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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-09
(45)【発行日】2024-10-18
(54)【発明の名称】抗原特異的Ｔリンパ球の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20241010BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2022510078
(86)(22)【出願日】2020-08-24
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-23
(86)【国際出願番号】 PL2020000073
(87)【国際公開番号】W WO2021034208
(87)【国際公開日】2021-02-25
【審査請求日】2023-06-30
(31)【優先権主張番号】P.430932
(32)【優先日】2019-08-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】PL
(73)【特許権者】
【識別番号】522059461
【氏名又は名称】グダニスキ ウニバルステット メディッチニー
(74)【代理人】
【識別番号】100104411
【弁理士】
【氏名又は名称】矢口 太郎
(72)【発明者】
【氏名】トゥロンコフスキー、ピオット
(72)【発明者】
【氏名】イバスキビッツ－グゼーッシュ、ドロタ
(72)【発明者】
【氏名】グリビーンスキ、マテウス
【審査官】松田 芳子
(56)【参考文献】
【文献】特表２００８－５４４７６０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５３７９６４（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／１０４８７５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Frontiers in Immunology，2017年，vol.8，article no.1870
【文献】Cytotherapy，2020年，vol.22，p.629-641
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／０７８３
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
モノクローナル抗体で標識され、選別された抗原特異的Ｔリンパ球の製造方法であって、前記リンパ球は、
ａ）前記抗原を搭載した自己由来の単球の使用によって生成され、
ｂ）生成されたＴ調節性リンパ球またはＴエフェクターリンパ球をＰＢＳに懸濁し、蛍光色素で細胞内を染色し、
ｃ）続いて、前記リンパ球を暗所で培養し、
ｄ）続いて、前記リンパ球細胞を培養液で数回集中的に洗浄し、
ｅ）細胞内蛍光色素で染色したＴ調節性リンパ球またはＴエフェクターリンパ球を、前記抗原を搭載したガンマ線照射した自己由来のＣＤ１４＋単球と一緒に前記培養液に懸濁し、
ｆ）Ｔ調節性リンパ球またはＴエフェクターリンパ球とＣＤ１４＋単球の共培養に、抗ＣＤ１５４抗体および抗ＣＤ２８抗体を添加し、
ｇ）前記添加された共培養物を培養液中で培養し、および
ｈ）培養後の抗原特異的Ｔリンパ球は、細胞内色素の低強度に基づいて選別され、蛍光の前記低強度は抗原特異性のマーカーであり、蛍光の消失は増殖の強度と相関する、製造方法。
【請求項2】
請求項１記載の方法において、前記Ｔ調節性またはＴエフェクターリンパ球が以下の濃度：１ｘ１０６細胞／ｍｌ ＰＢＳで懸濁される工程を特徴とする、方法。
【請求項3】
請求項１記載の方法において、前記リンパ球を以下の蛍光色素：最終濃度１～５μＭのＣＦＳＥまたはバイオレットブルーのいずれかで染色する工程を特徴とする、方法。
【請求項4】
請求項１記載の方法において、前記工程ｃ）において、前記リンパ球を室温の３７℃で２０分インキュベートする工程を特徴とする、方法。
【請求項5】
請求項１記載の方法において、前記自己由来の単球を、最終的な単球：リンパ球の比率が１：１になるように共培養に加える工程を特徴とする、方法。
【請求項6】
請求項１記載の方法において、前記工程ｅ）において、前記単球にガンマ線照射する工程を特徴とする、方法。
【請求項7】
請求項１記載の方法において、前記単球とリンパ球の共培養物を、最終濃度５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ１５４抗体および最終濃度５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体とともにインキュベートする工程を特徴とする、方法。
【請求項8】
請求項１記載の方法において、前記工程ｇ）において、前記共培養物を３７℃で５％ＣＯ２でインキュベートする工程を特徴とする、方法。
【請求項9】
請求項１記載の方法において、前記抗原に対する特異性は、抗原特異的Ｔリンパ球が非特異的Ｔリンパ球よりも活性が高い機能試験で評価され、Ｔ調節リンパ球の場合の活性は、機能Ｔエフェクターリンパ球の抑制として定義され、Ｔエフェクターリンパ球の場合の活性は、増殖の強度の増加、サイトカインおよび細胞障害性因子の産生強度の増加として定義される工程を特徴とする、方法。
【請求項10】
請求項９記載の方法において、前記抗原特異的Ｔリンパ球は、前記細胞内色素の低い蛍光に基づいて選別されたＴリンパ球である工程を特徴とする、方法。
【請求項11】
請求項９記載の方法において、前記非特異的Ｔリンパ球は、保存された前記細胞内色素の高い蛍光に基づいて選別されたＴリンパ球である工程を特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、免疫療法における臨床使用のための抗原特異的Ｔリンパ球（ＣｅｌｌＴｒＡｇ）の製造プロセスに関するものである。このようにして製造されたＣｅｌｌＴｒＡｇは、例えば多発性硬化症、関節リウマチ、１型糖尿病などの自己免疫疾患の治療や、移植片拒絶反応、アレルギー反応、移植片対宿主病ＧＶＨＤなどの有害な免疫反応の抑制に適する。
【背景技術】
【0002】
Ｔｒｅｇリンパ球は、末梢血リンパ球全体の約１％を占めるが、自分の組織の寛容性を維持するために重要な役割を果たす（Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋｉ Ｐ ２００９）（Ｖｉｇｎａｌｉ ＤＡ ２００８）（Ｙｉ Ｓ ２０１２）。制御性Ｔ細胞が不足すると、Ｘ連鎖性免疫不全症候群・多内分泌・腸管症（ＩＰＥＸ）の患者に見られるように、多くの自己免疫疾患や過敏症を引き起こす（Ｇａｍｂｉｎｅｒｉ Ｅ ２００３）。Ｔｒｅｇリンパ球は、ステロイドのように炎症反応を抑制し、免疫抑制的に作用することから、「インテリジェント・ステロイド」と呼び得るが、一方で、Ｔｒｅｇ細胞の生理的抑制作用は、病理組織的な反応（例えば、自分の組織に向けられた反応）にのみ関係する。私たちの観察結果を含む臨床試験の結果から、Ｔｒｅｇリンパ球を用いた治療は安全であり、異物や危険な抗原（ウイルス、細菌、がん細胞）に対する免疫反応を損なうことはないことが知られている（Ｍａｒｅｋ－Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋａ Ｎ ２０１２）（Ｍａｒｅｋ－Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋａ Ｎ ２０１４）（Ｍａｒｔｅｌｌｉ ＭＦ ２０１４）（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ ＪＡ ２０１５）。
【0003】
私たちの研究チームは、１０年以上にわたってＴｒｅｇリンパ球の生物学と臨床利用に関する研究を行ってきた。私たちは、成人の移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の治療にインビトロで増幅されたＴｒｅｇ細胞を使用した最初の研究者であり（ＮＫＥＢＮ／４５８－３１０／２００８）（Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋｉ Ｐ ２００９）、その後、小児の１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）に使用した（ＴｒｅｇＶＡＣ ＩＳＲＣＴＮ０６１２８４６２；ＴｒｅｇＶＡＣ２．０ＥｕｄｒａＣＴ：２０１４－００４３１９－３５）（Ｍａｒｅｋ－Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋａ Ｎ ２０１２）（Ｍａｒｅｋ－Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋａ Ｎ ２０１４）、多発性硬化症（ＴｒｅｇＳＭ ＥｕｄｒａＣＴ：２０１４－００４３２０－２２）（Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋｉ Ｐ ２０１５）などの研究が行われる。現在、Ｔｒｅｇ細胞を用いた臨床試験は、以下のようにも行われる。
【0004】
世界の他の施設では、ＧＶＨＤの治療／予防（Ｄｉ Ｉａｎｎｉ Ｍ ２０１１）、成人のＴ１Ｄ治療（ＮＣＴ０１２１０６６４）の他、腎移植（ｉ．ａ．ＮＣＴ０２０９１２３２ ａｎｄ ＮＣＴ０２１２９８８１）や肝臓（ＴｈＲＩＬ ＮＣＴ０２１６６１７７ ａｎｄ ＮＣＴ０１６２４０７７）における寛容性の誘導などに関連する。近年、Ｔｒｅｇリンパ球を治療ツールとして用いる細胞療法のダイナミックな開発が始まっている。現在、これらの細胞を用いた臨床試験が世界で約４０件行われる。これらのプロジェクトはすべて、生理的な免疫反応を損なわずに不要な免疫反応を抑制するという、インテリジェントな免疫抑制という１つの目標に導かれる（Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋｉ Ｐ ２０１５，Ｇｌｉｗｉ?ｓｋｉ Ｍ ２０１７）。
【0005】
上記の研究では、Ｔｒｅｇリンパ球は患者の末梢血または臍帯血ユニットから採取された。Ｔｒｅｇリンパ球の分離には、ソーターを使用するのが最良の方法で、これにより非常に純度の高い（９７～１００％）集団が得られる。典型的には、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ表現型またはＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７－またはＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ｌｏｗを有するリンパ球が単離される（出願Ｐ．３９９４４７）（Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋｉ Ｐ ２００９）（Ｍａｒｅｋ－Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋａ Ｎ ２０１２）（Ｍａｒｅｋ－Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋａ Ｎ ２０１４）（Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋａ Ｐ ２０１５）。分離した細胞は、患者に投与するのに十分な量を得るために、１０～１４日間、高度の増殖のために活性化される。効果的な拡大は、特定の実験的手法によって決定される、特にＦｏｘＰ３因子の高い発現を含む完全な表現型を維持しながらの条件で実施されなければならない（Ｍａｒｅｋ Ｎ ２０１１，Ｇｏ?ａｂ Ｋ ２０１３，Ｍａｒｅｋ－Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋａ Ｎ ２０１７）。また、Ｔｒｅｇリンパ球製剤は先進治療薬（ＡＴＭＰ）に分類され、薬事法および「先進治療薬に関する」欧州議会規則Ｎｏ．１３９４／２００７の適用を受けるため、臨床応用のためのこのようなスキームでの拡大は、ＧＭＰの基準に従って実施されなければならない。
【0006】
上記のスキームに従って製造された細胞を使用することは、その多特異性を意味し、それは多くの異なる抗原に対して特異性を持つ一連のリンパ球であり、したがって投与後の効果は限定的である。もちろん、すべてのＴｒｅｇリンパ球が炎症部位へのトロピズムを持っていること、「バイスタンダー」タイプを調節する能力と感染寛容性に基づいて他の細胞を制御表現型に変換する能力は、多特異性（ポリクローナル）製品の高い効率性に影響を与える。それにもかかわらず、そのような製品の有効性は、細胞を特定の抗原に標的化することによって高めることができる。このようにして、そのような抗原特異的Ｔｒｅｇｓリンパ球は、そのような抗原の発現が起こる部位にのみ移動し、そのような抗原の刺激によって誘発される炎症反応の部位でのみそのような抗原を認識する病的エフェクター細胞の活動を選択的に阻害することができる。自己免疫疾患の場合には、罹患した臓器（１型糖尿病のインスリン産生膵島や多発性硬化症のミエリン鞘など）の破壊を抑制することができる。同時に、Ｔｒｅｇｓリンパ球は、リンパ系全体を回るのではなく、感作された特定の抗原を発現している部位にのみトロピズムを示すので、全身的な副作用を抑えることができる。
【0007】
Ｔｒｅｇ細胞を治療ツールとして用いる臨床試験を開発し成功させるためには、特異的な抗原性と高いサプレッサー能を持つ安定したＴｒｅｇリンパ球を、安全かつ簡単に使用でき、同時に経済的にも実現可能な方法を開発することが重要である。
【0008】
また、アレルゲンに対する過敏症として知られる、過剰な免疫反応も問題となるようである。これらの疾患のほとんどは、市販の薬を使って対症療法を行うことができる。しかし、過敏症の中には、重度の障害や、死に至る合併症を引き起こすものもある。疾患のプロセスはしばしば時間とともに進行し、炎症が激化して気道に恒久的な構造的変化をもたらし、使用した薬剤が効かなくなる（Ｐａｎｅｔｔｉｅｒｉ ＲＡ Ｊｒ ２００８）（Ｂａｒｂａｒｏ ＭＰ ２０１４）。このような状況では、同じく抗原特異的Ｔｒｅｇリンパ球が現代の抗アレルギー薬になる可能性がある。
【0009】
結論として、自己免疫疾患、アレルギー、移植患者の治療の両方に使用される効果的で安全な薬剤は、望ましくない免疫反応（例えば、自己免疫疾患やアレルギー、拒絶器官、移植片対宿主病）の原因となる明確に定義された抗原に対する免疫システムの反応を最大限に選択的に調節し、同時に異物、そして危険な抗原に対する生理的な免疫反応を損なわないものである。このような知的な免疫抑制のきっかけとなるのが、まさに抗原特異的Ｔｒｅｇリンパ球である。しかし、Ｔｒｅｇ細胞を用いた臨床治療を成功させるための条件は、これらのリンパ球を増殖させるための患者に安全なプロトコルを開発することであり、これにより、抗原特異的な細胞の数を多く保証しつつ、その安定性と抑制活性を培養期間中維持することができる（Ｔａｎｇ Ｑ ２０１３）。本特許出願に記載される方法は、上述の要件を満たす。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１） 米国特許出願公開第２０１９／１６１７２８号明細書
（特許文献２） 国際公開第２０１８／１０６８８５号
（特許文献３） 国際公開第２０１３／１３１０４５号
（非特許文献）
（非特許文献１） ＨＡＮＳ Ｊ．Ｐ．Ｍ．ＫＯＥＮＥＮ ＥＴ ＡＬ，"ＣＤ２７／ＣＦＳＥ－Ｂａｓｅｄ Ｅｘ Ｖｉｖｏ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ Ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ"，ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１７４，Ｎｏ．１２，１５ Ｊｕｎｅ ２００５ （２００５－０６－１５），ｐａｇｅ ７５７３－７５８３
（非特許文献２） ＤＯＲＯＴＡ ＩＷＡＳＺＫＩＥＷＩＣＺ－ＧＲＺＥＳ ＥＴ ＡＬ，"Ａｎｔｉｇｅｎ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｃａｎ ｂｅ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｗｉｔｈ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ａｎｔｉ－ＣＤ２８ ａｎｄ ａｎｔｉ－ＣＤ１５４ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ"， ＣＹＴＯＴＨＥＲＡＰＹ，Ｖｏｌ． ２２， Ｎｏ． １１， ０１ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０２０ （２０２０－１１－０１）， ｐａｇｅ ６２９－６４１
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１） 米国特許出願公開第２０１９／１６１７２８号明細書
（特許文献２） 国際公開第２０１８／１０６８８５号
（特許文献３） 国際公開第２０１３／１３１０４５号
（非特許文献）
（非特許文献１） ＨＡＮＳ Ｊ．Ｐ．Ｍ．ＫＯＥＮＥＮ ＥＴ ＡＬ，"ＣＤ２７／ＣＦＳＥ－Ｂａｓｅｄ Ｅｘ Ｖｉｖｏ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ Ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ"，ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１７４，Ｎｏ．１２，１５ Ｊｕｎｅ ２００５ （２００５－０６－１５），ｐａｇｅ ７５７３－７５８３
（非特許文献２） ＤＯＲＯＴＡ ＩＷＡＳＺＫＩＥＷＩＣＺ－ＧＲＺＥＳ ＥＴ ＡＬ，"Ａｎｔｉｇｅｎ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｃａｎ ｂｅ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｗｉｔｈ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ａｎｔｉ－ＣＤ２８ ａｎｄ ａｎｔｉ－ＣＤ１５４ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ"， ＣＹＴＯＴＨＥＲＡＰＹ，Ｖｏｌ． ２２， Ｎｏ． １１， ０１ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０２０ （２０２０－１１－０１）， ｐａｇｅ ６２９－６４１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0010】
特に本発明では、モノクローナル抗体で標識され、選別された抗原特異的なＴリンパ球を製造するための工程を提供するものであり、
前記リンパ球は、
ａ）前記抗原を搭載した自己由来の単球の使用によって生成され、
ｂ）生成されたＴ調節性リンパ球またはＴエフェクターリンパ球をＰＢＳに懸濁し、蛍光色素で細胞内を染色し、
ｃ）続いて、前記リンパ球を暗所で培養し、
ｄ）続いて、前記リンパ球細胞を培養液で数回集中的に洗浄し、
ｅ）細胞内蛍光色素で染色したＴ調節性リンパ球またはＴエフェクターリンパ球を、前記抗原を搭載したガンマ線照射した自己由来のＣＤ１４＋単球と一緒に前記培養液に懸濁し、
ｆ）Ｔ調節性リンパ球またはＴエフェクターリンパ球とＣＤ１４＋単球の共培養に、抗ＣＤ１５４抗体および抗ＣＤ２８抗体を共培養し、
ｇ）前記共培養物を培養液中で培養し、および
ｈ）培養後の抗原特異的Ｔリンパ球は、細胞内色素の低強度に基づいて選別され、蛍光の前記低強度は抗原特異性のマーカーであり、蛍光の消失は増殖の強度と相関する。
前記リンパ球は、
ａ）前記抗原を搭載した自己由来の単球の使用によって生成され、
ｂ）生成されたＴ調節性リンパ球またはＴエフェクターリンパ球をＰＢＳに懸濁し、蛍光色素で細胞内を染色し、
ｃ）続いて、前記リンパ球を暗所で培養し、
ｄ）続いて、前記リンパ球細胞を培養液で数回集中的に洗浄し、
ｅ）細胞内蛍光色素で染色したＴ調節性リンパ球またはＴエフェクターリンパ球を、前記抗原を搭載したガンマ線照射した自己由来のＣＤ１４＋単球と一緒に前記培養液に懸濁し、
ｆ）Ｔ調節性リンパ球またはＴエフェクターリンパ球とＣＤ１４＋単球の共培養に、抗ＣＤ１５４抗体および抗ＣＤ２８抗体を共培養し、
ｇ）前記共培養物を培養液中で培養し、および
ｈ）培養後の抗原特異的Ｔリンパ球は、細胞内色素の低強度に基づいて選別され、蛍光の前記低強度は抗原特異性のマーカーであり、蛍光の消失は増殖の強度と相関する。
【0011】
上記で定義したプロセスでは、Ｔ調節性リンパ球またはＴエフェクターリンパ球を以下：１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ ＰＢＳの濃度で懸濁することが好ましい。
【0012】
上記で定義した工程において、リンパ球を以下の蛍光色素：ＣＦＳＥまたはバイオレットブルーのいずれかを最終濃度１～５μＭの１つで染色することが好ましい。
【0013】
上記のプロセスでは、リンパ球を室温または３７℃で２０分間インキュベートすることが好ましい。
【0014】
上記で定義したプロセスでは、自己単球を、最終的な単球：リンパ球の比率が１：１になるように共培養に加えることが好ましい。
【0015】
上記で定義したプロセスにおいて、単球をガンマ線照射することが好ましい。
【0016】
上記で定義したプロセスにおいて、単球とリンパ球の共培養は、５μｇ／ｍｌの最終濃度の抗ＣＤ１５４抗体および５μｇ／ｍｌの最終濃度の抗ＣＤ２８抗体とともにインキュベートすることが好ましい。
【0017】
上記のプロセスでは、共培養物を３７℃にて５％ＣＯ２でインキュベートすることが好ましい。
【0018】
上記のプロセスにおいて、抗原に対する特異性は、抗原特異的なＴリンパ球、特に細胞内色素の低い蛍光に基づいて選別されたＴリンパ球が、非特異的なＴリンパ球、特に細胞内色素の高い蛍光が維持されることに基づいて選別されたＴリンパ球よりも活性が高いという機能試験で評価されることが好ましい。ここで、Ｔ調節性リンパ球の場合の活性は、機能Ｔエフェクターリンパ球の抑制として定義され、一方、Ｔエフェクターリンパ球の場合の活性は、増殖の強度の増加、サイトカインおよび細胞傷害性因子の産生の強度の増加として定義される。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】図１は、実験の流れを示す。バフィーコートは単球とリンパ球に分離された。リンパ球をＴ調節細胞（Ｔｒｅｇ）とＴエフェクター細胞（Ｅｆｆ）に選別し、ＣＦＳＥで染色した後、ペプチド（インスリンまたはペプチド９－２３）を負荷した放射線照射単球で刺激した。ポリクローナルＴｒｅｇとＥｆｆは、ａｎｔｉＣＤ３／ａｎｔｉＣＤ２８ビーズを用いて作製した。培養７日後、図２Ｃおよび２Ｄに示したプロトコールを用いて、ＣＦＳＥの希釈蛍光に基づいて細胞を抗原特異的細胞と非特異的細胞に選別した。次に、得られたポリクローナル（Ｔｒｅｇｐｏｌｙ）、抗原特異的（Ｔｒｅｇｓｐｅｃ）および非特異的（Ｔｒｅｇｕｎｓｐｅｃ）のサブセットのＴｒｅｇｓを、ポリクローナル（Ｅｆｆｐｏｌｙ）または抗原特異的（Ｅｆｆｓｐｅｃ）のバイオレット染色された自己Ｔ細胞エフェクターをレスポンダーとする機能試験でテストした。Ｅｆｆｓｐｅｃは、あらかじめ抗原を負荷した照射単球で刺激して調製した。
【図2】図２は、抗原特異的レギュラトリーＴ細胞のソーティング法。Ｔｒｅｇｓを他の細胞（Ａ）、特に刺激時に使用した抗原提示単球と区別するために、蛍光色素で染色する（Ｂ）。共培養終了後、蛍光が減少した領域（Ｐ１ゲート）で抗原の配列を認識したＴｒｅｇｓリンパ球を、別の抗原特異的集団として選別した。
【図3】図３は、単球との共培養で抗原に反応したＴｒｅｇｓの割合を示す。解析対象となったのは、インスリンまたはペプチド９－２３という抗原を提示した単球と共培養したＴｒｅｇ細胞である。いくつかの培養では、モノクローナル抗体である抗ＣＤ２８および抗ＣＤ１５４（ｍａｂｓ２８／１５４）を加えて第２のシグナルとした。増殖している（抗原特異的な）Ｔｒｅｇｓの割合（Ａ）と、ＦｏｘＰ３の発現強度が高く（ｈｉｇｈ）、増殖している（水色）か、増殖していない（紺色）かのＴｒｅｇｓの割合（Ｂ）を評価した。結果は平均値＋／－ＳＤで示した。解析の例は、インスリンを負荷した単球で刺激した共培養のＣ図と、ペプチド９－２３を負荷した単球で刺激した共培養のＤ図のドットプロットに示される。ドットプロットのＣＤ４ｖｓ．Ｖｉｏｌｅｔのゲートは、左が増殖中の（ＳＰＥＣ）抗原特異的Ｔｒｅｇｓ、右が非増殖中の（ＵＮＳＰＥＣ）非特異的Ｔｒｅｇｓを示す。矢印は、ＦｏｘＰ３の発現を示す対応するドットプロットを結ぶ。上段のゲートはＦｏｘＰ３ｈｉｇｈ、下段はＦｏｘＰｌｏｗ３のサブセットを示す。
【図4】図４は、Ｔｒｅｇリンパ球のクローナリティを示す。ＴＣＲ受容体の各クラス（Ｖβ鎖）の発現によって測定されたＴｒｅｇリンパ球のクローナリティ。培養前（「Ｔｒｅｇ ＰＯＬＹ」）と、抗原（インスリンまたは９－２３ペプチド）を提示した単球との共培養後のＴｒｅｇリンパ球のクローン解析の例で、増殖能力に基づいて、増殖する細胞（「Ｔｒｅｇ ＳＰＥＣＩＦＩＣ」）と増殖しない細胞（「Ｔｒｅｇ ＵＮＳＰＥＣＩＦＩＣ」）に分類される。矢印の部分は、共培養中に優先的に増殖が促されたと同定されたクローン（「Ｔｒｅｇ ＰＯＬＹ」と比較して共培養後に目に見えて増加した割合）。実施した各培養では、Ｖβの発現が異なるクローンが存在し、各培養では１～２個以上のクローンが優先的に増加することはなく、増加率は数％を超えなかった。
【図5】図５は、機能試験である－Ｔエフェクターリンパ球の増殖抑制を示す。ポリクローナル（Ｔｒｅｇｓ ＰＯＬＹ）、インスリンやペプチド９－２３に対する抗原特異的（Ｔｒｅｇｓ ＳＰＥＣ）、非特異的（Ｔｒｅｇ ＵＮＳＰＥＣ）細胞など、生成されたＴｒｅｇｓ（Ｔｒｅｇ）のサブセットを、図の下部に示す割合で自己のＴエフェクター細胞（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ）と共役させた。エフェクターは、ポリクローナル（Ａ上図）または抗原特異的（Ｂ下図）のいずれかのレスポンダーとして処理した。続いて、この共培養体を、インスリンまたはペプチド９－２３をプレロードした放射線照射単球で刺激した。その結果、反応者の増殖が抑制されたことが読み取れた。結果は、増殖を常に１００％とみなした反応者のみの培養を指標とした。結果は平均値±最小値－最大値で示した。有意差は／＊とｐ値で示した。
【図6】図６は、機能試験－Ｔエフェクターリンパ球によるＩＦＮγ産生の抑制（ＥＬＩＳＡ）を示す。ポリクローナル（Ｔｒｅｇｓ ＰＯＬＹ）、インスリンやペプチド９－２３に対する抗原特異的（Ｔｒｅｇｓ ＳＰＥＣ）、非特異的（Ｔｒｅｇ ＵＮＳＰＥＣ）細胞などの生成されたＴｒｅｇｓ（Ｔｒｅｇｓ）のサブセットを、図の下部に示された割合で自己のＴエフェクター細胞（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ）と共役させた。エフェクターは、ポリクローナル（Ａ上図）または抗原特異的（Ｂ下図）のいずれかのレスポンダーとして処理した。次に、この共培養物を、インスリンまたはペプチド９－２３をプレロードした放射線照射単球で刺激した。その結果、レスポンダーによるＩＦＮγの産生が抑制された。結果は、増殖を常に１００％とみなした反応者の培養物のみを指標とした。結果は平均値＋／－最小値－最大値で示される。有意な差がある場合は／＊とｐ値で示した。
【図7】図７は、機能試験－Ｔエフェクターリンパ球によるＩＦＮγ産生の抑制－ＥＬＩＳＰＯＴを示す。ポリクローナル（Ｔｒｅｇｓ ＰＯＬＹｃｌｏｎａｌ）、インスリンやペプチド９－２３に対する抗原特異的（Ｔｒｅｇｓ ＳＰＥＣｉｆｉｃ）、非特異的（Ｔｒｅｇ ＵＮＳＰＥＣｉｆｉｃ）など、生成したＴｒｅｇｓ（Ｔｒｅｇ）のサブセットを、ポリクローナルまたは抗原特異的なレスポンダーとしての自己Ｔエフェクター細胞と共培養した。Ｔｒｅｇｓとエフェクターは、図の上部に示した割合で共培養した。この共培養細胞を、インスリンまたはペプチド９－２３を負荷した放射線照射単球で刺激した。その結果、レスポンダーによるＩＦＮγの産生が抑制された。結果は、培養物の写真と、特定のウェルにおけるスポットの数として示される。
【0020】
本発明は、以下の実施例によって説明されるが、これらはその限定ではない。
【0021】
材料と方法
図１に手法と機能解析の概要を示す。
献血者
バフィーコートは、グダニスクのＲｅｇｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ Ｄｏｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔから入手した。
Ｂ：９－２３インスリンペプチドとインスリン
Ｂ：９－２３インスリンペプチドはＬｉｐｏｐｈａｒｍ社（ポーランド、グダニスク）で合成された白色粉末で、ＨＰＬＣ法により９０％以上の純度で製造された。ペプチドはオートクレーブ滅菌した脱イオン水に溶解し、最終濃度を０．５μｇ／μｌとし、－７０oＣで３ヶ月以内に保存。
試験に使用したインスリンは、市販のもの（Ａｃｔｒａｐｉｄ（登録商標）Ｐｅｎｆｉｌｌ（登録商標），Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）を使用し、２～８℃の冷蔵庫で保存した。
図１に手法と機能解析の概要を示す。
献血者
バフィーコートは、グダニスクのＲｅｇｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ Ｄｏｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔから入手した。
Ｂ：９－２３インスリンペプチドとインスリン
Ｂ：９－２３インスリンペプチドはＬｉｐｏｐｈａｒｍ社（ポーランド、グダニスク）で合成された白色粉末で、ＨＰＬＣ法により９０％以上の純度で製造された。ペプチドはオートクレーブ滅菌した脱イオン水に溶解し、最終濃度を０．５μｇ／μｌとし、－７０oＣで３ヶ月以内に保存。
試験に使用したインスリンは、市販のもの（Ａｃｔｒａｐｉｄ（登録商標）Ｐｅｎｆｉｌｌ（登録商標），Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）を使用し、２～８℃の冷蔵庫で保存した。
【0022】
細胞の分離と選別
Ｔ制御細胞とＴエフェクター細胞
細胞の調製とソーティングの概要を図２に示す。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健康なボランティア血液提供者から得たバフィーコートから、フィコール・ハイパーク勾配遠心法により分離し、新鮮な状態で使用した。ＴｒｅｇｓとＴｅｆｆは、我々が以前に記述したプロトコルに従って新たに分離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４＋ＴＣｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、メーカーの指示に従い、ネガティブセレクションにより分離した。その後、ＣＤ＋４Ｔ細胞を、以下の抗原に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）で染色した。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５およびＣＤ１２７に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）で染色した。その後、ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩｕ ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， ＵＳＡ）を用いて、以下の表現型のＴｒｅｇｓに分類した。ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ＨｉｇｈＣＤ１２７－／Ｌｏｗｌｉｎ－ｄｏｕｂｌｅｔ－とＴｅｆｆｓに分類した。ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５－ＣＤ１２７Ｈｉｇｈｌｉｎ－ｄｏｕｂｌｅｔ－とした。分離したＴｒｅｇリンパ球とＴｅｆ細胞を別々のプレートで培養し、ＧＭＰ基準を満たす培養液Ｘ－ＶＩＶＯ２０（Ｌｏｎｚａ社）で３７℃で培養した。この培地に、熱不活化ヒトＡＢ型血清（１０％）、インターロイキン２（ＩＬ－２；２０００Ｕ／ｍｌ；Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ；Ｃｈｉｒｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）を加え、２４時間培養した。
Ｔ制御細胞とＴエフェクター細胞
細胞の調製とソーティングの概要を図２に示す。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健康なボランティア血液提供者から得たバフィーコートから、フィコール・ハイパーク勾配遠心法により分離し、新鮮な状態で使用した。ＴｒｅｇｓとＴｅｆｆは、我々が以前に記述したプロトコルに従って新たに分離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４＋ＴＣｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、メーカーの指示に従い、ネガティブセレクションにより分離した。その後、ＣＤ＋４Ｔ細胞を、以下の抗原に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）で染色した。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５およびＣＤ１２７に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）で染色した。その後、ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩｕ ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， ＵＳＡ）を用いて、以下の表現型のＴｒｅｇｓに分類した。ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ＨｉｇｈＣＤ１２７－／Ｌｏｗｌｉｎ－ｄｏｕｂｌｅｔ－とＴｅｆｆｓに分類した。ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５－ＣＤ１２７Ｈｉｇｈｌｉｎ－ｄｏｕｂｌｅｔ－とした。分離したＴｒｅｇリンパ球とＴｅｆ細胞を別々のプレートで培養し、ＧＭＰ基準を満たす培養液Ｘ－ＶＩＶＯ２０（Ｌｏｎｚａ社）で３７℃で培養した。この培地に、熱不活化ヒトＡＢ型血清（１０％）、インターロイキン２（ＩＬ－２；２０００Ｕ／ｍｌ；Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ；Ｃｈｉｒｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）を加え、２４時間培養した。
【0023】
単球
自己由来のＣＤ１４＋細胞は、メーカーの指示に従ってＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ１４ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてポジティブセレクションを行い、９５％以上の純度で分離した。その後、分離した単球を培養し（１０細胞６／ウェル）、ＧＭＰ基準を満たす培養液Ｘ－ＶＩＶＯ２０（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃で培養した。あらかじめ調製したペプチド溶液（２５μｇ／ｗｅｌｌ／ｍｌ）またはインスリン（１００μｌ／ｗｅｌｌ／ｍｌ）を添加して２４時間培養した。単球をＢ：９－２３インスリンペプチドで刺激した場合（Ｍｏ９－２３）、インスリンで刺激した場合（ＭｏＩＮＳ）、刺激しない場合（Ｍｏ）の３条件を用意した。
自己由来のＣＤ１４＋細胞は、メーカーの指示に従ってＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ１４ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてポジティブセレクションを行い、９５％以上の純度で分離した。その後、分離した単球を培養し（１０細胞６／ウェル）、ＧＭＰ基準を満たす培養液Ｘ－ＶＩＶＯ２０（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃で培養した。あらかじめ調製したペプチド溶液（２５μｇ／ｗｅｌｌ／ｍｌ）またはインスリン（１００μｌ／ｗｅｌｌ／ｍｌ）を添加して２４時間培養した。単球をＢ：９－２３インスリンペプチドで刺激した場合（Ｍｏ９－２３）、インスリンで刺激した場合（ＭｏＩＮＳ）、刺激しない場合（Ｍｏ）の３条件を用意した。
【0024】
色素標識と細胞拡張
単球
２４時間培養後、ウェルから単球を回収し、ガンマ線照射（血液製剤への照射と同様の標準的な条件）した後、計数し、新鮮な培地（Ｘ－ＶＩＶＯ２０）に最終濃度１６×１０細胞／ｍｌで再懸濁した。
単球
２４時間培養後、ウェルから単球を回収し、ガンマ線照射（血液製剤への照射と同様の標準的な条件）した後、計数し、新鮮な培地（Ｘ－ＶＩＶＯ２０）に最終濃度１６×１０細胞／ｍｌで再懸濁した。
【0025】
Ｔｒｅｇ細胞とＴｅｆｆ細胞
選別から２４時間後、Ｔ調節性リンパ球をウェルから回収し、ＰＢＳで洗浄して染色に影響する血清を除去した。その後、１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度でＰＢＳに再懸濁し、ＣＦＳＥ（Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ ＣＦＳＥ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＣＦＳＥの最終濃度が１～５μＭとなるように染色した。細胞を３７℃の暗所で２０分間培養した後、ＰＢＳで数回集中的に洗浄し、次に培養液（Ｘ－ＶＩＶＯ２０＋１０％血清＋ペニシリン／ストレプトマイシン）で洗浄した。Ｔエフェクター細胞も同様の方法で染色した。
選別から２４時間後、Ｔ調節性リンパ球をウェルから回収し、ＰＢＳで洗浄して染色に影響する血清を除去した。その後、１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度でＰＢＳに再懸濁し、ＣＦＳＥ（Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ ＣＦＳＥ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＣＦＳＥの最終濃度が１～５μＭとなるように染色した。細胞を３７℃の暗所で２０分間培養した後、ＰＢＳで数回集中的に洗浄し、次に培養液（Ｘ－ＶＩＶＯ２０＋１０％血清＋ペニシリン／ストレプトマイシン）で洗浄した。Ｔエフェクター細胞も同様の方法で染色した。
【0026】
あるいは、両方のリンパ球集団をバイオレット（Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で、１～５μＭの最終濃度で上記の方法で染色した。染色のコントロールはフローサイトメーター（Ｆｏｒｔｅｓｓａ， ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で行った。
ポリクローナル・スティミュレーション
染色後、細胞の一部を１０％の不活性ヒト血清と抗生物質ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む新鮮な培地（Ｘ－ＶＩＶＯ２０，Ｌｏｎｚａ）で懸濁した。次に、９６ウェルプレートに細胞を播種し（１×１０５細胞／ｗｅｌｌ）、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体をコーティングした磁気ビーズ（Ｔｒｅｇ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を１：１の比率（ビーズ：細胞）で刺激し、７日間培養した。ポリクローナル細胞はＴｒｅｇＰＯＬＹとＴｅｆｆＰＯＬＹの２条件を用意した。
ポリクローナル・スティミュレーション
染色後、細胞の一部を１０％の不活性ヒト血清と抗生物質ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む新鮮な培地（Ｘ－ＶＩＶＯ２０，Ｌｏｎｚａ）で懸濁した。次に、９６ウェルプレートに細胞を播種し（１×１０５細胞／ｗｅｌｌ）、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体をコーティングした磁気ビーズ（Ｔｒｅｇ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を１：１の比率（ビーズ：細胞）で刺激し、７日間培養した。ポリクローナル細胞はＴｒｅｇＰＯＬＹとＴｅｆｆＰＯＬＹの２条件を用意した。
【0027】
抗原の刺激
染色後、細胞の一部を１０％の不活性ヒト血清と抗生物質ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む新鮮な培地（Ｘ－ＶＩＶＯ２０，Ｌｏｎｚａ）で懸濁した。次に、９６ウェルプレートに細胞を播種し（１×１０５細胞／ウェル）、抗原：Ｂ：９－２３インスリンペプチド（Ｍｏ９－２３）またはインスリン（ＭｏＩＮＳ）を１：１の比率（Ｍｏ：細胞）で負荷した単球で刺激した。その後、滅菌した抗ＣＤ１５４（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＮＡ／ＬＥ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ１５４；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および抗ＣＤ２８（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＮＡ／ＬＥ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ２８；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を最終濃度５μｇ／ｍｌになるように共培養液に添加した。準備した共培養液は、培養液（Ｘ－ＶＩＶＯ２０＋１０％血清＋ペニシリン／ストレプトマイシン、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。Ｔｒｅｇ９－２３／ＩＮＳ＋ＣＤ２８ＣＤ１５４とＴｅｆｆ９－２３／ＩＮＳ＋ＣＤ２８ＣＤ１５４の２つの条件の細胞を用意した。同時に、抗原を負荷した単球で刺激したが、抗ＣＤ２８および抗ＣＤ１５４を含まない細胞、Ｔｒｅｇ９－２３／ＩＮＳおよびＴｅｆｆ９－２３／ＩＮＳを用意した。ネガティブコントロールとして、単球を添加していない細胞（刺激を受けていない、増殖していない）を使用した。ポジティブコントロールとして、ポリクローナル細胞（ｉｎｄｅｘ ＰＯＬＹ）を使用。細胞は７日間培養した。
染色後、細胞の一部を１０％の不活性ヒト血清と抗生物質ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む新鮮な培地（Ｘ－ＶＩＶＯ２０，Ｌｏｎｚａ）で懸濁した。次に、９６ウェルプレートに細胞を播種し（１×１０５細胞／ウェル）、抗原：Ｂ：９－２３インスリンペプチド（Ｍｏ９－２３）またはインスリン（ＭｏＩＮＳ）を１：１の比率（Ｍｏ：細胞）で負荷した単球で刺激した。その後、滅菌した抗ＣＤ１５４（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＮＡ／ＬＥ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ１５４；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および抗ＣＤ２８（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＮＡ／ＬＥ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ２８；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を最終濃度５μｇ／ｍｌになるように共培養液に添加した。準備した共培養液は、培養液（Ｘ－ＶＩＶＯ２０＋１０％血清＋ペニシリン／ストレプトマイシン、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。Ｔｒｅｇ９－２３／ＩＮＳ＋ＣＤ２８ＣＤ１５４とＴｅｆｆ９－２３／ＩＮＳ＋ＣＤ２８ＣＤ１５４の２つの条件の細胞を用意した。同時に、抗原を負荷した単球で刺激したが、抗ＣＤ２８および抗ＣＤ１５４を含まない細胞、Ｔｒｅｇ９－２３／ＩＮＳおよびＴｅｆｆ９－２３／ＩＮＳを用意した。ネガティブコントロールとして、単球を添加していない細胞（刺激を受けていない、増殖していない）を使用した。ポジティブコントロールとして、ポリクローナル細胞（ｉｎｄｅｘ ＰＯＬＹ）を使用。細胞は７日間培養した。
【0028】
抗原特異的細胞のソーティング
増殖７日目に細胞を回収し、新鮮な培地（Ｘ－ＶＩＶＯ）で洗浄した。ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩｕ ｓｏｒｔｅｒ （ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， ＵＳＡ）を用いて、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ ＣＦＳＥ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の４８８ｎｍチャンネルに対するＳＳＣ－Ａのドットプロット（側方散乱）、またはＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の４５０ｎｍチャンネルに対するＳＳＣ－Ａのドットプロット（側方散乱）から細胞を選別した。単球が提示した抗原に反応して増殖する細胞（ｉｎｄｅｘ ＰＲＯ）は、ネガティブコントロールの細胞よりも低い蛍光を示す細胞として同定された（ソーティングゲートのカットオフは、ネガティブコントロールのピークよりも低い蛍光強度を想定し、ゴールには最も低い蛍光を持つネガティブコントロールのピークが５％以上含まれないようにした）。ネガティブコントロール（ネガティブコントロールのピークの蛍光強度を想定したソーティングゲートのカットオフ、ネガティブコントロールのピークのイベントが８０％以上含まれることを目標とする）から、蛍光が細胞の蛍光と同等のものを非増殖細胞（インデックスＮＯＮ）とした。得られた細胞は、品質管理（表現型のコントロール、増殖やインターフェロンγの産生を抑制する機能テスト）を行い、または、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を１：１の比率（細胞：ビーズ）でコーティングした磁気マイクロスフィアを加えてさらに培養し、できるだけ多くの抗原特異的Ｔ制御リンパ球を得た。
増殖７日目に細胞を回収し、新鮮な培地（Ｘ－ＶＩＶＯ）で洗浄した。ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩｕ ｓｏｒｔｅｒ （ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， ＵＳＡ）を用いて、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ ＣＦＳＥ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の４８８ｎｍチャンネルに対するＳＳＣ－Ａのドットプロット（側方散乱）、またはＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の４５０ｎｍチャンネルに対するＳＳＣ－Ａのドットプロット（側方散乱）から細胞を選別した。単球が提示した抗原に反応して増殖する細胞（ｉｎｄｅｘ ＰＲＯ）は、ネガティブコントロールの細胞よりも低い蛍光を示す細胞として同定された（ソーティングゲートのカットオフは、ネガティブコントロールのピークよりも低い蛍光強度を想定し、ゴールには最も低い蛍光を持つネガティブコントロールのピークが５％以上含まれないようにした）。ネガティブコントロール（ネガティブコントロールのピークの蛍光強度を想定したソーティングゲートのカットオフ、ネガティブコントロールのピークのイベントが８０％以上含まれることを目標とする）から、蛍光が細胞の蛍光と同等のものを非増殖細胞（インデックスＮＯＮ）とした。得られた細胞は、品質管理（表現型のコントロール、増殖やインターフェロンγの産生を抑制する機能テスト）を行い、または、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を１：１の比率（細胞：ビーズ）でコーティングした磁気マイクロスフィアを加えてさらに培養し、できるだけ多くの抗原特異的Ｔ制御リンパ球を得た。
【0029】
品質管理
表現型チェック
展開７日目に、ＴｒｅｇｓとＴｅｆｆのサンプルを以下の抗原（Ａｇ）に対するＡｂｓで標識した。ＣＤ４，ＣＤ２５，ＣＤ１２７，ＣＤ４５ＲＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ），ＣＤ６２Ｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ），ＦｏｘＰ３（Ｆｏｘｐ３ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ））に対するＡｂｓで標識し、フローサイトメトリー（Ｆｏｒｔｅｓｓａ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）で解析した。
表現型チェック
展開７日目に、ＴｒｅｇｓとＴｅｆｆのサンプルを以下の抗原（Ａｇ）に対するＡｂｓで標識した。ＣＤ４，ＣＤ２５，ＣＤ１２７，ＣＤ４５ＲＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ），ＣＤ６２Ｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ），ＦｏｘＰ３（Ｆｏｘｐ３ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ））に対するＡｂｓで標識し、フローサイトメトリー（Ｆｏｒｔｅｓｓａ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）で解析した。
【0030】
増殖抑制アッセイ
培養７日目には、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）の産生を抑制する機能的なアッセイを行った。Ｔｒｅｇ細胞とＴｅｆｆ細胞をＰＢＳバッファーで洗浄し、磁石で刺激したマイクロスフィアから精製してカウントした。その後、抗生物質とヒト熱不活化ヒトＡＢ型血清（１０％）を含む新鮮な培養液に細胞を再懸濁した。次の２日間、やはり個々の条件の細胞を別々に培養した。この間、ＩＬ－２と活性化マイクロスフェアは加えなかった。４８時間後、Ｔｅｆｆ細胞をＰＢＳバッファーで洗浄し、カウントした。Ｔｅｆｆ細胞をＣＦＳＥ（Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ ＣＦＳＥ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１μＭ，１５分，３７℃）またはバイオレット（Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１μＭ，１５分，３７℃）で染色し、Ｔｒｅｇリンパ球の存在下での増殖を解析した。色素の選択は、前回のＴｒｅｇリンパ球の染色によって決定した。ＴｒｅｇｓがＣＦＳＥで染色された場合、Ｔｅｆｆ細胞はバイオレットで染色され、その逆も同様である。
培養７日目には、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）の産生を抑制する機能的なアッセイを行った。Ｔｒｅｇ細胞とＴｅｆｆ細胞をＰＢＳバッファーで洗浄し、磁石で刺激したマイクロスフィアから精製してカウントした。その後、抗生物質とヒト熱不活化ヒトＡＢ型血清（１０％）を含む新鮮な培養液に細胞を再懸濁した。次の２日間、やはり個々の条件の細胞を別々に培養した。この間、ＩＬ－２と活性化マイクロスフェアは加えなかった。４８時間後、Ｔｅｆｆ細胞をＰＢＳバッファーで洗浄し、カウントした。Ｔｅｆｆ細胞をＣＦＳＥ（Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ ＣＦＳＥ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１μＭ，１５分，３７℃）またはバイオレット（Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１μＭ，１５分，３７℃）で染色し、Ｔｒｅｇリンパ球の存在下での増殖を解析した。色素の選択は、前回のＴｒｅｇリンパ球の染色によって決定した。ＴｒｅｇｓがＣＦＳＥで染色された場合、Ｔｅｆｆ細胞はバイオレットで染色され、その逆も同様である。
【0031】
マーキングされた自己のＴｅｆｆ細胞（レスポンダー）を、Ｔｒｅｇ細胞（特異的、非特異的、ポリクローナル）と以下：１：１、１：１／２、１：１／４、１：１／８の割合で混合した。Ｔｅｆｆ細胞の数は毎回一定で、Ｔｒｅｇリンパ球の数は変動させた。細胞は、熱不活化ヒトＡＢ型血清（１０％）、インターロイキン２（ＩＬ－２；１００Ｕ／ｍｌ）および抗生物質：ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）を含む新鮮な培養液に懸濁した。刺激剤として、抗原（Ｍｏ９－２３またはＭｏＩＮＳ）を担持した照射済みの自己単球をＴｅｆｆと１：１の割合で添加した。陽性対照として、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体でコーティングした単球（Ｍｏ９－２３またはＭｏＩＮＳ）またはミクロスフェアで刺激したＴｅｆｆ（Ｔｒｅｇ細胞なし）を使用した。陰性対象として、刺激を加えていないＴｅｆｆ細胞を使用した（サイトメーターでの読み取り値を参照）。追加のコントロールとして、Ｔｅｆｆ細胞を用いずに培養した染色されていないＴｒｅｇ細胞を用いた。
【0032】
培養液（Ｘ－ＶＩＶＯ２０＋１０％血清＋ｐ／ｓ）を用いて、５％ＣＯ２、３７℃で６日間培養した。この後、細胞を採取し、フローサイトメーター（Ｆｏｒｔｅｓｓａ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。Ｔｒｅｇ細胞を添加せずに培養した刺激なしのＴｅｆｆ細胞をバックグラウンドとし、１００％の細胞が分裂しなかったことを１００％とした。Ｔｒｅｇ細胞を入れずに培養した刺激したＴｅｆｆ細胞は０％として、増殖が抑制されていないことを意味した。
【0033】
Ｔｒｅｇ細胞と培養したＴｅｆｆ細胞によるＩＮＦ－γ産生の抑制
各培養条件からＴｒｅｇリンパ球のサンプルを採取して機能試験を行い、自己のＴｅｆｆ細胞によるＩＦＮ－γの分泌に対するＴｒｅｇ細胞の抑制効果を確認した。並行して、Ｔｒｅｇ細胞と同じ条件で増殖させたＴｅｆｆリンパ球を、増殖抑制試験のレスポンダーとして採取した。このようにして、ポリクローナルＴｅｆｆ（ＴｅｆｆＰＯＬＹ）と抗原特異的（増殖）Ｔｅｆｆ（Ｔｅｆｆ９－２３＿ＰＲＯまたはＴｅｆｆＩＮＳ＿ＰＲＯ）という２つのシリーズのテストをレスポンダーとして実施することができた。
各培養条件からＴｒｅｇリンパ球のサンプルを採取して機能試験を行い、自己のＴｅｆｆ細胞によるＩＦＮ－γの分泌に対するＴｒｅｇ細胞の抑制効果を確認した。並行して、Ｔｒｅｇ細胞と同じ条件で増殖させたＴｅｆｆリンパ球を、増殖抑制試験のレスポンダーとして採取した。このようにして、ポリクローナルＴｅｆｆ（ＴｅｆｆＰＯＬＹ）と抗原特異的（増殖）Ｔｅｆｆ（Ｔｅｆｆ９－２３＿ＰＲＯまたはＴｅｆｆＩＮＳ＿ＰＲＯ）という２つのシリーズのテストをレスポンダーとして実施することができた。
【0034】
検査対象となる細胞（ＴｒｅｇｓおよびＴｅｆ）をＰＢＳで洗浄し、刺激に用いたマイクロスフィアから精製して計数した。次に、熱不活性化したヒトＡＢ型血清（１０％）と抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン）を含む新鮮な培地に細胞を懸濁した。次の２日間、個々の条件の細胞をやはり別々に培養した。この間、ＩＬ－２と活性化マイクロスフェアは加えなかった。
【0035】
マークを付けた自己のＴｅｆｆ細胞（レスポンダー）を、Ｔｒｅｇ細胞と以下：１：１、１：１／２、１：１／４、１：１／８の割合で混合した。Ｔｅｆｆ細胞の数は毎回一定で、Ｔｒｅｇリンパ球の数は変動させた。細胞は、熱不活化ヒトＡＢ型血清（１０％）、インターロイキン２（ＩＬ－２；１００Ｕ／ｍｌ）および抗生物質：ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）を含む新鮮な培養液に懸濁した。刺激剤として、抗原（Ｍｏ９－２３またはＭｏＩＮＳ）を担持した照射済みの自己単球をＴｅｆｆと１：１の割合で添加した。陽性対照として、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体でコーティングした単球（Ｍｏ９－２３またはＭｏＩＮＳ）またはミクロスフェアで刺激したＴｅｆｆ（Ｔｒｅｇ細胞なし）を使用した。陰性対象として、刺激を加えていないＴｅｆｆ細胞を使用した（サイトメーターでの読み取り値を参照）。追加のコントロールとして、Ｔｅｆｆ細胞を用いずに培養した染色されていないＴｒｅｇ細胞を用いた。
【0036】
培養液（Ｘ－ＶＩＶＯ２０＋１０％血清＋ｐ／ｓ）を用いて、３７℃で５％ＣＯ２の環境下で６日間培養した。この時間の後、培養下から上清を採取し、製造者の指示に従ってＥＬＩＳＡによりＩＦＮ－γレベルを測定した（Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－ｇａｍｍａ ＯｐｔＥＩＡ Ｋｉｔ ＩＩ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【0037】
ＩＮＦ－γ－ＥＬＩＳｐｏｔ
Ｔｅｆｆリンパ球（レスポンダー）とＴｒｅｇリンパ球の共培養を、特殊なＥＬＩＳｐｏｔプレート上で４８時間繁殖させた。この方法では、サイトカイン（ＩＮＦ－γ）を産生した細胞の数を正確に特定することができる。培養後、プレートを細胞から洗浄し、製造者の指示（ＭＡＢｔｅｃｈ社）に従ってプレートを染色した。ＥＬＩＳＰＯＴプレートリーダー（Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ ５，ＣＴＬ）で読み取りを行った。
Ｔｅｆｆリンパ球（レスポンダー）とＴｒｅｇリンパ球の共培養を、特殊なＥＬＩＳｐｏｔプレート上で４８時間繁殖させた。この方法では、サイトカイン（ＩＮＦ－γ）を産生した細胞の数を正確に特定することができる。培養後、プレートを細胞から洗浄し、製造者の指示（ＭＡＢｔｅｃｈ社）に従ってプレートを染色した。ＥＬＩＳＰＯＴプレートリーダー（Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ ５，ＣＴＬ）で読み取りを行った。
【0038】
結果
抗原、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ１５４抗体を提示した単球で刺激して抗原特異的Ｔ制御細胞を得る効果
自己の抗原提示単球によって生成されたＴｒｅｇｓ、すなわち抗原特異的制御Ｔ細胞の割合を解析したところ、抗ＣＤ２８抗体および抗ＣＤ１５４抗体を添加した共培養では、特にインスリンとの共培養でこれらの細胞の増殖が高くなることがわかった（ｔ－ｔｅｓｔによる抗体なし／抗体添加ありの差：インスリン ｐ＝０．０４１、ペプチド９－２３ ｐ＝０．０４４）。（図３Ａ）。
自己抗原提示単球から発生したＴｒｅｇｓの増殖に対する使用したペプチドの効果を比較したところ、提示したペプチド９－２３は、抗ＣＤ２８抗体および抗ＣＤ１５４抗体を使用しない培養において、インスリンと比較してＴｒｅｇｓの割合を有意に増加させた（ｔ－ｔｅｓｔ ｐ＝０．０３２）。また、抗ＣＤ２８抗体および抗ＣＤ１５４抗体を用いて共培養した場合、増殖したＴｒｅｇリンパ球の割合は両群で同程度であった（ｔ－ｔｅｓｔ ｐ＝０．５４）。
抗原、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ１５４抗体を提示した単球で刺激して抗原特異的Ｔ制御細胞を得る効果
自己の抗原提示単球によって生成されたＴｒｅｇｓ、すなわち抗原特異的制御Ｔ細胞の割合を解析したところ、抗ＣＤ２８抗体および抗ＣＤ１５４抗体を添加した共培養では、特にインスリンとの共培養でこれらの細胞の増殖が高くなることがわかった（ｔ－ｔｅｓｔによる抗体なし／抗体添加ありの差：インスリン ｐ＝０．０４１、ペプチド９－２３ ｐ＝０．０４４）。（図３Ａ）。
自己抗原提示単球から発生したＴｒｅｇｓの増殖に対する使用したペプチドの効果を比較したところ、提示したペプチド９－２３は、抗ＣＤ２８抗体および抗ＣＤ１５４抗体を使用しない培養において、インスリンと比較してＴｒｅｇｓの割合を有意に増加させた（ｔ－ｔｅｓｔ ｐ＝０．０３２）。また、抗ＣＤ２８抗体および抗ＣＤ１５４抗体を用いて共培養した場合、増殖したＴｒｅｇリンパ球の割合は両群で同程度であった（ｔ－ｔｅｓｔ ｐ＝０．５４）。
【0039】
ドットプロットの例と解析方法を図３Ｃ、３Ｄに示す。
単球提示抗原、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ１５４抗体で刺激した抗原特異的Ｔ制御リンパ球によるＦｏｘＰ３転写因子の発現
実験全体を通してすべての培養で、ＦｏｘＰ３を発現しているリンパ球の割合が９０％以下になることはなかった。
単球提示抗原、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ１５４抗体で刺激した抗原特異的Ｔ制御リンパ球によるＦｏｘＰ３転写因子の発現
実験全体を通してすべての培養で、ＦｏｘＰ３を発現しているリンパ球の割合が９０％以下になることはなかった。
【0040】
自己抗原提示単球によって刺激されたＦｏｘＰ３転写因子の高発現を示すＴｒｅｇ細胞（すなわち、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７－ＦｏｘＰ３ｈｉｇｈ表現型）の割合は、抗原特異的／増殖的な集団では、対応する非特異的／非増殖的なＴｒｅｇリンパ球に比べて有意に高かった（すべてのｔ－ｔｅｓｔ ｐ＜０．０５）（図３Ｂ－Ｄ）。
ＦｏｘＰ３転写因子の高発現を示すＴｒｅｇ細胞の割合は、抗ＣＤ２８抗体および抗ＣＤ１５４抗体を添加した共培養では、抗原特異的／増殖性Ｔｒｅｇ細胞（抗体なし／ありのｔ－ｔｅｓｔの差異：インスリン ｐ＝０．００２、ペプチド９－２３ ｐ＝０．０４２）、非特異的／非増殖性Ｔｒｅｇリンパ球の場合（抗体なし／ありのｔ－ｔｅｓｔの差異：インスリンｐ＝０．０３４、ペプチド９－２３の傾向のみｐ＝０．０６３）と同様であった。
ＦｏｘＰ３転写因子の高発現を示すＴｒｅｇ細胞の割合は、抗ＣＤ２８抗体および抗ＣＤ１５４抗体を添加した共培養では、抗原特異的／増殖性Ｔｒｅｇ細胞（抗体なし／ありのｔ－ｔｅｓｔの差異：インスリン ｐ＝０．００２、ペプチド９－２３ ｐ＝０．０４２）、非特異的／非増殖性Ｔｒｅｇリンパ球の場合（抗体なし／ありのｔ－ｔｅｓｔの差異：インスリンｐ＝０．０３４、ペプチド９－２３の傾向のみｐ＝０．０６３）と同様であった。
【0041】
Ｔｒｅｇｓリンパ球のＴＣＲのレパートリーに基づくクローン性の解析
抗原特異的／増殖中のＴｒｅｇリンパ球集団におけるＴＣＲレシーバーのクローン性の変化を分析したところ、各培養において、毎回異なるＴＣＲβ特異性を持つ１－２個のクローンの割合が増加していた。とはいえ、これらの増加は、全増殖細胞の数十パーセントを超えるものではない（図４）。
抗原特異的／増殖中のＴｒｅｇリンパ球集団におけるＴＣＲレシーバーのクローン性の変化を分析したところ、各培養において、毎回異なるＴＣＲβ特異性を持つ１－２個のクローンの割合が増加していた。とはいえ、これらの増加は、全増殖細胞の数十パーセントを超えるものではない（図４）。
【0042】
機能性試験－Ｔエフェクターリンパ球の増殖の抑制
増殖抑制アッセイで免疫反応を分析したところ、調べたすべてのＴｒｅｇリンパ球亜集団の抑制効果が確認された（ＡＮＯＶＡ，ｐ＜０．０５）（図５）。
増殖抑制アッセイで免疫反応を分析したところ、調べたすべてのＴｒｅｇリンパ球亜集団の抑制効果が確認された（ＡＮＯＶＡ，ｐ＜０．０５）（図５）。
【0043】
ペプチドの有効性
比較解析の結果、ペプチド９－２３に対する特異的Ｔｒｅｇｓは、インスリンに対する特異的Ｔｒｅｇｓと比較して、実験で阻害されたレスポンダーがポリクローナルエフェクターＴ細胞の場合（ＡＮＯＶＡ，Ｆ＝８．０３ ｐ＝０．０４７）（図５Ａ）、試験抗原に特異的なエフェクターＴ細胞の場合（ＡＮＯＶＡ，Ｆ＝２０．４０ ｐ＝０．０４５）（図５Ｂ）、統計的に有意に高いパフォーマンスを示した。
比較解析の結果、ペプチド９－２３に対する特異的Ｔｒｅｇｓは、インスリンに対する特異的Ｔｒｅｇｓと比較して、実験で阻害されたレスポンダーがポリクローナルエフェクターＴ細胞の場合（ＡＮＯＶＡ，Ｆ＝８．０３ ｐ＝０．０４７）（図５Ａ）、試験抗原に特異的なエフェクターＴ細胞の場合（ＡＮＯＶＡ，Ｆ＝２０．４０ ｐ＝０．０４５）（図５Ｂ）、統計的に有意に高いパフォーマンスを示した。
【0044】
ポリクローナル 対 特異的
増殖抑制効果は、ポリクローナルＴｒｅｇｓに比べて特異的Ｔｒｅｇｓを用いた試験で高かったが、いずれの試験でも統計的有意性は認められなかった（ＡＮＯＶＡ，ｐ＜０．０５）。
増殖抑制効果は、ポリクローナルＴｒｅｇｓに比べて特異的Ｔｒｅｇｓを用いた試験で高かったが、いずれの試験でも統計的有意性は認められなかった（ＡＮＯＶＡ，ｐ＜０．０５）。
【0045】
それにもかかわらず、試験における抑制効果には、主に特異的Ｔｒｅｇｓ成分が関与していることが示される。特異的Ｔｒｅｇｓ（増殖中）と非特異的Ｔｒｅｇｓ（非増殖中）を分離したところ、特異的Ｔｒｅｇｓは非特異的Ｔｒｅｇｓと比較して有意に多くのＴエフェクター細胞の反応を抑制した。この有意性は、レスポンダーがポリクローナルエフェクターＴ細胞である両方のテストに関係していた（ペプチド９－２３でのみ有意。ＡＮＯＶＡ，Ｆ＝８．２１ ｐ＝０．０２８，インスリンの場合。ＡＮＯＶＡ，Ｆ＝１．３１ ｐ＝０．３３）、および特異的なＴエフェクターリンパ球（ペプチド９－２３の場合。ＡＮＯＶＡ，Ｆ＝１８６．３２ ｐ＝０．００５，インスリンの場合。ＡＮＯＶＡ，Ｆ＝２２．４７ ｐ＝０．０４１）。
【0046】
機能性試験－インターフェロン分泌抑制作用
インターフェロンガンマ抑制アッセイで免疫反応を分析すると、調べたすべてのＴｒｅｇｓリンパ球亜集団の抑制作用が確認された（ＡＮＯＶＡ，ｐ＜０．０５）（図６および図７）。
インターフェロンガンマ抑制アッセイで免疫反応を分析すると、調べたすべてのＴｒｅｇｓリンパ球亜集団の抑制作用が確認された（ＡＮＯＶＡ，ｐ＜０．０５）（図６および図７）。
【0047】
ペプチドの有効性
比較分析の結果、ポリクローナルＴエフェクター細胞を用いた実験では、９－２３ペプチド特異的Ｔｒｅｇｓが完全インスリン特異的Ｔｒｅｇｓよりも高い性能を示した（ＡＮＯＶＡ，Ｆ＝５．７８ ｐ＝０．０２５）（図６Ａおよび７）。実験で抑制されたレスポンダーがテストされた抗原に対する特異的なＴエフェクター細胞であった場合も同様の差が見られたが、その差は統計的に有意ではなかった（ＡＮＯＶＡ，Ｆ＝１．８６ ｐ＝０．２２）（図６Ｂおよび７）。
比較分析の結果、ポリクローナルＴエフェクター細胞を用いた実験では、９－２３ペプチド特異的Ｔｒｅｇｓが完全インスリン特異的Ｔｒｅｇｓよりも高い性能を示した（ＡＮＯＶＡ，Ｆ＝５．７８ ｐ＝０．０２５）（図６Ａおよび７）。実験で抑制されたレスポンダーがテストされた抗原に対する特異的なＴエフェクター細胞であった場合も同様の差が見られたが、その差は統計的に有意ではなかった（ＡＮＯＶＡ，Ｆ＝１．８６ ｐ＝０．２２）（図６Ｂおよび７）。
【0048】
ポリクローナル 対 特異的
反応阻害効率は、ポリクローナルなものに比べて特異的なＴｒｅｇｓを用いた試験で高かったが、いずれの試験でも統計的有意性は認められなかった（ＡＮＯＶＡ，ｐ＜０．０５）。
反応阻害効率は、ポリクローナルなものに比べて特異的なＴｒｅｇｓを用いた試験で高かったが、いずれの試験でも統計的有意性は認められなかった（ＡＮＯＶＡ，ｐ＜０．０５）。
【0049】
しかし、ペプチド９－２３刺激の場合は、主に特異的Ｔｒｅｇｓ成分がアッセイにおける抑制効果に関与していることが示された。特異的Ｔｒｅｇｓ（増殖）と非特異的Ｔｒｅｇｓ（非増殖）を分離した後、９－２３ペプチドに対する特異的Ｔｒｅｇｓは、非特異的Ｔｒｅｇｓと比較して統計的に有意にＴエフェクター細胞の反応を抑制することが示された。この有意性は、ポリクローナルＴエフェクター細胞を反応対象とした試験（ＡＮＯＶＡ，Ｆ＝５．３ ｐ＝０．０３１）と、９－２３ペプチドに対する特異的Ｔエフェクターを反応対象とした試験（ＡＮＯＶＡ，Ｆ＝１１１．８４ ｐ＝０．０００４）の両方に関係している。
【0050】
また、インスリンに特異的なエフェクターＴ細胞が応答した場合、非特異的Ｔ細胞と比較して、インスリン特異的Ｔ細胞の方が強い抑制効果が認められた。この効果の統計的有意性は、一部の実験とポストホック分析でのみ認められたが、全体的な分析では統計的に有意でないことが判明した（ＡＮＯＶＡ，Ｆ＝０．３１ ｐ＝０．５６）。また、ポリクローナル・レスポンダーに対するインスリン特異的Ｔｒｅｇｓと非特異的Ｔｒｅｇｓの間には差がなかった（ＡＮＯＶＡ，Ｆ＝０．０００４ ｐ＝０．９４）。
【0051】
議論
この記事の主題は、抗原特異的Ｔ調節細胞をインビトロで得る方法であり、多発性硬化症、関節リウマチ、１型糖尿病などの自己免疫疾患の治療や、移植拒絶反応、アレルギー反応、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）などの望ましくない免疫反応の抑制に、これらの細胞を臨床的に使用することができる。今日、治療に使用されるＴ制御細胞はポリクローナルであり、つまり、多くの異なる抗原を認識するため、その有効性が制限される可能性がある（Ｍａｒｅｋ－Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋａ Ｎ ２０１４）（Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋｉ Ｐ ２０１３）（Ｍａｒｅｋ－Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋａ Ｎ ２０１３）（Ｍａｒｅｋ－Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋａ Ｎ ２０１２）（Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｐ ２００９）（Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋｉ Ｐ ２００９）（Ｄｉ Ｉａｎｎｉ Ｍ ２０１１）（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ ＪＡ ２０１５）（Ｓｔｅｌｍａｓｚｃｚｙｋ－Ｅｍｍｅｌ Ａ ２０１５）（Ｖｉｇｎａｌｉ ＤＡ ２００８）（Ｇｅｅｍ Ｄ ２０１５）。この方法により、Ｔｒｅｇリンパ球を特定の抗原を発現している組織や、特定の抗原に対する炎症反応を担う特定の自己反応性リンパ球に対してターゲティングすることができる。抗原特異的Ｔｒｅｇリンパ球を使用することで、より正確な治療が可能になり、Ｔｒｅｇリンパ球の投与量を減らすことができる。その結果、治療効果を高め、起こりうる副作用を軽減することができる。
この記事の主題は、抗原特異的Ｔ調節細胞をインビトロで得る方法であり、多発性硬化症、関節リウマチ、１型糖尿病などの自己免疫疾患の治療や、移植拒絶反応、アレルギー反応、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）などの望ましくない免疫反応の抑制に、これらの細胞を臨床的に使用することができる。今日、治療に使用されるＴ制御細胞はポリクローナルであり、つまり、多くの異なる抗原を認識するため、その有効性が制限される可能性がある（Ｍａｒｅｋ－Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋａ Ｎ ２０１４）（Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋｉ Ｐ ２０１３）（Ｍａｒｅｋ－Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋａ Ｎ ２０１３）（Ｍａｒｅｋ－Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋａ Ｎ ２０１２）（Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｐ ２００９）（Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋｉ Ｐ ２００９）（Ｄｉ Ｉａｎｎｉ Ｍ ２０１１）（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ ＪＡ ２０１５）（Ｓｔｅｌｍａｓｚｃｚｙｋ－Ｅｍｍｅｌ Ａ ２０１５）（Ｖｉｇｎａｌｉ ＤＡ ２００８）（Ｇｅｅｍ Ｄ ２０１５）。この方法により、Ｔｒｅｇリンパ球を特定の抗原を発現している組織や、特定の抗原に対する炎症反応を担う特定の自己反応性リンパ球に対してターゲティングすることができる。抗原特異的Ｔｒｅｇリンパ球を使用することで、より正確な治療が可能になり、Ｔｒｅｇリンパ球の投与量を減らすことができる。その結果、治療効果を高め、起こりうる副作用を軽減することができる。
【0052】
このような抗原特異的Ｔｒｅｇリンパ球の有用性は動物モデルで説明されており、数年前にはヒトでこのような細胞を入手する最初の試みが行われた。当初は、誘導型Ｔｒｅｇリンパ球やＴｒ１細胞を用いていたが、その後、自然型Ｔｒｅｇリンパ球を用いるようになった。Ｔｒｅｇｓの場合は、天然の抗原提示細胞や、特定の抗原を提示する細胞株から適切に調製された細胞を用いる方法が基本となっている。最近では、制御受容体を挿入した遺伝子を改変して、特定の抗原に特異的なリンパ球を人工的に作ることも試みられている（いわゆるＴｒｅｇ ＣＡＲリンパ球）。
【0053】
免疫反応を抗原特異的に制御する可能性は、治療上の観点からも重要である。生理学的には、免疫系は外来の危険な抗原を認識して破壊する一方で、自分自身の織りなすものには寛容である。それにもかかわらず、例えば多発性硬化症（ＭＳ）、１型糖尿病（ＤＭ１）、乾癬、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）などの自己免疫疾患の場合、このメカニズムが損なわれる（Ｓｅｎｅｃａｌ Ｖ ２０１５）（Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋｉ Ｐ ２０１５）（Ｍａｒｅｋ－Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋａ Ｎ ２０１２）（Ｐｕｊｏｌ－Ａｕｔｏｎｅｌｌ Ｉ ２０１３）（Ｌｉｍａ ＸＴ ２０１５）（Ｍｕ Ｑ ２０１５）（Ｏｒｅｎｔ Ｗ ２０１５）。エフェクターリンパ球は、自分の組織を構築する自己抗原を異物として扱い、自分の臓器を破壊し始める。このプロセスは不可逆的な変化をもたらす。現在、自己免疫疾患の治療は、薬理学的な免疫抑制と炎症反応の抑制に還元されることがほとんどである。しかし、このような治療は、時間が経つにつれて効果がなくなることがわかっている。初期の改善にもかかわらず、病気の進行を完全に止めることはできず、その中断は通常、病気の増悪を伴うことになる。また、この治療は、免疫力の大幅な低下を伴う（Ｇｕｐｔａ Ｓ ２０１２）。そのため、患者は感染症にかかりやすくなり、免疫抑制剤を投与される患者では、健康な人よりも重篤な経過をたどることになる。非特異的な免疫抑制は、がん発症のリスクを高めることにもなる（免疫抑制剤を投与されている患者さんでは症例の割合が高い）（Ａｎｄｒｅｓ Ａ ２００５）（Ｒａｍａ Ｉ ２０１０）。
【0054】
免疫反応の抗原特異的制御は、移植学の観点からも重要な課題である。臓器移植は通常、命を救う治療法であるが、強力な免疫抑制剤を常に服用する必要がある。治療を中断すると、移植された臓器の組織に対する免疫反応が増大し、短時間で破壊される。免疫抑制剤の使用は、自己免疫疾患の場合と同様に、重篤で望ましくない副作用の発生を伴う。また、このグループの薬剤の中には、患者の免疫系の破壊的な作用から移植臓器を保護するものの、同時に移植臓器や他の組織に毒性を及ぼすものもある。ここでの例としては、腎移植に使用されるカルシニューリンの阻害剤（シクロスポリン、タクロリムス）（Ｐｒｏｋａｉ Ａ１ ２０１５）や、膵島のレシピエントに使用されるラパマイシンは、移植細胞の作用を損なう（Ｚｈａｎｇ Ｎ１ ２００６）（Ｂｅｒｎｅｙ Ｔ ２００９）などが挙げられる。また、免疫抑制と免疫反応の調節の問題は、骨髄移植と密接に関係する。臓器移植と骨髄移植の主な違いは、前者では移植された臓器をレシピエントの免疫系の破壊的な影響から守ろうとする医学であり、後者では移植拒絶のリスクはないが、この移植された骨髄がレシピエントの体を攻撃する細胞の源となり、彼の死につながる可能性があるということである（Ｄｉ Ｉａｎｎｉ Ｍ ２０１１）（Ｚｈａｏ Ｋ ２０１５）。患者の体を攻撃する免疫系細胞の起源にかかわらず、過剰な免疫反応との戦いは、非特異的な免疫抑制剤の使用にも還元される。同種固体臓器移植と骨髄造血細胞のいずれの場合も、免疫系反応を刺激する同種抗原が厳密に定義されており、その作用は抗原特異的Ｔｒｅｇリンパ球によって制御することができる。
【0055】
本研究では、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として抗原を負荷した単球を用いて、インビトロで抗原特異的Ｔ調節細胞をすべてのポリクローナルＴレグから分離する。発表した実験の全体像を図１に示す。
【0056】
ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７表現型のポリクローナルＴｒｅｇ細胞は、特異的な抗原（例えば、インスリンやペプチド９－２３インスリンβ鎖）を提示した自己のガンマ線照射単球と一緒に培養され、単球が提示した抗原に特異性を持つ場合にのみ増殖する。
【0057】
抗原の多くはＴｒｅｇリンパ球に親和性がない（これらの細胞はアネルギーを持っている）か、刺激中に表現型が変化して制御特性が失われる可能性がある。そのため、特定のＴｒｅｇ細胞を増殖させ、一方でその制御特性や抑制特性を維持するためには、どのような条件で共培養を行うかが重要となる。抗ＣＤ２８抗体と抗ＣＤ１５４抗体を共培養液に添加すると、この２つの条件が満たされ、Ｔｒｅｇ細胞に不足していたセカンドシグナルがもたらされた。抗ＣＤ２８抗体と抗ＣＤ１５４抗体の存在下で、提示された抗原に特異的なＴｒｅｇリンパ球は、ＦｏｘＰ３因子の発現（この因子の発現を増加させることさえあった）と機能的抑制の活性として定義される安定性を失うことなく、増殖の開始が見られた（図５－７）。
【0058】
純粋な抗原特異的Ｔｒｅｇｅｎｅリンパ球集団の選別は、ＦＡＣＳセルソーターを用いて行った。ソーティングは、実験室条件（Ａｒｉａ ＩＩｕ ｓｏｒｔｅｒ，ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）または先進的な治療製品の製造を認めるクリーンな実験室条件（ＩＮＦＬＵＸ ｓｏｒｔｅｒ ｑｕａｌｉｆｉｅｄ ｆｏｒ ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ － ＧＭＰ）で実施した。ソートは、ポリクローナルＴｒｅｇリンパ球をあらかじめ蛍光色素（ＣＦＳＥまたはバイオレット）で染色しておくことで可能となった。存在する抗原に反応して増殖するＴｒｅｇ細胞、すなわち抗原特異的Ｔｒｅｇｓは、蛍光強度の希釈／消失が始まり、その後の細胞分裂ごとに約半分に減少する。このような蛍光の変化に基づいて、低蛍光性の増殖性細胞（抗原特異的Ｔｒｅｇリンパ球）と高蛍光性の非増殖性細胞（非特異的Ｔｒｅｇリンパ球）を分離・選別することができる（図２）。このようにして選別された細胞は、さらに増殖させて機能試験に用いることができる。
【0059】
この方法では、ＦｏｘＰ３転写因子の発現により制御細胞の表現型が維持され、機能的アッセイにおける活性（増殖抑制およびインターフェロンγ産生抑制）が開始時のポリクローナルＴ細胞集団の活性よりも高い抗原特異的Ｔｒｅｇリンパ球を得ることができる。
【0060】
今回得られた結果は、得られた特異的な細胞の高いクローン性を示すものではないことを強調しておきたい。ＴＣＲレパートリーの解析では、特定のクラスのＴＣＲ受容体を発現するＴｒｅｇリンパ球の割合が有意に増加することはなかった（図５）。
【0061】
抗原特異的Ｔｒｅｇリンパ球がポリクローナルＴｒｅｇリンパ球と比較して優れたサプレッサー特性を持つのは、ＦｏｘＰ３（フォックスＰ３Ｈｉｇｈ）の高発現によるものと考えられる。ＦｏｘＰ３細胞の免疫調節活性は、ＦｏｘＰ３因子の発現強度と正の相関があることから、ＦｏｘＰ３Ｈｉｇｈ細胞が最も活性の高いサプレッサーＴｒｅｇ細胞の画分であることはよく知られる（Ｍａｒｅｋ Ｎ ２０１１）（Ｒｙｂａ Ｍ ２０１１）。抗原特異性によりＦｏｘＰＨｉｇｈ３細胞が高い割合で誘導されるという事実は、このような細胞を用いた治療の有効性が高いことを説明する。この細胞は、特定の抗原でのみ活性化され、その作用はその抗原が発現している組織に限定されるようである。機能試験では、Ｔｒｅｇ細胞が増殖やＴエフェクターリンパ球によるインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）の産生に及ぼす影響を分析した。その結果、抗原特異的Ｔｒｅｇリンパ球は、ポリクローナルＴｒｅｇリンパ球と比較して、Ｔｅｆリンパ球の増殖およびＩＦＮ－γの産生を阻害する傾向があることがわかった（図５－７）。この抑制は、ポリクローナルＴｒｅｇリンパ球（図５ａ、６ａ、７）と、試験に使用したＴｒｅｇｓと同じ抗原を持つ抗原特異的Ｔｒｅｇリンパ球（図５ｂ、６ｂ、７）の両方に見られる。このシステムは、抗原特異的なＴｅｆｆリンパ球（自己反応性リンパ球）が主に自己免疫過程や臓器拒絶反応における組織の破壊に関与しているという、疾患中の生体内の状況を示唆しているため、特に重要である。
【0062】
私たちが作った抗原特異的Ｔｒｅｇｓリンパ球が、特異的なリンパ球を抑制することができるということは、治療効果に大きな影響を与えるはずである。
【0063】
備考
この方法では、抗原特異的なＴ制御細胞を作り出すことができる。プロトコルに使用される単球は、特定の抗原を搭載する。抗ＣＤ２８抗体と抗ＣＤ１５４抗体の組み合わせを用いて、抗原を添加した自己単球で刺激した抗原特異的Ｔｒｅｇリンパ球の増殖を活性化する。
この方法では、抗原特異的なＴ制御細胞を作り出すことができる。プロトコルに使用される単球は、特定の抗原を搭載する。抗ＣＤ２８抗体と抗ＣＤ１５４抗体の組み合わせを用いて、抗原を添加した自己単球で刺激した抗原特異的Ｔｒｅｇリンパ球の増殖を活性化する。
【0064】
著者の貢献
ＤＩ－Ｇ、ＭＧ、およびＰＴが論文を執筆した。ＰＴは、実験の設計と計画を行った。ＤＩ－Ｇ、ＭＧ、およびＰＴが実験を行い、分析した。
ＤＩ－Ｇ、ＭＧ、およびＰＴが論文を執筆した。ＰＴは、実験の設計と計画を行った。ＤＩ－Ｇ、ＭＧ、およびＰＴが実験を行い、分析した。
【0065】
資金調達
本研究は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｐｏｌａｎｄ：ＬＩＤＥＲ／１６０／Ｌ－６／１４／ＮＣＢＲ／２０１５およびＳＴＲＡＴＥＧＭＥＤ１／２３３３６８／１／ＮＣＢＲ／２０１４、ポーランドインフラクチャープログラムの省庁ＰＯＩＲ．０１．０１．０１－００－０７６９／１５－０１ ｆｏｒ ＰｏｌＴｒｅｇ Ｓ．Ａ．からの支援を受領する。
本研究は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｐｏｌａｎｄ：ＬＩＤＥＲ／１６０／Ｌ－６／１４／ＮＣＢＲ／２０１５およびＳＴＲＡＴＥＧＭＥＤ１／２３３３６８／１／ＮＣＢＲ／２０１４、ポーランドインフラクチャープログラムの省庁ＰＯＩＲ．０１．０１．０１－００－０７６９／１５－０１ ｆｏｒ ＰｏｌＴｒｅｇ Ｓ．Ａ．からの支援を受領する。
【0066】
略語
Ａ ＦＡＣＴＴ（ａ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｎｅｔｗｏｒｋ ａｃｔｉｏｎ ｔｏ ｆｏｃｕｓ ａｎｄ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）；Ａｇ（抗原）；ＡＰＣ（抗原提示細胞）；ＣＦＳＥ（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ）；ＣＯＳＴ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）；ＥＬＩＳｐｏｔ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ；ＩＦＮ－γ（インターフェロンγ）；ＩＮＳ（インスリン）；Ｍｏ（単球）；ＮＯＮ（非増殖性（非特異的））；ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）；ＰＯＬＹ（ポリクローナル）；ｐ／ｓ（ペニシリン－ストレプトマイシン）；ＰＲＯ（増殖性（抗原特異的））；Ｔｒｅｇｓ（Ｔ制御細胞）；Ｔｅｆｆｓ（Ｔエフェクター細胞（応答者））；Ｔ１Ｄ（１型糖尿病）。
Ａ ＦＡＣＴＴ（ａ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｎｅｔｗｏｒｋ ａｃｔｉｏｎ ｔｏ ｆｏｃｕｓ ａｎｄ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）；Ａｇ（抗原）；ＡＰＣ（抗原提示細胞）；ＣＦＳＥ（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ）；ＣＯＳＴ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）；ＥＬＩＳｐｏｔ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ；ＩＦＮ－γ（インターフェロンγ）；ＩＮＳ（インスリン）；Ｍｏ（単球）；ＮＯＮ（非増殖性（非特異的））；ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）；ＰＯＬＹ（ポリクローナル）；ｐ／ｓ（ペニシリン－ストレプトマイシン）；ＰＲＯ（増殖性（抗原特異的））；Ｔｒｅｇｓ（Ｔ制御細胞）；Ｔｅｆｆｓ（Ｔエフェクター細胞（応答者））；Ｔ１Ｄ（１型糖尿病）。
【0067】
参考文献
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】