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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-08
(45)【発行日】2024-10-17
(54)【発明の名称】ウェスタンブロッティング用増強剤
(51)【国際特許分類】
G01N 33/531 20060101AFI20241009BHJP
【ＦＩ】
G01N33/531 B
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2021057457
(22)【出願日】2021-03-30
(65)【公開番号】P2022154425
(43)【公開日】2022-10-13
【審査請求日】2023-10-31
(73)【特許権者】
【識別番号】000173588
【氏名又は名称】公益財団法人がん研究会
(73)【特許権者】
【識別番号】000004341
【氏名又は名称】日油株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100179431
【弁理士】
【氏名又は名称】白形 由美子
(72)【発明者】
【氏名】芝 清隆
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 裕貴
(72)【発明者】
【氏名】松田 将
(72)【発明者】
【氏名】野田 朋澄
(72)【発明者】
【氏名】原田 英治
【審査官】中村 直子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／１３３１５２（ＷＯ，Ａ２）
【文献】米国特許出願公開第２０１９／０２０４３０８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開平１０－０７５７９１（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１６／０８８６８９（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記の式１で表される単量体に基づく構成単位（ａ）を含有する重合体又は共重合体において、該重合体又は共重合体を構成する全ての構成単位中に占める（ａ）の割合が２０ｍｏｌ％以上１００ｍｏｌ％以下である重合体又は共重合体からなるウェスタンブロット用増感剤。
【化1】
【請求項2】
前記共重合体が、下記の式２で表される単量体に基づく構成単位（ｂ）をさらに含有する共重合体であって、該共重合体を構成する全ての構成単位中に占めるｂの割合は１０ｍｏｌ％以上８０ｍｏｌ％以下である、請求項１記載のウェスタンブロット用増感剤。
【化2】
【請求項3】
請求項１又は２に記載の共重合体が、式３で表される単量体に基づく構成単位（ｃ）をさらに含有し、該共重合体を構成する全ての構成単位中に占めるｃの割合は１０ｍｏｌ％以上５０ｍｏｌ％以下である、ウェスタンブロット用増感剤。
【化3】
【請求項4】
最終濃度が０．０００１ｗｔ％以上０．５ｗｔ％以下で使用することを特徴とする
請求項１～３いずれか１項記載のウェスタンブロット用増感剤。
【請求項5】
タンパク質の検出方法であって、タンパク質試料に請求項１～３いずれか１項記載の重合体又は共重合体を０．０００１ｗｔ％以上０．５ｗｔ％以下で含有させることを特徴とするタンパク質検出方法。
【請求項6】
ウェスタンブロッティングのシグナルを増感するためのキットであって、２倍、又は４倍濃度のＳＤＳサンプルバッファーに、
請求項１～３いずれか１項記載の重合体又は共重合体を最終濃度が０．０００１ｗｔ％以上０．５ｗｔ％以下となるように添加したサンプルバッファーを含むキット。
【請求項7】
還元剤を添付することを特徴とする請求項６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
ウェスタンブロット、ドットブロット、スロットブロット等の免疫検出法において、シグナルを増強するための組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
抗体を使用したアッセイ法は、ライフサイエンス分野の研究だけではなく、臨床検査等において、いまや必要不可欠な技術となっている。抗体を使用したアッセイ法には、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ-ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ－ｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、免疫組織染色、フローサイトメトリーなど様々な方法が知られている。
【0003】
ウェスタンブロッティングは、タンパク質を電気泳動し、特異的な抗体を反応させ可視化することによりタンパク質の発現量や分子量を測定する技術である。発現量だけではなく分子量も合わせて測定できることから、リン酸化、アセチル化、ユビキチン化などの翻訳後修飾の有無の解析など、ＥＬＩＳＡ等に比べて非常に情報量の多い解析方法である。一方で抗原又は抗体を固定し、抗原抗体反応を行わせるＥＬＩＳＡほど感度を増強することができない。
【0004】
従来から、ウェスタンブロット法においてバックグラウンドを下げ、感度を増強するために様々な方法が試みられている（特許文献１、２）。特許文献１には、自己組織化能を有するタンパク質、具体的にはＨＢｓＡｇ（Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原）タンパク質にプロテインＡ等の抗体結合ドメインを付与し、酵素標識をしたウイルス様粒子を作製し、ウェスタンブロット法の感度増強を図る方法が開示されている。特許文献２には、重量％濃度が０．０１％以上のブロッキング剤および重量％濃度が１から１０％の平均分子量２０００～２６０００のポリエチレングリコールを含有する免疫反応促進用組成物が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】国際公開第２０１６／０１７０３７号
【文献】特開２００６－１２６１６６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
上記特許文献１及び２に見られるように、従来のウェスタンブロット法の感度増強に用いる組成物は、一次抗体、あるいは二次抗体の希釈液として、抗体と混合して使用するためのものである。すなわちバックグラウンドを低減し、感度を高めている。そのため、使用する抗体によっては、バックグラウンドの低減とともに、シグナル強度も低減し、感度の増強につながらない場合も多く、使用量の条件設定が困難な場合もあった。さらに、特許文献１に記載の方法は、増感剤として用いる自己組織化能を有するタンパク質とともにブロッキング剤を用いる必要があるが、ブロッキング剤の種類、濃度が、アッセイ系ごとに異なり、最適なブロッキング剤の種類及び濃度をその都度検討する必要があった。特許文献２に記載の免疫反応促進用組成物は、抗体の希釈液として使用する組成物である。塩濃度やｐＨを調整することによって、バックグラウンドを低減することはできるものの、検出系の感度の増強にはつながらず、微弱なシグナルを捕えることは難しかった。本発明は、簡便な操作で免疫アッセイ、特にウェスタンブロッティングの感度を増強するシグナル増強剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は以下のシグナル増強剤に関する。
（１）下記の式１で表される単量体に基づく構成単位（ａ）を含有する重合体又は共重合体において、該重合体又は共重合体を構成する全ての構成単位中に占める（ａ）の割合が２０ｍｏｌ％以上１００ｍｏｌ％以下である重合体又は共重合体を含む、ウェスタンブロット用増感剤。
（１）下記の式１で表される単量体に基づく構成単位（ａ）を含有する重合体又は共重合体において、該重合体又は共重合体を構成する全ての構成単位中に占める（ａ）の割合が２０ｍｏｌ％以上１００ｍｏｌ％以下である重合体又は共重合体を含む、ウェスタンブロット用増感剤。
【0008】
【化1】
（２）前記重合体が、下記の式２で表される単量体に基づく構成単位（ｂ）をさらに含有する共重合体であって、該共重合体を構成する全ての構成単位中に占めるｂの割合は１０ｍｏｌ％以上８０ｍｏｌ％以下である、（１）記載のウェスタンブロット用増感剤。
【0009】
【化2】
（３）（１）又は（２）に記載の共重合体が、式３で表される単量体に基づく構成単位（ｃ）をさらに含有し、該共重合体を構成する全ての構成単位中に占めるｃの割合は１０ｍｏｌ％以上５０ｍｏｌ％以下である、ウェスタンブロット用増感剤。
【0010】
【化3】
（４）タンパク質の検出方法であって、タンパク質試料に（１）～（３）いずれか１つ記載の重合体又は共重合体を０．０００１ｗｔ％以上１ｗｔ％以下で含有させることを特徴とするタンパク質検出方法。
（５）ウェスタンブロッティングのシグナルを増感するためのキットであって、２倍、又は４倍濃度のＳＤＳサンプルバッファーに、（１）～（３）いずれか１つ記載の重合体又は共重合体を最終濃度が０．０００１ｗｔ％以上１ｗｔ％以下となるように添加したサンプルバッファーを含むキット。
（６）還元剤を添付することを特徴とする（５）に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】添加するポリマー濃度の検討を行った図。一次抗体として（Ａ）は抗ＣＤ９抗体を（Ｂ）は抗ＥｐＣＡＭ抗体を用いて検討を行った結果を示す。
【図2】添加するポリマー濃度を０．０００５％から０．５％まで変えて至適濃度の検討を行った図。一次抗体として（Ａ）は抗ＣＤ９抗体を（Ｂ）は抗ＥｐＣＡＭ抗体を用いて検討を行った結果を示す。
【図3】抗ＣＤ８１抗体を用い、種々のポリマーの効果を解析した図。（Ａ）はウェスタンブロッティングによる結果を、（Ｂ）はシグナル強度を測定した結果を示す図。
【図4】抗ＥｐＣＡＭ抗体を用い、種々のポリマーの効果を解析した図。（Ａ）は試料に２－メルカプトエタノールを添加せずにウェスタンブロッティングを行った結果を、（Ｂ）はシグナル強度を測定した結果を示す図。（Ｃ）は試料に２－メルカプトエタノールを添加してウェスタンブロッティングを行った結果を、（Ｄ）は移動度の遅いバンドのシグナル強度を測定した結果を、（Ｅ）は移動度の速いバンドのシグナル強度を測定した結果を示す図。
【図5】抗ＣＤ９抗体を用い、種々のポリマーの効果を解析した図。（Ａ）はウェスタンブロッティングによる結果を、（Ｂ）はシグナル強度を測定した結果を示す図。
【図6】膜タンパク質以外のタンパク質の検出について検討を行った図。抗Ｈｓｐ７０抗体を用い、種々のポリマーの効果を解析した図。（Ａ）はウェスタンブロッティングによる結果を、（Ｂ）はシグナル強度を測定した結果を示す図。
【図7】膜タンパク質以外のタンパク質としてフェリチンに対する効果を解析した図。ウマ脾臓フェリチンを抗フェリチン抗体を用い、種々のポリマーの効果を解析した図。（Ａ）はウェスタンブロッティングによる結果を、（Ｂ）はシグナル強度を測定した結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明は免疫アッセイ、特にウェスタンブロット用の増感剤に関する。さらに、ＰＶＤＦメンブレンやニトロセルロースメンブレン等の膜上で検出を行うドットブロットやスロットブロットなど、同様の検出形態のアッセイ法に対するシグナル増感剤としても利用できることは言うまでもない。
【0013】
本発明者らは、遠心管やチューブなどのプラスチック材料への非特異的吸着材として用いていたＭＰＣポリマーに、シグナル増強剤としての効果があることを見出し、本発明を完成させた。以下の実施例で示すように、本発明のシグナル増強剤は、試料に混合して使用すれば効果があることから、ごく微量用いれば足りる。試料に、ＳＤＳサンプルバッファーとともに混合して使用するウェスタンブロッティングの増感剤は従来にはない。また１回試料に混合すればよく、用いる抗体によって濃度等の検討をする必要がないことから非常に簡便に使用することができる。さらに、本発明の増感剤は、ＳＤＳサンプルバッファーに混合した状態のキットとして提供していることから、従来のＳＤＳ電位泳動、ウェスタンブロッティングと全く同じ手順で増感を行うことができる。
【0014】
以下の実施例に示すように、増感剤として用いるポリマーの構成単位となるモノマーは次のようなものが好ましい。構成単位であるモノマーａは、以下の式（１）の構造式で表されるモノマーであって、Ｒ１は水素原子またはメチル基を表し、Ｌ１は１個のヒドロキシ基を有していてもよい炭素数２～４のアルキレン基、または炭素数２～４のアルキレンオキシアルキレン基を表し、Ｒ２～Ｒ４はそれぞれ独立して炭素数１～３の炭化水素基を表すモノマーを好適に用いることができる。特に、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを好ましく用いることができる。
【0015】
【0016】
また、モノマーａは、構成単位中に２０ｍｏｌ％以上１００ｍｏｌ％以下の割合で含むことができ、共重合体として用いる場合には、２０ｍｏｌ％以上、より好ましくは３０ｍｏｌ％以上、さらに好ましくは、４０ｍｏｌ％以上で、また、９０ｍｏｌ％以下、より好ましくは、８０ｍｏｌ％以下、さらに好ましくは、７０ｍｏｌ％以下の割合で含むことができる。
【0017】
また、モノマーｂは、以下の式（２）の構造式で表されるモノマーであって、Ｒ５は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ６は水素、炭素数２～１０のアルキル基、又はベンジル基を表すモノマーを好適に用いることができる。より好ましくは、Ｒ６は炭素数２～１０のアルキル基を表すモノマーを用いることができる。具体的には、ブチルメタクリレート、ステアリルメタクリレート、ベンジルメタクリレート、メタクリル酸を、より好ましくはブチルメタクリレートを好適に用いることができる。
【0018】
【0019】
また、モノマーｂを構成中に含む場合には、構成単位中に１０ｍｏｌ％以上、好ましくは２０ｍｏｌ％以上で、また、８０ｍｏｌ％以下、より好ましくは７０ｍｏｌ％以下の割合で含むことができる。
【0020】
また、モノマーｃは、以下の式（３）の構造式で表されるモノマーであって、Ｒ７は水素原子又はメチル基を表し、Ｒ８は２個以上の水酸基を置換基として有する炭素数３～６のアルキル基を表すモノマーを好適に用いることができる。具体的にはグリセリンモノメタクリレートを好適に用いることができる。
【0021】
【0022】
また、モノマーｃを構成中に含む場合には、構成単位中に１０ｍｏｌ％以上、好ましくは１５ｍｏｌ％以上で、また、５０ｍｏｌ％以下、好ましくは４０ｍｏｌ％以下の割合で含むことができる。
【0023】
また、モノマーａは親水性の高いモノマーであることが好ましく、モノマーｂは、適度に疎水性のモノマーであることが好ましい。モノマーｂの疎水性の度合いとしては、オクタノール／水分配係数（ｌｏｇＰ）が０～１０であることが好ましく、０～５であることがより好ましく、１～５であることがよりさらに好ましい（表１参照）。
【0024】
ここで、ある物質のオクタノール／水分配係数とは、１－オクタノール／水の２相系において当該物質が分配平衡にあるとき、常用対数を用いてｌｏｇ（１－オクタノール中の物質濃度／水中の物質濃度）で表される物性値であり、例えば日本工業規格ＪＩＳ ７２６０－１１７に記載された方法によって測定することができる。または、各モノマーの供給元や、米国立衛生研究所ＰｕｂＣｈｅｍ等の公的データベースから提供される測定値や計算値を利用することができる。
【0025】
また、本発明の重合体又は共重合体の平均分子量は、ゲル濾過クロマトグラフィー測定によるポリエチレングリコール換算で１５，０００から１,５００,０００のものを好適に使用することができる。
【0026】
本発明のシグナル増感剤は、重合体又は共重合体を０．０００１ｗｔ％以上、より好ましくは０．０００５ｗｔ％以上、また、１ｗｔ％以下、より好ましくは０．５ｗｔ％以下で含有させることが好ましい。以下の実施例で示すように、本発明の重合体又は共重合体は非常に広い範囲で効果を奏する。本発明の重合体又は共重合体がシグナル増強に効果を及ぼす機序は明確ではないものの、ミセル形成能と関わりがあるものと推測される。そのため、０．０００１ｗｔ％より少ない場合には、ミセルを形成し難く、所望のシグナル増感効果を得ることができない。また、１ｗｔ％より多く試料に含有させると、ＭＰＣポリマーによる非特異的吸着阻害効果が過剰に生じ、検出したいタンパク質と抗体との結合を抑制するため、増感剤としての効果を得ることができない。
【0027】
以下の実施例で示すように、本発明のシグナル増感剤は、検出する抗原、あるいは用いる抗体によって多少増感の程度に差があることから、異なる重合体を混合して用いてもよい。複数のポリマーを混合して使用することにより安定した結果を得ることができる。その場合には、総量が上記範囲になるようにして試料に含有させることができる。
【0028】
また、本発明の増感剤は、上記範囲内の濃度になるようにポリマーを添加したＳＤＳサンプルバッファーとして提供することができる。通常用いられている２倍濃度、４倍濃度のＳＤＳサンプルバッファーにポリマーを含有させて提供することにより、非常に簡便にウェスタンブロッティングのシグナルを増強させることができる。例えば、４×（４倍濃度）ＳＤＳサンプルバッファー（２４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、８％ ＳＤＳ、４０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１％ ブロモフェノールブルー）に、ＭＰＣポリマーを０．０００４ｗｔ％以上、４ｗｔ％以下（最終濃度で０．０００１ｗｔ％以上、1ｗｔ％以下）となるように加えた増感剤を含むＳＤＳサンプルバッファーとして提供することができる。さらに、１Ｍ ＤＴＴ水溶液、あるいはβ-メルカプトエタノールのような還元剤をサンプル調整時に添加できるように、キットとして用意しておくことができる。
【0029】
１．ＭＰＣポリマーの合成
検討を行ったポリマーの組成は表１にまとめた。
ＭＰＣ：２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン
ＢＭＡ：ブチルメタクリレート
ＧＬＭ：グリセリンモノメタクリレート
ＳＭＡ：ステアリルメタクリレート
ＢｚＭＡ：ベンジルメタクリレート
ＭＡ：メタクリル酸
検討を行ったポリマーの組成は表１にまとめた。
【表1】
ＢＭＡ：ブチルメタクリレート
ＧＬＭ：グリセリンモノメタクリレート
ＳＭＡ：ステアリルメタクリレート
ＢｚＭＡ：ベンジルメタクリレート
ＭＡ：メタクリル酸
【0030】
合成は以下のようにして行った。
［合成例１］
モノマーａとして２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下「ＭＰＣ」と記載）４．７ｇ、モノマーｂとしてブチルメタクリレート（以下「ＢＭＡ」と記載）５．３ｇ（モノマーａ／モノマーｂ＝３０／７０（モル比））を重合用ガラスフラスコに秤量し、エタノール（以下「ＥｔＯＨ」と記載）９０．０ｇを加えてモノマーを溶解させ、得られた溶液に重合開始剤として２，２’－アゾビス（イソブチロニトリル）（以下「ＡＩＢＮ」と記載）を０．０２ｇ加えた。反応容器内を十分に窒素置換した後、攪拌下、６０℃で７時間加温することで重合を行った。得られた反応液を氷冷し、ジエチルエーテルに滴下することで重合体を沈殿させた。沈殿物を濾別し、ジエチルエーテルで洗浄した後、真空乾燥し、白色粉末状のランダム重合体（以下「重合体＃１」と記載）を得た。重合体＃１の重量平均分子量は、後述する条件でのゲル濾過クロマトグラフィー（以下「ＧＰＣ」と記載）測定により、ポリエチレングリコール換算で９３，０００であった。
［合成例１］
モノマーａとして２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下「ＭＰＣ」と記載）４．７ｇ、モノマーｂとしてブチルメタクリレート（以下「ＢＭＡ」と記載）５．３ｇ（モノマーａ／モノマーｂ＝３０／７０（モル比））を重合用ガラスフラスコに秤量し、エタノール（以下「ＥｔＯＨ」と記載）９０．０ｇを加えてモノマーを溶解させ、得られた溶液に重合開始剤として２，２’－アゾビス（イソブチロニトリル）（以下「ＡＩＢＮ」と記載）を０．０２ｇ加えた。反応容器内を十分に窒素置換した後、攪拌下、６０℃で７時間加温することで重合を行った。得られた反応液を氷冷し、ジエチルエーテルに滴下することで重合体を沈殿させた。沈殿物を濾別し、ジエチルエーテルで洗浄した後、真空乾燥し、白色粉末状のランダム重合体（以下「重合体＃１」と記載）を得た。重合体＃１の重量平均分子量は、後述する条件でのゲル濾過クロマトグラフィー（以下「ＧＰＣ」と記載）測定により、ポリエチレングリコール換算で９３，０００であった。
【0031】
［合成例２］
モノマーａとしてＭＰＣを８．４ｇ、単量体ｂとしてＢＭＡを２．１ｇ、および単量体ｃとしてグリセリンモノメタクリレート（以下「ＧＬＭ」と記載）を４．５ｇ（モノマーａ／モノマーｂ／モノマーｃ＝４０／４０／２０（モル比））、重合用ガラスフラスコに秤量し、精製水４２．５ｇおよびエタノール４２．５ｇを加えて各モノマーを溶解し、得られた溶液に２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）ジハイドロクロライド（以下「Ｖ－５０」と記載）を０．１５ｇ加えた。得られた反応液を氷冷し、アセトンに滴下することで重合体を沈殿させた。沈殿物を濾別し、アセトンで洗浄した後、真空乾燥し、白色粉末状のランダム重合体（以下「重合体＃２」と記載）を得た。重合体＃２の重量平均分子量は、後述する条件でのＧＰＣ測定により、ポリエチレングリコール換算で２２，０００であった。
モノマーａとしてＭＰＣを８．４ｇ、単量体ｂとしてＢＭＡを２．１ｇ、および単量体ｃとしてグリセリンモノメタクリレート（以下「ＧＬＭ」と記載）を４．５ｇ（モノマーａ／モノマーｂ／モノマーｃ＝４０／４０／２０（モル比））、重合用ガラスフラスコに秤量し、精製水４２．５ｇおよびエタノール４２．５ｇを加えて各モノマーを溶解し、得られた溶液に２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）ジハイドロクロライド（以下「Ｖ－５０」と記載）を０．１５ｇ加えた。得られた反応液を氷冷し、アセトンに滴下することで重合体を沈殿させた。沈殿物を濾別し、アセトンで洗浄した後、真空乾燥し、白色粉末状のランダム重合体（以下「重合体＃２」と記載）を得た。重合体＃２の重量平均分子量は、後述する条件でのＧＰＣ測定により、ポリエチレングリコール換算で２２，０００であった。
【0032】
［合成例３］
モノマーａとしてＭＰＣを１１．７ｇ、およびモノマーｂとしてステアリルメタクリレート（以下「ＳＭＡ」と記載）を３．３ｇ（モノマーａ／モノマーｂ＝８０／２０（モル比））、重合用ガラスフラスコに秤量し、エタノール８５．０ｇを加えて各モノマーを溶解し、得られた溶液にＡＩＢＮを０．０６ｇ加えた。フラスコ内を充分に窒素置換した後、攪拌下、６０℃で６時間加温することにより重合を行った。以降は合成例１と同様にして、ランダム重合体（以下「重合体＃３」と記載）を得た。重合体＃３の重量平均分子量は、後述する条件でのＧＰＣ測定により、ポリエチレングリコール換算で４３，０００であった。
モノマーａとしてＭＰＣを１１．７ｇ、およびモノマーｂとしてステアリルメタクリレート（以下「ＳＭＡ」と記載）を３．３ｇ（モノマーａ／モノマーｂ＝８０／２０（モル比））、重合用ガラスフラスコに秤量し、エタノール８５．０ｇを加えて各モノマーを溶解し、得られた溶液にＡＩＢＮを０．０６ｇ加えた。フラスコ内を充分に窒素置換した後、攪拌下、６０℃で６時間加温することにより重合を行った。以降は合成例１と同様にして、ランダム重合体（以下「重合体＃３」と記載）を得た。重合体＃３の重量平均分子量は、後述する条件でのＧＰＣ測定により、ポリエチレングリコール換算で４３，０００であった。
【0033】
［合成例４］
モノマーａとしてＭＰＣを２６．１ｇ、およびモノマーｂとしてベンジルメタクリレート（以下「ＢｚＭＡ」と記載）を３．９ｇ（モノマーａ／モノマーｂ＝８０／２０（モル比））、重合用ガラスフラスコに秤量し、エタノール７０．０ｇを加えて各モノマーを溶解し、得られた溶液にＡＩＢＮを０．０３ｇ加えた。フラスコ内を充分に窒素置換した後、攪拌下、６０℃で６時間加温することにより重合を行った。以降は合成例１と同様にして、ランダム共重合体（以下「重合体＃４」と記載）を得た。重合体＃４の重量平均分子量は、後述する条件でのＧＰＣ測定により、ポリエチレングリコール換算で２４０，０００であった。
モノマーａとしてＭＰＣを２６．１ｇ、およびモノマーｂとしてベンジルメタクリレート（以下「ＢｚＭＡ」と記載）を３．９ｇ（モノマーａ／モノマーｂ＝８０／２０（モル比））、重合用ガラスフラスコに秤量し、エタノール７０．０ｇを加えて各モノマーを溶解し、得られた溶液にＡＩＢＮを０．０３ｇ加えた。フラスコ内を充分に窒素置換した後、攪拌下、６０℃で６時間加温することにより重合を行った。以降は合成例１と同様にして、ランダム共重合体（以下「重合体＃４」と記載）を得た。重合体＃４の重量平均分子量は、後述する条件でのＧＰＣ測定により、ポリエチレングリコール換算で２４０，０００であった。
【0034】
［合成例５］
モノマーａとしてＭＰＣ４０．０ｇを重合用ガラスフラスコに秤量し、精製水６０．０ｇを加えて溶解し、得られた溶液にＶ－５０ ０．３１ｇを加えた。反応容器内を充分に窒素置換した後、攪拌下、７０℃で６時間加温することで重合を行った。以降は合成例２と同様にして、白色粉末状の単独重合体（以下「重合体＃５」と記載する）を得た。重合体＃５の重量平均分子量は、後述する条件でのＧＰＣ測定により、ポリエチレングリコール換算で１，０３０，０００であった。
モノマーａとしてＭＰＣ４０．０ｇを重合用ガラスフラスコに秤量し、精製水６０．０ｇを加えて溶解し、得られた溶液にＶ－５０ ０．３１ｇを加えた。反応容器内を充分に窒素置換した後、攪拌下、７０℃で６時間加温することで重合を行った。以降は合成例２と同様にして、白色粉末状の単独重合体（以下「重合体＃５」と記載する）を得た。重合体＃５の重量平均分子量は、後述する条件でのＧＰＣ測定により、ポリエチレングリコール換算で１，０３０，０００であった。
【0035】
［合成例６］
モノマーａとしてＭＰＣを１９．４ｇ、およびモノマーｂとしてＢＭＡを２．２ｇ（モノマーａ／モノマーｂ＝８０／２０（モル比））、重合用ガラスフラスコに秤量し、精製水３９．３ｇおよびエタノール３９．３ｇを加えて各モノマーを溶解し、得られた溶液にＶ－５０を０．０２ｇ加えた。フラスコ内を充分に窒素置換した後、攪拌下、６０℃で５時間加温することで重合を行った。以降は合成例２と同様にして、ランダム共重合体（以下「重合体＃６」と記載）を得た。重合体６の重量平均分子量は、後述する条件でのＧＰＣ測定により、ポリエチレングリコール換算で６００，０００であった。
モノマーａとしてＭＰＣを１９．４ｇ、およびモノマーｂとしてＢＭＡを２．２ｇ（モノマーａ／モノマーｂ＝８０／２０（モル比））、重合用ガラスフラスコに秤量し、精製水３９．３ｇおよびエタノール３９．３ｇを加えて各モノマーを溶解し、得られた溶液にＶ－５０を０．０２ｇ加えた。フラスコ内を充分に窒素置換した後、攪拌下、６０℃で５時間加温することで重合を行った。以降は合成例２と同様にして、ランダム共重合体（以下「重合体＃６」と記載）を得た。重合体６の重量平均分子量は、後述する条件でのＧＰＣ測定により、ポリエチレングリコール換算で６００，０００であった。
【0036】
［合成例７］
モノマーａとしてＭＰＣを６．０ｇ、およびモノマーｂとしてメタクリル酸（以下「ＭＡ」と記載）を４．０ｇ（モノマーａ／モノマーｂ＝３０／７０（モル比））、重合用ガラスフラスコに秤量し、精製水９０．０ｇを加えて各モノマーを溶解し、得られた溶液にＶ－５０を０．７８ｇ加えた。以降は合成例２と同様にして、ランダム共重合体（以下「重合体＃７」と記載）を得た。重合体＃７の重量平均分子量は、後述する条件でのＧＰＣ測定により、ポリエチレングリコール換算で６８０，０００であった。
モノマーａとしてＭＰＣを６．０ｇ、およびモノマーｂとしてメタクリル酸（以下「ＭＡ」と記載）を４．０ｇ（モノマーａ／モノマーｂ＝３０／７０（モル比））、重合用ガラスフラスコに秤量し、精製水９０．０ｇを加えて各モノマーを溶解し、得られた溶液にＶ－５０を０．７８ｇ加えた。以降は合成例２と同様にして、ランダム共重合体（以下「重合体＃７」と記載）を得た。重合体＃７の重量平均分子量は、後述する条件でのＧＰＣ測定により、ポリエチレングリコール換算で６８０，０００であった。
【0037】
［ＧＰＣ測定］
合成例１～７で得られた重合体＃１～＃７のＧＰＣ測定は、以下の条件で実施した。
ＧＰＣシステム：ＥｃｏＳＥＣシステム（東ソー株式会社製）
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｋ ＳＢ－８０２．５ＨＱ（昭和電工株式会社製）、
およびＳＢ－８０６ＨＱ（昭和電工株式会社製）を直列に接続
展開溶媒：２０ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．４）
検出器：示差屈折率検出器
分子量標準：ＥａｓｉＶｉａｌ ＰＥＧ／ＰＥＯ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）
流速：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
サンプル：得られた重合体を終濃度０．１重量％となるよう展開溶媒で希釈
注入量：１００μＬ
合成例１～７で得られた重合体＃１～＃７のＧＰＣ測定は、以下の条件で実施した。
ＧＰＣシステム：ＥｃｏＳＥＣシステム（東ソー株式会社製）
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｋ ＳＢ－８０２．５ＨＱ（昭和電工株式会社製）、
およびＳＢ－８０６ＨＱ（昭和電工株式会社製）を直列に接続
展開溶媒：２０ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．４）
検出器：示差屈折率検出器
分子量標準：ＥａｓｉＶｉａｌ ＰＥＧ／ＰＥＯ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）
流速：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
サンプル：得られた重合体を終濃度０．１重量％となるよう展開溶媒で希釈
注入量：１００μＬ
【0038】
２．試料の作成
ウェスタンブロッティングに用いる試料はヒト結腸腺がん由来の細胞株ＨＣＴ－１５から差分遠心法で調整したｓＥＶ粗分画、あるいは、同じくヒト結腸腺がん由来の細胞株ＨＴ２９から同様に調整したｓＥＶ粗分画を密度勾配遠心法により精製濃縮したｓＥＶ分画をＰＢＳで１０倍希釈したものを用いた。具体的には、５ｘ１０７細胞のＨＣＴ－１５細胞を、１５０ｍｍ径プラスチックシャーレ（ＩＷＡＫＩ、１１－００１－００８）８枚に播種し、５％仔牛血清を添加したＲＰＭＩ培地で３７℃、５％ＣＯ２条件下で３０時間培養、その後、牛血清アルブミンを含まないＲＰＭＩ培地に培地交換し、さらに４０時間培養後の培養上清を回収した。この時の細胞数は、シャーレ８枚からの合計が３．２８ｘ１０８細胞であった。培養上清を３００ｇ、１０分、４℃、スウィングローターで低速遠心し、上清を回収した。この上清を２０００ｇ、１０分、４℃、スウィングローターで低速遠心し、上清を回収した。次にこの上清を１００００ｇ、３０分、４℃、スウィングローターで遠心し、上清を回収した。さらに、この上清を１６００００ｇ、７０分、４℃、スウィングローターで超遠心し、上清を除去、沈殿物をＰＢＳで１回洗浄した。最後に１６００００ｇ、７０分、４℃、スウィングローターで超遠心、上清を除去した後に沈殿物を５００μｌのＰＢＳで懸濁したものをｓＥＶ粗分画とした。
ウェスタンブロッティングに用いる試料はヒト結腸腺がん由来の細胞株ＨＣＴ－１５から差分遠心法で調整したｓＥＶ粗分画、あるいは、同じくヒト結腸腺がん由来の細胞株ＨＴ２９から同様に調整したｓＥＶ粗分画を密度勾配遠心法により精製濃縮したｓＥＶ分画をＰＢＳで１０倍希釈したものを用いた。具体的には、５ｘ１０７細胞のＨＣＴ－１５細胞を、１５０ｍｍ径プラスチックシャーレ（ＩＷＡＫＩ、１１－００１－００８）８枚に播種し、５％仔牛血清を添加したＲＰＭＩ培地で３７℃、５％ＣＯ２条件下で３０時間培養、その後、牛血清アルブミンを含まないＲＰＭＩ培地に培地交換し、さらに４０時間培養後の培養上清を回収した。この時の細胞数は、シャーレ８枚からの合計が３．２８ｘ１０８細胞であった。培養上清を３００ｇ、１０分、４℃、スウィングローターで低速遠心し、上清を回収した。この上清を２０００ｇ、１０分、４℃、スウィングローターで低速遠心し、上清を回収した。次にこの上清を１００００ｇ、３０分、４℃、スウィングローターで遠心し、上清を回収した。さらに、この上清を１６００００ｇ、７０分、４℃、スウィングローターで超遠心し、上清を除去、沈殿物をＰＢＳで１回洗浄した。最後に１６００００ｇ、７０分、４℃、スウィングローターで超遠心、上清を除去した後に沈殿物を５００μｌのＰＢＳで懸濁したものをｓＥＶ粗分画とした。
【0039】
また、ヒト結腸腺がん由来の細胞株ＨＴ２９の培養上清から、差分遠心法で得られた粗分画はさらに密度勾配遠心法で濃縮した。具体的には、粗分画を０．５ｍｌのＰＢＳに懸濁後、１．５ｍｌの６０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ｉｏｄｉｘａｎｏｌとまぜ、遠心チューブに移し、そこに、ｉｏｄｉｘａｎｏｌの連続密度勾配（８－４０％、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．２）を形成させ、１００，０００ｇで１７時間４℃での超遠心（Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－９０Ｋ ｗｉｔｈ ＳＷ３２Ｔｉ ｒｏｔｏｒ）の後に、１０の分画（各３．２ｍｌ）を回収し、それぞれに３０ｍｌのＰＢＳを加えた後に、上記条件で１６０，０００ｇで２時間遠心し、得られた沈殿を０．５ｍｌのＰＢＳに懸濁した。分画３を１０倍希釈したものを試料として用いた。
【0040】
３．添加するポリマーの条件検討
これらの試料を用いて添加するＭＰＣポリマーの濃度の検討を行った。具体的には、１．５ｍｌ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＬｏＢｉｎｄ Ｔｕｂｅ， Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブに試料を１０μｌずつ入れ、さらに各チューブに１２．５μｌのＰＢＳ、もしくは、ポリマー溶液を加えた。さらに７．５μｌのｘ４ ＳＤＳ－Ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（２メルカプトエタノール有りの条件と無しの条件）を加え、９８℃１０分で熱処理した後に、この半量１５μｌを電気泳動し、ウェスタンブロッティングを常法により行った。具体的には、１５％、又は１０－２０％の市販ポリアクリルアミドゲル（Ｅｘｔｒａ ＰＡＧＥ Ｏｎｅ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌ、Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ、Ｉｎｃ．）で電気泳動した後、ｉＢｌｏｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりニトロセルロース膜に転写した。メンブレンはブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ、 ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を用いて行った。
これらの試料を用いて添加するＭＰＣポリマーの濃度の検討を行った。具体的には、１．５ｍｌ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＬｏＢｉｎｄ Ｔｕｂｅ， Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブに試料を１０μｌずつ入れ、さらに各チューブに１２．５μｌのＰＢＳ、もしくは、ポリマー溶液を加えた。さらに７．５μｌのｘ４ ＳＤＳ－Ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（２メルカプトエタノール有りの条件と無しの条件）を加え、９８℃１０分で熱処理した後に、この半量１５μｌを電気泳動し、ウェスタンブロッティングを常法により行った。具体的には、１５％、又は１０－２０％の市販ポリアクリルアミドゲル（Ｅｘｔｒａ ＰＡＧＥ Ｏｎｅ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌ、Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ、Ｉｎｃ．）で電気泳動した後、ｉＢｌｏｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりニトロセルロース膜に転写した。メンブレンはブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ、 ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を用いて行った。
【0041】
[実施例１]
添加するポリマー濃度の検討（１）
ＨＴ２９より精製したｓＥＶ画分１０μｌにモノマーａとしてＭＰＣを、モノマーｂとしてＢＭＡを３０：７０のモル比で含有するＭＰＣポリマー＃１を濃度を変えて１２．５μｌ加え、ＳＤＳサンプルバッファーを７．５μｌ加え、２－メルカプトエタノールなしの条件で電気泳動試料を作製した。試料に添加されたポリマーの最終濃度としては、０．０１２５ｗｔ％から０．２１ｗｔ％まで濃度を変えて試料を添加していることになる。１５％ゲルで電気泳動を行い、ウェスタンブロッティングを行った。メンブレンはブロッキング溶液でブロッキングを行った後、エクソソームマーカーである抗ＣＤ９抗体（コスモ・バイオ株式会社、ＳＨＩ－ＥＸＯ－Ｍ０１）を一次抗体として抗体希釈溶液（Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ、ＴＯＹＯＢＯ）で２０００倍に希釈し、二次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＩＯＲＡＤ社、１７０－６５１６）を５０００倍に希釈して用いた。一次抗体は２時間、二次抗体は一時間室温でインキュベートし、洗浄はＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））を用いた。また、検出はＥＣＬ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で発光させ、ＬｕｍｉＶｉｓｉｏｎＰＲＯ（ＡＩＳＩＮ）を用いて行った（図１（Ａ））。試料にＰＢＳを加えて電気泳動を行ったコントロール（レーン１）に比べて、ポリマー＃１を加えた試料（レーン２～６）の方が、シグナルが増強している。
添加するポリマー濃度の検討（１）
ＨＴ２９より精製したｓＥＶ画分１０μｌにモノマーａとしてＭＰＣを、モノマーｂとしてＢＭＡを３０：７０のモル比で含有するＭＰＣポリマー＃１を濃度を変えて１２．５μｌ加え、ＳＤＳサンプルバッファーを７．５μｌ加え、２－メルカプトエタノールなしの条件で電気泳動試料を作製した。試料に添加されたポリマーの最終濃度としては、０．０１２５ｗｔ％から０．２１ｗｔ％まで濃度を変えて試料を添加していることになる。１５％ゲルで電気泳動を行い、ウェスタンブロッティングを行った。メンブレンはブロッキング溶液でブロッキングを行った後、エクソソームマーカーである抗ＣＤ９抗体（コスモ・バイオ株式会社、ＳＨＩ－ＥＸＯ－Ｍ０１）を一次抗体として抗体希釈溶液（Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ、ＴＯＹＯＢＯ）で２０００倍に希釈し、二次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＩＯＲＡＤ社、１７０－６５１６）を５０００倍に希釈して用いた。一次抗体は２時間、二次抗体は一時間室温でインキュベートし、洗浄はＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））を用いた。また、検出はＥＣＬ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で発光させ、ＬｕｍｉＶｉｓｉｏｎＰＲＯ（ＡＩＳＩＮ）を用いて行った（図１（Ａ））。試料にＰＢＳを加えて電気泳動を行ったコントロール（レーン１）に比べて、ポリマー＃１を加えた試料（レーン２～６）の方が、シグナルが増強している。
【0042】
また、図１（Ｂ）は、一次抗体として抗ＥｐＣＡＭ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＡＦ９６０）を１０００倍希釈で、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｃｈ、３０５－０３５－０４５）を２０００倍に希釈して用いていた他は、上記と同じ条件で行っている。コントロールであるポリマーが含まれていない試料（レーン１、ＰＢＳを添加）に比べてポリマーを加えて電気泳動を行った試料（レーン２～６）で明らかにシグナルの増強が観察された。特に、０．０３ｗｔ％に調整したポリマー＃１を１２．５μｌ／３０μｌで添加した試料、すなわち０．０１２５ｗｔ％になるようにポリマーを添加した試料（レーン２）でシグナルが一番強く増強され、添加するポリマー量が増加するにつれてシグナルが弱くなっているのが観察された。
【0043】
[実施例２]
添加するポリマー濃度の検討（２）
実施例１の検討結果から、添加するポリマー濃度は、０．０３ｗｔ％付近（最終濃度０．０１２５ｗｔ％）で増加すると考えられた。そこで、より低濃度から濃度を振って検出感度が増強するポリマー濃度を検討した（図２）。ポリマー＃１を０．０００５ｗｔ％から０．５ｗｔ％まで濃度を変えて添加した他は、実施例１と同様の条件でウェスタンブロッティングにより解析した。
添加するポリマー濃度の検討（２）
実施例１の検討結果から、添加するポリマー濃度は、０．０３ｗｔ％付近（最終濃度０．０１２５ｗｔ％）で増加すると考えられた。そこで、より低濃度から濃度を振って検出感度が増強するポリマー濃度を検討した（図２）。ポリマー＃１を０．０００５ｗｔ％から０．５ｗｔ％まで濃度を変えて添加した他は、実施例１と同様の条件でウェスタンブロッティングにより解析した。
【0044】
一次抗体として抗ＣＤ９抗体（図２（Ａ））を用いた場合でも、抗ＥｐＣＡＭ抗体（図２（Ｂ））を用いた場合でも、ポリマーを添加した試料はいずれもコントロールであるＰＢＳを添加した試料に比べて強いシグナルが得られていた。特に、０．００５ｗｔ％以上、０．５ｗｔ％以下の濃度のポリマーを添加した場合に検出感度の増強が観察された。また、０．０５ｗｔ％濃度でポリマー＃１を添加した場合に一番検出感度の増強が観察された。非常に広い濃度範囲で検出感度の増強が観察されることが明らかになった。他のポリマーに関しても、添加するポリマー濃度を０．０５ｗｔ％、すなわちポリマーの最終濃度を０．０２１ｗｔ％に調整した試料を用いて検討を行うこととした。
【0045】
[実施例３]
種々のポリマーを用いた検討・・・ＣＤ８１の検出
表１に示した種々のポリマーについて、シグナル増強作用を有するか解析を行った。各ポリマーを０．０５ｗｔ％濃度で調製し、これを１２．５μｌ／３０μｌで添加し、２－メルカプトエタノールを添加せずにＨＣＴ－１５より得られたｓＥＶ粗分画を電気泳動した。一次抗体として抗ＣＤ８１抗体（ＥＸＢＩＯ、１１－５８８－Ｃ１００）を１０００倍希釈し、二次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＩＯＲＡＤ社）を２０００倍希釈し、ウェスタンブロッティングを行った。３回実験を繰り返し、各ポリマーを評価した（図３）。
種々のポリマーを用いた検討・・・ＣＤ８１の検出
表１に示した種々のポリマーについて、シグナル増強作用を有するか解析を行った。各ポリマーを０．０５ｗｔ％濃度で調製し、これを１２．５μｌ／３０μｌで添加し、２－メルカプトエタノールを添加せずにＨＣＴ－１５より得られたｓＥＶ粗分画を電気泳動した。一次抗体として抗ＣＤ８１抗体（ＥＸＢＩＯ、１１－５８８－Ｃ１００）を１０００倍希釈し、二次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＩＯＲＡＤ社）を２０００倍希釈し、ウェスタンブロッティングを行った。３回実験を繰り返し、各ポリマーを評価した（図３）。
【0046】
モノマーａとしてＭＰＣを、モノマーｂとしてＢＭＡを３０：７０のモル比で含有するＭＰＣポリマー＃１、モノマーａとしてＭＰＣを、モノマーｂとしてＢＭＡを、モノマーｃとしてＧＬＭを４０：４０：２０のモル比で含有するポリマー＃２がコントロールに比べて強いシグナル強度が得られている（図３（Ａ））。シグナル強度を“Ｉｍａｇｅ Ｊ”のＧｅｌ Ａｎａｌｙｚｅｒによって定量したところ、コントロールに対してポリマー＃１は４．８倍、ポリマー＃２は９．２倍のシグナル増強が認められた（図３（Ｂ））。モノマーｂとしてＳＭＡを含むポリマー＃３を除く他のポリマー、すなわち、モノマーｂとしてＢｚＭＡを含むポリマー＃４、ＭＰＣのみからなるポリマー＃５、ＭＰＣモノマーとＢＭＡモノマーを８０：２０の比で含有するポリマー＃６、モノマーｂとしてＭＡを含むポリマー＃７もＰＢＳと比較するとシグナルが増強する傾向が認められた。
【0047】
[実施例４]
種々のポリマーを用いた検討・・・ＥｐＣＡＭの検出
表１に示した種々のポリマーについて、抗ＥｐＣＡＭ抗体を使用してシグナル増強作用を有するか解析を行った（図４）。ＨＣＴ－１５より得られたｓＥＶ粗分画試料に、０．０５ｗｔ％に調製したポリマーを１２．５μｌ／３０μｌで添加し、２－メルカプトエタノールを添加せずに電気泳動を行った。一次抗体として抗ＥｐＣＡＭ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＡＦ９６０）を１０００倍希釈し、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｃｈ）を２０００倍希釈し、ウェスタンブロッティングを行った。３回実験を繰り返し、各ポリマーを評価した。
種々のポリマーを用いた検討・・・ＥｐＣＡＭの検出
表１に示した種々のポリマーについて、抗ＥｐＣＡＭ抗体を使用してシグナル増強作用を有するか解析を行った（図４）。ＨＣＴ－１５より得られたｓＥＶ粗分画試料に、０．０５ｗｔ％に調製したポリマーを１２．５μｌ／３０μｌで添加し、２－メルカプトエタノールを添加せずに電気泳動を行った。一次抗体として抗ＥｐＣＡＭ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＡＦ９６０）を１０００倍希釈し、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｃｈ）を２０００倍希釈し、ウェスタンブロッティングを行った。３回実験を繰り返し、各ポリマーを評価した。
【0048】
モノマーａとしてＭＰＣを、モノマーｂとしてＢＭＡを３０：７０のモル比で含有するＭＰＣポリマー＃１はコントロールとしてＰＢＳを添加した試料に比べて強いシグナルが得られている（図４（Ａ））。シグナル強度を定量したところ、コントロールに対してポリマー＃１は２．８倍のシグナル増強が認められた（図４（Ｂ））。ポリマー＃２、ポリマー＃３、ポリマー＃４もシグナルを増強する傾向が認められた。
【0049】
試料に２－メルカプトエタノールを添加し、還元条件で電気泳動を行った場合のポリマーの効果について検討を行った。０．０５ｗｔ％濃度になるように調製したポリマーを１２．５μｌ／３０μｌで添加し、２－メルカプトエタノールを５％になるように添加して電気泳動を行い、ウェスタンブロッティングにより評価した。一次抗体、二次抗体など抗体との反応条件は図４（Ａ）に示したものと同様の条件で行った。３回実験を繰り返し、各ポリマーを評価した。還元条件下では、ＥｐＣＡＭは３５ｋＤａ付近のバンドと、それより移動度の遅いバンドと２つのバンドが検出される。
【0050】
ポリマー＃１はコントロールとしてＰＢＳを添加した試料に比べて非常に強いシグナルが得られている（図４（Ｃ））。シグナル強度を定量したところ、コントロールに対してポリマー＃１は移動度の遅いバンドでは６．２倍、移動度の速いバンドでは７倍のシグナル増強が認められた（図４（Ｄ）、（Ｅ））。実施例３のＣＤ８１の検出結果ではポリマー＃２が非常に強いシグナル増強が認められたが、ＥｐＣＡＭの場合はポリマー＃１に強いシグナル増強効果が認められた。
【0051】
[実施例５]
種々のポリマーを用いた検討・・・ＣＤ９の検出
表１に示した種々のポリマーについて、抗ＣＤ９抗体を使用してシグナル増強作用を有するか解析を行った（図５）。０．０５ｗｔ％に調整したポリマーを１２．５μｌ／３０μｌでＨＴ２９より得たｓＥＶ試料に添加し、２－メルカプトエタノールを添加せずに電気泳動を行った。一次抗体として抗ＣＤ９抗体（コスモ・バイオ株式会社、ＳＨＩ－ＥＸＯ－ＭＯ１）を２０００倍希釈し、二次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＩＯＲＡＤ社）を２０００倍希釈し、ウェスタンブロッティングを行った。３回実験を繰り返し、各ポリマーを評価した。
種々のポリマーを用いた検討・・・ＣＤ９の検出
表１に示した種々のポリマーについて、抗ＣＤ９抗体を使用してシグナル増強作用を有するか解析を行った（図５）。０．０５ｗｔ％に調整したポリマーを１２．５μｌ／３０μｌでＨＴ２９より得たｓＥＶ試料に添加し、２－メルカプトエタノールを添加せずに電気泳動を行った。一次抗体として抗ＣＤ９抗体（コスモ・バイオ株式会社、ＳＨＩ－ＥＸＯ－ＭＯ１）を２０００倍希釈し、二次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＩＯＲＡＤ社）を２０００倍希釈し、ウェスタンブロッティングを行った。３回実験を繰り返し、各ポリマーを評価した。
【0052】
モノマーａとしてＭＰＣを、モノマーｂとしてＢＭＡを３０：７０のモル比で含有するＭＰＣポリマー＃１、及び、モノマーａとしてＭＰＣを、モノマーｂとしてＢＭＡを、モノマーｃとしてＧＬＭを４０：４０：２０のモル比で含有するポリマー＃２はコントロールとしてＰＢＳを添加した試料に比べてシグナルをやや増強する傾向が見られた。
【0053】
［実施例６］
膜タンパク質以外のタンパク質に対する効果・・・Ｈｓｐ７０の検出
上記実施例で検討を行ったのはエクソソームマーカーとして知られている膜タンパク質である。そこで膜タンパク質以外のタンパク質の検出においても効果があるか解析を行うこととした。Ｈｓｐ７０はエクソソームマーカーとして知られているタンパク質であるが、いわゆる膜を貫通するタイプの膜タンパク質ではない。そこで、表１に示した種々のポリマーが、抗Ｈｓｐ７０抗体を使用したウェスタンブロッティングでシグナル増強作用を有するか解析を行った（図６）。０．０５ｗｔ％に調整したポリマーを１２．５μｌ／３０μｌでＨＴ２９ｓより得たＥＶ試料に添加し、２－メルカプトエタノールを添加して電気泳動を行った。一次抗体として抗Ｈｓｐ７０抗体（ＳＢＩバイオテック株式会社、ＥＸＯＡＢ-Ｈｓｐ７０Ａ-１）を１０００倍希釈し、４℃で一晩、二次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＩＯＲＡＤ社）を２０００倍希釈し、室温で１時間インキュベートし、ウェスタンブロッティングを行った（図６（Ａ））。３回実験を繰り返し、各ポリマーを評価した。
膜タンパク質以外のタンパク質に対する効果・・・Ｈｓｐ７０の検出
上記実施例で検討を行ったのはエクソソームマーカーとして知られている膜タンパク質である。そこで膜タンパク質以外のタンパク質の検出においても効果があるか解析を行うこととした。Ｈｓｐ７０はエクソソームマーカーとして知られているタンパク質であるが、いわゆる膜を貫通するタイプの膜タンパク質ではない。そこで、表１に示した種々のポリマーが、抗Ｈｓｐ７０抗体を使用したウェスタンブロッティングでシグナル増強作用を有するか解析を行った（図６）。０．０５ｗｔ％に調整したポリマーを１２．５μｌ／３０μｌでＨＴ２９ｓより得たＥＶ試料に添加し、２－メルカプトエタノールを添加して電気泳動を行った。一次抗体として抗Ｈｓｐ７０抗体（ＳＢＩバイオテック株式会社、ＥＸＯＡＢ-Ｈｓｐ７０Ａ-１）を１０００倍希釈し、４℃で一晩、二次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＩＯＲＡＤ社）を２０００倍希釈し、室温で１時間インキュベートし、ウェスタンブロッティングを行った（図６（Ａ））。３回実験を繰り返し、各ポリマーを評価した。
【0054】
モノマーａとしてＭＰＣを、モノマーｂとしてＢＭＡを３０：７０のモル比で含有するＭＰＣポリマー＃１、及び、モノマーａとしてＭＰＣを、モノマーｂとしてＢＭＡを、モノマーｃとしてＧＬＭを４０：４０：２０のモル比で含有するポリマー＃２はコントロールとしてＰＢＳを添加した試料に比べてシグナルを増強する傾向が見られた（図６（Ｂ））。
【0055】
［実施例７］
膜タンパク質以外のタンパク質に対する効果・・・フェリチンの検出
エクソソームマーカー以外のタンパク質についても解析を行った。ウマ脾臓フェリチンに対するポリマーの効果を検討した。ウマ脾臓フェリチン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＨＭＷ＿ＧＥ）を、１レーンあたり３０ｎｇ泳動し、ＭＰＣポリマーの効果を解析した（図７）。
膜タンパク質以外のタンパク質に対する効果・・・フェリチンの検出
エクソソームマーカー以外のタンパク質についても解析を行った。ウマ脾臓フェリチンに対するポリマーの効果を検討した。ウマ脾臓フェリチン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＨＭＷ＿ＧＥ）を、１レーンあたり３０ｎｇ泳動し、ＭＰＣポリマーの効果を解析した（図７）。
【0056】
各ポリマーを０．０５％濃度になるように試料に添加し、２－メルカプトエタノールを添加して電気泳動を行った。一次抗体として抗ウマ脾臓フェリチン抗体（シグマ、Ｆ６１３６）を５００倍希釈し、二次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＩＯＲＡＤ社）を２０００倍希釈し、ウェスタンブロッティングを行った（図７（Ａ））。３回実験を繰り返し、各ポリマーを評価した。
【0057】
モノマーａとしてＭＰＣを、モノマーｂとしてＢＭＡを３０：７０のモル比で含有するＭＰＣポリマー＃１、及び、モノマーａとしてＭＰＣを、モノマーｂとしてＢＭＡを、モノマーｃとしてＧＬＭを４０：４０：２０のモル比で含有するポリマー＃２はコントロールと比較してシグナルを顕著に増強していた（図７（Ｂ））。ポリマー＃１は、４．８倍、ポリマー＃２は３．６倍のシグナル増強が認められた。
【0058】
実施例で示してきたように、本発明の増感剤は膜タンパク質であっても、膜タンパク質以外のタンパク質であっても増感剤としての効果が認められることから、疎水性、親水性、どのようなタンパク質であっても効果が得られるものと考えられる。しかし、一定の疎水性基を構成要素として有する共重合体で良好な結果が得られていることから、エクソソームのマーカータンパク質のような膜タンパク質の検出に適しているものと考えられる。
【0059】
以上示したように、ＭＰＣポリマーを試料に添加して電気泳動を行い、ウェスタンブロッティングを行うことにより、シグナル増強効果が得られることが明らかとなった。特に、ＭＰＣとＢＭＡの共重合体、及びＭＰＣ、ＢＭＡ、及びＧＬＭの共重合体は、種々の試料、抗体を用いた実験条件下でも強いシグナル増強作用を有する。さらに、ＭＰＣとＢｚＭＡ、又はＭＡの共重合体、さらにＭＰＣホモポリマーもＰＢＳと比較するとシグナル増強が認められた。試料に添加することにより、シグナル増強が得られるシグナル増感剤は今までにない。また、これらポリマーをＳＤＳサンプルバッファーに予め混合して使用するだけでよく、非常に簡便な操作でシグナル増強を得ることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
