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特許7569576クモ糸タンパク質を光合成細菌にて発現させるためのヌクレオチド構築物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-09
(45)【発行日】2024-10-18
(54)【発明の名称】クモ糸タンパク質を光合成細菌にて発現させるためのヌクレオチド構築物
(51)【国際特許分類】
C12N 15/74 20060101AFI20241010BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241010BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20241010BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20241010BHJP
【ＦＩ】
C12N15/74 Z ZNA
C12N1/21
C12P21/02 C
C12N15/12
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2023097595
(22)【出願日】2023-06-14
(62)【分割の表示】P 2019551207の分割
【原出願日】2018-10-24
(65)【公開番号】P2023116685
(43)【公開日】2023-08-22
【審査請求日】2023-07-14
(31)【優先権主張番号】62/577,373
(32)【優先日】2017-10-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】P 2017219141
(32)【優先日】2017-11-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２９年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、革新的研究開発推進プログラム事業「バイオ高分子を高効率に生産する光合成細菌の開発」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】503359821
【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110001047
【氏名又は名称】弁理士法人セントクレスト国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】沼田 圭司
(72)【発明者】
【氏名】フーン チューン ピン
【審査官】三谷 直也
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１５／１４６１９５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１７／０３３６５２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１０－５３８６１６（ＪＰ，Ａ）
【文献】立山晃，研究最前線－クモの糸に学び、構造タンパク質をつくる，ＲＩＫＥＮ ＮＥＷＳ，理化学研究所，2016年，423，pp. 4-7
【文献】KATSIOU, E. et al.，Microbiol. Res.，1998年，153，pp. 189-204
【文献】松永是，海洋性光合成原核生物のバイオテクノロジー，化学と生物，1989年，27 (8)，pp. 513-520
【文献】TOKAREVA, O. et al.，Microbial Biotechnology，2013年，6 (6)，pp. 651-663
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
Ｇｏｏｇｌｅ／Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
光合成細菌においてタンパク質発現を誘導し得るプロモーターに機能的に連結された、クモ糸タンパク質をコードするヌクレオチドを含み、前記光合成細菌が紅色光合成細菌であり、
前記プロモーターがＴａｃ１プロモーターであり、
前記クモ糸タンパク質がスピドロインタンパク質であり、かつ
前記光合成細菌において前記クモ糸タンパク質を発現させるための、ヌクレオチド構築物。
【請求項2】
請求項１に記載のヌクレオチド構築物が導入された、紅色光合成細菌。
【請求項3】
請求項２に記載の紅色光合成細菌を、光照射下において培養する工程と、前記培養にて得られた紅色光合成細菌の培養物から、前記クモ糸タンパク質を回収する工程とを、含む、前記クモ糸タンパク質を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、クモ糸タンパク質を光合成細菌にて発現させるためのヌクレオチド構築物に関する。また本発明は、該構築物を含む光合成細菌、及び該光合成細菌を用いたクモ糸タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
クモは、異なる７種類の糸繊維を目的に応じて産生する。７種の糸繊維は、異なる７つの腺（大瓶状腺（主管足瓶嚢腺）、小瓶状腺、鞭状腺、ブドウ状腺、梨状腺、集合腺、管状腺）から各々抽出される。
【0003】
クモ糸繊維の主成分はタンパク質であり、その主な構造として、高度に保存された３つのドメインを有する。アラニンリッチ領域（結晶領域、ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ）及びグリシンリッチ領域（非結晶領域、ｌｅｓｓ－ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ）が、交互に配置されているコアドメインと、その両側にある非反復型のアミノ末端ドメインとカルボキシル末端ドメインである。そして、このような構造を採ることにより、ランダムコイル構造、βシート構造及びヘリックス構造を有し、これら構造の混在により、クモ糸繊維は優れた特性を発揮する。
【0004】
例えば、クモ糸繊維は、抗張力及び伸張性といった材料特性において傑出している。さらに、鉄及びケブラー（登録商標）よりも靭性において優れ、クモ糸繊維は、天然ポリマー及び人工ポリマーにおいて、最も強靭な材料であることも知られている。その上、生分解性、生物的適合性及び抗菌性も有しているため、ドラッグデリバリー及びティッシュエンジニアリングといった生物医学的応用においても有用である。このように、クモ糸繊維は、多種多様な分野おいて、今後有望なスーパーマテリアルとして注目されている。
【0005】
しかしながら、クモは共食いや縄張り争いを行なうため、クモ糸タンパク質の大規模生産は、異種宿主においてしか達成することができず、例えば、組み換えクモ糸タンパク質の発現は、細菌、酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、昆虫（カイコ Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）、植物（タバコ及びジャガイモ）及び動物（マウス及びヤギ）において成功したことが報告されている（非特許文献１及び２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【文献】Ｔｅｕｌe，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２０１２年、１０９（３）：９２３－９２８
【文献】Ｔｏｋａｒｅｖａ，Ｏ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１３年、６（６）： ６５１－６６３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、合成コストを抑えてクモ糸タンパク質を製造することを、可能とすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、クモ糸タンパク質を製造する宿主として、上記酵母、昆虫、植物及び動物といった従属栄養生物の代わりに、光合成独立栄養生物を用いることを構想した。当該生物は、環境中から得られる二酸化炭素等及び光を用いることによって、給餌を必要とすることなく、維持することができるため、この生物をクモ糸タンパク質の製造に利用することができれば、合成コストを低くすることが可能となる。
【0009】
そこで、本発明者らは、ジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来大瓶状腺縦糸タンパク質１（ＭａＳｐ１）における反復配列（以下「単量体」とも称する）を、海洋性紅色非硫黄光合成細菌（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）において発現させることを試みた。より具体的には、先ず、前記単量体を１個含むＭａＳｐ１単量体タンパク質、又は前記単量体を複数含むＭａＳｐ１多量体タンパク質をコードするプラスミドベクターを大腸菌にてクローニングし、そして、前記光合成細菌に接合伝達により導入した。
【0010】
その結果、前記光合成細菌におけるＭａＳｐ１単量体タンパク質の発現を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより検出することができた。また同様に、ＭａＳｐ１多量体タンパク質もウエスタンブロッティングにより検出することができ、本発明を完成するに至った。
【0011】
すなわち、本発明は、クモ糸タンパク質を発現させるためのヌクレオチド構築物、該構築物を含む光合成細菌、及び該光合成細菌を用いたクモ糸タンパク質の製造方法に関し、より具体的には以下を提供する。
＜１＞ 光合成細菌においてタンパク質発現を誘導し得るプロモーターに機能的に連結された、クモ糸タンパク質をコードするヌクレオチドを含む、ヌクレオチド構築物。
＜２＞ 前記光合成細菌が紅色光合成細菌である、＜１＞に記載のヌクレオチド構築物。
＜３＞ 前記プロモーターがＴａｃ１プロモーターである、＜１＞又は＜２＞に記載のヌクレオチド構築物。
＜４＞ 前記クモ糸タンパク質がＭａＳｐ１タンパク質である、＜１＞～＜３＞のいずれか１項に記載のヌクレオチド構築物。
＜５＞ ＜１＞～＜４＞のいずれか１項に記載のヌクレオチド構築物が導入された、光合成細菌。
＜６＞ クモ糸タンパク質を製造する方法であって、
＜５＞に記載の光合成細菌を、光照射下において培養する工程と、
前記培養にて得られた光合成細菌の培養物から、クモ糸タンパク質を回収する工程とを、含む方法。
＜１＞ 光合成細菌においてタンパク質発現を誘導し得るプロモーターに機能的に連結された、クモ糸タンパク質をコードするヌクレオチドを含む、ヌクレオチド構築物。
＜２＞ 前記光合成細菌が紅色光合成細菌である、＜１＞に記載のヌクレオチド構築物。
＜３＞ 前記プロモーターがＴａｃ１プロモーターである、＜１＞又は＜２＞に記載のヌクレオチド構築物。
＜４＞ 前記クモ糸タンパク質がＭａＳｐ１タンパク質である、＜１＞～＜３＞のいずれか１項に記載のヌクレオチド構築物。
＜５＞ ＜１＞～＜４＞のいずれか１項に記載のヌクレオチド構築物が導入された、光合成細菌。
＜６＞ クモ糸タンパク質を製造する方法であって、
＜５＞に記載の光合成細菌を、光照射下において培養する工程と、
前記培養にて得られた光合成細菌の培養物から、クモ糸タンパク質を回収する工程とを、含む方法。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、宿主に給餌することなく、クモ糸タンパク質を製造することができるため、合成コストを抑えることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】細菌間接合伝達により、クモ糸タンパク質（ＭａＳＰ１タンパク質）を、光合成細菌においてＨｉｓタグ等と融合させて発現させるためのプラスミドＤＮＡの概略を示す、図である。
【図3】Ｈｉｓタグ等が融合してあるＭａＳＰ１単量体タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡを導入した光合成細菌（ＩＰＴＧによる発現誘導：１～４日間、及び非誘導）のタンパク質溶解液を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにて解析した結果を示すゲルの写真である。図中、「Ｍ」は、ＥＣＬ低レンジレインボー分子量マーカーを泳動したレーンを示し、「ＦＴ１」～「ＦＴ５」は、前記タンパク質溶解液をＨｉｓＴｒａｐＨＰカラムに結合させた後、得られたフロースルー１～５を各々泳動したレーンを示し、「ＨＰ」は前記タンパク質溶解液をＨｉｓＴｒａｐＨＰカラムにより精製し、さらに濃縮したものを、泳動したレーンを示す。また、矢印は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上の、Ｈｉｓタグ等が融合してあるＭａＳＰ１単量体タンパク質のサイズ又は位置を示す。
【図4】光合成細菌及び大腸菌に、Ｈｉｓタグ等が融合してあるＭａＳＰ１単量体タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡを導入し、これら細菌のタンパク質溶解液を、ウエスタンブロッティングにて解析した結果を示すＰＶＤＦメンブレンの写真である。図中、「Ｍ」は、ＥＣＬ低レンジレインボー分子量マーカーを泳動したレーンを示し、「ＨＰ」は前記プラスミドＤＮＡを導入した光合成細菌（ＩＰＴＧによる発現誘導：１～４日間、及び非誘導）のタンパク質溶解液をＨｉｓＴｒａｐＨＰカラムにより精製し、さらに濃縮したものを、泳動したレーンを示し、「１」は前記プラスミドＤＮＡを導入した光合成細菌（ＩＰＴＧによる発現誘導：３日間）のタンパク質溶解液を泳動したレーンを示し、「２」は前記プラスミドＤＮＡを導入した大腸菌（ＩＰＴＧによる発現誘導：４時間）のタンパク質溶解液を泳動したレーンを示し、「３」は前記プラスミドＤＮＡを導入した大腸菌（ＩＰＴＧによる発現誘導：２４時間）のタンパク質溶解液を泳動したレーンを示す。また、矢印は、ＰＶＤＦメンブレン上の、Ｈｉｓタグ等が融合してあるＭａＳＰ１単量体タンパク質のサイズ又は位置を示す。
【発明を実施するための形態】
【0014】
（ヌクレオチド構築物）
本発明のヌクレオチド構築物は、光合成細菌においてタンパク質発現を誘導し得るプロモーターに機能的に連結された、クモ糸タンパク質をコードするヌクレオチドを含むことを特徴とする。
本発明のヌクレオチド構築物は、光合成細菌においてタンパク質発現を誘導し得るプロモーターに機能的に連結された、クモ糸タンパク質をコードするヌクレオチドを含むことを特徴とする。
【0015】
本発明における「クモ」とは、クモ目に分類される動物、好ましくは造網性のクモ目に分類される動物であり、さらに好ましくはジョロウグモ、オニグモであり、より好ましくはジョロウグモである。
【0016】
「クモの糸」又は「クモ糸」は、クモ絹糸とも言われ、クモの体内の絹糸腺で産生され、腹部後部にある出糸突起（糸疣）の出糸管より吐糸される。クモの体内の絹糸腺はその形から梨状腺、ブドウ状腺、瓶状腺、管状腺、集合腺及び鞭状腺に分けられる。「クモ絹糸」は、一般に、その機能及び成分から、牽引糸（別名：しおり糸、ひき糸）、わく糸、縦糸、横糸及びけい留糸等に分けられる。
【0017】
本発明のヌクレオチド構築物がコードする「クモ糸タンパク質」は、クモ糸を構成するタンパク質のみならず、クモ糸を構成するタンパク質の特徴を有するタンパク質（類似タンパク質）のことである。天然のクモ糸タンパク質と全く同じ配列である必要はなく、人工的に改変されたタンパク質であっても良いが、本発明にかかる「クモ糸タンパク質」は、βシート構造を形成するアラニンリッチ領域（結晶領域）とランダムコイル構造の形成に関与するグリシンリッチ領域（非結晶領域）とが交互に配置された構造を含むタンパク質であることが好ましい。
【0018】
クモ糸タンパク質の例として、代表的には、スピドロインタンパク質が挙げられる。スピドロインタンパク質は、フィブロインとも言われ、天然のクモの大瓶状腺等で紡糸され、主にスピドロインＩ（ＭａＳｐ１）とスピドロインII（ＭａＳｐ２）とが挙げられる。スピドロイン関連タンパク質等のアミノ酸配列として、典型的には、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）に収録されている、下記表１～４において示されるアクセッション番号に記載のポリペプチドが挙げられる。
【0019】
【表1】
【0020】
【表2】
【0021】
【表3】
【0022】
【表4】
【0023】
なお、タンパク質をコードする遺伝子の配列は、自然界において変異し、それに伴い、当該タンパク質のアミノ酸配列も変化し得る。したがって、本発明にかかる「クモ糸タンパク質」には、表１～４に示す典型的な配列に特定されたタンパク質（野生型クモ糸タンパク質）のみならず、天然に変異した配列からなるタンパク質（野生型クモ糸タンパク質の相同体、野生型クモ糸タンパク質の天然変異体）も含まれるものであることは理解されたい。
【0024】
また、本発明にかかる「クモ糸タンパク質」は、このような天然に存在するタンパク質（野生型クモ糸タンパク質、野生型クモ糸タンパク質の相同体、及びそれらの天然変異体）のみならず、上述のとおり、アミノ酸配列が人工的に改変されたもの（クモ糸タンパク質改変体）であってもよい。
【0025】
また「クモ糸タンパク質」は、全長のみならず、その部分的な断片であってもよい。「部分的な断片」としては特に制限はなく、例えば、アラニンリッチ領域及びグリシンリッチ領域が交互に配置された構造を含む反復単位（単量体）、その反復単位が繰り返してなるコアドメイン、そのコアドメインの両端に位置する非反復型ドメイン（非反復型アミノ末端ドメイン、非反復型カルボキシル末端ドメイン）が挙げられるが、好ましくは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる、ＭａＳｐ１単量体タンパク質が挙げられる（なお、当該単量体タンパク質は、アクセッション番号：Ｐ１９８３７にて特定されるＭａＳｐ１タンパク質に由来する）。また、後述の実施例において示すとおり、クモ糸タンパク質として、前記単量体タンパク質を１個含むタンパク質（例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）も好適に用いられる。さらに、前記単量体タンパク質を複数含む、ＭａＳｐ１多量体タンパク質も好適に用いられる。かかる多量体タンパク質として、前記単量体タンパク質を２個含む場合は、例えば、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられ、前記単量体タンパク質を３個含む場合は、例えば、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられ、前記単量体タンパク質を６個含む場合は、例えば、配列番号：５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
【0026】
本発明にかかる「クモ糸タンパク質」は、前記典型的なアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質も含まれる。ここで「複数」とは、特に制限はないが、通常２～６０個、好ましくは２～５０個、より好ましくは２～４０個、さらに好ましくは２～３０個、より好ましくは２～２０個、さらに好ましくは２～１０個（例えば、２～８個、２～４個、２個）である。
【0027】
また、本発明にかかる「クモ糸タンパク質」は、前記典型的なアミノ酸配列との相同性が、５０％以上（例えば、６０％以上、７０％以上）であることが好ましく、８０％以上（例えば、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上）であることがより好ましく、９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）であることがより好ましい。配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸レベル）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０，１９９０）を利用して決定することができる。かかるプログラムを用いた解析方法の具体的な手法は公知であり、デフォルトのパラメーターを用いて解析することができる。また、本発明にかかる「相同性」には、「同一性」及び「類似性」が含まれる。
【0028】
また、本発明にかかるヌクレオチド構築物がコードする「クモ糸タンパク質」には、「他のタンパク質」が直接又は間接的に付加されていてもよい。「他のタンパク質」としては特に制限はなく、本発明にかかるクモ糸タンパク質の精製を容易にする目的の場合には、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ（ｔａｇ）タンパク質、ＦＬＡＧ－タグタンパク質（登録商標、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、Ｓタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等の精製用タグタンパク質が好適に用いられ、また本発明にかかるクモ糸タンパク質の検出を容易とする目的の場合には、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の化学発光タンパク質等の検出用タグタンパク質が好適に用いられる。また、これら他のタンパク質とクモ糸タンパク質とを分離するために、トロンビン認識配列、エンテロキナーゼ認識配列等の切断酵素によって認識される配列が、クモ糸タンパク質と他のタンパク質との間に配置されていてもよい。
【0029】
かかる他のタンパク質が付加されたクモ糸タンパク質としては、特に制限はないが、後述の光合成細菌における発現効率がより良いという観点から、配列番号；７又は８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましい。なお、配列番号；７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質においては、Ｎ末から順に、Ｈｉｓタグ、トロンビン認識配列、Ｓタグ及びエンテロキナーゼ認識配列からなるタグタンパク質（配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）、並びに配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるＭａＳｐ１単量体タンパク質が配置されているタンパク質である、また、配列番号；８に記載のアミノ酸配列は、配列番号；７に記載のアミノ酸配列から、トロンビン認識配列及びＳタグ直後のプロリン残基が除外されたものとなっている（詳細については、下記表５を参照）。
【0030】
【表5】
【0031】
また、後述の実施例において示すとおり、他のタンパク質が付加されたクモ糸タンパク質として、Ｎ末から、配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と、配列番号：３、４又は５に記載のアミノ酸配列からなるＭａＳｐ１多量体タンパク質が配置されているタンパク質も、本発明において好適に用いられる。
【0032】
本発明のヌクレオチド構築物は、上述のクモ糸タンパク質をコードするヌクレオチドに機能的に連結されることにより、光合成細菌において当該タンパク質の発現を誘導し得る「プロモーター」を少なくとも含む必要がある。かかる「プロモーター」としては、特に制限はなく、例えば、Ｔａｃ１プロモーター（典型的には、配列番号：１４に記載のヌクレオチド配列からなるプロモーター）、ｌａｃプロモーター（典型的には、配列番号：１５に記載のヌクレオチド配列からなるプロモーター）、ｐｕｆプロモーター（典型的には、配列番号：１６に記載のヌクレオチド配列からなるプロモーター）が挙げられるが、光合成細菌における発現効率がより良いという観点から、Ｔａｃ１プロモーターが好ましい。また、プロモーターは、誘導性プロモーターであってもよく、例えば、温度、ｐＨ、ホルモン、代謝物（例えば、ラクトース、マンニトール及びアミノ酸）、光、浸透ポテンシャル（例えば、塩誘導）、重金属又は抗生物質によって誘導されるものが挙げられる。
【0033】
なお、本発明にかかる「プロモーター」は、前記典型的なヌクレオチド配列において１又は複数のヌクレオチドが置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたヌクレオチド配列からなるタンパク質も含まれる。ここで「複数」とは、特に制限はないが、通常２～２０個、好ましくは２～１５個、より好ましくは２～１０個（例えば、２～９個、２～８個、２～７個、２～６個）、さらに好ましくは２～５個（例えば、２～４個、２～３個、２個）である。
【0034】
また、本発明にかかる「プロモーター」は、前記典型的なヌクレオチド配列との相同性が、５０％以上（例えば、６０％以上、７０％以上）であることが好ましく、８０％以上（例えば、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上）であることがより好ましく、９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）であることがより好ましい。配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＮのプログラムを利用して決定することができる。かかるプログラムを用いた解析方法の具体的な手法は公知であり、デフォルトのパラメーターを用いて解析することができる。
【0035】
さらに、本発明のヌクレオチド構築物は、前記プロモーターの他、クモ糸タンパク質をコードするヌクレオチドを光合成細菌にて発現（転写及び翻訳）するのに寄与する他の制御配列、例えば、複製開始点、ターミネーター、ポリＡ付加シグナル、ポリリンカー、エンハンサー、サイレンサー、リボゾーム結合部位等を適宜含むことができる。一般に、前記プロモーターの下流に、クモ糸タンパク質をコードするヌクレオチドが位置し、さらに該遺伝子の下流にターミネーターが位置する。
【0036】
さらに、前記発現を制御する配列以外に発現を誘導する配列を含んでいても良い。かかる発現を誘導する配列としては、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により、下流に配置された遺伝子の発現を誘導することのできるラクトースオペロンが挙げられる。
【0037】
また、光合成細菌に接合伝達法によって導入される場合、本発明のヌクレオチド構築物は、ｍｏｂ、ｔｒａ、ｏｒｉＴ及びｏｒｉＶ遺伝子群から選択される少なくとも１の遺伝子を含むものであることが望ましい。なお、これら遺伝子は細菌間の接合伝達に必要な遺伝子であるが、全て同じヌクレオチド構築物上になくても良く、別のヌクレオチド構築物（ヘルパープラスミドＤＮＡ等）に分配し、それを併用することによって接合伝達を行うことができる。
【0038】
さらに、本発明のヌクレオチド構築物は、その発現を指標として形質転換された光合成細菌を選択できるという観点から、マーカー遺伝子を含むものであってもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β－ガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子等の酵素遺伝子（レポーター遺伝子）が挙げられる。
【0039】
また、このようなヌクレオチド構築物の形態としては、例えば、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等のクローニングベクターが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではないが、プラスミドＤＮＡが好ましく、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、ｐＫＴ２３０、ｐＢＨＲ１等の広域宿主プラスミドＤＮＡがより好ましい。
【0040】
本発明のヌクレオチド構築物調製の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。例えば、本発明のヌクレオチド構築物を調製するには、後述の実施例において示すように、クモ糸タンパク質、また必要に応じて前記他のタンパク質もコードするヌクレオチドを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入して連結する方法等が採用される。
【0041】
また、このようにして挿入されるクモ糸タンパク質等をコードするヌクレオチドは、宿主細胞での発現量を上げるためにコドンの使用頻度を宿主細胞に合わせて最適化することが好ましい。かかるコドンの最適化は公知の方法で行うことができる。また、当該最適化には、使用頻度の高いコドンへの同義置換のみならず、使用頻度の低いいコドン（レアコドン）の削除も含まれる。さらに、本発明において、コドンの使用頻度を合わせる対象となる宿主細胞は、通常、光合成細菌となるが、後述の接合伝達法を用いる場合には、レシピエントとなる光合成細菌のみならず、ドナーとなる細菌（後述の実施例における、大腸菌）に合わせてコドンの使用頻度を最適化しても良い。
【0042】
（光合成細菌の形質転換体）
本発明は、上述のヌクレオチド構築物が導入された光合成細菌を提供する。
本発明は、上述のヌクレオチド構築物が導入された光合成細菌を提供する。
【0043】
本発明において、「光合成細菌」とは、光合成を行える細菌であればよく、酸素非発生型光合成細菌であってもよく、また酸素発生型光合成細菌（藍色細菌）であってもよい。酸素非発生型光合成細菌としては、紅色細菌（紅色非硫黄細菌、紅色硫黄細菌）、緑色細菌（緑色非硫黄細菌、緑色硫黄細菌）、ヘリオバクテリアが挙げられるが、好気性条件下でも生存可能であるため、扱い易く、メンテナンスが容易であるという観点から、好ましくは紅色細菌であり、さらに、好気的で暗所又は嫌気的で明所な条件下でも増殖でき、より扱い易く、メンテナンスが容易であるという観点から、また海水等の高塩度の条件下における培養となるため、培養中のクロスコンタミネーションも最小限に抑えることがし易いという観点からも、より好まししくは紅色非硫黄細菌である。より具体的に、本発明にかかる「光合成細菌」の好適な例として、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ （Ａｆｉｆｅｌｌａ） ｍａｒｉｎａ、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｅｕｒｙｈａｌｉｎｕｍ、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｉｍｈｏｆｆｉｉ、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｔｅｓｑｕｉｃｏｌａ、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｖｉｓａｋｈａｐａｔｎａｍｅｎｓｅ、Ｒｏｓｅｏｓｐｉｒａ ｍａｒｉｎａ、Ｒｏｓｅｏｓｐｉｒａ ｇｏｅｎｓｉｓ、Ｒｏｓｅｏｓｐｉｒａ ｖｉｓａｋｈａｐａｔｎａｍｅｎｓｉｓが、挙げられる。
【0044】
かかる光合成細菌へのヌクレオチド構築物導入方法（形質転換法）としては、特に制限はなく、例えば、接合伝達法、ペプチドを用いた導入法、エレクトロポレーション法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、スフェロプラスト法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポソーム（カチオン性、膜融合性、ｐＨ感受性等）を用いた方法が挙げられる。
【0045】
また、かかる方法により光合成細菌が形質転換されたかどうかは、クモ糸タンパク質をコードするヌクレオチドを、ＰＣＲやシークエンシング等により検出することにより、また当該タンパク質を免疫学的手法（ウエスタンブロッティング等）により検出することにより確認することができる。さらに、本発明のヌクレオチド構築物が、上記マーカー遺伝子を含むものである場合には、そのマーカーに応じた選択条件下にて培養することにより、確認することもできる。
【0046】
（クモ糸タンパク質の製造方法）
本発明のクモ糸タンパク質製造方法は、
本発明の光合成細菌を、光照射下において培養する工程と、
前記培養にて得られた光合成細菌の培養物から、クモ糸タンパク質を回収する工程とを、含むことを特徴とする。
本発明のクモ糸タンパク質製造方法は、
本発明の光合成細菌を、光照射下において培養する工程と、
前記培養にて得られた光合成細菌の培養物から、クモ糸タンパク質を回収する工程とを、含むことを特徴とする。
【0047】
本発明にかかる培養工程において、光合成細菌に照射する光としては、当該細菌が吸収し得る波長の光であれば良く、例えば、紅色光合成細菌であれば、波長６２０ｎｍ以上の赤色光（波長：～７００ｎｍ、例えば６５０～７００ｎｍ、具体的には６８０ｎｍ）、遠赤色光（波長：７００～８００ｎｍ、例えば７００～７５０ｎｍ、具体的には７３０ｎｍ）が好適に用いられる。また、他の波長の光が混合した光（例えば、白色光）であってもよい。さらに、放射照度としても特に制限はなく、通常、１０～５０Ｗｍ－２である。また、かかる光照射は、発光ダイオード（ＬＥＤ）、レーザー光源、蛍光ランプ等の人工光源、又は自然光源（太陽光）を利用することによって行なうことができる。
【0048】
光合成細菌の培養に用いる培地としては特に制限はなく、各光合成に必要な条件（有機物、硫化水素及び水等の水素供与体、炭素源）が揃っていればよく、光合成細菌が海洋性のものである場合には、海水成分の培地（例えば、マリンアガー、マリンブロス、海水（滅菌海洋水等）そのもの）が好適に用いられる。
【0049】
なお、本発明の方法は、大腸菌の発現系等と比べ、無機塩等の極めて安価な原料にて培養することが可能である。例えば、大腸菌の培養で通常用いられるグルコース、フルクトース、グルコン酸等の炭素源の代わりに、本発明においては、二酸化炭素や炭酸塩等の無機炭素原料を用いて培養することが可能である。さらに、酵母エキスやペプトンなどの有機窒素原料の代わりに、本発明においては、窒素、アンモニア、アンモニウム塩、硝酸塩、亜硝酸塩等の無機窒素原料で培養することも可能である。
【0050】
また、他の条件として、半好気性（半嫌気性）条件下、嫌気性条件下で培養することが好ましく、培養温度は、通常１５～３７℃であり、好ましくは２５～３５℃である。培養時間としては、特に制限はなく、用いるヌクレオチド構築物、光合成細菌及び導入法の種類、並びにクモ糸タンパク質の製造の程度により、適宜調整され得るが、通常１日～３０日であり、好ましくは２日～１０日、より好ましくは３日～７日である。
【0051】
また、このように培養して得られる光合成細菌の「培養物」とは、本発明において、増殖した光合成細菌のみならず、培養することによって得られる、前記細菌の分泌産物及び該光合成細菌の代謝産物等を含有する培地のことであり、それらの希釈物、濃縮物を含む。
【0052】
このような光合成細菌の培養物からのクモ糸タンパク質の回収についても、特に制限はなく、公知の回収、精製方法を用いて行うことができ、例えば、光合成細菌を溶解又は機械的に破壊することによって回収することができる。クモ糸タンパク質が分泌されている場合に、培地を回収することによって得ることができる。得られたタンパク質は、標準的な手順を用いて精製することができる。所望の場合、前記回収物を遠心分離にかけて、適切な画分（沈殿物又は上清）を収集することができる。また、クモ糸タンパク質をさらに精製するために、ゲルろ過クロマトグラフィー、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、透析法、相分離又は濾過に供することができる。さらにまた、クモ糸タンパク質に精製用タグタンパク質を付加させて光合成細菌に付加させている場合には、そのタグに応じたアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製することができる。
【0053】
なお、本発明の方法において、上述のとおり、夾雑タンパク質のない無機塩原料のみで培養することが可能である。したがって、大腸菌等の他の宿主細胞よりも、本発明の方法は、タンパク質精製における煩雑な工程を簡素化できる。
【実施例】
【0054】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。本実施例において、以下の材料及び方法を用い、光合成細菌におけるクモ糸タンパク質の発現を試みた。
【0055】
なお、本実施例において発現を試みたクモ糸タンパク質は、クモ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅ）のＭａＳｐ１における反復配列（単量体）、その二量体、三量体及び六量体を各々含むタンパク質である（以下、これらタンパク質を「ＭａＳｐ１タンパク質」とも総称する）。また、これらＭａＳｐ１タンパク質のＮ末には、Ｈｉｓタグ、トロンビン認識配列、Ｓタグ及びエンテロキナーゼ認識配列からなるタグタンパク質（配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）を融合させ、光合成細菌における発現を試みた（以下、前記タグタンパク質を融合させたタンパク質を、「融合ＭａＳｐ１タンパク質」とも総称する）。下記表６に、各ＭａＳｐ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号）、並びに各融合ＭａＳｐ１タンパク質のアミノ酸数及び分子量を示す。
【0056】
【表6】
【0057】
（細菌株及び培養条件）
海洋性紅色非硫黄光合成細菌 Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＤＳＭ１３７４／ＡＴＣＣ３５８８６は、理化学研究所 微生物材料開発室（ＪＣＭ）より入手した。Ｒｄｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍは、マリンアガー又はリンブロス（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ社製，ＵＳＡ）にて、３０℃、半好気条件、遠赤色光の連続照射下（７３０ｎｍ，３０Ｗｍ－２）にて培養（維持）した。
海洋性紅色非硫黄光合成細菌 Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＤＳＭ１３７４／ＡＴＣＣ３５８８６は、理化学研究所 微生物材料開発室（ＪＣＭ）より入手した。Ｒｄｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍは、マリンアガー又はリンブロス（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ社製，ＵＳＡ）にて、３０℃、半好気条件、遠赤色光の連続照射下（７３０ｎｍ，３０Ｗｍ－２）にて培養（維持）した。
【0058】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ＴａＫａＲａ社製，Ｊａｐａｎ）を、Ｌｙｓｏｇｅｎｙ ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）アガー又はＬＢブロス（ＢＤ ＤｉｆｃｏＬＢ社製，ＵＳＡ）にて、３７℃、好気条件、１８０ｒｐｍにて振とう培養しながら維持し、ジェネラルクローニングに供した。
【0059】
Ｒｄｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍへのプラスミド接合伝達を行なうため、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７－１（Ｓｉｍｏｎ，Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９８３年、１（９）：７８４－７９１．）を、ドナー株として用い、ＬＢアガー又はＬＢブロス（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ社製，ＵＳＡ）にて、３７℃、好気条件、１８０ｒｐｍにて振とう培養しながら維持した。
【0060】
（プラスミド構築及びＲｄｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍへの接合伝達）
全てのＰＣＲ増幅は、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製，Ｊａｐａｎ）を用いて行なった。また、前述のＭａＳｐ１タンパク質を各々コードし、Ｅ．ｃｏｌｉのコドンに最適化したＤＮＡを、Ｈｉｓタグ、Ｓタグ、トロンビン認識配列及びエンテロキナーゼ認識配列（配列番号：６に記載のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡと共に、ｐＥＴ３０－ａ－ＭａＳｐ１（Ｎｕｍａｔａ，Ｋ．ら、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、２０１０年、６２（１５）：１４９７－１５０８ 参照）から、下記表７に示すプライマー（配列番号：１１～１３）を用いて増幅した。また、当該表において、Ｔａｃ１プロモーターを、該プロモーターを有するプラスミドを鋳型として増幅するために用いたプライマー（配列番号：９及び１０）も併せて示す。
全てのＰＣＲ増幅は、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製，Ｊａｐａｎ）を用いて行なった。また、前述のＭａＳｐ１タンパク質を各々コードし、Ｅ．ｃｏｌｉのコドンに最適化したＤＮＡを、Ｈｉｓタグ、Ｓタグ、トロンビン認識配列及びエンテロキナーゼ認識配列（配列番号：６に記載のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡと共に、ｐＥＴ３０－ａ－ＭａＳｐ１（Ｎｕｍａｔａ，Ｋ．ら、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、２０１０年、６２（１５）：１４９７－１５０８ 参照）から、下記表７に示すプライマー（配列番号：１１～１３）を用いて増幅した。また、当該表において、Ｔａｃ１プロモーターを、該プロモーターを有するプラスミドを鋳型として増幅するために用いたプライマー（配列番号：９及び１０）も併せて示す。
【0061】
【表7】
【0062】
なお、表７において、下線を引いた箇所は、制限酵素認識配列を示す。また太字にて記載した箇所は、リボソーム結合配列（ＲＢＳ）を示す。
【0063】
ＴａｃＩプロモーター及びＭａＳｐ１遺伝子配列は、対応する制限酵素にて処理して精製した後、宿主ベクター ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２（Ｋｏｖａｃｈ，Ｍ．Ｅ．ら、Ｇｅｎｅ、１９９５年、１６６（１）： １７５－１７６ 参照）に挿入した（図１及び２ 参照）。
【0064】
組み換えプラスミドを保持するＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７－１（ドナー）とＲｄｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（レシピエント）との細菌間接合伝達は、以下に記載の方法に沿って行なった。
【0065】
先ず、組み換えプラスミドを保持するＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７－１を、５０μｇｍＬ－１カナマイシン含有５ｍＬ ＬＢ培地に接種し、３７℃、１８０ｒｐｍにて、１６時間の振とう培養を行なった。一方、Ｒｄｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍを、１５ｍＬ マリンブロスに接種し、３０℃、半好気性条件下、遠赤色光の連続照射下（７３０ｎｍ，３０Ｗｍ－２）にて、３０時間培養した。
【0066】
両細菌培養物を、１２，０００ｒｐｍ、３分間の遠心処理に供した後、新しい培養液に再懸濁した（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７－１はＬＢブロスに、Ｒｄｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍはマリンブロスに再懸濁した）。
【0067】
そして、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７－１及びＲｄｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍの細胞懸濁液を１：１にて混合した。得られた細菌混合液 約２００μＬを、マリンアガープレートに染み込ませ、遠赤色光の連続照射下（７３０ｎｍ，３０Ｗｍ－２）にて、１日培養した。その後、細胞をアガーから削り取り、新しいマリンブロス５ｍＬに再懸濁した。
【0068】
得られた細胞懸濁液 約１００μＬを、１００μｇｍＬ－１カナマイシン及び１００μｇｍＬ－１亜テルル酸カリウム含有シモンズクエン酸アガーに播いた。そのアガープレートを、３０℃にて、遠赤色光の連続照射下（７３０ｎｍ，３０Ｗｍ－２）にて、７日間培養した。
【0069】
なお、接合完了体が得られたことは、コロニーＰＣＲ、制限酵素処理及びＤＮＡシークエンシングにて確認した。
【0070】
（融合ＭａＳｐ１タンパク質の発現）
Ｅ．ｃｏｌｉのコドンに最適化したＮｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ由来のＭａＳｐ１遺伝子を含むｐＥＴ３０プラスミドが導入された、組み換えＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＴａＫａＲａ社製，Ｊａｐａｎ）を、３７℃、５０μｇｍＬ－１カナマイシン含有ＬＢブロスにて、振とう（１８０ｒｐｍ）させながら、ＯＤ６００（培養液の濁度）が約１．０に達する迄培養した。その後、１ｍＭ イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、培養温度を３０℃に変更して４時間又は２４時間培養することにより、ＭａＳｐ１タンパク質の発現を誘導した。
Ｅ．ｃｏｌｉのコドンに最適化したＮｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ由来のＭａＳｐ１遺伝子を含むｐＥＴ３０プラスミドが導入された、組み換えＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＴａＫａＲａ社製，Ｊａｐａｎ）を、３７℃、５０μｇｍＬ－１カナマイシン含有ＬＢブロスにて、振とう（１８０ｒｐｍ）させながら、ＯＤ６００（培養液の濁度）が約１．０に達する迄培養した。その後、１ｍＭ イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、培養温度を３０℃に変更して４時間又は２４時間培養することにより、ＭａＳｐ１タンパク質の発現を誘導した。
【0071】
Ｅ．ｃｏｌｉのコドンに最適化したＮｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ由来のＭａＳｐ１遺伝子を導入した組み換えＲｄｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍを、３０℃、１００μｇｍＬ－１カナマイシン含有マリンブロスにて、半好気性条件、遠赤色光の連続照射下（７３０ｎｍ，３０Ｗｍ－２）にて、ＯＤ６００が約１．５に達する迄、培養した。その後、融合ＭａＳｐ１タンパク質の発現誘導を、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、１日、２日、３日及び４日培養することにより行った。また、前記ＯＤ６００が約１．５に達した後、ＩＰＴＧ非存在下でも更に４日間培養した。
【0072】
（タンパク質溶解液の調製）
前記ＩＰＴＧ誘導後又はＩＰＴＧ非誘導下での培養後、４℃にて、９，０００ｇ、１０分間の遠心処理に供し、細菌を回収した。湿重量１ｇの細菌ペレットを、５ｍＬの変性バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，８Ｍ 尿素及び１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ７）に添加して再懸濁した。さらに、細胞懸濁液を、４℃にて一晩攪拌し、９，０００ｇ、３０分間、４℃の遠心処理に供した。そして、上清（タンパク質溶解液）を回収した。
前記ＩＰＴＧ誘導後又はＩＰＴＧ非誘導下での培養後、４℃にて、９，０００ｇ、１０分間の遠心処理に供し、細菌を回収した。湿重量１ｇの細菌ペレットを、５ｍＬの変性バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，８Ｍ 尿素及び１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ７）に添加して再懸濁した。さらに、細胞懸濁液を、４℃にて一晩攪拌し、９，０００ｇ、３０分間、４℃の遠心処理に供した。そして、上清（タンパク質溶解液）を回収した。
【0073】
（ＨｉｓＴｒａｐ精製及び濃縮）
タンパク質溶解液（ＩＰＴＧ誘導下又は非誘導下にて１～４日間培養）をまとめた上で（約５５０ｍＬ培養液に相当）、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ １ ｍＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製，ＵＳＡ）を用い、そのメーカープロトコールに沿って精製した。
タンパク質溶解液（ＩＰＴＧ誘導下又は非誘導下にて１～４日間培養）をまとめた上で（約５５０ｍＬ培養液に相当）、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ １ ｍＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製，ＵＳＡ）を用い、そのメーカープロトコールに沿って精製した。
【0074】
精製に際して、結合バッファー（８Ｍ 尿素，０．５Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ リン酸バッファー，５ｍＭイミダゾール，ｐＨ７．４）及び抽出バッファー（８Ｍ 尿素，０．５Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ リン酸バッファー，５００ｍＭイミダゾール，ｐＨ７．４）を、０．２２μｍセルロースアセテートフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製，ＵＳＡ）にてろ過した。
【0075】
ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ １ ｍＬカラム、結合バッファー及び抽出バッファーを用いて、得られた精製物は、Ｖｉｖａｓｐｉｎ ６ ＭＷＣＯ ３０００タンパク質濃縮スピンカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製，ＵＳＡ）を用いて濃縮した。
【0076】
なお、６×ヒスチジン残基（Ｈｉｓタグ）がＮ末に融合されている、融合ＭａＳｐ１タンパク質は、ＨｉｓＴｒａｐカラムへの結合能を有するため、前記処理により精製、濃縮されることとなる。
【0077】
（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ））
前記にて調製したサンプル（タンパク質溶液、ＨｉｓＴｒａｐによる濃縮後のタンパク質溶液等）を、１６．５％プレキャストＴｒｉｓ－トリシンゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製，ＵＳＡ）を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥに、２時間供した。そして、ゲルに、固定バッファー（２５％エタノール及び１５％ホルムアルデヒド）を３０分間染み込ませた後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）－Ｒ２５０による染色に１時間供した。得られた結果を図３に示す。
前記にて調製したサンプル（タンパク質溶液、ＨｉｓＴｒａｐによる濃縮後のタンパク質溶液等）を、１６．５％プレキャストＴｒｉｓ－トリシンゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製，ＵＳＡ）を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥに、２時間供した。そして、ゲルに、固定バッファー（２５％エタノール及び１５％ホルムアルデヒド）を３０分間染み込ませた後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）－Ｒ２５０による染色に１時間供した。得られた結果を図３に示す。
【0078】
（ウエスタンブロッティング）
前記ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供したゲルからフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレン（０．２μｍ孔サイズ）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製，ＵＳＡ）に、セミドライブロッター（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製，ＵＳＡ）を用い、タンパク質を電気泳動転写した。
前記ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供したゲルからフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレン（０．２μｍ孔サイズ）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製，ＵＳＡ）に、セミドライブロッター（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製，ＵＳＡ）を用い、タンパク質を電気泳動転写した。
【0079】
ＰＶＤＦメンブレンにおける、Ｈｉｓタグを含む融合ＭａＳｐ１単量体タンパク質の検出は、Ｈｉｓタグ（登録商標）ウエスタン試薬プロトコール（Ｎｏｖａｇｅｎ社製，ＵＳＡ）に沿って、抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体及びＡＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを用い、ＨｉｓタグＡＰウエスタン試薬による比色検出法により行った。得られた結果を図４に示す。また、融合ＭａＳｐ１タンパク質の検出は、前記プロトコールに沿って、抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体及びＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製，ＵＳＡ）、並びにＮｏｖｅｘ（登録商標）ＥＣＬ化学発光基質試薬キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製，ＵＳＡ）を用い、化学発光検出法によっても行った。得られた結果を図５に示す。
【0080】
（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析）
前記ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供したゲルから、目的とするバンドを切り出し、液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）によって分析し、アミノ酸配列を同定した。なお、ＬＣ－ＭＳデータについては、ＭＡＳＣＯＴプログラムにより、処理及び探索を行なった。
前記ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供したゲルから、目的とするバンドを切り出し、液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）によって分析し、アミノ酸配列を同定した。なお、ＬＣ－ＭＳデータについては、ＭＡＳＣＯＴプログラムにより、処理及び探索を行なった。
【0081】
図３に示した結果から明らかなように、細菌間接合伝達法を用い、融合ＭａＳｐ１単量体タンパク質をコードするベクターの海洋性紅色非硫黄光合成細菌 Ｒｄｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍへの導入を試みた結果、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて、前記タンパク質の分子量相当の位置に、強いバンドが検出された（図３のレーンＨＰ 参照）。さらに、図４に示した結果から明らかなように、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウエスタンブロッティングにおいて、同位置にＭａＳｐ１単量体タンパク質に融合させたＨｉｓタグが検出された（図４のレーンＨＰ 参照）。また、図５に示した結果から明らかなように、ＭａＳｐ１単量体タンパク質のみならず、二量体タンパク質、三量体タンパク質及び六量体タンパク質のいずれについても検出することができた。なお、融合ＭａＳｐ１単量体タンパク質については、検出されたタンパク質が当該単量体タンパク質であることを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によって確認した。
【0082】
したがって、光合成細菌においてＭａＳｐ１タンパク質（クモ糸タンパク質）を発現させることができるということが、明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【0083】
以上説明したように、本発明によれば、クモ糸タンパク質の製造の場となる光合成細菌は、給餌を必要とすることなく維持、増殖させることができるため、その合成コストを低く抑えられることが可能となる。
【0084】
クモ糸タンパク質は、上述のとおり、抗張力、伸張性、靭性といった材料特性において傑出している。そのため、例えば、防弾衣、パラシュート、自動車の車体等の高い耐衝撃性が必要な材料の製造、開発において利用できる。さらに、生分解性、生物的適合性及び抗菌性も有しているため、クモ糸タンパク質は、創傷閉止材、縫合糸、絆創膏、再生医療用の足場材料等の医療材料の製造、開発においても利用できる。
【0085】
したがって、かかるクモ糸タンパク質をその合成コストを抑えて提供することができる本発明は、工業分野、医療分野等の様々な分野において極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【0086】
配列番号：２～８
＜２２３＞ 人工的に合成されたポリペプチドの配列
配列番号：９～１３
＜２２３＞ 人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号：１４～１６
＜２２３＞ 人工的に合成されたプロモーターの配列
＜２２３＞ 人工的に合成されたポリペプチドの配列
配列番号：９～１３
＜２２３＞ 人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号：１４～１６
＜２２３＞ 人工的に合成されたプロモーターの配列
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】