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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-09
(45)【発行日】2024-10-18
(54)【発明の名称】１，３－プロパンジオールおよび酪酸の生産が改善された微生物
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20241010BHJP
C12P 7/52 20060101ALI20241010BHJP
C12P 7/18 20060101ALI20241010BHJP
C12N 9/12 20060101ALN20241010BHJP
C12N 9/02 20060101ALN20241010BHJP
C12N 15/53 20060101ALN20241010BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20241010BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12P7/52
C12P7/18
C12N9/12
C12N9/02
C12N15/53
C12N15/54
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2021507069
(86)(22)【出願日】2019-08-09
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-12-09
(86)【国際出願番号】 EP2019071392
(87)【国際公開番号】W WO2020030775
(87)【国際公開日】2020-02-13
【審査請求日】2022-08-01
(31)【優先権主張番号】18306099.5
(32)【優先日】2018-08-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】505311917
【氏名又は名称】メタボリック エクスプローラー
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(72)【発明者】
【氏名】ワンダ、ディシェール
(72)【発明者】
【氏名】セリーヌ、レイノー
(72)【発明者】
【氏名】ロランス、デュモン－セニョベル
(72)【発明者】
【氏名】ナデージュ、デュムーラン
【審査官】井関 めぐみ
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１３－５４５４６１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００６－５１２９０７（ＪＰ，Ａ）
【文献】Gonzalez-Pajuelo M et al.，“Microbial conversion of glycerol to 1,3-propanediol: physiological comparison of a natural producer, Clostridium butyricum VPI 3266, and an engineered strain, Clostridium acetobutylicum DG1(pSPD5).”，Applied and environmental microbiology，2006年01月，Vol. 72, No. 1，p.96-101
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／２１
Ｃ１２Ｐ ７／５２
Ｃ１２Ｐ ７／１８
Ｃ１２Ｎ ９／１２
Ｃ１２Ｎ ９／０２
Ｃ１２Ｎ １５／５３
Ｃ１２Ｎ １５／５４
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
クロストリジウム・ブチリカム由来のｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２およびｄｈａＴ遺伝子を発現し、かつ、非変異株と比較して減弱されたグリセロールキナーゼ活性を含んでなり、前記グリセロールキナーゼが、配列番号２で表される遺伝子配列を有するＣ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の遺伝子座ＣＡ＿Ｃ１３２１の遺伝子ｇｌｐＫによりコードされており、それが以下の突然変異：ａ．Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６２４６１～１４６２４６３番のヌクレオチド位置における、３４７番のアミノ酸アラニンをトレオニンに置換させるためのコドンの突然変異、
ｂ．Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６１４８６～１４６１４８８番のヌクレオチド位置における、２２番のアミノ酸ヒスチジンをチロシンに置換させるためのコドンの突然変異、
ｃ．Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６２８１８～１４６２８２０番のヌクレオチド位置における、４６６番のアミノ酸バリンをメチオニンに置換させるためのコドンの突然変異を含み、かつ
水素デヒドロゲナーゼ活性をコードするｈｙｄＡ遺伝子において、非変異タンパク質と比較して、変異をさらに含み、ここで、前記変異がＣ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の遺伝子座ＣＡ＿Ｃ００２８の遺伝子ｈｙｄＡの３９２３３番のヌクレオチド位置のヌクレオチドＣの欠失である、
Ｃ．アセトブチリカム変異株。
【請求項2】
遺伝子座ＣＡ＿Ｃ１３２１の、少なくとも、Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６２４６１～１４６２４６３番のヌクレオチド位置に、３４７番のアミノ酸アラニンをトレオニンに置換させるためのコドンの突然変異を含んでなる、請求項１に記載の変異株。
【請求項3】
前記水素デヒドロゲナーゼが、配列番号１５で表されるアミノ酸配列を有するものであり、Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の遺伝子座ＣＡ＿Ｃ００２８の遺伝子ｈｙｄＡによりコードされている、請求項１に記載の変異株。
【請求項4】
前記ｈｙｄＡ変異遺伝子が水素デヒドロゲナーゼをコードし、配列番号１８で表される遺伝子配列を有するものである、請求項１に記載の変異株。
【請求項5】
非変異株と比較して増強されたグリセロール取り込み促進因子透過酵素活性をさらに含んでなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の変異株。
【請求項6】
前記グリセロール取り込み促進因子透過酵素が、配列番号１９で表されるアミノ酸配列を有するものであり、Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の遺伝子座ＣＡ＿Ｃ０７７０の遺伝子ｇｌｐＦによりコードされている、請求項５に記載の変異株。
【請求項7】
Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の遺伝子座ＣＡ＿Ｃ０７７０の遺伝子ｇｌｐＦの８９２８７５番のヌクレオチド位置のヌクレオチドＧの置換を少なくとも含んでなり、それが配列番号２２で表される遺伝子配列を有する変異遺伝子をもたらす、請求項６に記載の変異株。
【請求項8】
非変異株と比較して減弱された電子伝達フラビンタンパク質サブユニットα活性をさらに含んでなる、請求項１～７のいずれか一項に記載の変異株。
【請求項9】
前記電子伝達フラビンタンパク質サブユニットαが、配列番号２３で表されるアミノ酸配列を有するものであり、Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の遺伝子座ＣＡ＿Ｃ２７０９の遺伝子ｅｔｆＡによりコードされている、請求項８に記載の変異株。
【請求項10】
Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の遺伝子座ＣＡ＿Ｃ２７０９の遺伝子ｅｔｆＡの２８３３３８４番のヌクレオチド位置のヌクレオチドＡの置換を少なくとも含んでなり、それが配列番号２６で表される遺伝子配列を有する変異遺伝子をもたらす、請求項９に記載の変異株。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の変異株を含んでなるクロストリジウムのコンソーシアム。
【請求項12】
請求項１～１０のいずれか一項に定義されるクロストリジウム・アセトブチリカム変異株と少なくとも１つのクロストリジウム・スポロゲネス株および／または少なくとも１つのクロストリジウム・スフェノイデス株とを含んでなる、請求項１１に記載のクロストリジウムのコンソーシアム。
【請求項13】
請求項１～１０のいずれか一項に定義される変異株または請求項１１または１２に定義されるコンソーシアムを、少なくともグリセロールを含んでなる適当な培養培地で培養すること、ならびに生産された１，３－プロパンジオールおよび／または酪酸を培養培地から回収することを含んでなる、１，３－プロパンジオールおよび酪酸の生産のための方法。
【請求項14】
生産された１，３－プロパンジオールおよび／または酪酸がさらに精製される、請求項１３に記載の１，３－プロパンジオールおよび酪酸の生産のための方法。
【請求項15】
培養培地中のグリセロール濃度が９０～１２０ｇ／Ｌ、好ましくは約１０５ｇ／Ｌである、請求項１３または１４に記載の１，３－プロパンジオールおよび酪酸の生産のための方法。
【請求項16】
培養培地が有機窒素を必要としない、好ましくは、有機窒素を添加しない、より好ましくは、酵母エキスを含まない合成培地である、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の１，３－プロパンジオールおよび酪酸の生産のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、１，３－プロパンジオールを生産することができ、減弱されたグリセロールキナーゼ活性を含んでなるクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium
acetobutylicum)の新たな変異株に関する。さらに、本発明は、少なくとも前記変異株とＣ．スポロゲネス(C. sporogenes)およびＣ．スフェノイデス(C. sphenoides)から選択される少なくとも１つの他のクロストリジウム種を含んでなるクロストリジウム綱(Clostridia)のコンソーシアムに関する。この改変株は高グリセロール含量の適当な培養培地での増殖におよび１，３－プロパンジオールの生産に適応させることができるので、本発明はまた、少なくともこの変異株を適当な培養培地で培養することにより１，３－プロパンジオールおよび酪酸を生産するための方法にも関する。
【背景技術】
【0002】
１，３－プロパンジオール（1,3-propanediol）（ＰＤＯ）は、トリメチレングリコールまたはプロピレングリコールとも呼ばれ、最も古くから知られている発酵生成物の１つである。ＰＤＯはクロストリジウム・パストゥリアヌム(Clostridium
pasteurianum)を含有するグリセリン発酵培地において、August Freundにより早くも１８８１年には最初に確認された。ＰＤＯはグリセリン発酵の典型的な生成物であり、他の有機基質の嫌気的変換において発見された。その生成が可能なのはごく少数の生物だけで、それらは総て細菌である。それらには、クレブシエラ属(Klebsiella)（Ｋ．ニューモニエ（K. pneumoniae））、エンテロバクテリウム属(Enterobacter)（Ｅ．アグロメランス（E. agglomerans））、シトロバクテリア属（Citrobacter）（Ｃ．フロインディ(C. freunddi)）、ラクトバシラス属(Lactobacilli)（Ｌ．ブレビス（L. brevis）およびＬ．ブチネリ（L. buchneri））、ならびにＣ．ブチリカムおよびＣ．パストゥリアヌム群のクロストリジウム綱(Clostridia)の細菌が含まれる。
【0003】
ＰＯＤは、二官能性有機化合物として、多くの合成反応に、特に、ポリエステル、ポリエーテル、ポリウレタン、特に、ポリトリメチレンテレフタレート（ＰＴＴ）を生産するための重縮合向けのモノマーとして使用される可能性がある。これらの構造および反応の特性が、化粧料、繊維製品（衣料繊維もしくはフローリング）またはプラスチック（自動車産業および梱包またはコーティング）での幾つかの応用をもたらす。
【0004】
ＰＤＯは種々の化学的経路で生産され得るが、それらは汚染物質を極度に含有する廃液流を生み出し、製造コストが高くつく。従って、化学的に生産されたＰＤＯは１，２－エタンジオール、１，２－プロパンジオールおよび１，４－ブタンジオールのような、石油化学的に利用可能なジオールと競争できない。この競争力を高めるために、１９９５年に、デュポン社はグルコースからＰＤＯへの生物変換のための研究プログラムを開始した。このプロセスは環境に優しいが、ｉ）非常に高価な補因子であるビタミンＢ１２を用い、また、ｉｉ）生産株が不安定であるために不連続なプロセスであるという欠点がある。
【0005】
バイオディーゼル産業で生産された大量のグリセロールが利用可能であるため、むしろ、連続的にビタミンＢ１２を必要とせず炭素収率がより高いプロセスが有利である。
【0006】
ＰＤＯが特に、塩および水と混合した約８０～８５％のグリセリンを含有するバイオディーゼル生成物の不要な副生成物であるグリセロールから生産され得ることは当技術分野で公知である。
【0007】
Ｃ．ブチリカムがバッチおよび２段階連続発酵で増殖でき工業グリセリンに含有されるグリセロールからＰＤＯを生産できることは従前に記載されていた(Papanikolaou et al., 2000)。しかしながら、グリセロールの最高濃度において、得られた最大ＰＤＯ力価は０．０２ｈ－１の希釈速度で４８．１ｇ．Ｌ－１であり、０．９６ｇ．Ｌ－１．ｈ－１の生産性を意味する。培養は、流加培地中グリセリンを起源とするグリセロールの最大濃度が９０ｇ．Ｌ－１で、細菌のバイオマス生産の増大に役立つと当業者に知られている有機窒素を含有する高価な化合物である酵母エキスの存在下で行われた。
【0008】
出願ＷＯ２００６／１２８３８１は、クレブシエラ・ニューモニエ、Ｃ．ブチリカムまたはＣ．パストゥリアヌムなどの天然ＰＤＯ生産生物を用いてバッチおよび流加バッチ培養でのＰＤＯの生産のためのこのグリセロールの使用を開示している。さらに、ＷＯ２００６／１２８３８１で使用された培地も酵母エキスを含有する。この特許出願に記載されているように、達成された最大生産性は０．８～１．１ｇ．ｌ－１ｈ－１であった。
【0009】
「Ｃ．アセトブチリカムＤＧ１ ｐＳＰＤ５」株と呼ばれる、Ｃ．ブチリカムからのビタミンＢ１２非依存性のグリセリンデヒドラターゼとＰＤＯデヒドロゲナーゼを含有するように改変されたＣ．アセトブチリカムの性能がGonzalez-Pajuelo et al., 2005に記載されている。この菌株は、最大１２０ｇ．ｌ－１の純粋なグリセロールを含有する流加培地において、最初は増殖しＰＤＯを生産する。さらに、最大６０ｇ．ｌ－１の純粋グリセロールまたは工業グリセリンに含有されるグリセロールを含有する流加培地における分析では何の差異も指摘されなかった。これらの結果は酵母エキスの存在下で得られた。その上、６０ｇ．ｌ－１より高い工業グリセリンの濃度を起源とするグリセロールの濃度では試験は行われなかった。野生型Ｃ．ブチリカムと改変型微生物「Ｃ．アセトブチリカムＤＧ１ ｐＳＰＤ５」を比較すると、全体的に同様の挙動が観察された。
【0010】
特許出願ＷＯ２０１０／１２８０７０において、発明者らはGonzalez-Pajuelo et al. (2005)に記載されているような「Ｃ．アセトブチリカムＤＧ１ ｐＳＰＤ５」の菌株を、工業グリセリンに含有される高濃度のグリセロールを含み、酵母エキスを含まない培地で増殖するように適応させるためのプロセスを記載している。結果として得られたＣ．アセトブチリカムＤＧ１ ｐＳＰＤ５適応株の集団は、工業グリセリンに含有される最大１２０ｇ．ｌ－１のグリセロールを含有する培地でＰＤＯを生産することができ、ＰＤＯの力価は最大５３．５ｇ．Ｌ－１で、収率は最大０．５３ｇ．ｇ－１および生産性は最大２．８６ｇ．Ｌ－１．ｈ－１であった。特許出願ＷＯ２０１２／０６２８３２では、発明者らは、ＷＯ２０１０／１２８０７０特許出願に記載のものと同じ方法によって得られたＣ．アセトブチリカムＤＧ１ ｐＳＰＤ５適応株の別の集団のクローンの単離を記載している。この第２の集団は、工業グリセリンに含有される１０５ｇ．Ｌ－１前後のグリセロールを含有する培地でＰＤＯを生産することができ、ＰＤＯの力価は最大５０．４５ｇ／Ｌ－１、収率は最大０．５３ｇ．ｇ－１および生産性は最大３．１８ｇ．Ｌ－１．ｈ－１であり、一方、単離されたクローンは、工業グリセリンに含有される１０５ｇ．Ｌ－１前後のグリセロールを含有する培地でＰＤＯを生産することができ、ＰＤＯの力価は最大５１．３０ｇ／Ｌ－１、収率は最大０．５０ｇ．ｇ－１および生産性は最大３．０５ｇ．Ｌ－１．ｈ－１であった。
【0011】
ブチレート（酪酸またはブタン酸とも呼ばれ、ＢＡと略される）は、構造式ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２－ＣＯＯＨを有するカルボン酸であり、揮発性で、無色、不快な臭いを持つ油性の液体で、水および溶媒（例えば、エタノールおよびエーテル）の両方に混和する。ブチレートは、ｉ）他の化学物質の製造、ｉｉ）動物栄養における飼料添加物として、ｉｉｉ）食品着香剤、または栄養補助食品として、ならびにｉｖ）医薬組成物および化粧用組成物など、様々な適用に使用される。特に、ブチレートは、商業上極めて重要な混合エステルの１つである酢酸酪酸セルロースなどの熱可塑性ポリマーの生産において原料として使用され得る。実際に、酢酸酪酸セルロースは、塗料およびポリマー中に存在する場合が多い。ブチレートはまた、バイオ燃料および可能性としては内燃機関のガソリン代替物であるブタノールの前駆体でもある。
【0012】
現在、工業規模でのブチレートの生産は、主として、例えば、酸素または有機オキシダントによるｎ－ブチルアルコールまたはブチルアルデヒドの酸化を介した化学合成を用いて行われる。あるいは、ブチレートは、推定２～４％のブチレートを含有するバターからの抽出により生産することもできるが、この方法はコストが高く、難しい。ブチレートはまた、嫌気性条件下での発酵中にクロストリジウム株の代謝産物として生産することもできる。より具体的には、ブチレートは、二相アセトン／ｎ－ブタノール／エタノール（ＡＢＥ）発酵における中間体であるアセテート／ブチレート混合物として生産することができる。アセテート／ブチレートの生産は、高増殖速度条件下での最初の酸生成相で起こり、その後、第２の溶媒生成相(solventogenic phase)で消費され、増殖速度が低下し、ＡＢＥ溶媒が生産される。二酸化炭素および水素はこの発酵プロセス中で常に生産される。
【0013】
本特許出願において、本発明者らは、減弱されたグリセロールキナーゼ活性を有するように変異された、グリセロールの存在下でＰＤＯを生産し得るクロストリジウム・アセトブチリカムＤＧ１ ｐＳＰＤ５株が、非変異生産株の性能に比べて改善したＰＤＯおよびＢＡ生産を提供することに気づいた。ＰＤＯおよびＢＡ生産のさらなる改善は、本発明による変異株が減弱された水素デヒドロゲナーゼ活性および／または増強されたグリセロール取り込み促進因子透過酵素活性をさらに保持する場合に得られ得る。
【0014】
よって、本発明によるクロストリジウム変異株は、グリセロールの存在下でのＰＤＯの生産に適応しただけの非変異型Ｃ．アセトブチリカムＤＧ１ ｐＳＰＤ５株を使用する場合に比べて、ＰＤＯおよびＢＡの改善した生産をもたらす。
【発明の概要】
【0015】
本発明は、クロストリジウム・ブチリカム由来のｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２およびｄｈａＴ遺伝子を発現し、かつ、減弱されたグリセロールキナーゼ活性を含んでなるＣ．アセトブチリカム変異株に関する。
【0016】
特に、本発明による変異株において、活性が減弱されるグリセロールキナーゼは、Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４の遺伝子座ＣＡ＿Ｃ１３２１の遺伝子ｇｌｐＫによりコードされている。
【0017】
本発明の特定の実施形態において、本発明による変異株は、遺伝子座ＣＡ＿Ｃ１３２１の遺伝子ｇｌｐＫに以下の突然変異のうち少なくとも１つを含んでなる：
ａ．Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６２４６１～１４６２４６３番のヌクレオチド位置における、３４７番のアミノ酸アラニンをトレオニンに置換させるためのコドンの突然変異、
ｂ．Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６１４８６～１４６１４８８番のヌクレオチド位置における、２２番のアミノ酸ヒスチジンをチロシンに置換させるためのコドンの突然変異、
ｃ．Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６２８１８～１４６２８２０番のヌクレオチド位置における、４６６番のアミノ酸バリンをメチオニンに置換させるためのコドンの突然変異。
ａ．Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６２４６１～１４６２４６３番のヌクレオチド位置における、３４７番のアミノ酸アラニンをトレオニンに置換させるためのコドンの突然変異、
ｂ．Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６１４８６～１４６１４８８番のヌクレオチド位置における、２２番のアミノ酸ヒスチジンをチロシンに置換させるためのコドンの突然変異、
ｃ．Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６２８１８～１４６２８２０番のヌクレオチド位置における、４６６番のアミノ酸バリンをメチオニンに置換させるためのコドンの突然変異。
【0018】
本発明の好ましい実施態様において、本発明による変異株は、これらの３つの突然変異の組合せを含んでなる。
【0019】
本発明の変異株はまた、減弱された水素デヒドロゲナーゼ活性、好ましくは、不活化された水素デヒドロゲナーゼ活性もさらに含んでなり得る。本発明の特定の実施態様において、前記ヒドロゲナーゼは、Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の遺伝子座ＣＡ＿Ｃ００２８の遺伝子ｈｙｄＡによりコードされている。
【0020】
本発明の変異株はまた、増強されたグリセロール取り込み促進因子透過酵素活性もさらに含んでなり得る。本発明の特定の実施態様において、前記グリセロール取り込み促進因子タンパク質は、Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の遺伝子座ＣＡ＿Ｃ０７７０の遺伝子ｇｌｐＦによりコードされている。
【0021】
本発明の変異株はまた、減弱された電子伝達フラビンタンパク質サブユニットα活性もさらに含んでなり得る。本発明の特定の実施態様において、前記電子伝達フラビンタンパク質サブユニットαは、Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の遺伝子座ＣＡ＿Ｃ２７０９の遺伝子ｅｔｆＡによりコードされている。
【0022】
本発明はまた、上記に開示されたような本発明によるＣ．アセトブチリカム変異株を含んでなるクロストリジウム綱の種のコンソーシアムに関する。
【0023】
本発明の特定の実施態様において、このコンソーシアムは、上記で定義されたようなクロストリジウム・アセトブチリカム変異株と少なくとも１つのクロストリジウムスポロゲネス株および／または少なくとも１つのクロストリジウム・スフェノイデス株を含んでなる。
【0024】
本発明はまた、クロストリジウム・アセトブチリカム変異株、または上記で定義されたような前記変異株を含んでなるコンソーシアムを、少なくともグリセリンを含んでなる適当な培養培地で培養すること、ならびに生産されたＰＤＯおよび／またはＢＡを培養培地から回収することを含んでなる、ＰＤＯおよびＢＡの生産のための方法にも関する。
【発明の具体的説明】
【0025】
第１の側面において、本発明は、ＰＤＯを生産することができ、かつ、非変異株に比べて減弱されたグリセロールキナーゼ活性を含んでなるクロストリジウム・アセトブチリカム変異株に関する。本発明において、グリセロールキナーゼは、ＡＴＰ：グリセロール３－ホスホトランスフェラーゼまたはグリセロキナーゼＧＫとも呼ばれる酵素である。
【0026】
特に、本発明による変異株において、活性が減弱されるグリセロールキナーゼ（配列番号１）は、Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４の遺伝子座ＣＡ＿Ｃ１３２１（配列番号２）の遺伝子ｇｌｐＫによりコードされている。本発明による変異株において、グリセロールキナーゼ活性は、非変異株に比べて、特に、遺伝子ｇｌｐＫが変異されていない菌株に比べて減弱されている。
【0027】
本明細書において述べるように、Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４は、クロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ ８２４の完全ゲノムとして、受託番号Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７（ＡＥ００７５１３－ＡＥ００７８６８）バージョンＡＥ００１４３７．１で入手可能な３９４０８８０ｂｐの環状ＤＮＡに相当する。
【0028】
本発明の特定の実施態様において、本発明による変異株は、遺伝子座ＣＡ＿Ｃ１３２１の遺伝子ｇｌｐＫに以下の突然変異のうち少なくとも１つを含んでなる：
ａ．Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６２４６１～１４６２４６３番のヌクレオチド位置における、３４７番のアミノ酸アラニンをトレオニンに置換させて配列番号３の変異タンパク質および配列番号４の変異遺伝子をもたらすためのコドンの突然変異、
ｂ．Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６１４８６～１４６１４８８番のヌクレオチド位置における、２２番のアミノ酸ヒスチジンをチロシンに置換させて配列番号５の変異タンパク質および配列番号６の変異遺伝子をもたらすためのコドンの突然変異、
ｃ．Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６２８１８～１４６２８２０番のヌクレオチド位置における、４６６番のアミノ酸バリンをメチオニンに置換させて配列番号７の変異タンパク質および配列番号８の変異遺伝子をもたらすためのコドンの突然変異。
ａ．Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６２４６１～１４６２４６３番のヌクレオチド位置における、３４７番のアミノ酸アラニンをトレオニンに置換させて配列番号３の変異タンパク質および配列番号４の変異遺伝子をもたらすためのコドンの突然変異、
ｂ．Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６１４８６～１４６１４８８番のヌクレオチド位置における、２２番のアミノ酸ヒスチジンをチロシンに置換させて配列番号５の変異タンパク質および配列番号６の変異遺伝子をもたらすためのコドンの突然変異、
ｃ．Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６２８１８～１４６２８２０番のヌクレオチド位置における、４６６番のアミノ酸バリンをメチオニンに置換させて配列番号７の変異タンパク質および配列番号８の変異遺伝子をもたらすためのコドンの突然変異。
【0029】
本発明の有利な実施態様において、この変異株は、遺伝子座ＣＡ＿Ｃ１３２１において、少なくとも、Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６２４６１～１４６２４６３番のヌクレオチド位置に、３４７番のアミノ酸アラニンをトレオニンに置換させるためのコドンの突然変異を含んでなる（配列番号３および配列番号４）。
【0030】
本発明の好ましい実施態様において、この変異株は、遺伝子座ＣＡ＿Ｃ１３２１において、少なくとも、
（ｉ）Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６２４６１～１４６２４６３番のヌクレオチド位置に、３４７番のアミノ酸アラニンをトレオニンに置換させるためのコドンの突然変異、および
（ｉｉ）Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６１４８６～１４６１４８８番のヌクレオチド位置に、２２番のアミノ酸ヒスチジンをチロシンに置換させるためのコドンの突然変異
を含んでなり、配列番号９の変異タンパク質および配列番号１０の変異遺伝子をもたらす。
（ｉ）Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６２４６１～１４６２４６３番のヌクレオチド位置に、３４７番のアミノ酸アラニンをトレオニンに置換させるためのコドンの突然変異、および
（ｉｉ）Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６１４８６～１４６１４８８番のヌクレオチド位置に、２２番のアミノ酸ヒスチジンをチロシンに置換させるためのコドンの突然変異
を含んでなり、配列番号９の変異タンパク質および配列番号１０の変異遺伝子をもたらす。
【0031】
本発明の別の好ましい実施態様において、この変異株は、遺伝子座ＣＡ＿Ｃ１３２１において、少なくとも、
（ｉ）Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６２４６１～１４６２４６３番のヌクレオチド位置に、３４７番のアミノ酸アラニンをトレオニンに置換させるためのコドンの突然変異、および
（ｉｉ）Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６２８１８～１４６２８２０番のヌクレオチド位置に、４６６番のアミノ酸バリンをメチオニンに置換させるためのコドンの突然変異
を含んでなり、配列番号１１の変異タンパク質および配列番号１２の変異遺伝子をもたらす。
（ｉ）Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６２４６１～１４６２４６３番のヌクレオチド位置に、３４７番のアミノ酸アラニンをトレオニンに置換させるためのコドンの突然変異、および
（ｉｉ）Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６２８１８～１４６２８２０番のヌクレオチド位置に、４６６番のアミノ酸バリンをメチオニンに置換させるためのコドンの突然変異
を含んでなり、配列番号１１の変異タンパク質および配列番号１２の変異遺伝子をもたらす。
【0032】
本発明の別の好ましい実施態様において、この変異株は、遺伝子座ＣＡ＿Ｃ１３２１において、少なくとも、
（ｉ）Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６２４６１～１４６２４６３番のヌクレオチド位置に、３４７番のアミノ酸アラニンをトレオニンに置換させるためのコドンの突然変異、および
（ｉｉ）Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６１４８６～１４６１４８８番のヌクレオチド位置に、２２番のアミノ酸ヒスチジンをチロシンに置換させるためのコドンの突然変異、および
（ｉｉｉ）Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６２８１８～１４６２８２０番のヌクレオチド位置に、４６６番のアミノ酸バリンをメチオニンに置換させるためのコドンの突然変異
を含んでなり、配列番号１３の変異タンパク質および配列番号１４の変異遺伝子をもたらす。
（ｉ）Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６２４６１～１４６２４６３番のヌクレオチド位置に、３４７番のアミノ酸アラニンをトレオニンに置換させるためのコドンの突然変異、および
（ｉｉ）Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６１４８６～１４６１４８８番のヌクレオチド位置に、２２番のアミノ酸ヒスチジンをチロシンに置換させるためのコドンの突然変異、および
（ｉｉｉ）Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６２８１８～１４６２８２０番のヌクレオチド位置に、４６６番のアミノ酸バリンをメチオニンに置換させるためのコドンの突然変異
を含んでなり、配列番号１３の変異タンパク質および配列番号１４の変異遺伝子をもたらす。
【0033】
上述の特定の好ましい実施態様の総てにおいて、突然変異のそれぞれは好ましくは以下の通りである：
・Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６２４６１番のヌクレオチド位置におけるＧのＡでの置換、
・Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６１４８６番のヌクレオチド位置におけるＣのＴでの置換、
・Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６２８１８番のヌクレオチド位置におけるＧのＡでの置換。
・Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６２４６１番のヌクレオチド位置におけるＧのＡでの置換、
・Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６１４８６番のヌクレオチド位置におけるＣのＴでの置換、
・Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の１４６２８１８番のヌクレオチド位置におけるＧのＡでの置換。
【0034】
本発明の変異株はまた、減弱された水素デヒドロゲナーゼ活性、好ましくは、不活化された水素デヒドロゲナーゼ活性もさらに含んでなり得る。本発明の特定の実施態様において、前記ヒドロゲナーゼ（配列番号１５）は、Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の遺伝子座ＣＡ＿Ｃ００２８の遺伝子ｈｙｄＡ（配列番号１６）によりコードされている。
【0035】
本発明の好ましい実施態様において、この変異株は、遺伝子座ＣＡ＿Ｃ００２８において、少なくとも、Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の３９２３３～３９２３５番のヌクレオチド位置における、好ましくは３９２３３番のヌクレオチド位置におけるＣの欠失により（配列番号１８の変異遺伝子）、配列番号１７の５８２個のアミノ酸の代わりにより短い２０９個のアミノ酸のタンパク質をもたらす終止コドンを有するためのコドンの突然変異を含んでなる。
【0036】
本発明の変異株はまた、増強されたグリセロール取り込み促進因子透過酵素活性もさらに含んでなり得る。本発明の特定の実施態様において、前記グリセロール取り込み促進因子タンパク質（配列番号１９）は、Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の遺伝子座ＣＡ＿Ｃ０７７０の遺伝子ｇｌｐＦ（配列番号２０）によりコードされている。
【0037】
本発明の好ましい実施態様において、この変異株は、遺伝子座ＣＡ＿Ｃ０７７０において、少なくとも、Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の８９２８７５～８９２８７７番のヌクレオチド位置に、１３番のアミノ酸メチオニンをイソロイシンに置換させるための（配列番号２１の変異タンパク質）、好ましくは、８９２８７５番のヌクレオチド位置のＧの、Ａ、ＣまたはＴでの置換、より好ましくは、Ａでの置換（配列番号２２の変異遺伝子）によるコドンの突然変異を含んでなる。
【0038】
本発明の変異株はまた、減弱された電子伝達フラビンタンパク質サブユニットα活性もさらに含んでなり得る。本発明の特定の実施態様において、前記電子伝達フラビンタンパク質サブユニットα（配列番号２３）は、Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の遺伝子座ＣＡ＿Ｃ２７０９の遺伝子ｅｔｆＡ（配列番号２４）によりコードされている。
【0039】
本発明の好ましい実施態様において、この変異株は、遺伝子座ＣＡ＿Ｃ２７０９において、少なくとも、Ｃ．アセトブチリカムゲノムＡＴＣＣ８２４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＥ００１４３７の２８３３３８４～２８３３３８６番のヌクレオチド位置に、１０５番のアミノ酸イソロイシンをバリンに置換させるための（配列番号２５の変異タンパク質）、好ましくは、２８３３３８４番のヌクレオチド位置のＡのＧでの置換（配列番号２６の変異遺伝子）によるコドンの突然変異を含んでなる。
【0040】
本発明によるＣ．アセトブチリカム変異株は、グリセロールが存在する適当な培養培地で培養した際に１，３－プロパンジオールを生産できるように改変される。このＣ．アセトブチリカム変異株は、プラスミドにより過剰発現されるかまたは微生物の染色体に組み込まれるＣ．ブチリカム由来の１，３ －プロパンジオールオペロンの余分なコピーを導入することによって、Ｃ．ブチリカム由来の１，３－プロパンジオールオペロン、ｄｈａＢ１遺伝子（配列番号２７）およびｄｈａＢ２遺伝子（配列番号２８）によりコードされているビタミンＢ１２非依存性グリセロールデヒドラターゼおよびｄｈａＴ遺伝子（配列番号２９）によりコードされているＰＤＯデヒドロゲナーゼを含有するように改変されている。例えば、ｐＳＰＤ５プラスミドを、１，３－プロパンジオールオペロンの過剰発現のために使用することができる。このＣ．アセトブチリカム変異株はＣ．アセトブチリカムＤＧ１ ｐＳＰＤ５と呼ばれ、引用することにより本明細書の一部とされるGonzalez-Pajuelo et al., 2005およびGonzalez-Pajuelo et al., 2006に詳細に記載されている。
【0041】
グリセロール代謝をＰＤＯの生産に向けるための方法は当技術分野で公知である（例えば、ＷＯ２００６／１２８３８１、Gonzalez-Pajuelo et al., 2006）。また、例えば、単一の炭素源としてのグリセロールからのＰＤＯの生産のために遺伝的に改変されたＣ．アセトブチリカム株が当技術分野で公知であり、特に特許出願ＷＯ２００１／０４３２４およびＷＯ２０１０／１２８０７０で開示されている。
【0042】
有利な実施態様において、本発明の変異株は、高グリセロール含量、特に、工業グリセリンに含有される高濃度のグリセロールを含み、有機窒素源を含まない培養培地からの増殖およびＰＤＯ生産に適応したＣ．アセトブチリカム株である。
【0043】
「適応したＣ．アセトブチリカム」、「従前に適応したＣ．アセトブチリカム」、または「適応しているＣ．アセトブチリカム」とは、高濃度の工業グリセリンで増殖することができるように改変されたＣ．アセトブチリカムを意味する。
【0044】
例えば、Ｃ．アセトブチリカム株は、特許出願ＷＯ２０１０／１２８０７０に開示されているような選択圧培養法によって、高グリセロール含量、特に、工業グリセリンを起源とする高濃度のグリセロールを含む培養培地で増殖するように適応させることができる。このＣ．アセトブチリカム株の適応は、好ましくは、当業者に周知の技術である嫌気的連続法によって行われる。当業者に公知のこの方法の特徴として、例えば、流加培地を発酵槽に連続的に加え、同時にこの系から、微生物を含む等量の変換栄養溶液が取り出されることが挙げられる。栄養交換の速度は希釈率として表される。従って、希釈率は培養培地に適用され、微生物の最大増殖速度を考慮し、培地の投入と引き抜きの速度に影響を与える。生産微生物の前記適応は、微生物を高い工業グリセリン含量（９０～１２０ｇ／Ｌ、好ましくは約１０５ｇ／Ｌを含む）を含んでなる培養培地にて低希釈率（０．００５～０．１ｈ－１、好ましくは０．００５～０．０２ｈ－１を含む）で培養すること、および工業グリセリンを起源とする高濃度のグリセロールを含む培養培地で増殖できる適応微生物を選択することにより得られる。
【0045】
「遺伝的に改変された」という表現は、その菌株がその遺伝的特徴を変化させる目的で形質転換さていることを意味する。内因性遺伝子は減弱、欠失、または過剰発現させることができ、または好ましくは、外因性遺伝子は、細胞で発現させるために導入するか、プラスミドによって運ばせるか、もしくは菌株のゲノムに組み込むことができる。
【0046】
用語「プラスミド」または「ベクター」は、本明細書で使用する場合、多くは細胞の中枢代謝の一部ではなく、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態の遺伝子を保持する染色体外エレメントを指す。
【0047】
高グリセロール含量、特に、工業グリセリンを起源とする高濃度のグリセロールを含む培養培地からの増殖および１，３－プロパンジオール生産にＣ．アセトブチリカム株を適応させるためには、特許出願ＷＯ２００８／０４０３８７（それらの内容は引用することにより本明細書の一部とされる）に開示されているものなど、クロストリジウムにおける突然変異誘発および／または遺伝子置換のいずれの標準技術を用いてもよい。
【0048】
当業者には、これらの実験条件のそれぞれをどのように管理すればよいか、また、本発明に従って使用されるクロストリジウム綱の株のための培養条件をどのように定義すればよいかは周知である。特に、クロストリジウム綱の株は、Ｃ．アセトブチリカムでは、２０℃～６０℃、好ましくは２５℃～４０℃の温度で発酵させる。
【0049】
本発明の変異株において改変される、本明細書で述べる各酵素の活性は、比活性を意味するものとする。
【0050】
さらに、本発明の変異株において改変される各酵素の活性は、クロストリジウム・アセトブチリカムの非変異株または野生株と比較して定義される。
【0051】
酵素などの対象タンパク質の「増強」、「発現」、または「過剰発現」という用語は、本明細書では、前記対象タンパク質の発現レベルおよび／または活性が改変されていない、特に遺伝的に改変されていない親微生物に比べた場合の、微生物の前記タンパク質の発現レベルおよび／または活性の有意な増大を指す。これに対して、対象タンパク質の「減弱」という用語は、前記対象タンパク質の発現レベルおよび／または活性が改変されていない、特に遺伝的に改変されていない親微生物に比べた場合の、微生物の前記タンパク質の発現レベルおよび／または活性の有意な減少を指す。対象タンパク質の発現レベルおよび／または活性の完全な減弱は、発現および／または活性が消失されている、従って、前記タンパク質の発現レベルがゼロであることを意味する。「増強」、「発現」、「過剰発現」、または「減弱」が対応する対象遺伝子またはタンパク質の突然変異による場合、前記対象遺伝子またはタンパク質の発現レベルおよび／または活性の改変は、同じ非変異型の対象遺伝子またはタンパク質の発現レベルおよび／または活性と比較される。
【0052】
用語「発現レベル」は、本明細書で適用する場合、ウエスタンブロット－イムノブロット(Burnette, 1981)、酵素結合免疫吸着アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）(Engvall and Perlman, 1971)、または定量的プロテオミクス(Bantscheff et al., 2007)などの当該技術分野で周知の方法によって測定可能である、微生物で発現される対象タンパク質（または前記タンパク質をコードする遺伝子）の量（例えば、相対的な量、濃度）を指す。
【0053】
１以上のタンパク質の発現レベルの調節は、微生物内で前記タンパク質をコードする１以上の内因性遺伝子の発現を変更することによって生じ得る。
【0054】
よって、突然変異、特に、ｇｌｐＫ遺伝子発現、ｈｙｄＡ遺伝子発現、ｅｔｆＡ遺伝子、および／またはｇｌｐＦ遺伝子の調節に関して上記に開示した特定の突然変異に加え、本発明の変異株において上記したように、上述の酵素の遺伝子発現をさらに減弱、消失、または過剰発現させるために当業者に周知の古典的手段を用いてもよい。
【0055】
特定の活性を有する酵素をコードする内因性遺伝子の発現レベルを、本発明による組換え微生物において特に過剰発現、減弱、または消失させることができる。このような改変は、例えば、遺伝子工学によって、微生物が培養され、そこでその微生物に特定のストレスをかけ、突然変異を誘発する適応によって、および／または定方向突然変異誘発と特定の選択圧下での進化を組み合わせることにより代謝経路の発達と進化を促すことによって行うことができる。
【0056】
用語「内因性遺伝子」は、本明細書では、微生物に本来存在する遺伝子を指す。
【0057】
内因性遺伝子は、特に、内因性調節エレメントに加えて、それぞれアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを有利とする異種配列を導入することにより過剰発現または減弱させることができる。それに加えて、またはその代わりに、内因性調節エレメントを、それ自体遺伝子発現を調節する適当な異種配列に置き換えてもよい。それに加えて、またはその代わりに、内因性遺伝子の１以上の追加コピーを微生物内に、染色体的に（すなわち、染色体に）または染色体外に（例えば、プラスミドまたはベクターで）導入してもよい。よって、この微生物は、互いに同種の数コピーの遺伝子を含んでなる。内因性遺伝子の１以上の追加コピーを染色体外で発現させる場合、染色体外の外因性遺伝子の導入に関して上記で詳説したように、それらは異なるタイプのプラスミドで運ばれ得る。
【0058】
内因性遺伝子を過剰発現させる、または発現を減弱するためのもう１つの方法は、そのプロモーター（すなわち、野生型プロモーター）をそれぞれより強いまたはより弱いプロモーターに交換することである。このような目的に好適なプロモーターは同種（すなわち、同じ種を起源とする）であっても異種（すなわち、異なる種を起源とする）であってもよく、当技術分野で周知である。実際に、当業者は、内因性遺伝子の発現を調節するための適当なプロモーターを容易に選択することができる。
【0059】
内因性遺伝子発現レベル、またはコードされるタンパク質の活性はまた、遺伝子のコード配列または非コード配列に突然変異を導入することにより増強または減弱することができる。これらの突然変異は、対応するアミノ酸の改変が存在しない場合には同義であり得、または対応するアミノ酸が変更される場合には非同義である。同義突然変異は翻訳されるタンパク質の機能には何の影響もないが、その変異配列がレギュレーター因子の結合部位内に位置する場合には、対応する遺伝子またはさらには他の遺伝子の調節にも影響を及ぼし得る。非同義突然変異は、その変異配列の性質に応じて、翻訳されるタンパク質の機能または活性にも、ならびに調節にも影響を及ぼし得る。特に、非コード配列における突然変異は、コード配列の上流（すなわち、プロモーター領域、エンハンサー、サイレンサーまたはインスレーター領域、特定の転写因子結合部位）に位置してもよいし、またはコード配列の下流に位置してもよい。プロモーター領域に導入された突然変異は、コアプロモーター、近位プロモーターまたは遠位プロモーターにあってよい。突然変異は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた部位特異的突然変異誘発によるか、例えば突然変異誘発物質（紫外線またはニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくはメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）のような化学薬剤）によるランダム突然変異誘発技術によるか、またはＤＮＡシャッフリングまたはエラープローンＰＣＲまたは微生物に特定のストレスをかけ突然変異を誘発する培養条件の使用によって導入することができる。遺伝子の上流に位置する領域に１以上の追加ヌクレオチドを挿入すると、特に遺伝子発現を調節することができる。
【0060】
第２の側面において、本発明は、上記に開示されたような本発明によるＰＤＯおよびＢＡ生産変異株を含んでなるクロストリジウム綱のコンソーシアムに関する。
【0061】
本発明の特定の実施態様において、このコンソーシアムは、上記で定義されたようなクロストリジウム・アセトブチリカム変異株と少なくとも１つのクロストリジウム・スポロゲネス株および／または少なくとも１つのクロストリジウム・スフェノイデス株を含んでなる。
【0062】
好ましくは、本発明によるコンソーシアムは、培養物中に含まれる細胞全体を１００％として８９％～９８％のＣ．アセトブチリカム、１％～１０％のＣ．スポロゲネス、および／または１％～１０％のＣ．スフェノイデスを含んでなる。より好ましくは、本発明によるコンソーシアムは、培養物中に含まれる細胞全体を１００％として８９％～９５％のＣ．アセトブチリカム、３％～７％のＣ．スポロゲネス、および／または１％～５％のＣ．スフェノイデスを含んでなる。
【0063】
本発明によるコンソーシアムは、好ましくは、グリセロールが存在する培養培地からの増殖およびＰＤＯ生産のために従前に改変されたＰＤＯおよびＢＡ生産Ｃ．アセトブチリカム変異株を含んでなる。上述のＣ．アセトブチリカム変異株に関する好ましい実施態様も総て、必要な修正を加えてこの特定の実施態様に当てはまる。
【0064】
第３の側面において、本発明は、クロストリジウム・アセトブチリカム変異株または上記で定義されたような前記変異株を含んでなるコンソーシアムを、少なくともグリセロールを含んでなる適当な培養培地で培養すること、および生産されたＰＤＯおよび／またはＢＡを培養培地から回収することを含んでなる、ＰＤＯおよびＢＡの生産のための方法に関する。
【0065】
本発明の方法において、生産は有利にはバッチ法、流加法または連続法で行う。ＰＤＯおよびＢＡの生産を目的とする工業規模での微生物の培養は当該技術分野で公知であり、特に、ＷＯ２０１０／１２８０７０およびＷＯ２０１１／０４２４３４に開示され、それらの内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
【0066】
本発明による方法において、得られたＰＤＯおよび／またはＢＡは、回収後にさらに精製されてもよい。
【0067】
発酵培地からＰＤＯまたはＢＡを回収し、最終的に精製するための方法は当業者に公知である。ＰＤＯは、蒸留により単離され得る。ほとんどの実施態様において、ＰＤＯは発酵培地からアセテートなどの副生成物とともに蒸留され、その後、既知の方法によりさらに精製される。特定の精製方法が特許出願ＷＯ２００９／０６８１１０およびＷＯ２０１０／０３７８４３に開示され、その内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
【0068】
ＢＡは、特許出願ＥＰ３５０３５５に開示されているような蒸留によるか、または例えばＷＯ２０１７／０１３３３５に開示されているような液液抽出により、好ましくは、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸もしくはノナン酸などのカルボン酸またはメチルイソブチルケトン、メチルイソアミルケトン、メチルヘプチルケトン、メチルノニルケトンなどのケトンから選択される溶媒を用いて単離することができる。
【0069】
本発明によるＰＤＯおよびＢＡの生産のための方法の好ましい実施態様において、グリセロール濃度は、培養培地中９０～１２０ｇ／Ｌ、好ましくは約１０５ｇ／Ｌである。
【0070】
「適当な培養培地」または「培養培地」とは、クロストリジウム株またはコンソーシアムの増殖およびそれらの細胞による対象生成物の合成に最適化された培養培地を指す。発酵法は、一般に、使用するクロストリジウム種に適合した規定の既知組成であり、かつ、グリセロールを含有する合成の、特に、無機の、培養培地を含む反応槽で行われる。
【0071】
用語「合成培地」は、そこで生物が増殖する化学的に定義された組成を含んでなる培養培地を意味する。本発明の培養培地では、グリセロールは有利には単一の炭素源である。しかしながら、培養培地は、炭素源としてグリセロールに加えて炭水化物を含んでなってもよい。炭水化物は、キシロース、グルコース、フルクトースおよびスクロースまたはそれらの組合せからなる群から選択される。
【0072】
特定の実施態様において、グリセロールは、少なくとも５０％のグリセロール、好ましくは少なくとも８５％のグリセロール含んでなるグリセリン組成物の形態で培地に添加される。
【0073】
有利には、本発明の培養培地に使用されるグリセリンは、工業グリセリンである。「工業グリセリン」とは、実質的な精製なく工業プロセスから得られたグリセリン製品を意味する。工業グリセリンはまた「未処理グリセリン」とも呼ぶことができる。工業グリセリンは、７０％を超える、好ましくは８０％を超えるグリセロール、水ならびに無機塩および脂肪酸などの不純物を含んでなる。工業グリセリン中のグリセロールの最大含量は一般に９０％、より一般には約８５％である。
【0074】
よって、本発明によるＰＤＯおよびＢＡの生産のための方法は、７０％を超えるグリセロールを含んでなる工業グリセリンにより提供されるグリセロールを使用することによって行うことができる。
【0075】
工業グリセリンが得られる工業プロセスは、とりわけ、油脂、特に、植物起源の油脂または動物起源の油脂または使用済み調理油が界面活性剤または潤滑剤などの工業製品に加工される製造方法である。このような製造方法において、工業グリセリンは、副生成物と見なされる。特定の実施態様において、工業グリセリンはバイオディーゼル生産からの副生成物であり、バイオディーゼル生産から得られるグリセリンの既知の不純物を含んでなり、これには約８０～８５％のグリセロールが塩、メタノール、水および脂肪酸などの少量の他の有機化合物とともに含まれる。バイオディーゼル生産から得られる工業グリセリンは、脂肪酸を除去するために酸性化工程をさらに受けてもよい。当業者には酸性化技術は公知であり、使用するグリセリンに応じて最適な酸性化条件を定義することができる。
【0076】
よって、本発明によるＰＤＯおよびＢＡの生産のための方法は、バイオディーゼル生産の副生成物である工業グリセリンを使用することにより行うことができる。
【0077】
本発明の方法において使用されるグリセロール濃度は、流加培地中、グリセロールが９０ｇ．Ｌ－１を超える。好ましい実施態様において、この濃度は、グリセリン溶液に含有される９０～２００ｇ．Ｌ－１のグリセロール、より詳しくは９０～１４０ｇ／Ｌのグリセロール、好ましくは約１２０ｇ．Ｌ－１のグリセロール、より好ましくは約１０５ｇ．Ｌ－１のグリセロールを含む。
【0078】
好ましくは、培養培地は、有機窒素を添加しない合成培地である。よって、本発明によるＰＤＯおよびＢＡの生産のための方法は、有機窒素を必要としない培養培地を使用することにより、好ましくは、有機窒素を添加しない、より好ましくは酵母エキスを含まない合成培地を使用することにより行うことができる。
【0079】
このような培養培地は、当該技術分野において、特に、特許出願ＷＯ２０１０／１２８０７０およびＷＯ２０１１／０４２４３４に開示され、これらの内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
【0080】
特定の実施態様において、本発明によるＰＤＯおよびＢＡの生産のための方法は、上記で定義されたような前記クロストリジウム・アセトブチリカム変異株を少なくとも１つのクロストリジウム・スポロゲネス株および／または少なくとも１つのクロストリジウム・スフェノイデス株とともに、少なくとも炭素源としてグリセロールを含んでなる適当な培養培地で培養すること、および生産されたＰＤＯおよび／またはＢＡを培養培地から回収することを含んでなる。
【実施例】
【0081】
本発明を以下の実施例でさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、単に例示として示されることが理解されるべきである。上記の開示およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な意味を変えることなく、様々な使用および条件にそれを適合させるように様々な変更を行うことができる。
【0082】
実施例１：タイプ１７４Ｐ集団から派生した１つのクローンに存在する突然変異の同定
クローンの単離
クローンの単離は、Ｃ．ブチリカム由来の１．３－プロパンジオールオペロンを過剰発現し、特許出願ＷＯ２０１２／０６２８３２Ａ１に記載されているように高濃度の工業グリセリンを含む培養培地からの増殖およびＰＤＯ生産に適当した集団であるクロストリジウム・アセトブチリカムＤＧ１ ｐＳＰＤ５タイプ１７４Ｐ株の集団の連続培養から開始し、寒天プレートで行った。寒天プレートでの単離に使用した合成培地は、脱イオン水１リットル当たり、寒天２５ｇ；市販のグリセリン３０ｇ；ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ；Ｋ２ＨＰＯ４、０．５ｇ；ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ；ＣｏＣｌ２ ６Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ；酢酸、９９．８％、２．２ｍｌ；ＮＨ４Ｃｌ、１．６５ｇ；ＭＯＰＳ、２３．０３ｇ、ビオチン、０．１６ｍｇ；ｐ－アミノ安息香酸、３２ｍｇ；ＦｅＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．０２８ｇ；レサズリン、１ｍｇおよびシステイン、０．５ｇを含有した。培地のｐＨは６ＮのＮＨ４ＯＨで６．５に調整した。
クローンの単離
クローンの単離は、Ｃ．ブチリカム由来の１．３－プロパンジオールオペロンを過剰発現し、特許出願ＷＯ２０１２／０６２８３２Ａ１に記載されているように高濃度の工業グリセリンを含む培養培地からの増殖およびＰＤＯ生産に適当した集団であるクロストリジウム・アセトブチリカムＤＧ１ ｐＳＰＤ５タイプ１７４Ｐ株の集団の連続培養から開始し、寒天プレートで行った。寒天プレートでの単離に使用した合成培地は、脱イオン水１リットル当たり、寒天２５ｇ；市販のグリセリン３０ｇ；ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ；Ｋ２ＨＰＯ４、０．５ｇ；ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ；ＣｏＣｌ２ ６Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ；酢酸、９９．８％、２．２ｍｌ；ＮＨ４Ｃｌ、１．６５ｇ；ＭＯＰＳ、２３．０３ｇ、ビオチン、０．１６ｍｇ；ｐ－アミノ安息香酸、３２ｍｇ；ＦｅＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．０２８ｇ；レサズリン、１ｍｇおよびシステイン、０．５ｇを含有した。培地のｐＨは６ＮのＮＨ４ＯＨで６．５に調整した。
【0083】
単離されたクローンは、寒天プレートでの３回の継代培養後に純粋であると見なされた。それらのうちの１つをクローンＰＤ０５５７Ｖｃ０５と命名し、次に、液体合成培地に移した。その後、増殖している液体培養物を同定まで、２０％グリセリンにて－８０℃で保存した。
【0084】
ＤＮＡ単離
クローンＰＤ０５５７Ｖｃ０５の連続培養物１６ｍｌから、Ｑｉａｇｅｎ（ＱＩＡＧＥＮ ＳＡ、コートアポフ、フランス）からのゲノムＤＮＡバッファーセットおよびゲノムチップ５００／Ｇキットを用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。細菌サンプルをQIAGEN Genomic DNA Handbook (Sample Preparation and Lysis Protocol for Bacteria)に記載されているプロトコールとその後のGenomic-tip Protocol (Protocol for Isolation of Genomic DNA from Blood, Cultured Cells, Tissue, Yeast, or Bacteria)に従って調製した。
クローンＰＤ０５５７Ｖｃ０５の連続培養物１６ｍｌから、Ｑｉａｇｅｎ（ＱＩＡＧＥＮ ＳＡ、コートアポフ、フランス）からのゲノムＤＮＡバッファーセットおよびゲノムチップ５００／Ｇキットを用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。細菌サンプルをQIAGEN Genomic DNA Handbook (Sample Preparation and Lysis Protocol for Bacteria)に記載されているプロトコールとその後のGenomic-tip Protocol (Protocol for Isolation of Genomic DNA from Blood, Cultured Cells, Tissue, Yeast, or Bacteria)に従って調製した。
【0085】
シークエンシング分析
ゲノムシークエンサーイルミナＨｉＳｅｑ技術を用い、クローンＰＤ０５５７Ｖｃ０５のゲノムの配列決定を行った。シークエンシングプロジェクトはＧＡＴＣ （ＧＡＴＣ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ、Ｊａｋｏｂ－Ｓｔａｄｌｅｒ－Ｐｌａｔｚ ７、７８４６７ Ｋｏｎｓｔａｎｚ、ドイツ）により、配列モードイルミナＨｉＳｅｑシークエンシング、標準ゲノムライブラリー、リード長２×１５０ｂｐ、ランタイプ：ペアエンド、リード長：２×１５０ｂｐ、シークエンスリード１１，５８９，２００、シークエンス塩基３，４７６，７６０，０００で行われた。
ゲノムシークエンサーイルミナＨｉＳｅｑ技術を用い、クローンＰＤ０５５７Ｖｃ０５のゲノムの配列決定を行った。シークエンシングプロジェクトはＧＡＴＣ （ＧＡＴＣ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ、Ｊａｋｏｂ－Ｓｔａｄｌｅｒ－Ｐｌａｔｚ ７、７８４６７ Ｋｏｎｓｔａｎｚ、ドイツ）により、配列モードイルミナＨｉＳｅｑシークエンシング、標準ゲノムライブラリー、リード長２×１５０ｂｐ、ランタイプ：ペアエンド、リード長：２×１５０ｂｐ、シークエンスリード１１，５８９，２００、シークエンス塩基３，４７６，７６０，０００で行われた。
【0086】
バイオインフォマティクス分析
バイオインフォマティクス分析は、ＧＡＴＣ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧにより、ＧＡＴＣ ＶＡＲＩＡＮＴ ＡＮＡＬＹＳＩＳ Ｖ１．２ワークフローおよび参照データベースＡＳＭ８７６ｖ１を用いて行われた。変異体分析はＧＡＴＣ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧにより行われ、ＳＮＰおよびＩｎＤｅｌコールは、ＧＡＴＫのハプロタイプコーラー[McKenna et al., 2010; De Pristo et al., 2011)を用いて行い、検出変異体に、ｓｎｐＥｆｆ(Cingolani et al., 2012)を用い、それらの遺伝子コンテキストに基づいて注釈を付ける。ＳｎｐＥｆｆソフトウエアは、例えば、ウェブサイトhttp://snpeff.sourceforge.net上で利用可能である。変異体の質を評価するために使用されるいくつかのマトリックスに、ＧＡＴＫのＶａｒｉａｎｔＡｎｎｏｔａｔｏｒモジュールを用いて注釈を付け、ＧＡＴＫのＶａｒｉａｎｔＦｉｌｔｒａｔｉｏｎモジュールを用い、偽陽性変異体をフィルタリングする(1lter)ために特注フィルターを変異体に適用する。
バイオインフォマティクス分析は、ＧＡＴＣ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧにより、ＧＡＴＣ ＶＡＲＩＡＮＴ ＡＮＡＬＹＳＩＳ Ｖ１．２ワークフローおよび参照データベースＡＳＭ８７６ｖ１を用いて行われた。変異体分析はＧＡＴＣ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧにより行われ、ＳＮＰおよびＩｎＤｅｌコールは、ＧＡＴＫのハプロタイプコーラー[McKenna et al., 2010; De Pristo et al., 2011)を用いて行い、検出変異体に、ｓｎｐＥｆｆ(Cingolani et al., 2012)を用い、それらの遺伝子コンテキストに基づいて注釈を付ける。ＳｎｐＥｆｆソフトウエアは、例えば、ウェブサイトhttp://snpeff.sourceforge.net上で利用可能である。変異体の質を評価するために使用されるいくつかのマトリックスに、ＧＡＴＫのＶａｒｉａｎｔＡｎｎｏｔａｔｏｒモジュールを用いて注釈を付け、ＧＡＴＫのＶａｒｉａｎｔＦｉｌｔｒａｔｉｏｎモジュールを用い、偽陽性変異体をフィルタリングする(1lter)ために特注フィルターを変異体に適用する。
【0087】
同定された突然変異のバリデーション
ＰＤ０５５７Ｖｃ０５において同定された突然変異の存在を確認するために、表１に記載のＰＣＲおよびサンガーシークエンシングオリゴヌクレオチドを用い、対象とする各遺伝子のＤＮＡまたはＤＮＡ領域に対してＰＣＲ反応およびサンガーシークエンシングを行った。
ＰＤ０５５７Ｖｃ０５において同定された突然変異の存在を確認するために、表１に記載のＰＣＲおよびサンガーシークエンシングオリゴヌクレオチドを用い、対象とする各遺伝子のＤＮＡまたはＤＮＡ領域に対してＰＣＲ反応およびサンガーシークエンシングを行った。
【0088】
【表1】
【0089】
ＰＤ０５５７Ｖｃ０５に対して行ったイルミナシーケンシングおよびサンガーシークエンシングの両分析に基づき、表２に記載されるようにいくつかの突然変異が同定された。
【0090】
【表2】
【0091】
実施例２：遺伝子ｇｌｐＫおよびｈｙｄＡにおいて同定された突然変異の特性評価
Ａ．野生型（ｇｌｐＫ）および変異型（ｇｌｐＫ ＊ ）グリセロールキナーゼタンパク質の特性評価
クローンＰＤ０５５７Ｖｃ０５のｇｌｐＫ遺伝子において、Ｈ２２Ｙ、Ａ３４７ＴおよびＶ４６６Ｍを有する変異タンパク質ｇｌｐＫ＊をもたらす３つの異なる点突然変異が同定された（上記の表２）。これらの突然変異の影響をより良く特徴付けるために、本発明者らはそれらを個々にまたは組み合わせて試験した。従って、変異型グリセロールキナーゼをコードする対立遺伝子を発現プラスミドｐＰＡＬ７（Ｂｉｏｒａｄ（登録商標））にクローニングし、得られたプラスミドを大腸菌(E. coli)株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｓｔａｒに形質転換して、各変異タンパク質を精製し、生化学的実験を行った。
Ａ．野生型（ｇｌｐＫ）および変異型（ｇｌｐＫ ＊ ）グリセロールキナーゼタンパク質の特性評価
クローンＰＤ０５５７Ｖｃ０５のｇｌｐＫ遺伝子において、Ｈ２２Ｙ、Ａ３４７ＴおよびＶ４６６Ｍを有する変異タンパク質ｇｌｐＫ＊をもたらす３つの異なる点突然変異が同定された（上記の表２）。これらの突然変異の影響をより良く特徴付けるために、本発明者らはそれらを個々にまたは組み合わせて試験した。従って、変異型グリセロールキナーゼをコードする対立遺伝子を発現プラスミドｐＰＡＬ７（Ｂｉｏｒａｄ（登録商標））にクローニングし、得られたプラスミドを大腸菌(E. coli)株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｓｔａｒに形質転換して、各変異タンパク質を精製し、生化学的実験を行った。
【0092】
【表3】
【0093】
タンパク質の過剰生産
タンパク質の過剰生産のための１～７の７株の培養を、５ｇ／Ｌのグルコースおよび１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを添加したＬＢ培地（Ｂｅｒｔａｎｉ、１９５１）を用い、２Ｌのエルレンマイヤーフラスコで行った。一晩培養物を用い、５００ｍＬ培養液にＯＤ６００ｎｍが約０．１５となるように播種した。培養はまず３７℃および２００ｒｐｍのシェーカー上でＯＤ６００ｎｍが約０．５となるまで維持し、次に、培養を２５℃および２００ｒｐｍの第２のシェーカー上に、ＯＤ６００ｎｍが０．６～０．８となるまで（約１時間）移し、その後、５００μＭのＩＰＴＧで誘導を行った。この培養物を２５℃および２００ｒｐｍで、ＯＤ６００ｎｍが４前後となるまで維持した後に停止した。細胞を４℃にて７０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、－２０℃で保存した。このプロトコールは菌株１～７で同じであった。
タンパク質の過剰生産のための１～７の７株の培養を、５ｇ／Ｌのグルコースおよび１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを添加したＬＢ培地（Ｂｅｒｔａｎｉ、１９５１）を用い、２Ｌのエルレンマイヤーフラスコで行った。一晩培養物を用い、５００ｍＬ培養液にＯＤ６００ｎｍが約０．１５となるように播種した。培養はまず３７℃および２００ｒｐｍのシェーカー上でＯＤ６００ｎｍが約０．５となるまで維持し、次に、培養を２５℃および２００ｒｐｍの第２のシェーカー上に、ＯＤ６００ｎｍが０．６～０．８となるまで（約１時間）移し、その後、５００μＭのＩＰＴＧで誘導を行った。この培養物を２５℃および２００ｒｐｍで、ＯＤ６００ｎｍが４前後となるまで維持した後に停止した。細胞を４℃にて７０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、－２０℃で保存した。このプロトコールは菌株１～７で同じであった。
【0094】
タンパク質の精製
工程１：無細胞抽出物の調製
各菌株について、約２５０ｍｇの大腸菌バイオマスを４０ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６およびプロテアーゼ阻害剤カクテルに懸濁させた。細胞懸濁液（１５ｍｌ／コニカルチューブ）に、氷上の５０ｍｌコニカルチューブ内で３０秒間隔で３０秒８サイクルの間、音波処理を施した（Ｂａｎｄｅｌｉｎ ｓｏｎｏｐｌｕｓ、７０Ｗ）。音波処理の後、細胞を室温で３０分間、５ｍＭのＭｇＣｌ２および１ＵＩ／ｍｌのＤＮアーゼＩとともにインキュベートした。４℃にて１２０００ｇで３０分間の遠心分離により細胞残渣を除去した。
工程１：無細胞抽出物の調製
各菌株について、約２５０ｍｇの大腸菌バイオマスを４０ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６およびプロテアーゼ阻害剤カクテルに懸濁させた。細胞懸濁液（１５ｍｌ／コニカルチューブ）に、氷上の５０ｍｌコニカルチューブ内で３０秒間隔で３０秒８サイクルの間、音波処理を施した（Ｂａｎｄｅｌｉｎ ｓｏｎｏｐｌｕｓ、７０Ｗ）。音波処理の後、細胞を室温で３０分間、５ｍＭのＭｇＣｌ２および１ＵＩ／ｍｌのＤＮアーゼＩとともにインキュベートした。４℃にて１２０００ｇで３０分間の遠心分離により細胞残渣を除去した。
【0095】
工程２：アフィニティー精製
この粗細胞抽出物から、生産者が推奨しているプロトコールに従い、Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙカラム（ＢＩＯＲＡＤ、Ｂｉｏ－Ｓｃａｌｅ Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅｘａｃｔカートリッジ５ｍｌ）にてタンパク質をアフィニティー精製した。粗抽出物を、１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６で平衡化した５ｍｌのＰｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅｘａｃｔカートリッジに載せた。このカラムを１０カラム容量の同じバッファーで洗浄し、室温で１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６、１００ｍＭフッ化物とともに４５分間インキュベートした。タンパク質を２カラム容量の１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６でカラムから溶出させた。タグは樹脂に強固に結合して残り、精製されたタンパク質は遊離した。タンパク質を含有する画分をプールし、濃縮した。タンパク質濃度を、ブラッドフォードタンパク質アッセイを用いて測定した。
この粗細胞抽出物から、生産者が推奨しているプロトコールに従い、Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙカラム（ＢＩＯＲＡＤ、Ｂｉｏ－Ｓｃａｌｅ Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅｘａｃｔカートリッジ５ｍｌ）にてタンパク質をアフィニティー精製した。粗抽出物を、１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６で平衡化した５ｍｌのＰｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅｘａｃｔカートリッジに載せた。このカラムを１０カラム容量の同じバッファーで洗浄し、室温で１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６、１００ｍＭフッ化物とともに４５分間インキュベートした。タンパク質を２カラム容量の１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６でカラムから溶出させた。タグは樹脂に強固に結合して残り、精製されたタンパク質は遊離した。タンパク質を含有する画分をプールし、濃縮した。タンパク質濃度を、ブラッドフォードタンパク質アッセイを用いて測定した。
【0096】
野生型および変異型ｇｌｐＫの動態パラメーターの決定
以下の反応：グリセロール＋ＡＴＰ＝＞グリセロール－３－リン酸＋ＡＤＰを触媒するグリセロールキナーゼ活性（ｇｌｐＫ）を、ＮＡＤＨ酸化と酵素的に共役させることにより、ＡＤＰの出現を測定することによって決定した。５０ｍＭ重炭酸ナトリウムｐＨ９、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭホスホエノールピルビン酸、０．２ｍＭ ＮＡＤＨ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５単位のピルビン酸キナーゼ、５単位の乳酸デヒドロゲナーゼを含有する反応混合物（１ｍＬ）を３０℃で５分間インキュベートした。次に、０．０１～５０ｍＭのグリセロールを添加して反応を開始させた。ブランクからは基質グリセロールを省いた。ＮＡＤＨの酸化を３０℃にて、分光光度計で３４０ｎｍにおける吸光度（λ３４０＝６２９０Ｍ－１ｃｍ－１）によりモニタリングした。
以下の反応：グリセロール＋ＡＴＰ＝＞グリセロール－３－リン酸＋ＡＤＰを触媒するグリセロールキナーゼ活性（ｇｌｐＫ）を、ＮＡＤＨ酸化と酵素的に共役させることにより、ＡＤＰの出現を測定することによって決定した。５０ｍＭ重炭酸ナトリウムｐＨ９、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭホスホエノールピルビン酸、０．２ｍＭ ＮＡＤＨ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５単位のピルビン酸キナーゼ、５単位の乳酸デヒドロゲナーゼを含有する反応混合物（１ｍＬ）を３０℃で５分間インキュベートした。次に、０．０１～５０ｍＭのグリセロールを添加して反応を開始させた。ブランクからは基質グリセロールを省いた。ＮＡＤＨの酸化を３０℃にて、分光光度計で３４０ｎｍにおける吸光度（λ３４０＝６２９０Ｍ－１ｃｍ－１）によりモニタリングした。
【0097】
１単位の酵素活性は、１分当たりに１μｍｏｌのＮＡＤＨの減少を触媒する酵素の量と定義された。動態パラメーターは、Ｓｉｇｍａｐｌｏｔでミカエリスーメンテンの式に当てはめることにより求めた。精製酵素のグリセロールに対する比活性および動態パラメーターを表４に示す。
【0098】
【表4】
【0099】
単純な突然変異は、基質グリセロールに対する比活性（Ａ３４７ＴおよびＶ４６６Ｍ）または親和性（Ａ３４７Ｔ）のいずれかを低下させる。この結論はまた二重突然変異体の場合にも当てはまり、これらは触媒活性および親和性を低下させた（Ｈ２２Ｙ／Ａ３４７ＴおよびＶ４６６Ｍ／Ａ３４７Ｔ）。
【0100】
総ての突然変異を合わせた三重突然変異体ｇｌｐＫ＊（Ａ３４７Ｔ／Ｖ４６６Ｍ／Ｈ２２Ｙ）は、触媒効率の強い低下を示し、野生型タンパク質の１５２０ｍＭ－１ｓ－１に比べ３３，９ｍＭ－１ｓ－１ての値であった。
【0101】
結論は、どんな突然変異またはそれらの組合せであっても、グリセロールキナーゼの触媒活性は多かれ少なかれ劇的に低下するということである。従って、ＰＤ０５５７Ｖｃ０５株は低下したｇｌｐＫ触媒活性を有する。
【0102】
Ｂ．ｈｙｄＡ突然変異の特性決定
ｈｙｄＡ遺伝子において同定されたより関連のある突然変異は、以下のｈｙｄＡタンパク質アラインメント：
ｈｙｄＡタンパク質アラインメント：ＣＡ＿Ｃ００２８：ｈｙｄＡ野生型タンパク質およびＣＡ＿Ｃ００２８ ＊ （Ｉ２１０ ＊ ）：末端切断型ｈｙｄＡ ＊ （Ｉ２１０ ＊ ）
ＣＡ＿Ｃ００２８ （１６１）
ＣＡ＿Ｃ００２８＊（Ｉ２１０＊） （１６１）
に開示されるような２１０番のアミノ酸位置に終止コドンの組み込みをもたらす。
ｈｙｄＡ遺伝子において同定されたより関連のある突然変異は、以下のｈｙｄＡタンパク質アラインメント：
ｈｙｄＡタンパク質アラインメント：ＣＡ＿Ｃ００２８：ｈｙｄＡ野生型タンパク質およびＣＡ＿Ｃ００２８ ＊ （Ｉ２１０ ＊ ）：末端切断型ｈｙｄＡ ＊ （Ｉ２１０ ＊ ）
ＣＡ＿Ｃ００２８ （１６１）
【化1】
【化2】
【0103】
この突然変異の表現型の特性評価を行うために、本発明者らは、連続培養中にＰＤ０５５７Ｖｃ０５クローン発酵の水素および二酸化炭素生産を測定した（表５）。発酵ガスサンプルはＳｕｐｅｌＴＭ－Ｉｎｅｒｔ Ｍｕｌｔｉ－Ｌａｙｅｒバッグに採取され、Ｑｕａｄ－Ｌａｂ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにより分析された。Ｈ２およびＣＯ２をＮＦＸ ２０－３０３に従い、μＧＣ／μＴＣＤにより定量した。
【0104】
【表5】
【0105】
これらのデータは、クローンＰＤ０５５７Ｖｃ０５は、もはや水素を生産しないが、例外なく二酸化炭素を生産することを示す。これによりｈｙｄＡ活性が存在しないことが確認される。
【0106】
この結果は、クローン培養のサンプル（細胞抽出物）で行ったプロテオミクス分析により妥当性が確認された。ｈｙｄＡタンパク質は全く検出されない。
【0107】
結論として、クローンＰＤ０５５７Ｖｃ０５は、もはやヒドロゲナーゼ活性を持たない。
【0108】
実施例３：２つの生産株；Ｃ．アセトブチリカムＤＧ１ ｐＳＰＤ５およびＰＤ０００１ＶＥ０５ｃ０８によるＰＤＯおよびＢＡ生産に対するｇｌｐＫ
＊
およびｈｙｄＡ末端切断の影響
ＰＤＯ／ＢＡの生産に対する、クローンＰＤ０５５７Ｖｃ０５において同定された突然変異の影響を確認するために（実施例２参照）、本発明者らは、ｇｌｐＫ＊およびｈｙｄＡ＊対立遺伝子を単独でまたは組み合わせて、これらの遺伝子で改変されていない２つの生産株に導入した。
ＰＤＯ／ＢＡの生産に対する、クローンＰＤ０５５７Ｖｃ０５において同定された突然変異の影響を確認するために（実施例２参照）、本発明者らは、ｇｌｐＫ＊およびｈｙｄＡ＊対立遺伝子を単独でまたは組み合わせて、これらの遺伝子で改変されていない２つの生産株に導入した。
【0109】
遺伝子改変のために選択された２つの受容株は次の通りである：
・ＤＧ１ ｐＳＰＤ５：Ｃ．アセトブチリカムＤＧ１ ｐＳＰＤ５株（刊行物Gonzalez-Pajuelo et al., 2006に記載）
・ＰＤ０００１ＶＥ０５ｃ０８：Ｃ．アセトブチリカムＤＧ１ ｐＳＰＤ５株（特許出願ＷＯ２０１２／０６２８３２に記載されているように単離され、高濃度のグリセリンに適応したクローン）。
・ＤＧ１ ｐＳＰＤ５：Ｃ．アセトブチリカムＤＧ１ ｐＳＰＤ５株（刊行物Gonzalez-Pajuelo et al., 2006に記載）
・ＰＤ０００１ＶＥ０５ｃ０８：Ｃ．アセトブチリカムＤＧ１ ｐＳＰＤ５株（特許出願ＷＯ２０１２／０６２８３２に記載されているように単離され、高濃度のグリセリンに適応したクローン）。
【0110】
上記のＰＤ０５５７Ｖｃ０５株において同定された遺伝子ｇｌｐＫ＊（三重突然変体）およびｈｙｄＡ＊における突然変異をＤＧ１ ｐＳＰＤ５株に導入して菌株８、９および１０を作出し、またはＰＤ０００１ＶＥ０５ｃ０８株に導入して菌株１１、１２および１３を作出した。
【0111】
菌株８～１０はGonzalez-Pajuelo et al., 2006に記載の連続培養条件で培養し
、菌株１１～１３はＷＯ２０１２／０６２８３２に記載されているように培養した。
、菌株１１～１３はＷＯ２０１２／０６２８３２に記載されているように培養した。
【0112】
【表6】
【0113】
それぞれｇｌｐＫ＊（Ｈ２２Ｙ／Ａ３４７Ｔ／Ｖ４６６Ｍ）でグリセロールキナーゼ活性の低下を、およびｈｙｄＡ＊（Ｉ２１０＊）でヒドロゲナーゼ活性の抑制をもたらすｇｌｐＫおよびｈｙｄＡ遺伝子の突然変異の際に、ＰＤＯおよびＢＡの両方の生産性が改善される。
【0114】
実施例４：高濃度の未処理グリセリンを用いた連続培養におけるＰＤ０５５７Ｖｃ０５の性能
菌株：
・ＰＤ０００１ＶＥ０５ｃ０８：Ｃ．アセトブチリカムＤＧ１ ｐＳＰＤ５株（特許出願ＷＯ２０１２／０６２８３２に記載されているように単離され、高濃度のグリセリンに適応したクローン）。
・ＰＤ０５５７Ｖｃ０５：Ｃ．アセトブチリカムＤＧ１ ｐＳＰＤ５株（特許出願ＷＯ２０１２／０６２８３２Ａ１に記載されているように高濃度の未処理の工業グリセリンでのＣ．アセトブチリカム株ＤＧ１ ｐＳＰＤ５タイプ１７４Ｐの連続培養から単離されたクローン）
菌株：
・ＰＤ０００１ＶＥ０５ｃ０８：Ｃ．アセトブチリカムＤＧ１ ｐＳＰＤ５株（特許出願ＷＯ２０１２／０６２８３２に記載されているように単離され、高濃度のグリセリンに適応したクローン）。
・ＰＤ０５５７Ｖｃ０５：Ｃ．アセトブチリカムＤＧ１ ｐＳＰＤ５株（特許出願ＷＯ２０１２／０６２８３２Ａ１に記載されているように高濃度の未処理の工業グリセリンでのＣ．アセトブチリカム株ＤＧ１ ｐＳＰＤ５タイプ１７４Ｐの連続培養から単離されたクローン）
【0115】
培養培地：
水道水１リットル当たりに含有されるクロストリジウムバッチ培養に使用される合成培地：グリセロール、３０ｇ；ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ；Ｋ２ＨＰＯ４、０．５ｇ；ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ；ＣｏＣｌ２ ６Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ；Ｈ２ＳＯ４、０．１ｍｌ；ＮＨ４Ｃｌ、１．５ｇ；ビオチン、０．１６ｍｇ；ｐ－アミノ安息香酸、３２ｍｇおよびＦｅＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．０２８ｇ。培地のｐＨは、３ＮのＮＨ４ＯＨで６．３に調整した。ＳＤＳ Ｃａｒｌｏ＿Ｅｒｂａから購入した市販のグリセロール（純度９９％）をバッチ培養に使用した。水道水１リットル当たりに含有される連続培養の流加培地：未処理グリセリン由来のグリセロール、１０５ｇ；ＫＨ２ＰＯ４、０．４５ｇ；Ｋ２ＨＰＯ４、０．４５ｇ；ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ；ＣｏＣｌ２ ６Ｈ２Ｏ、０．０１３ｇ；ビオチン、０．０８ｍｇ；ｐ－アミノ安息香酸、１６ｍｇ；ＦｅＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．０４ｇ；消泡剤、０，０５ｍｌ；ＺｎＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、８ｍｇ；ＣｕＣｌ２、２Ｈ２Ｏ、４ｍｇ；ＭｎＳＯ４、Ｈ２Ｏ、２０ｍｇ。培地のｐＨは、９６％Ｈ２ＳＯ４で３，５～４に調整した。バイオディーゼルのためのトランスエステル化プロセスからの未処理グリセリンは種々の供給者によって提供されたものであり（Ａｖｒｉｌ、Ｃａｒｏｔｅｃｈ Ｂｅｒｈａｄ）、８０～８６％（ｗ／ｗ）の純度であった。これらのグリセリンをブレンドし、酸性化により前処理した。
水道水１リットル当たりに含有されるクロストリジウムバッチ培養に使用される合成培地：グリセロール、３０ｇ；ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ；Ｋ２ＨＰＯ４、０．５ｇ；ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ；ＣｏＣｌ２ ６Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ；Ｈ２ＳＯ４、０．１ｍｌ；ＮＨ４Ｃｌ、１．５ｇ；ビオチン、０．１６ｍｇ；ｐ－アミノ安息香酸、３２ｍｇおよびＦｅＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．０２８ｇ。培地のｐＨは、３ＮのＮＨ４ＯＨで６．３に調整した。ＳＤＳ Ｃａｒｌｏ＿Ｅｒｂａから購入した市販のグリセロール（純度９９％）をバッチ培養に使用した。水道水１リットル当たりに含有される連続培養の流加培地：未処理グリセリン由来のグリセロール、１０５ｇ；ＫＨ２ＰＯ４、０．４５ｇ；Ｋ２ＨＰＯ４、０．４５ｇ；ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ；ＣｏＣｌ２ ６Ｈ２Ｏ、０．０１３ｇ；ビオチン、０．０８ｍｇ；ｐ－アミノ安息香酸、１６ｍｇ；ＦｅＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．０４ｇ；消泡剤、０，０５ｍｌ；ＺｎＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、８ｍｇ；ＣｕＣｌ２、２Ｈ２Ｏ、４ｍｇ；ＭｎＳＯ４、Ｈ２Ｏ、２０ｍｇ。培地のｐＨは、９６％Ｈ２ＳＯ４で３，５～４に調整した。バイオディーゼルのためのトランスエステル化プロセスからの未処理グリセリンは種々の供給者によって提供されたものであり（Ａｖｒｉｌ、Ｃａｒｏｔｅｃｈ Ｂｅｒｈａｄ）、８０～８６％（ｗ／ｗ）の純度であった。これらのグリセリンをブレンドし、酸性化により前処理した。
【0116】
実験の設定：
連続培養は５ＬのバイオリアクターＴｒｙｔｏｎ（Ｐｉｅｒｒｅ Ｇｕｅｒｉｎ、フランス）にて実行容量２０００ｍＬで行った。培養容量は培養水準の自動調節により２０００ｍＬで一定に維持した。培養を２００ＲＰＭで撹拌し、温度を３５℃に設定し、ｐＨを５．５ＮのＮＨ４ＯＨの自動添加により６．５で一定に維持した。嫌気性条件を作り出すために、容器内の滅菌培地を６０℃で１時間、無菌のＯ２不含窒素でフラッシュし、３５℃になるまで再びフラッシュした（２時間のフラッシュ）。バイオリアクターガスの出口は、ピロガロールを配置することによって酸素から保護した(Vasconcelos et al., 1994)。滅菌の後、流加培地をまた無菌のＯ２不含窒素で室温になるまでフラッシュし、Ｏ２が入らないように窒素下で維持した。
連続培養は５ＬのバイオリアクターＴｒｙｔｏｎ（Ｐｉｅｒｒｅ Ｇｕｅｒｉｎ、フランス）にて実行容量２０００ｍＬで行った。培養容量は培養水準の自動調節により２０００ｍＬで一定に維持した。培養を２００ＲＰＭで撹拌し、温度を３５℃に設定し、ｐＨを５．５ＮのＮＨ４ＯＨの自動添加により６．５で一定に維持した。嫌気性条件を作り出すために、容器内の滅菌培地を６０℃で１時間、無菌のＯ２不含窒素でフラッシュし、３５℃になるまで再びフラッシュした（２時間のフラッシュ）。バイオリアクターガスの出口は、ピロガロールを配置することによって酸素から保護した(Vasconcelos et al., 1994)。滅菌の後、流加培地をまた無菌のＯ２不含窒素で室温になるまでフラッシュし、Ｏ２が入らないように窒素下で維持した。
【0117】
バッチおよび連続培養法：
１００ｍＬのペニシリンフラスコにて合成培地上で増殖している培養物を対数増殖期の終了時に採取したもの（酢酸２．２ｇ．Ｌ－１およびＭＯＰＳ ２３．０３ｇ．Ｌ－１を添加すること以外はバッチ培養に関して上記したものと同じ）を播種物として使用した（５％ｖ／ｖ）。
１００ｍＬのペニシリンフラスコにて合成培地上で増殖している培養物を対数増殖期の終了時に採取したもの（酢酸２．２ｇ．Ｌ－１およびＭＯＰＳ ２３．０３ｇ．Ｌ－１を添加すること以外はバッチ培養に関して上記したものと同じ）を播種物として使用した（５％ｖ／ｖ）。
【0118】
培養物をまずバッチ増殖させた。対数増殖期の初期に、本発明者らは未処理グリセリン由来のグリセロールパルスを行った：パルスとしては、未処理グリセリン由来グリセロール１０５ｇ．Ｌ－１を含む合成培地（流加培養に関して記載したものと同じ）を３時間、静的流速で添加した（すなわち、１８ｇ．Ｌ－１のグリセロールの添加）。その後、バッチ培養で増殖を続けた後、対数増殖期の終了前に希釈率０．０３５ｈ－１で連続流加を開始した。流加培地は未処理グリセリン由来のグリセロール１０５ｇ．Ｌ－１を含有する。バイオリアクターへの播種の６～１３日後で、４滞留時間(residence times)（ＲＴ）の後に、５日間で希釈率を０．０３５ｈ－１から０．０７０ｈ－１に高めた。その後、下記のＨＰＬＣプロトコールを用い、ＰＤＯ生産およびグリセロール消費により培養の安定化を追跡した。特に、本発明者らは、残存グリセリン濃度ができる限り低くなるまで待った。
【0119】
ＰＤ０５５７Ｖｃ０５の総合的な性能を以下の表７に示し、Ｂ６０に記載の培養培地、バッチおよび連続法で得られたＰＤ０００１ＶＥ０５ｃ０８の性能と比較する。これらの工程条件は、希釈率０．０２５ｈ－１で開始し、希釈率０．０６ｈ－１に達したに過ぎなかった。ＰＤ０００１ＶＥ０５ｃ０８は、本実施例に記載され、変異株ＰＤ０５５７Ｖｃ０５に適用された、より希釈率の高い（希釈率０．０３５ｈ－１で始め、希釈率０．０７ｈ－１に達する）工程条件では流出(washout)した。
【0120】
分析手順：
細胞濃度を６２０ｎｍでの濁度により測定し、直接測定した細胞乾重と相関させた。グリセロール、１，３－プロパンジオール、エタノール、乳酸、酢酸および酪酸濃度は、ＨＰＬＣ分析により測定した。Ｂｉｏｒａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｈカラムにより分離を行い、屈折率により検出した。作動条件は次の通り：移動相 硫酸０．５ｍＭ；流速０．５ｍｌ／分、温度、２５℃。
細胞濃度を６２０ｎｍでの濁度により測定し、直接測定した細胞乾重と相関させた。グリセロール、１，３－プロパンジオール、エタノール、乳酸、酢酸および酪酸濃度は、ＨＰＬＣ分析により測定した。Ｂｉｏｒａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｈカラムにより分離を行い、屈折率により検出した。作動条件は次の通り：移動相 硫酸０．５ｍＭ；流速０．５ｍｌ／分、温度、２５℃。
【0121】
【表7】
【0122】
これらの結果は、上記の実施例で記載され特性評価されたｇｌｐＫおよびｈｙｄＡ遺伝子に突然変異を有するクローンＰＤ０５５７Ｖｃ０５は、クローンＰＤ０００１ＶＥ０５ｃ０８よりも高い生産性でＰＤＯおよびＢＡを生産することを示す。この増加は、両生成物に関して１０％を超える生産性であるので有意である（太字のデータ）。
【0123】
上述の重要な事実は、ＰＤ０５５７Ｖｃ０５とは対照的に、ＰＤ０００１ＶＥ０５ｃ０８株は０．０７ｈ－１の希釈率に達することができないということであり、これにより、細菌の増殖速度ならびにＰＤＯおよびＢＡ生産性に対する、特許請求される突然変異のプラスの影響が確認される。
【0124】
さらに、ＷＯ２０１２／０６２８３２に記載の培養条件をＰＤ０５５７Ｖｃ０５株に適用したところ、前記株の性能はＰＤ０００１ＶＥ０５ｃ０８のものより良好であった（データは示されていない）。
【0125】
実施例５：高濃度の未処理グリセリンを用いた連続培養におけるＰＤ０５５７Ｖｃ０５株、Ｃ．スポロゲネスおよびＣ．スフェノイデスを含んでなる微生物コンソーシアムの性能
新規なＰＤ０５５７Ｖｃ０５株を用いてＰＤＯおよびＢＡの生産を改善するために、本発明者らは、このような生産の改善が従前に示されている（データは開示されていない）細菌のコンソーシアムを再び作出することにした。よって、このコンソーシアムは、ＰＤ０５５７Ｖｃ０５への微生物Ｃ．スフェノイデスおよびＣ．スポロゲネスの添加によって再構成されたものである。「ＰＤ０５５７Ｖｃ０５コンソーシアム」と命名されたこの新規なコンソーシアムは、以下の「バッチおよび連続培養法」の節に記載されるように連続培養の最初の数日の間に作出した。
新規なＰＤ０５５７Ｖｃ０５株を用いてＰＤＯおよびＢＡの生産を改善するために、本発明者らは、このような生産の改善が従前に示されている（データは開示されていない）細菌のコンソーシアムを再び作出することにした。よって、このコンソーシアムは、ＰＤ０５５７Ｖｃ０５への微生物Ｃ．スフェノイデスおよびＣ．スポロゲネスの添加によって再構成されたものである。「ＰＤ０５５７Ｖｃ０５コンソーシアム」と命名されたこの新規なコンソーシアムは、以下の「バッチおよび連続培養法」の節に記載されるように連続培養の最初の数日の間に作出した。
【0126】
培養培地：
水道水１リットル当たりに含有されるクロストリジウムバッチ培養に使用される合成培地：グリセロール、３０ｇ；ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ；Ｋ２ＨＰＯ４、０．５ｇ；ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ；ＣｏＣｌ２ ６Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ；Ｈ２ＳＯ４、０．１ｍｌ；ＮＨ４Ｃｌ、１．５ｇ；ビオチン、０．１６ｍｇ；ｐ－アミノ安息香酸、３２ｍｇおよびＦｅＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．０２８ｇ。培地のｐＨは、３ＮのＮＨ４ＯＨで６．３に調整した。ＳＤＳ Ｃａｒｌｏ＿Ｅｒｂａ（純度９９％）から購入した市販のグリセロールをバッチ培養に使用した。水道水１リットル当たりに含有される連続培養の流加培地：未処理グリセリン由来のグリセロール（純度８０～８６％ｗ：ｗ）、１０５ｇ；ＫＨ２ＰＯ４、０．４５ｇ；Ｋ２ＨＰＯ４、０．４５ｇ；ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ；ＣｏＣｌ２ ６Ｈ２Ｏ、０．０１３ｇ；ビオチン、０．０８ｍｇ；ｐ－アミノ安息香酸、１６ｍｇ；ＦｅＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．０４ｇ；消泡剤、０，０５ｍｌ；ＣｕＣｌ２、２Ｈ２Ｏ、２ｍｇ；ＭｎＳＯ４、Ｈ２Ｏ、２０ｍｇ。培地のｐＨは、９６％Ｈ２ＳＯ４で３．５～４に調整した。グリセリンは酸性化により前処理した。
水道水１リットル当たりに含有されるクロストリジウムバッチ培養に使用される合成培地：グリセロール、３０ｇ；ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ；Ｋ２ＨＰＯ４、０．５ｇ；ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ；ＣｏＣｌ２ ６Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ；Ｈ２ＳＯ４、０．１ｍｌ；ＮＨ４Ｃｌ、１．５ｇ；ビオチン、０．１６ｍｇ；ｐ－アミノ安息香酸、３２ｍｇおよびＦｅＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．０２８ｇ。培地のｐＨは、３ＮのＮＨ４ＯＨで６．３に調整した。ＳＤＳ Ｃａｒｌｏ＿Ｅｒｂａ（純度９９％）から購入した市販のグリセロールをバッチ培養に使用した。水道水１リットル当たりに含有される連続培養の流加培地：未処理グリセリン由来のグリセロール（純度８０～８６％ｗ：ｗ）、１０５ｇ；ＫＨ２ＰＯ４、０．４５ｇ；Ｋ２ＨＰＯ４、０．４５ｇ；ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ；ＣｏＣｌ２ ６Ｈ２Ｏ、０．０１３ｇ；ビオチン、０．０８ｍｇ；ｐ－アミノ安息香酸、１６ｍｇ；ＦｅＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．０４ｇ；消泡剤、０，０５ｍｌ；ＣｕＣｌ２、２Ｈ２Ｏ、２ｍｇ；ＭｎＳＯ４、Ｈ２Ｏ、２０ｍｇ。培地のｐＨは、９６％Ｈ２ＳＯ４で３．５～４に調整した。グリセリンは酸性化により前処理した。
【0127】
実験の設定：
連続培養は５ＬのバイオリアクターＴｒｙｔｏｎ（Ｐｉｅｒｒｅ Ｇｕｅｒｉｎ、フランス）にて実行容量２０００ｍＬで行った。培養容量は培養水準の自動調節により２０００ｍＬで一定に維持した。培養を２００ＲＰＭで撹拌し、温度を３５℃に設定し、ｐＨを５．５ＮのＮＨ４ＯＨの自動添加により６．５で一定に維持した。嫌気性条件を作り出すために、容器内の滅菌培地を６０℃で１時間、無菌のＯ２不含窒素でフラッシュし、３５℃になるまで再びフラッシュした（２時間のフラッシュ）。バイオリアクターガスの出口は、ピロガロールを配置することによって酸素から保護した(Vasconcelos et al., 1994)。滅菌の後、流加培地をまた無菌のＯ２不含窒素で室温になるまでフラッシュし、Ｏ２が入らないように窒素下で維持した。
連続培養は５ＬのバイオリアクターＴｒｙｔｏｎ（Ｐｉｅｒｒｅ Ｇｕｅｒｉｎ、フランス）にて実行容量２０００ｍＬで行った。培養容量は培養水準の自動調節により２０００ｍＬで一定に維持した。培養を２００ＲＰＭで撹拌し、温度を３５℃に設定し、ｐＨを５．５ＮのＮＨ４ＯＨの自動添加により６．５で一定に維持した。嫌気性条件を作り出すために、容器内の滅菌培地を６０℃で１時間、無菌のＯ２不含窒素でフラッシュし、３５℃になるまで再びフラッシュした（２時間のフラッシュ）。バイオリアクターガスの出口は、ピロガロールを配置することによって酸素から保護した(Vasconcelos et al., 1994)。滅菌の後、流加培地をまた無菌のＯ２不含窒素で室温になるまでフラッシュし、Ｏ２が入らないように窒素下で維持した。
【0128】
バッチおよび連続培養法：
１００ｍＬのペニシリンフラスコにて合成培地（酢酸２．２ｇ．Ｌ－１およびＭＯＰＳ ２３．０３ｇ．Ｌ－１を添加すること以外はバッチ培養に関して上記したものと同じ）上で増殖しているＰＤ０５５７Ｖｃ０５培養物を対数増殖期の終了時に採取したものを播種物として使用した（５％ｖ／ｖ）。
１００ｍＬのペニシリンフラスコにて合成培地（酢酸２．２ｇ．Ｌ－１およびＭＯＰＳ ２３．０３ｇ．Ｌ－１を添加すること以外はバッチ培養に関して上記したものと同じ）上で増殖しているＰＤ０５５７Ｖｃ０５培養物を対数増殖期の終了時に採取したものを播種物として使用した（５％ｖ／ｖ）。
【0129】
培養物をまずバッチ増殖させた。対数増殖期の初期に、本発明者らは未処理グリセリン由来のグリセロールパルスを行った：パルスとしては、未処理グリセリン由来グリセロール１０５ｇ．Ｌ－１を含む合成培地（流加培養に関して記載したものと同じ）を３時間、静的流速で添加した（すなわち、１８ｇ．Ｌ－１のグリセロールの添加）。その後、連続バッチ増殖を続け、対数増殖期の終了前に希釈率０．０３５ｈ-１での連続的流加が開始した。流加培地は未処理グリセリン由来のグリセロール１０５ｇ．Ｌ－１を含有した。バイオリアクターへの播種の８日後に、Ｃ．スポロゲネスおよびＣ．スフェノイデスの微生物コンソーシアムを、バイオリアクター内の光学密度（６２０ｎｍ）がそれぞれ０．００９ｕＯＤおよび０．３１７ｕＯＤとなるように添加した。培養の安定化の後、希釈率を０．０３５ｈ－１から０．０７０ｈ－１に高めた。その後、下記のＨＰＬＣプロトコールを用い、１，３－プロパンジオール生産、酪酸生産およびグリセロール消費により培養の安定化を追跡した。特に、本発明者らは、残存グリセリン濃度ができる限り低くなるまで待った。ＰＤ０５５７Ｖｃ０５コンソーシアムの総合的な性能を以下の表８に示し、Ｃ．スポロゲネスおよびＣ．スフェノイデスを伴わないＰＤ０５５７Ｖｃ０５の性能と比較する。
【0130】
分析手順：
細胞濃度を６２０ｎｍでの濁度により測定し、直接測定した細胞乾重と相関させた。グリセロール、１，３－プロパンジオール、エタノール、乳酸、酢酸および酪酸濃度は、ＨＰＬＣ分析により測定した。Ｂｉｏｒａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｈカラムにより分離を行い、屈折率により検出した。作動条件は次の通り：移動相 硫酸０．５ｍＭ；流速０．５ｍｌ／分、温度、２５℃。
細胞濃度を６２０ｎｍでの濁度により測定し、直接測定した細胞乾重と相関させた。グリセロール、１，３－プロパンジオール、エタノール、乳酸、酢酸および酪酸濃度は、ＨＰＬＣ分析により測定した。Ｂｉｏｒａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｈカラムにより分離を行い、屈折率により検出した。作動条件は次の通り：移動相 硫酸０．５ｍＭ；流速０．５ｍｌ／分、温度、２５℃。
【0131】
【表8】
【0132】
これらの結果は、ＰＤ０５５７Ｖｃ０５コンソーシアムは、ＰＤＯおよびＢＡの両方においてＰＤ０５５７Ｖｃ０５株よりも良好な生産性能を有することを示す（太字のデータ）。実際に、ＰＤ０５５７Ｖｃ０５コンソーシアムは、より高いＰＤＯおよびＢＡ力価、より高いＰＤＯ収量および低い残存グリセリンを示し、これはこの技術の明らかな全体的改善を意味する。
【0133】
微生物コンソーシアムの定量
ＤＮＡの単離
Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）２４ライザー／ホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サン・カンタン・イヴリーヌ、フランス）を用い、Ｇｌａｓｓ Ｂｅａｄ Ｔｕｂｅ Ｋｉｔ、０．１ｍｍで、１ｍＬの培養物からゲノムＤＮＡを抽出し、ホモジナイズし、２ｍＬチューブに移した。Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）２４の設定は、６５００ｒｐｍ、サイクル持続時間２０秒、サイクル間の遅延時間５秒、合計２サイクルとした。Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ抽出の後、溶解液を１０，０００ｇで１０分間遠心分離し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ゲルおよびＭａｃｈｅｒｅｙ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、Ｈｏｅｒｄｔ、フランス）からのＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐを用いて上清を総ゲノム抽出に使用した。
ＤＮＡの単離
Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）２４ライザー／ホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サン・カンタン・イヴリーヌ、フランス）を用い、Ｇｌａｓｓ Ｂｅａｄ Ｔｕｂｅ Ｋｉｔ、０．１ｍｍで、１ｍＬの培養物からゲノムＤＮＡを抽出し、ホモジナイズし、２ｍＬチューブに移した。Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）２４の設定は、６５００ｒｐｍ、サイクル持続時間２０秒、サイクル間の遅延時間５秒、合計２サイクルとした。Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ抽出の後、溶解液を１０，０００ｇで１０分間遠心分離し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ゲルおよびＭａｃｈｅｒｅｙ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、Ｈｏｅｒｄｔ、フランス）からのＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐを用いて上清を総ゲノム抽出に使用した。
【0134】
定量的ＰＣＲによるＰＤ０５５７Ｖｃ０５コンソーシアムの定量
ＰＣＲ技術などの分子技術などの最近の進展は、例えば本特許出願では発酵生産からの培養液の場合のような異なるタイプの環境での、潜在的微生物の迅速、特異的かつ高感度の検出および同定を可能とする。
ＰＣＲ技術などの分子技術などの最近の進展は、例えば本特許出願では発酵生産からの培養液の場合のような異なるタイプの環境での、潜在的微生物の迅速、特異的かつ高感度の検出および同定を可能とする。
【0135】
サンプルの絶対定量値は、Ｓｓｏ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－ｒａｄ Ｍｉｔｒｙ Ｍｏｒｙ、フランス）を用いた定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により決定した。ｑＰＣＲは、ＣＦＸ９６ＴＭリアルタイムシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｍｉｔｒｙ Ｍｏｒｙ、フランス）を備えたＢｉｏ－Ｒａｄ Ｃ１０００ＴＭサーマルサイクラーで行った。
【0136】
反応混合物は、１×Ｓｓｏ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｍｉｔｒｙ Ｍｏｒｙ、フランス）、６μＬの各フォワード（Ｆ）およびリバース（Ｒ）プライマー（１μＭ）、２μＬの希釈サンプル（２ｎｇ／μＬ Ｎａｎｏｄｒｏｐ ｍｅａｓｕｒｅから）および最終容量２０μＬとするためのヌクレアーゼ不含水からなった。増幅は以下のサーマルサイクルプログラムに従って行った：９８℃で２分間の初期融解（１回）、次いで、９８℃で１０秒の融解、６０℃で３０秒間のプライマーのアニーリングおよび伸張４０回（メルトカーブ６５～９５℃、５秒毎に０．５℃上昇）。
【0137】
既知濃度のゲノムＤＮＡ希釈系のＣｑ値を用い、各微生物について標準曲線を決定した。各ウェル（標準曲線およびサンプル）のＣｑ値をＣＦＸ ＭａｎａｇｅｒＴＭ３．１ソフトウエアにより決定した。これらのサンプルを標準曲線に対してプロットし、核酸の存在量を決定した。絶対量は、Ｃ．アセトブチリカム１細胞当たりｇａｐＣ遺伝子１コピー、Ｃ．スフェノイデス１細胞当たりｃｐｎ６０遺伝子１コピー、およびＣ．スポロゲネス１細胞当たりｔｐｉ遺伝子１コピーに基づいた。抽出効率の測定値は得られないことから、計算のために、核酸抽出を完全なものと仮定した。
【0138】
サンプル中の各微生物の存在量は、ＣＦＸ９６ＴＭリアルタイムシステムを備えたＢｉｏ－Ｒａｄ Ｃ１０００ＴＭサーマルサイクラーにて、Ｓｓｏ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－ｒａｄ Ｍｉｔｒｙ Ｍｏｒｙ、フランス）を用いた定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により決定した。Ｃ．アセトブチリカムの標的化に用いたｇａｐＣ遺伝子に基づくプライマーは、ｇａｐＣ＿Ｆ、５’－ＴＧＣＴＧＣＴＧＴＡＡＧＴＡＴＣＡＴＣ－３’（配列番号４２）およびｇａｐＣ＿Ｒ、５’－ＧＴＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＣＴＣＴＴ－３’（配列番号４３）であった。Ｃ．スフェノイデスの標的化に用いたｃｐｎ６０遺伝子に基づくプライマーは、ｃｐｎ６０＿Ｆ、５’－ＴＴＡＴＡＴＧＴＧＣＡＣＣＧＡＴＡＴＧ－３’（配列番号４４）およびｃｐｎ６０＿Ｒ、５’－ＧＡＧＡＡＧＴＣＴＴＧＣＧＣＣＧＧＡＣ－３’（配列番号４５）であった。Ｃ．スポロゲネスの標的化に用いたｔｐｉ遺伝子に基づくプライマーは、ｔｐｉ＿Ｆ、５’－ＣＣＡＧＣＧＧＴＡＴＴＡＧＡＡＧＡＡ－３’（配列番号４６）およびｔｐｉ＿Ｒ、５’－ＧＴＣＣＴＡＴＡＡＴＴＡＣＡＴＡＡＴＧＡＡＣＴＣ－３’（配列番号４７）であった。
【0139】
下表に、培養物に含有される細胞の総体を１００％とした場合に、ＰＤ０５５７Ｖｃ０５コンソーシアム中に存在する異なる種が表すパーセンテージを示す。
【0140】
【表9】
【0141】
参照文献
【配列表】