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特許7568224ＣＡＲＴ細胞療法のための配列決定法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-10-07

(45)【発行日】2024-10-16

(54)【発明の名称】ＣＡＲＴ細胞療法のための配列決定法

(51)【国際特許分類】

A61K 35/17 20150101AFI20241008BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20241008BHJP

A61P 35/02 20060101ALI20241008BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20241008BHJP

A61K 39/00 20060101ALI20241008BHJP

A61K 31/519 20060101ALN20241008BHJP

C12N 15/62 20060101ALN20241008BHJP

C07K 16/28 20060101ALN20241008BHJP

C07K 16/46 20060101ALN20241008BHJP

C12N 15/13 20060101ALN20241008BHJP

C12P 21/08 20060101ALN20241008BHJP

【ＦＩ】

A61K35/17 ZNA

A61P35/00

A61P35/02

A61P43/00 121

A61K39/00 H

A61K31/519

C12N15/62 Z

C07K16/28

C07K16/46

C12N15/13

C12P21/08

【請求項の数】 26

(21)【出願番号】P 2020544671

(86)(22)【出願日】2019-02-22

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-06-03

(86)【国際出願番号】 US2019019191

(87)【国際公開番号】W WO2019165237

(87)【国際公開日】2019-08-29

【審査請求日】2022-02-16

(31)【優先権主張番号】62/634,573

(32)【優先日】2018-02-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/656,265

(32)【優先日】2018-04-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/724,345

(32)【優先日】2018-08-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/736,730

(32)【優先日】2018-09-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】508347801

【氏名又は名称】エンドサイト・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＥＮＤＯＣＹＴＥ，ＩＮＣ．

(73)【特許権者】

【識別番号】505194066

【氏名又は名称】パーデュー・リサーチ・ファウンデイション

【氏名又は名称原語表記】ＰＵＲＤＵＥＲＥＳＥＡＲＣＨＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ

(73)【特許権者】

【識別番号】518337658

【氏名又は名称】シアトルチルドレンズホスピタル（ディービーエイシアトルチルドレンズリサーチインスティテュート）

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100156144

【弁理士】

【氏名又は名称】落合康

(72)【発明者】

【氏名】リチャード・メスマン

(72)【発明者】

【氏名】クリストファー・ポール・リーモン

(72)【発明者】

【氏名】ハイヤン・チュー

(72)【発明者】

【氏名】インジュアン・ジューン・ル

(72)【発明者】

【氏名】フィリップ・ステュワート・ロウ

(72)【発明者】

【氏名】マイケル・シー・ジェンセン

(72)【発明者】

【氏名】ジェイムズ・マッテイ

(72)【発明者】

【氏名】ナビン・ロバート・チャールズ・ピント

(72)【発明者】

【氏名】ジュリー・ルッジェーリ・パーク

【審査官】六笠紀子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１６／１６８７６６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／１７７１４９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１６／１４９６６５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Cancer Res.，2017年，77(supplement 13)，Abstract LB-187

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ３５／００－３５／７６８

Ａ６１Ｋ３９／００－３９／４４

Ａ６１Ｋ３１／３３－３３／４４

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

キメラ受容体発現Ｔ細胞(ＣＡＲＴ細胞)組成物であって、フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)を指向するＣＡＲを含むＣＡＲＴ細胞を含み、癌を処置する方法に使用するためのＣＡＲＴ細胞組成物であり、該方法が、
ｉ)患者に少なくとも一用量のＣＡＲＴ細胞組成物を投与すること；そして
ii)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、化合物はリンカーによりＦＩＴＣに結合したフォレートを含む小分子リガンドを含む)を含み、ここで、該化合物またはその薬学的に許容される塩は少なくとも１回目の用量漸増過程および２回目の用量漸増過程により投与されるものであり、
１回目の用量漸増過程が患者に最初の２週間サイクルにおける連続していない３日で該化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量の約１％、約１０％および約１００％の３漸増用量で投与することを含み、
２回目の用量漸増過程が患者に２回目の２週間サイクルにおける連続していない３日で該化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量の約１％、約１０～３０％および約１００～３００％の３漸増用量で投与することを含み、
化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量が約１０μg／kg～約５０μg／kgであり、そしてＣＡＲＴ細胞が
SVLTQPSSVSAAPGQKVTISCSGSTSNIGNNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNSASLDISGLQSEDEADYYCAAWDDSLSEFLFGTGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGNLVQPGGSLRLSCAASGFTFGSFSMSWVRQAPGGGLEWVAGLSARSSLTHYADSVKGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRVEDTAVYYCARRSYDSSGYWGHFYSYMDVWGQGTLVTVSESKYGPPCPPCPAPEFDGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKMFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRLEGGGEGRGSLLTCGDVEENPG(配列番号５)
の配列を有するポリペプチドを含むものである、
ＣＡＲＴ細胞組成物。

【請求項2】

化合物またはその薬学的に許容される塩が少なくとも１回目の用量漸増過程、２回目の用量漸増過程および３回目の用量漸増過程で投与される、請求項１に記載のＣＡＲＴ細胞組成物。

【請求項3】

化合物またはその薬学的に許容される塩が少なくとも１回目の用量漸増過程、２回目の用量漸増過程、３回目の用量漸増過程および４回目の用量漸増過程で投与される、請求項１に記載のＣＡＲＴ細胞組成物。

【請求項4】

化合物またはその薬学的に許容される塩が少なくとも１回目の用量漸増過程、２回目の用量漸増過程、３回目の用量漸増過程、４回目の用量漸増過程および５回目の用量漸増過程で投与される、請求項１に記載のＣＡＲＴ細胞組成物。

【請求項5】

化合物またはその薬学的に許容される塩が少なくとも１回目の用量漸増過程、２回目の用量漸増過程、３回目の用量漸増過程、４回目の用量漸増過程、５回目の用量漸増過程および６回目の用量漸増過程で投与される、請求項１に記載のＣＡＲＴ細胞組成物。

【請求項6】

患者にＣＡＲＴ細胞の初回用量およびＣＡＲＴ細胞の第二用量が投与される、請求項１～５の何れかに記載のＣＡＲＴ細胞組成物。

【請求項7】

ＣＡＲＴ細胞の初回用量が患者のＣＡＲＴ細胞に対する認容性のモニターのための試験用量である、請求項６に記載のＣＡＲＴ細胞組成物。

【請求項8】

ＣＡＲＴ細胞の第二用量がＣＡＲＴ細胞の初回用量より高用量のＣＡＲＴ細胞を含む、請求項６に記載のＣＡＲＴ細胞組成物。

【請求項9】

１回目の用量漸増過程の後に化合物またはその薬学的に許容される塩が投与されない期間がある、請求項１～８の何れかに記載のＣＡＲＴ細胞組成物。

【請求項10】

２回目の用量漸増過程の後に化合物またはその薬学的に許容される塩が投与されない期間がある、請求項１～９の何れかに記載のＣＡＲＴ細胞組成物。

【請求項11】

３回目の用量漸増過程の後に化合物またはその薬学的に許容される塩が投与されない期間がある、請求項２～１０の何れかに記載のＣＡＲＴ細胞組成物。

【請求項12】

４回目の用量漸増過程の後に化合物またはその薬学的に許容される塩が投与されない期間がある、請求項３～１１の何れかに記載のＣＡＲＴ細胞組成物。

【請求項13】

５回目の用量漸増過程の後に化合物またはその薬学的に許容される塩が投与されない期間がある、請求項４～１２の何れかに記載のＣＡＲＴ細胞組成物。

【請求項14】

６回目の用量漸増過程の後に化合物またはその薬学的に許容される塩が投与されない期間がある、請求項５～１３の何れかに記載のＣＡＲＴ細胞組成物。

【請求項15】

期間が約７日間である、請求項９～１４の何れかに記載のＣＡＲＴ細胞組成物。

【請求項16】

３回目の用量漸増過程が、患者に、連続していない３日で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量の約１％、約５０％および約５００％で投与することを含む、請求項２～１５の何れかに記載のＣＡＲＴ細胞組成物。

【請求項17】

４回目の用量漸増過程が、患者に、連続していない３日で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量の約１％、約１０％および約１００％で投与することを含む、請求項３～１６の何れかに記載のＣＡＲＴ細胞組成物。

【請求項18】

５回目の用量漸増過程が、患者に、連続していない３日で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量の約１％、約３０％および約３００％で投与することを含む、請求項４～１７の何れかに記載のＣＡＲＴ細胞組成物。

【請求項19】

６回目の用量漸増過程が、患者に、連続していない３日で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量の約１％、約５０％および約５００％で投与することを含む、請求項５～１８の何れかに記載のＣＡＲＴ細胞組成物。

【請求項20】

患者で２回目の用量漸増過程中サイトカイン放出症候群(ＣＲＳ)または神経毒性が観察されなければ、方法を３回目の用量漸増過程に進める、請求項２～１９の何れかに記載のＣＡＲＴ細胞組成物。

【請求項21】

患者で３回目の用量漸増過程中ＣＲＳまたは神経毒性が観察されなければ、方法を４回目の用量漸増過程に進める、請求項３～２０の何れかに記載のＣＡＲＴ細胞組成物。

【請求項22】

患者で４回目の用量漸増過程中ＣＲＳまたは神経毒性が観察されなければ、方法を５回目の用量漸増過程に進める、請求項４～２１の何れかに記載のＣＡＲＴ細胞組成物。

【請求項23】

患者で５回目の用量漸増過程中ＣＲＳまたは神経毒性が観察されなければ、方法を６回目の用量漸増過程に進める、請求項５～２２の何れかに記載のＣＡＲＴ細胞組成物。

【請求項24】

用量漸増過程の何れかで患者で低血圧を伴わない発熱が観察され、患者で神経毒性が観察されなければ、化合物またはその薬学的に許容される塩のその後の全ての用量を、患者に低血圧を伴わない発熱を引き起こしたその用量漸増過程レベルで投与する、請求項１～２３の何れかに記載のＣＡＲＴ細胞組成物。

【請求項25】

用量漸増過程の何れかで患者に重度ＣＲＳまたは神経毒性が生じたら、化合物またはその薬学的に許容される塩のその後の全ての用量を、患者に重度ＣＲＳまたは神経毒性を引き起こしたその用量漸増過程レベルより低い用量漸増過程レベルで患者に投与する、１～２３の何れかに記載のＣＡＲＴ細胞組成物。

【請求項26】

ＣＡＲＴ細胞組成物であって、フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)を指向するＣＡＲを含むＣＡＲＴ細胞を含み、癌を処置する方法に使用するためのＣＡＲＴ細胞組成物であり、該方法が、
ｉ)患者に少なくとも一用量のＣＡＲＴ細胞組成物を投与すること；そして
ii)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、化合物はリンカーによりＦＩＴＣに結合したフォレートを含む小分子リガンドを含む)を含み、ここで、該化合物またはその薬学的に許容される塩は１回目の用量漸増過程で投与され、重度ＣＲＳが１回目の用量漸増過程で生じたならば、該化合物またはその薬学的に許容される塩を低用量漸増過程を使用して投与し、ここで、該低用量漸増過程における化合物またはその薬学的に許容される塩の初回用量は、１回目の用量漸増過程で投与される該化合物またはその薬学的に許容される塩の初回用量より低いものであり、
ここで、低用量漸増過程において、該化合物またはその薬学的に許容される塩が、連続していない３日で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量の約０.５％、約５％および約５０％で投与されるものであり、化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量が約１０μg／kg～約５０μg／kgであり、
ここで、ＣＡＲＴ細胞が
SVLTQPSSVSAAPGQKVTISCSGSTSNIGNNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNSASLDISGLQSEDEADYYCAAWDDSLSEFLFGTGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGNLVQPGGSLRLSCAASGFTFGSFSMSWVRQAPGGGLEWVAGLSARSSLTHYADSVKGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRVEDTAVYYCARRSYDSSGYWGHFYSYMDVWGQGTLVTVSESKYGPPCPPCPAPEFDGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKMFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRLEGGGEGRGSLLTCGDVEENPG(配列番号５)
の配列を有するポリペプチドを含む、
ＣＡＲＴ細胞組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互引用
本出願は、２０１８年２月２３日出願の米国仮出願６２／６３４,５７３、２０１８年４月１１日出願の米国仮出願６２／６５６,２６５、２０１８年８月２９日出願の米国仮出願６２／７２４,３４５および２０１８年９月２６日出願の米国仮出願６２／７３６,７３０に基づく優先権を主張し、これら全ての開示は、引用により明示的に全体として本明細書に包含させる。

【0002】

技術分野
本発明は、患者にＣＡＲＴ細胞を含む組成物を投与し、かつ患者にリンカーにより標的化部分に結合した小分子を投与することによる、癌を有する患者を処置する方法に関する。本発明はまたそのような方法で使用する組成物にも関する。

【背景技術】

【0003】

背景
リンパ球(例えば、Ｔ細胞)の患者への養子移入に基づく免疫療法は、癌および他の疾患の処置における価値ある治療である。リンパ球の養子移入に基づく免疫療法の展開で、重要な進歩がなされている。種々のタイプの免疫療法剤において、開発中の最も有用な免疫療法剤の一つは、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞(ＣＡＲＴ細胞)である。キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)は、特異的抗原、例えば、腫瘍抗原を標的とするよう設計された遺伝子改変受容体である。このターティングは、例えば、ＣＡＲを発現するＣＡＲＴ細胞が特異的腫瘍抗原を介して腫瘍を標的とし、致死させるように、腫瘍に対する細胞毒性をもたらし得る。

【0004】

第一世代ＣＡＲは、腫瘍により発現される抗原の認識および結合のための認識領域、例えば、抗体由来一本鎖フラグメント可変(ｓｃＦｖ)領域および活性化シグナル伝達ドメインからなり、例えば、Ｔ細胞のＣＤ３ζ鎖は、ＣＡＲにおけるＴ細胞活性化シグナルとして働き得る。ＣＡＲＴ細胞はインビトロで良い成果を出しているが、臨床治験における疾患(例えば、癌)根絶の成功は限定的である。一つの問題は、インビボでＣＡＲＴ細胞集団が長期に活性化および増大できないことである。

【0005】

この問題に取り組むために、インビボでＴ細胞の長期活性化を達成するための、共刺激ドメイン(例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ２８またはＣＤ１３４)が第二世代ＣＡＲに取り込まれている。共刺激ドメインの付加はＣＡＲを含むＴ細胞のインビボ増殖および生存を増強し、初期の臨床データは、このような構築物が癌などの疾患の処置に有望な治療剤であることを示している。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

ＣＡＲＴ細胞療法で改善がなされているが、いくつかの問題が残っている。第一に、ＣＡＲＴ細胞により標的とされる抗原(例えば、腫瘍関連抗原)を発現する正常細胞により、「オフターゲット」毒性が生じ得る。第二に、無制御のＣＡＲＴ細胞活性化が、ＣＡＲＴ細胞による罹患細胞(例えば、癌細胞)の迅速かつ無制御な排除が患者とって致命的となり得る腫瘍溶解症候群またはサイトカイン放出症候群(ＣＲＳ)と称される一群の代謝障害により誘発され際にみられ得る。腫瘍溶解症候群およびＣＲＳは、容易に制御できず、制御不能に活性化される投与されたＣＡＲＴ細胞によるものであり得る。従って、ＣＡＲＴ細胞は癌などの疾患の処置におけるツールとして非常に有望であるが、オフターゲット毒性低減およびＣＡＲＴ細胞活性化のより厳密な制御を提供する、さらなるＣＡＲＴ細胞治療プロトコールが必要である。

【課題を解決するための手段】

【0007】

発明の概要
ここに記載する種々の実施態様において、リンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンドは、ＣＡＲＴ細胞を癌改善のために該癌に指向させる、癌とＣＡＲＴ細胞の間の架橋として使用される。ある実施態様において、「小分子リガンド」は、例えば、フォレート、ＤＵＰＡ、ＮＫ－１Ｒリガンド、ＣＡＩＸリガンド、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼのリガンド、ＮＫＧ２ＤリガンドまたはＣＣＫ２Ｒリガンドであってよく、この各々は癌細胞に特異的に結合する小分子リガンドである(すなわち、これらのリガンドに対する受容体は正常組織に比して癌で過剰発現される)。

【0008】

ある実施態様において、「小分子リガンド」は、ＣＡＲＴ細胞により発現されるＣＡＲに結合する「標的化部分」に結合する。種々の実施態様において、「標的化部分」は、例えば、２,４－ジニトロフェノール(ＤＮＰ)、２,４,６－トリニトロフェノール(ＴＮＰ)、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)、ＮＨＳ－フルオレセイン、ペンタフルオロフェニルエステル(ＰＦＰ)、テトラフルオロフェニルエステル(ＴＦＰ)、ノッチン、センチリンおよびＤＡＲＰｉｎから選択され得る。

【0009】

「標的化部分」は、ＣＡＲＴ細胞により発現される遺伝子改変ＣＡＲの認識領域に結合する。従って、ＣＡＲの認識領域(例えば、抗体の一本鎖フラグメント可変領域(ｓｃＦｖ)、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆｃ、(Ｆａｂ’)_２フラグメントなど)が「標的化部分」に指向される。故に、リンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンドは、癌とＣＡＲＴ細胞の間の架橋として働き、癌の改善のためにＣＡＲＴ細胞を該癌に指向させる。

【0010】

ある実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に少なくとも一用量のＣＡＲＴ細胞組成物を投与すること(ここでＣＡＲＴ細胞は標的化部分を指向するＣＡＲを含む)；ii)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、化合物はリンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンドを含む)を含み、ここで、該化合物またはその薬学的に許容される塩は少なくとも１回目の用量漸増過程および２回目の用量漸増過程により投与される。

【0011】

他の実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法はｉ)患者に少なくとも一用量のＣＡＲＴ細胞組成物を投与すること(ここでＣＡＲＴ細胞は標的化部分を指向するＣＡＲを含む)；ii)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、化合物はリンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンドを含む)を含み、ここで、該化合物またはその薬学的に許容される塩は１回目の用量漸増過程で投与され、重度ＣＲＳが１回目の用量漸増過程で生じたならば、該化合物またはその薬学的に許容される塩を低用量漸増過程を使用して投与し、ここで、該低用量漸増過程における化合物またはその薬学的に許容される塩の初回用量は、１回目の用量漸増過程で投与される該化合物またはその薬学的に許容される塩の初回用量より低い。ある実施態様において、低用量漸増過程において、該化合物またはその薬学的に許容される塩は、連続していない３日で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量(full dose)の約０.５％、約５％および約５０％で投与され得る。

【0012】

さらなる実施態様を次の番号付けした項によっても記載する。本出願の概要部分、説明的実施態様の詳細な記載部分、実施例部分または特許請求の範囲に記載した任意の適用し得る実施態様と組み合わせた次の実施態様の何れかも考慮される。

【0013】

１. 癌を処置する方法であって、
ｉ)患者に少なくとも一用量のＣＡＲＴ細胞組成物を投与すること(ここでＣＡＲＴ細胞は標的化部分を指向するＣＡＲを含む)；
ii)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、化合物はリンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンドを含む)を含み、ここで、該化合物またはその薬学的に許容される塩は少なくとも１回目の用量漸増過程および２回目の用量漸増過程により投与される、方法。

【0014】

２. 化合物またはその薬学的に許容される塩が少なくとも１回目の用量漸増過程、２回目の用量漸増過程および３回目の用量漸増過程で投与される、項１に記載の方法。

【0015】

３. 化合物またはその薬学的に許容される塩が少なくとも１回目の用量漸増過程、２回目の用量漸増過程、３回目の用量漸増過程および４回目の用量漸増過程で投与される、項１に記載の方法。

【0016】

４. 化合物またはその薬学的に許容される塩が少なくとも１回目の用量漸増過程、２回目の用量漸増過程、３回目の用量漸増過程、４回目の用量漸増過程および５回目の用量漸増過程で投与される、項１に記載の方法。

【0017】

５. 化合物またはその薬学的に許容される塩が少なくとも１回目の用量漸増過程、２回目の用量漸増過程、３回目の用量漸増過程、４回目の用量漸増過程、５回目の用量漸増過程および６回目の用量漸増過程で投与される、項１に記載の方法。

【0018】

６. 患者にＣＡＲＴ細胞の初回用量およびＣＡＲＴ細胞の第二用量が投与される、項１～５の何れかに記載の方法。

【0019】

７. ＣＡＲＴ細胞の初回用量が患者のＣＡＲＴ細胞に対する認容性のモニターのための試験用量である、項６に記載の方法。

【0020】

８. ＣＡＲＴ細胞の第二用量がＣＡＲＴ細胞の初回用量より高用量のＣＡＲＴ細胞を含む、項６に記載の方法。

【0021】

９. ＣＡＲＴ細胞の初回用量が患者体重kgあたり約０.５×１０^５のＣＡＲＴ細胞～患者体重kgあたり約１.５×１０^６のＣＡＲＴ細胞を含む、項６～８の何れかに記載の方法。

【0022】

１０. ＣＡＲＴ細胞の第二用量が患者体重kgあたり約０.８×１０^６のＣＡＲＴ細胞～患者体重kgあたり約２×１０^７のＣＡＲＴ細胞を含む、項６～９の何れかに記載の方法。

【0023】

１１. １回目の用量漸増過程の後に化合物またはその薬学的に許容される塩が投与されない期間がある、項１～１０の何れかに記載の方法。

【0024】

１２. ２回目の用量漸増過程の後に化合物またはその薬学的に許容される塩が投与されない期間がある、項１～１１の何れかに記載の方法。

【0025】

１３. ３回目の用量漸増過程の後に化合物またはその薬学的に許容される塩が投与されない期間がある、項２～１２の何れかに記載の方法。

【0026】

１４. ４回目の用量漸増過程の後に化合物またはその薬学的に許容される塩が投与されない期間がある、項３～１３の何れかに記載の方法。

【0027】

１５. ５回目の用量漸増過程の後に化合物またはその薬学的に許容される塩が投与されない期間がある、項４～１４の何れかに記載の方法。

【0028】

１６. ６回目の用量漸増過程の後に化合物またはその薬学的に許容される塩が投与されない期間がある、項５～１５の何れかに記載の方法。

【0029】

１７. 期間が約７日間である、項１１～１６の何れかに記載の方法。

【0030】

１８. １回目の用量漸増過程が、患者に、連続していない３日で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量の約１％、約１０％および約１００％で投与することを含む、項１～１７の何れかに記載の方法。

【0031】

１９. ２回目の用量漸増過程が、患者に、連続していない３日で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量の約１％、約３０％および約３００％で投与することを含む、項１～１８の何れかに記載の方法。

【0032】

２０. ３回目の用量漸増過程が、患者に、連続していない３日で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量の約１％、約５０％および約５００％で投与することを含む、項２～１９の何れかに記載の方法。

【0033】

２１. ４回目の用量漸増過程が、患者に、連続していない３日で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量の約１％、約１０％および約１００％で投与することを含む、項３～２０の何れかに記載の方法。

【0034】

２２. ５回目の用量漸増過程が、患者に、連続していない３日で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量の約１％、約３０％および約３００％で投与することを含む、項４～２１の何れかに記載の方法。

【0035】

２３. ６回目の用量漸増過程が、患者に、連続していない３日で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量の約１％、約５０％および約５００％で投与することを含む、項５～２２の何れかに記載の方法。

【0036】

２４. 化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量が約１０μg／kg～約５０μg／kgの化合物またはその薬学的に許容される塩である、項１８～２３の何れかに記載の方法。

【0037】

２５. 化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量が約２０μg／kg～約４０μg／kgの化合物またはその薬学的に許容される塩である、項１８～２４の何れかに記載の方法。

【0038】

２６. 化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量が約２５μg／kg～約３５μg／kgの化合物またはその薬学的に許容される塩である、項１８～２５の何れかに記載の方法。

【0039】

２７. 化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量が約３０μg／kgの化合物またはその薬学的に許容される塩である、項１８～２６の何れかに記載の方法。

【0040】

２８. ＣＡＲＴ細胞の初回用量およびＣＡＲＴ細胞の第二用量が第１週の間に患者に投与される、項６～２７の何れかに記載の方法。

【0041】

２９. ＣＡＲＴ細胞の初回用量およびＣＡＲＴ細胞の第二用量が第１週の月曜日および木曜日に患者に投与される、項６～２８の何れかに記載の方法。

【0042】

３０. 化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の用量漸増過程を第２週および第３週の間に行う、項１～２９の何れかに記載の方法。

【0043】

３１. 化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の用量漸増過程を第４週および第５週の間に行う、項１～３０の何れかに記載の方法。

【0044】

３２. 化合物またはその薬学的に許容される塩の３回目の用量漸増過程を第６週および第７週の間に行う、項２～３１の何れかに記載の方法。

【0045】

３３. 化合物またはその薬学的に許容される塩を連続していない３日に投与し、該連続していない３日が第２週の月曜日および木曜日ならびに第３週の月曜日である、項３０に記載の方法。

【0046】

３４. 化合物またはその薬学的に許容される塩を連続していない３日に投与し、該連続していない３日が第４週の月曜日および木曜日ならびに第５週の月曜日である、項３１に記載の方法。

【0047】

３５. 化合物またはその薬学的に許容される塩を連続していない３日に投与し、該連続していない３日が第６週の月曜日および木曜日ならびに第７週の月曜日である、項３２に記載の方法。

【0048】

３６. 患者にＣＡＲＴ細胞組成物を投与する前に、患者でリンパ球が除去される、項１～３５の何れかに記載の方法。

【0049】

３７. 患者に血小板を投与すること、患者に濃厚赤血球を投与すること、患者に寒冷沈降物を投与すること、患者に静脈内免疫グロブリンを投与することおよび／または患者に抗菌療法を施すことをさらに含む、項１～３６の何れかに記載の方法。

【0050】

３８. 患者で１回目の用量漸増過程中ＣＲＳまたは神経毒性が観察されなければ、方法を２回目の用量漸増過程に進める、項１～３７の何れかに記載の方法。

【0051】

３９. 患者で２回目の用量漸増過程中ＣＲＳまたは神経毒性が観察されなければ、方法を３回目の用量漸増過程に進める、項２～３８の何れかに記載の方法。

【0052】

４０. 患者で３回目の用量漸増過程中ＣＲＳまたは神経毒性が観察されなければ、方法を４回目の用量漸増過程に進める、項３～３９の何れかに記載の方法。

【0053】

４１. 患者で４回目の用量漸増過程中ＣＲＳまたは神経毒性が観察されなければ、方法を５回目の用量漸増過程に進める、項４～４０の何れかに記載の方法。

【0054】

４２. 患者で５回目の用量漸増過程中ＣＲＳまたは神経毒性が観察されなければ、方法を６回目の用量漸増過程に進める、項５～４１の何れかに記載の方法。

【0055】

４３. 用量漸増過程の何れかで患者で低血圧を伴わない発熱が観察され、患者で神経毒性が観察されなければ、化合物またはその薬学的に許容される塩のその後の全ての用量を、患者に低血圧を伴わない発熱を引き起こしたその用量漸増過程レベルで投与する、項１～４２の何れかに記載の方法。

【0056】

４４. 用量漸増過程の何れかで患者に重度ＣＲＳまたは神経毒性が生じたら、化合物またはその薬学的に許容される塩のその後の全ての用量を、患者に重度ＣＲＳまたは神経毒性を引き起こしたその用量漸増過程レベルより低い用量漸増過程レベルで患者に投与する、項１～４３の何れかに記載の方法。

【0057】

４５. 癌を処置する方法であって、
ｉ)患者に少なくとも一用量のＣＡＲＴ細胞組成物を投与すること(ここでＣＡＲＴ細胞は標的化部分を指向するＣＡＲを含む)；
ii)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、化合物はリンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンドを含む)を含み、ここで、該化合物またはその薬学的に許容される塩は１回目の用量漸増過程で投与され、重度ＣＲＳが１回目の用量漸増過程で生じたならば、該化合物またはその薬学的に許容される塩を低用量漸増過程を使用して投与し、ここで、該低用量漸増過程における化合物またはその薬学的に許容される塩の初回用量は、１回目の用量漸増過程で投与される該化合物またはその薬学的に許容される塩の初回用量より低いものである、方法。

【0058】

４６. 低用量漸増過程において、該化合物またはその薬学的に許容される塩が、連続していない３日で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量の約０.５％、約５％および約５０％で投与される、項４５に記載の方法。

【0059】

４７. 化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量が約１０μg／kg～約５０μg／kgの化合物またはその薬学的に許容される塩である、項４６に記載の方法。

【0060】

４８. 化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量が約２５μg／kg～約３５μg／kgの化合物またはその薬学的に許容される塩である、項４６～４７の何れかに記載の方法。

【0061】

４９. 化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量が約３０μg／kgの化合物またはその薬学的に許容される塩である、項４６～４８の何れかに記載の方法。

【0062】

５０. リガンドがフォレート、ＤＵＰＡ、ＮＫ－１Ｒリガンド、ＣＡＩＸリガンド、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼのリガンド、ＮＫＧ２ＤリガンドおよびＣＣＫ２Ｒリガンドからなる群から選択される、項１～４９の何れかに記載の方法。

【0063】

５１. リガンドがフォレートである、項１～５０の何れかに記載の方法。

【0064】

５２. リガンドがＮＫ－１Ｒリガンドである、項１～５０の何れかに記載の方法。

【0065】

５３. リガンドがＤＵＰＡである、項１～５０の何れかに記載の方法。

【0066】

５４. リガンドがＣＣＫ２Ｒリガンドである、項１～５０の何れかに記載の方法。

【0067】

５５. リガンドがガンマグルタミルトランスペプチダーゼのリガンドである、項１～５０の何れかに記載の方法。

【0068】

５６. 標的化部分が２,４－ジニトロフェノール(ＤＮＰ)、２,４,６－トリニトロフェノール(ＴＮＰ)、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)、ＮＨＳ－フルオレセイン、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、ノッチン、センチリンおよびＤＡＲＰｉｎからなる群から選択される、項１～５５の何れかに記載の方法。

【0069】

５７. 標的化部分がＦＩＴＣである、項１～５６の何れかに記載の方法。

【0070】

５８. 標的化部分がＤＮＰである、項１～５６の何れかに記載の方法。

【0071】

５９. 標的化部分がＴＮＰである、項１～５６の何れかに記載の方法。

【0072】

６０. リンカーがポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリプロリン、親水性アミノ酸、糖、非天然ペプチドグリカン、ポリビニルピロリドン、プルロニックＦ－１２７またはこれらの組み合わせを含む、項１～５９の何れかに記載の方法。

【0073】

６１. リンカーがＰＥＧを含む、項１～６０の何れかに記載の方法。

【0074】

６２. 化合物またはその薬学的に許容される塩が式

【化1】

〔式中、Ｂは小分子リガンドであり、Ｌはリンカーであり、Ｔは標的化部分であり、ここで、Ｌは式

【化2】

(式中、ｎは０～２００の整数である)
を有する構造を含む。〕
を有する、項１～６１の何れかに記載の方法。

【0075】

６３. ｎが０～１５０の整数である、項６２に記載の方法。

【0076】

６４. ｎが０～１１０の整数である、項６２に記載の方法。

【0077】

６５. ｎが０～２０の整数である、項６２に記載の方法。

【0078】

６６. ｎが１５～２０の整数である、項６２に記載の方法。

【0079】

６７. ｎが１５～１１０の整数である、項６２に記載の方法。

【0080】

６８. 癌が肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部癌、頚部癌、皮膚黒色腫、眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、子宮内膜癌、直腸癌、胃癌、結腸癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、非小細胞肺癌、副腎癌、軟組織肉腫、小児または非小児骨肉腫を含む骨肉腫、尿道癌、前立腺癌、慢性白血病、急性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、骨髄性白血病、骨髄単球性白血病、ヘアリー細胞白血病、胸膜中皮腫、膀胱癌、バーキットリンパ腫、輸尿管癌、腎臓癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系(ＣＮＳ)新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫および食道胃接合部腺癌からなる群から選択される、項１～６７の何れかに記載の方法。

【0081】

６９. 癌が葉酸受容体発現癌である、項１～５１または５６～６８の何れかに記載の方法。

【0082】

７０. 癌が骨肉腫である、項１～６９の何れかに記載の方法。

【0083】

７１. ＣＡＲが認識領域を有し、認識領域が抗体の一本鎖フラグメント可変(ｓｃＦｖ)領域である、項１～７０の何れかに記載の方法。

【0084】

７２. ＣＡＲが認識領域を有し、ＣＡＲの認識領域が抗ＦＩＴＣ抗体の一本鎖フラグメント可変(ｓｃＦｖ)領域である、項１～５７または６０～７１の何れかに記載の方法。

【0085】

７３. ＣＡＲが共刺激ドメインを有し、共刺激ドメインがＣＤ２８、ＣＤ１３７(４－１ＢＢ)、ＣＤ１３４(ＯＸ４０)およびＣＤ２７８(ＩＣＯＳ)からなる群から選択される、項１～７２の何れかに記載の方法。

【0086】

７４. ＣＡＲが活性化シグナル伝達ドメインを有し、活性化シグナル伝達ドメインがＴ細胞ＣＤ３ζ鎖またはＦｃ受容体γである、項１～７３の何れかに記載の方法。

【0087】

７５. ＣＡＲが認識領域を有し、認識領域が抗ＦＩＴＣ抗体の一本鎖フラグメント可変(ｓｃＦｖ)領域であり、該ＣＡＲが共刺激ドメインを有し、共刺激ドメインがＣＤ１３７(４－１ＢＢ)であり、そして該ＣＡＲが活性化シグナル伝達ドメインを有し、活性化シグナル伝達ドメインがＴ細胞ＣＤ３ζ鎖である、項１～５７または６０～７４の何れかに記載の方法。

【0088】

７６. 患者が化合物またはその薬学的に許容される塩の投与前またはＣＡＲＴ細胞組成物の投与前に造影される、項１～７５の何れかに記載の方法。

【0089】

７７. 化合物またはその薬学的に許容される塩が抗体ではなく、抗体のフラグメントを含まない、項１～７６の何れかに記載の方法。

【0090】

７８. 標的化部分がペプチドエピトープを含まない、項１～７７の何れかに記載の方法。

【0091】

７９. 患者でオフターゲット毒性をもたらすサイトカイン放出が発生せず、癌に対するＣＡＲＴ細胞毒性が発生する、項１～７８の何れかに記載の方法。

【0092】

８０. オフターゲット組織毒性が患者において発生せず、癌に対するＣＡＲＴ細胞毒性が発生する、項１～７８の何れかに記載の方法。

【0093】

８１. 癌が腫瘍を含み、患者で腫瘍サイズが減少し、オフターゲット毒性が生じない、項１～７８の何れかに記載の方法。

【0094】

８２. ＣＡＲＴ細胞が配列番号１を含む核酸を含む、項１～８１の何れかに記載の方法。

【0095】

８３. ＣＡＲＴ細胞が配列番号２を含むポリペプチドを含む、項１～８２の何れかに記載の方法。

【0096】

８４. 核酸がキメラ抗原受容体をコードする、項８２に記載の方法。

【0097】

８５. ＣＡＲＴ細胞が配列番号４を含む核酸を含む、項１～８１の何れかに記載の方法。

【0098】

８６. ＣＡＲＴ細胞が配列番号５を含むポリペプチドを含む、項１～８１または８５の何れかに記載の方法。

【0099】

８７. 核酸がキメラ抗原受容体をコードする、項８５に記載の方法。

【0100】

８８. ＣＡＲがヒト化アミノ酸配列を含む、項１～８７の何れかに記載の方法。

【0101】

８９. ＣＡＲがヒト化アミノ酸配列からなる、項１～８７の何れかに記載の方法。

【0102】

９０. 患者にフォレート、フォレートを含むコンジュゲート(ここで、フォレートを含むコンジュゲートは標的化部分を含まない)またはＣＡＲＴ細胞の活性化を阻害する薬剤を投与することをさらに含む、項１～８９の何れかに記載の方法。

【0103】

９１. フォレートが投与される、項９０に記載の方法。

【0104】

９２. 葉酸またはロイコボリンが投与される、項９０に記載の方法。

【0105】

９３. フォレートを含むコンジュゲートが投与される、項９０に記載の方法。

【0106】

９４. フォレートを含むコンジュゲートが１以上のアミノ酸に結合したフォレートを含む、項９３に記載の方法。

【0107】

９５. フォレートを含むコンジュゲートが式

【化3】

を有する、項９３に記載の方法。

【0108】

９６. フォレートが式

【化4】

〔式中、Ｘ^１およびＹ^１は各々独立してハロ、Ｒ^２、ＯＲ^２、ＳＲ^３およびＮＲ^４Ｒ^５からなる群から選択され；
Ｕ、ＶおよびＷは各々独立して－(Ｒ^６ａ)Ｃ＝、－Ｎ＝、－(Ｒ^６ａ)Ｃ(Ｒ^７ａ)－および－Ｎ(Ｒ^４ａ)－からなる群から選択される二価部分であり；ＱはＣおよびＣＨからなる群から選択され；ＴはＳ、Ｏ、Ｎおよび－Ｃ＝Ｃ－からなる群から選択され；
Ｘ^２およびＸ^３は各々独立して酸素、硫黄、－Ｃ(Ｚ)－、－Ｃ(Ｚ)Ｏ－、－ＯＣ(Ｚ)－、－Ｎ(Ｒ^４ｂ)－、－Ｃ(Ｚ)Ｎ(Ｒ^４ｂ)－、－Ｎ(Ｒ^４ｂ)Ｃ(Ｚ)－、－ＯＣ(Ｚ)Ｎ(Ｒ^４ｂ)－、－Ｎ(Ｒ^４ｂ)Ｃ(Ｚ)Ｏ－、－Ｎ(Ｒ^４ｂ)Ｃ(Ｚ)Ｎ(Ｒ^５ｂ)－、－Ｓ(Ｏ)－、－Ｓ(Ｏ)_２－、－Ｎ(Ｒ^４ａ)Ｓ(Ｏ)_２－、－Ｃ(Ｒ^６ｂ)(Ｒ^７ｂ)－、－Ｎ(Ｃ≡ＣＨ)－、－Ｎ(ＣＨ_２Ｃ≡ＣＨ)－、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキレンおよびＣ_１－Ｃ_１２アルキレンオキシからなる群から選択され、ここで、Ｘは酸素または硫黄であり；
Ｒ^１は水素、ハロ、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルおよびＣ_１－Ｃ_１２アルコキシからなる群から選択され；
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^４ａ、Ｒ^４ｂ、Ｒ^５、Ｒ^５ｂ、Ｒ^６ｂおよびＲ^７ｂは各々独立して水素、ハロ、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_１－Ｃ_１２アルカノイル、Ｃ_１－Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキニル、(Ｃ_１－Ｃ_１２アルコキシ)カルボニルおよび(Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルアミノ)カルボニルからなる群から選択され；
Ｒ^６およびＲ^７は各々独立して水素、ハロ、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルおよびＣ_１－Ｃ_１２アルコキシからなる群から選択され；またはＲ^６およびＲ^７は一体となってカルボニル基を形成し；
Ｒ^６ａおよびＲ^７ａは各々独立して水素、ハロ、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルおよびＣ_１－Ｃ_１２アルコキシからなる群から選択され；またはＲ^６ａおよびＲ^７ａは一体となってカルボニル基を形成し；
ｐ、ｒ、ｓおよびｔは各々独立して０または１であり；そして
＊は、何らかのさらなる化学部分がフォレートの一部であるならば、コンジュゲートの残りへの任意の共有結合である。〕
を有する、項９１に記載の方法。

【0109】

９７. ＣＡＲＴ細胞の活性化を阻害する薬剤がリンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＩＬ－２誘導型Ｔ細胞キナーゼ阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、ＥＣ２３１９および化合物またはその薬学的に許容される塩へのＣＡＲＴ細胞の結合を遮断するが、癌に結合しない薬剤からなる群から選択される、項９０に記載の方法。

【0110】

９８. ＣＡＲＴ細胞の活性化を阻害する薬剤が投与され、該薬剤がリンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤である、項９０に記載の方法。

【0111】

９９. リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤がダサチニブである、項９８に記載の方法。

【0112】

１００. ＣＡＲＴ細胞の活性化を阻害する薬剤が投与され、該薬剤がＰＩ３キナーゼ阻害剤である、項９０に記載の方法。

【0113】

１０１. ＰＩ３キナーゼ阻害剤がＧＤＣ０９８０である、項１００に記載の方法。

【0114】

１０２. ＣＡＲＴ細胞の活性化を阻害する薬剤が投与され、該薬剤がＩＬ－２誘導型Ｔ細胞キナーゼ阻害剤である、項９０に記載の方法。

【0115】

１０３. ＩＬ－２誘導型Ｔ細胞キナーゼ阻害剤がＢＭＳ－５０９７４４である、項１０２に記載の方法。

【0116】

１０４. ＣＡＲＴ細胞の活性化を阻害する薬剤が投与され、化合物またはその薬学的に許容される塩へのＣＡＲＴ細胞の結合を遮断するが、癌に結合しない薬剤である、項９０に記載の方法。

【0117】

１０５. 薬剤がフルオレセインアミン、ＦＩＴＣまたはナトリウムフルオレセインである、項１０４に記載の方法。

【0118】

１０６. 薬剤がナトリウムフルオレセインである、項１０５に記載の方法。

【0119】

１０７. フォレート、フォレートを含むコンジュゲート(ここで、フォレートを含むコンジュゲートは標的化部分を含まない)またはＣＡＲＴ細胞の活性化を阻害する薬剤の投与が患者におけるサイトカインレベルの減少をもたらす、項９０～１０６の何れかに記載の方法。

【0120】

１０８. サイトカインレベルの減少がほぼ未処置患者のサイトカインレベルまでの減少である、項１０７に記載の方法。

【0121】

１０９. 癌が腫瘍を含み、患者における腫瘍サイズが患者にフォレート、フォレートを含むコンジュゲート(ここで、フォレートを含むコンジュゲートは標的化部分を含まない)またはＣＡＲＴ細胞の活性化を阻害する薬剤を投与したとき増加しない、項９０～１０８の何れかに記載の方法。

【0122】

１１０. ＣＲＳグレードが１、２、３または４に達したとき患者にＣＡＲＴ細胞の活性化を阻害する薬剤が投与される、項１０４～１０６の何れかに記載の方法。

【0123】

１１１. ＣＲＳグレードが３または４に達したとき患者にＣＡＲＴ細胞の活性化を阻害する薬剤が投与される、項１１０に記載の方法。

【0124】

１１２. ＣＡＲＴ細胞の活性化を阻害する薬剤が約.０１～約３００μmole／kg患者体重の用量で投与される、項１０４～１０６の何れかに記載の方法。

【0125】

１１３. ＣＲＳが患者で低減または阻止され、方法が患者における腫瘍体積の減少をもたらす、項１～１１２の何れかに記載の方法。

【0126】

１１４. ＣＲＳによる体重減少が低減または阻止される、項１～１１３の何れかに記載の方法。

【0127】

１１５. 患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を再投与することをさらに含む、項９０～１１４の何れかに記載の方法。

【0128】

１１６. 化合物またはその薬学的に許容される塩のその後の投与が患者におけるＣＡＲＴ細胞活性化およびサイトカインレベル増加をもたらす、項１１５に記載の方法。

【0129】

１１７. ＣＡＲＴ細胞組成物が化合物またはその薬学的に許容される塩の前に投与される、項１～１１６の何れかに記載の方法。

【0130】

１１８. ＣＡＲＴ細胞が自己である、項１～１１７の何れかに記載の方法。

【0131】

１１９. １回目の用量漸増過程が、患者に、連続していない３日で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量の約１％、約２％および約２０％で投与することを含み、２回目の用量漸増過程が、患者に、連続していない３日で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量の約１％、約６％および約６０％で投与することを含み、そして３回目の用量漸増過程が、患者に、連続していない３日で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量の約１％、約１０％および約１００％で投与することを含む、項２～１７の何れかに記載の方法。

【0132】

１２０. １回目の用量漸増過程が、患者に、連続していない３日で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量の約１％、約１０％および約１００％で投与することを含み、そして２回目の用量漸増過程が、患者に、連続していない３日で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量の約１％、約２０％および約２００％で投与することを含む、項２～１７の何れかに記載の方法。

【0133】

１２１. １回目の用量漸増過程が、患者に、連続していない３日で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量の約１％、約１０％および約１００％で投与することを含み、そして２回目の用量漸増過程が、患者に、連続していない３日で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量の約１％、約１０％および約１００％で投与することを含む、項２～１７の何れかに記載の方法。

【0134】

１２２. １回目の用量漸増過程が、患者に、連続していない３日で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量の約１％、約２０％および約２００％で投与することを含み、そして２回目の用量漸増過程が、患者に、連続していない３日で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量の約１％、約２０％および約２００％で投与することを含む、項２～１７の何れかに記載の方法。

【0135】

１２３. 化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量が約５００nmol／kgである、項１１９～１２２の何れかに記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0136】

【図1】本願発明方法による例示的投与スキームの略図を示す。この例示的スキームにおいて、Ｅ２ＣＡＲＴ細胞(配列番号４の核酸配列によりコードされるタンパク質を発現するＣＡＲＴ細胞)の投与を第１週の月曜日および木曜日に行い、その後リンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンド(例えば、ＥＣ１７)の投与を第２週に開始する。第２週に、リンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンド(例えば、ＥＣ１７)が用量漸増過程を使用して、月曜日および木曜日、続いて第３週の月曜日に投与される(すなわち、過程１)。リンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンド(例えば、ＥＣ１７)は、第３週の火曜日から日曜日まで投与しない。第２～３週は、「サイクル１」と称する。第４週に、リンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンド(例えば、ＥＣ１７)が用量漸増過程を使用して、月曜日および木曜日、続いて第５週の月曜日に投与される(すなわち、過程２)。リンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンド(例えば、ＥＣ１７)は、第５週の火曜日から日曜日まで投与しない。第４～５週は、「サイクル２」と称する。第６週に、リンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンド(例えば、ＥＣ１７)が用量漸増過程を使用して、月曜日および木曜日、続いて第７週の月曜日に投与される(すなわち、過程３)。リンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンド(例えば、ＥＣ１７)は、第７週の火曜日から日曜日まで投与しない。第６～７週は、「サイクル３」と称する。第２～７週は、「コース１」と称する。過程１中、リンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンド(例えば、ＥＣ１７)が、それぞれ標的化部分に結合した小分子リガンド(例えば、ＥＣ１７)の全用量(例えば、３１μg／kg)の１％、１０％および１００％の用量で、第２週にの月曜日および木曜日、次いで第３週の月曜日に投与される。過程２中、リンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンド(例えば、ＥＣ１７)が、それぞれ標的化部分に結合した小分子リガンド(例えば、ＥＣ１７)の全用量(例えば、３１μg／kg)の１％、３０％および３００％の用量で、第４週の月曜日および木曜日、次いで第５週の月曜日に投与される。過程３中、リンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンド(例えば、ＥＣ１７)が、それぞれ標的化部分に結合した小分子リガンド(例えば、ＥＣ１７)の全用量(例えば、３１μg／kg)の１％、５０％および５００％の用量で、第６週の月曜日および木曜日、次いで第７週の月曜日に投与される。コース１を、その後治療的利益および容認できる毒性を考慮して繰り返す。

【0137】

【図2】ＣＡＲＴ形質導入に使用する構築物の概略図を示す。

【0138】

【図3】Ｅ２構築物対４Ｍ５.３構築物を図式的に示し、Ｅ２構築物の地図を示す。

【0139】

【図4】(上部パネル)Ｅ２ＣＡＲＴ細胞のみ(●)およびＥ２ＣＡＲＴ細胞＋ＥＣ－１７(〇)で処置したときのＨＯＳ－ＦＲα腫瘍の腫瘍体積を示すチャートである。(下部パネル)Ｅ２ＣＡＲＴ細胞のみ(●)およびＥ２ＣＡＲＴ細胞＋ＥＣ－１７(〇)で処置したときのＨＯＳ－ＦＲα腫瘍担持マウスの体重変化を示すチャートである。

【0140】

【図5】Ｃａｒ－Ｔ無(●)；ＥＣ－１７無(■)；ＥＣ－１７ＳＩＷ５００nmol／kg(▲)；ＥＣ－１７ＴＩＷ(５nmol／kg、５０nmol／kg、５００nmol／kgオン／オフ)；(◆)ＥＣ－１７用量漸増(Ｍ／Ｔｈ／Ｍオン／オフ)で処置したＴＨＰ－１－ＦＲβ ＡＭＬ担持マウスの体重変化を示すチャートである。

【0141】

【図6】(左パネル)肝転移腫瘍負荷を示すチャートである。(右パネル)非肝転移腫瘍負荷を示すチャートである。

【0142】

【図7】対数目盛で３９日目の１００μL血液あたりの循環ＴＨＰ１－ＦＲβ細胞数を示す。

【0143】

【図8】種々のＥＣ－１７投与レジメンで固形肝臓腫瘍(ｙ軸)から単離した総Ｅ２ＣＡＲＴ細胞のパーセンテージを示すチャートである。各投与レジメンで、一番左側のバーはＰＤ１＋ＬＡＧ３＋ＴＩＭ３＋、左から二番目のバーはＰＤ１＋ＬＡＧ３＋ＴＩＭ３－、中央のバーはＰＤ１＋ＬＡＧ３－ＴＩＭ３＋；右から二番目のバーはＰＤ１＋ＬＡＧ３－ＴＩＭ３－；一番右のバーはＰＤ１－ＬＡＧ３－ＴＩＭ３－である。

【0144】

【図9】抗ＦＩＴＣｓｃＦｖ(クローンＥ２)、全長ＩｇＧ４スペーサー(Ｆｃ由来ヒンジ－ＣＨ２(Ｌ２３５Ｄ、Ｎ２９７Ｑ)－ＣＨ３)、ＣＤ２８ｔｍ膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ／ＣＤ３ζ細胞質活性化ドメインおよび上皮細胞増殖因子受容体の非機能的切断細胞表面ポリペプチド(ＥＧＦＲｔ)を含む完全ヒトＣＡＲ構築物を示す。下部：ＥＧＦＲｔ選別(左パイチャート)ＣＡＲＴ細胞調製物および未選別「臨床模写株(clinical facsimile)」(右パイチャート)のフローサイトメトリーにより実施したＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞表現型解析の例。カラーキーは示すとおりである。

【0145】

【図10】パネルＡ：３７℃で２時間インキュベーション後のＦＲ＋標的細胞による^３Ｈ－ＥＣ１７取り込みのＫｄ値(細胞あたりに結合した分子の数から計算)。パネルＢ：室温で２時間インキュベーション後のＥ２－ＣＡＲＴ細胞(約２４％ＥＧＦＲｔ＋、約９５：５ＣＤ８／ＣＤ４比)による^３Ｈ－ＥＣ１７取り込みのＫｄ値(総細胞関連放射活性から計算、ＤＰＭ)。

【0146】

【図11】 ^３Ｈ－ＦＡベースの結合アッセイにより測定した腫瘍細胞上の機能的ＦＲレベル(１００nM、１時間、３７℃)。

【0147】

【図12】腫瘍対無腫瘍マウスにおけるＥＣ１７用量設定およびＣＲＳ評価。パネルＡ：予め確立されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１異種移植片を有しないまたは有するＮＳＧマウスに３つの異なる方法で投与したＣＡＲＴ細胞(約１０００万「臨床模写株」(clinical facsimile))＋ＥＣ１７の投与スケジューリングを示す模式図である。無腫瘍マウスは、ＥＣ１７ＳＩＷ５００nmol／kgを受けた(２日目および１０日目に２回投与)。腫瘍担持マウスはＥＣ１７を次のとおり受けた：ＥＣ１７ＳＩＷ５００nmol／kg(２日目、１０日目、１７日目、２４日目および３１日目に５回投与)、ＥＣ１７Ｍ／Ｔｈ／Ｍ＿漸増－１(月曜日／木曜日／月曜日に５／５０／５００nmol／kg、続いて１週間休薬の繰り返し、すなわち２日目、６日目、１０日目、１７日目、２０日目、２４日目および３１日目)またはＥＣ１７Ｍ／Ｔｈ／Ｍ＿漸増－２(月曜日／木曜日／月曜日に５／１００／１０００nmol／kg、続いて１週間休薬の繰り返し、すなわち２日目、６日目、１０日目、１７日目、２０日目、２４日目および３１日目)。パネルＢ：腫瘍担持対無腫瘍マウスのＣＡＲＴ細胞注射後１１日目および１２日目(すなわち、全処置コホートで、先のＥＣ１７投与から約２０時間および４２時間後)のマウス血漿におけるｌｏｇ２メモリでのヒトＩＦＮγの全身レベル。パネルＣ：フローサイトメトリーにおいてヒトＣＤ３ε＋ＥＧＦＲｔ＋事象として同定され、全血１００μLあたりで列挙されるマウス血中循環ＣＡＲＴ細胞。パネルＤ：ＣＡＲＴ細胞のみまたはＣＡＲＴ細胞＋３つの異なる方法で投与したＥＣ１７(点線は各ＥＣ１７投与を示す)を受けた腫瘍担持マウスにおける体重および腫瘍体積変化の測定。ｎ＝５マウス／群。全データは平均±ｓ.ｅ.ｍ.を表す。＊一元配置ＡＮＯＶＡ検定によりｐ＜０.０５。

【0148】

【図13】インビボでの安全性および抗白血病活性におけるＥＣ１７用量漸増を示す。パネルＡ：１日齢静脈内ＴＨＰ１－ＦＲβ異種移植片を有するＮＳＧマウスにおけるＥＣ１７＋未選別ＥＧＦＲｔＣＡＲＴ細胞(約６００万、０日目)の投与スケジューリングを示す模式図を示す。ＣＡＲＴ細胞注射３日後から開始して、ＥＣ１７を３つの異なる方法で投与した：ＥＣ１７ＳＩＷ５００nmol／kg(３日目、１０日目、１７日目、２４日目、３１日目および３８日目に５回投与)、ＥＣ１７ＴＩＷ５／５０／５００nmol／kg(月曜日／水曜日／金曜日に５／５０／５００nmol／kg、続いて９日間休薬の３反復、すなわち３／５／７日目、１７／１９／２１日目および３１／３３／３５日目)または月曜日／木曜日／月曜日のＥＣ１７Ｍ／Ｔｈ／Ｍ＿用量漸増(サイクル１の５／１０／１００nmol／kg、サイクル２の５／３０／３００nmol／kgおよびサイクル３の５／５０／５００nmol／kgの３漸増サイクル、すなわち３／６／１０日目、１７／２０／２４日目および３１／３４／３８日目)。パネルＢ：体重変化の測定(ｎ＝５)。パネルＣ：対数目盛での、３１日目のマウス全血１００μLあたりにみられるヒトＣＤ３ε＋ＥＧＦＲｔ＋事象としての循環ＣＡＲＴ細胞。パネルＤ：左棒グラフ：試験最終日(３９日目)に測定した全コホートにおける全血１００μLあたりの循環腫瘍細胞(ＧＦＰ＋)；中央棒グラフ：肝転移負荷を表すＴＨＰ１－ＦＲβ浸潤肝臓重量；右棒グラフ：全非肝臓マクロ転移の総腫瘍重量。パネルＥ：プレインフュージョンＣＡＲＴ細胞産物(トリプルネガティブ)および肝転移から単離した腫瘍浸潤ＣＡＲＴ細胞のＴ細胞疲弊マーカー、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３のフローサイトメトリー分析。完全に疲弊したＴ細胞の重要な特性は、複数阻害性受容体マーカーの共発現である(すなわちトリプルポジティブ)。

【0149】

【図14】小児骨肉腫の攻撃的モデルにおける抗腫瘍活性およびＣＲＳレスキューを示す。パネルＡ：３日齢皮下ＨＯＳ－ＦＲα異種移植片を有するＮＳＧマウス(ｎ＝５)におけるＣＡＲＴ細胞(約６００万、０日目)＋ＥＣ１７の投与スケジューリングを示す模式図。ＣＡＲＴ細胞注射３日後から開始して(腫瘍移植６日後)、月曜日／木曜日／月曜日に、サイクル１で５／１０／１００nmol／kg、サイクル２で５／３０／３００nmol／kgおよびサイクル３で５／５０／５００nmol／kg、すなわち３／６／１０日目、１７／２０／２４日目および３１／３４／３８日目の３サイクルのＥＣ１７Ｍ／Ｔｈ／Ｍ「患者内」用量漸増。パネルＢ：腫瘍体積および体重変化の測定。腫瘍進行により、ＣＡＲＴ細胞のみ(ＥＣ１７無)を受けた５匹のマウスは２３～３１日目に屠殺し、５匹のＥＣ１７処置マウスは３３日目(２マウス)および４７日目(３マウス)にそれぞれ屠殺した。パネルＣ：対数目盛でプロットした全血１００μLあたりのＣＡＲＴ細胞(ヒトＣＤ３ε＋ＥＧＦＲｔ＋)(左)および屠殺時点の腫瘍浸潤ＣＡＲＴ細胞(右)のフローサイトメトリー分析。

【発明を実施するための形態】

【0150】

定義
ここで使用する単数表現は、１以上を意味し得る。ここで使用する、例えば、整数、分数およびパーセンテージを含む、数値に関係する「約」は、一般に当業者が記載する値と同等(例えば、同じ機能または結果を有する)と考える、数値の範囲(例えば、記載する値の±５％～１０％)をいう。

【0151】

ここで使用する用語「処置」または「処置する」は、治療的処置および予防または予防的処置の両者をいう。

【0152】

ここで使用する、癌に関係するする用語「改善」、「改善する」または「改善された」は、癌の症状軽減、腫瘍サイズ減少、腫瘍の完全なまたは部分的除去(例えば、完全または部分応答)、疾患安定誘発、癌進行阻止(例えば、無進行生存)または医師が癌の治療的、予防的または防止的処置であると考える癌に対する何らかの他の効果を意味し得る。

【0153】

ここで使用する用語「投与」または「投与する」は、ここに記載する化合物もしくはその薬学的に許容される塩またはＣＡＲＴ細胞組成物を患者に導入する全ての手段を意味し、経口、静脈内、筋肉内、皮下および経皮を含むが、これらに限定されない。

【0154】

ここで使用する用語「オフターゲット毒性」は、患者を処置する医師にとり許容されない臓器損傷または患者の体重減少または患者を処置する医師にとり許容されない他の何らかの影響、例えば、Ｂ細胞形成不全、発熱、血圧低下または肺浮腫を意味する。

【0155】

ここで使用する用語「形質導入」および「トランスフェクション」は同等に使用し、これら用語はウイルス法および非ウイルス法を含む任意の人為的方法で核酸を細胞に導入することを意味する。

【0156】

ここで使用する用語「用量漸増過程」は、化合物またはその薬学的に許容される塩の用量が経時的に増やされて投与されることを意味する。ここで使用する「２回目の用量漸増過程」、「３回目の用量漸増過程」、「４回目の用量漸増過程」、「５回目の用量漸増過程」および「６回目の用量漸増過程」などと組み合わせた「１回目の用量漸増過程」の記載は、複数用量漸増過程を行い、各別々の用量漸増過程について、１回目の用量漸増過程の後は、後続の用量漸増過程における化合物またはその薬学的に許容される塩の初回用量が、先の用量漸増過程の化合物またはその薬学的に許容される塩の最終用量より低いことを意味する(例えば、図１および図面の簡単な説明の図１の説明参照)。

【0157】

説明的実施態様の詳細な記載
ここに記載する種々の実施態様において、リンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンドは、癌とＣＡＲＴ細胞(すなわち、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞)の間の架橋として使用される。架橋は、癌の改善のためにＣＡＲＴ細胞を癌に指向させる。ある実施態様において、「小分子リガンド」はフォレート、ＣＡＩＸリガンド、ＤＵＰＡ、ＮＫ－１Ｒリガンド、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼのリガンド、ＮＫＧ２ＤリガンドまたはＣＣＫ２Ｒリガンドであってよく、この各々は癌細胞型に特異的に結合する小分子リガンドである(すなわち、これらリガンドの各々に対する受容体は正常組織に比して癌で過剰発現される)。

【0158】

小分子リガンドに結合した「標的化部分」は、ＣＡＲＴ細胞により発現される遺伝子改変ＣＡＲの認識領域に結合する。従って、ＣＡＲの認識領域(例えば、抗体の一本鎖フラグメント可変領域(ｓｃＦｖ)、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆｃまたは(Ｆａｂ’)_２フラグメントなど)は「標的化部分」に指向される。故に、リンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンドは、癌の改善のためにＣＡＲＴ細胞を癌に指向させる癌とＣＡＲＴ細胞の間の架橋として働く。種々の実施態様において、癌とＣＡＲＴ細胞の間の架橋は、実施例に示す適用し得るコンジュゲートの何れでもよい。

【0159】

架橋は小有機分子であり、よって血流からのクリアランスが迅速に達成され得る(例えば、約２０分以内)。ある態様において、ＣＡＲＴ細胞応答は、‘架橋’の小分子リガンド部分に対する受容体を発現する癌細胞のみを標的とでき、それにより正常組織へのオフターゲット毒性が低減される。さらに、１タイプのＣＡＲＴ細胞構築物を使用して、種々の‘架橋’を使用して広範な癌を標的とするのに使用できるため、このシステムは‘汎用性’であり得る。実例として、ＣＡＲＴ細胞により認識される標的化部分は、１つのタイプのＣＡＲＴ細胞構築物が使用され得るように一定のままであり得るが、癌に結合する小分子リガンドは、広範な癌のターティングを可能とするよう改変され得る。

【0160】

【0161】

他の実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に少なくとも一用量のＣＡＲＴ細胞組成物を投与すること(ここでＣＡＲＴ細胞は標的化部分を指向するＣＡＲを含む)；ii)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、化合物はリンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンドを含む)を含み、ここで、該化合物またはその薬学的に許容される塩は１回目の用量漸増過程で投与され、重度ＣＲＳが１回目の用量漸増過程で生じたならば、該化合物またはその薬学的に許容される塩を低用量漸増過程を使用して投与し、ここで、該低用量漸増過程における化合物またはその薬学的に許容される塩の初回用量は、１回目の用量漸増過程で投与される該化合物またはその薬学的に許容される塩の初回用量より低い。他の実施態様において、低用量漸増過程において、該化合物またはその薬学的に許容される塩は、連続していない３日で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量の約０.５％、約５％および約５０％で投与され得る。

【0162】

下記項一覧および特許請求の範囲ならびに本明細書に記載される種々の実施態様において、リンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンドを「化合物」と称する。

【0163】

数実施態様が次の番号付けした項によって記載される。次の実施態様の何れかと本特許出願の概要部分、本特許出願の概説明的実施態様の詳細な記載部分、実施例部分または特許請求の範囲に記載した適用し得る実施態様の何れかの組み合わせも考慮される。

【0164】

【0165】

【0166】

【0167】

【0168】

【0169】

６. 患者にＣＡＲＴ細胞の初回用量およびＣＡＲＴ細胞の第二用量が投与される、項１～５の何れかに記載の方法。

【0170】

７. ＣＡＲＴ細胞の初回用量が患者のＣＡＲＴ細胞に対する認容性のモニターのための試験用量である、項６に記載の方法。

【0171】

８. ＣＡＲＴ細胞の第二用量がＣＡＲＴ細胞の初回用量より高用量のＣＡＲＴ細胞を含む、項６に記載の方法。

【0172】

【0173】

【0174】

１１. １回目の用量漸増過程の後に化合物またはその薬学的に許容される塩が投与されない期間がある、項１～１０の何れかに記載の方法。

【0175】

１２. ２回目の用量漸増過程の後に化合物またはその薬学的に許容される塩が投与されない期間がある、項１～１１の何れかに記載の方法。

【0176】

１３. ３回目の用量漸増過程の後に化合物またはその薬学的に許容される塩が投与されない期間がある、項２～１２の何れかに記載の方法。

【0177】

１４. ４回目の用量漸増過程の後に化合物またはその薬学的に許容される塩が投与されない期間がある、項３～１３の何れかに記載の方法。

【0178】

１５. ５回目の用量漸増過程の後に化合物またはその薬学的に許容される塩が投与されない期間がある、項４～１４の何れかに記載の方法。

【0179】

１６. ６回目の用量漸増過程の後に化合物またはその薬学的に許容される塩が投与されない期間がある、項５～１５の何れかに記載の方法。

【0180】

１７. 期間が約７日間である、項１１～１６の何れかに記載の方法。

【0181】

【0182】

【0183】

【0184】

【0185】

【0186】

【0187】

【0188】

【0189】

【0190】

【0191】

２８. ＣＡＲＴ細胞の初回用量およびＣＡＲＴ細胞の第二用量が第１週の間に患者に投与される、項６～２７の何れかに記載の方法。

【0192】

【0193】

３０. 化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の用量漸増過程を第２週および第３週の間に行う、項１～２９の何れかに記載の方法。

【0194】

３１. 化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の用量漸増過程を第４週および第５週の間に行う、項１～３０の何れかに記載の方法。

【0195】

３２. 化合物またはその薬学的に許容される塩の３回目の用量漸増過程を第６週および第７週の間に行う、項２～３１の何れかに記載の方法。

【0196】

【0197】

【0198】

【0199】

３６. 患者にＣＡＲＴ細胞組成物を投与する前に、患者でリンパ球が除去される、項１～３５の何れかに記載の方法。

【0200】

【0201】

【0202】

【0203】

【0204】

【0205】

【0206】

【0207】

【0208】

【0209】

【0210】

【0211】

【0212】

【0213】

【0214】

５１. リガンドがフォレートである、項１～５０の何れかに記載の方法。

【0215】

５２. リガンドがＮＫ－１Ｒリガンドである、項１～５０の何れかに記載の方法。

【0216】

５３. リガンドがＤＵＰＡである、項１～５０の何れかに記載の方法。

【0217】

５４. リガンドがＣＣＫ２Ｒリガンドである、項１～５０の何れかに記載の方法。

【0218】

５５. リガンドがガンマグルタミルトランスペプチダーゼのリガンドである、項１～５０の何れかに記載の方法。

【0219】

【0220】

５７. 標的化部分がＦＩＴＣである、項１～５６の何れかに記載の方法。

【0221】

５８. 標的化部分がＤＮＰである、項１～５６の何れかに記載の方法。

【0222】

５９. 標的化部分がＴＮＰである、項１～５６の何れかに記載の方法。

【0223】

【0224】

６１. リンカーがＰＥＧを含む、項１～６０の何れかに記載の方法。

【0225】

６２. 化合物またはその薬学的に許容される塩が式

【化5】

〔式中、Ｂは小分子リガンドであり、Ｌはリンカーであり、Ｔは標的化部分であり、ここで、Ｌは式

【化6】

(式中、ｎは０～２００の整数である)
を有する構造を含む。〕
を有する、項１～６１の何れかに記載の方法。

【0226】

６３. ｎが０～１５０の整数である、項６２に記載の方法。

【0227】

６４. ｎが０～１１０の整数である、項６２に記載の方法。

【0228】

６５. ｎが０～２０の整数である、項６２に記載の方法。

【0229】

６６. ｎが１５～２０の整数である、項６２に記載の方法。

【0230】

６７. ｎが１５～１１０の整数である、項６２に記載の方法。

【0231】

６８. 癌が肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部癌、頚部癌、皮膚黒色腫、眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、子宮内膜癌、直腸癌、胃癌、結腸癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、卵管癌、子宮内膜癌の悪性腫瘍、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、非小細胞肺癌、副腎癌、軟組織肉腫、小児または非小児骨肉腫を含む骨肉腫、尿道癌、前立腺癌、慢性白血病、急性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、骨髄性白血病、骨髄単球性白血病、ヘアリー細胞白血病、胸膜中皮腫、膀胱癌、バーキットリンパ腫、輸尿管癌、腎臓癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系(ＣＮＳ)新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫および食道胃接合部腺癌からなる群から選択される、項１～６７の何れかに記載の方法。

【0232】

６９. 癌が葉酸受容体発現癌である、項１～５１または５６～６８の何れかに記載の方法。

【0233】

７０. 癌が骨肉腫である、項１～６９の何れかに記載の方法。

【0234】

７１. ＣＡＲが認識領域を有し、認識領域が抗体の一本鎖フラグメント可変(ｓｃＦｖ)領域である、項１～７０の何れかに記載の方法。

【0235】

【0236】

【0237】

【0238】

【0239】

７６. 患者が化合物またはその薬学的に許容される塩投与前またはＣＡＲＴ細胞組成物投与前に造影される、項１～７５の何れかに記載の方法。

【0240】

７７. 化合物またはその薬学的に許容される塩が抗体ではなく、抗体のフラグメントを含まない、項１～７６の何れかに記載の方法。

【0241】

７８. 標的化部分がペプチドエピトープを含まない、項１～７７の何れかに記載の方法。

【0242】

【0243】

８０. オフターゲット組織毒性が患者において発生せず、癌に対するＣＡＲＴ細胞毒性が発生する、項１～７８の何れかに記載の方法。

【0244】

８１. 癌が腫瘍を含み、患者で腫瘍サイズが減少し、オフターゲット毒性が生じない、項１～７８の何れかに記載の方法。

【0245】

８２. ＣＡＲＴ細胞が配列番号１を含む核酸を含む、項１～８１の何れかに記載の方法。

【0246】

８３. ＣＡＲＴ細胞が配列番号２を含むポリペプチドを含む、項１～８２の何れかに記載の方法。

【0247】

８４. 核酸がキメラ抗原受容体をコードする、項８２に記載の方法。

【0248】

８５. ＣＡＲＴ細胞が配列番号４を含む核酸を含む、項１～８１の何れかに記載の方法。

【0249】

８６. ＣＡＲＴ細胞が配列番号５を含むポリペプチドを含む、項１～８１または８５の何れかに記載の方法。

【0250】

８７. 核酸がキメラ抗原受容体をコードする、項８５に記載の方法。

【0251】

８８. ＣＡＲがヒト化アミノ酸配列を含む、項１～８７の何れかに記載の方法。

【0252】

８９. ＣＡＲがヒト化アミノ酸配列からなる、項１～８７の何れかに記載の方法。

【0253】

【0254】

９１. フォレートが投与される、項９０に記載の方法。

【0255】

９２. 葉酸またはロイコボリンが投与される、項９０に記載の方法。

【0256】

９３. フォレートを含むコンジュゲートが投与される、項９０に記載の方法。

【0257】

９４. フォレートを含むコンジュゲートが１以上のアミノ酸に結合したフォレートを含む、項９３に記載の方法。

【0258】

９５. フォレートを含むコンジュゲートが式

【化7】

を有する、項９３に記載の方法。

【0259】

９６. フォレートが式

【化8】

【0260】

【0261】

９８. ＣＡＲＴ細胞の活性化を阻害する薬剤が投与され、該薬剤がリンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤である、項９０に記載の方法。

【0262】

９９. リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤がダサチニブである、項９８に記載の方法。

【0263】

１００. ＣＡＲＴ細胞の活性化を阻害する薬剤が投与され、該薬剤がＰＩ３キナーゼ阻害剤である、項９０に記載の方法。

【0264】

１０１. ＰＩ３キナーゼ阻害剤がＧＤＣ０９８０である、項１００に記載の方法。

【0265】

１０２. ＣＡＲＴ細胞の活性化を阻害する薬剤が投与され、該薬剤がＩＬ－２誘導型Ｔ細胞キナーゼ阻害剤である、項９０に記載の方法。

【0266】

１０３. ＩＬ－２誘導型Ｔ細胞キナーゼ阻害剤がＢＭＳ－５０９７４４である、項１０２に記載の方法。

【0267】

【0268】

１０５. 薬剤がフルオレセインアミン、ＦＩＴＣまたはナトリウムフルオレセインである、項１０４に記載の方法。

【0269】

１０６. 薬剤がナトリウムフルオレセインである、項１０５に記載の方法。

【0270】

【0271】

１０８. サイトカインレベルの減少がほぼ未処置患者のサイトカインレベルまでの減少である、項１０７に記載の方法。

【0272】

【0273】

【0274】

１１１. ＣＲＳグレードが３または４に達したとき患者にＣＡＲＴ細胞の活性化を阻害する薬剤が投与される、項１１０に記載の方法。

【0275】

１１２. ＣＡＲＴ細胞の活性化を阻害する薬剤が約.０１～約３００μmole／kg患者体重の用量で投与される、項１０４～１０６の何れかに記載の方法。

【0276】

１１３. ＣＲＳが患者で低減または阻止され、方法が患者における腫瘍体積の減少をもたらす、項１～１１２の何れかに記載の方法。

【0277】

１１４. ＣＲＳによる体重減少が低減または阻止される、項１～１１３の何れかに記載の方法。

【0278】

１１５. 患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を再投与することをさらに含む、項９０～１１４の何れかに記載の方法。

【0279】

【0280】

１１７. ＣＡＲＴ細胞組成物が化合物またはその薬学的に許容される塩の前に投与される、項１～１１６の何れかに記載の方法。

【0281】

１１８. ＣＡＲＴ細胞が自己である、項１～１１７の何れかに記載の方法。

【0282】

【0283】

【0284】

【0285】

【0286】

１２３. 化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量が約５００nmol／kgである、項１１９～１２２の何れかに記載の方法。

【0287】

従って、種々の実施態様が先の段落および上に挙げた項およびこの「説明的実施態様の詳細な記載」、「概要」部分、実施例および特許請求の範囲に記載される全ての適用し得る実施態様がこれら実施態様に適用される。

【0288】

ここで使用する「患者」は、ヒトであってよく、または、獣医適用において、患者は実験動物、農業用動物、家庭用動物または野生動物であり得る。種々の態様において、患者は齧歯類(例えば、マウス、ラット、ハムスターなど)、ウサギ、サル、チンパンジーなどの実験動物、イヌ、ネコまたはウサギなどの家庭用動物、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの農業用動物またはクマ、パンダ、ライオン、トラ、ヒョウ、ゾウ、シマウマ、キリン、ゴリラ、イルカまたはクジラなどの捕獲された野生動物であり得る。

【0289】

種々の実施態様において、処置される癌は、癌腫、肉腫、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、鼻咽頭癌、白血病、腺癌または骨髄腫から選択され得る。他の実施態様において、癌は肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部癌、頚部癌、皮膚黒色腫、眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、子宮内膜癌、直腸癌、胃癌、結腸癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、非小細胞肺癌、副腎癌、軟組織肉腫、小児または非小児骨肉腫を含む骨肉腫、尿道癌、前立腺癌、慢性白血病、急性骨髄性白血病を含む急性白血病、リンパ球性リンパ腫、骨髄性白血病、骨髄単球性白血病、ヘアリー細胞白血病、胸膜中皮腫、膀胱癌、バーキットリンパ腫、輸尿管癌、腎臓癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系(ＣＮＳ)新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫および食道胃接合部腺癌であり得る。

【0290】

これら実施態様のある態様において、癌は葉酸受容体発現癌である。他の実施態様において、癌は葉酸受容体α発現癌である。さらに他の実施態様において、癌は葉酸受容体β発現癌である。これら実施態様のある態様において、癌は子宮内膜癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、小児または非小児骨肉腫を含む骨肉腫またはトリプルネガティブ乳癌である。他の実施態様において、処置される癌は腫瘍である。他の実施態様において、癌は悪性である。他の実施態様において、癌は小児または非小児骨肉腫を含む骨肉腫である。

【0291】

ある実施態様において、「小分子リガンド」はフォレート、ＤＵＰＡ(ＰＳＭＡ陽性ヒト前立腺癌細胞および他の癌細胞型により結合されるリガンド)、ＮＫ－１Ｒリガンド(ＮＫ－１Ｒリガンドに対する受容体は、例えば、結腸および膵臓の癌で見られる)、ＣＡＩＸリガンド(ＣＡＩＸリガンドに対する受容体は、例えば、腎臓、卵巣、外陰および乳癌で見られる)、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼのリガンド(トランスペプチダーゼは、例えば、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、アストロサイト神経膠腫、黒色腫および白血病で過剰発現される)、ＮＫＧ２Ｄリガンド(ＮＫＧ２Ｄリガンドの受容体は、例えば、肺、結腸、腎臓、前立腺の癌およびＴおよびＢ細胞リンパ腫で見られる)またはＣＣＫ２Ｒリガンド(ＣＣＫ２Ｒリガンドの受容体は、数ある中で、甲状腺、肺、膵臓、卵巣、脳、胃、消化器間質および結腸の癌で見られる)であり得て、この各々は癌細胞型に特異的に結合する小分子リガンドである(すなわち、これらリガンドの各々に対する受容体は正常組織に比して癌で過発現され得る)。

【0292】

ある実施態様において、小分子リガンドは約１０,０００ダルトン未満、約９０００ダルトン未満、約８,０００ダルトン未満、約７０００ダルトン未満、約６０００ダルトン未満、約５０００ダルトン未満、約４５００ダルトン未満、約４０００ダルトン未満、約３５００ダルトン未満、約３０００ダルトン未満、約２５００ダルトン未満、約２０００ダルトン未満、約１５００ダルトン未満、約１０００ダルトン未満または約５００ダルトン未満の質量を有し得る。他の実施態様において、小分子リガンドは約１～約１０,０００ダルトン、約１～約９０００ダルトン、約１～約８,０００ダルトン、約１～約７０００ダルトン、約１～約６０００ダルトン、約１～約５０００ダルトン、約１～約４５００ダルトン、約１～約４０００ダルトン、約１～約３５００ダルトン、約１～約３０００ダルトン、約１～約２５００ダルトン、約１～約２０００ダルトン、約１～約１５００ダルトン、約１～約１０００ダルトンまたは約１～約５００ダルトンの質量を有し得る。

【0293】

ある実施態様において、ＤＵＰＡ誘導体は、標的化部分に結合した小分子リガンドのリガンドであってよく、ＤＵＰＡ誘導体は、引用により本明細書に包含されるＷＯ２０１５／０５７８５２に記載される。

【0294】

ある実施態様において、「リンカーに結合した小分子リガンド」との記載での小分子リガンドはフォレートである。種々の実施態様において、フォレートは葉酸、葉酸アナログまたは他の葉酸受容体結合分子であり得る。種々の実施態様において、使用し得るフォレートのアナログは、フォリン酸(例えば、ロイコボリン)、プテロポリグルタミン酸および葉酸受容体結合プテリジン、例えばテトラヒドロプテリン、ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸およびそのデアザおよびジデアザアナログであり得る。用語「デアザ」および「ジデアザ」アナログは、天然に存在する葉酸構造の１または２窒素原子の代わりに炭素原子を有する、当分野で認識されるアナログをいう。例えば、デアザアナログは１－デアザ、３－デアザ、５－デアザ、８－デアザおよび１０－デアザアナログを含む。ジデアザアナログは例えば、１,５－ジデアザ、５,１０－ジデアザ、８,１０－ジデアザおよび５,８－ジデアザアナログを含む。前記葉酸アナログは、葉酸受容体への結合能を反映して、慣用的に「フォレート」と称される。他の葉酸受容体結合アナログは、アミノプテリン、アメトプテリン(メトトレキサート)、Ｎ１０－メチルフォレート、２－デアミノ－ヒドロキシフォレート、デアザアナログ、例えば１－デアザメトプテリンまたは３－デアザメトプテリンおよび３’,５’－ジクロロ－４－アミノ－４－デオキシ－Ｎ１０－メチルプテロイルグルタミン酸(ジクロロメトトレキサート)を含む。

【0295】

他の実施態様において、「リンカーに結合した小分子リガンド」との記載での小分子リガンドは、式

【化9】

【0296】

ある態様において、ＣＡＲＴ細胞により発現されるＣＡＲに結合する「標的化部分」は、例えば、２,４－ジニトロフェノール(ＤＮＰ)、２,４,６－トリニトロフェノール(ＴＮＰ)、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)、ＮＨＳ－フルオレセイン、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、ノッチン、センチリン、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、アフィリン、アンチカリン、アトリマー、アビマー、二環ペプチド、ＦＮ３スキャフォールド、ｃｙｓノット、フィノマー、クーニッツドメインまたはＯｂｏｄｙから選択され得る。標的化部分の特性は、それがＣＡＲにより、好ましくは特異的に、認識され、結合され、かつ比較的低分子量であることによってのみ限定される。種々の態様において、例示的ターティング部分は、小分子量有機分子を含むハプテンである。

【0297】

ある説明的実施態様において、標的化部分は、次の説明的構造

【化10】

〔式中、Ｘは酸素、窒素または硫黄であり、ＸはリンカーＬに結合し；ＹはＯＲ^ａ、ＮＲ^ａ _２またはＮＲ^ａ _３ ^＋であり；そしてＹ’はＯ、ＮＲ^ａまたはＮＲ^ａ _２ ^＋であり；各Ｒは各場合Ｈ、フルオロ、スルホン酸、スルホネートおよびそれらの塩などから独立して選択され；そしてＲ^ａは水素またはアルキルである。〕
を有し得る。

【0298】

ある説明的態様において、リンカーはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリプロリン、親水性アミノ酸、糖、非天然ペプチドグリカン、ポリビニルピロリドン、プルロニックＦ－１２７またはこれらの組み合わせを含み得る。

【0299】

他の説明的態様において、ここに記載する化合物またはその薬学的に許容される塩におけるリンカーは、直接結合を含んでよく(例えば、小分子リガンドのＦＩＴＣのイソチオシアネート基と遊離アミン基間の反応)または結合は中間リンカーを介してよい。ある実施態様において、存在するならば、中間リンカーは、二価リンカーなどの当分野で知られる任意の生体適合性リンカーであり得る。ある説明的実施態様において、二価リンカーは、約１～約３０炭素原子を含み得る。他の説明的実施態様において、二価リンカーは約２～約２０炭素原子を含み得る。他の実施態様において、低分子量二価リンカー(すなわち、おおよその分子量約３０～約３００ダルトンを有するもの)が用いられる。他の実施態様において、適当なリンカー長は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０またはそれ以上の原子を有するリンカーを含むが、これらに限定されない。

【0300】

種々の実施態様において、標的化部分に結合する小分子リガンドは、式

【化11】

〔式中、Ｂは小分子リガンドであり、Ｌはリンカーであり、Ｔは標的化部分であり、ここで、Ｌは式

【化12】

(式中、ｎは０～２００の整数である)
を有する構造を含む。〕
を有するものであり得る。他の実施態様において、ｎは０～１５０、０～１１０、０～１００、０～９０、０～８０、０～７０、０～６０、０～５０、０～４０、０～３０、０～２０、０～１５、０～１４、０～１３、０～１２、０～１１、０～１０、０～９、０～８、０～７、０～６、０～５、０～４、０～３、０～２、０～１、１５～１６、１５～１７、１５～１８、１５～１９、１５～２０、１５～２１、１５～２２、１５～２３、１５～２４、１５～２５、１５～２６、１５～２７、１５～２８、１５～２９、１５～３０、１５～３１、１５～３２、１５～３３、１５～３４、１５～３５、１５～３６、１５～３７、１５～３８、１５～３９、１５～４０、１５～５０、１５～６０、１５～７０、１５～８０、１５～９０、１５～１００、１５～１１０、１５～１２０、１５～１３０、１５～１４０、１５～１５０の整数であり得てまたはｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０８、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０であり得る。

【0301】

他の実施態様において、リンカーは、１以上のスペーサーを含んでよい二価リンカーであり得る。説明的スペーサーを下表に示す。次の非限定的、説明的スペーサーは、＊が小分子リガンドまたは標的化部分または他の二価リンカー部分への結合点を示すとして記載する。

【表1】

【0302】

他の実施態様において、標的化部分に結合する小分子リガンド(架橋)は次の構造の何れかを有し得る。

【化13】

【化14】

【化15】

【0303】

他の実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩が抗体ではなく、抗体のフラグメントを含まない。さらに他の実施態様において、標的化部分がペプチドエピトープを含まない。

【0304】

ある説明的実施態様において、リンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンド(架橋)は、小分子リガンドに結合するフルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)を含む。ある態様において、癌は、小分子リガンドに対する受容体を過剰発現し得る。他の態様において、例えば、細胞毒性Ｔ細胞または他のタイプのＴ細胞を抗ＦＩＴＣｓｃＦｖを含むＣＡＲを発現するよう、形質転換できる。この態様において、ＣＡＲは標的ＦＩＴＣであってよく、ここで、癌への小分子リガンドの結合の結果として、癌がＦＩＴＣ分子で装飾される。故に、正常、非標的細胞への毒性は回避または低減され得る。この実施態様において、抗ＦＩＴＣＣＡＲ発現Ｔ細胞がＦＩＴＣに結合するとき、ＣＡＲＴ細胞は活性化され、癌が改善される。

【0305】

リンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンドの「薬学的に許容される塩」が考慮される。ここで使用する用語「薬学的に許容される塩」は、カウンターイオンが医薬で使用され得る塩をいう。種々の実施態様において、このような塩は、１)遊離塩基の親化合物と無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、リン酸、硫酸および過塩素酸などまたは有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、(Ｄ)または(Ｌ)リンゴ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸またはマロン酸などの反応により得ることができる酸付加塩；または２)親化合物に存在する酸性プロトンが金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオンまたはアルミニウムイオンで置き換えられたとき；または有機塩基、例えばエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トリメタミン、Ｎ－メチルグルカミンなどとの配位により形成される塩を含むが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩は当業者に周知であり、あらゆるこのような薬学的に許容される塩がここに記載する実施態様と関連して考慮される。

【0306】

種々の実施態様において、適当な酸付加塩は、非毒性塩を形成する酸から形成される。説明的例は、酢酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、べシル酸塩、重炭酸塩／炭酸塩、重硫酸塩／硫酸塩、ホウ酸塩、カンシル酸塩、クエン酸塩、エジシル酸塩、エシル酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプチン酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ヒベンズ酸塩、塩酸塩／塩化物、臭化水素酸塩／臭化物、ヨウ化水素酸塩／ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ナフチル酸塩、２－ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オロト酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩／リン酸水素塩／リン酸二水素塩、サッカリン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩およびトリフルオロ酢酸塩を含む。

【0307】

種々の実施態様において、適当な塩基塩は、非毒性塩を形成する塩基から形成される。説明的例は、アルギニン塩、ベンザチン塩、カルシウム塩、コリン塩、ジエチルアミン塩、ジオラミン塩、グリシン塩、リシン塩、マグネシウム塩、メグルミン塩、オラミン塩、カリウム塩、ナトリウム塩、トロメタミン塩および亜鉛塩を含む。酸および塩基のヘミ塩、例えば、ヘミ硫酸塩およびヘミカルシウム塩も形成され得る。

【0308】

ある説明的態様において、ここに記載する化合物またはその薬学的に許容される塩は、１以上のキラル中心を含み得るかまたは他に複数立体異性体として存在可能であり得る。従って、種々の実施態様は、純粋立体異性体ならびに立体異性体混合物、例えばエナンチオマー、ジアステレオマーおよびエナンチオマーまたはジアステレオマー富化混合物を含み得る。ある態様において、ここに記載する化合物またはその薬学的に許容される塩は、幾何異性体として存在し得る。従って、種々の実施態様は、純粋幾何異性体または幾何異性体混合物を含み得る。

【0309】

ある態様において、ここに記載する化合物またはその薬学的に許容される塩は溶媒和されていない形態および水和形態を含む溶媒和された形態で存在し得る。一般に、溶媒和された形態は溶媒和されていない形態と等価であり、本発明の範囲内に包含される。

【0310】

ここに記載する方法はまた架橋の標的化部分(例えば、ＦＩＴＣ、ＤＮＰまたはＴＮＰ)を認識し、結合するキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するよう操作されたＴリンパ球(例えば、細胞毒性Ｔリンパ球)も利用する。ある実施態様において、ここに記載するＣＡＲは、１)標的化部分を特異性をもって認識し、結合する認識領域(例えば、抗体の一本鎖フラグメント可変(ｓｃＦｖ)領域、Ｆａｂフラグメントなど)、２)Ｔリンパ球の増殖および生存を増強する共刺激ドメインおよび３)Ｔリンパ球活性化シグナルを産生する活性化シグナル伝達ドメインを含む３個のドメインを含む。

【0311】

種々の態様において、非限定的例として、２,４－ジニトロフェノール(ＤＮＰ)、２,４,６－トリニトロフェノール(ＴＮＰ)、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)、ＮＨＳ－フルオレセイン、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、ノッチン、センチリン、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、アフィリン、アンチカリン、アトリマー、アビマー、二環ペプチド、ＦＮ３スキャフォールド、ｃｙｓノット、フィノマー、クーニッツドメインまたはＯｂｏｄｙに結合する抗体のｓｃＦｖ領域が使用され得る。説明的非限定的実施態様において、ｓｃＦｖ領域は、(ｉ)当分野で標的化部分に結合することが知られる抗体、(ii)ハプテンなどの選択標的化部分を使用して新たに調製される抗体および(iii)このような抗体のｓｃＦｖ領域由来の配列バリアント、例えば、由来するｓｃＦｖ領域のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または少なくとも約９９.５％配列同一性を有するｓｃＦｖ領域から製造され得る。

【0312】

ある態様において、共刺激ドメインは、ＣＡＲの標的化部分への結合により、細胞毒性Ｔリンパ球の増殖および生存を増強するために働く。適当な共刺激ドメインは、活性化Ｔ細胞に発現されるＣＤ２８、ＣＤ１３７(４－１ＢＢ)、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)受容体ファミリーメンバー、ＣＤ１３４(ＯＸ４０)、受容体のＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバー、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ１５０、ＤＡＰ１０、ＮＫＧ２ＤおよびＣＤ２７８(ＩＣＯＳ)、ＣＤ２８スーパーファミリー共刺激分子またはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。当業者は、これら共刺激ドメインの配列バリアントを、本発明に不利に影響することなく利用できることを理解し、ここで、バリアントはそれらがモデルとしたドメインと同じまたは類似する活性を有する。種々の実施態様において、このようなバリアントは、由来するドメインのアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または少なくとも約９９.５％配列同一性を有する。

【0313】

説明的実施態様において、活性化シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲの標的化部分への結合により、Ｔリンパ球(例えば、細胞毒性Ｔリンパ球)を活性化するために働く。種々の実施態様において、適当な活性化シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ３デルタ受容体タンパク質、ｍｂｌ受容体タンパク質、Ｂ２９受容体タンパク質およびＦｃ受容体γを含む。当業者は、これら活性化シグナル伝達ドメインの配列バリアントが、該バリアントがモデルとしたドメインと同じまたは類似する活性を有するとき、使用できることを認識する。種々の実施態様において、バリアントは、由来するドメインのアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または少なくとも約９９.５％配列同一性を有する。

【0314】

ある態様において、ＣＡＲをコードする構築物は、遺伝子工学技術を使用して製造される。このような技術は、引用により本明細書に包含させるSambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001), incorporated herein by reference, and Green and Sambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2012)に詳述される。

【0315】

例として、フレーム内に、５’から３’方向で結合した、認識領域、１以上の共刺激ドメインおよび活性化シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質をコードする、プラスミドまたはウイルス発現ベクター(例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、sleeping beautyおよびpiggyback(非ウイルス介在ＣＡＲ遺伝子送達系を含むトランスポゾン／トランスポザーゼ系))を、製造できる。他の実施態様において、他の配置が許容され、認識領域、活性化シグナル伝達ドメインおよび１以上の共刺激ドメインを含む。ある実施態様において、融合タンパク質への認識領域の配置は、一般にＣＡＲＴ細胞の外部上への領域の呈示が達成されるようなものである。ある実施態様において、ＣＡＲは、融合タンパク質の細胞表面への適切な輸送を確実にするためのシグナルペプチド(例えば、ＣＤ８αシグナルペプチド)、融合タンパク質が膜内在性膜タンパク質(例えば、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメイン)として維持されることを確実にする膜貫通ドメインおよび認識領域に柔軟性を付与し、標的化部分との強い結合を可能とするヒンジドメイン(例えば、ＣＤ８αヒンジ)などの付加的要素を含み得る。

【0316】

例示的ＣＡＲの略図を図２および３に示す。図２に関して、融合タンパク質配列はレンチウイルス発現ベクターに取り込まれ得て、ここで、「ＳＰ」はシグナルペプチド、ＣＡＲは抗ＦＩＴＣＣＡＲであり、ＣＤ８αヒンジおよびＣＤ８α膜貫通ドメインは存在し、共刺激ドメインは４－１ＢＢであり、活性化シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζである。ＣＡＲインサートの例示的核酸配列が配列番号１および３として提供され、コードされるアミノ酸配列が配列番号２として提供される。さらに他の実施態様において、配列番号２は、ヒト化またはヒトアミノ酸配列を含むまたはそれからなることができる。

【0317】

図３に関して、発現されるＣＡＲがＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメントを含む例示的ＣＡＲ構築物の略図が示され、ここで、融合タンパク質配列は発現ベクターに取り込まれ得て、ＣＡＲはＥ２抗フルオレセイン抗体フラグメント、ＩｇＧ４ヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメインを含み、共刺激ドメインがＣＤ１３７(４－１ＢＢ)であり、活性化シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζである。ＣＡＲはさらなる適当なドメインを含み得る。このようなＣＡＲインサートの例示的核酸配列は配列番号４として提供され、例示的なコードされるアミノ酸配列は配列番号５として提供される。ここで使用する「配列番号４」は、下線「ａｇｃ」コドンから始まり、下線「ｇｇｃ」コドンで終わる配列を意味する。長い配列のこの部分は、Ｔ細胞膜に挿入されたＣＡＲをコードする。長い配列の他の部分は、膜に挿入されたＣＡＲの一部ではなく、キメラ抗原受容体として機能する、シグナルペプチド、ＥＧＦＲｔドメインなどのコード配列を含む。ここで使用する「配列番号５」は、下線「Ｓ」から始まり、下線「Ｇ」で終わる配列を意味する。長い配列のこの部分は、Ｔ細胞膜に挿入されたＣＡＲのアミノ酸配列である。長い配列の他の部分は、膜に挿入されたＣＡＲの一部ではなく、キメラ抗原受容体として機能する、シグナルペプチド、ＥＧＦＲｔドメインなどのアミノ酸配列を含む。さらに他の実施態様において、配列番号５は、ヒト化またはヒトアミノ酸配列を含むまたはそれからなることができる。配列番号４および５は上記のとおりであり、下に示す。長い核酸配列の開始コドンおよび停止コドンは下線を付し、長い配列は、ここに記載する方法において使用するＴ細胞の形質導入に使用され得る例示的配列である。

【0318】

配列番号４(Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントＣＡＲ核酸配列(インサート))

【表2】

【0319】

配列番号５(Ｅ２抗フルオレセイン抗体フラグメントＣＡＲアミノ酸配列(インサート))

【表3】

【0320】

他の例示的ＣＡＲ構築物は、図３に図式的に示される４Ｍ５.３ＣＡＲである。ここで使用する「配列番号６」は、下線「ｇａｃ」コドンから始まり、下線「ｇｇｃ」コドン終わる下記配列を意味する。長い配列のこの部分は例示的４Ｍ５.３ＣＡＲをコードする。ＣＡＲはＴ細胞膜に挿入される。長い配列の他の部分は、膜に挿入されたＣＡＲの一部ではなく、キメラ抗原受容体として機能する、シグナルペプチド、ＥＧＦＲｔドメインなどのコード配列を含む。ここで使用する「配列番号７」は、下線「Ｄ」から始まり、下線「Ｇ」終わる下記配列を意味する。長い配列のこの部分は、Ｔ細胞膜に挿入されるＣＡＲのアミノ酸配列である。長い配列の他の部分は、膜に挿入されたＣＡＲの一部ではなく、キメラ抗原受容体として機能する、シグナルペプチド、ＥＧＦＲｔドメインなどのアミノ酸配列を含む。さらに他の実施態様において、配列番号７は、ヒト化またはヒトアミノ酸配列を含むまたはそれからなることができる。配列番号６および７は上記のとおりであり、下に示す。長い核酸配列の開始コドンおよび停止コドンは下線を付し、長い配列は、４Ｍ５.３ＣＡＲを製造するためにＴ細胞の形質導入に使用され得る例示的配列である。

【0321】

配列番号７[４Ｍ５.３－ＣＡＲアミノ酸配列(インサート)]

【表4】

【0322】

配列番号６[４Ｍ５.３－ＣＡＲヌクレオチド酸配列(インサート)]

【表5】

【0323】

ある実施態様において、ＣＡＲは認識領域を有し、認識領域は抗ＦＩＴＣ抗体の一本鎖フラグメント可変(ｓｃＦｖ)領域であり、共刺激ドメインおよび共刺激ドメインはＣＤ１３７(４－１ＢＢ)であり、そして活性化シグナル伝達ドメインはＴ細胞ＣＤ３ζ鎖である。抗ＦＩＴＣｓｃＦｖと抗フルオレセインｓｃＦｖが同義の用語であることは、当業者には周知である。

【0324】

ある実施態様において、Ｔリンパ球(例えば、細胞毒性Ｔリンパ球)を、ＣＡＲ構築物をコードする発現ベクターでＴリンパ球の集団をトランスフェクトすることにより、ＣＡＲ構築物を発現するよう遺伝子改変できる。選択ＣＡＲ構築物を発現する形質導入Ｔリンパ球集団の製造に適当な方法は当業者に周知であり、Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)(引用により本明細書に包含する)およびGreen and Sambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2012)(引用により本明細書に包含する)に記載される。

【0325】

ある実施態様において、配列番号１、３、４または６の核酸を含むＣＡＲＴ細胞が提供される。他の実施態様において、配列番号２、５または７のポリペプチドを含むＣＡＲＴ細胞が提供される。他の説明的態様において、配列番号１、３、４または６を含み、キメラ抗原受容体をコードする核酸(例えば、単離核酸)が提供される。さらに他の実施態様において、配列番号２、５または７を含むキメラ抗原受容体ポリペプチドが提供される。他の実施態様において、配列番号１、３、４または６を含むベクターが提供される。他の態様において、配列番号１、３、４または６を含むレンチウイルスベクターが提供される。さらに他の実施態様において、配列番号２、５または７は、ヒト化またはヒトアミノ酸配列を含むまたはそれからなることができる。

【0326】

これらの実施態様の各々において、配列番号１～７に少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または少なくとも約９９.５％配列同一性を有するバリアント核酸配列またはアミノ酸配列が考慮される。他の実施態様において、核酸配列は、バリアント配列が配列番号２(配列番号１および３について)、配列番号５(配列番号４について)または配列番号７(配列番号６について)のポリペプチドをコードする限り、配列番号１、３、４または６に少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または少なくとも約９９.５％配列同一性を有するバリアント核酸配列であり得る。他の実施態様において、核酸配列またはアミノ酸配列は、配列番号１、３、４もしくは６に関して２００核酸にわたってまたは配列番号２、５もしくは７に関して２００アミノ酸にわたって、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または少なくとも約９９.５％配列同一性を有するバリアント核酸またはアミノ酸配列であり得る。ある実施態様において、配列間の％同一性または類似性決定は、例えば、ＧＡＰプログラム(Genetics Computer Group、ソフトウェア；現在http://www.accelrys.comのAccelrysから入手可能)を使用して決定でき、アラインメントは、例えば、ClustalWアルゴリズム(ＶＮＴＩソフトウェア、InforMax Inc.)を使用して実施できる。配列データベースを、目的の核酸またはアミノ酸配列を使用してサーチできる。データベースサーチのためのアルゴリズムは、一般にＢＬＡＳＴソフトウェアに基づく(Altschul et al., 1990)。ある実施態様において、パーセント同一性を、核酸またはアミノ酸配列の全長にわたり、決定できる。

【0327】

また、本発明の範囲内であるのは配列番号１、３、４または６により表される核酸に相補的な核酸および高ストリンジェント条件下で、配列番号１、３、４または６により表される核酸とハイブリダイズするまたはその相補体とハイブリダイズする核酸である。本発明によって「高ストリンジェント条件」は、６５℃で５×ＳＳＰＥおよび５０％ホルムアミド中でハイブリダイゼーションおよび６５℃で０.５×ＳＳＰＥで洗浄を意味する。高ストリンジェンシー、低ストリンジェンシーおよび中ストリンジェンシーハイブリダイゼーションのための条件は、Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)(引用により本明細書に包含する)およびGreen and Sambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2012)(引用により本明細書に包含する)に記載される。ある説明的態様において、ハイブリダイゼーションは、核酸の全長にわたり起こる。

【0328】

ある実施態様において、ここに記載する方法において使用するＴリンパ球(例えば、ＣＡＲＴ細胞の製造に使用した細胞毒性Ｔリンパ球)は自己細胞であり得るが、処置されている患者が、該患者の免疫系を破壊するために高用量化学療法または放射線処置を受けているときなど、異種細胞も使用できる。ある実施態様において、同種異系細胞が使用され得る。

【0329】

ある態様において、Ｔリンパ球を、当分野で周知の手段により患者から得ることができる。例えば、Ｔ細胞(例えば、細胞毒性Ｔ細胞)を、患者から末梢血を採取し、該血液をFicoll密度勾配遠心分離に付し、次いで陰性Ｔ細胞単離キット(例えばEasySep^TM Ｔ細胞単離キット)を使用して、末梢血からＴ細胞集団を単離することにより、得ることができる。ある説明的実施態様において、Ｔリンパ球(例えば、細胞毒性Ｔ細胞)の集団は純粋である必要はなく、他のタイプのＴ細胞(例えば、細胞毒性Ｔ細胞の場合)、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞およびＢ細胞などの他の細胞を含んでよい。ある態様において、採取される集団は、選択細胞型を少なくとも約９０％、選択細胞型を少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％含み得る。

【0330】

ある実施態様において、Ｔリンパ球(例えば、ＣＡＲＴ細胞の製造に使用する細胞毒性Ｔ細胞)を得た後、該細胞を、細胞の活性化を促進する条件下で培養する。この実施態様において、培養条件は、培養培地成分との反応性の懸念なく、細胞を患者に投与できるようなものであり得る。例えば、培養条件は、ウシ血清アルブミンなどのウシ血清製品を含まない。ある説明的態様において、活性化は、細胞毒性Ｔ細胞の場合抗ＣＤ３抗体など、既知アクティベーターの培養培地への導入により達成できる。他の適当なアクティベーターは抗ＣＤ２８抗体を含む。ある態様において、リンパ球の集団は、約１～約４日間、活性化を促進する条件下で培養され得る。ある実施態様において、活性化の適切なレベルは、細胞サイズ、増殖速度またはフローサイトメトリーにより決定される活性化マーカーにより決定され得る。

【0331】

ある説明的実施態様において、Ｔリンパ球(例えば、ＣＡＲＴ細胞の製造に使用した細胞毒性Ｔリンパ球)の集団が活性化を促進する条件下で培養された後、細胞は、ＣＡＲをコードする発現ベクターでトランスフェクトされ得る。種々の実施態様において使用する適当なベクターおよびトランスフェクション方法は上に記載される。ある態様において、トランスフェクション後、細胞を患者にすぐに投与してよくまたは細胞を、例えば、該細胞にトランスフェクションから回復するための時間を与えるため、少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日またはそれ以上または約５～約１２日、約６～約１３日、約７～約１４日または約８～約１５日培養してよい。ある態様において、適当な培養条件は、活性化を促進するために使用した薬剤を含むかまたは含まない、細胞が活性化のために培養された条件に類似したものであり得る。

【0332】

故に、上記のとおり、ある説明的態様において、ここに記載する処置方法は、さらに、１)自己または異種Ｔリンパ球(例えば、ＣＡＲＴ細胞の製造に使用した細胞毒性Ｔリンパ球)の集団を得て、２)細胞の活性化を促進する条件下にＴリンパ球を培養し、そして３)リンパ球をＣＡＲをコードする発現ベクターでトランスフェクトして、ＣＡＲＴ細胞を形成することを含む。

【0333】

ある実施態様において、ウシ血清などのあらゆる動物資材を含まない培養培地がＣＡＲＴ細胞の培養に使用され得る。他の実施態様において、一般に当業者が細菌、真菌およびマイコプラズマでの汚染を避けるために使用する組織培養条件が使用され得る。例示的実施態様において、患者に投与する前に、細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞)をペレット化し、洗浄し、薬学的に許容される担体または希釈剤に再懸濁する。ＣＡＲ発現Ｔリンパ球(例えば、細胞毒性Ｔリンパ球)を含む例示的組成物は、無菌２９０mOsm食塩水、注射可能凍結保存培地(Plasma-Lyte A、デキストロース、塩化ナトリウム注射、ヒト血清アルブミンおよびＤＭＳＯ含有)、２％ヒト血清アルブミン添加０.９％ＮａＣｌまたは何らかの他の無菌２９０mOsm注射可能物質中に細胞を含む組成物である。あるいは、他の実施態様において、培養培地の特性によって、ＣＡＲＴ細胞を組成物として培養培地に投与できまたは投与前に濃縮し、培養培地に再懸濁できる。種々の実施態様において、ＣＡＲＴ細胞組成物を、非経腸投与、例えば、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内または髄腔内などの何れかの適当な手段で患者に投与し得る。

【0334】

ある態様において、患者に投与する組成物中のＣＡＲＴ細胞の総数および細胞の濃度は、使用するＴリンパ球(例えば、細胞毒性Ｔリンパ球)のタイプ、ＣＡＲの結合特異性、標的化部分および小分子リガンドの特性、癌の特性、患者における癌の部位、患者に組成物を投与するのに使用する手段および処置する患者の健康状態、年齢および体重を含む、多数の因子により変わる。種々の実施態様において、適当な形質導入ＣＡＲＴ細胞を含む組成物は、約０.１ml～約２００mlおよび約０.１ml～約１２５mlの体積を有するものである。

【0335】

種々の実施態様において、患者に投与される形質導入ＣＡＲＴ細胞は、約１×１０^５～約１×１０^１５または１×１０^６～約１×１０^１５の形質導入ＣＡＲＴ細胞からなり得る。種々の実施態様において約１×１０^５～約１×１０^１０、約１×１０^６～約１×１０^１０、約１×１０^６～約１×１０^９、約１×１０^６～約１×１０^８、約１×１０^６～約２×１０^７、約１×１０^６～約３×１０^７、約１×１０^６～約１.５×１０^７、約１×１０^６～約１×１０^７、約１×１０^６～約９×１０^６、約１×１０^６～約８×１０^６、約１×１０^６～約７×１０^６、約１×１０^６～約６×１０^６、約１×１０^６～約５×１０^６、約１×１０^６～約４×１０^６、約１×１０^６～約３×１０^６、約１×１０^６～約２×１０^６、約２×１０^６～約６×１０^６、約２×１０^６～約５×１０^６、約３×１０^６～約６×１０^６、約４×１０^６～約６×１０^６、約４×１０^６～約１×１０^７、約１×１０^６～約１×１０^７、約１×１０^６～約１.５×１０^７、約１×１０^６～約２×１０^７、約０.２×１０^６～約１×１０^７、約０.２×１０^６～約１.５×１０^７、約０.２×１０^６～約２×１０^７、約０.２×１０^６～約３×１０^７、約０.２×１０^６～約４×１０^７、約０.２×１０^６～約５×１０^７、約０.２×１０^５～約１.５×１０^６、約０.５×１０^５～約１.５×１０^６、約０.２×１０^５～約１.４×１０^６、約０.２×１０^５～約１.３×１０^６、約０.５×１０^５～約１.３×１０^６、約０.８×１０^６～約２×１０^７、約０.８×１０^６～約１.５×１０^７、約０.９×１０^６～約１.２×１０^７または約０.５×１０^６、１×１０^６、５×１０^６、６×１０^６、７×１０^６、８×１０^６、９×１０^６、１×１０^７、１.５×１０^７、２×１０^７、３×１０^７、４×１０^７または５×１０^７ＣＡＲＴ細胞を患者に投与し得る。これらの量は、患者体重kgあたりである。

【0336】

他の実施態様において、ＣＡＲＴ細胞組成物で患者に投与するＣＡＲＴ細胞の用量は、約１００万、約２００万、約３００万、約４００万、約５００万、約６００万、約７００万、約８００万、約９００万、約１０００万、約１１００万、約１２００万、約１２５０万、約１３００万、約１４００万および約１５００万のＣＡＲＴ細胞からなる群から選択される。これらの量は、患者体重kgあたりである。

【0337】

本段落に記載する実施態様の何れにおいても、ＣＡＲＴ細胞用量は、患者体重kgあたりのＣＡＲＴ細胞数であり得る。ある態様において、ここに記載する何れの実施態様においても、単一用量または複数用量のＣＡＲＴ細胞を患者に投与できる。ある説明的実施態様において、ＣＡＲＴ細胞の初回用量およびＣＡＲＴ細胞の第二回用量を患者に投与し得る。ある態様において、ＣＡＲＴ細胞の初回用量は、患者のＣＡＲＴ細胞に対する認容性をモニターするための試験用量であってよく、ＣＡＲＴ細胞の第二回用量は、ＣＡＲＴ細胞の初回用量より高用量のＣＡＲＴ細胞を含み得る。ある実施態様において、ＣＡＲＴ細胞の初回用量は、約０.５×１０^５のＣＡＲＴ細胞～約１.５×１０^６のＣＡＲＴ細胞を含み得る。他の実施態様において、ＣＡＲＴ細胞の第二回用量は、約０.８×１０^６のＣＡＲＴ細胞～約２×１０^７のＣＡＲＴ細胞を含み得る。ＣＡＲＴ細胞の初回および第二回用量を含むこれらの実施態様において、ここに記載するあらゆる用量のＣＡＲＴ細胞が投与され得る。

【0338】

ここに記載する何れの実施態様においても、ＣＡＲＴ細胞を化合物またはその薬学的に許容される塩の投与前または後に投与してよい。理解されるとおり、ここに記載するあらゆる方法の工程についての指定ｉ)、ii)およびiii)などは、特に断らない限り順番を示すものではない。

【0339】

ここに記載する化合物もしくはその薬学的に許容される塩またはＣＡＲＴ細胞組成物を、当分野で知られる任意の適当な方法を使用して患者に投与し得る。ここで使用する用語「投与する」または「投与」は、経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮などを含むが、これらに限定されない、患者に化合物もしくはその薬学的に許容される塩またはＣＡＲＴ細胞組成物を導入する全ての手段を含む。ある態様において、ここに記載する化合物またはその薬学的に許容される塩を、慣用の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバントおよび媒体を含む、単位剤型および／または製剤で投与し得る。

【0340】

ある態様において、ここに記載する化合物もしくはその薬学的に許容される塩またはＣＡＲＴ細胞組成物を、血流、筋肉または内臓に直接投与し得る。種々の実施態様において、このような非経腸投与のための適当な経路は、静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、硬膜外、脳室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、腫瘍内、筋肉内および皮下送達を含む。ある実施態様において、非経腸投与手段は、有針(マイクロニードルを含む)注射器、無針注射器および点滴技術を含む。

【0341】

ある説明的態様において、非経腸製剤は、一般に塩、炭水化物および緩衝剤(好ましくはｐＨ３～９)などの担体または添加物を含み得る水溶液であるが、無菌非水溶液または無菌、発熱性物質除去水または無菌食塩水などの適当な媒体と組み合わせて使用すべき乾燥形態として製剤されるのがより好適であり得る。他の実施態様において、ここに記載する液体製剤の何れもここに記載する非経腸投与に適合させ得る。非経腸製剤用無菌凍結乾燥粉末を製造するための、凍結乾燥による無菌条件下の製造は、当業者に周知の標準製薬技術を使用して容易に達成され得る。ある実施態様において、非経腸製剤の製造に使用する化合物またはその薬学的に許容される塩の溶解度を、溶解促進剤の取り込みなどの適切な製剤技術の使用により、増加させ得る。

【0342】

ある実施態様において、患者に投与される化合物またはその薬学的に許容される塩の量は、処置される癌、化合物またはその薬学的に許容される塩の投与経路および組織分布により顕著に変わり得る。ある態様において、患者に投与される量は、体表面積、体重および医師の評価に基づき得る。

【0343】

種々の実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩を、１)少なくとも１回目の用量漸増過程および２回目の用量漸増過程、２)少なくとも１回目の用量漸増過程、２回目の用量漸増過程および３回目の用量漸増過程、３)少なくとも１回目の用量漸増過程、２回目の用量漸増過程、３回目の用量漸増過程および４回目の用量漸増過程、４)少なくとも１回目の用量漸増過程、２回目の用量漸増過程、３回目の用量漸増過程、４回目の用量漸増過程および５回目の用量漸増過程、５)少なくとも１回目の用量漸増過程、２回目の用量漸増過程、３回目の用量漸増過程、４回目の用量漸増過程、５回目の用量漸増過程および６回目の用量漸増過程で投与できまたは６)１以上のさらなる用量漸増過程が含まれ得る。

【0344】

種々の実施態様において、１回目、２回目、３回目、４回目、５回目または６回目などの用量漸増過程について、患者に投与される化合物またはその薬学的に許容される塩の量は、約０.１μg／kg～約２０００μg／kg、０.１μg／kg～約１５００μg／kg、０.１μg／kg～約１０００μg／kg、０.１μg／kg～約５００μg／kg、約０.１μg／kg～約１００μg／kg、約０.１μg／kg～約８０μ／kg、約０.１μg／kg～約７０μg／kg、約０.１μg／kg～約５０μg／kg、約０.１μg／kg～約４０μg／kg、約０.１μg／kg～約３０μg／kg、約０.３μg／kg～約５００μg／kg、約０.３μg／kg～約４００μg／kg、約０.３μg／kg～約３００μg／kg、約０.３μg／kg～約２００μg／kg、約０.３μg／kg～約１００μg／kg、約０.３μg／kg～約９０μg／kg、約０.１μg／kg～約４００μg／kg、約０.１μg／kg～約３５０μg／kg、約０.１μg／kg～約３００μg／kg、約０.１μg／kg～約２５０μg／kg、約０.１μg／kg～約２００μg／kg、約０.１μg／kg～約１５０μg／kgまたは約０.３μg／kg～約１５０μg／kgまたは５μg／kg～約２０００μg／kg、５μg／kg～約１５００μg／kg、５μg／kg～約１０００μg／kg、５μg／kg～約５００μg／kg、約５μg／kg～約１００μg／kg、約５μg／kg～約８０μ／kg、約５μg／kg～約７０μg／kg、約５μg／kg～約５０μg／kg、約５μg／kg～約４０μg／kgまたは約５μg／kg～約３０μg／kgであり得る。他の実施態様において、１回目および４回目の用量漸増過程について、患者に投与される化合物またはその薬学的に許容される塩の量は約０.１μg／kg～約１００μg／kg、約０.１μg／kg～約８０μg／kg、約０.１μg／kg～約７０μg／kg、約０.１μg／kg～約５０μg／kg、約０.１μg／kg～約４０μg／kg、約０.１μg／kg～約３０μg／kgまたは約０.３μg／kg～約３０μg／kg、約５μg／kg～約１００μg／kg、約５μg／kg～約８０μg／kg、約５μg／kg～約７０μg／kg、約５μg／kg～約５０μg／kg、約５μg／kg～約４０μg／kg、約５μg／kg～約３０μg／kgまたは約５μg／kg～約２０００μg／kgまたは約５μg／kg～約１５００μg／kgまたは約５μg／kg～約１０００μg／kgまたは約５μg／kg～約５００μg／kgであり得る。他の実施態様において、２回目および５回目の用量漸増過程について、患者に投与される化合物またはその薬学的に許容される塩の量は約０.３μg／kg～約５００μg／kg、約０.３μg／kg～約４００μg／kg、約０.３μg／kg～約３００μg／kg、約０.３μg／kg～約２００μg／kg、約０.３μg／kg～約１００μg／kgまたは約０.３μg／kg～約９０μg／kgまたは約５μg／kg～約１００μg／kg、約５μg／kg～約８０μg／kg、約５μg／kg～約７０μg／kg、約５μg／kg～約５０μg／kg、約５μg／kg～約４０μg／kg、約５μg／kg～約３０μg／kgまたは約５μg／kg～約２０００μg／kgまたは約５μg／kg～約１５００μg／kgまたは約５μg／kg～約１０００μg／kgまたは約５μg／kg～約５００μg／kgであり得る。さらに他の実施態様において、３回目および６回目の用量漸増過程について、患者に投与される化合物またはその薬学的に許容される塩の量は０.１μg／kg～約４００μg／kg、約０.１μg／kg～約３５０μg／kg、約０.１μg／kg～約３００μg／kg、約０.１μg／kg～約２５０μg／kg、約０.１μg／kg～約２００μg／kg、約０.１μg／kg～約１５０μg／kgまたは約０.３μg／kg～約１５０μg／kgまたは約５μg／kg～約１００μg／kg、約５μg／kg～約８０μg／kg、約５μg／kg～約７０μg／kg、約５μg／kg～約５０μg／kg、約５μg／kg～約４０μg／kg、約５μg／kg～約３０μg／kgまたは約５μg／kg～約２０００μg／kgまたは約５μg／kg～約１５００μg／kgまたは約５μg／kg～約１０００μg／kgまたは約５μg／kg～約５００μg／kgであり得る。これらの実施態様において、「kg」は患者体重キログラムである。

【0345】

これらの実施態様の何れにおいても、化合物またはその薬学的に許容される塩の量の範囲は、該化合物またはその薬学的に許容される塩の「全用量」のパーセンテージの計算に基づく範囲であり得て、ここで、化合物またはその薬学的に許容される塩の「全用量」は約３０μg／kgであってよく、パーセンテージは、化合物またはその薬学的に許容される塩の「全用量」の約１％～約１００％(図１の過程１参照)、約１％～約３００％(図１の過程２参照)および約１％～約５００％(図１の過程３参照)である。他の実施態様において、用量漸増過程で投与される化合物またはその薬学的に許容される塩の「全用量」のパーセンテージは、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約２００％、約３００％、約４００％または約５００％であり得て、投与量はそれぞれ約０.３μg／kg、約３μg／kg、約９μg／kg、約１５μg／kg、約３０μg／kg、約９０μg／kgまたは約１５０μg／kgであるかまたは約１７％、約３３３％、約１６６６％または約３３３３％であり、投与量はそれぞれ約５μg／kg、約１００μg／kg、約５００μg／kgまたは約１０００μg／kgであり得る。これらの実施態様において、「kg」は患者体重キログラムである。

【0346】

他の実施態様において、用量漸増過程で投与される化合物またはその薬学的に許容される塩の「全用量」のパーセンテージは、１回目の用量漸増過程について約１％、約２％および約２０％、２回目の用量漸増過程について約１％、約６％および約６０％、そして３回目の用量漸増過程について約１％、約１０％および約１００％であり、化合物またはその薬学的に許容される塩の「全用量」は５００nmol／kgであり得る。この実施態様において、「kg」は患者体重キログラムである。この実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩を、各用量漸増サイクルの間が約６日間で月曜日、木曜日および月曜日に投与し得る。

【0347】

他の実施態様において、用量漸増過程で投与される化合物またはその薬学的に許容される塩の「全用量」のパーセンテージは、１回目の用量漸増過程について約１％、約１０％および約１００％および２回目の用量漸増過程について約１％、約２０％および約２００％であってよく、化合物またはその薬学的に許容される塩の「全用量」は５００nmol／kgであり得る。この実施態様において、「kg」は患者体重キログラムである。この実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩を、各用量漸増サイクルの間が約６日間で月曜日、木曜日および月曜日に投与し得る。

【0348】

他の実施態様において、用量漸増過程で投与される化合物またはその薬学的に許容される塩の「全用量」のパーセンテージは、１回目の用量漸増過程について約１％、約１０％および約１００％、そして２回目の用量漸増過程については約１％、約１０％および約１００％であってよく、化合物またはその薬学的に許容される塩の「全用量」は５００nmol／kgであり得る。この実施態様において、「kg」は患者体重キログラムである。この実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩を、各用量漸増サイクルの間が約６日間で月曜日、木曜日および月曜日に投与し得る。他の実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩、を、各用量漸増サイクルの間が約９日間で月曜日、木曜日および月曜日に投与し得る。他の実施態様において、用量漸増を回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回または１０回または何れか適当な回数繰り返し得る。

【0349】

さらに他の実施態様において、用量漸増過程で投与される化合物またはその薬学的に許容される塩の「全用量」のパーセンテージは１回目の用量漸増過程について約１％、約２０％および約２００％、そして２回目の用量漸増過程について約１％、約２０％および約２００％であってよく、化合物またはその薬学的に許容される塩の「全用量」は５００nmol／kgであり得る。この実施態様において、「kg」は患者体重キログラムである。この実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩を、各用量漸増サイクルの間が約６日間で月曜日、木曜日および月曜日に投与し得る。他の実施態様において、用量漸増を回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回または１０回または何れかの適当な回数繰り返し得る。

【0350】

他の実施態様において、１回目または４回目の用量漸増過程で投与される化合物またはその薬学的に許容される塩の「全用量」のパーセンテージは、漸増用量で化合物またはその薬学的に許容される塩の「全用量」の約１％、約１０％および約１００％(約１０～約５０μg／kg、約２０～約４０μg／kg、約２５～約３５μg／kgまたは約３０μg／kg)であってよく、投与される化合物またはその薬学的に許容される塩の量はそれぞれ約０.３μg／kg、約３μg／kgおよび約３０μg／kgであり得る。さらに他の実施態様において、２回目または５回目の用量漸増過程で投与される化合物またはその薬学的に許容される塩の「全用量」のパーセンテージは、漸増用量で化合物またはその薬学的に許容される塩の「全用量」の約１％、約３０％および約３００％(約１０～約５０μg／kg、約２０～約４０μg／kg、約２５～約３５μg／kgまたは約３０μg／kg)であってよく、投与される化合物またはその薬学的に許容される塩の量はそれぞれ約０.３μg／kg、約９μg／kgおよび約９０μg／kgであり得る。さらに他の実施態様において、３回目または６回目の用量漸増過程で投与される化合物またはその薬学的に許容される塩の「全用量」のパーセンテージは、漸増用量で化合物またはその薬学的に許容される塩の「全用量」の約１％、約５０％および約５００％(約１０～約５０μg／kg、約２０～約４０μg／kg、約２５～約３５μg／kgまたは約３０μg／kg)であってよく、投与される化合物またはその薬学的に許容される塩の量はそれぞれ約０.３μg／kg、約１５μg／kgおよび約１５０μg／kgであり得る。これらの実施態様において、「kg」は患者体重キログラムである。

【0351】

種々の他の実施態様において、患者に投与すべき量は、例えば、約０.０５mg～約３０mg、０.０５mg～約２５.０mg、約０.０５mg～約２０.０mg、約０.０５mg～約１５.０mg、約０.０５mg～約１０.０mg、約０.０５mg～約９.０mg、約０.０５mg～約８.０mg、約０.０５mg～約７.０mg、約０.０５mg～約６.０mg、約０.０５mg～約５.０mg、約０.０５mg～約４.０mg、約０.０５mg～約３.０mg、約０.０５mg～約２.０mg、約０.０５mg～約１.０mg、約０.０５mg～約０.５mg、約０.０５mg～約０.４mg、約０.０５mg～約０.３mg、約０.０５mg～約０.２mg、約０.０５mg～約０.１mg、約.０１mg～約２mg、約０.３mg～約１０mg、約０.１mg～約２０mgまたは約０.８～約３mgの範囲であり得る。

【0352】

他の実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩の用量は、例えば、約５０nmol／kg～約３０００nmol／kg患者体重、約５０nmol／kg～約２０００nmol／kg、約５０nmol／kg～約１０００nmol／kg、約５０nmol／kg～約９００nmol／kg、約５０nmol／kg～約８００nmol／kg、約５０nmol／kg～約７００nmol／kg、約５０nmol／kg～約６００nmol／kg、約５０nmol／kg～約５００nmol／kg、約５０nmol／kg～約４００nmol／kg、約５０nmol／kg～約３００nmol／kg、約５０nmol／kg～約２００nmol／kg、約５０nmol／kg～約１００nmol／kg、約１００nmol／kg～約３００nmol／kg、約１００nmol／kg～約５００nmol／kg、約１００nmol／kg～約１０００nmol／kg、約１００nmol／kg～約２０００nmol／kg患者体重の範囲であり得る。他の実施態様において、用量は約１nmol／kg、約５nmol／kg、約１０nmol／kg、約２０nmol／kg、約２５nmol／kg、約３０nmol／kg、約４０nmol／kg、約５０nmol／kg、約６０nmol／kg、約７０nmol／kg、約８０nmol／kg、約９０nmol／kg、約１００nmol／kg、約１５０nmol／kg、約２００nmol／kg、約２５０nmol／kg、約３００nmol／kg、約３５０nmol／kg、約４００nmol／kg、約４５０nmol／kg、約５００nmol／kg、約６００nmol／kg、約７００nmol／kg、約８００nmol／kg、約９００nmol／kg、約１０００nmol／kg、約２０００nmol／kg、約２５００nmol／kgまたは約３０００nmol／kg患者体重であり得る。さらに他の実施態様において、用量は約０.１nmol／kg、約０.２nmol／kg、約０.３nmol／kg、約０.４nmol／kgまたは約０.５nmol／kg、約０.１nmol／kg～約１０００nmol／kg、約０.１nmol／kg～約９００nmol／kg、約０.１nmol／kg～約８５０nmol／kg、約０.１nmol／kg～約８００nmol／kg、約０.１nmol／kg～約７００nmol／kg、約０.１nmol／kg～約６００nmol／kg、約０.１nmol／kg～約５００nmol／kg、約０.１nmol／kg～約４００nmol／kg、約０.１nmol／kg～約３００nmol／kg、約０.１nmol／kg～約２００nmol／kg、約０.１nmol／kg～約１００nmol／kg、約０.１nmol／kg～約５０nmol／kg、約０.１nmol／kg～約１０nmol／kgまたは約０.１nmol／kg～約１nmol／kg患者体重であり得る。他の実施態様において、用量は約０.３nmol／kg～約１０００nmol／kg、約０.３nmol／kg～約９００nmol／kg、約０.３nmol／kg～約８５０nmol／kg、約０.３nmol／kg～約８００nmol／kg、約０.３nmol／kg～約７００nmol／kg、約０.３nmol／kg～約６００nmol／kg、約０.３nmol／kg～約５００nmol／kg、約０.３nmol／kg～約４００nmol／kg、約０.３nmol／kg～約３００nmol／kg、約０.３nmol／kg～約２００nmol／kg、約０.３nmol／kg～約１００nmol／kg、約０.３nmol／kg～約５０nmol／kg、約０.３nmol／kg～約１０nmol／kgまたは約０.３nmol／kg～約１nmol／kg患者体重であり得る。これらの実施態様において、「kg」はすべて患者体重キログラムである。

【0353】

他の実施態様において、化合物(例えば、ここで、各用量漸増段階は５０nmol／kg、次いで５００nmol／kgである)またはその薬学的に許容される塩の１回目の用量漸増段階および２回目の用量漸増段階を、ＣＡＲＴ細胞(例えば、ここに記載する何れかの量で)投与後実施する。この実施態様において、例えば、１週目および２週目の１回目および２回目の用量漸増段階後、化合物またはその薬学的に許容される塩のレベルは、２週目に投与された最終用量に比して、３週目は一定に維持され得る(例えば、５００nmol／kgで一定に維持)。ここに記載する何れの実施態様においても、化合物またはその薬学的に許容される塩のレベルは、先の週に投与された最終用量に比して、後の週は一定に維持され得る。

【0354】

種々の他の実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩の用量は、例えば、約１０nmol／kg～約１００００nmol／kg、約１０nmol／kg～約５０００nmol／kg、約１０nmol／kg～約３０００nmol／kg、約１０nmol／kg～約２５００nmol／kg、約１０nmol／kg～約２０００nmol／kg、約１０nmol／kg～約１０００nmol／kg、約１０nmol／kg～約９００nmol／kg、約１０nmol／kg～約８００nmol／kg、約１０nmol／kg～約７００nmol／kg、約１０nmol／kg～約６００nmol／kg、約１０nmol／kg～約５００nmol／kg、約１０nmol／kg～約４００nmol／kg、約１０nmol／kg～約３００nmol／kg、約１０nmol／kg～約２００nmol／kg、約１０nmol／kg～約１５０nmol／kg、約１０nmol／kg～約１００nmol／kg、約１０nmol／kg～約９０nmol／kg、約１０nmol／kg～約８０nmol／kg、約１０nmol／kg～約７０nmol／kg、約１０nmol／kg～約６０nmol／kg、約１０nmol／kg～約５０nmol／kg、約１０nmol／kg～約４０nmol／kg、約１０nmol／kg～約３０nmol／kg、約１０nmol／kg～約２０nmol／kg、約２００nmol／kg～約９００nmol／kg、約２００nmol／kg～約８００nmol／kg、約２００nmol／kg～約７００nmol／kg、約２００nmol／kg～約６００nmol／kg、約２００nmol／kg～約５００nmol／kg、約２５０nmol／kg～約６００nmol／kg、約３００nmol／kg～約６００nmol／kg、約３００nmol／kg～約５００nmol／kgまたは約４００nmol／kg～約６００nmol／kg患者体重の範囲であり得る。これらの実施態様において、「kg」は患者体重キログラムである。

【0355】

上記用量実施態様の全てにおいて、用量漸増過程の任意の段階で投与される化合物またはその薬学的に許容される塩の「全用量」のパーセンテージは、化合物またはその薬学的に許容される塩の「全用量」の約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約２００％、約３００％、約４００％または約５００％であり得る。化合物またはその薬学的に許容される塩の「全用量」は、用量漸増過程で投与される用量として先の段落に記載した、化合物またはその薬学的に許容される塩の何れの用量でもよい。

【0356】

種々の他の実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩の用量は、例えば、約１nmol／kg～約１００００nmol／kg、約１nmol／kg～約５０００nmol／kg、約１nmol／kg～約３０００nmol／kg、約１nmol／kg～約２５００nmol／kg、約１nmol／kg～約２０００nmol／kg、約１nmol／kg～約１０００nmol／kg、約１nmol／kg～約９００nmol／kg、約１nmol／kg～約８００nmol／kg、約１nmol／kg～約７００nmol／kg、約１nmol／kg～約６００nmol／kg、約１nmol／kg～約５００nmol／kg、約１nmol／kg～約４００nmol／kg、約１nmol／kg～約３００nmol／kg、約１nmol／kg～約２００nmol／kg、約１nmol／kg～約１５０nmol／kg、約１nmol／kg～約１００nmol／kg、約１nmol／kg～約９０nmol／kg、約１nmol／kg～約８０nmol／kg、約１nmol／kg～約７０nmol／kg、約１nmol／kg～約６０nmol／kg、約１nmol／kg～約５０nmol／kg、約１nmol／kg～約４０nmol／kg、約１nmol／kg～約３０nmol／kgまたは約１nmol／kg～約２０nmol／kgの範囲であってよく、これらの実施態様において、「kg」は患者体重キログラムである。

【0357】

他の実施態様において、約２０μg／kg患者体重～約３mg／kg患者体重の化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に投与し得る。他の態様において、量は約０.２mg／kg患者体重～約０.４mg／kg患者体重であり得る。

【0358】

上記用量実施態様のいずれにおいても、単独用量または反復用量の化合物またはその薬学的に許容される塩が患者に投与され得る。

【0359】

ある実施態様において、標的化部分に結合した小分子リガンドをＣＡＲＴ細胞組成物前に患者に投与し得る。他の実施態様において、標的化部分に結合した小分子リガンドをＣＡＲＴ細胞組成物と同時に、異なる製剤または同じ製剤で患者に投与し得る。さらに他の実施態様において、標的化部分に結合した小分子リガンドをＣＡＲＴ細胞組成物後に患者に投与し得る。

【0360】

ある説明的態様において、ＣＡＲＴ細胞と標的化部分に結合した小分子の投与の間のタイミングは、使用するＣＡＲＴ細胞のタイプ、ＣＡＲの結合特異性、標的化部分および小分子リガンドの特性、癌の特性、患者における癌の部位、患者にＣＡＲＴ細胞および標的化部分に結合した小分子リガンドを投与するのに使用する手段および患者の健康状態、年齢および体重を含む因子により広範に変わり得る。ある態様において、標的化部分に結合した小分子リガンドをＣＡＲＴ細胞の投与前または後、例えば、約３時間、６時間、９時間、１２時間、１５時間、１８時間、２１時間、２４時間、２７時間、３０時間、３３時間、３６時間、３９時間、４２時間、４５時間、４８時間または５１時間または約０.５日、１日、１.５日、２日、２.５日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日またはそれ以上の時間以内に投与してよい。

【0361】

ある実施態様において、当分野で知られるあらゆる適用し得る投与スケジュールを、化合物またはその薬学的に許容される塩またはＣＡＲＴ細胞組成物の投与に使用し得る。ある態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩およびＣＡＲＴ細胞組成物について選択される投与スケジュールは、ＣＡＲＴ細胞組成物の細胞毒性制御およびＣＲＳ制御のために投与される化合物またはその薬学的に許容される塩の濃度およびＣＡＲＴ細胞の数を考慮に入れ得る。

【0362】

ある例示的実施態様において、１回目の用量漸増過程、２回目の用量漸増過程、３回目の用量漸増過程、４回目の用量漸増過程、５回目の用量漸増過程、６回目の用量漸増過程またはさらなる用量漸増過程の後に化合物またはその薬学的に許容される塩が投与されない期間がある。種々の説明的実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩が投与されない期間は、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間または１０日間であり得る。他の実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩が投与されない期間は６日間、７日間または８日間であり得るさらに他の実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩が投与されない期間は７日間であり得る。

【0363】

ある態様において、ＣＡＲＴ細胞の初回用量およびＣＡＲＴ細胞の第二回用量は、第１週の間に、例えば、月曜日および木曜日に、患者に投与されるこの実施態様において、次いで、化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の用量漸増過程を、第２週および第３週に行い得る。例えば、化合物またはその薬学的に許容される塩を連続していない３日で投与でき、連続していない３日は第２週の月曜日および木曜日および第３週の月曜日であり得る(図１の過程１参照)。この実施態様において、次いで、化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の用量漸増過程を、第４週および第５週に行い得る(図１の過程２参照)。例えば、化合物またはその薬学的に許容される塩を連続していない３日で投与でき、連続していない３日は第４週の月曜日および木曜日ならびに第５週の月曜日であり得る。この実施態様において、次いで、化合物またはその薬学的に許容される塩の３回目の用量漸増過程を、第６週および第７週に行い得る(図１の過程３参照)。例えば、化合物またはその薬学的に許容される塩を連続していない３日で投与でき、連続していない３日は第６週の月曜日および木曜日ならびに第７週の月曜日であり得る。他の実施態様において、後の用量漸増過程は類似の順番に従い得るまたは過程３を過程３終了約７日後に「コース２」として繰り返してよく、「コース３」開始まで化合物またはその薬学的に許容される塩でのさらなる処置は行わない(「コース２」の長さは、「コース」１について図１に示す時間の長さに基づく)。ある実施態様において、患者は、４コースの治療を受け得る。

【0364】

他の説明的実施態様において、癌を処置する方法が提供される。該方法は、ｉ)患者に少なくとも一用量のＣＡＲＴ細胞組成物を投与すること(ここでＣＡＲＴ細胞は標的化部分を指向するＣＡＲを含む)、ii)患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与すること(ここで、化合物はリンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンドを含む)を含み、ここで、該化合物またはその薬学的に許容される塩は１回目の用量漸増過程で投与され、重度ＣＲＳが１回目の用量漸増過程で生じたならば、該化合物またはその薬学的に許容される塩を低用量漸増過程を使用して投与し、ここで、該低用量漸増過程における化合物またはその薬学的に許容される塩の初回用量は、１回目の用量漸増過程で投与される該化合物またはその薬学的に許容される塩の初回用量より低い。この実施態様において、低用量漸増過程において、該化合物またはその薬学的に許容される塩が、連続していない３日で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量の約０.５％、約５％および約５０％で投与される。この実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩の全用量は約１０μg／kg～約５０μg／kg、約２０μg／kg～約４０μg／kg、約２５μg／kg～約３５μg／kgまたは約３０μg／kgであり得る。これらの実施態様において、「kg」は患者体重キログラムである。

【0365】

種々の関連実施態様において、リンパ球を、例えば、シトキサン、フルダラビンおよび／またはエトポシドを使用して、患者にＣＡＲＴ細胞組成物を投与する前に患者で枯渇でき、方法は、さらに、患者に血小板を投与すること、患者に濃厚赤血球を投与すること、患者に寒冷沈降物を投与すること、患者に静脈内免疫グロブリンを投与すること、カルシウムサプリメント、酸－クエン酸塩－デキストロースおよび／またはヘパリンで処置することおよび／または患者に抗菌療法を施すことを含むが、これらに限定されないさらなる過程を含み得る。ある実施態様において、リンパ球枯渇を、ＣＡＲＴ細胞投与少なくとも約２４時間前に行う。

【0366】

他の態様において、方法はＣＲＳモニタリング段階を含み得る。ある説明的態様において、１回目の用量漸増過程の間に患者にＣＲＳまたは神経毒性が観察されなければ、方法を２回目の用量漸増過程に進めてよい。２回目の用量漸増過程の間に患者にＣＲＳまたは神経毒性が観察されなければ、方法を３回目の用量漸増過程に進めてよい。３回目の用量漸増過程の間に患者にＣＲＳまたは神経毒性が観察されなければ、方法を４回目の用量漸増過程に進めてよい。４回目の用量漸増過程の間に患者にＣＲＳまたは神経毒性が観察されなければ、方法を５回目の用量漸増過程に進めてよい。５回目の用量漸増過程の間に患者にＣＲＳまたは神経毒性が観察されなければ、方法を６回目の用量漸増過程に進めてよいなどである。

【0367】

他の説明的実施態様において、用量漸増過程の何れかの間に低血圧を伴わない発熱(すなわち、非重度ＣＲＳ)が患者で確認され、神経毒性が患者で確認されなければ、化合物またはその薬学的に許容される塩のその後の全ての用量を、低血圧を伴わない発熱を引き起こした用量漸増過程レベルで患者に投与し得る。他の態様において、用量漸増過程の何れかの間にＣＲＳ(すなわち、重度ＣＲＳ)または神経毒性が患者で生じたら、化合物またはその薬学的に許容される塩のその後の全ての用量を、患者に重度ＣＲＳまたは神経毒性を引き起こした用量漸増過程レベルより低い用量漸増過程レベルで患者に投与し得る。

【0368】

ある態様において、重度ＣＲＳは、セツキシマブの使用を必要とするあらゆる毒性、何らかの≧グレード３自己免疫性毒性、ＣＡＲＴ細胞投与または化合物またはその薬学的に許容される塩投与に起因し得て、処置開始後２８日以内に起こる何らかの≧グレード３毒性を含み得るが、処置開始後の継続が４８時間未満である≦グレード４発熱、処置開始後の継続が２４時間である≦グレード３悪寒、処置開始後の継続が２４時間である≦グレード３咳嗽、処置開始後の継続が７日未満である≦グレード３トランスアミナーゼ、処置開始後の継続が４８時間未満である≦グレード３低血圧、処置開始後の継続が４８時間未満である≦グレード３ＣＲＳ、ベナドリルおよび／またはエピネフリンで解消可能なＤＭＳＯに関連する≦グレード３アナフィラキシーまたは経口またはIV麻薬治療で制御される≦グレード３疼痛は例外であり、または、さらに、継続が５日間までである≦グレード３悪寒、継続が２週間までである≦グレード３トランスアミナーゼ、継続が２週間までである≦グレード３ＣＲＳ、≦グレード４リンパ球減少症、≦グレード４白血球減少または経口またはIV麻薬治療で制御される継続が２週間までである≦グレード３疼痛を含む、ＣＡＲＴ細胞注入約３週間後に生じる毒性を含み得る。

【0369】

患者におけるＣＲＳを予防または阻止するある実施態様において、方法は、患者にフォレート、フォレートを含むコンジュゲート(ここで、フォレートを含むコンジュゲートは標的化部分を含まない)またはＣＡＲＴ細胞の活性化を阻止する薬物を投与する過程をさらに含み得る。この実施態様において、フォレート、フォレートを含むコンジュゲート(ここで、フォレートを含むコンジュゲートは標的化部分を含まない)またはＣＡＲＴ細胞の活性化を阻止する薬物の何れも、ここで「レスキュー剤」と称し得る。ある実施態様において、葉酸などのフォレートを、患者におけるＣＲＳの予防または阻止のために投与し得る。この実施態様において、フォレートは架橋(すなわち、リンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンド)と、腫瘍上の架橋の受容体の相互作用を阻害し、腫瘍溶解を阻止し、患者におけるＣＲＳを予防または阻止する。

【0370】

ある実施態様において、架橋の腫瘍への結合の阻害剤として投与されるフォレートは、例えば、葉酸、葉酸アナログまたは他の葉酸受容体結合分子であり得る。種々の実施態様において、使用され得るフォレートのアナログはフォリン酸、プテロポリグルタミン酸および葉酸受容体結合プテリジン、例えばテトラヒドロプテリン、ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸およびそのデアザおよびジデアザアナログを含む。用語「デアザ」および「ジデアザ」アナログは、天然に存在する葉酸構造の１または２窒素原子の代わりに炭素原子を有する、当分野で認識されるアナログをいう。例えば、デアザアナログは１－デアザ、３－デアザ、５－デアザ、８－デアザおよび１０－デアザアナログを含む。ジデアザアナログは例えば、１,５－ジデアザ、５,１０－ジデアザ、８,１０－ジデアザおよび５,８－ジデアザアナログを含む。前記葉酸アナログは、葉酸受容体への結合能を反映して、慣用的に「フォレート」と称される。他の葉酸受容体結合アナログは、アミノプテリン、アメトプテリン(メトトレキサート)、Ｎ１０－メチルフォレート、２－デアミノ－ヒドロキシフォレート、デアザアナログ、例えば１－デアザメトプテリンまたは３－デアザメトプテリンおよび３’,５’－ジクロロ－４－アミノ－４－デオキシ－Ｎ１０－メチルプテロイルグルタミン酸(ジクロロメトトレキサート)を含む。

【0371】

他の実施態様において、架橋の腫瘍への結合の阻害剤として投与されるフォレートは、式

【化16】

【0372】

さらに他の実施態様において、フォレートを含むコンジュゲートを投与して、患者におけるサイトカイン放出症候群(ＣＲＳ)を阻止または予防できる。ＣＲＳは、体重減少、高熱、肺浮腫および危険な血圧低下を含むが、これらに限定されない有害作用を患者で引き起こし得る。

【0373】

この実施態様において、フォレートを含むコンジュゲートは標的化部分を含まず、故に、コンジュゲートは架橋と腫瘍の相互作用を阻害して、腫瘍溶解を予防し、患者におけるＣＲＳを低減する。この実施態様において、フォレートを含むコンジュゲートのフォレート部分は、標的化部分を含まない化学部分に結合した、先の段落に記載するフォレートのいずれかを含み得る。ある態様において、フォレートを含むコンジュゲートは、標的化部分を含まない１以上のアミノ酸に結合したフォレートを含み得る。実例として、フォレートを含むコンジュゲートは式

【化17】

を有し得る。

【0374】

この化合物は、「ＥＣ９２３」とも称される。これらの実施態様において、フォレートまたはフォレートを含むコンジュゲートを、リンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンドに対してフォレートまたはフォレートを含むコンジュゲートが１０倍過剰、１００倍過剰、２００倍過剰、３００倍過剰、４００倍過剰、５００倍過剰、６００倍過剰、７００倍過剰、８００倍過剰、９００倍過剰、１０００倍過剰または１０,０００倍過剰のように、架橋(すなわち、リンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンド)に対してモル過剰で患者に投与し得る。架橋と腫瘍の相互作用を阻害するのに必要なリンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンドの量に対するフォレートまたはフォレートを含むコンジュゲートの量は、当業者により決定され得る。

【0375】

他の実施態様において、ＣＡＲＴ細胞の活性化を阻害する薬剤を、ＣＡＲＴ細胞活性化を阻害し、患者におけるＣＲＳを阻止または予防するために、患者に投与し得る。ある態様において、本薬剤を、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤(例えば、ダサチニブ)、ＰＩ３キナーゼ阻害剤(例えば、ＧＤＣ０９８０)、トシリズマブ、ＩＬ－２誘導型Ｔ細胞キナーゼ阻害剤(例えば、ＢＭＳ－５０９７４４)、ＪＡＫ阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、ＳＩＰアゴニスト(例えばシポニモドおよびオザニモド)および架橋へのＣＡＲＴ細胞結合を遮断するが、癌に結合しない薬剤(例えば、フルオレセインアミン、ＦＩＴＣまたはナトリウムフルオレセイン)からなる群から選択される。生理学的条件または、例えば、生理学的ｐＨの緩衝液でＦＩＴＣ(すなわち、フルオレセイン)は塩(例えば、ナトリウムフルオレセイン)またはその非塩形であり得ることは、当業者には理解される。従って、ある実施態様において、フルオレセインが患者に投与されるとき、塩形態(例えば、ナトリウムフルオレセイン)と非塩形態の間で平衡であり得る。他の実施態様において、ＣＡＲＴ細胞の活性化を阻害するレスキュー剤は、式

【化18】

の化合物であり得る。この化合物は「ＥＣ２３１９」とも称される。

【0376】

種々の実施態様において、レスキュー剤は、例えば、０.１ml、０.２ml、０.３ml、０.４ml、０.５ml、０.６ml、０.７ml、０.８ml、０.９ml、１ml、２ml、３ml、４ml、５ml、１０ml、１００mlまたは１０００mlを含む何れかの適切な体積で、約.００１nM～約１００mM、約.０１nM～約１００mM、約１nM～約１００mM、約１０nM～約１００mM、約５０nM～約１００mMまたは約１００nM～約１００mMの濃度で投与され得る。他の実施態様において、レスキュー剤は、約.０１～約３００μmole／kg患者体重、約.０６～約１００μmole／kg患者体重、約.０６～約９０μmole／kg患者体重、約.０６～約８０μmole／kg患者体重、約.０６～約７０μmole／kg患者体重、約.０６～約６０μmole／kg患者体重、約.０６～約５０μmole／kg患者体重、約.０６～約４０μmole／kg患者体重、約.０６～約３０μmole／kg患者体重、約.０６～約２０μmole／kg患者体重、約.０６～約１０μmole／kg患者体重、約.０６～約８μmole／kg患者体重または約.０６～約６μmole／kg患者体重の用量で投与され得る。

【0377】

これらの実施態様において、レスキュー剤を、リンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンドに対してレスキュー剤が約１０倍過剰、約２０倍過剰、約３０倍過剰、約４０倍過剰、約５０倍過剰、約６０倍過剰、約７０倍過剰、約８０倍過剰、約９０倍過剰、約１００倍過剰、約２００倍過剰、約３００倍過剰、約４００倍過剰、約５００倍過剰、約６００倍過剰、約７００倍過剰、約８００倍過剰、約９００倍過剰、約１０００倍過剰または約１０,０００倍過剰のように化合物またはその薬学的に許容される塩(すなわち、リンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンド)に対してモル過剰で患者に投与し得る。化合物またはその薬学的に許容される塩と腫瘍および／またはＣＡＲＴ細胞の相互作用の阻害に必要なリンカーにより標的化部分に結合した小分子リガンドの量に対するレスキュー剤の量は、当業者により決定され得る。

【0378】

他の実施態様において、フォレート、フォレートを含むコンジュゲート(ここで、フォレートを含むコンジュゲートは標的化部分を含まない)またはＣＡＲＴ細胞の活性化を阻害する薬剤を１回を超えて患者に投与し得る。

【0379】

ここに記載する‘レスキュー剤’実施態様において、フォレート、フォレートを含むコンジュゲート(ここで、フォレートを含むコンジュゲートは標的化部分を含まない)またはＣＡＲＴ細胞の活性化を阻害する薬剤を化合物またはその薬学的に許容される塩の前および／または後に患者に投与し得る。他の態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩を、フォレート、フォレートを含むコンジュゲート(ここで、フォレートを含むコンジュゲートは標的化部分を含まない)またはＣＡＲＴ細胞の活性化を阻害する薬剤の投与の前および後に投与し得る。この実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩の後の投与は、ＣＡＲＴ細胞活性化および患者におけるサイトカインレベル増加を引き起こし得る。

【0380】

他の実施態様において、フォレート、フォレートを含むコンジュゲート(ここで、フォレートを含むコンジュゲートは標的化部分を含まない)またはＣＡＲＴ細胞の活性化を阻害する薬剤の投与は、患者におけるサイトカインレベルの減少を引き起こし得る。他の実施態様において、サイトカインレベルの減少がほぼ未処置患者のサイトカインレベルまでの減少である。他の実施態様において、ＣＲＳグレードが１、２、３または４に達したときまたはＣＲＳグレードが３または４に達したとき、患者にＣＡＲＴ細胞の活性化を阻害する薬剤が投与される。

【0381】

フォレートがリンカーにより標的化部分に結合したリガンドであるここに記載する実施態様のいずれにおいても、患者に、ここに記載する方法での処置前フォレート欠損食事を課してよくまたは患者に食餌中のフォレートを投与してよい。患者がフォレートを投与される実施態様において、用量は、例えば、約５０nmol／kg～約３０００nmol／kg患者体重、約５０nmol／kg～約２０００nmol／kg、約５０nmol／kg～約１０００nmol／kg、約５０nmol／kg～約９００nmol／kg、約５０nmol／kg～約８００nmol／kg、約５０nmol／kg～約７００nmol／kg、約５０nmol／kg～約６００nmol／kg、約５０nmol／kg～約５００nmol／kg、約５０nmol／kg～約４００nmol／kg、約５０nmol／kg～約３００nmol／kg、約５０nmol／kg～約２００nmol／kg、約５０nmol／kg～約１００nmol／kg、約１００nmol／kg～約３００nmol／kg、約１００nmol／kg～約５００nmol／kg、約１００nmol／kg～約１０００nmol／kg、約１００nmol／kg～約２０００nmol／kg患者体重の範囲であり得る。他の実施態様において、用量は約１００nmol／kg、約１５０nmol／kg、約２００nmol／kg、約２５０nmol／kg、約３００nmol／kg、約３５０nmol／kg、約４００nmol／kg、約４５０nmol／kg、約５００nmol／kg、約６００nmol／kg、約７００nmol／kg、約８００nmol／kg、約９００nmol／kg、約１０００nmol／kg、約２０００nmol／kgまたは約３０００nmol／kg患者体重であり得る。これらの実施態様において、「kg」は患者体重キログラムである。ある態様において、フォレートを、例えば、連日、毎週、週２回、週３回または、フォレートの投与に何らかの適当なレジメンを使用して投与し得る。

【0382】

ここに記載する種々の実施態様において、ＣＡＲＴ細胞は、ＣＡＲＴ細胞投与後、最長約１０日間、最長約１５日間、最長約２０日間、最長約２５日間、最長約３０日間、最長約３５日間、最長約４０日間、最長約４５日間、最長約５０日間、最長約５５日間、最長約６０日間、最長約６５日間、最長約７０日間、最長約７５日間または最長約８０日間、循環ＣＡＲＴ細胞数が高いままで維持され得る。

【0383】

ここに記載する種々の実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩の半数値効果濃度(ＥＣ_５０)は、約１pM～約２nM、約１pM～約５nM、約１pM～約１０nM、約１pM～約２０nM、約１pM～約３０nM、約１pM～約４０nM、約１pM～約５０nM、約１pM～約６０nM、約１pM～約７０nM、約１pM～約８０nM、約１pM～約９０nM、約１pM～約１００nM、約１pM～約２００nM、約１pM～約３００nM、約１pM～約４００nM、約１pM～約５００nM、約１pM～約６００nM、約１pM～約７００nM、約１pM～約８００nM、約１pM～約９００nM、約１pM～約１nM、約１pM～約９００pM、約１pM～約８００pM、約１pM～約７００pM、約１pM～約６００pM、約１pM～約５００pM、約１pM～約４００pM、約１pM～約３００pM、約１pM～約２００pM、約１pM～約１００pM、約１pM～約９０pM、約１pM～約８０pM、約１pM～約７０pM、約１pM～約６０pM、約１pM～約５０pM、約１pM～約４０pM、約１pM～約３０pM、約１pM～約２０pM、約１pM～約１０pMまたは約１pM～約５pMであり得る。

【0384】

ここに記載する種々の実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩のＣＡＲＴ細胞への結合のＫｄは、約１nM～約１００nM、約１nM～約２００nM、約１nM～約３００nM、約１nM～約４００nM、約１nM～約５００nM、約１nM～約６００nM、約１nM～約７００nM、約１nM～約８００nM、約１nM～約９００nM、約１００nM～約５００nM、約１００nM～約４００nM、約１００nM～約３００nM、約１００nM～約２００nM、約１００nM～約１５０nMまたは約１３０nMであり得る。

【0385】

ここに記載する種々の実施態様において、ＥＧＦＲｔ選別または未選別ＣＡＲＴ細胞が使用され得る。他の実施態様において、低分化プロファイルのＣＡＲＴ細胞の「臨床模写株」バッチが使用され得る。他の実施態様において、ＣＡＲＴ細胞の「研究バッチ」が使用され得る。「臨床模写株」バッチ(約３９％ＥＧＦＲｔ＋)は、約６６％Ｔ_ＳＣＭおよび約３２％Ｔ_ＣＭでＣＤ４＋サブセットならびに約９５％Ｔ_ＳＣＭおよび約３％Ｔ_ＣＭでＣＤ８サブセットを含み得る。研究バッチ(約２３％ＥＧＦＲｔ＋)は、約３２％Ｔ_ＳＣＭ、約５３％Ｔ_ＣＭ、約１１％Ｔ_ＥＭおよび約３.７％Ｔ_ＥＦＦでＣＤ４サブセットならびに約４４％Ｔ_ＳＣＭ、約０.２８％Ｔ_ＣＭ、約３.４％Ｔ_ＥＭおよび約５２％Ｔ_ＥＦＦでＣＤ８サブセットを含み得る。

【0386】

ここに記載する種々の説明的実施態様において、化合物またはその薬学的に許容される塩を、ＣＡＲＴ細胞の約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日または約１０日前または後またはＣＡＲＴ細胞の前または後の何れかの適切な日に患者に投与し得る。

【0387】

ここに記載する方法のある実施態様において、癌は、患者に化合物またはその薬学的に許容される塩を投与する前または患者にＣＡＲＴ細胞組成物を投与する前に造影される。ある説明的実施態様において、造影をＰＥＴ造影により行う。他の説明的実施態様において、造影をＭＲＩ造影またはＳＰＥＣＴ／ＣＴ造影により行う。造影方法は、当分野で知られる任意の適当な造影方法であり得る。ある実施態様において、造影方法は、患者が葉酸受容体発現について陽性であるかを決定するために、ここに記載するが、ここに記載する造影のタイプに適当な造影剤に結合した、小分子リガンドの使用を含み得る。他の実施態様において、免疫組織化学分析を、この目的のために使用し得る。

【0388】

ここに記載する実施態様のいずれにおいても、患者でオフターゲット毒性をもたらすサイトカイン放出は、癌に対するＣＡＲＴ細胞毒性が生じても、患者において生じ得ない。ここに記載する何れの実施態様においても、オフターゲット組織毒性は、癌に対するＣＡＲＴ細胞毒性が生じても、患者において生じ得ない。ここに記載する何れの実施態様においても、癌は腫瘍を含み得て、腫瘍サイズは、オフターゲット毒性が生じなくても、患者で減少される。ここに記載する実施態様の何れかにおいて、ＣＲＳは低減または予防され得て、方法は患者における腫瘍体積減少をもたらし得る。ここに記載する何れの実施態様においても、ＣＲＳによる体重減少およびＣＡＲＴ細胞疲弊は低減または予防され得る。ここに記載する何れの実施態様においても、癌は腫瘍を含み得て、腫瘍に対する完全応答が得られ得る。

【実施例】

【0389】

実施例１
ＦＩＴＣ－フォレートの合成

【化19】

フォレート－γ－エチレンジアミンを、テトラメチルグアニジンおよびジイソプロピルアミンの存在下、無水ジメチルスルホキシド(ＤＭＦ)中でフルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)異性体Ｉ(Sigma-Aldrich)とカップリングさせた。粗生成物をXterra RP18分取ＨＰＬＣカラム(Waters)に負荷し、９９％５mM ナトリウムリン酸塩(移動相Ａ、ｐＨ７.４)および１％アセトニトリル(移動相Ｂ)から始まり、９０％Ａおよび１０％Ｂに２０mL／分の流速で１０分で達する勾配条件で溶出した。これら条件下、ＦＩＴＣ－フォレート主ピークは、一般に２７～５０分で溶出した。ＦＩＴＣ－フォレートフラクションの品質を、ＵＶ検出器を備えた分析的逆相ＨＰＬＣでモニターした。９８.０％純度(ＬＣＭＳ)を超えるフラクションを凍結乾燥して、最終ＦＩＴＣ－フォレート生成物を得た。当分野で知られるとおり、この構造の化合物はＥＣ１７とも称される。

【0390】

実施例２
ＦＩＴＣ－ＰＥＧ１２－フォレートの合成

【化20】

汎用性ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)Nova Tag^TM樹脂(０.２ｇ)をペプチド合成器に加え、イソプロピルアルコール(ｉ－ＰｒＯＨ)(３×１０mL)およびジメチルホルムアミド(ＤＭＦ、３×１０mL)で洗浄した。９－フルオレニルメトキシカルボニル(Ｆｍｏｃ)脱保護をＤＭＦ中２０％ピペリジン(３×１０mL)を使用して実施した。反応進行を追跡するために、カイザーテストを実施した。次いで、合成器にＦｍｏｃ－Ｌ－グルタミン酸５－ｔｅｒｔ－ブチルエステル(Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－(Ｏ－ｔ－Ｂｕ)－ＯＨ)(２３.５mg)のＤＭＦ溶液、Ｎ,Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン(ｉ－Ｐｒ_２ＮＥｔ)(４当量)およびベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩(ＰｙＢＯＰ)(２当量)を加えた。Ｆｍｏｃ脱保護をＤＭＦ中２０％ピペリジン(３×１０mL)を使用して実施した。次いで、合成器にＮ^１０－ＴＦＡ－Ｐｔｅ－ＯＨ(２２.５mg)、ＤＭＦ、ｉ－Ｐｒ_２ＮＥｔ(４当量)およびＰｙＢＯＰ(２当量)の溶液を加えた。アルゴンを２時間通気し、樹脂をＤＭＦ(３×３mL)およびｉ－ＰｒＯＨ(３×３mL)で洗浄した。ジクロロメタン(ＤＣＭ)で樹脂を膨潤させた後、１Ｍヒドロキシベンゾトリアゾール(ＨＯＢＴ)のＤＣＭ／トリフルオロエタン(ＴＦＥ)(１：１)(２×３mL)溶液を加えた。アルゴンを１時間通気し、溶媒を除去し、樹脂をＤＭＦ(３×３mL)およびｉ－ＰｒＯＨ(３×３mL)で洗浄した。ＤＭＦで樹脂を膨潤させた後、Ｆｍｏｃ－ＮＨ－(ＰＥＧ)_１２－ＣＯＯＨ(４６.３mg)のＤＭＦ溶液、ｉ－Ｐｒ_２ＮＥｔ(４当量)およびＰｙＢＯＰ(２当量)を加えた。アルゴンを２時間通気し、樹脂をＤＭＦ(３×３mL)およびｉ－ＰｒＯＨ(３×３mL)で洗浄した。Ｆｍｏｃ脱保護をＤＭＦ中２０％ピペリジン(３×１０mL)を使用して実施した。反応進行を追跡するために、カイザーテストを実施した。次いで容器にＦＩＴＣ(Life Technologies ２１.４mg)のＤＭＦ溶液およびｉ－Ｐｒ_２ＮＥｔ(４当量)を入れ、次いでアルゴンを２時間通気し、樹脂をＤＭＦ(３×３mL)およびｉ－ＰｒＯＨ(３×３mL)で洗浄した。次いで容器にＤＭＦ中２％ＮＨ_２ＮＨ_２(２×２mL)を加えた。最終化合物をＴＦＡ：Ｈ_２Ｏ：トリイソプロピルシラン(ＴＩＳ)(９５：２.５：２.５)(開裂溶液)を使用して樹脂から開裂させ、減圧下濃縮した。濃縮生成物をＥｔ_２Ｏで沈殿させ、減圧下乾燥させた。粗製生成物を分取ＲＰ－ＨＰＬＣ(移動相：Ａ＝１０mM 酢酸アンモニウムｐＨ＝７、Ｂ＝ＡＣＮ；方法：０％Ｂ～３０％Ｂを、１３mL／分で３０分間)を使用して精製した。精製フラクションを集め、凍結乾燥させ、ＦＩＴＣ－ＰＥＧ１２－フォレートを得た。

【0391】

実施例３
ＦＩＴＣ－ＰＥＧ２０－フォレートの合成

【化21】

エチレンジアミン、ポリマー結合(２００～４００メッシュ)樹脂(５０mg)をペプチド合成器に加え、ＤＣＭ(３mL)、続いてＤＭＦ(３mL)で膨潤させた。次いで、容器にＤＭＦ中Ｆｍｏｃ－ＰＥＧ_２０－ＣＯＯＨ溶液(１３１mg、１.０当量)、ｉ－Ｐｒ_２ＮＥｔ(６.０当量)およびＰｙＢＯＰ(４.０当量)を加えた。アルゴンを６時間通気し、カップリング溶液を廃棄し、樹脂をＤＭＦ(３×１０mL)およびｉ－ＰｒＯＨ(３×１０mL)で洗浄した。反応進行を追跡するために、カイザーテストを実施した。Ｆｍｏｃ脱保護をＤＭＦ中２０％ピペリジン(３×１０mL)を使用して行い、その後各アミノ酸カップリングをした。上記の一連をＦｍｏｃ－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕ(７２mg、２.０当量)およびＴｆａ.プテロイン酸(４１mg、１.２当量)カップリング工程の反応を完了させるために繰り返した。樹脂をＤＭＦ中２％ヒドラジン３×１０mL(５分)で洗浄して、プテロイン酸のトリフルオロ－アセチル保護基を開裂させ、ｉ－ＰｒＯＨ(３×１０mL)、続いてＤＭＦ(３×１０mL)で洗浄した。樹脂をアルゴン下３０分間乾燥させた。フォレート－ペプチドを開裂溶液を使用して、樹脂から開裂した。１０mLの開裂混合物を加え、アルゴンを１.５時間通気した。開裂混合物を新たなフラスコに排出した。樹脂をさらなる開裂混合物で３回洗浄した。合わせた混合物を、小体積(約５mL)まで減圧下濃縮し、エチルエーテルで沈殿させた。
沈殿を遠心分離で回収し、エチルエーテル(３回)で洗浄し、高真空下で乾燥させた。乾燥フォレート－ＰＥＧ_２０－ＥＤＡ(１.０当量)を、ＤＭＳＯおよびＤＩＰＥＡ中のＦＩＴＣ(５０mg、１.５当量)で、室温で処理した。ＬＣＭＳにより反応の進行をモニターした。８時間後、出発物質は消費されて、生成物を得た。粗製反応混合物を分取ＨＰＬＣ(移動相Ａ＝１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７；有機相Ｂ＝アセトニトリル；方法：０％Ｂ～３０％Ｂを、１３mL／分で３５分間)で精製して、ＦＩＴＣ－ＰＥＧ２０－フォレートを６０％収率で得た。

【0392】

実施例４
ＦＩＴＣ－ＰＥＧ１０８－フォレートの合成

【化22】

エチレンジアミン、ポリマー結合(２００～４００メッシュ)樹脂(５０mg)をペプチド合成器に加え、ＤＣＭ(３mL)、続いてＤＭＦ(３mL)で膨潤させた。次いで、合成器にＤＭＦ中Ｆｍｏｃ－ＰＥＧ_３６－ＣＯＯＨ溶液(１６１mg、１.０当量)、ｉ－Ｐｒ_２ＮＥｔ(６.０当量)およびＰｙＢＯＰ(４.０当量)を加えた。アルゴンを６時間通気し、カップリング溶液を廃棄し、樹脂をＤＭＦ(３×１０mL)およびｉ－ＰｒＯＨ(３×１０mL)で洗浄した。反応進行を追跡するために、カイザーテストを実施した。Ｆｍｏｃ脱保護をＤＭＦ中２０％ピペリジン(３×１０mL)を使用して行い、その後各アミノ酸カップリングをした。上記の一連を２ＸＦｍｏｃ－ＰＥＧ_３６－ＣＯＯＨ(１６１mg、１.０当量)、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕ(７２mg、２.０当量)およびＴｆａ.プテロイン酸(４１.０mg、１.２当量)カップリング工程の反応を完了させるために繰り返した。最後に、樹脂をＤＭＦ中２％ヒドラジン３×１０mL(５分)で洗浄して、プテロイン酸のトリフルオロ－アセチル保護基を開裂させ、ｉ－ＰｒＯＨ(３×１０mL)、続いてＤＭＦ(３×１０mL)で洗浄した。樹脂をアルゴン下３０分間乾燥させた。フォレート－ペプチドを開裂溶液を使用して、樹脂から開裂した。１０mLの開裂混合物を加え、アルゴンを１.５時間通気した。開裂混合物を清潔なフラスコに排出した。樹脂をさらなる開裂混合物で３回洗浄した。合わせた混合物を、小体積(約５mL)まで減圧下濃縮し、エチルエーテルで沈殿させた。
沈殿を遠心分離で回収し、エチルエーテル(３×)で洗浄し、高真空下で乾燥させた。乾燥フォレート－ＰＥＧ_１０８－ＥＤＡ(１.０当量)を、ＤＭＳＯおよびＤＩＰＥＡ中のＦＩＴＣ(５０mg、１.５当量)で、室温で処理した。ＬＣＭＳにより反応進行をモニターした。Ａｆｔｅｒ１０ｈ出発物質は消費されて、生成物を得た。粗製反応混合物を分取ＨＰＬＣ(移動相Ａ＝１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７；有機相Ｂ＝アセトニトリル；方法：０％Ｂ～３０％Ｂを、１３mL／分で３５分間)で精製して、ＦＩＴＣ－ＰＥＧ１０８－フォレートを６４％収率で得た。

【0393】

実施例５
ＦＩＴＣ－ＤＵＰＡの合成

【化23】

ＤＵＰＡ－ＦＩＴＣを、下記のとおり固相合成法により合成した。汎用性Nova Tag^TM樹脂(５０mg、０.５３mM)をＤＣＭ(３mL)、続いてＤＭＦ(３mL)で膨潤させた。ＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液(３×３mL)を樹脂に加え、アルゴンを５分間通気した。樹脂をＤＭＦ(３×３mL)およびイソプロピルアルコール(ｉ－ＰｒＯＨ、３×３mL)で洗浄した。ＤＭＦで樹脂を膨潤させた後、ＤＵＰＡ－(ＯｔＢｕ)－ＯＨ(１.５当量)、ＨＡＴＵ(２.５当量)およびｉ－Ｐｒ_２ＮＥｔ(４.０当量)のＤＭＦ溶液を加えた。アルゴンを２時間通気し、樹脂をＤＭＦ(３×３mL)およびｉ－ＰｒＯＨ(３×３mL)で洗浄した。ＤＣＭで樹脂を膨潤させた後、１ＭＨＯＢｔのＤＣＭ／ＴＦＥ(１：１)(２×３mL)溶液を加えた。アルゴンを１時間通気し、溶媒を除去し、樹脂をＤＭＦ(３×３mL)およびｉ－ＰｒＯＨ(３×３mL)で洗浄した。ＤＭＦで樹脂を膨潤させた後、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ(２.５当量)、ＨＡＴＵ(２.５当量)およびＤＩＰＥＡ(４.０当量)のＤＭＦ溶液を加えた。アルゴンを２時間通気し、樹脂をＤＭＦ(３×３mL)およびｉ－ＰｒＯＨ(３×３mL)で洗浄した。上記の一連を８－アミノオクタン酸およびフルオレセインイソチオシアネートまたはローダミンＢイソチオシアネートの付加のために、さらに２カップリング工程繰り返した。最終化合物を開裂溶液を使用して、樹脂から開裂し、減圧下濃縮した。濃縮生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、減圧下乾燥させた。粗製生成物を分取ＲＰ－ＨＰＬＣ[λ＝４８８nm；溶媒勾配：１％Ｂ～８０％Ｂを２５分間、８０％Ｂ洗浄３０分間実施；Ａ＝１０mM ＮＨ_４ＯＡｃ、ｐＨ＝７；Ｂ＝アセトニトリル(ＡＣＮ)]を使用して精製した。ＡＣＮを減圧下除去し、精製フラクションを凍結乾燥させて、ＦＩＴＣ－ＤＵＰＡを帯褐色－橙色固体として得た。ＲＰ－ＨＰＬＣ：ｔＲ＝８.０分(Ａ＝１０mM ＮＨ_４ＯＡｃ、ｐＨ＝７.０；Ｂ＝ＡＣＮ、溶媒勾配：１％Ｂ～５０％Ｂを１０分間、８０％Ｂ洗浄１５分間実施)。¹H NMR (DMSO-d₆/D₂O):δ 0.98-1.27 (ms, 9H);1.45 (b, 3H);1.68-1.85 (ms, 11H);2.03 (m, 8H);2.6-3.44 (ms, 12H);3.82 (b, 2H);4.35 (m, 1H);6.53 (d, J=8.1 Hz, 2H), 6.61 (dd, J=5.3, 3.5 Hz, 2H);6.64 (s, 2H);7.05 (d, J=8.2 Hz, 2H), 7.19 (m, 5H);7.76 (d, J=8.0 Hz, 1H);8.38 (s, 1H). HRMS (ESI)(m/z):(M+H)⁺ C₅₁H₅₉N₇O₁₅Sの計算値1040.3712, 実測値, 1040.3702. UV/vis:λ max=491nm

【0394】

実施例６
ＦＩＴＣ－ＰＥＧ１２－ＤＵＰＡの合成

【化24】

１,２－ジアミノエタントリチル樹脂(０.０２５ｇ)をペプチド合成器に加え、ｉ－ＰｒＯＨ(３×１０mL)、続いてＤＭＦ(３×１０mL)で洗浄した。次いで、容器にＦｍｏｃ－ＮＨ－(ＰＥＧ)_１２－ＣＯＯＨ(４２.８mg)のＤＭＦ溶液、ｉ－Ｐｒ_２ＮＥｔ(２.５当量)およびＰｙＢＯＰ(２.５当量)を加えた。得られた溶液にＡｒを１時間通気し、カップリング溶液を廃棄し、樹脂ＤＭＦ(３×１０mL)およびｉ－ＰｒＯＨ(３×１０mL)で洗浄した。反応進行を追跡するために、カイザーテストを実施した。Ｆｍｏｃ脱保護をＤＭＦ中２０％ピペリジン(３×１０mL)を使用して実施した。この工程を全カップリング工程が完了するまで繰り返した(２×１.５当量のＦｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨおよび１.５当量の８－アミノオクタン酸および１.２当量のＤＵＰＡを、各カップリング工程の各々で使用した)。ＤＵＰＡカップリング後、樹脂をＤＭＦ(３×１０mL)およびｉ－ＰｒＯＨ(３×１０mL)で洗浄し、減圧下乾燥させた。ペプチドを、、ペプチド合成器中で開裂溶液を使用して、樹脂から開裂させた。１５mLの開裂溶液をペプチド合成器に加え、反応物をＡｒで１５分間通気した。樹脂をさらに２回１０mL量の開裂溶液で、各５分処理した。開裂混合物を約５mLに濃縮し、エチルエーテルで沈殿させた。沈殿を遠心分離で回収しエチルエーテル(３×)で洗浄し、高減圧下乾燥させ、粗製物質を回収した。撹拌中の粗製ＤＵＰＡ－(ＰＥＧ)_１２－ＥＤＡ(１０mg)およびＦＩＴＣ(５.６mg)のジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ、１mL)溶液に、室温でｉ－Ｐｒ_２ＮＥｔ(５当量)を加え、アルゴン下６時間撹拌した。反応をＬＣＭＳでモニターし、分取ＨＰＬＣ(移動相：Ａ＝１０mM 酢酸アンモニウムｐＨ＝７、Ｂ＝ＡＣＮ；方法：０％Ｂ～５０％Ｂを、１３mL／分で３０分間)で精製した。精製フラクションを集め、凍結乾燥させ、ＦＩＴＣ－ＰＥＧ１２－ＤＵＰＡを得た。

【0395】

実施例７
ＦＩＴＣ－ＰＥＧ１１－ＮＫ１の合成

【化25】

撹拌中のＮＫ－１(０.０２ｇ、０.０４３３mmol、１.０当量)、Ｏ－(２－アミノエチル)－Ｏ’－[２－(Ｂｏｃ－アミノ)エチル]デカエチレングリコール(ＢｏｃＮＨ－ＰＥＧ_１１－ＮＨ_２)(Sigma、０.０３３６ｇ、０.０５２１mmol、１.２当量)、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩(ＰｙＢＯＰ)(０.０２７ｇ、０.０５２１mmol、１.２当量)の乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２溶液に、室温でアルゴン下、Ｎ,Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン(ＤＩＰＥＡ)(０.０７６mL、０.４３３８mmol、１０当量)を加えた。反応進行をＬＣＭＳでモニターし、分取ＲＰ－ＨＰＬＣ(Waters、XBridge^TM Prep C18、５μm；１９×１００mmカラム、移動相Ａ＝２０mM 酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ７、Ｂ＝アセトニトリル、勾配１０～１００％Ｂを３０分間、１３mL／分、λ＝２２０nm、２５４nm)で精製した。精製フラクションを取得し、全有機溶媒を蒸発させ、サンプルを４８時間凍結乾燥させて、ＮＫ１－ＰＥＧ_１１－ＮＨＢｏｃを得た。収量：４０.１３mg(９７％)。ＮＫ１－ＰＥＧ_１１－ＮＨＢｏｃ(０.０１６５ｇ、０.０１５mmol)の乾燥ＤＣＭ溶液にトリフルオロ酢酸(ＴＦＡ、２０当量)を加え、反応混合物を４時間、ｒ.ｔ.で撹拌した。過剰ＴＦＡを除去し、残存溶液を水で希釈し、ＣＨ_２Ｃｌ_２(３×５mL)を使用して抽出した。合わせた有機層を塩水で洗浄し、乾燥させ(Ｎａ_２ＳＯ_４)、濃縮した。得られた残留物を減圧下乾燥させ、さらに精製することなく次工程で使用した。撹拌中のＮＫ１－ＰＥＧ_１１－ＮＨ_２(０.００８ｇ、０.００８１mmol、１.０当量)、フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)(Sigma、０.００３７ｇ、０.００９７mmol、１.２当量)の乾燥ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ、０.３mL)溶液に、室温でアルゴン下、ジイソプロピルエチルアミン(０.００２８mL、０.０１６２mmol、２.０当量)を加えた。反応進行をＬＣＭＳでモニターし、生成物を分取ＲＰ－ＨＰＬＣ(Waters、XBridge^TM Prep C18、５μm；１９×１００mmカラム、移動相Ａ＝２０mM 酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ７、Ｂ＝アセトニトリル、勾配１０～１００％Ｂを３０分間、１３mL／分、λ＝２８０nm)で精製した。純粋フラクションを取得し、全有機溶媒を蒸発させ、サンプルを４８時間凍結乾燥させて、ＦＩＴＣ－ＰＥＧ１１－ＮＫ１を８.５４mg(７７％)の収量で得た。
＊注：ＮＫ－１化合物を文献法を使用して製造した塩基性リガンドから出発する２工程法により合成した(DESIGN AND DEVELOPMENT OF NEUROKININ-1 RECEPTOR-BINDING AGENT DELIVERY CONJUGATES、出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／４４２２９；引用により本明細書に包含。)。

【0396】

実施例８
ＦＩＴＣ－ＰＥＧ２－ＣＡ９の合成

【化26】

ＣＡ９リガンド(５３.６mg)を、テフロン磁気撹拌棒を使用して、５０mL丸底フラスコ中、ＤＭＦ(２～３mL)に溶解した。空気を減圧と窒素ガスでの置換を使用して除去し、この操作を３サイクル行った。丸底フラスコを窒素ガス下に維持した。このフラスコに、２８.９mgのＮ－(３－ジメチルアミノプロピル)－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)、続いて２１.６mg １－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(ＨＯＢｔ)および１８.９μLのＢｏｃ－ＰＥＧ_２－ＮＨ_２(Sigma Aldrich)を加えた。５.４μLのトリエチルアミン(ＴＥＡ)を加え、反応物を一夜撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣを使用して精製し、ＵＨＰＬＣ－ＭＳ(標的ｍ／ｚ８３１)で確認した。アセトニトリルを高真空回転蒸発を使用して除去し、生成物を凍結乾燥させた。化合物を１：１ＴＦＡ：ＤＣＭと３０分間混合した。ＴＦＡ／ＤＣＭを高真空回転蒸発、続いて３０分間、高真空を使用して除去した。次いで、化合物をＤＭＦに溶解し、５モル当量のｉ－Ｐｒ_２ＮＥｔ、１６mgのフルオレセインイソチオシアネート(Life Technologies)と合わせ、１時間撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣで精製し、標的化合物をＵＨＰＬＣ－ＭＳ(標的ｍ／ｚ１１２０)で確認した。サンプルを凍結乾燥させ、－２０℃で保存した。

【0397】

実施例９
Ｔ細胞調製
ヒト末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を、健常ドナーの全血からFicoll密度勾配遠心分離(GE Healthcare Lifesciences)を使用して単離した。次いで、Ｔ細胞をEasySep^TMヒトＴ細胞単離キット(STEM CELL technologies)を使用してＰＢＭＣから単離した。Ｔ細胞を、４０～１００IU／mLヒトＩＬ－２(Miltenyi Biotech)、２％ヒトＡＢ型血清および１％ペニシリン／硫酸ストレプトマイシン添加ＴｅｘＭＡＣＳ培地(Miltenyi Biotech Inc)で培養した。DynabeadsヒトＴ－アクティベーターＣＤ３／ＣＤ２８(ThermoFisher Scientific)をＴ細胞に１：１比で加えて、Ｔ細胞を活性化した。活性化１２～２４時間後、Ｔ細胞を、８μg／mLポリブレン(Santa Cruiz Biotech)存在下、１,２００ｇで９０分間、２２～３２℃でスピンフェクションによりＦＩＴＣ－ＣＡＲレンチウイルス粒子で形質導入した。ＣＡＲ修飾したもの(ＣＡＲ－Ｔｓ)およびＣＡＲ修飾がないもの(非形質転換Ｔｓ)を含むＴ細胞混合物を、活性化ビーズ存在下、６日間培養し、その後活性化ビーズを除去した。蛍光活性化セルソーティングを使用して、ＧＦＰ発現に基づき、ＣＡＲＴ細胞(ＧＦＰ陽性)および非形質転換Ｔ細胞(ＧＦＰ陰性)をふるい分けした。ふるい分けしたＴ細胞を７～１５日間培養し、その後マウスに注射した。Ｔ細胞混合物を使用したとき、ＣＡＲＴ細胞および非形質転換Ｔ細胞を、マウスに注射する前に所望の比で混合した。

【0398】

実施例１０
ＣＡＲ遺伝子をコードするレンチウイルスベクターの産生
オーバーラップＰＣＲ方法を使用して、フルオレセインに対するｓｃＦｖを含むＣＡＲ構築物を産生した。抗フルオレセイン(４－４－２０)抗体由来のフルオレセインに対するｓｃＦｖである４Ｍ５.３(Ｋｄ＝２７０fM、７６２bp)を合成した。図２に示すヒトＣＤ８αシグナルペプチド(ＳＰ、６３bp)、ヒンジおよび膜貫通領域(２４９bp)、４－１ＢＢの細胞質ドメイン(ＣＤ１３７、１４１bp)およびＣＤ３ζ鎖(３３６bp)の配列を、オーバーラップＰＣＲにより抗フルオレセインｓｃＦＶと融合した。得られたＣＡＲ構築物(１５５１bp)を、ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ開裂レンチウイルス発現ベクターｐＣＤＨ－ＥＦ１－ＭＣＳ－(ＰＧＫ－ＧＦＰ)に挿入した(図２、System Biosciences)。レンチウイルスベクター中のＣＡＲ構築物の配列を、ＤＮＡシークエンシングにより確認した。

【0399】

例示的ＣＡＲ核酸コード配列は次を含み得る。

【表6】

【0400】

上記例示的核酸配列(配列番号１)において、最初のＡＴＧは開始コドンである。例示的ＣＡＲアミノ酸配列は次を含み得る。

【表7】

【0401】

例示的インサートは次を含み得る。

【表8】

【0402】

上記例示的インサート(配列番号３)において、最初のＧＣＣＡＣＣ配列は制限酵素開裂部位、続いてＡＴＧ開始コドンを含み得る。コードされるアミノ酸配列は次を含み得る。

【表9】

【0403】

実施例１１
ヒトＴ細胞形質導入のためのＣＡＲ遺伝子を含むレンチウイルスの産生
抗フルオレセイン(すなわち、抗ＦＩＴＣ)一本鎖フラグメント可変(ｓｃＦｖ)ＣＡＲを含むレンチウイルスウイルスを産生するために、ＨＥＫ－２９３ＴＮパッケージング細胞株を抗フルオレセインｓｃＦｖＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターおよび第二世代レンチウイルスパッケージングプラスミドミックス(Cellecta)またはViraPower Lentivrial Packaging Mix(ThermoFisher)と共トランスフェクトした。トランスフェクション２４時間および４８時間後、ＣＡＲ遺伝子を伴うレンチウイルスを含む上清を回収し、ウイルス粒子をヒトＴ細胞での後の形質導入のために、標準ポリエチレングリコールウイルス濃縮方法(Clontech)により濃縮した。

【0404】

実施例１２
ヒトＰＢＭＣからのヒトＴ細胞の単離
Ｔ細胞を、Ficoll密度勾配遠心分離(GE Healthcare Lifesciences)によりヒト末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)から単離した。残存Ficoll溶液を洗い流した後、Ｔ細胞をEasySep^TMヒトＴ細胞単離キット(STEM CELL technologies)を使用して単離した。精製Ｔ細胞を、ヒトＩＬ－２(１００IU／mL、Miltenyi Biotech Inc)存在下、１％ペニシリンおよび硫酸ストレプトマイシン添加TexMACSTM培地(Miltenyi Biotech Inc)で培養した。Ｔ細胞を１×１０^６細胞／mL密度で、多ウェルプレートで培養した。Ｔ細胞を分割し、２～３日毎に再給餌した。

【0405】

実施例１３
ヒトＴ細胞の形質導入
単離Ｔ細胞を、ヒトＩＬ－２(１００IU／mL)存在下、１２～２４時間抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体(Life Technologies)に結合したDynabeadsで活性化し、次いで抗フルオレセインＣＡＲ遺伝子をコードするレンチウイルスで形質導入した。細胞を７２時間後採取し、形質導入Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現を、フローサイトメトリーを使用するＧＦＰ蛍光細胞の計数により確認した。

【0406】

実施例１４
ＦＩＴＣ－フォレートの合成
フォレート－γ－エチレンジアミンを、テトラメチルグアニジンおよびジイソプロピルアミンの存在下、無水ジメチルスルホキシド(ＤＭＦ)中でフルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)異性体Ｉ(Sigma-Aldrich)とカップリングさせた。粗生成物をXterra RP18分取ＨＰＬＣカラム(Waters)に負荷し、９９％５mM ナトリウムリン酸塩(移動相Ａ、ｐＨ７.４)および１％アセトニトリル(移動相Ｂ)から始まり、９０％Ａおよび１０％Ｂに２０mL／分の流速で１０分で達する勾配条件で溶出した。これら条件下、ＦＩＴＣ－フォレート主ピークは、一般に２７～５０分で溶出した。ＦＩＴＣ－フォレートフラクションの品質を、ＵＶ検出器を備えた分析的逆相ＨＰＬＣでモニターした。９８.０％純度(ＬＣＭＳ)を超えるフラクションを凍結乾燥して、最終ＦＩＴＣ－フォレート生成物を得た。

【化27】

【0407】

実施例１５
ＦＩＴＣ－ＤＵＰＡの合成
ＤＵＰＡ－ＦＩＴＣを、下記のとおり固相合成法により合成した。汎用性NovaTag樹脂(５０mg、０.５３mM)をジクロロメタン(ＤＣＭ)(３mL)、続いてジメチルホルムアミド(ＤＭＦ、３mL)で膨潤させた。ＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液(３×３mL)を樹脂に加え、アルゴンを５分間通気した。樹脂をＤＭＦ(３×３mL)およびイソプロピルアルコール(ｉ－ＰｒＯＨ、３×３mL)で洗浄した。ＤＭＦで樹脂を膨潤させた後、ＤＵＰＡ－(ＯｔＢｕ)－ＯＨ(１.５当量)、ＨＡＴＵ(２.５当量)およびＤＩＰＥＡ(４.０当量)のＤＭＦ溶液を加えた。アルゴンを２時間通気し、樹脂をＤＭＦ(３×３mL)およびｉ－ＰｒＯＨ(３×３mL)で洗浄した。ＤＣＭで樹脂を膨潤させた後、１ＭＨＯＢｔのＤＣＭ／トリフルオロエタン(ＴＦＥ)(１：１)(２×３mL)溶液を加えた。アルゴンを１時間通気し、溶媒を除去し、樹脂をＤＭＦ(３×３mL)およびｉ－ＰｒＯＨ(３×３mL)で洗浄した。ＤＭＦで樹脂を膨潤させた後、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ(２.５当量)、ＨＡＴＵ(２.５当量)およびＤＩＰＥＡ(４.０当量)のＤＭＦ溶液を加えた。アルゴンを２時間通気し、樹脂をＤＭＦ(３×３mL)およびｉ－ＰｒＯＨ(３×３mL)で洗浄した。上記の一連の工程を８－アミノオクタン酸およびフルオレセインイソチオシアネートまたはローダミンＢイソチオシアネートの付加のために、さらに２カップリング繰り返した。最終化合物をトリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン：カクテル(９５：２.５：２.５)を使用して樹脂から開裂させ、減圧下濃縮した。濃縮生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、減圧下乾燥させた。粗製生成物を分取ＲＰ－ＨＰＬＣ[λ＝４８８nm；溶媒勾配：１％Ｂ～８０％Ｂを２５分間、８０％Ｂ洗浄３０分間ラン；Ａ＝１０mM ＮＨ４ＯＡｃ、ｐＨ＝７；Ｂ＝アセトニトリル(ＡＣＮ)]を使用して精製した。ＡＣＮを減圧下除去し、精製フラクションを凍結乾燥させて、ＤＵＰＡ－ＦＩＴＣを帯褐色－橙色固体として得た。ＲＰ－ＨＰＬＣ：ｔＲ＝８.０分(Ａ＝１０mM ＮＨ４ＯＡｃ、ｐＨ＝７.０；Ｂ＝ＡＣＮ、溶媒勾配：１％Ｂ～５０％Ｂを１０分間、８０％Ｂ洗浄１５分間ラン)。¹H NMR (DMSO-d₆/D₂O):δ 0.98-1.27 (ms, 9H);1.45 (b, 3H);1.68-1.85 (ms, 11H);2.03 (m, 8H);2.6-3.44 (ms, 12H);3.82 (b, 2H);4.35 (m, 1H);6.53 (d, J=8.1 Hz, 2H), 6.61 (dd, J=5.3, 3.5 Hz, 2H);6.64 (s, 2H);7.05 (d, J=8.2 Hz, 2H), 7.19 (m, 5H);7.76 (d, J=8.0 Hz, 1H);8.38 (s, 1H). HRMS (ESI)(m/z):(M+H)+ C₅₁H₅₉N₇O₁₅Sの計算値1040.3712, 実測値, 1040.3702. UV/vis:λ max=491nm

【化28】

【0408】

実施例１６
ＦＩＴＣ－ＣＡ９の合成
５０mL丸底フラスコに、ＣＡ９リガンド(５３.６mg、実験室で合成)を、所望量のＮ,Ｎ－ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)(２～３mL)に、テフロン磁気撹拌棒を使用して溶解した。外気を減圧と窒素ガスでの置換を使用して除去し、これを３サイクル行った。次いで、丸底フラスコを一定の窒素ガス下に維持した.このフラスコに、２８.９mgのＮ－(３－ジメチルアミノプロピル)－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)、続いて２１.６mg １－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(ＨＯＢｔ)および１８.９μLのＢｏｃ－ＰＥＧ２－ＮＨ_２(Sigma Aldrichから購入)を加えた。５.４μLのトリエチルアミン(ＴＥＡ)を最後に加え、反応物を一夜撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣを使用して精製し、ＵＨＰＬＣ－ＭＳ(標的ｍ／ｚ８３１)で確認した。アセトニトリルを高真空回転蒸発を使用して除去し、凍結乾燥機に４８時間入れた。Ｂｏｃ脱保護を１：１ＴＦＡ：ＤＣＭで３０分間実施した。ＴＦＡ／ＤＣＭを高真空回転蒸発、続いて３０分間、高真空を使用して除去した。次いで、化合物をＤＭＦに溶解し、５モル当量のＮ,Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン(ＤＩＰＥＡ)と合わせた。１６mgのフルオレセインイソチオシアネート(Life Technologiesから購入)を溶液に加え、１時間撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣで精製し、標的化合物をＵＨＰＬＣ－ＭＳ(標的ｍ／ｚ１１２０)で確認した。サンプルを４８時間凍結乾燥機に入れ、化合物を－２０℃で保存した。

【化29】

【0409】

実施例１７
ＦＩＴＣ－ＮＫ１Ｒの合成
撹拌中のＮＫ－１(０.０２ｇ、０.０４３３mmol、１.０当量)、Ｏ－(２－アミノエチル)－Ｏ’－[２－(Ｂｏｃ－アミノ)エチル]デカエチレングリコール(ＢｏｃＮＨ－ＰＥＧ１１－ＮＨ２)(Sigma、０.０３３６ｇ、０.０５２１mmol、１.２当量)、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩(ＰＹＢＯＰ)(０.０２７ｇ、０.０５２１mmol、１.２当量)の乾燥ＣＨ２Ｃｌ２溶液に、室温でアルゴン下、Ｎ,Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン(ＤＩＰＥＡ)(０.０７６mL、０.４３３８mmol、１０当量)を加えた。反応進行をＬＣＭＳでモニターし、分取ＲＰ－ＨＰＬＣ(Waters、XBridgeＴＭ Prep C18、５μm；１９×１００mmカラム、移動相Ａ＝２０mM 酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ７、Ｂ＝アセトニトリル、勾配１０～１００％Ｂを３０分間、１３mL／分、λ＝２２０nm、２５４nm)で精製した。精製フラクションを取得し、全有機溶媒を蒸発させ、サンプルを４８時間凍結乾燥させて、ＮＫ１－ＰＥＧ１１－ＮＨＢｏｃを得た。収量：４０.１３mg(９７％)。ＮＫ１－ＰＥＧ１１－ＮＨＢｏｃ(０.０１６５ｇ、０.０１５mmol)の乾燥ＣＨ２Ｃｌ２溶液にトリフルオロ酢酸(ＴＦＡ、２０当量)を加え、反応混合物を４時間、ｒ.ｔ.で撹拌した。過剰のＴＦＡを除去し、水で希釈し、ＣＨ_２Ｃｌ_２(３ｘ５mL)を使用して抽出した。合わせた有機層を塩水で洗浄し、乾燥させ(Ｎａ_２ＳＯ_４)、濃縮した。得られた残留物を減圧下乾燥させ、さらに精製することなく次工程で使用した。撹拌中のＮＫ１－ＰＥＧ１１－ＮＨ_２(０.００８ｇ、０.００８１mmol、１.０当量)、フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)(Sigma、０.００３７ｇ、０.００９７mmol、１.２当量)の乾燥ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ、０.３mL)溶液に、室温でアルゴン下、ジイソプロピルエチルアミン(０.００２８mL、０.０１６２mmol、２.０当量)を加えた。反応進行をＬＣＭＳでモニターし、分取ＲＰ－ＨＰＬＣ(Waters、XBridgeＴＭ Prep C18、５μm；１９×１００mmカラム、移動相Ａ＝２０mM 酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ７、Ｂ＝アセトニトリル、勾配１０～１００％Ｂを３０分間、１３mL／分、λ＝２８０nm)で精製した。精製フラクションを取得し、全有機溶媒を蒸発させ、サンプルを４８時間凍結乾燥させて、ＮＫ１－ＰＥＧ１１－ＦＩＴＣ(５)を得た。収量：８.５４mg(７７％)。
ＮＫ－１化合物を文献法を使用して製造した塩基性リガンドから出発する２工程法により合成した(DESIGN AND DEVELOPMENT OF NEUROKININ-1 RECEPTOR-BINDING AGENT DELIVERY CONJUGATES、出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／４４２２９、引用により全体として本明細書に包含。)。

【0410】

実施例１８
ＨＯＳ－ＦＲ－αおよびＡＭＬ試験概要

【表10】

ＥＣ１７の連続漸増投与は、下記に従い実施される。
・ＣＲＳまたは神経毒性がなければ、計画に沿ってＥＣ１７用量漸増を進める。
・ＣＲＳグレード≦２であれば、その後の全てのＥＣ１７用量を、同じサイクルで非重度ＣＲＳを引き起こしたその用量漸増過程レベルで投与する。
・ＣＲＳグレード＞２であれば、現サイクルでのＥＣ１７のさらなる投与を中断し、ｓＣＲＳを引き起こしたものより低い中で一番高い用量過程でその後の全サイクルを実施する。

【0411】

Ａ. 腫瘍移植
ＨＯＳ－ＦＲα(すなわちＨＯＳ－１４３ｂ－ＬＶ－ＦＲα)は、ヒトＦＲαで安定にトランスフェクトしたＨＯＳ－１４３Ｂ(ＡＴＣＣＣＲＬ－８３０３)のサブクローンである。ＨＯＳ－１４３Ｂは、もともと骨肉腫を有する１３歳白人女児由来であった。腫瘍細胞を、５％ＦＢＳを添加したフォレート欠損ＲＰＭＩ１６４０で、３７℃で５％ＣＯ_２加湿雰囲気で増殖させた。インビボ試験のため、腫瘍細胞を動物あたり１×１０^６細胞で皮下接種した。

【0412】

Ｂ. ＣＡＲＴ細胞投与
ＥＧＦＲｔ選別抗ＦＩＴＣＥ２ｓｃＦｖ－ＣＡＲＴ細胞をＴ細胞凍結培地で凍結させた。到着時、凍結ＣＡＲＴ細胞のバイアルを直ぐに－８０℃で保存した。ＣＡＲＴ細胞を３７℃で急速に解凍し、ＰＢＳで２回洗浄し、動物あたり６００万生存可能ＥＧＦＲｔ＋Ｅ２ＣＡＲＴ細胞(ＣＤ４／ＣＤ８約１：１)で動物注射に使用した。Ｅ２－ＣＡＲＴ細胞表現型のフローサイトメトリー分析のため、注射日に小量を採った。

【0413】

Ｃ. 投与薬物溶液調製
ＥＣ１７投薬溶液を、各化合物を適切な量秤量し、ＰＢＳ、ｐＨ７.４で再構成し、０.２２μm ＰＶＤＦシリンジフィルターで薬物溶液を濾過滅菌し、各投与日に－２０℃で一定量凍結させることにより投与を開始するとき調製した。

【0414】

Ｄ. 化合物投与
全ＥＣ１７用量を、夜間に可能性のあるＣＲＳ(サイトカイン放出症候群)が発症するように、１日の最後(午後３～４時)に投与した。翌朝、動物をＣＲＳグレーディングシステムにより採点した(下記参照)。

【0415】

Ｅ. 評価

【表11】

【0416】

腫瘍増殖、体重および全体的評価：腫瘍サイズを２～３回／週モニターし、体重を２～３回／週測定した。何れかのＥＣ１７用量投与直後の日、体重測定を連日行い、全体的な動物の形態および行動に注意した。

【0417】

屠殺：マウスが体重の≧２０％を失ったとき、腫瘍が≧１５００mm^３に達したとき、屠殺した。マウスが短期間で大幅に体重を失ったとき(例えば、重度の頭位傾斜により)またはＣＲＳグレーディングシステムで瀕死条件に近づいたときもまた屠殺した。

【0418】

ＥＣ１７宿主内用量漸増処置(３サイクル)

【表12】

抗腫瘍活性(Ｎ＝５)

【0419】

図４に示すとおり：
コホート１(Ｅ２－ＣＡＲＴ細胞のみ)は、ＥＣ１７処置なしでＨＯＳ－ＦＲαが攻撃的に増殖することが示された。
コホート２(ＥＣ１７５／１００／１０００nmol／kg、Ｍ／Ｔｈ／Ｍ)は、本試験をとおして、体重減少またはＣＲＳなく、顕著な腫瘍退縮を示した。
ゆっくりしたＥＣ１７用量漸増(Ｍ／Ｔｈ／Ｍ)レジメンは安全であった。体重減少またはサイトカイン放出症候群(ＣＲＳ)の症状は、ＨＯＳ－ＦＲα腫瘍担持マウスで見られなかった。

【0420】

このＥ２－ＣＡＲＴ細胞試験の一つの目標は、ＣＡＲ－Ｔ注入３日後に開始する、複数投与レジメンを使用するＥＣ１７／Ｅ２ＣＡＲＴ細胞活性および関連毒性(例えばｓＣＲＳ)の試験であった。３つの異なるＥＣ１７投与レジメンは、(ａ)週１回(ＳＩＷ)、５００nmol／kg、(ｂ)９日間間隔を開けた月曜日／水曜日／金曜日の５nmol／kg、５０nmol／kgおよび５００nmol／kgでの「ＴＩＷ様」および(ｃ)７日間間隔を開けた月曜日／木曜日／月曜日の５nmol／kg、１００nmol／kgおよび１０００nmol／kgでの「ＴＩＷ様」を含む。

【表13】

* 群4～5: 各サイクルの２週目投与せず。

【0421】

試験図
群１(処置せず)：効果比較のためのみ。

【0422】

群２(ＣＡＲ－Ｔのみ)：

【表14】

【0423】

群３(ＥＣ１７ＳＩＷ)：

【表15】

【0424】

群４(ＥＣ１７真のＴＩＷ)：

【表16】

【0425】

群５－ＥＣ１７低用量「ＴＩＷ」(Ｍ／Ｔｈ／Ｍ、６日間オフ)、有効性を伴う。

【表17】

【0426】

Ａ. 腫瘍移植
ＴＨＰ－１－ＦＲβ ＡＭＬ腫瘍細胞を、５～１０％ＦＢＳを添加したフォレート欠損ＲＰＭＩ１６４０で、３７℃で５％ＣＯ_２加湿雰囲気で増殖させた。無血清フォレート欠損ＲＰＭＩ１６４０培地中のＴＨＰ－１－ＦＲβ腫瘍細胞を、動物あたり５×１０^６細胞でｉ.ｖ.注射した。

【0427】

Ｂ. ＣＡＲＴ細胞投与
抗ＦＩＴＣＥ２ｓｃＦｖ－ＣＡＲＴ細胞をＴ細胞凍結培地で凍結した。到着時、凍結ＣＡＲＴ細胞のバイアルを直ぐに－８０℃で保存した。ＣＡＲＴ細胞を３７℃で急速に解凍し、ＣＡＲＴ細胞培養培地で２回洗浄し、動物あたり６００万生存可能ＥＧＦＲｔ＋Ｅ２ＣＡＲＴ細胞(ＣＤ４／ＣＤ８約１：１)で動物注射に使用した。Ｅ２－ＣＡＲＴ細胞表現型のフローサイトメトリー分析のため、注射日に小量を採った。

【0428】

Ｃ. 投与薬物溶液調製
ＥＣ１７およびビス－ＥＤＡ－ＦＩＴＣ投薬溶液を、各化合物を適切な量秤量し、ＰＢＳ、ｐＨ７.４で再構成し、０.２２μm ＰＶＤＦシリンジフィルターで薬物溶液を濾過滅菌し、および各投与日に－２０℃で一定量凍結させることにより投与を開始するとき調製した。

【0429】

【0430】

ＥＣ１７投与スケジュール：
コホート１～２：ＥＣ１７投与せず

【0431】

コホート３：

【表18】

【0432】

コホート４：

【表19】

【0433】

コホート５：

【表20】

【0434】

モニタリング／有効性：
ＥＣ１７投与後、毎日の体重測定が必要である。全体的な動物の形態および行動に注意した。マウスが短期間で大幅に体重を失ったときまたはＣＲＳグレーディングシステムまたは神経毒性で瀕死条件に近づいたとき屠殺した。

【0435】

【表21】

【0436】

腫瘍増殖、体重および全体的評価：体重を２～３回／週測定した。何れかのＥＣ１７用量投与直後の日、体重測定を連日行い、全体的な動物の形態および行動に注意した。

【0437】

フローサイトメトリー分析
全血細胞分析：血漿を、全ＥＤＴＡ処理血液から予定体積除去し、ＲＢＣをＲＢＣ溶解溶液で溶解した。次いで白血球ペレットをフローサイトメトリー染色溶液(１％ウシ血清アルブミン、５０mg／mLヒトＩｇＧ(Equitech Bio, cat#SLH56-000１)、リン酸緩衝化食塩水中０.９％ナトリウムアジド、ｐＨ＝７.４)に再懸濁し、白血球表面マーカー染色を次の抗体を使用して実施した：抗ヒトＣＤ４５(クローンＨＩ３０、eBioscience #47-0459-42、１：２０(ｖ／ｖ)希釈)、抗ヒトＣＤ１３７(clone 4B4-1, BD Bioscience #564092、１：２０(ｖ／ｖ)希釈)、抗ヒトＣＤ８α[clone RPA-T8, BD Bioscience, catalog #557746、１：２０(ｖ／ｖ)希釈]、抗ヒトＣＤ４[clone SK3, eBioscience catalog #46-0047-42、１：２０(ｖ／ｖ)希釈]、抗ヒトＥＧＦＲ[R&D systems, clone Hu1, catalog #FAB9577B @ 1:10(v/v)]、抗ヒトＰＤ１[BD Biosciences, clone EH12.1, catalog#562511 @1:20(v/v)]、抗ヒトＬＡＧ３[BD Biosciences, clone T47-530, catalog #565616 @1:20(v/v)]、抗ヒトＴＩＭ３[BD Biosciences, clone 7D3, catalog #565558 @1:20(v/v)]、抗ヒトＣＤ３ε[BD Biosciences, clone SK7, catalog #557832 @1:20(v/v)]。白血球染色後、細胞をＰＢＳで洗浄し、５３,０００ CountBright^TMビーズ[Invitrogen catalog #C36950]含有冷ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメトリーコレクションチューブに移した。フローサイトメトリーデータを、Galliosフローサイトメーター(Beckman Coulter, Brea, CA)で集めた。各血液サンプルのＣＡＲＴ細胞の濃度決定を、Invitrogenの指示に従い計算した。ＣＡＲＴ細胞をヒトＣＤ３ε ＋ＥＧＦＲｔ＋事象として同定し、Kaluza^TMフローサイトメトリーソフトウェアを使用して容易に区別され、計数された。次いで、各注入したマウスの循環中のＣＡＲＴ細胞の数を、分析した５０μLの全血あたりのＣＡＲＴ細胞の総数としてグラフにした。統計的有意を、独立、両側スチューデントｔ検定を用いて決定し、有意をｐ＜０.０５に設定した。

【0438】

腫瘍および組織分析：固形腫瘍(１００～１０００mm^３)を採取し、秤量し、小片に切断し、次いで、２０mLの腫瘍消化カクテルを含む５０mLチューブに移した。酵素腫瘍消化カクテルは、抗生物質添加無血清およびフォレート欠損ＲＰＭＩ１６４０培地中、０.５mg／mL コラゲナーゼIV(Sigma-Aldrich, Catalog# C5138)、０.５mg／mL ヒアルロニダーゼ(Sigma-Aldrich, Catalog# H3506)および０.１mg／mL ＤＮａｓｅＩ(Sigma-Aldrich, Catalog# DN25)からなった。腫瘍断片を１時間、３７℃で３００rpmで、往復振とう式シェーカーで消化させた。その後、腫瘍消化物を４００×ｇで５分間遠心分離し、腫瘍細胞ペレットを赤血球溶解工程に付し、次いで冷リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ、ｐＨ７.４)で洗浄し、最後に４０μmナイロンセルストレイナーをとおした。

【0439】

結果および結論
ＥＣ１７投与の３つの異なる投与スケジュールは、異なる体重減少パターンおよび異なるＣＲＳレベルを示した。
図５に示すとおり、コホート１(処置なし)およびコホート２(ＣＡＲ－Ｔのみ)は大きな体重減少を示さず、ＣＲＳはなかった。コホート３(ＥＣ１７ＳＩＷ)は各ＥＣ１７投与後ＥＣ１７用量依存性体重減少を示し、グレード１～２ＣＲＳを試験をとおして示した。コホート５(ＥＣ１７用量漸増)は最初の２サイクルの間はほとんど体重減少を示さなかったが、２サイクル目のＥＣ１７投与の終了後、コホート２に類似する体重減少を示し始めた。コホート４(ＥＣ１７ＴＩＷオン／オフ)は、３処置群の中でもっとも軽度の体重減少を示した。コホート４または５は、１より大きなＣＲＳをなんら示さなかった。

【0440】

コホート３

【表22】

【0441】

コホート４

【表23】

【0442】

コホート５

【表24】

【0443】

ＥＣ１７投与の３つの異なる投与スケジュールは、異なる抗腫瘍活性を示した。
図６にみられるとおり、肝臓および非肝臓腫瘍負荷を３９日目に全コホートにわたり評価した。コホート２(ＣＡＲ－Ｔのみ)は、コホート１(処置なし)と比較して、何ら差異を示さなかった。コホート４は、３つの異なるＥＣ１７投与スケジュールで最良の抗腫瘍活性を示した。

【0444】

循環ＡＭＬ細胞株、ＴＨＰ１－ＦＲβの排除
ＣＤ１９特異的抗ＡＬＬ治療を使用する試験で、血中のＣＡＲＴ細胞の拡大および持続性は、治療への完全応答をもたらす循環ＣＤ１９＋ＡＬＬ細胞の排除と相関することが報告されている。本実験で、ＣＡＲＴアダプター分子、ＥＣ１７の種々の投与レジメンに応答した、ＧＦＰ標識ヒトＡＭＬ細胞株、ＴＨＰ１－ＦＲβを調べることにより、アダプター制御Ｅ２ＣＡＲＴ細胞の抗腫瘍活性を決定するために、マウスＡＭＬモデルで類似アッセイを実施した。図７は、循環ＴＨＰ１－ＦＲβ細胞を示し、ｙ軸は全血１００μLあたりのＧＦＰ＋細胞の総数を対数目盛で示す。異なるバーは異なる処置コホートを表す。高ＡＭＬ細胞負荷が、ＣＡＲＴ細胞もＥＣ１７も受けていないマウスで、ＡＭＬ細胞注入４０日後循環で存在することが示された。血中ＡＭＬ細胞の減少は、ＡＭＬ細胞およびＥ２ＣＡＲＴ細胞注入両者を受けたが、ＥＣ１７無処置のマウスで見られなかった。これは、ヒトＴ細胞と同種異系ＴＨＰ１細胞の潜在的同種異系反応性による抗腫瘍活性は無視できることを示した。興味深いことに、種々の投与レジメンでＥ２ＣＡＲＴ細胞＋ＥＣ１７を注入された全３コホートのマウスで、循環ＴＨＰ１細胞負荷の顕著な減少が見られ、故に、３つの異なるアダプター投与レジメン下のＣＡＲＴ治療の有効性が示された。

【0445】

Ｅ２－ＣＡＲ－Ｔ疲弊表現型
慢性抗原刺激下、例えば慢性ウイルス感染または癌の場合、Ｔ細胞は、もはや増殖できず、炎症性サイトカインを分泌できず、抗原提示標的細胞を殺せない、疲弊の過程を受ける。ＣＡＲＴ細胞はまたｓｃＦｖ刺激抗原の慢性的存在により、ＣＡＲの慢性刺激下に、疲弊する可能性がある。Ｅ２ＣＡＲＴ細胞は、ＦＲ＋腫瘍細胞表面に結合した架橋分子、ＥＣ１７の存在下でしか反応しないため、ＥＣ１７での処置を止め、故に表面結合抗原の存在を除去することにより、Ｅ２ＣＡＲＴ細胞が慢性抗原刺激を防止する能力を有する。表面抗原不在により特徴付けられる残りの期間は、Ｅ２ＣＡＲＴ細胞の慢性抗原暴露を予防し、もたらされる結果的な疲弊を予防する。

【0446】

ＥＣ１７投与レジメンがＥ２ＣＡＲＴ細胞疲弊をもたらさないことを確認するために、フローサイトメトリー分析をＴＨＰ１－ＦＲβ肝転移からの単一細胞調製物および疲弊Ｔ細胞で特異的に発現される表面マーカーで実施した。Ｔ細胞が疲弊に近づくにつれて、表面阻害性受容体、ＰＤ１、ＬＡＧ３およびＴＩＭ３の共発現が増加する。図８は、ｙ軸が異なるバーにより表される３表面マーカーの種々の組み合わせを発現する固形肝臓腫瘍から単離した総Ｅ２ＣＡＲＴ細胞のパーセンテージを示す、棒グラフを示す。注意すべきは、全３マーカーを同時に発現する完全に疲弊したＴ細胞が各群の左手側に示される。左群は、３つの異なるＥＣ１７処置コホートから単離した肝臓腫瘍ＣＡＲＴ細胞へのＥ２ＣＡＲＴ細胞の前注入を示す。阻害性受容体発現は、Ｔ細胞の大部分が全３表面マーカー陰性であるため、プレインフュージョンＣＡＲＴ細胞産物でほとんど０である。重要なことに、全３ＥＣ１７処置コホートＥ２ＣＡＲＴ細胞は、疲弊トリプルポジティブ細胞を有し、興味深いことに、コホート４(ＥＣ１７ＴＩＷ)のダブルおよびトリプルポジティブ事象数は最小であり、さらに、相当数のトリプルネガティブＣＡＲＴ細胞からなった。これらのデータは、このマウス実験で使用した全３ＥＣ１７投与レジメンが、相当な抗腫瘍活性があり、ＣＡＲＴ疲弊の誘発が極めて少ない点で、臨床で有用である。

【0447】

実施例１９～２５－図９～１４参照。
実施例１９
細胞株および試薬
特に断らない限り、全ＦＲ＋およびＦＲ陰性癌細胞株を、２.４μM 葉酸(ＦＡ)不添加(ＦＦＲＰＭＩ)または添加(ＲＰＭＩ)した、１０％熱不活性化ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ－１６４０培地(Gibco BRL)に維持した。ＫＢ(ＨｅＬａマーカーを伴うＦＲα発現ヒト子宮頸癌)およびＣＨＯ－β(ヒトＦＲβでトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣細胞)を、それぞれ放射性リガンド結合アッセイのＦＲαおよびＦＲβの源として使用した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１は、ヒトＴＮＢＣ(トリプルネガティブ乳癌)細胞株のＦＲαサブクローンを表す。ＡＭＬ試験のために、ＦＲβ陽性(ＴＨＰ１－ＦＲβ)およびＦＲ陰性(ＴＨＰ１－ＦＧ１２)細胞株の緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)発現同質遺伝子的対が提供された。両者とも、もともと急性単球性白血病の１歳男児由来の小児ＡＭＬ試験に一般に使用される細胞モデルであるＴＨＰ－１(ＡＴＣＣ、ＴＩＢ－２０２)から確率された。骨肉腫試験のために、ＨＯＳ－ＦＲαは、ヒトＦＲαをコードするＦＯＬＲ１遺伝子でＦＲ陰性ＨＯＳ－１４３ｂ(ＡＴＣＣ、ＣＲＬ８３０３)をレンチウイルス形質導入することにより確率した。ＨＯＳ－１４３ｂは、もともと１３歳白人女児の原発性腫瘍から確率され、ＮＳＧマウスで高度に腫瘍原性である。ＦＲ＋ＨＯＳ－ＦＲα^ｆＬｕｃおよびＦＲ陰性ＨＯＳ－１４３ｂ^ｆＬｕｃのＧＦＰ発現生物発光対を、レンチウイルスホタルルシフェラーゼで形質導入した。

【0448】

LEGENDplex^TMヒトサイトカインパネルをBioLegend(San Diego, CA)から購入した。乳酸デヒドロゲナーゼ(ＬＤＨ)ベースのCytoTox 96^{(登録商標)}非放射性細胞毒性アッセイキットをPromega(Madison, WI)から購入した。多色フローサイトメトリーに使用した市販の抗ヒト抗体は、のＣＤ４５ＲＡ(クローンＨＩ１００)、ＣＤ４５ＲＯ(クローンＵＣＨＬ１)、ＣＤ４(クローンＳＫ３)およびＣＤ６９(クローンＦＮ５０)；BD Bioscience(San Jose, CA)のＣＤ３ε(クローンＳＫ７)、ＣＤ８α(クローンＲＰＡ－Ｔ８)、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ(クローン４Ｂ４－１)、ＣＤ２５(クローンＭ－Ａ２５１)、ＰＤ１(クローンＥＨ１２.１)、ＬＡＧ３(クローンＴ４７－５３０)およびＴＩＭ３(クローン７Ｄ３)；R&D systems(Minneapolis, MN)のビオチニル化抗ヒトＥＧＦＲ(セツキシマブ、クローンＨｕ１)；およびBioLegend(San Diego, CA)のＦＲα(クローンＬＫ２６)であった。フルオロフォアコンジュゲート抗ビオチンをBioLegendから購入した。ＡＰＣコンジュゲート抗ＦＩＴＣマウスＩｇＧ２ａ／カッパ抗体(クローンNAWESLEE)、CountBright^TMビーズ(Invitrogen)、Annexin V染色緩衝液およびAlexaFluor-647コンジュゲートAnnexin VをThermo Fisher Scientificから購入した。腫瘍組織の酵素消化のために、コラゲナーゼIV、ヒアルロニダーゼおよびＤＮａｓｅＩを全てSigma-Aldrich(St. Louis, MO)から購入した。

【0449】

ＥＣ１７またはフォレート－ＦＩＴＣ[ＦＡ－(γ)－エチレンジアミン－ＦＩＴＣ]はEndocyteで合成した。^３Ｈ－ＥＣ１７は、約０.９５２Ci／mmolの比活性でMoravek biochemicals(Brea, CA)から購入したかまたは約１.２Ci／mmolの比活性でViTrax(Placentia, CA)により製造したＦＩＴＣと^３Ｈ－ＦＡ－(γ)－エチレンジアミンのコンジュゲートによｒ, Endocyteで製造した。^３Ｈ－ＦＡも、５９Ci／mmolの比活性でViTraxから購入した。ＣＲＳレスキューのために、ナトリウムフルオレセイン投与溶液を、Purdue Pharmacy(NDC 17478-250-25)から購入したＡＫ－ＦＬＵＯＲ^{(登録商標)}２５％(フルオレセイン注射、ＵＳＰ)で希釈した。

【0450】

実施例２０
ヒト化ＣＡＲ構築物およびＣＡＲ修飾Ｔ細胞
先の試験は、ヒンジおよびＣＤ８αの膜貫通配列および４－１ＢＢ／ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＧＦＰ＋第二世代抗ＦＩＴＣｓｃＦｖ(クローン４Ｍ５.３)ＣＡＲ(すなわち、ＦＩＴＣ－４Ｍ５.３－ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８αｔｍ－４－１ＢＢ／ＣＤ３ζ)を使用した。ヒトで最初の治験に転換するために、第二世代完全ヒトＦＩＴＣ特異的(クローンＥ２)ＣＡＲ構築物(ここではＥ２と称する)を開発した(図９、上部略図)。ＣＡＲ修飾Ｔ細胞を図９、下部パイチャートとして示す。
ここに記載する構築物は、(１)完全ヒト抗ＦＩＴＣｓｃＦｖ(クローンＥ２、Ｋｄ＝０.７５nM)、(２) ＣＤ２８－膜貫通ドメインに融合したＩｇＧ４ヒンジ－ＣＨ２(Ｌ２３５Ｄ、Ｎ２９７Ｑ)－ＣＨ３スペーサー、(３)第二世代４－１ＢＢ／ＣＤ３ζ－エンドドメインおよび(４)細胞表面ヒトＥＧＦＲｔタグを含むＦＩＴＣ特異的ＣＡＲ構築物である(図９、上部略図)(配列番号４および５はそれぞれ核酸およびアミノ酸配列である)。ＣＡＲ修飾Ｔ細胞を三世するために、レンチウイルスを、ＣＡＲコード化ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターで共トランスフェクトした２９３Ｔ細胞に製造した。ドナーＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を免疫磁気選択で精製し、別々にまたは約５０：５０比で形質導入した。一般に、１ラウンドのみのＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ活性化、続いて１または２ラウンドの迅速インビトロ拡大を実施した。前臨床評価のために、数バッチのＥＧＦＲｔ選別ＣＤ４、ＣＤ８および未選別ＣＤ４／ＣＤ８ＣＡＲＴ細胞を使用した。全ＣＡＲＴ細胞調製物を、フローサイトメトリーにより、凍結保存前およびＥＧＦＲｔ発現およびＣＤ４／ＣＤ８比決定のために解凍後分析した。表面マーカーの組み合わせを使用して、注入日のＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＣＡＲＴ細胞サブセットの分化状態を分析し、Ｔ_Ｎ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５－ナイーブＴ細胞；Ｔ_ＳＣＭ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５＋ｓｔｅｍ細胞記憶Ｔ細胞；Ｔ_ＣＭ、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ９５＋中央記憶Ｔ細胞；Ｔ_ＥＭ、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ９５＋エフェクター記憶細胞；およびＴ_ＥＦＦ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ９５＋エフェクターＴ細胞として定義した。下記前臨床試験のために、試験は、２バッチのＥＧＦＲｔ選別純粋ＣＤ４およびＣＤ８サブセット(約１：１比で混合後)および低分化プロファイルの「臨床模写株」調製物を含む数バッチの未選別約１：１ＥＧＦＲｔ＋ＣＤ４／ＣＤ８混合物を含んだ。

【0451】

合成および評価した一連の種々のＣＡＲ構築物中、完全ヒト抗ＦＩＴＣｓｃＦｖ(ＦＩＴＣ－Ｅ２)ＣＡＲを前臨床開発のために選択した(図９)。この第二世代完全ヒトＣＡＲは、抗ＦＩＴＣｓｃＦｖ(クローンＥ２)、ＦｃγＲへの結合を低減するためのＩｇＧ４－Ｆｃスペーサー／ヒンジとＣＨ２領域の二重変異(Ｌ２３５ＤおよびＮ２９７Ｑ)、ＣＤ２８膜貫通ドメインおよびＴ２Ａリボソームスキップ配列により細胞表面ＥＧＦＲｔタグに結合した４－１ＢＢ／ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含んだ(すなわち、ＦＩＴＣ－Ｅ２－ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４ヒンジ－ＣＤ２８ｔｍ－４－１ＢＢ／ＣＤ３ζ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ)。前臨床試験のために、ＥＧＦＲｔ選別および未選別Ｅ２ＣＡＲＴ細胞両者を約１：１ＣＤ４／ＣＤ８比で調製し、Ｔ細胞サブタイプ表現型解析を、日常的に各インビボ実験についてＣＡＲＴ細胞注入時(０日目)、フローサイトメトリーにより実施した。ＥＧＦＲｔ選別ＣＡＲＴ細胞の典型的発現パターンは、約４２％Ｔ_ＳＣＭ、１０％Ｔ_ＣＭ、１２％Ｔ_ＥＭおよび３４％Ｔ_ＥＦＦでＣＤ４およびＣＤ８サブセット両者を含んだ(図９、左のパイチャート)。ＥＧＦＲｔ選別ＣＡＲＴ細胞のみを共培養および薬物動態試験に使用した。腫瘍治療のため、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に関する低分化プロファイルの「臨床模写株」バッチ(図９、右のパイチャート)を使用し、試験バッチをＴＨＰ１－ＦＲβおよびＨＯＳ－ＦＲα試験に使用した。「臨床模写株」バッチ(約３９％ＥＧＦＲｔ＋)は、約６６％Ｔ_ＳＣＭおよび約３２％Ｔ_ＣＭのＣＤ４＋サブセットおよび約９５％Ｔ_ＳＣＭおよび約３％Ｔ_ＣＭのＣＤ８サブセットを含んだ。試験バッチ(約２３％ＥＧＦＲｔ＋)は、より分解しており、約３２％Ｔ_ＳＣＭ、約５３％Ｔ_ＣＭ、約１１％Ｔ_ＥＭおよび約３.７％Ｔ_ＥＦＦのＣＤ４サブセットおよび約４４％Ｔ_ＳＣＭ、約０.２８％Ｔ_ＣＭ、約３.４％Ｔ_ＥＭおよび約５２％Ｔ_ＥＦＦのＣＤ８サブセットを含んだ。

【0452】

実施例２１
ＥＣ１７ＣＡＭの二特異的親和性
ＥＣ１７ＣＡＭの二特異的親和性(ＣＡＭは本願の「架橋」または「化合物」に等しい)を、細胞ベースの放射性リガンド結合アッセイで^３Ｈ－ＥＣ１７を使用してアッセイした。ＦＲ＋標的への結合のために、ＫＢおよびＣＨＯ－β細胞を２４ウェル組織培養プレートに一夜前播種し、０.１nM、０.５nM、１nM、５nM、１０nM、２０nMおよび４０nMの^３Ｈ－ＥＣ１７とＦＦＲＰＭＩ中、２時間、３７℃でインキュベートした。その後、細胞をリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ、ｐＨ７.４)ですすぎ、１％ドデシル硫酸ナトリウムで溶解した。全細胞ライセートを標準Pierce BCAタンパク質アッセイで放射活性レベルおよび細胞タンパク質含量を定量した。細胞あたりに結合した^３Ｈ－ＥＣ１７分子数を、ＦＲα(ＫＢ)およびＦＲβ(ＣＨＯ－β)それぞれの解離定数(Ｋｄ)決定のために計算した(図１０)。
ＥＣ１７は、免疫療法および光学造影目的で臨床ですでに試験されている。二特異的結合親和性を直接定量するために、^３Ｈ－ＥＣ１７を合成し、放射性リガンド結合アッセイを、それぞれＦＲα＋およびＦＲβ＋標的細胞を表すＫＢおよびＣＨＯ－β細胞株およびエフェクター細胞を表す未選別ＥＧＦＲｔＣＡＲＴ細胞で実施した。標的に結合したとき、ＥＣ１７は、ＦＲαおよびＦＲβ両者に、１.７nMおよび０.８nMの低Ｋｄ値で類似親和性を示した (図１０、パネルＡ)。)。未選別Ｅ２－ＣＡＲＴ細胞(約２４％ＥＧＦＲｔ＋、～９５：５ＣＤ８／ＣＤ４比)への結合により、Ｋｄ値は約１３０nMと推定された(図１０、パネルＢ)。

【0453】

実施例２２
腫瘍モデル
全動物ケアおよび使用は、ＮＩＨガイドラインに従い、Purdue University Animal Use and Care Committee承認プロトコールに従い、実施した。雌４～５週齢ＮＯＤ／ＳＣＩＤガンマ(ＮＳＧ^TM)マウス(ストック番号：００５５５７)をThe Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME)から購入した。特に断らない限り、全動物を、到着時から試験をとおして、ＦＡ欠損餌(TestDiet, St. Louis, MO)で飼育した。皮下異種移植片を確立するために、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＨＯＳ－ＦＲαを、それぞで動物あたり２.５×１０^６および１×１０^６細胞で右脇腹領域に移植した。静脈内異種移植について、ＴＨＰ１－ＦＲβ細胞を動物あたり５×１０^６細胞で接種した。皮下腫瘍を週２～３回カリパスで測定し、楕円式(長さ×幅^２)／２で計算した。試験設計に従いまたは(ｉ)動物が体重の≧２０％を失ったときまたは瀕死条件に近づいたとき、(ii)皮下腫瘍が≧１５００mm^３サイズに達したときまたは(iii)動物が腹部腫大および重度窮迫の徴候を示したとき(すなわち、ＴＨＰ１－ＦＲβ)、屠殺を実施した。全動物用量(ＣＡＲＴ細胞、ＥＣ１７、ナトリウムフルオレセイン)は静脈内で与えた。

【0454】

実施例２３
腫瘍治療
治療設定で、ＥＣ１７ＣＡＭは、ＣＡＲＴ細胞注射前または後に与えてよい。ここで使用するＥＣ１７の初回用量を、ＣＡＲＴ細胞２～３.５日後に与え、腫瘍担持マウスにおけるヒトＴ細胞の観察期間を確保した。２バッチの未選別Ｅ２－ＣＡＲＴ細胞(２３％または３９％ＥＧＦＲｔ＋、１：１ＣＤ４／ＣＤ８)をインビボ試験で使用した。各実験の注入日(０日目)、凍結ＣＡＲＴ細胞を３７℃で急速に解凍し、Dulbeccoの１ＸＰＢＳ(ｐＨ７.４)で２回洗浄し、尾静脈に所望のＥＧＦＲｔ＋Ｅ２－ＣＡＲＴ細胞用量を注射した。さらに、小量のＣＡＲＴ細胞を、ＣＡＲＴ細胞のＣＤ４対ＣＤ８比および分化状態についてフローサイトメトリーで分析した。ＥＣ１７投与初日、腫瘍担持動物を腫瘍サイズまたは静脈内移植(すなわち、ＴＨＰ１－ＦＲβ)から同じ日数であることに基づき、無作為に群に分けた。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１試験について、マウスは、低分化プロファイルのＥ２－ＣＡＲＴ細胞(約３９％ＥＧＦＲｔ＋)の「臨床模写株」の高用量(約１０００万)を受けた(図９)。２日後、ＥＣ１７の３つの異なる処置レジメンを、平均腫瘍サイズ約２９３±３９mm^３で開始した(図１２)。ＥＣ１７投与を、週１回(ＳＩＷ)、５００nmol／kgで月曜日または５nmol／kg、５０nmol／kgまたは１００nmol／kgおよび５００または１０００nmol／kgの漸増用量(すなわち、５／５０／５００または５／１００／１０００)で月曜日、木曜日および月曜日にサイクル間６日間休薬で与えた。対照マウスは未処置のままであった(ＣＡＲＴ細胞を受けたが、ＥＣ１７は無かった)。比較のため、無腫瘍同腹仔コホートも同じＣＡＲＴ細胞の数を、ＥＣ１７ＳＩＷ、５００nmol／kgと併用してまたは併用せずに受けた。

【0455】

ＡＭＬ試験のために(図１３)、マウスに、低用量の約６００万Ｅ２－ＣＡＲＴ細胞(約２３％ＥＧＦＲｔ＋)を受ける１日前に、ＴＨＰ１－ＦＲβ腫瘍細胞を静脈内注入した。ＣＡＲＴ細胞注入約３.５日後、ＥＣ１７を、ｉ)ＳＩＷを５００nmol／kg、ii)５／５０／５００nmol／kgを月曜日／水曜日／金曜日３回、続いてサイクル間９日間休薬(ＴＩＷオン／オフ)およびiii)サイクル１で５／１０／１００nmol／kg、サイクル２で５／３０／３００nmol／kgおよびサイクル３で５／５０／５００nmol／kgの漸増用量で、全て月曜日／木曜日／月曜日で、サイクル間６日間休薬(Ｍ／Ｔｈ／Ｍ＿オン／オフ)を含む３つの異なる方法で投与した。３１日目、サテライト動物を、マウス血中のヒトＣＤ３ε＋ＥＧＦＲｔ＋事象として同定されるＣＡＲ陽性Ｔ細胞および１００μLの全血あたりの絶対数の定量のために集めた。屠殺または３８日目の試験終了時、ＴＨＰ１－ＦＲβ腫瘍担持マウスの総腫瘍負荷を、フローサイトメトリーにより血中ＧＦＰ＋腫瘍細胞を計数し、肝重量(転移病巣を含む)および体内で見られた非肝臓マクロ転移の総重量で補正することにより、評価した。肝転移腫瘍断片を、単一細胞懸濁液に酵素消化し、生存可能細胞集団を抗ヒトＰＤ１、ＬＡＧ３およびＴＩＭ３(それぞれ、クローンＥＨ１２.１、Ｔ４７－５３０および７Ｄ３)を使用して、ＣＡＲＴ細胞疲弊状態を分析した。
骨肉腫試験について(図１４)、マウスの２コホートに、ＨＯＳ－ＦＲα腫瘍細胞を皮下移植し、３日後、約６００万のＴＨＰ１－ＦＲβ試験に使用したのと同じＣＡＲＴ細胞調製物を与えた(図１３)。ＣＡＲＴ細胞注入約３.５日後、マウスの１コホートに最大３サイクルのＥＣ１７を、サイクル１で５／１０／１００nmol／kg、サイクル２で５／３０／３００nmol／kgおよびサイクル３で５／５０／５００nmol／kgで、全て月曜日／木曜日／月曜日レジメンに従い、サイクル間６日間休薬で投与した。試験終了時、マウス血液１００μＬあたりの循環ＣＤ３ε＋ＥＧＦＲｔ＋ＣＡＲＴ細胞を数え上げた。ＨＯＳ－ＦＲα腫瘍(±ＥＣ１７処置)も採取し、腫瘍浸潤ＣＡＲＴ細胞のフローサイトメトリー分析のために消化した。

【0456】

攻撃的骨肉腫モデルに対する用量漸増治験
意図する目的のために、ＨＯＳ－ＦＲαは、低ＦＲ発現であるが、約５.８２±１.４５pmol／mgタンパク質の機能的ＦＲレベルを有する最も攻撃的腫瘍モデルである。上記ＴＨＰ１－ＦＲβ試験と併行して、３日齢ＨＯＳ－ＦＲα腫瘍を有するマウスの２コホートｗに、同じＥ２－ＣＡＲＴ細胞を同じ用量(約６００万)で与えた。１コホートを、サイクル１で５／１０／１００nmol／kg、サイクル２で５／３０／３００nmol／kgおよびサイクル３で５／５０／５００nmol／kg、月曜日／木曜日／月曜日スケジュール、続いて６日間休薬の同じ加速ＥＣ１７用量漸増レジメンで処置した(図１４、パネルＡ)。ＨＯＳ－ＦＲα腫瘍がＥＣ１７処置無しで攻撃的に増殖するため、このＣＡＲＴ細胞用量の家族ＥＣ１７用量漸増は安全であり(ＣＲＳまたは体重減少なし)、最初の２サイクルの処置内で腫瘍増殖の顕著な遅延をもたらした(図１４、パネルＢ)。腫瘍サイズ(≧１５００mm^３)のみによるプロトコール指定屠殺により、全血で実施したフローサイトメトリー分析は、４７日目までの、しかし、３３日目て高いＥＣ１７依存性ＣＡＲＴ細胞拡大を示した(図１４、パネルＣ、左棒グラフ)。３３日目のエクスビボ腫瘍分析は、ＥＣ１７処置動物で、低いが、顕著な腫瘍内ＣＤ３ε＋ＥＧＦＲｔ＋ＣＡＲＴ細胞集団を示し、これは、約１％総生存可能消化腫瘍由来細胞からなった(図１４、パネルＣ、右棒グラフ)。大きなＨＯＳ－ＦＲα腫瘍がサイクル３で処置への応答を停止したため(図１４、パネルＢ)、腫瘍内ＣＡＲＴ細胞も４７日目に減少した(図１４、パネルＣ)。顕著なことに、疾患進行による^３Ｈ－ＦＡ放射性リガンドアッセイにより分析したＨＯＳ－ＦＲα腫瘍は、ＥＣ１７処置有りおよび無しで、類似ＦＲαレベルを示した。故に、インビトロ共培養により示唆されるとおり、ＮＳＧマウスのＨＯＳ－ＦＲα腫瘍は急速にＣＡＲＴ細胞の腫瘍浸潤能を伸長させ、Ｔ細胞疲弊により細胞溶解性活性を低減すると考えられる。

【0457】

腫瘍含有および無腫瘍マウスのＥＣ１７用量設定試験
初期ＥＣ１７用量設定試験を、実験レイアウトの模式図に示すとおり、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍担持マウスで実施した(図１２、パネルＡ)。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍(約２１１±６５mm^３)が無いまたは有るＮＳＧマウスに、０日目に約１０００万のＥ２－ＣＡＲＴ細胞(約３９％ＥＧＦＲｔ＋、５１：４９ＣＤ４／ＣＤ８)の「臨床模写株」バッチを移植した。ＣＡＲＴ細胞のこのバッチは、大部分Ｔ_ＳＣＭおよびＴ_ＣＭ表現型からなった(図９参照)。ＣＡＲＴ細胞注射２日後、腫瘍担持マウスの１コホートは未処置のままであり、３コホートは、５００nmol／kgの週あたり１回注射(ＳＩＷ)または月曜日／木曜日／月曜日スケジュールで、１週間休薬間隔の５／５０／５００(漸増－１)または５／１００／１０００nmol／kg(漸増－２)の漸増ＥＣ１７用量レベルを含む、ＥＣ１７の種々のレジメンで処置した。比較のため、２無腫瘍コホートは、未処置またはＥＣ１７ＳＩＷの５００nmol／kg処置を含んだ。
マウス血液のヒトＴ細胞由来ＩＦＮγレベルを、１１日目および１２日目にサテライト動物を使用して、全コホートで測定した(先のＥＣ１７用量後約２０時間および４２時間)。ＣＡＲＴ細胞のみを受けた腫瘍担持マウスと比較して、全ＥＣ１７処置腫瘍コホートは、約３０×(１１日目)および～１０×(１２日目)に、マウス血漿で高いＩＦＮγ産生を示し、このサイトカインレベルは２０時間～４２時間後に自然に
減少した(図１２、パネルＢ)。ＩＦＮγ放出に従って、ＥＣ１７はマウス血中でヒトＣＤ３ε＋ＥＧＦＲｔ＋事象として同定されるＣＡＲＴ細胞拡大も誘発し、細胞は、腫瘍担持動物で５４日目まで持続した(最終測定)(図１２、パネルＣ)。無腫瘍コホートで、ＣＡＲ－Ｔ細胞拡大はフローサイトメトリーで検出されなかったが、低レベルのＩＦＮγが、同じＣＡＲＴ細胞の数＋ＥＣ１７を受けた動物で１１日目および１２日目に検出された(図１２、パネルＢ～Ｃ)。さらに、ＣＲＳ症状(０～５スケールのうちグレード０)または体重減少は、５００nmol／kgのＥＣ１７の週２回投与で、無腫瘍マウスで観察されなかった。
中度～重度ＣＲＳ症状(グレード２～３)および顕著な体重減少(図１２、パネルＤ)が、腫瘍担持コホートで観察され、レジメン無関係のＥＣ１７投与を続けた。ＥＣ１７ＳＩＷ、５００nmol／kgはＣＲＳおよび体重減少の早期発生を起こしたが、攻撃的ＥＣ１７漸増－２レジメン(最大１０００nmol／kg)は、ＥＣ１７用量中止後、動物回復と共に、持続する体重減少を引き起こした(図１２、パネルＤ、上部行)。顕著なことに、移植変対宿主病(ＧＶＨＤ)の症状は、赤く、掻痒感のある皮膚および脱毛を含み、ＣＡＲＴ細胞移植約１ヶ月後明らかになった。ＣＡＲＴ細胞のみを受けた動物は、非特異的ＣＡＲＴ細胞／腫瘍アロ反応性の徴候を示したが、ＥＣ１７のみ処置コホートは、１００％治癒をもたらした(図１２、パネルＤ、下部行)。それ故に、ＦＲ＋腫瘍存在下のＥＣ１７投与は、ｉ)ＣＡＲＴ細胞活性化、ii)サイトカイン産生およびiii)インビボＣＡＲＴ細胞拡大および持続の駆動に重要であった。しかしながら、特異的条件下、重度ＣＲＳ(グレード≧３)は、５００nmol／kg以上のＥＣ１７用量と組み合わせた、高ＣＡＲＴ細胞用量により駆動された。

【0458】

抗白血病活性におけるＥＣ１７ＣＡＭ投与管理
静脈内移植ＧＦＰ発現ＴＨＰ１－ＦＲβ腫瘍細胞は、循環および肝臓／体中の非肝転移の腫瘍細胞を有するＮＳＧマウスで播種性疾患を発生させた。ＴＨＰ１－ＦＲβ腫瘍細胞は、腫瘍進行初期段階で炎症が出現したマウス卵巣にも局在化した。それ故に、試験コホートにおける各動物の総腫瘍負荷を、血中循環ＧＦＰ＋腫瘍細胞、肝臓重量および裸眼で可視の全包含非肝臓マクロ転移の定量により評価した。ＴＨＰ１－ＦＲβはインビトロで低レベルのＦＲを発現したが、ＴＨＰ１－ＦＲβ腫瘍転移は約８.９±２.８pmol／mg膜タンパク質レベルで、予想より高い機能的ＦＲを発現することが判明した。故に、ＴＨＰ１－ＦＲβ腫瘍担持マウスに、ＥＧＦＲｔ－未選別Ｅ２－ＣＡＲＴ細胞(約２３％ＥＧＦＲｔ＋、１：１ＣＤ４：ＣＤ８)を約６００万／動物の試験バッチを移植し、ついで、３つの異なるＥＣ１７投与レジメンで処置した(図１３)。ＣＡＲＴ細胞注射３日後から開始して、ＥＣ１７投与レジメンを、ＳＩＷで５００nmol／kgで連続的に、週３回(ＴＩＷ)、５／５０／５００nmol／kgで月曜日／水曜日／金曜日に、続いて９日間休薬またはサイクル１で５／１０／１００nmol／kg、サイクル２で５／３０／３００nmol／kgおよびサイクル３で５／５０／５００nmol／kgの加速用量漸増レジメンで、月曜日／木曜日／月曜日(Ｍ／Ｔｈ／Ｍ)に、続いて６日間休薬で開始した(図１３、パネルＡ)。サイクル２および３で、多少の体重減少およびグレード１～２ＣＲＳがＥＣ１７ＳＩＷ処置を受けた動物で観察されたが、ＥＣ１７ＴＩＷを受けた動物は、グレード０～１ＣＲＳのみで体重減少が最小であった(図１３、パネルＢ)。３サイクルのＥＣ１７Ｍ／Ｔｈ／Ｍ用量漸増を受けた動物のうち、グレード０～１ＣＲＳおよび極めて軽度の体重減少が、サイクル２の３００nmol／kgのＥＣ１７の最終用量後観察された。３１日目にサテライト動物を使用して、ＣＡＲＴ細胞を血液で数え上げ、データは、全処置コホートでＥＣ１７依存性ＣＡＲＴ細胞拡大および持続を示した(図１３、パネルＣ)。腫瘍細胞のみまたはＥＣ１７無しで腫瘍細胞＋ＣＡＲＴ細胞を受けた対照動物と比較して、３「患者内」漸増形式のいずれかで投与したＥＣ１７は、血中循環ＴＨＰ１－ＦＲβ腫瘍細胞を効率的に減少させ、肝臓腫瘍転移に類似活性を示した(図１３、パネルＤ、左および中央棒グラフ)。軽度同種異系反応性のみが、ＣＡＲＴ細胞のみを受けたマウスのＴＨＰ１－ＦＲβ肝転移で観察された。１０倍用量漸増(オン／オフ)のＥＣ１７ＳＩＷおよびＴＩＷは、非肝臓マクロ転移の完全制御に成功したが、サイクルあたりゆっくりしたペースのＥＣ１７Ｍ／Ｔｈ／Ｍ用量漸増(図１３、パネルＡ)は、非肝臓マクロ転移制御ができなかった(図１３、パネルＤ、最右パネル)。試験終了時(すなわち、ＣＡＲＴ細胞注射後３９日)、肝臓ＴＨＰ１－ＦＲβ腫瘍転移から単離したＣＡＲＴ細胞は、ダブルおよびトリプルポジティブＴ細胞阻害性受容体、ＰＤ１、ＬＡＧ３およびＴＩＭ３発現が最小であることが見られた(図１３、パネルＥ)。全体的、重度ＣＲＳ(すなわち、グレード≧３)はＥＣ１７処置コホートのいずれでも観察されなかった。それにも関わらず、より攻撃的ＥＣ１７ＴＩＷ用量漸増(オン／オフ)スケジュールは、これらマウスで全ＴＨＰ１－ＦＲβ腫瘍負荷の軽減に最良のレジメンである傾向を示した。

【0459】

実施例２４
機能的ＦＲ評価
これらの機能的ＦＲ評価を、ここに記載する実施例に適用した。ＦＲα(ＨＯＳ－ＦＲα)およびＦＲβ(ＴＨＰ１－ＦＲβ)でトランスフェクトした小児癌細胞株以外、種々の組織学およびＦＲ発現レベルの癌細胞株(図１１)を包含させた。放射性リガンド結合アッセイ(１００nM ^３Ｈ－ＦＡ、１時間、３７℃)で概算して、これら細胞株の総利用可能ＦＲの順序は、９×１０^４(ＯＶ９０、低ＦＲ発現卵巣癌細胞株)、１.９×１０^５(ＴＨＰ１－ＦＲβ)、２.４×１０^５(ＨＯＳ－ＦＲα^ｆＬｕｃ)、７×１０^５(ＨＯＳ－ＦＲα)、２.１×１０^６(ＭＤＡ－ＭＢ－２３１)および４.８×１０^６(ＫＢ)ＦＡ分子／細胞であった。ＦＲ陰性対照として、ＨＯＳ－１４３ｂ^{(ｆＬｕｃ)}およびＴＨＰ１－ＦＧ１２親細胞株もまた包含させた。故に、共培養ＦＲ＋癌細胞株の機能的ＦＲ発現順は、ＫＢ＞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１＞ＨＯＳ－ＦＲα＞ＨＯＳ－ＦＲα^ｆＬｕｃ＞ＴＨＰ１－ＦＲβ(ＡＭＬ)＞ＯＶ９０であった。

【0460】

実施例２５
統計
統計分析を、コンピュータプログラムGraphPad Prism(GraphPad Software Inc., San Diego, CA)で実施した。データを、スチューデントｔ検定または一元配置ＡＮＯＶＡを使用して解析した。適用可能であれば、データをさらに適切な複数後検定を使用して、複数処置群にわたり解析した。＊＝ｐ＜０.０５を全試験で統計学的有意とした。

【図1】