1706s, 1599w, 1459m, 1372m, 1102m, 931m; MS(ES): m/z = 169.3 [M+H]+.その他のデータはすべて文献と一致しました(Kikuchi et al. J. Med. Chem. 2000; 43：pp.409-419)。
3,3,6,6-テトラメチルシクロヘキサン-1,2-ジオンの合成方法を図１Jに示す。11（2.6g、8.2mmol）のジクロロメタン（DCM）溶液に、臭素（0.42mL、8.2mmol）を5分かけて滴下して加えた。得られた黄色の溶液を室温で1時間撹拌した後、DCMで希釈し、飽和NA2S2O3で処理した後、H2Oで洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、蒸発させて、粗い黄色固体（1.5g）を得た。これをヘプタンから再結晶させて精製し、12を黄色の結晶性固体として得た（1.07g、78%）:1H NMR (700 MHz, CDCl3) δ 1.14 (s, 4H), 1.85 (s, 12H); 13C NMR (176 MHz, CDCl3) δ 22.9, 34.7, 48.6, 207.3; IR (ATR) vmax/cm-12973m, 2940w, 2870w, 1706s, 1599w, 1459m, 1372m, 1102m, 931m; MS(ES): m/z = 169.3 [M+H]+.その他のデータはすべて文献と一致しました(Kikuchi et al. J. Med. Chem. 2000; 43：pp.409-419)。
【0083】
1.1.10 メチル5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロキノキサリン-2-カルボキシラート、13の合成
メチル5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロキノキサリン-2-カルボキシレート、13の合成を図１Ｊに示す。12（0.80g、4.76mmol）とDL-2,3-ジアミノプロピオン酸ハイドロクロライド（0.67g、4.76mmol）をMeOH（30mL）中で合わせた。NaOH（0.76g、19.04mmol）を加え、得られた混合物を24時間還流で撹拌した。この溶液を0℃に冷却し、H2SO4を注意深く加え、該溶液をさらに6時間還流で撹拌した。子の溶液を冷却し、溶媒を蒸発させて祖残渣を得た。これをEtOAcで溶解し、飽和NaHCO3、H2O、および鹹水で洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、蒸発させて、黄色の粗油（0.9g）を得た。これをSiO2クロマトグラフィー（95：5、ヘプタン／EtOAc）で精製し、13を無色の油として得た（0.633g、54％）：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.33＆1.36 (s, 12H), 1.81 (s, 4H), 3.98 (s, 3H), 9.00 (s, 1H)。その他のデータはすべて文献と一致した（Kikuchi et al. J. Med. Chem. 2000; 43：pp.409-419）。
メチル5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロキノキサリン-2-カルボキシレート、13の合成を図１Ｊに示す。12（0.80g、4.76mmol）とDL-2,3-ジアミノプロピオン酸ハイドロクロライド（0.67g、4.76mmol）をMeOH（30mL）中で合わせた。NaOH（0.76g、19.04mmol）を加え、得られた混合物を24時間還流で撹拌した。この溶液を0℃に冷却し、H2SO4を注意深く加え、該溶液をさらに6時間還流で撹拌した。子の溶液を冷却し、溶媒を蒸発させて祖残渣を得た。これをEtOAcで溶解し、飽和NaHCO3、H2O、および鹹水で洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、蒸発させて、黄色の粗油（0.9g）を得た。これをSiO2クロマトグラフィー（95：5、ヘプタン／EtOAc）で精製し、13を無色の油として得た（0.633g、54％）：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.33＆1.36 (s, 12H), 1.81 (s, 4H), 3.98 (s, 3H), 9.00 (s, 1H)。その他のデータはすべて文献と一致した（Kikuchi et al. J. Med. Chem. 2000; 43：pp.409-419）。
【0084】
1.1.11 （5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロキノキサリン-2-イル）メタノール、14の合成
（5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロキノキサリン-2-イル）メタノール、14の合成を図１Ｋに示す。13（5.09g、20.5mmol）のTHF（80mL）溶液に、NaBH4（2.33g、61.5mmol）を加えた。その後、この溶液を加熱還流し、そこにMeOH（16mL）を1時間かけてゆっくりと加えた。次に、得られた溶液を還流で一晩攪拌した。この溶液を冷却し、1M HClでクエンチし、溶媒を蒸発させた。残渣をDCMに溶解し、水で洗浄し、乾燥させ(MgSO4）、蒸発させて、黄色の粗油（4g）を得た。これをSiO2クロマトグラフィー（溶離液として8：2、ヘプタン／EtOAc）で精製し、14を無色の油として得た（3.96g、88％）：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.33 & 1.36 (s, 12H), 1.80 (s, 4H), 3.50 (br, 1H), 4.75 (s, 2H), 8.32 (s, 1H); その他のデータはすべて文献（Kikuchi et al. J. Med. Chem. 2000; 43：pp.409-419)。
（5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロキノキサリン-2-イル）メタノール、14の合成を図１Ｋに示す。13（5.09g、20.5mmol）のTHF（80mL）溶液に、NaBH4（2.33g、61.5mmol）を加えた。その後、この溶液を加熱還流し、そこにMeOH（16mL）を1時間かけてゆっくりと加えた。次に、得られた溶液を還流で一晩攪拌した。この溶液を冷却し、1M HClでクエンチし、溶媒を蒸発させた。残渣をDCMに溶解し、水で洗浄し、乾燥させ(MgSO4）、蒸発させて、黄色の粗油（4g）を得た。これをSiO2クロマトグラフィー（溶離液として8：2、ヘプタン／EtOAc）で精製し、14を無色の油として得た（3.96g、88％）：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.33 & 1.36 (s, 12H), 1.80 (s, 4H), 3.50 (br, 1H), 4.75 (s, 2H), 8.32 (s, 1H); その他のデータはすべて文献（Kikuchi et al. J. Med. Chem. 2000; 43：pp.409-419)。
【0085】
1.1.12 5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロキノキサリン-2-カルバルデヒド、15の合成
5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロキノキサリン-2-カルバルデヒド、15の合成を図１Ｌに示す。N2下で、無水DCM（100mL）に塩化オキサリル（2.28mL、26.96mmol）を加えた。得られた溶液を-78℃に冷却し、そこに、温度を-60℃未満に保つためにDMSO（3.83mL、53.92mmol）を滴下して加えた。この溶液を15分間撹拌した後、無水DCMの溶液である14（3.96g、17.97mmol, 20mL中）を、温度を-60℃未満に保つように滴下して加えた。この溶液をさらに15分間撹拌した後、Et3N（18.03mL、129.38mmol）を加えた。次にこの溶液を10分間撹拌した後、30分間かけて室温（RT）にした。H2Oを加え、得られた混合物をDCMで希釈し、H2Oで洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、蒸発させて粗油（4g）を得た。これをドライカラム真空クロマトグラフィー（DCVC）（ヘプタンから9：1、ヘプタン／EtOAcへ）で精製して、ゆっくりと結晶化する無色の油として15を得た（3.39g、86%)：1H NMR (700 MHz, CDCl3) δ 1.35 & 1.37 (s, 12H), 1.83 (s, 4H), 8.90 (s, 1H), 10.08 (s, 1H); 13C NMR (176 MHz, CDCl3) δ 29.7, 29.7, 33.8, 37.4, 37.9, 139.8, 144.2, 159.0, 163.7, 193.4; IR (ATR) vmax/cm-12979m, 2964m, 2928m, 2862m, 2823w, 1707s, 1553m, 1457m, 1126s, 1078s, 737s; MS(ES)：m/z = 219.3 [M+H]+; HRMS（ES）calcd. for C13H19ON2 [M+H]+:216.1497, found 216.1503.
5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロキノキサリン-2-カルバルデヒド、15の合成を図１Ｌに示す。N2下で、無水DCM（100mL）に塩化オキサリル（2.28mL、26.96mmol）を加えた。得られた溶液を-78℃に冷却し、そこに、温度を-60℃未満に保つためにDMSO（3.83mL、53.92mmol）を滴下して加えた。この溶液を15分間撹拌した後、無水DCMの溶液である14（3.96g、17.97mmol, 20mL中）を、温度を-60℃未満に保つように滴下して加えた。この溶液をさらに15分間撹拌した後、Et3N（18.03mL、129.38mmol）を加えた。次にこの溶液を10分間撹拌した後、30分間かけて室温（RT）にした。H2Oを加え、得られた混合物をDCMで希釈し、H2Oで洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、蒸発させて粗油（4g）を得た。これをドライカラム真空クロマトグラフィー（DCVC）（ヘプタンから9：1、ヘプタン／EtOAcへ）で精製して、ゆっくりと結晶化する無色の油として15を得た（3.39g、86%)：1H NMR (700 MHz, CDCl3) δ 1.35 & 1.37 (s, 12H), 1.83 (s, 4H), 8.90 (s, 1H), 10.08 (s, 1H); 13C NMR (176 MHz, CDCl3) δ 29.7, 29.7, 33.8, 37.4, 37.9, 139.8, 144.2, 159.0, 163.7, 193.4; IR (ATR) vmax/cm-12979m, 2964m, 2928m, 2862m, 2823w, 1707s, 1553m, 1457m, 1126s, 1078s, 737s; MS(ES)：m/z = 219.3 [M+H]+; HRMS（ES）calcd. for C13H19ON2 [M+H]+:216.1497, found 216.1503.
【0086】
1.1.13 1-ジアゾ-2-オキソプロピルホスホン酸ジメチル、16の合成
1-ジアゾ-2-オキソプロピルホスホン酸ジメチル、16の合成を図１Ｍに示す。0℃の2-オキソプロピルホスホン酸ジメチル（4.49mL、32.5mmol）の無水トルエン（30mL）溶液に、激しく撹拌しながらNaH（鉱油に60%分散、1.20g、30.00mmol）を一部分ずつ加えた。ガスの発生が止まった後、4-アセトアミドベンゼンスルホニルアジド（7.21g、30.0mmol）の無水THF（10mL）溶液を滴下して加えた。得られた懸濁液を室温で16時間撹拌し、そこにヘプタンを加え、懸濁液をCelite（登録商標）でろ過し、MTBEで洗浄した。その後、有機抽出物を蒸発させて粗油（5g）を得、これをSiO2クロマトグラフィー（1：1、ヘプタン／EtOAc）で精製して、1-ジアゾ-2-オキソプロピルホスホン酸ジメチルを淡黄色の油として得た（3.14g、54%)：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.24 (s, 3H), 3.82 (d, J = 11.9 Hz, 6H)、その他のデータはすべて文献（Pietruszka et al. Synthesis, 2006, pp.4266-4268）と一致した。
1-ジアゾ-2-オキソプロピルホスホン酸ジメチル、16の合成を図１Ｍに示す。0℃の2-オキソプロピルホスホン酸ジメチル（4.49mL、32.5mmol）の無水トルエン（30mL）溶液に、激しく撹拌しながらNaH（鉱油に60%分散、1.20g、30.00mmol）を一部分ずつ加えた。ガスの発生が止まった後、4-アセトアミドベンゼンスルホニルアジド（7.21g、30.0mmol）の無水THF（10mL）溶液を滴下して加えた。得られた懸濁液を室温で16時間撹拌し、そこにヘプタンを加え、懸濁液をCelite（登録商標）でろ過し、MTBEで洗浄した。その後、有機抽出物を蒸発させて粗油（5g）を得、これをSiO2クロマトグラフィー（1：1、ヘプタン／EtOAc）で精製して、1-ジアゾ-2-オキソプロピルホスホン酸ジメチルを淡黄色の油として得た（3.14g、54%)：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.24 (s, 3H), 3.82 (d, J = 11.9 Hz, 6H)、その他のデータはすべて文献（Pietruszka et al. Synthesis, 2006, pp.4266-4268）と一致した。
【0087】
1.1.14 2-エチニル-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロキノキサリン、17
2-エチニル-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロキノキサリン、17の合成を図１Ｎに示す。N2下で、15（1.18g、5.40mmol）の無水MeOH（50mL）溶液に、K2CO3（1.49g、10.80mmol）とジメチル-1-ジアゾ-2-オキソプロピルホスホネート（0.98mL、6.48mmol）を加え、得られた懸濁液を室温で16時間撹拌した。この溶液をEtOAcで希釈し、5% NaHCO3、H2O、および鹹水で洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、蒸発させて、オレンジ色の粗油（0.4g）を得た。これをSiO2クロマトグラフィー（溶離液として95：5、ヘプタン／EtOAc）で精製して、ゆっくりと結晶化した無色の油として17を得た（0.84g、73%)：1H NMR (700 MHz, CDCl3) δ 1.30 & 1.31 (s, 12H), 1.77 (s, 4H), 3.22 (s, 1H), 8.45 (s, 1H); 13C NMR (176 MHz, CDCl3) δ 29.6, 29.7, 33.8, 34.0, 37.2, 37.3, 79.0, 81.0, 135.4, 144.5, 158.1, 158.6; IR (ATR) vmax/cm-13279s, 2986w, 2945m, 2917m, 2863w, 2110w, 1519w, 1470m, 1459m, 1274m, 1078s, 674s; MS(ES)：m/z = 215.3 [M+H]+; HRMS（ES）calcd. for C14H19N2[M+H]+:215.1548, found 215.1548.
2-エチニル-5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロキノキサリン、17の合成を図１Ｎに示す。N2下で、15（1.18g、5.40mmol）の無水MeOH（50mL）溶液に、K2CO3（1.49g、10.80mmol）とジメチル-1-ジアゾ-2-オキソプロピルホスホネート（0.98mL、6.48mmol）を加え、得られた懸濁液を室温で16時間撹拌した。この溶液をEtOAcで希釈し、5% NaHCO3、H2O、および鹹水で洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、蒸発させて、オレンジ色の粗油（0.4g）を得た。これをSiO2クロマトグラフィー（溶離液として95：5、ヘプタン／EtOAc）で精製して、ゆっくりと結晶化した無色の油として17を得た（0.84g、73%)：1H NMR (700 MHz, CDCl3) δ 1.30 & 1.31 (s, 12H), 1.77 (s, 4H), 3.22 (s, 1H), 8.45 (s, 1H); 13C NMR (176 MHz, CDCl3) δ 29.6, 29.7, 33.8, 34.0, 37.2, 37.3, 79.0, 81.0, 135.4, 144.5, 158.1, 158.6; IR (ATR) vmax/cm-13279s, 2986w, 2945m, 2917m, 2863w, 2110w, 1519w, 1470m, 1459m, 1274m, 1078s, 674s; MS(ES)：m/z = 215.3 [M+H]+; HRMS（ES）calcd. for C14H19N2[M+H]+:215.1548, found 215.1548.
【0088】
1.2 3-フルオロ-4-[2-(5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロナフタレン-2-イル)エチニル]安息香酸、DC526の合成
例示化合物DC526の合成を図２Ａに示す。
例示化合物DC526の合成を図２Ａに示す。
【0089】
Et3N（80mL）をN2で1時間スパージして脱気した。次に、化合物1（0.80g、2.55mmol）、化合物6（0.54g、3.05mmol）、Pd(PPh3)2Cl2（179mg、0.255mmol）およびCuI（49mg、0.255mmol）をN2下で加え、得られた懸濁液を室温で72時間撹拌した。懸濁液をMTBEで希釈し、Celite（登録商標）/SiO2に通した後、抽出液を蒸発させて粗固体（1.1g）を得た。これをドライカラム真空クロマトグラフィー（100%ヘプタン、95:5、ヘプタン/EtOAcへ）で精製すると、ゆっくりと結晶化した無色の油として化合物7を得た（0.82g、88%）。これをそのまま次のステップに運んだ。化合物7（0.80g、2.20mmol）をTHF（40mL）に溶解し、20％NaOH（3mL）を加え、得られた溶液を還流で16時間撹拌した。混合物を冷却し、5％HClでpH1に酸性化し、EtOAcで抽出し、H2Oと鹹水で洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、蒸発させて粗い白色固体を得た。これをアセトニトリル（MeCN）から再結晶させて、DC526を無色の結晶性固体として得た（0.60g、77%)：1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) 1.24 & 1.26 (s, 12H), 1.64 (s, 4H), 7.32 (dd, J = 8.1, 1.8 Hz, 1H), 7.40 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.70 - 7.78 (m, 2H), 7.80 (dd, J = 7.9, 1.6 Hz, 1H), 13.44 (br, 1H); 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 31.3, 31.4, 33.9, 34.1, 34.2, 34.3, 81.0, 97.4 (d, J = 3.1 Hz), 115.2, 115.3 (d, J = 15.8 Hz), 116.0 (d, J = 22.3 Hz), 118.5, 125.4 (d, J = 3.4 Hz）, 127.1, 128.7, 129.6, 132.7 (d, J = 7.1 Hz）, 133.6, 145.2, 146.5, 161.4 (d, J = 250.3 Hz), 165.7 (d, J = 2.5 Hz); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ -110.0; IR (ATR) vmax/cm-12967m, 2928m, 2857m, 2210w, 1686s, 1617m, 1566m, 1421m, 1307m, 1218m, 834s, 764m; MS(ASAP)：m/z = 351.2 [M+H]+; HRMS（ASAP）calcd. for C23H24O2F [M+H]+:351.1760, found 351.1766.
【0090】
1.3 5-[2-(5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロナフタレン-2-イル)エチニル]ピリジン-2-カルボン酸、DC528の合成
例示化合物DC528の合成を図２Ｂに示す。
例示化合物DC528の合成を図２Ｂに示す。
【0091】
Et3N/THF（1：1、120mL）をN2で1時間スパージして脱気し、Pd(PPh3)2Cl2（0.265g、0.38mmol）、CuI（0.072g、0.38mmol）、化合物3（0.8g、4.80mmol）および化合物8（0.98g、4.52mmol）を加え、得られた溶液を50℃で40時間撹拌した。この溶液をヘプタンで希釈し、Celite（登録商標）/SiO2プラグを介してヘプタンで溶出した。その後、有機物を飽和NH4Cl、H2O、および鹹水で洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、蒸発させて茶色の粗固体（1.9g）を得た。これをドライカラム真空クロマトグラフィー（100％ヘプタンから8：2、ヘプタン／EtOAcへ）で精製し、化合物9を白色固体（0.36g、27％）として得て、これをそのまま次のステップに運んだ：1H NMR (400 MHz, CDCl3） δ 1.29 (d, J = 7.9 Hz, 12H), 1.69 (s, 4H), 4.02 (s, 3H), 7.31 (d, J = 1.1 Hz, 2H), 7.51 (s, 1H), 7.94 (dd, J = 8.1, 2.1 Hz, 1H), 8.12 (dd, J = 8.1, 0.9 Hz, 1H), 8.85 (dd, J = 2.1, 0.9 Hz, 1H)。化合物9（0.33g、0.95mmol）をTHF（30mL）に溶解し、20％NaOH（3mL）を加え、得られた溶液を還流で16時間撹拌した。混合物を冷却し、5％HClでpH1に酸性化し、EtOAcで抽出し、H2Oおよび鹹水で洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、蒸発させて白色の粗固体を得た。これをMeCNから再結晶し、DC528を無色の結晶性固体として得た（0.30g、96％）：1H NMR (700 MHz, DMSO-d6) δ 1.25 & 1.27 (s, 12H), 1.65 (s, 4H), 7.35 (dd, J = 8.1, 1.8 Hz, 1H), 7.41 (dd, J = 8.1 Hz, 1H), 7.57 (dd, J = 1.8 Hz, 1H), 8.06 (dd, J = 8.1, 0.9 Hz, 1H), 8.12 (dd, J = 8.1, 2.1 Hz, 1H), 8.85 (dd, J = 2.1, 0.9 Hz, 1H), 13.35 (s, 1H); 13C NMR (176 MHz, DMSO-d6) δ 31.3, 31.4, 33.9, 34.1, 34.2, 34.3, 39.5, 84.8, 95.4, 118.4, 122.7, 124.3, 127.1, 128.7, 129.8, 139.5, 145.2, 146.4, 146.9, 151.3, 165.6; IR (ATR) vmax/cm-1 3283br, 2955m, 2920m, 2856m, 2208m, 1752s, 1586m, 1336s, 1247m, 1017m, 833m; MS(ES)：m/z = 334.2 [M+H]+; HRMS (ES) calcd. for C22H24NO2[M+H]+: 334.1807, found 334.1808.
【0092】
1.4 メチル 4-[2-(5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロキノキサリン-2-イル)エチニル]ベンゾエート（DC641）の合成
例示化合物DC641の合成を図２Ｃに示す。Et3N（20mL）をArで1時間スパージして脱気した。次に、4-ヨード安息香酸メチル（0.31g、1.20mmol）、DC640（0.30g、1.40mmol）、Pd(PPh3)2Cl2（83mg、0.12mmol）およびCuI（22mg、0.12mmol）をAr下で加え、得られた懸濁液を室温で16時間撹拌した。この懸濁液をMTBEで希釈し、Celite（登録商標）/SiO2に通した後、抽出液を蒸発させて粗固体（0.5g）を得た。これをドライカラム真空クロマトグラフィー（100%ヘプタンから85:15、ヘプタン/EtOAcへ）で精製してオフホワイトの固体を得、続いてMeOHから再結晶させてDC641を無色の結晶性固体（0.29g、71%）を得た。これをそのまま次のステップに運んだ：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.33 & 1.35 (s, 12H), 1.81 (s, 4H), 3.94 (s, 3H), 7.64 - 7.71 (m, 2H), 8.01 - 8.08 (m, 2H), 8.52 (s, 1H).
例示化合物DC641の合成を図２Ｃに示す。Et3N（20mL）をArで1時間スパージして脱気した。次に、4-ヨード安息香酸メチル（0.31g、1.20mmol）、DC640（0.30g、1.40mmol）、Pd(PPh3)2Cl2（83mg、0.12mmol）およびCuI（22mg、0.12mmol）をAr下で加え、得られた懸濁液を室温で16時間撹拌した。この懸濁液をMTBEで希釈し、Celite（登録商標）/SiO2に通した後、抽出液を蒸発させて粗固体（0.5g）を得た。これをドライカラム真空クロマトグラフィー（100%ヘプタンから85:15、ヘプタン/EtOAcへ）で精製してオフホワイトの固体を得、続いてMeOHから再結晶させてDC641を無色の結晶性固体（0.29g、71%）を得た。これをそのまま次のステップに運んだ：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.33 & 1.35 (s, 12H), 1.81 (s, 4H), 3.94 (s, 3H), 7.64 - 7.71 (m, 2H), 8.01 - 8.08 (m, 2H), 8.52 (s, 1H).
【0093】
1.5 4-[2-(5,5,8,8-テトラメチル-5,6,7,8-テトラヒドロキノキサリン-2-イル)エチニル]安息香酸、DC645の合成
例示化合物DC645の合成を図２Ｄに示す。DC641（0.28g、0.8mmol）をTHF（20mL）に溶解し、20％NaOH（2mL）を加え、得られた溶液を還流で16時間撹拌した。この混合物を冷却し、5％HClでpH1に酸性化し、EtOAcで抽出し、H2Oおよび鹹水で洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、蒸発させて白色の粗固体を得た。これをMeCNから再結晶させて、DC645を無色の結晶性固体として得た（0.24g、89％）：1H NMR (700MHz, DMSO-d6) δ 1.29 (s, 12H), 1.78 (s, 4H), 7.73 - 7.79 (m, 2H), 7.98 - 8.02 (m, 2H), 8.68 (s, 1H), 13.24 (br, 1H); 13C NMR (176 MHz, DMSO-d6) δ 29.4, 29.4, 33.1, 33.2, 37.0, 37.1, 88.9, 89.8, 125.2, 129.6, 131.3, 131.9, 135.2, 144.4, 157.6, 158.0, 166.5; IR (ATR) vmax/cm-1 2961w, 2925w, 2958w, 2223w, 1683s, 1606m, 1558w, 1428m, 1282s, 862s, 769m; MS(ASAP): m/z = 334.2 [M]+; HRMS (ASAP) calcd. for C21H22N2O2 [M]+：334.1681, found 334.1686.
例示化合物DC645の合成を図２Ｄに示す。DC641（0.28g、0.8mmol）をTHF（20mL）に溶解し、20％NaOH（2mL）を加え、得られた溶液を還流で16時間撹拌した。この混合物を冷却し、5％HClでpH1に酸性化し、EtOAcで抽出し、H2Oおよび鹹水で洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、蒸発させて白色の粗固体を得た。これをMeCNから再結晶させて、DC645を無色の結晶性固体として得た（0.24g、89％）：1H NMR (700MHz, DMSO-d6) δ 1.29 (s, 12H), 1.78 (s, 4H), 7.73 - 7.79 (m, 2H), 7.98 - 8.02 (m, 2H), 8.68 (s, 1H), 13.24 (br, 1H); 13C NMR (176 MHz, DMSO-d6) δ 29.4, 29.4, 33.1, 33.2, 37.0, 37.1, 88.9, 89.8, 125.2, 129.6, 131.3, 131.9, 135.2, 144.4, 157.6, 158.0, 166.5; IR (ATR) vmax/cm-1 2961w, 2925w, 2958w, 2223w, 1683s, 1606m, 1558w, 1428m, 1282s, 862s, 769m; MS(ASAP): m/z = 334.2 [M]+; HRMS (ASAP) calcd. for C21H22N2O2 [M]+：334.1681, found 334.1686.
【0094】
実施例２：生物学的評価
2.1 合成レチノイドのゲノム活性
合成レチノイドのゲノム活性を、X-Galアッセイを用いて転写を誘導する効率を測定することによって評価した。X-Galアッセイは、レチノイン酸応答エレメント（RARE）に連結したプロモーターによってLacZ遺伝子の転写が制御されているSil-15レポーター細胞を用いる。レポーター細胞をレチノイドで処理した後、レポーター細胞が産生するβ-ガラクトシダーゼの活性をモニターし、定量することで、化合物の転写誘導能力を得ることができる。
2.1 合成レチノイドのゲノム活性
合成レチノイドのゲノム活性を、X-Galアッセイを用いて転写を誘導する効率を測定することによって評価した。X-Galアッセイは、レチノイン酸応答エレメント（RARE）に連結したプロモーターによってLacZ遺伝子の転写が制御されているSil-15レポーター細胞を用いる。レポーター細胞をレチノイドで処理した後、レポーター細胞が産生するβ-ガラクトシダーゼの活性をモニターし、定量することで、化合物の転写誘導能力を得ることができる。
【0095】
0.1%ゼラチンでコーティングした96ウェルプレートに、Sil-15細胞を1ウェルあたり100000個ずつ蒔いた。翌日、10％の子牛胎児血清（FCS）を含むダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）で調製したレチノイドリガンドの連続希釈液を10-6Mから10-14Mの濃度で添加し、プレートを一晩インキュベートした。ATRA標準曲線および他のレチノイドリガンドの濃度はすべて3連で試験した。
【0096】
翌日、アッセイプレートをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄し、PBS中の1％グルタルアルデヒドと1mMのMgCl2を各ウェルにつき100μLずつ用いて15分間固定し、PBSで2回洗浄した。β-ガラクトシダーゼ活性は、PBS中の1mM MgCl2、3.3mM フェロシアン化カリウム、3.3mM フェロシアン化カリウムに溶解した0.2％X-Galを改めて調製し、1ウェルあたり100μL添加することで検出した。プレートを37℃、5% CO2で6時間インキュベートし、該プレートをEmax Precision Microplate Reader（Molecular Devices）を用いて650nmで読み取ることで色の変化を検出した。
【0097】
その結果、表１および図３に示すように、レポーター細胞での転写を誘発する能力が高いことから分かるように、いくつかの合成レチノイドは内因性リガンド（ATRA）よりも高いゲノム活性を示すことが実証された。特に、DC527、DC540、DC525、DC528、DC526およびDC645はすべて、レチノイン酸（ATRA）と比較して、高いゲノム活性と効力を示した。
【0098】
2.2合成レチノイドの非ゲノム活性
合成レチノイドの非ゲノム活性を、AlphaLISA（登録商標） SureFire（登録商標） Ultra ERK1/2キットを用いて、ERK1/2のリン酸化を誘導する能力を測定することで評価した。
合成レチノイドの非ゲノム活性を、AlphaLISA（登録商標） SureFire（登録商標） Ultra ERK1/2キットを用いて、ERK1/2のリン酸化を誘導する能力を測定することで評価した。
【0099】
このアッセイでは、SH-SY5Y細胞（100,000個／ウェル）を96ウェルプレートに蒔き、DMEMにおいて24時間血清飢餓状態にした。レチノイドを、10-5Mから10-11Mの濃度で、培地中のDMSOの最終濃度0.1%で試験した。無血清DMEM中のSH-SY5Y細胞について、細胞を37℃で30分間レチノイドで刺激して、アッセイを行った。
【0100】
アッセイ終了後、培地を除去し、新たに調製した50μLの1X溶解緩衝液（キットに付属）で細胞を溶解した。96ウェルプレートを、オービタルシェーカー（SO1、Stuart Scientific社製）において、約350rpmで、室温で10分間撹拌した。
【0101】
その間に、活性化緩衝液を反応緩衝液で25倍に希釈した。暗室で緑色の光の下、アクセプタービーズを新しく調製した反応混合物で50倍に希釈し、一方、ドナービーズを希釈緩衝液で50倍に希釈して、2つの最終反応混合物を得た。
【0102】
続いて、細胞ライセート10μLを384ウェルの白色Proxiplatesプレート（PerkinElmer）にウェルごとに移し、暗室で緑色の光の下、調製した各アクセプターとドナーの反応混合物を5μLずつ加えた。プレートをアルミホイルで包み、室温で少なくとも3時間インキュベートした。Envisionシステム（PerkinElmer Life Sciences）を用いて、AlphaScreen（登録商標）の設定で読み取りを行った。
【0103】
表１および図４に示した結果から、SH-SY5Y細胞においてレチノイドのErk1/2のリン酸化を誘導する能力が実証された。DC527、DC540、DC528、DC526、DC645など、レチノイン酸よりも高い効力と有効性の両方を持つレチノイドが確認され、中でもDC525は高い効力を持つことが確認された。
【0104】
2.3神経突起伸長の誘導
SY-SY5Y細胞を、酸処理し/ポリ-L-リジンでコーティングしたカバースリップを含む12ウェルプレートに10,000細胞/ウェルで蒔いた。24時間後、各レチノイドを10nMの濃度で培地に添加し、プレートを5日間インキュベートした。レチノイド処理後、カバースリップ上のSH-SY5Y細胞をPBSで2回洗浄し、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で室温で20分間固定し、PBSで2回洗浄した。
SY-SY5Y細胞を、酸処理し/ポリ-L-リジンでコーティングしたカバースリップを含む12ウェルプレートに10,000細胞/ウェルで蒔いた。24時間後、各レチノイドを10nMの濃度で培地に添加し、プレートを5日間インキュベートした。レチノイド処理後、カバースリップ上のSH-SY5Y細胞をPBSで2回洗浄し、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で室温で20分間固定し、PBSで2回洗浄した。
【0105】
神経突起の免疫細胞化学的染色のために、カバースリップ上の細胞をPBSで3回洗浄し、ブロッキング溶液（PBS中の10％ドンキー血清と0.1％トリトンX-100）中で室温で1時間インキュベートした。その後、ブロッキング緩衝液で1:1000に希釈したβ-IIIチューブリン一次抗体（sigma-Aldrich）を用いて4℃で一晩インキュベートし、細胞を標識した。一晩インキュベートした後、細胞を0.1% Triton X-100溶液（PBST）を含むPBSで3回洗浄してから、抗マウスモノクローナル二次抗体（PBSTで1:300、Jackson Immunoresearch）と室温で2時間インキュベートした。最後に、PBSTで3回洗浄し、PBSで最後の洗浄を行った後、カバースリップをスライドに乗せ、4℃で保存した。
【0106】
染色した細胞上の神経突起の伸長を定量化するために、NeuronJプラグイン付きのImageJソフトウェアを使用した。各実験では、Nikon Eclipse E400蛍光顕微鏡を用いて、各カバースリップからランダムに選んだ10種類の画像を撮影した。各画像を8ビット画像（NeuronJプラグインに必要）に変換し、GIMP（GNU Image Manipulation Program）の明るさとコントラストのツールを用いて最適化した。各画像について、NeuronJプラグインのトレースツールを用いて、明確に識別できる神経突起ごとに個別のトレースを描いた。神経突起の長さはピクセル単位で測定し、使用した倍率に応じてμm単位の長さに変換した。各画像の平均神経突起長は、神経突起長の合計を画像ごとの神経突起の合計数で割ることで算出した。カバースリップごとに10枚の画像を測定し、カバースリップ全体の平均値を算出した。カバースリップは、各レチノイドおよび濃度ごとに3枚ずつ作成した。
【0107】
図５に示すデータは、いくつかのレチノイドがSY-SY5Y細胞の神経突起伸長を誘導する能力を示したことを実証するものである。さらに、これらの化合物のいくつか（DC527、DC525、DC528、DC526、DC645）で処理した細胞は、ATRAで処理した細胞よりも有意に大きな平均神経突起長を示した。
【0108】
以下の表１は、試験したレチノイド化合物のゲノム活性（転写活性）と非ゲノム活性（p-ERK1/2活性）を、神経突起伸長の増加とともにまとめたもので、これらの結果を図５にプロットした。この図から、ゲノムおよび非ゲノムの両アッセイで高い有効性を示した化合物は、神経突起伸長誘導が増加していることが明らかである。これは、ゲノム活性と非ゲノム活性の両方を誘導する「二重効力」の化合物が、臨床使用においてより効果的である可能性を示しており、このデュアルアッセイ法が新しい治療用化合物の強力なスクリーニングツールとなる可能性を秘めている。
【0109】
【表1】
【0110】
2.4アルツハイマー病関連遺伝子の制御
レチノイドがアルツハイマー病に関与する遺伝子の発現に与える影響を調べるため、ラットの混合初代神経細胞/グリア培養液において、レチノイド処理後のアルツハイマー病関連遺伝子群の発現を評価した。
レチノイドがアルツハイマー病に関与する遺伝子の発現に与える影響を調べるため、ラットの混合初代神経細胞/グリア培養液において、レチノイド処理後のアルツハイマー病関連遺伝子群の発現を評価した。
【0111】
約300,000個のラット神経細胞／グリア細胞を、まず1μg/mLのリポポリサッカライド（sigma-Aldrich）で6時間処理し、炎症を誘発しました。炎症を起こした後、細胞を10nMのレチノイドで24時間処理した。今回の実験では、これまでのアッセイで最も強力であることが判明したレチノイドを選択して使用した。処理後、処理した細胞からRNAを抽出し、qPCR解析を行った。
【0112】
トータルRNAは、Qiagen RNeasy mini kit（CAT# 74104、Qiagen）を用いて、メーカーのプロトコルに従って抽出した。簡単に述べると、細胞と脳組織のサンプルを、それぞれβ-MEを混合した350μLと1200μLのRLT緩衝液（緩衝液1mL：β-ME10μLの割合）でホモジナイズした。その後、サンプルを13,000rpmで3分間遠心分離した。上清を70%エタノールと1:1の体積比で混合してから（CAT# E7023, Sigma-Aldrich）、コレクションチューブに入れたスピンカラムに移した。サンプルを10,000rpmで1分間遠心分離し、RNAをスピンカラムの膜に結合させた。
【0113】
オンカラムDNase消化では、カラム内のサンプルを350μLのRW1緩衝液で洗浄し、10,000rpmで1分間遠心分離した。その後、80μLのDNase混合液（10μLのDNase酵素と70μLのRDD緩衝液；CAT# 79254, Qiagen）を各サンプルの上に加えた。サンプルを室温で15分間インキュベートした後、350μLのRW1緩衝液を加えた。サンプルを10,000rpmで1分間遠心分離した。
【0114】
その後、500μLのRPE緩衝液（100％エタノールを1：4の割合で混合したもの）をサンプルの上に加えた。サンプルを10,000rpmで1分間遠心分離した（このステップは2回繰り返した）。スピンカラムを再び13,000rpmで1分間遠心分離し、膜を乾燥させた。スピンカラムを回収管から取り出し、別の1.5mL RNaseフリー回収管内に置いた。30μLのRNaseフリーの水をスピンカラムの膜に直接加えてRNAを溶出させた。サンプルを室温で5分間インキュベートした後、10,000rpmで1分間回転させた。
【0115】
RNA濃度は、NanoDrop（商標）2000c分光光度計（Thermo Fisher Scientific）を用いて測定した。RNAの溶出に使用したRNaseフリーの水をブランクとし、各RNAサンプルを2μL使用して、装置をキャリブレーションした。RNAサンプルは、RNAの劣化を最小限に抑えるため、-70℃のフリーザーで保存した。
【0116】
qPCR反応は、PerfeCTa SYBR Green SuperMix（CAT# 733-1246, VWR）を用いて行った。10μLの反応ミックスを384ウェルプレート（CAT# 04729749001, Roche）の各ウェルに3つ組で加えた。各反応には、4倍に希釈したcDNAテンプレート2μL、2X SYBRグリーンミックス5μL、250nMのプライマーを含めた。
【0117】
プライマーはPrimer-BLASTを用いて、約60℃の融点で設計した。それをqPCRに使用する前に、PCRでプライマーの特異性を確認し、PCR産物をシーケンシングに回した。
【0118】
qPCRでテストしたすべてのプライマーセットについて、標準曲線（ストックcDNAの5倍希釈液を用いて作成）とブランクコントロールを行った。その後、プレートを密封し、短時間の遠心分離を行い、すべての試薬がウェルの底にあることを確認した。このプレートを、95℃で5分間保持するようにプログラムされたRoche LightCycler 480で実行した。その後、95℃で15秒、60℃で15秒、72℃で15秒の45サイクルでqPCRを実行した。その後、プレートを95℃で5秒、次に58℃で1分実行することで融解曲線を得た。
【0119】
結果は、LightCycler 480 1.5 ソフトウェアの delta delta CT法を用いて解析した。対象の遺伝子の発現は、各実験に応じて適切な参照遺伝子に正規化した。
【0120】
図７に示したデータは、DC645、DC528、DC526が炎症遺伝子（Ccl5、TNFα、Nos2）をダウンレギュレートし、神経保護遺伝子（AbcA1、Abcg1、Igf1、Igf2）および非アミロイド生成経路遺伝子（Nep、Ide、Adam10）をアップレギュレートして、アミロイド前駆体を毒性のあるアミロイド断片を生成しない経路に連れて行くことを示している。
【0121】
実施例３：MDCK-MDR1の透過性アッセイ：
このアッセイは、MDCK-MDR1細胞における試験化合物の頂端-側底（A-B）方向および側底-頂端（B-A）方向の透過性を測定し、化合物が積極的に排出されるかどうかを示す排出率（ER）を決定するために用いられる。このように、このアッセイは、血液脳透過性およびCNS暴露の貴重なin vitroサロゲートとなる
このアッセイは、MDCK-MDR1細胞における試験化合物の頂端-側底（A-B）方向および側底-頂端（B-A）方向の透過性を測定し、化合物が積極的に排出されるかどうかを示す排出率（ER）を決定するために用いられる。このように、このアッセイは、血液脳透過性およびCNS暴露の貴重なin vitroサロゲートとなる
【0122】
3.1実験手順
NIH（Rockville, MD, USA）から入手したMDCK-MDR1細胞を、継代数6-30の間で使用する。細胞はMillipore Multiscreen Transwellプレートに3.4×105細胞/cm2で播種する。細胞はDMEMで培養し、3日目に培地を交換する。4日目に透過性試験を行う。細胞培養およびアッセイのインキュベーションは、5%CO2、相対湿度95%の雰囲気下で、37℃で行う。アッセイ当日、37℃に加温した所望のpHのハンクス平衡塩溶液（HBSS）で頂端側と側底側の両方の表面を2回洗浄して単層膜を調製する。次に、生理的パラメータを安定させるために、頂端側と側底側の両方のコンパートメントで、所望のpHのHBSSを用いて40分間細胞をインキュベートする。投与液は、試験化合物をアッセイ緩衝液で希釈し、試験化合物の最終濃度が10μMになるように調製する。分析用標準液は、試験化合物のDMSO希釈液から調製し、1% v/vのDMSO濃度を維持したまま緩衝液に移す。緩衝液は補充HBSS pH7.4からなる。A-Bの透過性を評価するために、頂端コンパートメントからHBSSを取り除き、試験化合物の投与液に置き換える。次に、頂端コンパートメントインサートを、新鮮な緩衝液（1% v/v DMSOを含む）を含むコンパニオンプレートに配置する。B-Aの透過性を評価するために、コンパニオンプレートからHBSSを取り除き、試験化合物の投与液に置き換える。新鮮な緩衝液（1% v/v DMSOを含む）を頂端コンパートメントインサートに加え、コンパニオンプレートに配置する。60分後、頂端コンパートメントインサートとコンパニオンプレートを分離し、頂端サンプルと側底サンプルを希釈して分析する。試験化合物の透過性は二重に評価する。透過性が既知の化合物をコントロールとして各アッセイプレートで実施する。試験化合物とコントロール化合物を、サンプルを適切に希釈した7点キャリブレーションを用いて、LCMS/MSカセット分析により定量する。投与液から開始濃度（C0）を求め、C0と頂端コンパートメントおよび側底コンパートメントの両方の濃度から実験的回収率を算出する。
NIH（Rockville, MD, USA）から入手したMDCK-MDR1細胞を、継代数6-30の間で使用する。細胞はMillipore Multiscreen Transwellプレートに3.4×105細胞/cm2で播種する。細胞はDMEMで培養し、3日目に培地を交換する。4日目に透過性試験を行う。細胞培養およびアッセイのインキュベーションは、5%CO2、相対湿度95%の雰囲気下で、37℃で行う。アッセイ当日、37℃に加温した所望のpHのハンクス平衡塩溶液（HBSS）で頂端側と側底側の両方の表面を2回洗浄して単層膜を調製する。次に、生理的パラメータを安定させるために、頂端側と側底側の両方のコンパートメントで、所望のpHのHBSSを用いて40分間細胞をインキュベートする。投与液は、試験化合物をアッセイ緩衝液で希釈し、試験化合物の最終濃度が10μMになるように調製する。分析用標準液は、試験化合物のDMSO希釈液から調製し、1% v/vのDMSO濃度を維持したまま緩衝液に移す。緩衝液は補充HBSS pH7.4からなる。A-Bの透過性を評価するために、頂端コンパートメントからHBSSを取り除き、試験化合物の投与液に置き換える。次に、頂端コンパートメントインサートを、新鮮な緩衝液（1% v/v DMSOを含む）を含むコンパニオンプレートに配置する。B-Aの透過性を評価するために、コンパニオンプレートからHBSSを取り除き、試験化合物の投与液に置き換える。新鮮な緩衝液（1% v/v DMSOを含む）を頂端コンパートメントインサートに加え、コンパニオンプレートに配置する。60分後、頂端コンパートメントインサートとコンパニオンプレートを分離し、頂端サンプルと側底サンプルを希釈して分析する。試験化合物の透過性は二重に評価する。透過性が既知の化合物をコントロールとして各アッセイプレートで実施する。試験化合物とコントロール化合物を、サンプルを適切に希釈した7点キャリブレーションを用いて、LCMS/MSカセット分析により定量する。投与液から開始濃度（C0）を求め、C0と頂端コンパートメントおよび側底コンパートメントの両方の濃度から実験的回収率を算出する。
【0123】
3.2データ分析
各化合物の透過係数（Papp）は、以下の式から算出される。
各化合物の透過係数（Papp）は、以下の式から算出される。
【0124】
【数1】
【数2】
【0125】
3.3.生物学的研究
前述のMDCK-MDR1アッセイにおいて、式Iの多数の化合物の膜透過性を測定した。化合物の透過性（Papp, nm/s）および排出率（ER）を測定し、関連性の高い参照化合物EC23の透過性と比較した。その結果を表２にまとめた。
前述のMDCK-MDR1アッセイにおいて、式Iの多数の化合物の膜透過性を測定した。化合物の透過性（Papp, nm/s）および排出率（ER）を測定し、関連性の高い参照化合物EC23の透過性と比較した。その結果を表２にまとめた。
【0126】
【表2】
【0127】
表２に示した結果から、式（I）の化合物の中には、MDCK-MDR1アッセイにおいて透過性および排出の欠如がかなり改善されているものがあり、したがって、血液脳関門の透過性およびCNS暴露がかなり改善されていることが期待できる。ALSやアルツハイマー病などのCNS疾患の治療には、CNS標的を十分に高い濃度の治療薬に曝露することが必要であることから、最適なCNSへの曝露が、これらの疾患の治療薬に不可欠な特性であることは明らかである。このように、研究した式（I）の化合物は、文献に記載されている化合物EC23と比較して、薬らしい特性が著しく向上している。このようなCNS曝露の改善は、驚くべき意外な発見である。
【0128】
実施例4：比濁法による水溶解度
実施例4.1実験手順
試験化合物（DMSO中10mM）を連続的に希釈し、DMSO中0.1、0.3、1、および3mMの溶液を得た。その後、各試験化合物濃度を緩衝液（0.01Mリン酸緩衝生理食塩水pH7.4）でさらに100分の1に希釈し、最終的なDMSO濃度が1％、最終的な試験化合物濃度が1、3、10、30、および100μMとなるようにした。実験は37℃で行い、各濃度のサンプルを7つの複製ウェルでインキュベートした。プレートを37℃で2時間インキュベートした後、620nmで吸光度を測定した。サンプルの溶解度は、溶媒対照群（すなわち、緩衝液中の1％DMSO）よりも吸光度の増加をもたらす試験化合物の濃度から推定した。
実施例4.1実験手順
試験化合物（DMSO中10mM）を連続的に希釈し、DMSO中0.1、0.3、1、および3mMの溶液を得た。その後、各試験化合物濃度を緩衝液（0.01Mリン酸緩衝生理食塩水pH7.4）でさらに100分の1に希釈し、最終的なDMSO濃度が1％、最終的な試験化合物濃度が1、3、10、30、および100μMとなるようにした。実験は37℃で行い、各濃度のサンプルを7つの複製ウェルでインキュベートした。プレートを37℃で2時間インキュベートした後、620nmで吸光度を測定した。サンプルの溶解度は、溶媒対照群（すなわち、緩衝液中の1％DMSO）よりも吸光度の増加をもたらす試験化合物の濃度から推定した。
【0129】
4.2生物学的研究
式（I）の多数の化合物の溶解度を、先に述べた比濁法による水溶解度アッセイで測定した。化合物の溶解度を測定し、関連性の高い参照化合物EC23の溶解度と比較した。その結果を表3にまとめた。
式（I）の多数の化合物の溶解度を、先に述べた比濁法による水溶解度アッセイで測定した。化合物の溶解度を測定し、関連性の高い参照化合物EC23の溶解度と比較した。その結果を表3にまとめた。
【0130】
【表3】
【0131】
上の表に示された結果は、式Iの化合物が溶解性をかなり改善し得ることを示しており、したがって、吸収や標的への曝露を含む多くの生物学的特性もかなり改善することが期待できる。これもまた、驚くべき意外な発見である。
【0132】
本明細書において、レチノイン酸受容体（RAR）の活性化によって軽減される状態または疾病の治療に化合物を使用することが記載されている場合、それはこれらの化合物自体の開示を意味することが理解されるであろう。
【0133】
本明細書（添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）に開示されているすべての特徴、ならびに／または、そのように開示されている任意の方法もしくはプロセスのすべてのステップは、斯かる特徴および／またはステップの少なくともいくつかが相互に排他的である組み合わせを除いて、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書（添付の特許請求の範囲、要約書、および図面を含む）に開示されている各特徴は、明示的に別段の記載がない限り、同じ目的、同等の目的、または類似の目的を果たす代替の特徴で置き換えることができる。したがって、明示的に別段の記載がない限り、開示された各特徴は、同等または類似の特徴の一般的なシリーズの一例に過ぎない。本発明は、上述の実施形態の詳細に限定されるものではない。本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲、要約書、および図面を含む）に開示された特徴の任意の新規の1つ、または任意の新規の組み合わせ、または、そのように開示された任意の方法もしくはプロセスのステップの任意の新規の1つ、もしくは任意の新規の組み合わせにまで及ぶ。
【0134】
本明細書における実質的に任意の複数形および/または単数形の用語の使用に関しては、当業者であれば、文脈および/または用途に応じて、複数形から単数形へ、および/または単数形から複数形へと翻訳することができる。様々な単数/複数の順列は、明確にするために本明細書において明示的に記載される場合がある。
【0135】
一般に、本明細書、特に添付の特許請求の範囲で使用される用語は、一般に「オープン」な用語として意図されていることが、当業者には理解されよう（例えば、「～を含み」という用語は、「～を含むがこれに限定されない」と解釈されるべきであり、「～を有する」という用語は、「～を少なくとも有する」と解釈されるべきであり、「～を含む」という用語は、「～を含むがこれに限定されない」と解釈されるべきである、など）。導入された請求項の記載の特定の数が意図されている場合、そのような意図は請求項に明示的に記載され、そのような記載がない場合にはそのような意図は存在しないことが、当業者にはさらに理解されるであろう。例えば、理解を助けるために、以下の添付の請求項には、請求項の記載を導入するために、「少なくとも1つ」および「1つまたは複数の」という導入句の使用を含み得る。しかし、このような句の使用は、同じ請求項が、導入句「1つまたは複数」または「少なくとも1つ」および「a」または「an」などの不定冠詞を含む場合であっても、不定冠詞「a」または「an」による請求項の記載の導入が、そのような導入された請求項の記載を含む特定の請求項を、そのような記載を1つだけ含む実施形態に限定することを意味すると解釈されるべきではない（例えば、「a」や「an」は、「少なくとも1つ」や「1つまたは複数」を意味すると解釈されるべきである）。請求項の記載の導入に使用される定冠詞の使用についても同様である。さらに、導入された請求項の記載の特定の数が明示的に記載されている場合であっても、当業者であれば、そのような記載は少なくとも記載された数を意味するように解釈すべきであることを認識するであろう（例えば、他の修飾語を伴わない「2回の記載」という裸の記載は、少なくとも2回またはそれ以上の記載を意味する）。
【0136】
本開示の様々な実施形態は、説明のために本明細書に記載されており、本開示の範囲から逸脱することなく様々な変更を加えることができることが理解されるであろう。したがって、本明細書に開示された様々な実施形態は、限定的であることを意図するものではなく、真の範囲は以下の請求項によって定義される。
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図1d】
【図1e】
【図1f】
【図1g】
【図1h】
【図1i】
【図1j】
【図1k】
【図1l】
【図1m】
【図1n】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
