(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-07
(45)【発行日】2024-10-16
(54)【発明の名称】組換えタンパク質の連続的生産
(51)【国際特許分類】
C07K 1/16 20060101AFI20241008BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20241008BHJP
C12P 21/02 20060101ALN20241008BHJP
【ＦＩ】
C07K1/16
C12M1/00 A
C12P21/02 C
【請求項の数】
43
(21)【出願番号】P 2021559051
(86)(22)【出願日】2020-04-01
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-25
(86)【国際出願番号】 US2020026107
(87)【国際公開番号】W WO2020205928
(87)【国際公開日】2020-10-08
【審査請求日】2023-02-09
(31)【優先権主張番号】62/828,755
(32)【優先日】2019-04-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】500034653
【氏名又は名称】ジェンザイム・コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(72)【発明者】
【氏名】マイケル・クールボー
(72)【発明者】
【氏名】タール・ヴェッター
(72)【発明者】
【氏名】チャド・ヴァーナー
(72)【発明者】
【氏名】ケヴィン・ブラウァー
【審査官】太田 雄三
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１６－５１９１３７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５４４５２４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５２２１６９（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１８／００５１０５４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０２９９２４９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／１６４９９５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１５／１９８３２０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１７－５１５５０１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５１０９８１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５１８７４９（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００
Ｃ１２Ｍ １／００
Ｃ１２Ｐ ２１／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
組換えタンパク質を連続的に生産する方法であって、（ａ）１つまたは複数の捕捉クロマトグラフィーシステムを用いて、実質的に無細胞サンプルから組換えタンパク質を捕捉し、１つまたは複数の捕捉クロマトグラフィーシステムから組換えタンパク質を溶出させて、組換えタンパク質を含む溶出物を生成することであって、該溶出物は組換えタンパク質を含む単一の混合物に均質化されることと；
（ｂ）均質化された単一の混合物を、１つまたは複数の捕捉後クロマトグラフィーシステムに供し、組換えタンパク質を含む生成物の出力を収集することと；
（ｃ）生成物の出力を限外濾過と透析濾過に供し、組換えタンパク質を精製することと；
を含み、各工程は単位操作で行われ、各単位操作は、工程（ａ）から工程（ｃ）まで物理的に接続されており、工程（ａ）から工程（ｃ）の接続された単位操作は、工程（ａ）から工程（ｃ）の組換えタンパク質を含む連続的なフローを処理する、前記方法。
【請求項2】
工程（ａ）に続いて、均質化された単一の混合物をウイルス不活性化に供することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ウイルス不活性化は、溶媒－界面活性剤溶液による不活性化、熱による不活性化、または酸性ｐＨによる不活性化を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
酸性ｐＨによる不活性化は：（ａ）均質化された単一の混合物に、１つまたはそれ以上の溶液を加えてインラインで低ｐＨに調整することと；
（ｂ）調整された均質化された単一の混合物を、ウイルス不活性化混合物になる間、低ｐＨでインキュベートすることと
を含む請求項３に記載の方法。
【請求項5】
期間は１５分から２時間の間である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
工程（ｂ）の生成物の出力をウイルス濾過に供することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
実質的に無細胞サンプルは、組換えタンパク質を産生する宿主細胞を含む灌流バイオリアクター、組換えタンパク質を産生する宿主細胞を含むフェッドバッチバイオリアクター、または組換えタンパク質を産生する宿主細胞を含む清澄化液体培養物から除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
１つまたは複数の捕捉クロマトグラフィーシステムおよび１つまたは複数の捕捉後クロマトグラフィーシステムは、樹脂ビーズ、多孔質膜、またはナノファイバーを含むクロマトグラフィー媒体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
クロマトグラフィー媒体は、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、または混合モードクロマトグラフィーのために官能化されている、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
アフィニティークロマトグラフィー媒体は、プロテインＡベースの樹脂である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
１つまたは複数の捕捉クロマトグラフィーシステムおよび１つまたは複数の捕捉後クロマトグラフィーシステムは、周期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
調整された均質化された単一の混合物を、ウイルス不活性化をもたらす一定期間、低ｐＨでインキュベートすることは管型流通式リアクターで行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項13】
１つまたはそれ以上の溶液の添加は、インラインでの組換えタンパク質濃度測定およびインラインでの流量測定に基づく、請求項４に記載の方法。
【請求項14】
ウイルス濾過は、加圧ループ内で行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項15】
加圧ループは、圧力容器、ウイルス除去フィルタ、および滅菌フィルタを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
圧力容器は、単回使用、密閉式、および滅菌可能な容器である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
ウイルス除去フィルタは、限外濾過膜またはナノフィルタである、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
ウイルス濾過は、デッドエンド濾過を用いて行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項19】
デッドエンド濾過は、限外濾過膜またはナノフィルタを用いて行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
限外濾過は、単一パス接線流濾過で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項21】
透析濾過は、単一パス透析濾過カセットを用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項22】
組換えタンパク質は、抗体またはその抗原結合断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項23】
工程（ｃ）の後に１つまたはそれ以上の賦形剤を加えて治療用薬剤物質を生成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項24】
組換えタンパク質を生産するための製造システムであって、（ａ）組換えタンパク質を産生する宿主細胞を含むバイオリアクターを含む第１の単位操作と；
（ｂ）１つまたは複数の捕捉クロマトグラフィーシステムを含む第２の単位操作と；
（ｃ）１つまたは複数の捕捉後クロマトグラフィーシステムを含む第３の単位操作と；
（ｄ）限外濾過システムと透析濾過システムを含む第４の単位操作と
を含み、（ａ）から（ｄ）の各単位操作は、物理的に接続されており、接続された各単位操作は、組換えタンパク質を含む連続的なフローを処理する、前記製造システム。
【請求項25】
第１の単位操作と第２の単位操作との間に位置する第５の単位操作をさらに含み、第５の単位操作は、ウイルス不活性化を事前に行うためのサブシステムを含む、請求項２４に記載のシステム。
【請求項26】
サブシステムは、管型流通式リアクターである、請求項２５に記載のシステム。
【請求項27】
第３の単位操作と第４の単位操作との間に位置する第６の単位操作をさらに含み、第６の単位操作は、ウイルス濾過を事前に行うための第２のサブシステムを含む、請求項２４に記載のシステム。
【請求項28】
１つまたは複数の捕捉クロマトグラフィーシステムおよび１つまたは複数の捕捉後クロマトグラフィーシステムは、樹脂ビーズ、多孔質膜、またはナノファイバーを含むクロマトグラフィー媒体を含む、請求項２４に記載のシステム。
【請求項29】
クロマトグラフィー媒体は、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、または混合モードクロマトグラフィーのために官能化されている、請求項２８に記載のシステム。
【請求項30】
アフィニティークロマトグラフィー媒体は、プロテインＡベースの樹脂である、請求項２９に記載のシステム。
【請求項31】
１つまたは複数の捕捉クロマトグラフィーカラムおよび１つまたは複数の捕捉後クロマトグラフィーシステムは、周期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ）である、請求項２４に記載のシステム。
【請求項32】
管型流通式リアクターは、定義された最小滞留時間が少なくとも３０分である、請求項２６に記載のシステム。
【請求項33】
ウイルス濾過を行うための第２のサブシステムは、ウイルス除去フィルタ、および滅菌フィルタを含む加圧コンテナである、請求項２７に記載のシステム。
【請求項34】
加圧コンテナは、単回使用、密閉式、および滅菌可能なコンテナである、請求項３３に記載のシステム。
【請求項35】
ウイルス除去フィルタは、限外濾過膜またはナノフィルタである、請求項３３に記載のシステム。
【請求項36】
第１の単位操作は、第２の単位操作の入口に接続された出口を含み、第２の単位操作は、第３の単位操作の入口に接続された出口を含み、第３の単位操作は、第４の単位操作の入口に接続された出口を含む、請求項２４に記載のシステム。
【請求項37】
第１の単位操作、第２の単位操作、第３の単位操作、および第４の単位操作のそれぞれの間に、サージ容器をさらに含む、請求項２４に記載のシステム。
【請求項38】
組換えタンパク質は、抗体またはその抗原結合断片である、請求項２４に記載のシステム。
【請求項39】
システムはスキッド上にある、請求項２４に記載のシステム。
【請求項40】
システムは閉じられている、請求項２４に記載のシステム。
【請求項41】
第３のサブシステムを含む第７の単位操作をさらに含み、第３のサブシステムは、治療用薬剤物質を製剤化するためのインライン賦形剤を含む、請求項２４に記載のシステム。
【請求項42】
組換えタンパク質は、単一パス接線流濾過による限外濾過を用いて、および、単一パス透析濾過を用いて、精製される、請求項１に記載の方法。
【請求項43】
限外濾過システムは、単一パス接線流濾過を含み、透析濾過システムは、単一パス透析濾過カセットを含む、請求項２４に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示内容が参照により本明細書に明示的に組み入れられている、２０１９年４月３日に出願された米国仮出願第６２／８２８，７５５号の優先権を主張するものである。
本出願は、その開示内容が参照により本明細書に明示的に組み入れられている、２０１９年４月３日に出願された米国仮出願第６２／８２８，７５５号の優先権を主張するものである。
【0002】
本開示は、組換えタンパク質を連続的に生産するための方法およびシステムに関する。特定の実施形態では、本開示は、組換えタンパク質を連続的に生産するための、捕捉クロマトグラフィー、捕捉後クロマトグラフィー、ウイルス濾過、および限外濾過／透析濾過を使用する方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【0003】
連続的製造は、石油化学や食品生産のような産業において、日常的に行われている生産方法である。連続的プロセスの利点としては、定常運転、装置の小型化、高い容積測定生産性、プロセスフローの合理化、低サイクルタイム、資本コストの削減などが挙げられる。非特許文献１。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｖら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０４（３）：８１３～２０頁（２０１５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
バイオ医薬品業界では、連続的製造は幅広くは実施されていない。上流の開発と下流の開発では技術的なニーズが大きく異なるため、下流での連続運転の経験は限られている。そのため、バイオ医薬品業界では、最小限のオペレーターの操作で長時間稼働できる統合型の連続的バイオプロセスが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0006】
組換えタンパク質を連続的に生産する方法であって、（ａ）１つまたは複数の捕捉クロマトグラフィーシステムを用いて、実質的に無細胞サンプルから組換えタンパク質を捕捉し、１つまたは複数の捕捉クロマトグラフィーシステムから組換えタンパク質を溶出させて、組換えタンパク質を含む溶出物を生成することであって、単一または複数の溶出物は組換えタンパク質を含む単一の混合物に均質化されることと、（ｂ）単一の混合物を、１つまたは複数の捕捉後クロマトグラフィーシステムに供し、組換えタンパク質を含む生成物の出力を収集することと、（ｃ）生成物の出力を限外濾過と透析濾過に供し、組換えタンパク質を精製することとを含み、方法は、工程（ａ）から工程（ｃ）まで統合的かつ連続的に行われる方法が本明細書で提供される。
【0007】
また、組換えタンパク質を生産するための製造システムであって、（ａ）組換えタンパク質を産生する宿主細胞を含むバイオリアクターを含む第１の単位操作と、（ｂ）１つまたは複数の捕捉クロマトグラフィーシステムを含む第２の単位操作と、（ｃ）１つまたは複数の捕捉後クロマトグラフィーシステムを含む第３の単位操作と、（ｄ）限外濾過システムと透析濾過システムを含む第４の単位操作とを含む製造システムが本明細書で提供される。
【0008】
また、組換えタンパク質を連続的に生産する方法であって、（ａ）１つまたは複数の捕捉クロマトグラフィーシステムを用いて、実質的に無細胞サンプルから組換えタンパク質を捕捉し、１つまたは複数の捕捉クロマトグラフィーシステムから組換えタンパク質を溶出させて、組換えタンパク質を含む溶出物を生成することであって、溶出物は組換えタンパク質を含む単一の混合物に均質化されることと、（ｂ）均質化された単一の混合物をウイルス不活性化に供することと、（ｃ）工程（ｂ）の均質化された単一の混合物を、１つまたは複数の捕捉後クロマトグラフィーシステムに供し、組換えタンパク質を含む生成物の出力を収集することと、（ｄ）工程（ｃ）の生成物の出力をウイルス濾過に供することと、（ｅ）工程（ｄ）の生成物の出力を限外濾過と透析濾過に供し、組換えタンパク質を精製することとを含み、方法は、工程（ａ）から工程（ｅ）まで統合的かつ連続的に行われる方法が本明細書で提供される。
【0009】
他の態様、実施形態、および実施態様は、必要に応じて添付の図面を参照して、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】本明細書で開示する方法のプロセスフローを示す模式図である。プロセスフローは：（１）二重交互接線流（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ）（ＡＴＦ）フィルタと細胞分離を結合したバイオリアクターで組換えタンパク質を生産すること（「ＢＲＸ」と表記）、（２）１つまたは複数の捕捉クロマトグラフィーシステムを用いて組換えタンパク質を捕捉し、捕捉クロマトグラフィーシステムに接続されたバイオリアクターから得られた培養液中に存在する組換えタンパク質を捕捉すること（「捕捉」と表記）、（３）培地のウイルス不活性化（「ＶＩ」と表記）、（４）培地を１つまたは複数の捕捉後クロマトグラフィーシステムに供すること（「捕捉後」と表記）、（５）培地のウイルス濾過、および（６）培地の限外濾過／透析濾過、を含むインラインでの緩衝液を用いた組換えタンパク質の生産のための連続的プロセスを含む。
【図2】図２Ａ～図２Ｂは、本明細書で開示する方法およびシステムの単位操作の統合の概要を示す図である。図２Ａは、各単位操作の連続運転のための単位操作の統合の期間を示す。図２Ｂは、各単位操作の平均タンパク質滞留時間を示す。本明細書で開示する方法およびシステムは、２５日間で約５ｋｇの薬剤物質を生成した。
【図3-1】図３Ａ～図３Ｆは、本明細書に開示された方法およびシステムのプロテインＡの操作性能を示すグラフである。図３ＡはプロテインＡ溶出物の濃度（ｇ／Ｌ）を示し、図３ＢはプロテインＡ溶出物残留宿主細胞タンパク質を示し、図３ＣはプロテインＡ溶出物残留タンパク質を示し、図３ＤはプロテインＡの入口質量流量を示し、図３Ｅおよび３ＦはプロテインＡの紫外線クロマトグラムを示す。
【図4-1】図４Ａ～図４Ｇは、本明細書に開示された方法およびシステムのウイルス不活性化操作性能を示すグラフである。図４Ａは、単位操作を通して維持されるウイルス不活性化ｐＨを示し、図４Ｂは、不活性化前のタンパク質濃度を示し、図４Ｃは、ウイルス不活性化中のタンパク質質量流量を示し、図４Ｄは、ウイルス不活性化中の酸フローを示し、図４Ｅは、ウイルス不活性化中の塩基フローを示し、図４Ｆは、ウイルス不活性化中の高分子量種を示し、図４Ｇは、ウイルス不活性化後のタンパク質濃度を示す。
【図5-1】図５Ａ～図５Ｄは、本明細書に開示された方法およびシステムの捕捉後の操作性能を示すグラフである。図５Ａは捕捉後の溶出物の残留プロテインＡを示し、図５Ｂは捕捉後の溶出物のタンパク質濃度を示し、図５Ｃは紫外線クロマトグラムを示し、図５Ｄは捕捉後の溶出物の残留宿主細胞タンパク質を示す。
【図6-1】図６Ａは、本明細書に開示された方法およびシステムのウイルス濾過の模式図である。図６Ｂ～図６Ｇは、本明細書に開示された方法およびシステムのウイルス濾過操作性能を示すグラフである。図６Ｂは、ウイルス濾過後のタンパク質濃度を示し、図６Ｃは、ウイルス濾過後の高分子量種を示し、図６Ｄは、ウイルス濾過中のタンパク質質量流束を示し、図６Ｅは、ウイルス濾過中の濾液体積流束を示し、図６Ｆは、ウイルス濾過中の膜貫通圧力を示し、図６Ｇは、ウイルス濾過中のフィルタ性能を示す。
【図7-1】図７Ａ～図７Ｅは、本明細書に開示された方法およびシステムの限外濾過操作性能を示すグラフである。図７Ａは、限外濾過後のタンパク質濃度および変換を示し、図７Ｂは、限外濾過中のフィルタ性能を示し、図７Ｃは、限外濾過中の入口タンパク質質量流束を示し、図７Ｄは、限外濾過中の透過液体積流束を示し、図７Ｅは、限外濾過中の膜貫通圧力を示す。
【図8-1】図８Ａ～図８Ｅは、本明細書に開示された方法およびシステムの透析濾過操作性能を示すグラフである。図８Ａは、透析濾過中の透過液体積流束を示し、図８Ｂは、透析濾過中のタンパク質質量流束を示し、図８Ｃは、透析濾過中の膜貫通圧力を示し、図８Ｄは、透析濾過比を示し、図８Ｅは、透析濾過中のフィルタ性能を示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本開示は、組換えタンパク質を連続的に生産するための方法およびシステムに関する。特定の実施形態では、本開示は、組換えタンパク質を生産するための、捕捉クロマトグラフィー、捕捉後クロマトグラフィー、および限外濾過／透析濾過を使用する方法およびシステムに関する。本明細書に記載の方法およびシステムは、組換えタンパク質の連続的かつ時間効率的な生産を提供する。
【0012】
本開示に従って利用される場合、特に明記しない限り、すべての技術的および科学的用語は、当業者が一般的に理解しているのと同じ意味を持つと理解されるものとする。文脈上特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【0013】
一部の実施形態では、組換えタンパク質を連続的に生産する方法であって、１つまたは複数の捕捉クロマトグラフィーシステムを用いて、実質的に無細胞サンプルから組換えタンパク質を捕捉し、１つまたは複数の捕捉クロマトグラフィーシステムから組換えタンパク質を溶出させて、組換えタンパク質を含む溶出物を生成することであって、溶出物は組換えタンパク質を含む単一の混合物に均質化されることと、均質化された単一の混合物を、１つまたは複数の捕捉後クロマトグラフィーシステムに供し、組換えタンパク質を含む生成物の出力を収集することと、生成物の出力を限外濾過と透析濾過に供し、組換えタンパク質を精製することとを含み、方法は、統合され、連続的に行われる方法が本明細書で提供される。
【0014】
また、組換えタンパク質を生産するための製造システムであって、組換えタンパク質を産生する宿主細胞を含むバイオリアクターを含む第１の単位操作と、１つまたは複数の捕捉クロマトグラフィーシステムを含む第２の単位操作と、１つまたは複数の捕捉後クロマトグラフィーシステムを含む第３の単位操作と、限外濾過システムと透析濾過システムを含む第４の単位操作とを含む製造システム、が本明細書で提供される。
【0015】
一部の実施形態では、製造システムは、第１の単位操作と第２の単位操作との間に位置する第５の単位操作を含み、第５の単位操作は、ウイルス不活性化を事前に行うためのサブシステムを含む。一部の実施形態では、製造システムは、第３の単位操作と第４の単位操作との間に位置する第６の単位操作を含み、第６の単位操作は、ウイルス濾過を事前に行うための第２のサブシステムを含む。一部の実施形態では、製造システムは、第３のサブシステムを含む第７の単位操作を含み、第３のサブシステムは、治療用薬剤物質を製剤化するためのインライン賦形剤を含む。
【0016】
本明細書では、「実質的に無細胞」は、哺乳動物細胞のような特定の物質を少なくとももしくは約９０％含まない（例えば、少なくとももしくは約９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとももしくは約９９％、または約１００％含まない）サンプルを表す。
【0017】
特定の実施形態では、実質的に無細胞サンプルが、組換えタンパク質を産生する宿主細胞を含む灌流バイオリアクター、組換えタンパク質を産生する宿主細胞を含むフェッドバッチバイオリアクター、または組換えタンパク質を産生する宿主細胞を含む清澄化液体培養物から除去される。
【0018】
本明細書では、「液体培養培地」は、細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで成長または増殖するのに十分な栄養分を含む液体を表す。例えば、液体培養培地には：アミノ酸（例えば、２０種類のアミノ酸）、プリン（例えば、ヒポキサンチン）、ピリミジン（例えば、チミジン）、コリン、イノシトール、チアミン、葉酸、ビオチン、カルシウム、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チミジン、シアノコバラミン、ピルビン酸、リポ酸、マグネシウム、グルコース、ナトリウム、カリウム、鉄、銅、亜鉛、および炭酸水素ナトリウム、のうちの１つまたはそれ以上を含むことができる。一部の実施形態では、液体培養培地は、哺乳動物由来の血清を含むことができる。一部の実施形態では、液体培養培地は、哺乳動物由来の血清または他の抽出物を含まない（定義された液体培養培地）。一部の実施形態では、液体培養培地は、微量金属、哺乳動物成長ホルモン、および／または哺乳動物成長因子を含むことができる。追加の適切な液体培養培地は、当技術分野で公知であり、市販されている。
【0019】
本明細書では、「灌流バイオリアクター」は、第１の液体培養培地中に複数の細胞を含むバイオリアクターを表し、バイオリアクター内に存在する細胞の培養は、第１の液体培養培地を定期的または連続的に除去することと、それと同時にまたはその直後に、実質的に同量の第２の液体培養培地をバイオリアクターに加えることとを含む。一部の実施形態では、培養期間中の漸進的期間（例えば、約２４時間の期間、約１分から約２４時間の間の期間、または２４時間を超える期間）にわたって除去および追加される第１の液体培地の量に漸進的変化（例えば、増加または減少）がある（例えば、１日単位での培地の再給率など）。一日ごとに除去され交換される培地の割合は、培養される特定の細胞、初期播種密度、および特定の時間における細胞密度に応じて変化し得る。
【0020】
本明細書では、「フェッドバッチバイオリアクター」は、複数の細胞を含むバイオリアクターで、細胞の成長と生成物の形成に必要な栄養素が、１つまたはそれ以上の供給流によって断続的または連続的に供給されるものを表す。
【0021】
本明細書では、「清澄化液体培養培地」は、細菌や酵母の細胞培養から得られた液体培養培地で、細菌や酵母の細胞が実質的に含まれていない（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、または９９％含まれていない）ものを表す。
【0022】
本明細書では、「組換えタンパク質」は、免疫グロブリン、タンパク質断片、操作されたタンパク質、血液因子、ナノボディ、または酵素を表し、そのため抗体または抗体断片も含む。
【0023】
本明細書では、「単位操作」は、組換えタンパク質の製造方法、または組換えタンパク質の製造プロセスで使用されるシステムの構成要素で実行可能な機能工程を表す。例えば、単位操作は、濾過（例えば、組換え治療用タンパク質を含む液体からの汚染細菌、酵母ウイルス、もしくはマイコバクテリア、および／または特定の物質の除去）、捕捉、エピトープタグの除去、精製、保持または保存、研磨、ウイルス不活性化、組換えタンパク質を含む液体のイオン濃度および／またはｐＨの調整、ならびに不要な塩の除去であり得る。
【0024】
本明細書では、「連続的な方法」または「連続的なシステム」という用語は、単位操作の少なくとも一部に液体が連続的に供給される方法またはシステムを表す。単位操作は、連続的なフロー入力を長時間処理できる場合、連続的である。連続的な単位操作は、最小限の内部保持量を有する。出力は、連続的である、または周期的に生成される小さなパケットで離散化される。統合された（物理的に接続された）連続的な単位操作で構成され、その間の内部保持量がゼロまたは最小の場合、その方法は連続的である。
【0025】
本明細書では、「統合された方法」は、特定の結果（例えば、液体培養培地からの組換えタンパク質の生成）を達成するために協調して機能する構造要素を使用して実行される方法を表す。
【0026】
本明細書では、「溶出物」は、検出可能な量の組換えタンパク質を含むクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から排出される液体を表す。
【0027】
本明細書では、「クロマトグラフィー媒体」は、クロマトグラフィーカラムに充填される材料を表す。
【0028】
一部の実施形態では、本明細書に開示されたシステムは、閉鎖システムである。閉鎖システムは、外部環境への露出を制限するように設計および操作される単位操作を含む。材料を閉鎖システムに導入することができるが、追加は、生成物が室内環境にさらされることを避けるように行われなければならない。
【0029】
本明細書に開示された方法およびシステムは、１つまたは複数の捕捉クロマトグラフィーシステムを用いて組換えタンパク質を捕捉し、１つまたは複数の捕捉クロマトグラフィーシステムから組換えタンパク質を溶出させて、組換えタンパク質を含む溶出物を生成することを含む。捕捉クロマトグラフィーシステムのうちの１つまたはそれ以上に含まれるクロマトグラフィー媒体は、捕捉機構（例えば、プロテインＡ結合捕捉機構、プロテインＧ結合捕捉機構、抗体もしくは抗体断片結合捕捉機構、基質結合捕捉機構、補因子結合捕捉機構、タグ結合捕捉機構、および／またはアプタマー結合捕捉機構）を利用する樹脂である可能性がある。一部の実施形態では、１つまたは複数の捕捉クロマトグラフィーシステムは、樹脂ビーズ、多孔質膜、またはナノファイバーからなるクロマトグラフィー媒体を含む。一部の実施形態では、クロマトグラフィー媒体は、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、または混合モードクロマトグラフィーのために官能化されている。一部の実施形態では、アフィニティークロマトグラフィー媒体は、プロテインＡベースの樹脂である。
【0030】
一部の実施形態では、１つまたは複数の捕捉クロマトグラフィーシステムは、周期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ）である。一部の実施形態では、ＰＣＣＳは、２つのクロマトグラフィーカラムを含むか、または、例えば、４、５、６、７、８、もしくは８以上のカラムまで実行可能な修正ＡＫＴＡシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含む。一部の実施形態では、ＰＣＣＳは、カラムスイッチ機構を利用する。カラムスイッチイベントは、クロマトグラフィーシステムを通過する液体中のあるレベルの組換えタンパク質に対応するＵＶ吸光によって検出された組換えタンパク質のレベルの検出、特定の体積の液体（例えば、緩衝液）、または特定の時間経過によって始動される。
【0031】
捕捉クロマトグラフィーシステムを用いて組換えタンパク質を捕捉するためには、捕捉クロマトグラフィーシステムの負荷、洗浄、溶出、再生という一連のクロマトグラフィー工程を行う必要がある。
【0032】
一部の実施形態では、１つまたは複数の捕捉クロマトグラフィーシステムからの溶出物を、組換えタンパク質を含む単一の混合物に均質化する。一部の実施形態では、均質化された単一の混合物を、１つまたは複数の捕捉後クロマトグラフィーシステムに供し、組換えタンパク質を含む生成物の出力を収集する。捕捉後クロマトグラフィーシステムは、最終的な所望の純度に近い組換えタンパク質を含む液体から、残存する微量または少量の汚染物質または不純物を除去するために使用される。一部の実施形態では、１つまたは複数の捕捉後クロマトグラフィーシステムは、樹脂ビーズ、多孔質膜、またはナノファイバーからなるクロマトグラフィー媒体を含む。一部の実施形態では、クロマトグラフィー媒体は、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、または混合モードクロマトグラフィーのために官能化されている。一部の実施形態では、１つまたは複数の捕捉後クロマトグラフィーカラムは、周期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ）である。
【0033】
捕捉後クロマトグラフィーシステムを用いて組換えタンパク質を捕捉するためには、捕捉後クロマトグラフィーシステムの負荷、洗浄、溶出、再生という一連のクロマトグラフィー工程を行う必要がある。
【0034】
一部の実施形態では、方法およびシステムは、組換えタンパク質をさらに精製および濃縮するために、限外濾過（ＵＦ）および／または透析濾過（ＤＦ）を含む。ＵＦ／ＤＦは、組換えタンパク質の濃度を高めるだけでなく、緩衝塩を特定の製剤用緩衝液に置換することができる。限外濾過（ＵＦ）は、静水圧によって液体を半透膜に押し付ける膜濾過の一種である。一部の実施形態では、ＵＦは、単一ＴＦＦおよび高性能接線流濾過（ＨＰＴＦＦ）を含む接線流濾過（ＴＦＦ）で実行される。単一パス接線流濾過（ＳＰＴＦＦ）とは、モジュールを通過する単一パスでの変換（透過流量を入口供給流量で除した値）が十分に大きく、システムが保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）のリサイクル（再循環）ループなしで運転できる任意のＴＦＦシステムを表す。ＳＰＴＦＦは、例えば、クロマトグラフィーや沈殿工程の前にプロセス量を減らすために、他の単位操作の間にインラインで濃縮するために使用することができる。Ｚｙｄｎｅｙ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１３（３）：４６５～７５頁、（２０１６）。
【0035】
本明細書では、「透析濾過」は、限外濾過膜を用いて、抗体のようなタンパク質、ペプチド、核酸、およびその他の生体分子を含む溶液から塩や緩衝成分を除去、置換、または濃度を低下させる方法を表す。連続的透析濾過（定容量透析濾過とも呼ばれる）では、組換え産生されたポリペプチドを含む製剤を形成するために、水または製剤用緩衝液のような新しい緩衝液を保持物に加えることにより、保持物中の元の緩衝液の塩（または他の低分子量種）を洗い流すことを含む。一般的には、新しい緩衝液は、透析濾過中に保持物の体積および生成物の濃度が著しく変化しないように、濾液が生成されるのと同じ速度で添加される。特定の実施形態では、透析濾過は単一パス透析濾過カセットを用いて行われる。
【0036】
一部の実施形態では、均質化された単一混合物は、１つまたは複数の捕捉後クロマトグラフィーシステムに供される前に、ウイルス不活性化に供される。一部の実施形態では、ウイルス不活性化は、溶媒－界面活性剤溶液による不活性化、熱による不活性化、または酸性ｐＨによる不活性化を含む。
【0037】
溶媒－界面活性剤によるウイルス不活性化では、組換えタンパク質を含むサンプルを有機溶媒と界面活性剤に供することを含む。溶媒と界面活性剤の組合せは、トリ－ｎ－ブチルリン酸とＴｒｉｔｏｎＸ－１００（商標）、Ｔｗｅｅｎ８０（商標）とコール酸ナトリウム、その他のような当業者で知られている任意の溶媒と界面活性剤の組合せが可能である。
【0038】
熱不活性化によるウイルス不活性化は、組換えタンパク質を含むサンプルを高温にさらすことを含む。一部の実施形態では、方法は、サンプルを、４５℃以上、４６℃以上、４７℃以上、４８℃以上、および約４９℃以上、５０℃以上、５１℃以上まで、およびそれ以上の温度に加熱することを含む。一部の実施形態では、サンプルは、４５℃から６５℃の間の温度に加熱される。
【0039】
サンプルを加熱する期間は変えることができる。例えば、一部の実施形態では、サンプルは、１分から６時間の間の期間、目標温度に加熱される。一部の実施形態では、サンプルは、１０分から１８０分の間、２０分から１８０分の間、２０分から６０分の間、または２０分から４０分の間の期間、目標温度に加熱される。
【0040】
一部の実施形態では、酸性ｐＨによる不活性化は、均質化された単一の混合物を、１つまたはそれ以上の溶液によってインラインで低ｐＨに調整すること、および調整された均質化された単一の混合物を、ウイルス不活性化混合物になる間、低ｐＨでインキュベートすること、によって行われる。
【0041】
本明細書に開示された方法およびシステムは、ＵＶ吸光によって検出される組換えタンパク質のレベルの検出、流量の検出、および／または液体（例えば、緩衝液）の体積の検出を含む、インラインモニタリングを含む。組換えタンパク質濃度のモニタリング（例えば、ＵＶモニタリングによって行われるモニタリング）は、フィードバック制御を伴う生成物濃度のインライン測定が可能な任意のツールによって決定することができる。
【0042】
一部の実施形態では、均質化された単一の混合物は、１５分から２時間の間、低ｐＨにさらされる。特定の実施形態では、低ｐＨは、３から５の間のｐＨである。ｐＨレベルの選択は、組換えタンパク質および他の緩衝剤成分の安定性プロファイルに依存する。ウイルス不活性化後、方法を継続する前に、抗体溶液のｐＨをより中性的なｐＨ、例えば４．０から８．５の間に調整することができる。
【0043】
一部の実施形態では、ウイルスの不活性化は、Ｐａｒｋｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１５（３）：６０６～１６頁（２０１８）に記載されているような管型流通式リアクターで行われる。一部の実施形態では、管型流通式リアクターは、定義された最小滞留時間が少なくとも３０分である。
【0044】
一部の実施形態では、捕捉後クロマトグラフィーシステムから出力された生成物の収集後に、ウイルス濾過のようなウイルス除去工程が含まれる。ウイルス除去工程は、ウイルス不活性化処理に対してより耐性のある小型非エンベロープ型ウイルスを除去するために行われる。一部の実施形態では、ウイルス濾過は、加圧ループで行われ、加圧ループは、圧力容器、ウイルス除去フィルタ、および滅菌フィルタを含む。一部の実施形態では、加圧ループ内のウイルス除去フィルタは、中空繊維ウイルスフィルタである。一部の実施形態では、圧力容器は、単回使用、密閉式、および滅菌可能な容器である。本明細書では、「滅菌可能な」という用語は、既知の滅菌方法に適合する材料から形成された容器を表す。一部の実施形態では、ウイルス濾過は、デッドエンド濾過を用いて行われる。本明細書では、「デッドエンド濾過」は、濾過される液体の流れ全体が、リサイクルまたは保持物の流れを伴わずにフィルタを通過する濾過を表す。一部の実施形態では、ウイルス除去フィルタは、限外濾過膜またはナノフィルタである。適切なウイルス濾過システムの一例は、国際公開ＷＯ２０１８／０３５１１６に開示され、参照によって本明細書に組み入れる。
【0045】
一部の実施形態では、第１の単位操作は、第２の単位操作の入口に接続された出口を含み、第２の単位操作は、第３の単位操作の入口に接続された出口を含み、第３の単位操作は、第４の単位操作の入口に接続された出口を含む。一部の実施形態では、第１の単位操作は、第５の単位操作の入口に接続された出口を含み、第５の単位操作は、第２の単位操作の入口に接続された出口を含み、第２の単位操作は、第３の単位操作の入口に接続された出口を含み、第３の単位操作は、第６の単位操作の入口に接続された出口を含み、第６の単位操作は、第４の単位操作の入口に接続された出口を含む。
【0046】
一部の実施形態では、本明細書に開示されたシステムは、第１の単位操作、第２の単位操作、第３の単位操作、および第４の単位操作のそれぞれの間に、サージ容器を含む。サージ容器は、次の単位操作に移動する前に、任意の液体培養物を保持することができる。
【0047】
本明細書に記載のシステムは、任意の単位操作の間に配置される液体導管も含むことができる。適切な液体導管は、ポリエチレン、ポリカーボネート、またはプラスチック製チューブである。液体導管は、次の：液体導管と液体連通しており、インライン緩衝液調整リザーバ内に貯蔵された緩衝液が液体導管内に存在する液体に追加されるように配置されている１つまたはそれ以上のインライン緩衝液調整リザーバと；液体導管内に存在する液体を濾過（例えば、細菌の除去）することができるように液体導管内に配置されている１つまたはそれ以上のフィルタ、のうちの１つまたはそれ以上を任意の組合せで含むこともできる。
【0048】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるシステムは、ポンプシステムを含む。ポンプシステムは、次のうち１つまたはそれ以上：当技術分野で既知の１つまたはそれ以上のポンプ、当技術分野で既知の１つまたはそれ以上のフィルタ、および１つまたはそれ以上のＵＶ検出器を含むことができる。
【0049】
一部の実施形態では、限外濾過／透析濾過の後に、１つまたはそれ以上の賦形剤を生成物の出力に加えて、治療用薬剤物質を生成する。
【0050】
本明細書では、「治療用薬剤物質」は、汚染タンパク質、脂質、核酸（例えば、液体培養培地中に存在する汚染タンパク質、脂質、核酸）や、宿主細胞（例えば、哺乳動物、酵母、細菌の宿主細胞由来）、および生物学的汚染物質（例えば、ウイルスや細菌の汚染物質）から十分に精製または分離された組換えタンパク質を含む物質を表し、さらに実質的な精製および／または汚染除去の工程を経ることなく、医薬品に製剤化することができる。
【0051】
一部の実施形態では、本明細書に開示されたシステムは、スキッド上にある。本明細書では、「スキッド」は、本明細書に記載のシステムのプラットフォームまたは支持体として機能することができる３次元の固体構造を表す。スキッドは、移動を可能にする１つまたはそれ以上の構造（例えば、車輪、ローラーなど）を含む場合、システムまたはその一部に移動性を付与することができる。
【0052】
一部の実施形態では、方法およびシステムは、少なくとも約４０％、５０％、５５％、または６０％、最大で約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の組換えタンパク質の回収率を有する。一部の実施形態では、精製回収率は少なくとも約６０％～約７０％である。
【0053】
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法およびシステムでは、治療用タンパク質薬剤物質中の組換えタンパク質の正味収量が、少なくとも約５日、１０日、２０日、または３０日、および少なくとも約２８０日、２９０日、３００日、３１０日、３２０日、３３０日、３４０日、３５０日、または３６５日までの連続した期間にわたって、少なくとも約５ｇ／日、１０ｇ／日または２０ｇ／日、３０ｇ／日または４０ｇ／日、および少なくとも約２００ｇ／日、３００ｇ／日、４００ｇ／日、５００ｇ／日、または１０００ｇ／日までとなる。
【0054】
以下の実施例は、本開示の具体的な実施形態およびその種々の使用を説明する。これらは説明のためだけに記載されており、いかなる方法でも本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例1】
【0055】
組換えタンパク質の連続的生産
二重ＡＴＦを結合した１００Ｌの強化灌流バイオリアクターを用いて、組換えモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を７０日間にわたって生産した。無細胞のｍＡｂを含む培地（採取）を、さらなる処理のために１００Ｌの採取サージ容器に連続的に投入した。
二重ＡＴＦを結合した１００Ｌの強化灌流バイオリアクターを用いて、組換えモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を７０日間にわたって生産した。無細胞のｍＡｂを含む培地（採取）を、さらなる処理のために１００Ｌの採取サージ容器に連続的に投入した。
【0056】
パイロットスケールのスチームインプレイス（ｓｔｅａｍ－ｉｎ－ｐｌａｃｅ）ＰＣＣスキッド上で、結合および溶出ＭＣＣモードで、充填済みで照射したプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラム１Ｌ（８×２０ｃｍ）２本を使用して、抗体含有培地を捕捉した。捕捉工程は、２本のカラムのうち１本が常に採取サージ容器から負荷され、捕捉工程の平均入口流量と灌流バイオリアクターの平均出口流量が一致するように実行した。プロテインＡカラムへの負荷は、Ｄｅｌｔａ ＵＶにより約３％のブレークスルーに制御された。個々の捕捉カラムの溶出物は、ウイルス不活性化の前に５Ｌの混合容器に集められた。プロテインＡの操作を、１２日目に灌流式バイオリアクターと統合し、５８日間連続して行った。プロテインＡの操作性能をまとめたデータを図３Ａ～３Ｆに示す。
【0057】
個々のプロテインＡ溶出物を５Ｌの混合容器で混合し、ウイルス不活性化単位操作のための均一な流れを確保した。混合容器からの流出を、次のプロテインＡ溶出サイクルの前に容器全体が処理されるように自動化した。１Ｍ酢酸を添加することによって、均質化されたプロテインＡ溶出物を、目標ｐＨの３．６にインラインで調整した。次いで、低ｐＨに調整したプロテインＡ溶出物を、少なくとも３０分以上の定義された最小滞留時間で管型流通式リアクター（ＴＦＲ）より送り出し、低ｐＨで十分な時間をかけてウイルスを完全に不活性化した。次いで、０．７５Ｍ酢酸ナトリウムを添加することによって、ウイルス不活性化されたプロテインＡ溶出物を、目標ｐＨの４．５にインラインで調整した。次いで、調整されたウイルス不活性化プロテインＡ溶出物を、滅菌グレードのフィルタで処理し、さらに処理するために小型サージ容器に連続的に収集した。ウイルス不活性化の操作を、１５日目に先行する操作と統合し、５５日間連続して行った。ウイルス不活性化の操作性能をまとめたデータを図４Ａ～４Ｇに示す。
【0058】
調整されたウイルス不活性化プロテインＡの溶出物を、混合モードの陰イオン交換樹脂と疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂を用いた２つの直交クロマトグラフィー操作でさらに処理し、フロースルーモードで運転した。この処理例では、２つの捕捉後クロマトグラフィー操作の間に工程間の調整はなく、混合モードカラムからのフロースルーを直接疎水性相互作用カラムに負荷することができた。捕捉後装置は、２本の０．２Ｌ（５×１０ｃｍ）充填済み混合モードカラムと２本の０．２Ｌ（５×１０ｃｍ）充填済み疎水性相互作用カラムからなり、プロテインＡの操作と同じＰＣＣスキッド上で、ＭＣＣモードで運転した。調整してウイルスを不活性化したプロテインＡの溶出物の流れを、並行する２つの捕捉後装置のうちの１つに連続的に負荷し、各捕捉後サイクルでプロテインＡの溶出物約２本分の質量が負荷されるようにカラムの負荷を自動化した。
【0059】
混合モード／疎水性相互作用を組み合わせたフロースルー（捕捉後溶出物と表示）を、さらなる処理のために小型のサージ容器に連続的に収集した。捕捉後クロマトグラフィー操作を、２３日目に先行する単位操作と統合し、４７日間連続して行った。捕捉後クロマトグラフィーの操作性能をまとめたデータを図５Ａ～５Ｄに示す。
【0060】
捕捉後溶出物を接線流モードで動作する０．１ｍ２のＰｌａｎｏｖａ ２０Ｎ（ＡＫ Ｂｉｏ）ウイルス除去フィルタでさらに処理した。捕捉後溶出物を、図６Ａに示すように、サージ容器から、圧力容器、ウイルス除去フィルタ、滅菌グレードのフィルタ、および再循環を駆動する蠕動ポンプを含む加圧ループに連続的に移送した。ループ内の圧力を、ウイルスフィルタを通過する正味の体積流量（透過液流束）が、捕捉後操作から排出される正味の体積流量と等しくなるように自動化した。Ｐｌａｎｏｖａ ２０Ｎフィルタは、予備的なウイルス検証研究に基づいて定期的に交換した。ウイルスを濾過した材料を、さらに処理するために小型サージ容器に連続的に収集した。ウイルス濾過の操作を、２９日目に先行する単位操作と統合し、４１日間連続して行った。ウイルス濾過の操作性能をまとめたデータを図６Ｂ～６Ｆに示す。
【0061】
ウイルス濾過した材料を、０．０６５ｍ２のＩＬＣ単一パスＴＦＦ（ＳＰ－ＴＦＦ）カセットを用いた限外濾過でさらに処理し、目標ｍＡｂ濃度の６５ｇ／Ｌまで濃縮した。ウイルス濾過後のサージ容器からＳＰ－ＴＦＦカセットの入口まで、ウイルス濾過操作の出口流量に合わせた流量で材料を送り出した。ＳＰ－ＴＦＦカセットからの保持物の流量を、生成物濃度のインライン測定によるフィードバックループを用いて自動的に制御し、目標濃度値を維持した。次いで、濃縮ｍＡｂの流れを、単一パス透析濾過（ＳＰ－ＤＦ）カセットの入口に直接送出し、インラインでの緩衝液交換を行った。透析濾過緩衝液をＳＰ－ＤＦカセットの緩衝液入口に送液し、緩衝液フローを自動化して生成物フローに対する緩衝液の比率を一定に保った。保持物の流量を入口の流量に合わせて制御した。次いで、濃縮した賦形剤溶液をインラインで添加することによって、緩衝液を交換したＤＦの保持物の流れを製剤化し、製剤原体を生成した。製剤原体を滅菌グレードのフィルタでさらに処理して薬剤物質を生成し、これを単回使用容器に収集した。限外濾過および透析濾過の操作を、４２日目に先行する単位操作と統合し、２９日間連続して行った。製剤化操作および薬剤物質生成を、４６日目に統合し、２５日間連続して行った。２５日の間に６バッチの薬剤物質が生成された。限外濾過および透析濾過の操作性能をまとめたデータを図７Ａ～７Ｅおよび図８Ａ～８Ｄに示す。図９Ａ～９Ｈは、生成された薬剤物質の性状を示す。
【実施例2】
【0062】
組換えタンパク質の連続的生産
二重ＡＴＦを結合した１００Ｌの強化灌流バイオリアクターを用いて、組換えモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を２７日間にわたって生産した。無細胞のｍＡｂを含む培地（採取）を、さらなる処理のために１００Ｌの採取サージ容器に連続的に投入した。
二重ＡＴＦを結合した１００Ｌの強化灌流バイオリアクターを用いて、組換えモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を２７日間にわたって生産した。無細胞のｍＡｂを含む培地（採取）を、さらなる処理のために１００Ｌの採取サージ容器に連続的に投入した。
【0063】
パイロットスケールのスチームインプレイスＰＣＣスキッド上で、結合および溶出ＭＣＣモードで、充填済みで照射したプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラム１Ｌ（８×２０ｃｍ）２本を使用して、抗体含有培地を捕捉した。捕捉工程は、２本のカラムのうち１本が常に採取サージ容器から負荷され、捕捉工程の平均入口流量と灌流バイオリアクターの平均出口流量が一致するように実行した。プロテインＡカラムへの負荷は、Ｄｅｌｔａ ＵＶにより約３％のブレークスルーに制御された。個々の捕捉カラムの溶出物は、ウイルス不活性化の前に５Ｌの混合容器に集められた。プロテインＡの操作を、１２日目に灌流式バイオリアクターと統合し、１５日間連続して行った。
【0064】
個々のプロテインＡの溶出物を５Ｌの混合容器で混合し、ウイルス不活性化単位操作のための均一な流れを確保した。混合容器からの流出を、次のプロテインＡ溶出サイクルの前に容器全体が処理されるように自動化した。１Ｍ酢酸を添加することによって、均質化されたプロテインＡ溶出物を、目標ｐＨの３．６にインラインで調整した。次いで、低ｐＨに調整したプロテインＡ溶出物を、少なくとも３０分以上の定義された最小滞留時間で、ガンマ線を照射した３Ｄプリントの管型流通式リアクター（ＴＦＲ）より送り出し、低ｐＨで十分な時間をかけてウイルスを完全に不活性化した。次いで、０．７５Ｍ酢酸ナトリウムを添加することによって、ウイルス不活性化されたプロテインＡ溶出物を、目標ｐＨの４．５にインラインで調整した。次いで、調整されたウイルス不活性化プロテインＡ溶出物を、滅菌グレードのフィルタで処理し、さらに処理するために小型サージ容器に連続的に収集した。ウイルス不活性化の操作を、１３日目に先行する操作と統合し、１４日間連続して行った。
【0065】
調整されたウイルス不活性化プロテインＡ溶出物を、混合モードの陰イオン交換樹脂と疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂を用いた２つの直交クロマトグラフィー操作でさらに処理し、フロースルーモードで運転した。捕捉後装置は、２本の０．２Ｌ（５×１０ｃｍ）充填済みガンマ線照射済み混合モードカラムと、２本の０．２Ｌ（５×１０ｃｍ）充填済みガンマ線照射済み疎水性相互作用カラムからなり、ＭＣＣモードで運転した。調整してウイルスを不活性化したプロテインＡの溶出物の流れを、２本の混合モードカラムのうち１本に連続的に負荷し、混合モードカラムのフロースルーを、２本の疎水性相互作用カラムのうち１本に連続的に負荷した。混合モードカラムと疎水性相互作用カラムは、それぞれの負荷容量まで独立して負荷した。
【0066】
捕捉後クロマトグラフィー操作を、１４日目に先行する単位操作と統合し、１３日間連続して行った。
【0067】
捕捉後溶出物を接線流モードで動作する０．１ｍ２のＰｌａｎｏｖａ ２０Ｎ（ＡＫ Ｂｉｏ）ウイルス除去フィルタでさらに処理した。捕捉後溶出物を、疎水性相互作用カラムの出口から、圧力容器、ウイルス除去フィルタ、滅菌グレードのフィルタ、および再循環を駆動する蠕動ポンプを含む加圧ループに連続的に移送した。ループ内の圧力を、ウイルスフィルタを通過する正味の体積流量（透過液流束）が、捕捉後操作から排出される正味の体積流量と等しくなるように自動化した。ウイルス濾過した材料を、さらに処理するために小型サージ容器に連続的に収集した。ウイルス濾過の操作を、１４日目に先行する単位操作と統合し、１３日間連続して行った。
【0068】
ウイルス濾過した材料を、順次、２×０．１ｍ２のガンマ線照射済みＴＦＦカプセルを用いた限外濾過でさらに処理し、単一パスモードで運転した。ウイルス濾過した材料を、目標ｍＡｂ濃度の１１０ｇ／Ｌまで濃縮した。ウイルス濾過後のサージ容器からＴＦＦカプセルの入口まで、ウイルス濾過操作の出口流量に合わせた流量で材料を送出した。ＴＦＦカプセルからの保持物の流量を、生成物濃度のインライン測定によるフィードバックループを用いて自動的に制御し、目標濃度値を維持した。次いで、濃縮ｍＡｂの流れを、ガンマ線照射済み単一パス透析濾過（ＳＰ－ＤＦ）カセットの入口に直接送出し、インラインでの緩衝液交換を行った。透析濾過緩衝液をＳＰ－ＤＦカセットの緩衝液入口に送出し、緩衝液フローを自動化して生成物フローに対する緩衝液の比率を一定に保った。保持物の流量を入口の流量に合わせて制御した。次いで、濃縮した賦形剤溶液をインラインで添加することによって、緩衝液を交換したＤＦの保持物の流れを製剤化し、製剤原体を生成した。製剤用緩衝液の添加を、フィードバックループと製剤流の賦形剤のレベルを測定するインラインセンサーによって制御した。製剤原体を滅菌グレードのフィルタでさらに処理して薬剤物質を生成し、これを単回使用容器に収集した。限外濾過および透析濾過の操作を、１８日目に先行する単位操作と統合し、製剤化の操作を２０日目に統合した。インラインセンサーに問題があったため、ＵＦ／ＤＦと製剤化の操作はキャンペーン終了前に定常状態に達しなかった。
【0069】
本開示を、種々の実施形態の観点から説明してきたが、当業者には変形や改変が生じることが理解される。したがって、添付の特許請求の範囲は、請求項に記載した本開示の範囲内に入るすべてのそのような同等の変形をカバーすることが意図されている。さらに、本明細書で用いる節の見出しは構成のみを目的としており、記載された対象物を限定するものとみなされるべきではない。
【0070】
本明細書に記載された各実施形態は、明確に反対のことが示されていない限り、他の任意の実施形態と組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であると示された特徴または実施形態は、明確に反対のことが示されない限り、好ましいまたは有利であると示された他の特徴または実施形態と組み合わせてもよい。
【0071】
本出願で引用されているすべての文献は、参照によって本明細書に明示的に組み入れる。
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図6-4】
【図7-1】
【図7-2】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図9-1】
【図9-2】
【図9-3】
【図9-4】