▶ デュポン ニュートリション バイオサイエンシス エーピーエスの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-09
(45)【発行日】2024-10-18
(54)【発明の名称】副原料醸造におけるインフュージョン・マッシング用の酵素
(51)【国際特許分類】
C12C 7/047 20060101AFI20241010BHJP
C12C 5/02 20060101ALI20241010BHJP
C12G 3/02 20190101ALI20241010BHJP
C12G 3/021 20190101ALI20241010BHJP
C12N 9/26 20060101ALI20241010BHJP
C12N 9/28 20060101ALI20241010BHJP
C12N 9/34 20060101ALI20241010BHJP
【ＦＩ】
C12C7/047 ZNA
C12C5/02
C12G3/02
C12G3/021
C12N9/26 A
C12N9/28
C12N9/34
【請求項の数】
41
(21)【出願番号】P 2021522068
(86)(22)【出願日】2019-10-21
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-07
(86)【国際出願番号】 US2019057150
(87)【国際公開番号】W WO2020086430
(87)【国際公開日】2020-04-30
【審査請求日】2022-10-14
(31)【優先権主張番号】62/748,739
(32)【優先日】2018-10-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】513207806
【氏名又は名称】インターナショナル エヌアンドエイチ デンマーク エーピーエス
(74)【代理人】
【識別番号】110003579
【氏名又は名称】弁理士法人山崎国際特許事務所
(74)【代理人】
【識別番号】100118647
【弁理士】
【氏名又は名称】赤松 利昭
(74)【代理人】
【識別番号】100123892
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 忠雄
(74)【代理人】
【識別番号】100169993
【弁理士】
【氏名又は名称】今井 千裕
(74)【代理人】
【識別番号】100173978
【弁理士】
【氏名又は名称】朴 志恩
(72)【発明者】
【氏名】クレーマー、ジェイコブ、フライホルム
(72)【発明者】
【氏名】ブラット、トゥローヴ
【審査官】戸来 幸男
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００４／０５０８２０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００５／０８６６４０（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特開２００６－２８８３７９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００４－０２４１５１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開昭６０－２３７９８３（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｃ １／０００－１３／１０
Ｃ１２Ｇ ３／００－３／０８
Ｃ１２Ｐ １９／００－１９／６４
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
Ｇｏｏｇｌｅ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
１００％副原料ビール醸造のマッシング方法であって、ａ．）副原料を含む非モルトグリストを提供する工程；及び
ｂ．）αアミラーゼと、マルトジェニックαアミラーゼ及び／又はグルコアミラーゼと、前記グリストを８０℃以下の温度で接触させて、前記グリストの液化および糖化を経て糖化液を生成する工程；
を含む方法。
【請求項2】
前記αアミラーゼが、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記αアミラーゼが、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記αアミラーゼが、配列番号１による配列を有する酵素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記マルトジェニックαアミラーゼが、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記マルトジェニックαアミラーゼが、配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記マルトジェニックαアミラーゼが、配列番号２による配列を有する酵素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記グルコアミラーゼが、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記グルコアミラーゼが、配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記グルコアミラーゼが配列番号３を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
工程ｂ．）において、前記グリストをαアミラーゼ及びマルトジェニックαアミラーゼと接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記αアミラーゼが、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有し、且つ前記マルトジェニックαアミラーゼが、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記αアミラーゼが、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ前記マルトジェニックαアミラーゼが、配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記αアミラーゼが、配列番号１による配列を有する酵素を含み、且つ前記マルトジェニックαアミラーゼが、配列番号２による配列を有する酵素を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
工程ｂ．）において、前記グリストをαアミラーゼ及びグルコアミラーゼと接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
前記αアミラーゼが、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有し、且つ前記グルコアミラーゼが、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記αアミラーゼが、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ前記グルコアミラーゼが、配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記αアミラーゼが、配列番号１による配列を有する酵素を含み、且つ前記グルコアミラーゼが、配列番号３による配列を有する酵素を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記グリストが、トウモロコシ、コメ、モロコシ及びカッサバ又はその混合物からなる群から選択される、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記グリストが、モロコシを少なくとも１０％含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記グリストが、モロコシを少なくとも２５％含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記グリストが、モロコシを少なくとも５０％含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記グリストが、モロコシを少なくとも７５％含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記グリストが、モロコシを１００％含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記グリストが、トウモロコシを少なくとも１０％含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項26】
前記グリストが、トウモロコシを少なくとも２５％含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記グリストが、トウモロコシを少なくとも５０％含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記グリストが、トウモロコシを少なくとも７５％含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記グリストが、トウモロコシを１００％含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記グリストが、コメを少なくとも１０％含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項31】
前記グリストが、コメを少なくとも２５％含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項32】
前記グリストが、コメを少なくとも５０％含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項33】
前記グリストが、コメを少なくとも７５％含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項34】
前記グリストが、コメを１００％含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項35】
前記グリストが、カッサバを少なくとも１０％含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項36】
前記グリストが、カッサバを少なくとも２５％含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項37】
前記グリストが、カッサバを少なくとも５０％含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項38】
前記グリストが、カッサバを少なくとも７５％含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項39】
前記グリストが、カッサバを１００％含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項40】
前記糖化液がビールへと転化される、請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
１００％副原料ビール醸造におけるαアミラーゼと、マルトジェニックαアミラーゼ及び／又はグルコアミラーゼと、の使用であって、前記醸造において液化および糖化が８０℃以下の温度で行われる、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、副原料グリストをマッシュする方法に関する。さらに具体的には、本開示は、マルトジェニックαアミラーゼ及び／又はグルコアミラーゼと併せてαアミラーゼを醸造に用いて、副原料によって構成される非モルト麦汁が提供される、方法及び組成物を提供する。
【背景技術】
【0002】
醸造は一般に、３つの工程：モルティング、マッシング及び発酵を含む。モルティング工程の主な目的は、デンプン及びタンパク質分解における醸造プロセス中の次の役割を有する酵素を発生させることである。従来からビールはオオムギモルト、ホップ及び水から醸造されていたが、優れた品質の穀物、発芽用の水及びキルニングのためのエネルギーが必要であるため、モルトは高価な原料である。原料のコストを下げるために、副原料とも呼ばれる非モルト化穀物、例えばトウモロコシ、コメ、カッサバ、コムギ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、キノア及びモロコシなどが醸造プロセスに含まれ得る。容易に入手可能であり、オオムギモルトよりも低いコストで発酵性炭水化物を提供することから、副原料が主に使用される。
【0003】
醸造における副原料の使用によって、従来の醸造プロセスが複雑となる。通常、デンプンを液化するために、副原料は「シリアルクッカー」で別々に処理しなければならない。したがって、副原料を使用すると原料の全体的なコストは下がるが、シリアルクッカーにおける更なる投資、並びに発酵性糖類を遊離させるための、副原料の加熱及び処理に更なる費用が必要である。これらの更なるコストを低減するために、醸造者は、低い副原料比率（つまり、副原料：モルトの比）を使用する傾向があった。
【0004】
シリアルクッカーを使用する必要なく、ビール製造において副原料を使用することができる方法が引き続き必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明の態様に従って、以下の工程：ａ．）副原料を含むグリストを提供する工程；及びｂ．）αアミラーゼと、マルトジェニックαアミラーゼ及び／又はグルコアミラーゼと、グリストとを接触させて麦汁を生成する工程；を有する、１００％副原料醸造のためのマッシング方法が示される。
【0006】
任意に、αアミラーゼは、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有する。任意に、αアミラーゼは、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有する。任意に、αアミラーゼは、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有する。任意に、αアミラーゼは、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有する。任意に、αアミラーゼは、配列番号１による配列を有する酵素である。
【0007】
任意に、マルトジェニックαアミラーゼは、配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する。任意に、マルトジェニックαアミラーゼは、配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有する。任意に、マルトジェニックαアミラーゼは、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する。任意に、マルトジェニックαアミラーゼは、配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を有する。任意に、マルトジェニックαアミラーゼは、配列番号２による配列を有する酵素である。
【0008】
任意に、グルコアミラーゼは、配列番号３と少なくとも７０％の配列同一性を有する。任意に、グルコアミラーゼは、配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有する。任意に、グルコアミラーゼは、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する。任意に、グルコアミラーゼは、配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性を有する。任意に、グルコアミラーゼは、配列番号３による配列を有する酵素である。
【0009】
本発明の一態様において、グリストをαアミラーゼ及びマルトジェニックαアミラーゼと接触させる。任意に、αアミラーゼは、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、且つマルトジェニックαアミラーゼは、配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する。任意に、αアミラーゼは、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有し、且つマルトジェニックαアミラーゼは、配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有する。任意に、αアミラーゼは、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有し、且つマルトジェニックαアミラーゼは、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する。任意に、αアミラーゼは、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つマルトジェニックαアミラーゼは、配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を有する。任意に、αアミラーゼは、配列番号１による配列を有する酵素であり、マルトジェニックαアミラーゼは、配列番号２による配列を有する酵素である。
【0010】
本発明の他の態様において、グリストをαアミラーゼ及びグルコアミラーゼと接触させる。任意に、αアミラーゼは、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、且つグルコアミラーゼは、配列番号３と少なくとも７０％の配列同一性を有する。任意に、αアミラーゼは、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有し、且つグルコアミラーゼは、配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有する。任意に、αアミラーゼは、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有し、且つグルコアミラーゼは、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する。任意に、αアミラーゼは、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つグルコアミラーゼは、配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性を有する。任意に、αアミラーゼは、配列番号１による配列を有する酵素であり、且つグルコアミラーゼは、配列番号３による配列を有する酵素である。
【0011】
任意に、グリストは、トウモロコシ、コメ、モロコシ及びカッサバ又はその混合物からなる群から選択される。任意に、グリストは少なくとも１０％のモロコシである。任意に、グリストは少なくとも２５％のモロコシである。任意に、グリストは少なくとも５０％のモロコシである。任意に、グリストは少なくとも７５％のモロコシである。任意に、グリストは１００％モロコシである。
【0012】
本発明の他の態様において、グリストは少なくとも１０％のトウモロコシである。任意に、グリストは少なくとも２５％のトウモロコシである。任意に、グリストは少なくとも５０％のトウモロコシである。任意に、グリストは少なくとも７５％のトウモロコシである。任意に、グリストは１００％トウモロコシである。
【0013】
他の態様において、グリストは少なくとも１０％のコメである。任意に、グリストは少なくとも２５％のコメである。任意に、グリストは少なくとも５０％のコメである。任意に、グリストは少なくとも７５％のコメである。任意に、グリストは１００％コメである。
【0014】
他の態様において、グリストは少なくとも１０％のカッサバである。任意に、グリストは少なくとも２５％のカッサバである。任意に、グリストは少なくとも５０％のカッサバである。任意に、グリストは少なくとも７５％のカッサバである。任意に、グリストは１００％カッサバである。
【0015】
任意に、麦汁がビールに転化される。
【0016】
本発明の一態様において、醸造におけるαアミラーゼと、マルトジェニックαアミラーゼ及び／又はグルコアミラーゼと、の使用が提供される。
【0017】
本発明の他の態様において、αアミラーゼ及びマルトジェニックαアミラーゼを有する酵素組成物が提供される。
【0018】
本発明のさらに他の態様において、αアミラーゼ及びグルコアミラーゼを有する酵素組成物が提供される。
【0019】
生物学的配列の簡単な説明
配列番号１は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ＧｓＡＡ１由来のαアミラーゼ変異体の成熟アミノ酸配列を示す。
配列番号１は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ＧｓＡＡ１由来のαアミラーゼ変異体の成熟アミノ酸配列を示す。
【0020】
配列番号２は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ＧｓＡＡ２由来のマルトジェニックαアミラーゼの成熟アミノ酸配列を示す。
【0021】
配列番号３は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来のグルコアミラーゼの成熟アミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【0022】
本発明の実行は、別途指示しない限り、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学及び生化学の従来の技術を用いることができ、これらは当技術分野の技術範囲内である。かかる技術は、文献に、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０）、及びＴｈｅ Ａｌｃｏｈｏｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ（Ｉｎｇｌｅｄｅｗ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００９）及びＥｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｌｉｎｄｈｏｒｓｔｅ，２００７）に説明されている。
【0023】
別途本明細書で定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）及びＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｋｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は、本発明で使用する用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。本明細書で説明する方法及び材料と類似の又は等価のあらゆる方法及び材料を、本発明の実施又は試験で使用することができる。
【0024】
本明細書に記載する数値範囲は、この範囲を定義する数字を含む。
【0025】
定義
ポリペプチドに関する「野生型」、「親」又は「参照」という用語は、１つ以上のアミノ酸の位置での人為的な置換、挿入又は欠失を含まない天然型ポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関する「野生型」、「親」又は「参照」という用語は、人為的なヌクレオシド変化を含まない天然型ポリヌクレオチドを指す。しかし、野生型、親又は参照ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドに限定されず、野生型、親又は参照ポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドを包含することに留意されたい。
ポリペプチドに関する「野生型」、「親」又は「参照」という用語は、１つ以上のアミノ酸の位置での人為的な置換、挿入又は欠失を含まない天然型ポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関する「野生型」、「親」又は「参照」という用語は、人為的なヌクレオシド変化を含まない天然型ポリヌクレオチドを指す。しかし、野生型、親又は参照ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドに限定されず、野生型、親又は参照ポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドを包含することに留意されたい。
【0026】
野生型ポリペプチドへの言及は、ポリペプチドの成熟形を含むと理解される。「成熟」ポリペプチド又はその変異体は、例えば、そのポリペプチドの発現中又は発現後のポリペプチドの未熟型から切断されて、シグナル配列が存在しないものである。
【0027】
ポリペプチドに関する用語「変異体」は、アミノ酸の１つ以上の天然型又は人為的置換、挿入若しくは欠失を含むという点で特定の野生型、親又は参照ポリペプチドと異なるポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関する用語「変異体」は、ヌクレオチド配列において特定の野生型、親又は参照ポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドを指す。野生型、親又は参照ポリペプチド又はポリヌクレオチドの同一性は、文脈から明らかになるであろう。
【0028】
「組み換え」という用語は、対象細胞、核酸、タンパク質又はベクターに関して使用される場合には、対象がその天然状態から改変されていることを示す。したがって、例えば、組み換え細胞は、天然（非組み換え）型の細胞内では見出されない遺伝子を発現するか、又は異なるレベルで、若しくは天然に見出される条件と異なる条件下で天然遺伝子を発現する。組み換え核酸は、天然配列とは１つ以上のヌクレオチドが異なり、且つ／又は、異種配列、例えば発現ベクター内の異種プロモーターと動作可能に連結している。組み換えタンパク質は、天然配列とは１つ以上のアミノ酸が異なり得、且つ／又は異種配列と融合している。アミラーゼをコードする核酸を含むベクターは、組み換えベクターである。
【0029】
「回収（された）」、「単離（された）」及び「分離（された）」という用語は、化合物、タンパク質（ポリペプチド）、細胞、核酸、アミノ酸若しくは他の特定の物質又は構成要素であって、天然に見出されるようにそれが自然に同伴している少なくとも１つの他の物質又は構成要素から除去されるものを指す。それらの「単離された」ポリペプチドには、異種宿主細胞内で発現した分泌ポリペプチドを含有する細胞培養ブロスが含まれるが、それに限定されない。
【0030】
「アミノ酸配列」という用語は、用語「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」と同義であり、互換的に使用される。そのようなアミノ酸配列が活性を示す場合、それらは「酵素」と呼ぶことができる。アミノ酸残基に対して従来の１文字コード又は３文字コードが使用され、アミノ酸配列は、標準のアミノからカルボキシ末端方向（すなわち、Ｎ→Ｃ）に表示される。
【0031】
「核酸」という用語は、ポリペプチドをコードできるＤＮＡ、ＲＮＡ、ヘテロ二本鎖及び合成分子を含む。核酸は一本鎖であっても二本鎖であってもよいし、化学改変を有してもよい。用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用される。遺伝コードは縮重しているため、特定のアミノ酸をコードするために２個以上のコドンを使用し得、本発明の組成物及び方法は、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を包含する。他に規定しない限り、核酸配列は、５’－から－３’の方向に表示される。
【0032】
細胞に関連して使用される「形質転換（された）」、「安定に形質転換（された）」及び「トランスジェニック」という用語は、細胞が、そのゲノム内に組み込まれた非天然の（例えば、異種の）核酸配列を、又は複数世代を通して維持されるエピソームとして保持している核酸配列を含有していることを意味する。
【0033】
細胞内へ核酸配列を挿入することに関連して、「導入（された）」という用語は、当技術分野において知られているように「遺伝子導入」、「形質転換」又は「形質導入」を意味する。
【0034】
「宿主株」又は「宿主細胞」は、その中に目的のポリペプチド（例えば、アミラーゼ）をコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクター、ファージ、ウイルス又は他のＤＮＡ構築物が導入されている生物である。宿主株の例としては、対象とするポリペプチドを発現することができる微生物細胞（例えば、細菌、糸状菌及び酵母）がある。「宿主細胞」という用語には、細胞から作成されたプロトプラストが含まれる。
【0035】
ポリヌクレオチド又はタンパク質に関連する「異種の」という用語は、宿主細胞中で自然には生じないポリヌクレオチド又はタンパク質を指す。
【0036】
ポリヌクレオチド又はタンパク質に関連する「内在性の」という用語は、宿主細胞中で自然に生じるポリヌクレオチド又はタンパク質を指す。
【0037】
「発現」という用語は、核酸配列に基づいてポリペプチドが生成されるプロセスを指す。このプロセスには、転写及び翻訳の両方が含まれる。
【0038】
「選択的マーカー」又は「選択可能なマーカー」は、遺伝子を運ぶ宿主細胞の選択を容易にするために宿主内で発現させることのできる遺伝子を指す。選択可能なマーカーの例としては、抗生物質（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン又はクロラムフェニコール）及び／又は宿主細胞に代謝上の利点、例えば栄養上の利点を付与する遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【0039】
「ベクター」は、核酸を１種以上の細胞型に導入するように設計されたポリヌクレオチド配列を指す。ベクターには、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセットなどが含まれる。
【0040】
「発現ベクター」は、関心対象のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を意味するが、そのコーディング配列は、好適な宿主内のＤＮＡの発現を実施できる好適な制御配列に機能的に連結している。そのような制御配列には、転写を生じさせるプロモーター、転写を制御する任意選択的オペレーター配列、ｍＲＮＡ上の好適なリボソーム結合部位をコードする配列、エンハンサー並びに転写及び翻訳の終了を制御する配列が含まれ得る。
【0041】
「作動可能に連結した」という用語は、特定の構成成分が意図された方法で機能することを許容する関係（並列を含むがそれには限定されない）にあることを意味する。例えば、調節配列は、コーディング配列の発現が調節配列の制御下にあるようにコーディング配列に機能的に連結している。
【0042】
「シグナル配列」は、細胞外部へのタンパク質の分泌を容易にする、タンパク質のＮ末端部分に付着しているアミノ酸の配列である。細胞外タンパク質の成熟形は、分泌プロセス中に切断して除かれるシグナル配列を欠いている。
【0043】
「生物活性」は、例えば酵素活性などの特定の生物活性を有する配列を指す。
【0044】
「比活性」という用語は、特定条件下で単位時間当たりに、酵素又は酵素調製物によって生成物へと転化され得る基質のモル数を指す。比活性は、一般に、単位数（Ｕ）／ｍｇタンパク質で表される。
【0045】
本明細書で使用する場合、「配列同一性パーセント」は、特定の配列を、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムをデフォルトパラメータで使用して整列させた場合、特定の参照配列内のものと同一のアミノ酸残基を少なくとも一定のパーセンテージで有することを意味する。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０を参照されたい。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムのデフォルトパラメータは、次のとおりである：
ギャップ開始ペナルティ：１０．０
ギャップ伸長ペナルティ：０．０５
タンパク質ウエイトマトリックス：ＢＬＯＳＵＭシリーズ
ＤＮＡウエイトマトリックス：ＩＵＢ
ディレイ発散配列（％）：４０
ギャップ分離距離：８
ＤＮＡトランジションウエイト：０．５０
親水性残基のリスト：ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ
ネガティブマトリックスの使用：オフ
トグル残基特異的ペナルティ：オン
トグル親水性ペナルティ：オン
トグル末端ギャップ分離ペナルティ オフ。
ギャップ開始ペナルティ：１０．０
ギャップ伸長ペナルティ：０．０５
タンパク質ウエイトマトリックス：ＢＬＯＳＵＭシリーズ
ＤＮＡウエイトマトリックス：ＩＵＢ
ディレイ発散配列（％）：４０
ギャップ分離距離：８
ＤＮＡトランジションウエイト：０．５０
親水性残基のリスト：ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ
ネガティブマトリックスの使用：オフ
トグル残基特異的ペナルティ：オン
トグル親水性ペナルティ：オン
トグル末端ギャップ分離ペナルティ オフ。
【0046】
欠失は、参照配列と比較して非同一の残基として計数される。いずれかの末端で発生している欠失が含まれる。例えば、成熟した６１７個の残基ポリペプチドのＣ末端の５つのアミノ酸欠失を有する変異体は、成熟ポリペプチドに対して９９％の配列同一性率（６１２／６１７個の同一残基×１００、最も近い整数に丸めた）を有するであろう。そのような変異体は、成熟ポリペプチドに対して「少なくとも９９％の配列同一性」を有する変異体に包含されるであろう。
【0047】
「融合（した）」ポリペプチド配列は、２つの対象ポリペプチド配列間のペプチド結合によって接続されている、すなわち動作可能に連結されている。
【0048】
「糸状菌」という用語は、ユウミコチナ（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門のすべての糸状体、特にペジゾミコチナ（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）種を指す。
【0049】
「約」という用語は、参照値の±５％を指す。
【0050】
更なる突然変異
一部の実施形態において、本発明のアミラーゼはさらに、更なる性能又は安定性の利点を提供する１つ又は複数の突然変異を含む。例示的な性能の利点としては、限定されないが、増加した熱安定性、増加した貯蔵安定性、増加した溶解性、変化したｐＨプロファイル、増加した比活性、改質された基質特異性、改質された基質結合性、改質されたｐＨ依存性活性、改質されたｐＨ依存性安定性、増加した酸化安定性、及び増加した発現が挙げられる。一部の場合には、性能の利点は、比較的低い温度で実現される。一部の場合には、性能の利点は、比較的高い温度で実現される。
一部の実施形態において、本発明のアミラーゼはさらに、更なる性能又は安定性の利点を提供する１つ又は複数の突然変異を含む。例示的な性能の利点としては、限定されないが、増加した熱安定性、増加した貯蔵安定性、増加した溶解性、変化したｐＨプロファイル、増加した比活性、改質された基質特異性、改質された基質結合性、改質されたｐＨ依存性活性、改質されたｐＨ依存性安定性、増加した酸化安定性、及び増加した発現が挙げられる。一部の場合には、性能の利点は、比較的低い温度で実現される。一部の場合には、性能の利点は、比較的高い温度で実現される。
【0051】
さらに、本アミラーゼは、任意の数の保存的アミノ酸置換を含み得る。例示的な保存的アミノ酸置換を表１に列挙する。
【0052】
保存的アミノ酸置換
【0053】
【表1】
【0054】
読者は、上述の保存的突然変異の一部を遺伝子操作によって生成することができ、他の保存的突然変異が、遺伝的又は他の手段によって合成アミノ酸をポリペプチド内に導入することによって生成されることを理解するであろう。
【0055】
本発明のアミラーゼは、シグナル配列を含む「前駆体」、「未成熟」若しくは「完全長」、又はシグナル配列が欠如した「成熟」であり得る。ポリペプチドの成熟形態が、一般に、最も有用である。特に記載がない限り、本明細書で使用するアミノ酸残基の番号付けは、それぞれのアミラーゼポリペプチドの成熟形態を指す。本発明のアミラーゼポリペプチドはまた、得られたポリペプチドがアミラーゼ活性を保持する限り、Ｎ末端又はＣ末端を切断して除去してもよい。
【0056】
本発明のアミラーゼは、それが第１のアミラーゼポリペプチドの少なくとも一部分及び、第２のアミラーゼポリペプチドの少なくとも一部分を含むという点で、「キメラ」、「ハイブリッド」ポリペプチドであり得る。本発明のアミラーゼは、異種シグナル配列、トラッキング又は精製を可能にするエピトープなどをさらに含んでもよい。代表的な異種シグナル配列は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼ（ＬＡＴ）、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＡｍｙＥ又はＡｐｒＥ）及びストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ＣｅｌＡ由来である。
【0057】
アミラーゼの産生
本発明のアミラーゼは、例えば分泌又は細胞内発現により、宿主細胞内中で産生され得る。アミラーゼを含む培養細胞材料（例えば、全細胞ブロス）は、アミラーゼの細胞培地への分泌後に得ることができる。任意選択により、アミラーゼを、最終的なアミラーゼの所望の純度に応じて、宿主細胞から単離し得るか、又はさらに細胞ブロスから単離し得る。プロリン特異性アミラーゼをコードする遺伝子を、当技術分野で公知の方法に従って、クローニングして発現させ得る。好適な宿主細胞としては、細菌、真菌（酵母及び糸状菌を含む）及び植物細胞（藻類を含む）が挙げられる。特に有用な宿主細胞としては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）又はトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）が挙げられる。他の宿主細胞として、細菌細胞、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、並びにストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、及び大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）が挙げられる。
本発明のアミラーゼは、例えば分泌又は細胞内発現により、宿主細胞内中で産生され得る。アミラーゼを含む培養細胞材料（例えば、全細胞ブロス）は、アミラーゼの細胞培地への分泌後に得ることができる。任意選択により、アミラーゼを、最終的なアミラーゼの所望の純度に応じて、宿主細胞から単離し得るか、又はさらに細胞ブロスから単離し得る。プロリン特異性アミラーゼをコードする遺伝子を、当技術分野で公知の方法に従って、クローニングして発現させ得る。好適な宿主細胞としては、細菌、真菌（酵母及び糸状菌を含む）及び植物細胞（藻類を含む）が挙げられる。特に有用な宿主細胞としては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）又はトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）が挙げられる。他の宿主細胞として、細菌細胞、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、並びにストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、及び大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）が挙げられる。
【0058】
宿主細胞はさらに、宿主細胞と同じ種ではない相同若しくは異種アミラーゼ、又は１種若しくは複数種の他の酵素をコードする核酸を発現し得る。アミラーゼは変異体アミラーゼであり得る。さらに、宿主は、１つ以上のアクセサリー酵素、タンパク質、ペプチドを発現し得る。
【0059】
ベクター
アミラーゼをコードする核酸を含むＤＮＡ構築物は、宿主細胞において発現されるように作成され得る。遺伝子コードの既知の縮重のために、同一のアミノ酸配列をコードする変異体ポリヌクレオチドを、通常の技術を用いて設計し、作製し得る。特定の宿主細胞に対してコドン使用を最適化することは当技術分野でよく知られている。アミラーゼをコードする核酸は、ベクターに組み込むことができる。ベクターは、既知の形質転換技術、例えば、下記に開示される技術などを使用して宿主細胞に導入することができる。
アミラーゼをコードする核酸を含むＤＮＡ構築物は、宿主細胞において発現されるように作成され得る。遺伝子コードの既知の縮重のために、同一のアミノ酸配列をコードする変異体ポリヌクレオチドを、通常の技術を用いて設計し、作製し得る。特定の宿主細胞に対してコドン使用を最適化することは当技術分野でよく知られている。アミラーゼをコードする核酸は、ベクターに組み込むことができる。ベクターは、既知の形質転換技術、例えば、下記に開示される技術などを使用して宿主細胞に導入することができる。
【0060】
ベクターは、宿主細胞へ形質転換され宿主細胞内で複製され得るなら、いかなるベクターであってもよい。例えば、アミラーゼをコードする核酸を含むベクターは、ベクターの増殖及び増幅の手段として細菌宿主細胞内で形質転換及び複製することができる。さらに、コード核酸を機能性アミラーゼとして発現することができるように、ベクターを発現宿主中に形質転換することもできる。発現宿主としての役割を果たす宿主細胞は、例えば糸状菌を含み得る。
【0061】
アミラーゼをコードする核酸は、宿主細胞中で転写を可能にする好適なプロモーターと作動可能に連結することができる。プロモーターは、選択された宿主細胞中で転写活性を示すあらゆるＤＮＡ配列であり得、且つ宿主細胞に対して相同又は異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子由来であり得る。特に細菌宿主において、アミラーゼをコードするＤＮＡ配列の転写を指示する例示的なプロモーターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のラクオペロンのプロモーター、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子ｄａｇＡ若しくはｃｅｌＡプロモーター、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）αアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）αアミラーゼ（ａｍｙＱ）のプロモーター、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子等のプロモーターである。真菌宿主における転写のために、有用なプロモーターの例は、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミーハイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）天然αアミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酸安定性αアミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、リゾムコール・ミーハイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）アルカリ性プロテアーゼ、コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）トリオースホスフェートイソメラーゼ、又はアスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーターである。アミラーゼをコードする遺伝子が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌種において発現される場合、例えば、Ｔ７プロモーター及びファージラムダプロモーターなどのバクテリオファージプロモーターから適切なプロモーターを選択することができる。酵母種中での発現に適切なプロモーターの例として、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧａｌ１及びＧａｌ１０プロモーター並びにピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１又はＡＯＸ２プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。ｃｂｈ１は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）由来の内因性、誘導プロモーターである。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｂｙ ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ｉ ｇｅｎｅ（ｃｂｈ１）ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｓｉｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）４０（２）：１５８－６５を参照されたい。
【0062】
このコード配列は、シグナル配列と作動可能に連結され得る。シグナル配列をコードするＤＮＡは、発現されるべきアミラーゼ遺伝子と天然に関連付けられる、又は様々な属若しくは種に由来するＤＮＡ配列であり得る。ＤＮＡ構築物又はベクターを含むシグナル配列及びプロモーター配列は、真菌宿主細胞に導入され得、且つ同一起源に由来し得る。例えば、シグナル配列は、ｃｂｈ１プロモーターに作動可能に連結されるｃｂｈ１シグナル配列である。
【0063】
発現ベクターはまた、好適な転写ターミネーターと、真核生物中では、変異体アミラーゼをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されているポリアデニル化配列と、を含み得る。終結配列及びポリアデニル化配列は、適切には、プロモーターと同一の供給源に由来し得る。
【0064】
ベクターは、宿主細胞中でのベクターの複製を可能とするＤＮＡ配列をさらに含み得る。このような配列の例は、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１、及びｐＩＪ７０２の複製開始点である。
【0065】
ベクターは、選択可能マーカーも含み得、例えば、産物が単離宿主細胞の欠陥を補う遺伝子も含み得、例えば、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）若しくはＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来するｄａｌ遺伝子、又は抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性、クロラムフェニコール耐性、若しくはテトラサイクリン耐性）を付与する遺伝子も含み得る。さらに、ベクターは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）選択マーカー（例えば、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ及びｘｘｓＣ）、ハイグロマイシン耐性を生じさせるマーカーを含んでもよいし、又は当技術分野で既知の同時形質転換により選択が達成されてもよい。例えば、国際公開第９１／１７２４３号パンフレットを参照されたい。
【0066】
一部の観点からは、例えば、その後の富化若しくは精製のために、大量のアミラーゼを産生するため、宿主細胞として特定の細菌又は真菌を使用した場合に、細胞内発現は有利であり得る。培地中へのアミラーゼの細胞外分泌を用いて、単離されたアミラーゼを含む培養細胞材料を作製することもできる。
【0067】
発現ベクターは、通常、クローニングベクターの成分、例えば、選択宿主生物中でのベクターの自己複製を許容するエレメント、及び選択目的のための表現型により検出可能な１種以上のマーカーなどを含む。発現ベクターは、通常、制御ヌクレオチド配列、例えば、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル及び任意に、リプレッサー遺伝子又は１種若しくは複数種のアクチベーター遺伝子を含む。さらに、発現ベクターは、ペルオキシソームなどの宿主細胞オルガネラ、又は特定の細胞コンパートメントにアミラーゼを標的化することができるアミノ酸配列をコードする配列を含み得る。かかる標的化配列としては、現令されないが、配列ＳＫＬが挙げられる。制御配列の指向下での発現のため、アミラーゼの核酸配列は、発現に関して適切な方法で制御配列に作動可能に連結されている。
【0068】
それぞれ、アミラーゼ、プロモーター、ターミネーター及び他のエレメントをコードするＤＮＡ構築物をライゲートし、且つ複製に必要な情報を含有する適切なベクター内にそれらを挿入するため、用いられる手順は当業者にはよく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９，ａｎｄ ３ｒｄ ｅｄ．，２００１を参照されたい）。
【0069】
宿主細胞の形質転換及び培養
ＤＮＡ構築物又は発現ベクターのいずれかを含む単離細胞は、アミラーゼの組み換え産生における宿主細胞として有利に使用される。この細胞は、この酵素をコードするＤＮＡ構築物で、便宜的にはこのＤＮＡ構築物を宿主の染色体に（１つ又は複数のコピー数で）組み込むことにより形質転換され得る。このＤＮＡ配列は細胞中で安定して維持され易いことから、この組込みは有利であると一般に考えられている。宿主の染色体へのＤＮＡ構築物の組込みを、従来方法に従って実施し得、例えば、相同組み換え又は非相同組み換えにより実施し得る。代替方法としては、細胞は、異なるタイプの宿主細胞と関連した上述の発現ベクターを用いて形質転換させることができる。
ＤＮＡ構築物又は発現ベクターのいずれかを含む単離細胞は、アミラーゼの組み換え産生における宿主細胞として有利に使用される。この細胞は、この酵素をコードするＤＮＡ構築物で、便宜的にはこのＤＮＡ構築物を宿主の染色体に（１つ又は複数のコピー数で）組み込むことにより形質転換され得る。このＤＮＡ配列は細胞中で安定して維持され易いことから、この組込みは有利であると一般に考えられている。宿主の染色体へのＤＮＡ構築物の組込みを、従来方法に従って実施し得、例えば、相同組み換え又は非相同組み換えにより実施し得る。代替方法としては、細胞は、異なるタイプの宿主細胞と関連した上述の発現ベクターを用いて形質転換させることができる。
【0070】
適切な細菌宿主生物の例は、グラム陽性菌種、例えば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、ブレビバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ゲオバチルス（以前はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカリフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ラウタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）及びバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）などのバチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）；ストレプトマイセス・ムリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）などのストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種；ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）などのラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属；；ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）などのラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）；ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属；ペジオコックス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属；及び連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属を含む乳酸細菌種である。その代わりとして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）又はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）に属する、グラム陰性菌種の株を宿主生物として選択することができる。
【0071】
好適な酵母宿主生物は、バイオテクノロジー関連の酵母種から選択され得、この酵母種として下記が挙げられるが、これらに限定されない：酵母種、例えば、ピキア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、ハンゼヌラ種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐ．）、若しくはクリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイニア属（Ｙａｒｒｏｗｉｎｉａ）、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、又はサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、又はシゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する種、例えば、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）種。宿主生物として、メチロトローフ酵母種であるピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の株を使用し得る。或いは、宿主生物はハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）種であり得る。糸状菌中の好適な宿主生物として、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種が挙げられ、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ツビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、又はアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）が挙げられる。或いは、宿主生物として、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）等のフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種の株、又はリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）等のリゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）種の株を使用し得る。他の好適な株として、サーモマイセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）及びムコール属（Ｍｕｃｏｒ）の種が挙げられる。加えて、宿主として、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）を使用し得る。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主細胞を形質転換する適切な手順としては、例えば欧州特許第２３８０２３号明細書に記載の手順が挙げられる。真菌宿主細胞により発現されたアミラーゼはグリコシル化され得、即ちグリコシル部分を含むであろう。グリコシル化パターンは、野生型アミラーゼに存在するものと同一であり得るか、又は異なり得る。グリコシル化のタイプ及び／又は程度により、酵素的特性及び／又は生化学的特性の変化が付与され得る。
【0072】
形質転換された発現ベクターにより遺伝子欠損が治癒され得る発現宿主から遺伝子を欠失させることが有利である。既知の方法を使用して、１種又は複数種の不活性化遺伝子を有する真菌宿主細胞を得ることができる。遺伝子の不活性化は、遺伝子が機能性タンパク質の発現を防止するように、完全若しくは部分欠失によって、挿入不活性化によって又は本来の目的で遺伝子を非機能的にさせる任意の他の手段によって実施することができる。クローニングされている、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）又は他の糸状菌宿主からの任意の遺伝子（例えば、ｃｂｈ１遺伝子、ｃｂｈ２遺伝子、ｅｇｌ１遺伝子、及びｅｇｌ２遺伝子）を欠失させ得る。遺伝子欠失を、当技術分野で既知の方法により、不活性化する所望の遺伝子のある形態をプラスミドに挿入することにより達成させ得る。
【0073】
宿主細胞中へのＤＮＡ構築物又はベクターの導入として、形質転換；電気穿孔；核マイクロインジェクション；形質導入；遺伝子導入、例えば、リポフェクション媒介及びＤＥＡＥ－デキストリン媒介遺伝子導入；リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション；ＤＮＡ被覆マイクロプロジェクティル（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）による高速衝突；並びにプロトプラスト融合等の技術が挙げられる。一般的な形質転換技術は、当技術分野において公知である。例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）を参照されたい。トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）での異種タンパク質の発現は、例えば、米国特許第６，０２２，７２５号明細書で説明されている。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株の形質転換については、Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：９９１－１００１も参照されたい。遺伝子的に安定な形質転換体を、アミラーゼをコードする核酸が宿主細胞の染色体に安定的に組み込まれる、ベクターシステムにより構築し得る。次いで、既知の技術により、形質転換体を選択して精製する。
【0074】
発現
アミラーゼを製造する方法は、この酵素の産生を促す条件下で宿主細胞を培養すること、及びこの細胞及び／又は培養培地からこの酵素を回収することを含み得る。
アミラーゼを製造する方法は、この酵素の産生を促す条件下で宿主細胞を培養すること、及びこの細胞及び／又は培養培地からこの酵素を回収することを含み得る。
【0075】
細胞を培養するために使用される培地は、当該宿主細胞の増殖及びアミラーゼの発現の取得に好適な従来の任意の培地であってよい。好適な培地及び培地成分は、商業的供給業者から入手可能であるか、公開されたレシピ（例えば米国菌株保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のカタログに記載される）に従って調製され得る。
【0076】
宿主細胞から分泌される酵素はブロス調製全体に使用することができる。本発明の方法において、組み換え微生物の使用済み全発酵ブロスの調製は、当技術分野で公知の任意の培養法を使用して達成することができ、アミラーゼが発現される。したがって、発酵は、好適な培地中で、且つ酵素の発現又は単離が可能な条件下における、振盪フラスコ培養、実験室用又は産業用発酵槽内での、小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、流加バッチ若しくは固体発酵を含む）を含むと理解することができる。「使用済み全発酵ブロス」という用語は、本明細書では培養培地、細胞外タンパク質（例えば、酵素）及び細胞バイオマスを含む発酵材料の未分画内容物であると定義されている。「使用済み全発酵ブロス」という用語は、さらに当分野において周知の方法を使用して溶解若しくは透過化されている細胞バイオマスも含むと理解されている。
【0077】
宿主細胞から分泌される酵素は便利なことに、硫酸アンモニウムなどの塩を用いて培地のタンパク質性成分を遠心、若しくは濾過、及び沈殿させ、続いてイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフ手順の使用によって、培地から細胞を分離することなど、既知の手順によって培地から回収され得る。
【0078】
ベクターにおけるアミラーゼをコードするポリヌクレオチドは、ベクターによってコード配列の発現を提供することができる制御配列に作動可能に連結することができ、つまりベクターは発現ベクターである。制御配列によって指示される転写のレベルを転写修飾因子に対してより応答性にするために、制御配列は、例えば更なる転写調節因子を添加することによって修飾され得る。制御配列は特に、プロモーターを含み得る。
【0079】
宿主細胞は、アミラーゼの発現を可能にするのに適した条件下で培養することができる。酵素の発現は、酵素が連続的に生成されるように構成的であってよく、又は発現を開始するためには刺激を必要とする誘導性であってよい。誘導性発現の場合には、タンパク質生成は、必要とされる場合は、例えば培養培地への誘導物質、例えばデキサメタゾン又はＩＰＴＧ又はソホロースの添加によって開始することができる。ポリペプチドはまた、例えばＴＮＴ（商標）（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））ウサギ網状赤血球系などのインビトロの無細胞系内で組み換え技術により産生することができる。
【0080】
アミラーゼを濃縮及び精製する方法
発酵、分離、及び濃縮技術は当技術分野でよく知られており、アミラーゼポリペプチド含有溶液を調製するために、従来の方法を用いることができる。
発酵、分離、及び濃縮技術は当技術分野でよく知られており、アミラーゼポリペプチド含有溶液を調製するために、従来の方法を用いることができる。
【0081】
発酵後に発酵ブロスが得られ、アミラーゼ溶液を得るために、微生物細胞及び残留発酵原料を含む様々な懸濁固体が従来型分離技術によって除去される。濾過、遠心分離、精密濾過、回転真空ドラム濾過、限外濾過、遠心分離後に行われる限外濾過、抽出又はクロマトグラフィーなどが一般に使用される。
【0082】
回収率を最適化するために、アミラーゼポリペプチド含有溶液を濃縮することが望ましい。未濃縮溶液の使用には、典型的には、濃縮又は精製酵素沈殿物を収集するためのインキュベーション時間の増加が必要である。
【0083】
酵素含有溶液は、所望の酵素レベルが得られるまで、従来型の濃縮技術を使用して濃縮される。酵素含有溶液の濃縮は、本明細書で考察した手法のいずれかによって達成し得る。濃縮及び精製の例示的な方法には、回転真空濾過及び／又は限外濾過が含まれるがそれらに限定されない。
【0084】
本発明の好ましい実施形態
本発明の態様に従って、αアミラーゼと、マルトジェニックαアミラーゼ及び／又はグルコアミラーゼとを組み合わせることによって、かかるデンプンタイプに従来から使用される温度よりも低い処理温度で、高いゲル化温度を有する副原料デンプンを効率的に液化し、糖化して、本明細書に記載の、且つ特許請求の範囲に記載の発酵性麦汁を製造することができることを発見した。したがって、内因性モルト酵素なしで、且つ（好ましくは）いわゆるインフュージョン法において事前のゲル化なしに、デンプン供給源の中でもトウモロコシグリスト、トウモロコシデンプン、コメデンプン、モロコシデンプン又はカッサバなどの副原料を処理することができる。かかる副原料デンプンの液化及び糖化には、外因的に供給された酵素組成物によってマッシュを補足することが必要である。これらのデンプン副原料は通常、高い開始ゲル化温度など、高ゲル化温度を特徴とする。意外なことに、酵素の正しい組み合わせによって、前記デンプン材料を高度にデンプン可溶化／液化及び糖化することが可能となり、上昇温度でそのプロセス中に抽出されたデンプンは徐々に、発酵性糖類及びより小さなデキストリンへと加水分解される。好ましくは、最終的なマッシュは、ヨウ素試験に対してデンプンネガティブであり、得られた麦汁において高いエキス濃度値（ｅｘｔｒａｃｔ ｖａｌｕｅ）とも相関する。酵母発酵によってエタノールへと前記糖類を適切に転化するために、ＤＰ４＋デキストリンの画分は好ましくは、可溶性糖類の合計の３０％未満、又はより好ましくは可溶性糖類の合計の２５％未満であるべきである。マッシングは、７０℃以上の温度；好ましくは少なくとも８０℃でのマッシュアウトによって仕上げられる。
本発明の態様に従って、αアミラーゼと、マルトジェニックαアミラーゼ及び／又はグルコアミラーゼとを組み合わせることによって、かかるデンプンタイプに従来から使用される温度よりも低い処理温度で、高いゲル化温度を有する副原料デンプンを効率的に液化し、糖化して、本明細書に記載の、且つ特許請求の範囲に記載の発酵性麦汁を製造することができることを発見した。したがって、内因性モルト酵素なしで、且つ（好ましくは）いわゆるインフュージョン法において事前のゲル化なしに、デンプン供給源の中でもトウモロコシグリスト、トウモロコシデンプン、コメデンプン、モロコシデンプン又はカッサバなどの副原料を処理することができる。かかる副原料デンプンの液化及び糖化には、外因的に供給された酵素組成物によってマッシュを補足することが必要である。これらのデンプン副原料は通常、高い開始ゲル化温度など、高ゲル化温度を特徴とする。意外なことに、酵素の正しい組み合わせによって、前記デンプン材料を高度にデンプン可溶化／液化及び糖化することが可能となり、上昇温度でそのプロセス中に抽出されたデンプンは徐々に、発酵性糖類及びより小さなデキストリンへと加水分解される。好ましくは、最終的なマッシュは、ヨウ素試験に対してデンプンネガティブであり、得られた麦汁において高いエキス濃度値（ｅｘｔｒａｃｔ ｖａｌｕｅ）とも相関する。酵母発酵によってエタノールへと前記糖類を適切に転化するために、ＤＰ４＋デキストリンの画分は好ましくは、可溶性糖類の合計の３０％未満、又はより好ましくは可溶性糖類の合計の２５％未満であるべきである。マッシングは、７０℃以上の温度；好ましくは少なくとも８０℃でのマッシュアウトによって仕上げられる。
【0085】
配列番号１は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ＧｓＡＡ１由来のαアミラーゼ変異体の成熟アミノ酸配列を示す。
【0086】
配列番号２は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ＧｓＡＡ２由来のマルトジェニックαアミラーゼの成熟アミノ酸配列を示す。
【0087】
配列番号３は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来のグルコアミラーゼの成熟アミノ酸配列を示す。
【0088】
【表2】
【0089】
本発明の態様に従って、以下の工程：ａ．）副原料を含むグリストを提供する工程；及びｂ．）αアミラーゼと、マルトジェニックαアミラーゼ及び／又はグルコアミラーゼとをグリストと接触させて、麦汁を製造する工程；を有する、１００％副原料醸造のマッシング方法が示される。
【0090】
好ましくは、αアミラーゼは、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有する。より好ましくは、αアミラーゼは、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有する。またより好ましくは、αアミラーゼは、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有する。より好ましい態様において、αアミラーゼは、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有する。最も好ましい態様において、αアミラーゼは、配列番号１による配列を有する酵素である。
【0091】
好ましくは、マルトジェニックαアミラーゼは、配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する。より好ましくは、マルトジェニックαアミラーゼは、配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有する。またより好ましくは、マルトジェニックαアミラーゼは、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する。より好ましい態様において、マルトジェニックαアミラーゼは、配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を有する。最も好ましい態様において、マルトジェニックαアミラーゼは、配列番号２による配列を有する酵素である。
【0092】
好ましくは、グルコアミラーゼは、配列番号３と少なくとも７０％の配列同一性を有する。より好ましくは、グルコアミラーゼは、配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有する。またより好ましくは、グルコアミラーゼは、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する。より好ましい態様において、グルコアミラーゼは、配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性を有する。最も好ましい態様において、グルコアミラーゼは、配列番号３による配列を有する酵素である。
【0093】
本発明の好ましい態様において、αアミラーゼ及びマルトジェニックαアミラーゼとグリストを接触させる。好ましくは、αアミラーゼは、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、且つマルトジェニックαアミラーゼは、配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を有する。より好ましくは、αアミラーゼは、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有し、且つマルトジェニックαアミラーゼは、配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有する。またより好ましくは、αアミラーゼは、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有し、且つマルトジェニックαアミラーゼは、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する。より好ましい態様において、αアミラーゼは、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つマルトジェニックαアミラーゼは、配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を有する。最も好ましい態様において、αアミラーゼは、配列番号１による配列を有する酵素であり、且つマルトジェニックαアミラーゼは、配列番号２による配列を有する酵素である。
【0094】
本発明の他の好ましい実施形態において、αアミラーゼ及びグルコアミラーゼとグリストを接触させる。好ましくは、αアミラーゼは、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、且つグルコアミラーゼは、配列番号３と少なくとも７０％の配列同一性を有する。より好ましくは、αアミラーゼは、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有し、且つグルコアミラーゼは、配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有する。またより好ましくは、αアミラーゼは、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有し、且つグルコアミラーゼは、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する。より好ましい態様において、αアミラーゼは、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つグルコアミラーゼは、配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性を有する。最も好ましい態様において、αアミラーゼは、配列番号１による配列を有する酵素であり、且つグルコアミラーゼは、配列番号３による配列を有する酵素である。
【0095】
好ましくは、グリストは、トウモロコシ、コメ、モロコシ及びカッサバ、又はその混合物からなる群から選択される。より好ましくは、グリストは少なくとも１０％のモロコシである。より好ましくは、グリストは少なくとも２５％のモロコシである。またより好ましくは、グリストは少なくとも５０％のモロコシである。より好ましい実施形態において、グリストは少なくとも７５％のモロコシである。最も好ましい実施形態において、グリストは１００％モロコシである。
【0096】
他の好ましい実施形態において、グリストは少なくとも１０％のトウモロコシである。より好ましくは、グリストは少なくとも２５％のトウモロコシである。またより好ましくは、グリストは少なくとも５０％のトウモロコシである。より好ましい実施形態において、グリストは少なくとも７５％のトウモロコシである。最も好ましい実施形態において、グリストは１００％トウモロコシである。
【0097】
他の好ましい実施形態において、グリストは少なくとも１０％のコメである。より好ましくは、グリストは少なくとも２５％のコメである。またより好ましくは、グリストは少なくとも５０％のコメである。より好ましい実施形態において、グリストは少なくとも７５％のコメである。最も好ましい実施形態において、グリストは１００％コメである。
【0098】
他の好ましい実施形態において、グリストは少なくとも１０％のカッサバである。より好ましくは、グリストは少なくとも２５％のカッサバである。またより好ましくは、グリストは少なくとも５０％のカッサバである。より好ましい実施形態において、グリストは少なくとも７５％のカッサバである。最も好ましい実施形態において、グリストは１００％カッサバである。
【0099】
好ましくは、麦汁はビールに転化される。
【0100】
本発明の一態様において、醸造におけるαアミラーゼと、マルトジェニックαアミラーゼ及び／又はグルコアミラーゼとの使用が提供される。
【0101】
本発明の他の態様において、αアミラーゼ及びマルトジェニックαアミラーゼを有する酵素組成物が提供される。
【0102】
本発明のさらに他の態様において、αアミラーゼ及びグルコアミラーゼを有する酵素組成物が提供される。
【0103】
以下の実施例は、請求の範囲に記載の開示を説明するために提示されたものであって、その開示を限定するものではない。
［実施例］
［実施例］
【実施例1】
【0104】
－酵素
ＧｓＡＡ１：配列番号１に示すアミノ酸配列を有する、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のαアミラーゼ変異体
ＧｓＡＡ２：配列番号２に示すアミノ酸配列を有する、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のマルトジェニックαアミラーゼ
ＴｒＧＡ：配列番号３に示すアミノ酸配列を有する、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来のグルコアミラーゼ
ＧｓＡＡ１：配列番号１に示すアミノ酸配列を有する、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のαアミラーゼ変異体
ＧｓＡＡ２：配列番号２に示すアミノ酸配列を有する、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のマルトジェニックαアミラーゼ
ＴｒＧＡ：配列番号３に示すアミノ酸配列を有する、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来のグルコアミラーゼ
【0105】
αアミラーゼの一例として、デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）社からのＡＭＹＬＥＸ（登録商標）５Ｔ（Ａ ５Ｔ）を使用した。マルトジェニックαアミラーゼの一例として、デュポン社からのＤＩＡＺＹＭＥ（登録商標）ＭＡ（Ｄ ＭＡ）を使用した。グルコ－アミラーゼの一例として、デュポン社からのＤＩＡＺＹＭＥ（登録商標）ＴＧＡ（Ｄ ＴＧＡ）を使用した。
【実施例2】
【0106】
－タンパク質の決定法
Ｓｔａｉｎ Ｆｒｅｅ Ｉｍａｇｅｒ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎによるタンパク質の決定
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル及びＧｅｌ Ｄｏｃ（商標）ＥＺイメージングシステムを用いた濃度測定により、タンパク質を定量した。この分析で使用した試薬：濃縮（２×）Ｌａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１６１－０７３７）；２６－ウェルＸＴ４－１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号３４５－０１２５）；タンパク質マーカー「Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ」（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１６１－０３６３）；タンパク質標準ＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２３２０８）及びＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ Ｓａｆｅｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＬＣ ６０６０。分析は以下のように行った：９６ウェルＰＣＲプレート中で、５０μＬの希釈酵素試料を、２．７ｍｇのＤＴＴを含有する５０μＬの試料バッファと混合した。プレートをＢｉｏ－Ｒａｄ製のＭｉｃｒｏｓｅａｌ「Ｂ」Ｆｉｌｍで密封し、ＰＣＲ装置に入れ、７０°Ｃまで１０分間加熱した。その後、容器をランニングバッファで満たし、ゲルカセットをセットした。次いで、１０μＬの各試料及び標準（０．１２５～１．００ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）をゲル上に置き、５μＬのマーカーを加えた。その後、２００Ｖで４５分間電気泳動を行った。電気泳動に続き、ゲルを水で３回、５分間濯ぎ、その後、Ｓａｆｅｓｔａｉｎ中で終夜染色し、最後に水で脱染した。その後、ゲルをＩｍａｇｅｒに移した。各バンドの強度計算にＩｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェアを使用した。ＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号２３２０８）を使用して、較正曲線を作成した。標的タンパク質の量をバンド強度と較正曲線によって決定した。タンパク質定量化法を用いて、その後の実施例に使用される酵素試料を調製した。
Ｓｔａｉｎ Ｆｒｅｅ Ｉｍａｇｅｒ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎによるタンパク質の決定
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル及びＧｅｌ Ｄｏｃ（商標）ＥＺイメージングシステムを用いた濃度測定により、タンパク質を定量した。この分析で使用した試薬：濃縮（２×）Ｌａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１６１－０７３７）；２６－ウェルＸＴ４－１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号３４５－０１２５）；タンパク質マーカー「Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ」（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１６１－０３６３）；タンパク質標準ＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２３２０８）及びＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ Ｓａｆｅｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＬＣ ６０６０。分析は以下のように行った：９６ウェルＰＣＲプレート中で、５０μＬの希釈酵素試料を、２．７ｍｇのＤＴＴを含有する５０μＬの試料バッファと混合した。プレートをＢｉｏ－Ｒａｄ製のＭｉｃｒｏｓｅａｌ「Ｂ」Ｆｉｌｍで密封し、ＰＣＲ装置に入れ、７０°Ｃまで１０分間加熱した。その後、容器をランニングバッファで満たし、ゲルカセットをセットした。次いで、１０μＬの各試料及び標準（０．１２５～１．００ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）をゲル上に置き、５μＬのマーカーを加えた。その後、２００Ｖで４５分間電気泳動を行った。電気泳動に続き、ゲルを水で３回、５分間濯ぎ、その後、Ｓａｆｅｓｔａｉｎ中で終夜染色し、最後に水で脱染した。その後、ゲルをＩｍａｇｅｒに移した。各バンドの強度計算にＩｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェアを使用した。ＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号２３２０８）を使用して、較正曲線を作成した。標的タンパク質の量をバンド強度と較正曲線によって決定した。タンパク質定量化法を用いて、その後の実施例に使用される酵素試料を調製した。
【実施例3】
【0107】
－ＨＰＬＣによる糖類分析
すべての標準物質：グルコース、マルトース、マルトトリオース及びマルトテトラオースを再蒸留水（ｄｄＨ２０）中で調製し、０．４５μｍシリンジフィルターを通して濾過した。各標準物質のセットを１０～１００，０００ｐｐｍの濃度範囲で調製した。
すべての標準物質：グルコース、マルトース、マルトトリオース及びマルトテトラオースを再蒸留水（ｄｄＨ２０）中で調製し、０．４５μｍシリンジフィルターを通して濾過した。各標準物質のセットを１０～１００，０００ｐｐｍの濃度範囲で調製した。
【0108】
試料を１０分間９５℃に加熱することによって、活性酵素を含有するすべての麦汁試料を不活性化した。続いて、麦汁試料を９６ウェルＭＴＰプレート（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）社，ＮＹ，ＵＳＡ）に調製し、ｄｄＨ２０中で最小限４倍に希釈し、分析前に０．２０μｍ ９６ウェルプレートフィルター（コーニングフィルタープレート，ＰＶＤＦ 親水性膜，ＮＹ，ＵＳＡ）を通して濾過した。すべての試料を二重反復で分析した。
【0109】
計器による計測
糖類：ＤＰ１、ＤＰ２、ＤＰ３、ＤＰ４及びＤＰ５＋の定量化をＵＰＬＣによって実施した。試料の分析を、ＤＧＰ－３６００ＳＤ Ｄｕａｌ－Ｇｒａｄｉｅｎｔ分析用ポンプ、ＷＰＳ－３０００ＴＳＬサーモスタットオートサンプラ、ＴＣＣ－３０００ＳＤサーモスタットカラムオーブン及びＲＩ－１０１屈折率検出器（Ｓｈｏｄｅｘ、ＪＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を備えたＤｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実行した。データの取得及び分析にＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎデータシステムソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．８０、ＤＵ１０Ａ Ｂｕｉｌｄ ２８２６、１７１９４８）を使用した。
糖類：ＤＰ１、ＤＰ２、ＤＰ３、ＤＰ４及びＤＰ５＋の定量化をＵＰＬＣによって実施した。試料の分析を、ＤＧＰ－３６００ＳＤ Ｄｕａｌ－Ｇｒａｄｉｅｎｔ分析用ポンプ、ＷＰＳ－３０００ＴＳＬサーモスタットオートサンプラ、ＴＣＣ－３０００ＳＤサーモスタットカラムオーブン及びＲＩ－１０１屈折率検出器（Ｓｈｏｄｅｘ、ＪＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を備えたＤｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実行した。データの取得及び分析にＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎデータシステムソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．８０、ＤＵ１０Ａ Ｂｕｉｌｄ ２８２６、１７１９４８）を使用した。
【0110】
クロマトグラフ条件
７０℃で操作される、分析ガードカラム（Ｃａｒｂｏ－Ａｇ＋中性，ＡＪ０－４４９１，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，オランダ）を備えた、Ａｇ＋ ４％架橋された（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，オランダ）ＲＳＯオリゴ糖カラムを使用して、試料を分析した。カラムを流量０．３ｍｌ／分にて再蒸留水（０．４５μｍの再生セルロース膜を通して濾過され、ヘリウムガスでパージされた）で溶離した。総実行時間が４５分である分析の間中、０．３ｍｌ／分のアイソクラチックフロー（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｆｌｏｗ）を維持し、注入量を１０μＬに設定した。恒温自動サンプラー区画内で２０℃にて試料を維持した。屈折率検出器（ＲＩ－１０１，Ｓｈｏｄｅｘ，ＪＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して溶離液をモニターし、所定の標準物質のピーク面積に対するピーク面積によって定量化を行った（ＤＰ１：グルコース；ＤＰ２：マルトース；ＤＰ３：マルトトリオース及び４以上のマルトテトラオースのピークを標準として使用した）。
７０℃で操作される、分析ガードカラム（Ｃａｒｂｏ－Ａｇ＋中性，ＡＪ０－４４９１，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，オランダ）を備えた、Ａｇ＋ ４％架橋された（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，オランダ）ＲＳＯオリゴ糖カラムを使用して、試料を分析した。カラムを流量０．３ｍｌ／分にて再蒸留水（０．４５μｍの再生セルロース膜を通して濾過され、ヘリウムガスでパージされた）で溶離した。総実行時間が４５分である分析の間中、０．３ｍｌ／分のアイソクラチックフロー（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｆｌｏｗ）を維持し、注入量を１０μＬに設定した。恒温自動サンプラー区画内で２０℃にて試料を維持した。屈折率検出器（ＲＩ－１０１，Ｓｈｏｄｅｘ，ＪＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して溶離液をモニターし、所定の標準物質のピーク面積に対するピーク面積によって定量化を行った（ＤＰ１：グルコース；ＤＰ２：マルトース；ＤＰ３：マルトトリオース及び４以上のマルトテトラオースのピークを標準として使用した）。
【実施例4】
【0111】
－抽出及び発酵性糖類を可能にする酵素を使用した、トウモロコシ、コメ、モロコシ及びカッサバでの低温インフュージョン・マッシング
この実施例の目的は、発酵性糖類を遊離するための酵素のうちの１つのみと比較して、インフュージョンプロセス（単一容器）における副原料の処理中に存在する２種類の酵素（マルトジェニックαアミラーゼ又はグルコアミラーゼ及びαアミラーゼ）を有する利点（放出された発酵性糖及びエキストラクト）を実証することであった。
この実施例の目的は、発酵性糖類を遊離するための酵素のうちの１つのみと比較して、インフュージョンプロセス（単一容器）における副原料の処理中に存在する２種類の酵素（マルトジェニックαアミラーゼ又はグルコアミラーゼ及びαアミラーゼ）を有する利点（放出された発酵性糖及びエキストラクト）を実証することであった。
【0112】
トウモロコシグリスト（Ｎｏｒｄｇｅｔｒｅｉｄｅ ＧｍＢＨ Ｌｕｅｂｅｃ，ドイツ）、コメグリスト（Ｃａｍｂｏｄｉａ．ＭＥＫＯＮＧ Ａｓｉａｎ Ｍａｒｋｅｔ，Ｄａｇｒｏｆａ Ｂｒａｂｒａｎｄ）、モロコシ（モロコシ、白色、未粉砕－Ｄｉａｇｅｏ，アイルランド）及びカッサバ粉（ウガンダ）及び固定水：グリスト比４：１を用いて、マッシング操作モデルシステムにおいて麦汁生成について酵素を試験した。Ｂｕｈｌｅｒ Ｍｉａｇ モルトミル０．５ｍｍ設定にてコメグリストを粉砕し、モロコシを設定１．６ｍｍにて粉砕した。
【0113】
麦汁生成のためのマッシング操作
６４℃の水道水１２．０ｇで予めインキュベートされたウィートン（ｗｈｅａｔｏｎ）カップ（キャップを有するガラス容器）内でトウモロコシグリスト（３．０ｇ）、コメグリスト（粉砕３．０ｇ）、モロコシ（３．０ｇ）又はカッサバ粉（３．０ｇ）を混合し、２．５Ｍ硫酸でｐＨ５．４にｐＨ調整した。実施例２に従って決定されたタンパク質ｍｇ（合計０．５ｍＬ）に基づいて酵素を添加し、酵素なしのコントロールとして水を添加した。ＧｓＡＡ１、ＧｓＡＡ２及びＴｒＧＡの添加に加えて、固定濃度の０．５ｍｇ／ｇグリストＬａｍｉｎｅｘ（登録商標）７５０（デュポン社）を使用し、濾過性（Ｂ－グルカナーゼ）（発酵性糖類の放出にこれは影響しない）を確実にした。電磁攪拌を備えたドライバス（Ｄｒｙｂａｔｈ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｔｅｍ ｓｔａｔｉｏｎ）にウィートンカップを入れ、以下のマッシングプログラムを適用した：試料を６４℃で６０分間維持し；８０℃で１０分間加熱し；最後に８０℃で５５分間維持してマッシュアウトした。１５ｍｌ試料をファルコンチューブに移し、Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ Ｘ３Ｒにおいて４５００ｒｐｍにて１０℃で２０分間遠心することによって使用済み穀物を麦汁から分離した。手持ち式Ｐｌａｔｏ屈折計（ＰＡＬ－ＰＬＡＴＯ、愛宕（Ａｔａｇｏ），東京）によって、抽出物を測定した。すべての試料をＨ２Ｏで１０倍に希釈し、水浴中で２０分間煮沸して酵素を不活性化した。ＨＰＬＣ糖分析のために、実施例３に記載のように上清を回収し、濾過した（０．２μｍ）。
６４℃の水道水１２．０ｇで予めインキュベートされたウィートン（ｗｈｅａｔｏｎ）カップ（キャップを有するガラス容器）内でトウモロコシグリスト（３．０ｇ）、コメグリスト（粉砕３．０ｇ）、モロコシ（３．０ｇ）又はカッサバ粉（３．０ｇ）を混合し、２．５Ｍ硫酸でｐＨ５．４にｐＨ調整した。実施例２に従って決定されたタンパク質ｍｇ（合計０．５ｍＬ）に基づいて酵素を添加し、酵素なしのコントロールとして水を添加した。ＧｓＡＡ１、ＧｓＡＡ２及びＴｒＧＡの添加に加えて、固定濃度の０．５ｍｇ／ｇグリストＬａｍｉｎｅｘ（登録商標）７５０（デュポン社）を使用し、濾過性（Ｂ－グルカナーゼ）（発酵性糖類の放出にこれは影響しない）を確実にした。電磁攪拌を備えたドライバス（Ｄｒｙｂａｔｈ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｔｅｍ ｓｔａｔｉｏｎ）にウィートンカップを入れ、以下のマッシングプログラムを適用した：試料を６４℃で６０分間維持し；８０℃で１０分間加熱し；最後に８０℃で５５分間維持してマッシュアウトした。１５ｍｌ試料をファルコンチューブに移し、Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ Ｘ３Ｒにおいて４５００ｒｐｍにて１０℃で２０分間遠心することによって使用済み穀物を麦汁から分離した。手持ち式Ｐｌａｔｏ屈折計（ＰＡＬ－ＰＬＡＴＯ、愛宕（Ａｔａｇｏ），東京）によって、抽出物を測定した。すべての試料をＨ２Ｏで１０倍に希釈し、水浴中で２０分間煮沸して酵素を不活性化した。ＨＰＬＣ糖分析のために、実施例３に記載のように上清を回収し、濾過した（０．２μｍ）。
【0114】
トウモロコシ、コメ、モロコシ及びカッサバを用いた結果をそれぞれ、表１～４に示す。副原料タイプが処理可能ではなかった（ｎ．ｐ．）又はマルトジェニックαアミラーゼ若しくはグルコアミラーゼを単独で使用した場合に有意に低いにもかかわらず、エンド型αアミラーゼの添加は、酵素が使用されない場合と比較して、麦汁のエキス濃度を増加することが確認された。麦汁に残った非発酵性糖類の量は、所定の順序でＴｒＧＡ、ＧｓＡＡ２及びＧｓＡＡ１を添加することによって、この実施例において低減された。したがって、非発酵性糖類（ＤＰ４＋）における最大の減少が、ＧｓＡＡ２及びＴｒＧＡによって得られ、一部の副原料については、ＧｓＡＡ１と共に個々に、これらの相乗効果が見られた。結論として、高いエキス濃度（＞１５°Ｐ）及び高度の発酵性糖類（＜３０％ ＤＰ４＋）を有するインフュージョン麦汁が、原料タイプ（トウモロコシ、コメ、モロコシ及びカッサバ）とは無関係に、エンド型αアミラーゼ（ＧｓＡＡ１）とマルトジェニックαアミラーゼ（ＧｓＡＡ２）、又はエンド型αアミラーゼ（ＧｓＡＡ１）とグルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ）の添加により生成された。
【0115】
原料（５０％モロコシ及び５０％トウモロコシ；５０％モロコシ及び５０％コメ；５０％コメ及び５０％トウモロコシ）のブレンドを使用した結果を表６に示す。高いエキス濃度（＞１５°Ｐ）及び高度の発酵性糖類（＜３０％ ＤＰ４＋）の達成に関して、インフュージョン・マッシングにおける個々の原料からの麦汁の生成と比較して、酵素の同様な効果が確認された。
【0116】
【表3】
【0117】
【表4】
【0118】
【表5】
【0119】
【表6】
【0120】
【表7】
【実施例5】
【0121】
－麦汁生成のためのαアミラーゼ、マルトジェニックαアミラーゼ及びグルコアミラーゼの適用
麦汁生成のための、濾過を用いた実験室規模のインフュージョン・マッシング操作
１００％ひきわりトウモロコシ（Ｎｏｒｄｇｅｔｒｅｉｄｅ ＧｍＢＨ Ｌｕｅｂｅｃ，ドイツ，Ｂａｔｃｈ：０１．１１．２０１６．）でのマッシング操作において、水：グリスト比３．８：１を用いて、αアミラーゼ、マルトジェニックαアミラーゼ及びグルコアミラーゼを試験した。
麦汁生成のための、濾過を用いた実験室規模のインフュージョン・マッシング操作
１００％ひきわりトウモロコシ（Ｎｏｒｄｇｅｔｒｅｉｄｅ ＧｍＢＨ Ｌｕｅｂｅｃ，ドイツ，Ｂａｔｃｈ：０１．１１．２０１６．）でのマッシング操作において、水：グリスト比３．８：１を用いて、αアミラーゼ、マルトジェニックαアミラーゼ及びグルコアミラーゼを試験した。
【0122】
トウモロコシ副原料を以下の方法で処理した：ひきわりトウモロコシ（７０．０ｇ）及び水道水（２６３ｇ）をマッシング浴（Ｌｏｃｋｎｅｒ，ＬＧ－ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）カップ内に入れ、ｐＨを２．５Ｍ 硫酸でｐＨ５．４に調整した。トウモロコシ副原料を以下のプログラムを用いてマッシングした；６３℃に加熱し、酵素を適用し；マッシングのために６３℃で７６分間維持し、糖化し；２℃／分で温度を上昇させることによって、８０℃まで８．５分間加熱し；８０℃で３５．５分間維持し、マッシュアウトした。
【0123】
マッシングの最後に、水道水でマッシュを３５０ｇにし、内容物を麦汁と使用済みトウモロコシに分離した。分離して３０分後に麦汁の体積を測定し、ＤＰ１、ＤＰ２、ＤＰ３及びＤＰ４＋のパーセンテージとして測定された様々な可溶化糖タイプの抽出及び分布について分析した。
【0124】
１つのαアミラーゼ（ＡＡ）、１つのマルトジェニックαアミラーゼ（ＭＡ）及び１つのグルコアミラーゼ（ＧＡ）を試験した。αアミラーゼの一例として、デュポン社からのＡＭＹＬＥＸ（登録商標）５Ｔ（Ａ ５Ｔ）を使用した。マルトジェニックαアミラーゼの一例として、デュポン社からのＤＩＡＺＹＭＥ（登録商標）ＭＡ（Ｄ ＭＡ）を使用した。グルコアミラーゼの一例として、デュポン社からのＤＩＡＺＹＭＥ（登録商標）ＴＧＡ（Ｄ ＴＧＡ）を使用した。以下の用量及び組み合わせを試験した：表６に示すように、酵素なし；ＡＭＹＬＥＸ（登録商標）５Ｔ（２．５ｋｇ／ｔ トウモロコシ）；ＤＩＡＺＹＭＥ（登録商標）ＭＡ（１．５ｋｇ／ｔ トウモロコシ）；ＡＭＹＬＥＸ（登録商標）５Ｔ（２．５ｋｇ／ｔ トウモロコシ）及びＤＩＡＺＹＭＥ（登録商標）ＭＡ（１．５ｋｇ／ｔ トウモロコシ）；ＤＩＡＺＹＭＥ（登録商標）ＴＧＡ（３．０ｋｇ／ｔ トウモロコシ）；ＡＭＹＬＥＸ（登録商標）５Ｔ（２．５ｋｇ／ｔ トウモロコシ）及びＤＩＡＺＹＭＥ（登録商標）ＴＧＡ（３．０ｋｇ／ｔ トウモロコシ）。
【0125】
【表8】
【0126】
麦汁の分析：Ｄｕｐｏｎｔ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｂｒｅｗｉｎｇ，２３．８５８０－Ｂ１１に従って、マッシュ分離から３０分後に、それぞれの試料の麦汁体積を測定した。要するに、２５０ｍｌメスシリンダーグラスの上に置かれた、濾紙（ＶＷＲ，Ｅｕｒｏｐｅａｎカタログ番号５１６－０３１０，サイズ３２０ｍｍ，折り畳み定性的濾紙，３０７醸造等級（Ｂｒｅｗｅｒｙ ｇｒａｄｅ），中程度の濾過速度）を備えたプラスチック漏斗を通して試料を濾過し、時間を記録した。３０分後、フィルターを通してメスシリンダー内へ入った液体の量（濾液）を測定した。Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ（Ｌｏｖｉｓ）を使用して、Ｄｕｐｏｎｔ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｂｒｅｗｉｎｇ，２３．８５８０－Ｂ２８（ＥＢＣ ８．３ Ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ｗｏｒｔに基づく）に従って、原麦汁濃度（ＯＥ）、マッシング後の麦汁試料中のエキス濃度を測定した。ＨＰＬＣによる発酵性糖類（全体％＋ｇ／１００ｍＬ）はＤＰ１、ＤＰ２、ＤＰ３及びＤＰ４＋であり、Ｄｕｐｏｎｔ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｂｒｅｗｉｎｇ，２３．８５８０－Ｂ２０（ＥＢＣ ８．７ Ｆｅｒｍｅｎｔａｂｌｅ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｉｎ Ｗｏｒｔ ｂｙ ＨＰＬＣ（ＩＭ）に基づく）に従って、マッシング後に決定した。
【0127】
以下の：単独で又は組み合わせて異なる酵素を適用することによる、麦汁体積、エキス濃度、及びマッシング中に放出されたＤＰ１～ＤＰ３の合計％として表される発酵性糖類の程度を表７に示す。
【0128】
【表9】
【0129】
達成された麦汁の量から（表７）分かるように、外来性酵素を全く適用しなかった場合にも、又はグルコアミラーゼのみを適用した場合にも、所定のマッシングプロトコルを用いて１００％トウモロコシを処理することは不可能であった。許容可能な量の麦汁及びエキス濃度を達成するために、マッシング中にαアミラーゼが必要であった。しかしながら、αアミラーゼ（エンド型）のみ適用した場合には、ＤＰ１～ＤＰ３の合計によって表される発酵性糖類タイプの相対濃度は、いずれのビールスタイルに対しても許容可能な希釈には低すぎた。ＤＰ１～ＤＰ３（発酵性糖類）の高パーセンテージを達成するために、マルトジェニックαアミラーゼ又はグルコアミラーゼ酵素のいずれかとαアミラーゼを組み合わせる必要があった。
【実施例6】
【0130】
－実施例５からの麦汁の実験室規模の発酵性
希釈された試料に対する発酵操作
発酵に十分な量の麦汁を提供した実施例７に記載のように、生成された麦汁試料（＞１００ｍＬ）を２．５Ｍ硫酸でｐＨ５．２に調整し、Ｈｏｐｆｅｎｖｅｒｅｄｌｕｎｇ，Ｓｔ．Ｊｏｈａｎｎから入手したビターホップのペレット：α含有率１６，０％（ＥＢＣ ７．７ ０特異的ＨＰＬＣ分析，０１．１０．２０１３）を各フラスコに添加した（合計２１０ｇ）。麦汁試料を煮沸浴で６０分間煮沸し、麦汁を１７℃に冷却し、濾過した。各麦汁１００ｇを発酵用の５００ｍＬ三角フラスコに計量し、１７℃の麦汁に新たに生成された酵母（０．５０ｇ）０．５％ Ｗ３４／７０（Ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ）を添加した。酵母を添加した後に、麦汁試料を１８℃及び１５０ｒｐｍにて発酵させた。発酵が完了した時に分析を実施した。
希釈された試料に対する発酵操作
発酵に十分な量の麦汁を提供した実施例７に記載のように、生成された麦汁試料（＞１００ｍＬ）を２．５Ｍ硫酸でｐＨ５．２に調整し、Ｈｏｐｆｅｎｖｅｒｅｄｌｕｎｇ，Ｓｔ．Ｊｏｈａｎｎから入手したビターホップのペレット：α含有率１６，０％（ＥＢＣ ７．７ ０特異的ＨＰＬＣ分析，０１．１０．２０１３）を各フラスコに添加した（合計２１０ｇ）。麦汁試料を煮沸浴で６０分間煮沸し、麦汁を１７℃に冷却し、濾過した。各麦汁１００ｇを発酵用の５００ｍＬ三角フラスコに計量し、１７℃の麦汁に新たに生成された酵母（０．５０ｇ）０．５％ Ｗ３４／７０（Ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ）を添加した。酵母を添加した後に、麦汁試料を１８℃及び１５０ｒｐｍにて発酵させた。発酵が完了した時に分析を実施した。
【0131】
ビールの分析：Ｄｕｐｏｎｔ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｂｒｅｗｉｎｇ，２３．８５８０－Ｂ２８（ＥＢＣ ８．３ Ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ｗｏｒｔに基づく）に従ってＡｎｔｏｎ Ｐａａｒ（ＤＭＡ ５０００）を使用してＲＤＦを測定し、且つＤｕｐｏｎｔ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｂｒｅｗｉｎｇ，２３．８５８０－Ｂ２８（ＥＢＣ ８．３ Ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ｗｏｒｔに基づく）によってアルコールを測定した。
【0132】
真正発酵度（ＲＤＦ）は、下記式により算出することができる：
式中、ＲＥ＝真正エキス濃度＝（０．１８０８×ｏＰｉｎｉｔｉａｌ）＋（０．８１９２×ｏＰｆｉｎａｌ）であり、ｏＰｉｎｉｔｉａｌは発酵前の標準化麦汁の比重であり、ｏＰｆｉｎａｌはプラート度で表した発酵麦汁の比重である。
【数1】
【0133】
本発明の文脈において、真正発酵度（ＲＤＦ）は比重とアルコール濃度とから決定した。
【0134】
Ｂｅｅｒ Ａｌｃｏｌｙｚｅｒ Ｐｌｕｓ及びＤＭＡ ５０００比重計（両方ともＡｎｔｏｎ Ｐａａｒ、Ｇｒａｔｚ、Ａｕｓｔｒｉａより入手）を使用し、発酵試料について比重及びアルコール濃度を決定した。これらの測定に基づき、下記式より真正発酵度（ＲＤＦ）を算出した：
式中、Ｅ（ｒ）はプラート度（°Ｐ）で表した真正エキス濃度であり、ＯＥは°Ｐを単位とする原麦汁濃度である。
【数2】
【0135】
Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ（ＤＭＡ ５０００）を使用して、Ｄｕｐｏｎｔ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｂｒｅｗｉｎｇ，２３．８５８０－Ｂ２８（ＥＢＣ ８．３ Ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ｗｏｒｔに基づく）に従って、マッシング後のビール試料中の原麦汁濃度（ＯＥ）を測定した。Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ（ＤＭＡ ５０００）を使用して、Ｄｕｐｏｎｔ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｂｒｅｗｉｎｇ，２３．８５８０－Ｂ２８（ＥＢＣ ８．３ Ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ｗｏｒｔに基づく）に従って、アルコール体積濃度（％Ｖ／Ｖ）、達成されたアルコール度数（ＡＢＶ）を測定した。
【0136】
マッシング中にαアミラーゼを単独で、又はマルトジェニックαアミラーゼ若しくはグルコアミラーゼと組み合わせて適用した麦汁発酵後の以下の真正発酵度（ＲＤＦ）を表８に示す。
【0137】
【表10】
【0138】
得られたＲＤＦ値は、適用された麦汁中の糖組成の分析と一致し、したがって、麦汁中のＤＰ１～ＤＰ３（発酵性）糖の含有率が相対的に高くなることによって、発酵のＲＤＦ値％が高くなる。αアミラーゼとグルコアミラーゼ、又はαアミラーゼとマルトジェニックαアミラーゼの組み合わせは、αアミラーゼのみ適用した場合と比較して増加したＲＤＦ値を示した。したがって、αアミラーゼは、一部のビールスタイルに関して十分な希釈を達成するために、マルトジェニックαアミラーゼ又はグルコアミラーゼのいずれかと組み合わせることが必要であった。
【実施例7】
【0139】
－麦汁生成のための、αアミラーゼ、マルトジェニックαアミラーゼ及びグルコアミラーゼの組み合わせの適用
麦汁生成のためのマッシング操作
１００％ひきわりトウモロコシ（Ｎｏｒｄｇｅｔｒｅｉｄｅ ＧｍＢＨ Ｌｕｅｂｅｃ，ドイツ，Ｂａｔｃｈ：０１．１１．２０１６）でのマッシング操作において、水：グリスト比３．８：１を用いて、αアミラーゼ、マルトジェニックαアミラーゼ及びグルコアミラーゼをすべて試験した。
麦汁生成のためのマッシング操作
１００％ひきわりトウモロコシ（Ｎｏｒｄｇｅｔｒｅｉｄｅ ＧｍＢＨ Ｌｕｅｂｅｃ，ドイツ，Ｂａｔｃｈ：０１．１１．２０１６）でのマッシング操作において、水：グリスト比３．８：１を用いて、αアミラーゼ、マルトジェニックαアミラーゼ及びグルコアミラーゼをすべて試験した。
【0140】
トウモロコシ副原料を以下の方法で処理した：ひきわりトウモロコシ（７０．０ｇ）及び水道水（２６３ｇ）をマッシング浴（Ｌｏｃｋｎｅｒ，ＬＧ－ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）カップ内に入れ、ｐＨを２．５Ｍ硫酸でｐＨ５．４に調整した。トウモロコシ副原料を以下のプログラムを用いてマッシングした；６３℃に加熱し、酵素を適用し；マッシュインのために６３℃で６０分間維持し、糖化し；１．５℃／分で温度を上昇させることによって、７５℃まで８分間加熱し；７５℃で２０分間維持し、１．５℃／分で温度を上昇させて８０℃まで３分間加熱し；８０℃で２０分間維持し、次いでマッシュアウトした。
【0141】
マッシングの最後に、水道水でマッシュを３５０ｇにし、内容物を麦汁と使用済みトウモロコシに分離した。３０分間分離した後に麦汁の体積を測定し、ＤＰ１、ＤＰ２、ＤＰ３及びＤＰ４＋のパーセンテージとして測定された様々な可溶化糖タイプのエキス濃度及び分布について分析した。
【0142】
１つのαアミラーゼ（ＡＡ）、１つのマルトジェニックαアミラーゼ（ＭＡ）及び１つのグルコアミラーゼ（ＧＡ）を試験した。すべての実験において、Ｌａｍｉｎｅｘ（登録商標）７５０を０．５ｋｇ／トン（トウモロコシ）にて適用して、発酵性糖類の分布に対して著しく影響を及ぼすことなく、適切な濾過を確実にした。
【0143】
αアミラーゼの一例として、デュポン社からのＡＭＹＬＥＸ（登録商標）５Ｔ（Ａ ５Ｔ）を使用した。マルトジェニックαアミラーゼの一例として、デュポン社からのＤＩＡＺＹＭＥ（登録商標）ＭＡ（Ｄ ＭＡ）を使用した。グルコアミラーゼの一例として、デュポン社からのＤＩＡＺＹＭＥ（登録商標）ＴＧＡ（Ｄ ＴＧＡ）を使用した。使用された用量及び組み合わせを表９に示す。
【0144】
【表11】
【0145】
麦汁の分析：Ｄｕｐｏｎｔ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｂｒｅｗｉｎｇ，２３．８５８０－Ｂ１１に従って、マッシュ分離から３０分後に、それぞれの試料の麦汁体積を測定した。要するに、２５０ｍｌメスシリンダーグラスの上に置かれた、濾紙（ＶＷＲ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ カタログ番号５１６－０３１０，サイズ３２０ｍｍ，折り畳み定性的濾紙，３０７醸造等級（Ｂｒｅｗｅｒｙ ｇｒａｄｅ），中程度の濾過速度）を備えたプラスチック漏斗を通して試料を濾過し、時間を記録した。３０分後、フィルターを通してメスシリンダー内へ入った液体の量（濾液）を測定した。Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ（Ｌｏｖｉｓ）を使用して、Ｄｕｐｏｎｔ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｂｒｅｗｉｎｇ，２３．８５８０－Ｂ２８（ＥＢＣ ８．３ Ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ｗｏｒｔに基づく）に従って、マッシング後の原麦汁濃度（ＯＥ）、麦汁試料中のエキス濃度を測定した。ＨＰＬＣによる発酵性糖類（全体％＋ｇ／１００ｍＬ）はＤＰ１、ＤＰ２、ＤＰ３及びＤＰ４＋であり、Ｄｕｐｏｎｔ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｂｒｅｗｉｎｇ，２３．８５８０－Ｂ２０（ＥＢＣ ８．７ Ｆｅｒｍｅｎｔａｂｌｅ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｉｎ Ｗｏｒｔ ｂｙ ＨＰＬＣ（ＩＭ）に基づく）に従って、マッシング後に決定した。
【0146】
以下の：異なる酵素を組み合わせて適用することによる、麦汁体積、エキス濃度及びマッシング中に放出されたＤＰ１～ＤＰ３の合計％として表される発酵性糖の程度を表１０に示す。
【0147】
【表12】
【0148】
分離後に達成された麦汁の量（表１０）から分かるように、すべての試料が、適用された酵素で処理することが可能であった。おそらく（エンド型）αアミラーゼの量が低かったために、実施例４及び５と比較して、エキス濃度は低かった。注目すべきことには、高いパーセンテージのＤＰ１～ＤＰ３（発酵性糖）によって示されるように、エンド型αアミラーゼの他に、マルトジェニックαアミラーゼをグルコアミラーゼと組み合わせることが可能であった。酵素のこれらの組み合わせはすべて、良好な濾過性、高いエキス濃度、及び高度の発酵性糖を可能にする。
【0149】
前述の本発明は、理解を明確にする目的で、図面及び実施例によって、ある程度詳しく説明してきたが、添付の請求項の範囲内で特定の変更及び修正を行うことができる。さらに、本明細書において提供されるそれぞれの参考文献は、それぞれの参照があたかも参照により個々に組み込まれるがごとく同程度に、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。ウェブサイト又は受入番号などのいずれかの引用の内容が時間と共に変化し得る程度まで、本出願の出願日にて効力があるバージョンを意味する。文脈から特に明らかでない限り、任意の工程、要素、態様、実施形態の特徴を、他のいずれかと組み合わせて使用することができる。
【配列表】