特許 7569372 デュアルインデックス付きメチル－ＳＥＱライブラリーの調製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-10-08

(45)【発行日】2024-10-17

(54)【発明の名称】デュアルインデックス付きメチル－ＳＥＱライブラリーの調製方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6869 20180101AFI20241009BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6869 Z

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2022517788

(86)(22)【出願日】2020-09-29

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-09

(86)【国際出願番号】 US2020053284

(87)【国際公開番号】W WO2021067275

(87)【国際公開日】2021-04-08

【審査請求日】2023-04-03

(31)【優先権主張番号】62/907,778

(32)【優先日】2019-09-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】505092968

【氏名又は名称】インテグレーティッド ディーエヌエイ テクノロジーズ インコーポレーティッド

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100196243

【弁理士】

【氏名又は名称】運 敬太

(72)【発明者】

【氏名】ダス・チャクラバルティー，ウシャティ

(72)【発明者】

【氏名】ファン，シャオ－ユン

(72)【発明者】

【氏名】ツェン，ユー

(72)【発明者】

【氏名】ライ，ケビン

【審査官】大西 隆史

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１８／１４０６９５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１９－５０４６４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１４／０３２９６９７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】URICH, Mark A. et al.，Nature Protocols，2015年02月18日，Vol. 10，pp. 475-483，DOI: 10.1038/nprot.2014.114.

【文献】RAINE, Amanda et al.，Nucleic Acids Research，2017年04月07日，Vol. 45, Issue 6, Article No. e36，DOI: 10.1093/nar/gkw1110

【文献】SCHUMACHER, Cassie et al.，Nature Methods，2015年10月29日，Vol. 12，pp. v-vi，DOI: 10.1038/nmeth.f.386

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

二本鎖ＤＮＡのメチル化プロファイルを決定する方法であって：
ａ）前記二本鎖ＤＮＡを得るステップと、
ｂ）第１のリガーゼを用いて第１のアダプターを前記二本鎖ＤＮＡの３’末端に連結するステップであって、前記第１のアダプターが、５’アデニル化された鎖、３’末端がブロックされた相補鎖、およびメチルデオキシシトシンを含む二本鎖アダプターである、前記ステップと、
ｃ）第２のリガーゼを用いて第２のアダプターを前記二本鎖ＤＮＡの５’末端に連結してアダプター－標的核酸－アダプター複合体を生成するステップであって、前記第２のアダプターがメチルデオキシシトシンを含む、前記ステップと、
ｄ）前記アダプター－二本鎖ＤＮＡ－アダプター複合体中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して変換された標的を生成するステップと、
ｅ）前記変換された標的をＰＣＲ増幅するステップと、
ｆ）前記変換された標的をシーケンシングするステップと、
ｇ）前記変換された標的の配列を参照配列と比較して前記二本鎖ＤＮＡの前記メチル化プロファイルを決定するステップ、
を含み、
ステップａ）からｇ）を順番に実施し、
ここで、前記第１のアダプターおよび／または前記第２のアダプターが固有の分子識別子（ＵＭＩ）配列を含む、
前記方法。

【請求項2】

前記二本鎖ＤＮＡが全ゲノムＤＮＡ、細胞外ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）またはホルマリン固定パラフィン包埋ＤＮＡ（ＦＦＰＥ ＤＮＡ）である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第１のリガーゼがＴ４ ＤＮＡリガーゼである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記Ｔ４ ＤＮＡリガーゼが変異体リガーゼである、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記変異体リガーゼがＫ１５９でのアミノ酸置換を含有する、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記の非メチル化シトシンをウラシルに変換するステップが、バイサルファイトでの処理を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記の非メチル化シトシンをウラシルに変換するステップが、シチジンデアミナーゼでの処理を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記アダプターがユニバーサルプライミング部位を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記アダプター－二本鎖ＤＮＡ－アダプター複合体を、ハイブリダイゼーションキャプチャーによって濃縮する、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
[0001]本出願は、２０１９年９月３０日出願の米国仮特許出願第６２／９０７，７７８号の優先権を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

[0002]本発明は、二本鎖ＤＮＡ分子の配列を決定するための方法ならびに二本鎖ＤＮＡ分子中のメチル化シトシンの同定およびプロファイリングのための方法に関する。本発明は、全ゲノムシーケンシング、ターゲットリシーケンシング（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、シーケンシングベースのスクリーニングアッセイ、メタゲノミクス、またはＮＧＳ用のサンプル調製を必要とする他の任意の用途のための、デュプレックスコンセンサス対応（ｄｕｐｌｅｘ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｅｎａｂｌｅｄ）次世代シーケンシング（ＮＧＳ）メチル－ｓｅｑライブラリーを構築するための方法にも関する。

【背景技術】

【0003】

[0003]ＤＮＡメチル化は、遺伝子発現およびクロマチン構造の制御に直接関係することが示唆されているエピジェネティック修飾である。エピジェネティック修飾、たとえばＤＮＡメチル化は、哺乳動物の発育、たとえば胚発育における役割を担い、クロマチン構造およびクロマチンの安定性に関与する。異常なＤＮＡメチル化は、がんを含むいくつかの疾患プロセスに関係することが示唆されている。加えて、メチル化可変領域および／またはアレル特異的なメチル化の特定のパターンは、非侵襲診断用の分子マーカーとして使用され得る。重要なことに、メチル化にフォーカスした全ゲノムディープシーケンシングは、ヘミメチル化、すなわちＤＮＡデュプレックスのうちの一方の鎖のみにおけるメチル化、を含むがんメチロームが非常に複雑であることを明らかにした。ゲノム全体、または循環する細胞外ＤＮＡ全体のＤＮＡメチル化状態の解析は興味深い可能性がある。

【0004】

[0004]ＤＮＡメチル化をプロファイリングするための方法は、バイサルファイト変換シーケンシングに依拠する。バイサルファイト処理は、非メチル化シトシン残基をウラシルに変換する。サンガーシーケンシングまたは現行のＮＧＳ法によりシーケンシングされると、ウラシル残基はチミンとして可視化される。一方、メチルシトシンはバイサルファイト処理によるウラシルへの変換から保護される。サンガーシーケンシングまたは現行のＮＧＳ法によりシーケンシングされると、メチルシトシンはシトシンとして可視化される。バイサルファイト変換または酵素変換の後に、配列を修飾されていない参照配列と比較することによって、個々のシトシン残基の変換状態を推測することができる。

【0005】

[0005]しかし、現行の方法は、多くの場合、ライブラリー調製および／またはシーケンシング中に、増幅またはシーケンシングのアーティファクトを導入する。これらのエラーは、ＤＮＡメチル化解析の結果に悪い影響を及ぼし得る。加えて、現在の方法では、使用者は、データ解析中に固有の分子識別子（ＵＭＩ）を使用することができず、ヘミメチル化、フルメチル化および非メチル化イベントを区別することができない。現行の方法は、アダプターを付ける前の、非メチル化シトシンのウラシルへの変換に依拠する。変換はアダプターの付加の前に起こるため、ヘミメチル化イベントを区別することは不可能である。現行の方法は、全ゲノムメチル化プロファイリングにも、ターゲットシーケンシングメチル化プロファイリングにも対応していない。

【発明の概要】

【0006】

したがって、当分野では、メチル化が遺伝子発現にとって決定的である領域に対する網羅的なターゲットキャプチャーシステムを実現する方法が必要とされている。加えて、当分野では、一塩基分解能でのメチル化状態の正確な検出、ならびにフルメチル化およびヘミメチル化ＤＮＡの検出を可能にする方法および組成物が必要とされている。

【0007】

[0006]本明細書で開示されるのは、メチル化プロファイリングのためのデュアルインデックス核酸ライブラリーを調製するための方法および組成物である。さらに、本明細書で開示される方法および組成物は、非メチル化シトシンのバイサルファイト変換または酵素変換のいずれかに依拠し得る。種々の実施形態では、開示された方法および組成物は、標的配列中に存在する非メチル化シトシンのバイサルファイト処理または酵素変換の前に、標的核酸をＵＭＩでタグ付けするための２段階タグ付けプロセスを使用する。タグ付けプロセスは、単一のＵＭＩを１本の鎖に付加してもよく、またはＵＭＩを標的核酸の各鎖に付加してもよい。タグ付け法の後に、標的核酸をバイサルファイト処理また酵素的に処理して非メチル化シトシンをウラシルに変換する。ＵＭＩは、個々のＤＮＡ分子を識別するために、および増幅またはシーケンシングにより導入されたアーティファクトを低下させ、ＤＮＡメチル化解析の正確性を向上させるために使用される。加えて、バイサルファイト処理または酵素変換の前に各鎖をＵＭＩで個別にタグ付けすることにより、ヘミメチル化イベント、フルメチル化および非メチル化イベントを直接比較するためのエラーの修正が可能になる。

【0008】

[0007]一実施形態（図１Ａ）では、全ゲノムメチル－ｓｅｑライブラリー構築のためのワークフローが提供される。鎖特異的な分子識別子（固有の分子識別子、ＵＭＩ）が、平滑ライゲーションとその後に続くギャップ充填（ｇａｐ－ｆｉｌｌ）ライゲーション反応により生物学的な鋳型に付けられる。第１のステップでは、断片化されたｇＤＮＡ、ＦＦＰＥ ＤＮＡ、またはせん断されていないｃｆＤＮＡが、遊離の３’ＯＨ末端を伴う平滑化された５’リン酸化インサートを生じる末端修復反応にかけられる。末端修復後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、平滑ライゲーションにより、第１のシーケンシングアダプター（たとえばＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームのＰ７）がインサートＤＮＡの３’末端に付けられるが、アダプターの一方の鎖はライゲーションを容易にするために５’アデニル化されている一方で、相補鎖は、ライゲーションを防ぐためにジデオキシ－Ａ、ジデオキシ－Ｔ、ジデオキシ－ＣまたはジデオキシＧで３’末端においてブロックされている（図１Ａおよび１Ｂ）。アダプター中のｄＣ塩基は、メチル－ｄＣに変えられ、下流のバイサルファイト処理／シトシンのウラシルへの酵素変換中、その本来の同一性を保持する。次いで、アダプター分子の３’末端をインサートのリン酸化５’末端に連結するギャップ充填ライゲーション反応により、第２のシーケンシングアダプターが生物学的インサートの５’末端に付けられる。アダプター中のｄＣ塩基の本来の同一性が、下流のバイサルファイト処理／酵素変換中に保持されるように、アダプター中のｄＣ塩基はメチル－ｄＣに変えられる。ギャップ充填ライゲーション中に、相補的なＵＭＩ塩基が、ＴａｑＩＴポリメラーゼならびにｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびメチル－ｄＣＴＰを含むｄＮＴＰ混合物を使用して重合される。第２のライゲーション後、バイサルファイト処理または酵素処理により、非メチル化シトシンはウラシルに変換される。次いで、サンプルにバーコードを付加するために、新規に構築されたライブラリーの分子を、ウラシル適合型のＤＮＡポリメラーゼ（ｕｒａｃｉｌ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いてＰＣＲ増幅させることができる。このステップ中に、インサート（標的ストランド）中のウラシルは、新規に合成される相補鎖上でチミンに変換される（重合される）。得られたライブラリーは、適切なシーケンシングシステム、たとえば、限定はされないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上での全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）にいつでも使用することができる。

【0009】

[0008]代替の実施形態（図１Ｂ）では、標的メチル－ｓｅｑライブラリー構築のためのワークフローが提供される。鎖特異的な分子識別子（固有の分子識別子、ＵＭＩ）は、平滑ライゲーションとその後に続くギャップ充填ライゲーション反応により生物学的な鋳型に付けられる。第１のステップでは、断片化されたｇＤＮＡ、ＦＦＰＥ ＤＮＡ、またはせん断されていないｃｆＤＮＡが、遊離の３’ＯＨ末端を伴う平滑化された５’リン酸化インサートを生じる末端修復反応にかけられる。末端修復後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、平滑ライゲーションにより、第１のシーケンシングアダプター（たとえばＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームのＰ７）がインサートＤＮＡの３’末端に付けられるが、アダプターの一方の鎖はライゲーションを容易にするために５’アデニル化されている一方で、相補鎖は、ライゲーションを防ぐためにジデオキシ－Ａ、Ｔ、ＣまたはＧで３’末端においてブロックされている（図１Ａおよび１Ｂ）。アダプター中のｄＣ塩基の本来の同一性が、下流のバイサルファイト処理／酵素変換中に保持されるように、アダプター中のｄＣ塩基はメチル－ｄＣに変えられる。次いで、アダプター分子の３’末端をインサートのリン酸化５’末端に連結するギャップ充填ライゲーション反応により、第２のシーケンシングアダプターが生物学的インサートの５’末端に付けられる。アダプター中のｄＣ塩基の本来の同一性が、下流のバイサルファイト処理／酵素変換中に保持されるように、アダプター中のｄＣ塩基はメチル－ｄＣに変えられる。ギャップ充填ライゲーション中に、相補的なＵＭＩ塩基を、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびメチル－ｄＣＴＰを含むｄＮＴＰ混合物を使用して、ＴａｑＩＴポリメラーゼにより重合させる。ゲノム中の目的の標的領域を、ビオチン化プローブのカスタムパネルを使用して、ハイブリダイゼーションキャプチャーにより濃縮させる。標的の濃縮後に、非メチル化シトシンが、バイサルファイトまたは酵素処理によりウラシルに変換される。次いで、サンプルにバーコードを付加するために、キャプチャーライブラリー分子を、ウラシル適合型のＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅させることができる。このステップ中に、インサート（標的ストランド）中のウラシルは、新規に合成される相補鎖上でチミンに変換される（重合される）。得られたライブラリーは、適切なシーケンシングプラットフォーム、たとえば、限定はされないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上でのターゲットシーケンシングにいつでも使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1A】[0009]全ゲノムメチル－ｓｅｑライブラリー構築のワークフローを示す図である。

【図1B】[0010]標的メチル－ｓｅｑライブラリー構築のワークフローを示す図である。

【図2】[0011]メチル－ｄＣＴＰが、ｄＣＴＰと比べた場合に類似の効率で取り込まれ得ることを実証する図である。

【図3】[0012]図３Ａ、３Ｂ、３Ｃは、全ゲノムバイサルファイトシーケンシングによるメチル化の検出を実証する図である。

【図4】[0013]図４Ａ、４Ｂ、４Ｃは、酵素変換法を使用して非メチル化シトシンをウラシルに変換した場合のメチル化状態の検出を実証する図である。

【図5】[0014]図５Ａ、５Ｂ、５Ｃは、ターゲットシーケンシング法を使用するメチル化状態の検出を実証する図である。

【図6】[0015]図６Ａ、６Ｂは、ハイブリダイゼーションキャプチャー法のためのプローブデザイン、ならびに１００ｎｇおよび２５０ｎｇの投入量での対応するキャプチャーを実証する図である。

【図7A】[0016]正確なメチル化レベルが、１０ｎｇの少量の投入サンプルからバイアスの低下を伴って同定されることを実証する図である。

【図7B】正確なメチル化レベルが、１０ｎｇの少量の投入サンプルからバイアスの低下を伴って同定されることを実証する図である。

【図8A】[0017]健常サンプルおよび疾患サンプルから単離された、少量の投入ｃｆＤＮＡを使用するＷＧＢＳを実証する図である。

【図8B】健常サンプルおよび疾患サンプルから単離された、少量の投入ｃｆＤＮＡを使用するＷＧＢＳを実証する図である。

【図8C】健常サンプルおよび疾患サンプルから単離された、少量の投入ｃｆＤＮＡを使用するＷＧＢＳを実証する図である。

【図9A】[0018]標準的なタイリングまたは２×タイリングを用いたカスタムエピジェネティクスパネルを使用する標的メチル－ｓｅｑを実証する図である。

【図9B】標準的なタイリングまたは２×タイリングを用いたカスタムエピジェネティクスパネルを使用する標的メチル－ｓｅｑを実証する図である。

【図9C】標準的なタイリングまたは２×タイリングを用いたカスタムエピジェネティクスパネルを使用する標的メチル－ｓｅｑを実証する図である。

【図9D】標準的なタイリングまたは２×タイリングを用いたカスタムエピジェネティクスパネルを使用する標的メチル－ｓｅｑを実証する図である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

[0019]本明細書で開示される方法および組成物は、メチル－ｓｅｑ次世代シーケンシングライブラリーを調製するための組成物および方法を提供する。本明細書で開示されるのは、メチル化プロファイリングのためのインデックス付き核酸ライブラリーを調製する方法である。標的核酸の非メチル化シトシンは、バイサルファイト変換またはシチジンデアミナーゼのいずれかを用いてウラシルに変換される。種々の実施形態では、方法は標的核酸を固有の分子識別子（ＵＭＩ）でタグ付けするために２段階のプロセスを使用し、そこでは第１のＵＭＩが、標的核酸の３’末端に連結される。任意に、第２のＵＭＩが標的核酸の５’末端に付加すなわち連結されてもよい。アダプターの標的核酸への付加後、タグ付けされた核酸は化学的または酵素的に処理されて、非メチル化シトシンがウラシルに変換される。ＵＭＩの使用およびＵＭＩ付加後の変換は、シーケンシングおよび／または増幅により誘導されるアーティファクトを低減または実質的に取り除き、メチル化解析の正確性を向上させる。加えて、アダプター付加後の非メチル化シトシンのウラシルへの変換は、フルメチル化（すなわち、標的核酸の両方の鎖におけるメチル化イベント）、ヘミメチル化（すなわち、二本鎖標的核酸のうちの一方の鎖において起こるメチル化）または非メチル化標的核酸を識別するために使用することができる。本発明のこれらおよび他の利点ならびにさらなる発明の特徴が、本明細書で提供される本発明についての記載から明らかになるであろう。

【0012】

[0020]一実施形態では、標的核酸のメチル化プロファイルを決定する方法が提供される。方法は、ａ）標的核酸を得るステップと、ｂ）第１のリガーゼを用いて第１のアダプターを標的核酸の３’末端に連結するステップと、ｃ）第２のリガーゼを用いて第２のアダプターを標的核酸の５’末端に連結してアダプター－標的核酸－アダプター複合体を生成するステップと、ｄ）アダプター－標的核酸－アダプター複合体中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して変換された標的を生成するステップと、ｅ）任意で、変換された標的をＰＣＲ増幅するステップと、ｆ）変換された標的をシーケンシングするステップと、ｇ）変換された標的の配列を参照配列と比較して標的核酸のメチル化プロファイルを決定するステップを含む。

【0013】

[0021]さらなる実施形態では、標的核酸分子はＤＮＡである。さらなる実施形態では、ＤＮＡは全ゲノムＤＮＡ、細胞外ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、またはホルマリン固定パラフィン包埋ＤＮＡ（ＦＦＰＥ ＤＮＡ）である。

【0014】

[0022]別の実施形態では、第１のリガーゼはＴ４ ＤＮＡリガーゼである。さらなる実施形態では、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは変異体リガーゼである。別の実施形態では、変異体リガーゼはＫ１５９でのアミノ酸置換を含有する。別の実施形態で、変異体リガーゼはアミノ酸置換を含有し、Ｋ１５９Ｓ変異体である。

【0015】

[0023]別の実施形態では、第１のアダプターまたは第２のアダプターは固有の分子識別子配列を含有する。別の実施形態では、第１のアダプターおよび第２のアダプターは共に固有の分子識別子配列を含有する。

【0016】

[0024]一実施形態では、非メチル化シトシンのウラシルへの変換はバイサルファイト処理で実施される。別の実施形態では、非メチル化シトシンのウラシルへの変換はシチジンデアミナーゼを用いて実施される。

【0017】

[0025]別の実施形態では、アダプターはユニバーサルプライミング部位を含む。別の実施形態では、アダプター－標的核酸－アダプター複合体を形成するためのアダプターのライゲーション後に、複合体はハイブリダイゼーションキャプチャーによって濃縮される。前記アダプター－標的核酸－アダプター複合体を、ハイブリダイゼーションキャプチャーによって濃縮する、請求項１に記載の方法。

【0018】

[0026]一実施形態では、核酸の集団におけるメチル化シトシンを識別するための方法が提供される。さらなる実施形態では、核酸はＤＮＡであり、加えてＤＮＡは二本鎖である。一実施形態では、本発明の方法は、全ゲノム、ｃｆＤＮＡ、ｃｔＤＮＡまたはＦＦＰＥ ＤＮＡのメチル化パターンをプロファイリングするために使用される。記載される実施形態における方法は、配列の忠実度を保証し、シーケンシングデータの質を向上させる。記載される実施形態における方法は、シーケンシングおよび二本鎖ＤＮＡの各鎖を識別するステップを含んでもよい。加えて、記載される実施形態における方法は、フルメチル化およびヘミメチル化標的核酸の同定を可能し、標的核酸におけるフルメチル化、ヘミメチル化および非メチル化イベント間の区別を可能にする。

【0019】

[0027]さらに、本発明は、ライブラリーの生成およびメチル化標的核酸のシーケンシングを実現し、そこで使用されるアダプターはバーコードが付けられるか、または固有の分子識別子を含有する。ＵＭＩの使用は、二本鎖の標的核酸のうちのいずれかの鎖を追跡することを可能にする、すなわち、ＵＭＩは元の標的核酸のセンス鎖またはアンチセンス鎖を追跡することを可能にする。一実施形態では、ＵＭＩはランダムである。別の実施形態では、ＵＭＩは合理的または知的にデザインされる、すなわち、ＵＭＩは、バーコードが既知の配列になるようにデザインされる。核酸の組成の違いに起因する、異なる標的の非対称な増幅（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）である増幅バイアスを低下させるために、ＵＭＩを使用することができる。ＵＭＩは、ライブラリー調製中または増幅中に生じる核酸変異と、非メチル化シトシンのウラシルへのバイサルファイト変換または酵素変換によって誘導される変異を見分けるために使用することができる。いくつかの実施形態では、ＵＭＩは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６，１７、１８、１９または２０ヌクレオチドよりも大きくてもよい。

【0020】

[0028]別の実施形態では、サンプルインデックスまたはサンプルＩＤタグがアダプターに組み込まれてもよい。サンプルインデックスは、２～１８、３～１８、４～１８、５～１８、６～１８、７～１８または８～１８ヌクレオチド長の任意の適した長さであってもよい。サンプルＩＤタグは、少なくとも２、少なくとも４、少なくとも２５６、少なくとも１０２４、少なくとも４０９６、または少なくとも１６，３８４またはそれより多い個々のサンプルを識別するのに必要な任意の長さであってもよい。

【0021】

[0029]別の実施形態では、ユニバーサルプライミング部位がアダプター内に組み込まれてもよい。ユニバーサルプライミング部位は、タグ付けされたサンプルの増幅を可能にする。サンプルは、ＵＭＩによって、サンプルＩＤによって、またはＵＭＩもしくはサンプルＩＤの組み合わせによってタグ付けされてもよい。

【0022】

[0030]別の実施形態では、非メチル化シトシンのウラシルへの変換は、バイサルファイト処理または酵素処理で達成することができる。いくつかの実施形態では、酵素処理はシチジンデアミナーゼ酵素を用いてであってもよい。さらなる実施形態では、シチジンデアミナーゼはＡＰＯＢＥＣであってもよい。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）およびアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）を含む。いくつかの実施形態では、ＡＰＯＢＥＣ酵素は、ＡＰＯＢＥＣ－１（Ａｐｏ１）、ＡＰＯＢＥＣ－２（Ａｐｏ２）、ＡＩＤ、ＡＰＯＢＥＣ－３Ａ、－３Ｂ、－３Ｃ、－３ＤＥ、－３Ｆ、－３Ｇ、－３ＨおよびＡＰＯＢＥＣ－４（Ａｐｏ４）からなるヒトＡＰＯＢＥＣファミリーから選択される。いくつかの実施形態では、変換は、バイサルファイト変換によってであろうが酵素変換によってであろうが、市販のキットを使用する。一例では、キット、たとえば、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｇｏｌｄ、ＥＸ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ＤｉｒｅｃｔまたはＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｌｉｇｈｔｉｎｇ ｋｉｔ（ＺＹｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ （Ｉｒｖｉｎｅ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ．）より入手可能）が使用される。別の例では、キット、たとえばＡＰＯＢＥＣ－Ｓｅｑ （ＮＥＢｉｏｌａｂｓ）が使用される。

【0023】

[0031]別の実施形態では、アダプターは、非メチル化シトシンのウラシルへの変換前に付加される。さらなる実施形態では、アダプターはＵＭＩを含有する。非メチル化シトシンのウラシルへの変換前にアダプターを付加することは、個々の鎖の追跡を可能にし、フルメチル化またはヘミメチル化イベントの検出およびプロファイリングを可能にする。

【0024】

[0032]別の実施形態では、アダプターは非メチル化シトシンを含有する。さらに別の実施形態では、アダプターは非メチル化およびメチル化シトシンを含有してもよい。さらなる実施形態では、アダプターはもっぱらメチル化シトシンだけを含有してもよい。アダプター中のｄＣ塩基は、メチル－ｄＣに変えられ、下流のバイサルファイト処理／シトシンのウラシルへの酵素変換中、その本来の同一性を保持する。

【0025】

[0033]本発明は、二本鎖標的核酸の集団におけるメチル化シトシンを同定するための方法に関する。二本鎖標的核酸はＤＮＡであってもよい。さらなる実施形態では、ＤＮＡはゲノムＤＮＡ、せん断されたＤＮＡ、断片化されたＤＮＡ、ｃｆＤＮＡまたはＦＦＰＥ ＤＮＡであってもよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは末端修復されてＡテール化されてもよく、または末端修復されて平滑化されてもよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、疾患または障害の検出、診断またはスクリーニングのための生物学的サンプルから単離される。特定の実施形態では、生物学的サンプルは組織または腫瘍細胞であってもよい。

【0026】

[0034]図１Ａは、全ゲノムシーケンシングに適したメチル－ｓｅｑライブラリーの調製についての例を例示する。ステップ１では、標的核酸は末端修復されて平滑末端が導入される。得られた末端修復され平滑末端化された分子は、遊離の３’ＯＨ末端を伴う５’リン酸化末端を有する。ステップ２では、一方の末端上でブロックされたデュプレックスアダプターを備えたアダプター１が、標的核酸の３’末端に連結される。たとえば、第１のシーケンシングアダプターはＰ７ Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム配列を含有してもよい。一実施形態では、アダプター１を連結するために使用されるリガーゼは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼである。別の実施形態では、アダプター１を連結するために使用されるリガーゼは、変異体Ｔ４ ＤＮＡリガーゼである。特定の実施形態では、変異体Ｔ４ ＤＮＡリガーゼはＫ１５９でのアミノ酸置換を含有し、一方他の実施形態では、変異体Ｔ４ ＤＮＡリガーゼはＫ１５９Ｓアミノ酸置換を含有する。ステップ３では、アダプター２はギャップ充填およびライゲーションの手順により付加される。ステップ３では、アダプター分子の３’末端を標的核酸のリン酸化５’末端に連結するギャップ充填ライゲーション反応により、第２のシーケンスアダプターが標的核酸の５’末端に付けられる。ギャップ充填ライゲーション中に、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびメチル－ｄＣＴＰを含むｄＮＴＰ混合物を使用して、相補的なＵＭＩ塩基がＴａｑＩＴポリメラーゼにより充填される、すなわち重合される。ステップ４では、非メチル化シトシンがウラシルに変換される。バイサルファイト処理または酵素処理が、非メチル化シトシンをウラシルに変換するために使用されてもよい。ステップ５は任意のＰＣＲステップである。この任意のＰＣＲステップは、加えて、ウラシル適合型のＤＮＡポリメラーゼを使用してもよい。任意のＰＣＲが、残りのアダプター配列、サンプルインデックスまたはＮＧＳに必要なＮＧＳプラットフォーム特異的な配列を付加するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、ＮＧＳに必要とされる完全なアダプター配列が、２段階ライゲーションプロセスにより付加される。アダプターが付加された標的核酸（ａｄａｐｔｅｄ ｔａｒｇｅｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）および任意でＰＣＲ増幅されたアダプター標的核酸またはライブラリーは、メチル化プロファイリングおよび適切なシーケンシング機器上でのシーケンシングにいつでも使用することができる。いくつかの実施形態では、ＮＧＳに必要とされる完全なアダプター配列が２段階ライゲーションプロセスにより付加され、任意のＰＣＲは必要ない。

【0027】

[0035]図１Ｂは、メチル－ｓｅｑライブラリーを調製するための方法およびハイブリダイゼーションキャプチャー、すなわち特定の標的領域に対して濃縮するための濃縮を例示する。ステップ１では、標的核酸が末端修復されて核酸の末端が平滑化される。得られた末端修復され平滑末端化された分子は、遊離の３’－ＯＨ末端を伴う５’リン酸化末端を有する。ステップ２では、一方の末端上でブロックされたデュプレックスアダプターを備えたアダプター１が、標的核酸の３’末端に連結される。たとえば、第１のシーケンシングアダプターはＰ７ Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム配列を含有してもよい。一実施形態では、アダプター１を連結するために使用されるリガーゼは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼである。別の実施形態ではアダプター１を連結するために使用されるリガーゼは変異体Ｔ４ ＤＮＡリガーゼであり、一方特定の実施形態では変異体Ｔ４ ＤＮＡリガーゼはＫ１５９Ｓアミノ酸置換を含有する。特定の実施形態では、変異体Ｔ４ ＤＮＡリガーゼはＫ１５９でのアミノ酸置換を含有する。ステップ３ではアダプター２は、ギャップ充填およびライゲーションの手順により付加される。ステップ３では、アダプター分子の３’末端を標的核酸のリン酸化５’末端に連結するギャップ充填ライゲーション反応により、第２のシーケンスアダプターが標的核酸の５’末端に付けられる。ギャップ充填ライゲーション中に、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびメチル－ｄＣＴＰを含むｄＮＴＰ混合物を使用して、相補的なＵＭＩ塩基がＴａｑＩＴポリメラーゼにより充填される、すなわち重合される。ステップ４では、アダプターが付加された標的配列が、二本鎖ＤＮＡに対するパネルを用いたハイブリダイゼーションキャプチャーを使用して濃縮される。ステップ５では、非メチル化シトシンがウラシルに変換される。バイサルファイト処理または酵素処理が、非メチル化シトシンをウラシルに変換するために使用されてもよい。ステップ６は任意のＰＣＲである。この任意のＰＣＲステップは、加えて、ウラシル適合型のＤＮＡポリメラーゼを使用してもよい。任意のＰＣＲが、残りのアダプター配列、サンプルインデックスまたはＮＧＳに必要なＮＧＳプラットフォーム特異的な配列を付加するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、ＮＧＳに必要とされる完全なアダプター配列が、２段階ライゲーションプロセスにより付加される。アダプターが付加された標的核酸および任意でＰＣＲ増幅されたアダプター標的核酸またはライブラリーは、メチル化プロファイリングおよび適切なシーケンシング機器上でのシーケンシングにいつでも使用することができる。いくつかの実施形態では、ＮＧＳに必要とされる完全なアダプター配列が２段階ライゲーションプロセスにより付加され、任意のＰＣＲは必要ない。

【0028】

[0036]図２は、ＴａｑＩＴポリメラーゼが、ｄＣＴＰまたはメチル－ｄＣＴＰの取り込みに対して類似の取り込み効率を有することを実証する。ＵＭＩ中のｄＧは、ｄＣまたはメチル－ｄＣが、ギャップ充填プロセス中に反対の鎖上に取り込まれることになるということを示す。２５０ｎｇの１１７ｂｐのｇＢｌｏｃｋが、ライゲーション効率をテストするためのインサートとして使用された。ＵＭＩ配列中にｄＧを有するアダプター、ＵＭＩ配列中にｄＧを有さないアダプター、ＵＭＩ配列中にｄＧを有するメチル化アダプター、ＵＭＩ配列中にｄＧを有さないメチル化アダプターの４タイプのアダプターが検討された。ギャップ充填／ライゲーションのステップ（図１Ａ、ステップ３）では、メチル－ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰを含む緩衝液が、ＴａｑＩＴによるメチル－ｄＣＴＰの取り込み効率をテストするために使用された。ｄＮＴＰを含む緩衝液（緩衝液中のｄＣＴＰとして示される）が、対照として使用された。

【0029】

[0037]一実施形態では、標的の濃縮が実施される。特定の実施形態では、アンプリコンベースの濃縮が使用されてもよい。特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションキャプチャー濃縮が使用されてもよい。別の実施形態では、二本鎖キャプチャーのための２×交互パネルデザイン（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ ｐａｎｅｌ ｄｅｓｉｇｎ）が使用される。（図６Ａまたは９Ａを参照のこと）

【実施例】

【0030】

[0038]実施例における要素および行為は、単純化のために本発明を例示することを意図しており、必ずしもいずれかの特定の順序または実施形態にしたがって示されているのではない。実施例は、発明者らが本発明を所有していたことを確立することもまた意図している。

【0031】

実施例１
[0039]全ゲノムメチル－ｓｅｑライブラリーの構築
[0040]標的ＤＮＡを末端修復し、平滑ライゲーション用に調製する。５’アデニル化およびメチル化アダプターを標的インサートの３’末端に付けるために、変異体ＤＮＡリガーゼを使用する。５’アダプターの相補部分を、ライゲーションを防ぐためにブロックする。アダプター２を付けるためにギャップ充填ライゲーションを使用し、相補的なＵＭＩ塩基を、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびメチル－ｄＣＴＰを含有するｄＮＴＰ混合物を使用してＴａｑＩＴにより充填する。標的核酸中の非メチル化シトシンを、バイサルファイト処理または酵素処理によってウラシルに変換する。ＵＭＩがタグ付けされた標的配列のＰＣＲ増幅を使用して、固有のデュアルインデックスを導入する。

【0032】

[0041]図１Ａは、ＵＭＩアダプターを標的核酸に付加するために使用されるワークフローの一実施例、非メチル化シトシンの変換、ならびに固有のデュアルインデックスおよび適切なＮＧＳプラットフォーム特異的なアダプター配列を付加するためのＰＣＲ増幅を実証する。次いで、調製された標的配列を、適切なＮＧＳプラットフォーム上でシーケンシングする。シーケンシング後に、配列を参照配列と比較してメチル化プロファイルを決定する。

【0033】

[0042]１～２５０ｎｇの断片化されたＤＮＡを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、２０℃で３０分間、末端修復反応にかける。末端修復後、第１のシーケンシングアダプター（ＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームのＰ７）を、変異体Ｔ４ ＤＮＡリガーゼＫ１５９Ｓを使用して、２０℃で１５分間の平滑ライゲーションによりインサートＤＮＡの３’末端に付ける。次いで、変異体リガーゼを、６５℃で１５分間、熱失活させる。次いで、第２のシーケンシングアダプターを、６５℃で３０分間のギャップ充填ライゲーション反応により生物学的インサートの５’末端に付ける。ギャップ充填ライゲーション中に、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびメチル－ｄＣＴＰを含むｄＮＴＰ混合物を使用して、ＴａｑＩＴにより相補的なＵＭＩ塩基を重合させる（充填する）。Ｔａｑリガーゼを、インサートとＴａｑＩＴで伸長させたアダプターの間のニックを連結するために使用する。第２のライゲーション後、メーカーのプロトコールを使用して、バイサルファイト反応または酵素処理により、非メチル化シトシンをウラシルに変換する。次いで、サンプルにバーコードを付加するために、新規に構築されたライブラリーの分子を、ウラシル適合型のＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅させることができる。得られたライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上での全ゲノムバイサルファイトシーケンシングにいつでも使用することができる。

【0034】

[0043]

【表1】

【0035】

[0044]表１は、せん断されたヒトゲノムＤＮＡ（ＮＡ１２８７８）から、さまざまな標的核酸投入量（１～２５０ｎｇの範囲の核酸投入物）で調製された、ＷＧＢＳライブラリーを示す。非メチル化シトシンは、ＥＺ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｇｏｌｄ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ）（バイサルファイト変換法）またはＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ＮＥＢ）（酵素変換法）によって変換した。ＰＣＲサイクルは、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングに十分なライブラリー収量を実現するように最適化した。表１は、十分なライブラリー収量および平均ライブラリーサイズが１ｎｇ～２５０ｎｇの投入核酸量で十分であることを示す。加えて、表１は、適切なライブラリーサイズ（塩基対（ｂｐ）において測定される）が得られることを実証する。

【0036】

実施例２
[0045]標的メチル－ｓｅｑライブラリーの構築
[0046]ＤＮＡを末端修復し、平滑ライゲーション用に調製する。５’アデニル化およびメチル化アダプターを標的インサートの３’末端に付けるために、変異体ＤＮＡリガーゼを使用する。５’アダプターの相補部分を、ライゲーションを防ぐためにブロックする。アダプター２を付けるためにギャップ充填ライゲーションを使用し、相補的なＵＭＩ塩基を、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびメチル－ｄＣＴＰを含有するｄＮＴＰ混合物を使用してＴａｑＩＴにより充填する。標的領域を、ハイブリダイゼーションキャプチャー法によりキャプチャーし、濃縮する。ハイブリダイゼーションキャプチャーパネルには、二本鎖キャプチャーのための２×交互パネルデザインを利用する（図６を参照のこと）。ハイブリダイゼーションキャプチャー後に、標的核酸中の非メチル化シトシンを、バイサルファイト処理または酵素処理によってウラシルに変換する。ＵＭＩがタグ付けされた標的配列のＰＣＲ増幅を使用して、固有のデュアルインデックスを導入する。

【0037】

[0047]図１Ｂは、ＵＭＩアダプターを標的核酸に付加するために使用されるワークフローの一実施形態、標的領域のハイブリダイゼーションキャプチャー、非メチル化シトシンの変換、ならびに固有のデュアルインデックスおよび適切なＮＧＳプラットフォーム特異的なアダプターを付加するためのＰＣＲ増幅を実証する。次いで、調製された標的配列を、適切なＮＧＳプラットフォーム上でシーケンシングする。

【0038】

実施例３
[0048]非メチル化シトシンのバイサルファイト変換を使用するＷＧＢＳによるメチル化の検出。
[0049]１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（ＥｐｉＳｃｏｐｅ メチル化ＨＣＴ１１６、およびＮＡ１２８７８）を、５％の非メチル化ラムダＤＮＡと混合し、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２機器を使用して１５０ｂｐにせん断した。ＥｐｉＳｃｏｐｅ メチル化ＨＣＴ１１６のｇＤＮＡは、ＣｐＧメチラーゼ（ＴａＫａＲａ）を使用して高度にメチル化したヒトＨＣＴ１１６細胞から精製されたゲノムＤＮＡである。非メチル化ラムダＤＮＡを使用して、バイサルファイト処理の変換効率をモニターした。非メチル化シトシンを、ＥＺ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｇｏｌｄ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ）により変換した。ライブラリーを、ＩｌｌｕｍｉｎａのＭｉＳｅｑ（２×１５０塩基）上でシーケンシングした。バイサルファイトシーケンシングデータを、デフォルト設定を用いてｂｉｓｍａｒｋプログラムにより解析した。

【0039】

[0050]図３Ａは、９９．７％のシトシンからウラシルへの変換率および約８０％の固有のマッピング効率が、両サンプルタイプから得られたことを実証する。図３Ｂは、メチル化ＨＣＴ１１６のメチル化レベルが、ＣｐＧ、ＣＨＨおよびＣＨＧコンテキストにおいて、９６．３％、０．８％および０．５％であることを示す。ＮＡ１２８７８のメチル化レベルは、ＣｐＧ、ＣＨＨおよびＣＨＧコンテキストにおいて、４９．５％、０．４％および０．４％である。図３Ｃは、使用された１６個の合理的にデザインされたＵＭＩおよび固定配列の分布度数を示す。マッピングされていないリードはＮＮＮＮＮＮＮＮとして測定した。ＵＭＩ分布のプロットは、すべての合理的にデザインされたアダプターＵＭＩが効率的に連結することを示す。

【0040】

実施例４
[0051]非メチル化シトシンの酵素変換を使用したメチル化の検出。
[0052]１０および１００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（ＮＡ１２８７８）を、１％の非メチル化ラムダＤＮＡと混合し、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２機器を使用して１５０ｂｐにせん断した。非メチル化シトシンを、ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅによって変換した。ライブラリーを、ＩｌｌｕｍｉｎａのＭｉＳｅｑ（２×１５０塩基）上でシーケンシングした。酵素的メチル－ｓｅｑデータ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑ ｄａｔａ）を、デフォルト設定を用いてｂｉｓｍａｒｋプログラムにより解析した。

【0041】

[0053]図４Ａは、９９．７％のシトシンからウラシルへの変換率および約８１％の固有のマッピング効率が得られたことを示す。図４Ｂは、ＮＡ１２８７８のメチル化レベルが、ＣｐＧ、ＣＨＨおよびＣＨＧコンテキストにおいて、約４９％、約０．４％および約０．４％であることを実証する。図４Ｃは、使用された１６個の合理的にデザインされたＵＭＩおよび固定配列の分布度数を示す。マッピングされていないリードはＮＮＮＮＮＮＮＮとして測定した。ＵＭＩ分布のプロットは、すべての合理的にデザインされたアダプターＵＭＩが効率的に連結することを示す。

【0042】

実施例５
[0054]メチル化の検出および標的濃縮
[0055]標的メチル－ｓｅｑライブラリーを、前記ワークフロー（図１Ｂ）を使用して２５、５０、１００および２５０ｎｇのせん断されたヒトｇＤＮＡ（ＮＡ１２８７８）から調製し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．のｘＧｅｎ ＡＭＬ ｐａｎｅｌを使用して濃縮した。非メチル化シトシンを、ＥＺ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｇｏｌｄ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ）を使用してウラシルに変換した。

【0043】

[0056]図５Ａは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ上で試験された、最終的に得られたライブラリーのトレースを示す。図５Ｂは、２５０ｎｇのメチル化ＨＣＴ１１６およびＮＡ１２８７８のｇＤＮＡから調製され、ＩｌｌｕｍｉｎａのＭｉＳｅｑ（２×１５０塩基）上でシーケンシングされた標的メチル－ｓｅｑライブラリーを示す。標的メチル－ｓｅｑデータを、デフォルト設定を用いてｂｉｓｍａｒｋプログラムおよびＰｉｃａｒｄ ｔｏｏｌｋｉｔにより解析した。９１．７～９２．９％の、標的領域上の選択された塩基、および３６～１８８×の平均標的カバレッジが得られ、これは標的領域内で起こるメチル化イベントがより高感度に同定できることを示唆する。図５Ｃは、ＮＡ１２８７８のｇＤＮＡのメチル化レベルが、ＣｐＧ、ＣＨＨおよびＣＨＧコンテキストにおいて、約５８％、約０．３％および約０．３％であることを示す。

【0044】

実施例６
[0057]ライブラリーを、１０ｎｇの、０、５、１０、２５、５０、１００％のメチル化（ＥｐｉｇｅｎＤｘ）を有するメチル化対照から、実施例１に記載の通りに生成した。非メチル化シトシンを、ＥＺ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｇｏｌｄ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ）により変換した。ライブラリーを、ＩｌｌｕｍｉｎａのＮｅｘｔＳｅｑ（２×１５０塩基）上でシーケンシングした。

【0045】

[0058]Ｂｉｓｍａｒｋ（ｖ０．２２．３）およびＰｉｃａｒｄ（ｖ２．１８．９）を使用してアラインメントおよびメチル化の解析を実施し、モチーフの発見のためのＨｏｍｅｒ（Ｈｙｐｅｒｇｅｏｍｅｔｒｉｃ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｔｉｆ ＥｎＲｉｃｈｅｍｅｎｔ）を使用して、ゲノムの特徴を注釈付けした。図７Ａは、予想されたメチル化レベルと観測されたメチル化レベルの間の高い相関を示す。図７Ｂは、３６Ｍリードまでのシーケンシング後のＨｏｍｅｒの使用による、転写調節領域を含む広範なゲノムの特徴を明らかにする。図７Ｂは、Ｙ軸上に同定されたＣｐＧ部位の数、Ｘ軸上に注釈付けされたモチーフ／領域を示す。前記図は、前記ワークフローが、バイアスを伴うことなく／ほとんど伴うことなく、種々のメチル化レベルを有する投入物に対して、種々のゲノムの特徴をカバー／同定することができることを示す。

【0046】

実施例７
[0059]健常個体および肺がんを有する個体からの１０ｎｇのｃｆＤＮＡを、実施例１に記載の通りにライブラリー調製した。非メチル化シトシンを、ＥＺ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｇｏｌｄ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ）により変換した。ライブラリーを、ＩｌｌｕｍｉｎａのＮｅｘｔＳｅｑ（２×１５０塩基）上でシーケンシングした。

【0047】

[0060]アラインメントおよびメチル化の解析を、デフォルト設定でｂｉｓｍａｒｋプログラムを使用して実施した。図８Ａは、記載されたメチル化ワークフローを使用したライブラリーからの代表的なエレクトロフェログラムを示す。図８Ｂは、前記ワークフローが、１０ｎｇのｃｆＤＮＡから１μｇを超えるライブラリー収量を与えることを実証する。図８Ｃは、健常サンプルとがんサンプルの両方から、約８０％の固有のマッピング効率が得られたことを示す。

【0048】

実施例８
[0061]ヘミメチル化解析のための、両鎖の標的メチル－ｓｅｑキャプチャー（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑ ｃａｐｔｕｒｅｓ ｂｏｔｈ ｓｔｒａｎｄｓ）における交互デザイン。
[0062]せん断された、１００ｎｇの５０％メチル化対照および１００％メチル化対照（ＥｐｉｇｅｎＤｘ）から、標的メチル－ｓｅｑライブラリーを前記ワークフロー（図１Ｂ）を使用して調製し、癌遺伝子内のＣｐＧアイランド、ＣｐＧショアおよびＣｐＧシェルフを標的化するための２種のデザインの１３０ｋｂのカスタムパネルを使用して濃縮した。第１の標準的なパネルデザインでは、我々は、エンドツーエンドアルゴリズムでＩＤＴのｘＧｅｎ ｖ２パイプラインを使用した。最初に出力されるプローブデザインは、ＤＮＡの片方の鎖のみに対するものである。両ＤＮＡ鎖を標的化するために、我々は、前記プローブを加え、逆相補鎖生成させて（ｒｅｖｅｒｓｅ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ）、他方の鎖を標的化した（図９Ａ）。第２の２×タイリングデザインでは、我々は２×タイリングアルゴリズムでＩＤＴのｘＧｅｎ ｖ２パイプラインを使用した。両ＤＮＡ鎖を標的化するために、我々は１プローブおきに標的鎖を入れ替えた（図９Ａ）。非メチル化シトシンを、ＥＺ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｇｏｌｄ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ）により変換した。ライブラリーを、ＩｌｌｕｍｉｎａのＮｅｘｔＳｅｑ（２×１５０塩基）上でシーケンシングした。アラインメントおよびメチル化の解析を、Ｂｉｓｍａｒｋ（ｖ０．２２．３）およびＰｉｃａｒｄ（ｖ２．１８．９）を使用して実施した。ＤＮＡ鎖を、約７０％のオンターゲット率でキャプチャーした。図９Ｂは、ヘミメチル化部位がフィッシャーの正確確率検定を適用することにより同定され、次いで、すべてのｐ値が、０．０５の偽発見誤差率（ｆａｌｓｅ－ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅ）でベンジャミニ－ホッホベルクの手順を使用して調整されたことを示す。図９Ｃは、１６Ｍリードにダウンサンプリングした後に、１５０～３００×の平均標的カバレッジが観測されたことを示す。図９Ｄは、両パネルデザインが高いキャプチャー均一性を実現することを実証する。

【0049】

[0063]公表文献、特許出願および特許を含む、本明細書で引用されるすべての参考文献は、あたかも各参考文献が参照により組み込まれることが個別にかつ具体的に示されたのと同程度に、および本明細書にその全体が明記されたのと同程度に、参照により組み込まれる。

【0050】

[0064]本発明を記載する文脈における（特に以下の特許請求の範囲の文脈にける）、「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語ならびに類似の指示対象の使用は、本明細書で別様に示されない限り、または文脈によって明確に否定されない限り、単数と複数の両方を包含すると解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、別様に言及されない限り、オープンエンド用語（すなわち、「含むが、限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において別様に示されない限り、その範囲に入るそれぞれの独立した値を個別に参照する簡略な方法として機能することが単に意図されており、それぞれの独立した値は、それが本明細書で個別に列挙されるかのように本明細書中に組み込まれる。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書において別様に示されない限り、または文脈によって明確に否定されない限り、任意の適した順番で実施され得る。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的な言語（たとえば、「たとえば（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、単に本発明をよりはっきりとさせることを意図しており、別様に主張されない限り、本発明の範囲に制限を課すものではない。本明細書におけるいかなる言語も、本発明の実践に必須の何らかの特許請求されていない要素を示すとして解釈されるべきではない。

【0051】

[0065]本発明を実行するための発明者らが知る最良の形態を含む本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載される。それらの好ましい実施形態の変形形態が、上述の記載を読めば当業者には明らかになり得る。発明者らは、当業者がそのような変形形態を適切に使用することを期待しており、発明者らは、本明細書に具体的に記載されるものとは別様に本発明が実践されることを意図している。よって、本発明は、適用法によって許可されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲で列挙された主題のすべての改変および等価物を含む。さらに、本明細書において別様に示されない限り、または文脈によって明確に否定されない限り、それらのすべての可能な変形形態における上記の要素のあらゆる組み合わせが本発明により包含される。

【0052】

[0066]参考文献
[0067]Valouev et al. Methods of preparing dual-indexed DNA libraries for bisulfite conversion sequencing. US Patent Application: US20180044731A1
[0068]Gai, W. and K. Sun, Epigenetic Biomarkers in Cell-Free DNA and Applications in Liquid Biopsy. Genes (Basel), 2019. 10(1).
[0069]Liu, Y., et al., Bisulfite-free direct detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at base resolution. Nat Biotechnol, 2019. 37(4):
[0070]Moss, J., et al., Comprehensive human cell-type methylation atlas reveals origins of circulating cell-free DNA in health and disease. Nat Commun, 2018. 9(1): p. 5068.
[0071]Schutsky, E.K., et al., APOBEC3A efficiently deaminates methylated, but not TET-oxidized, cytosine bases in DNA. Nucleic Acids Res, 2017. 45(13): p. 7655-7665.

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】