知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ アンスティチュー・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィックの特許一覧
特許7569787紙パルプ廃棄物ストリームからのポリヒドロキシアルカン酸の製造
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-09
(45)【発行日】2024-10-18
(54)【発明の名称】紙パルプ廃棄物ストリームからのポリヒドロキシアルカン酸の製造
(51)【国際特許分類】
C12P 7/40 20060101AFI20241010BHJP
C12P 7/625 20220101ALI20241010BHJP
C12N 1/00 20060101ALN20241010BHJP
C12N 1/20 20060101ALN20241010BHJP
【ＦＩ】
C12P7/40
C12P7/625
C12N1/00 G
C12N1/20 A
【請求項の数】
17
(21)【出願番号】P 2021534211
(86)(22)【出願日】2019-12-12
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-10
(86)【国際出願番号】 CA2019051797
(87)【国際公開番号】W WO2020118439
(87)【国際公開日】2020-06-18
【審査請求日】2022-12-07
(31)【優先権主張番号】62/778,349
(32)【優先日】2018-12-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】521257488
【氏名又は名称】アンスティチュー・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィック
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(72)【発明者】
【氏名】チャギ，ラジェシュワ・ダヤル
(72)【発明者】
【氏名】カウル，ラージウィンダー
【審査官】坂崎 恵美子
(56)【参考文献】
【文献】International Journal of Biological Macromolecules，Vol.80，2015年，p.627-635，https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2015.07.034.
【文献】Practice Periodical of Hazardous, Toxic, and Radioactive Waste Management，Vol.12, No.4，2008年，p.1399-1405
【文献】J Ind Microbiol Biotechnol.，Vol.39, No.3，2011年，p.459-469，DOI 10.1007/s10295-011-1040-6
【文献】Bioengineering，Vol.4, No.53，2017年，https://doi.org/10.3390/bioengineering4020053
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｐ ７／４０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）を製造する方法であって、 浮遊物質（ＳＳ）を含む二次スラッジからなる廃棄物ストリームを提供する工程、
前記廃棄物ストリームを処理して、処理された廃棄物ストリームを生成する工程であって、該処理は、
ｉ）浮遊物質１ｇあたり０．０５～０．５ｇの量のカルシウム含有ミネラルを廃棄物ストリームに添加する工程、および
ｉｉ）カルシウム含有ミネラルの存在下で廃棄物ストリームを熱処理して、廃棄物ストリームを滅菌する工程を含み、
前記処理された廃棄物ストリームを炭素源として含む培養液を調製する工程、
少なくとも１株のＰＨＡ産生微生物を培養液に添加する工程；および
前記培養液に第二の炭素源を添加する工程；
前記培養液を発酵に供して、炭素源および第二の炭素源を用いてＰＨＡ産生微生物によるＰＨＡ産生を開始させ、ＰＨＡ産生微生物に蓄積されたＰＨＡを含む発酵混合物を調製する工程；および
前記発酵混合物を細胞破砕に供し、ＰＨＡ産生微生物からＰＨＡを抽出して、抽出されたＰＨＡと細胞物質からなる抽出混合物を調製する工程、
ここで、カルシウム含有ミネラルが、廃棄物ストリームの熱処理前および／または熱処理中に廃棄物ストリームに添加され、
ここで、ＰＨＡ産生微生物の少なくとも１つの株が、発酵の前および／または発酵の間に培養液に添加され；および、
第二の炭素源は、発酵の前および／または発酵の間に培養液に添加される、
前記方法。
【請求項2】
前記廃棄物ストリームは、パルプおよび紙活性汚泥ストリームである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記カルシウム含有ミネラルは、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、および酸化カルシウムの少なくとも１つを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記廃棄物ストリームに前記カルシウム含有ミネラルを添加するステップの前に、前記廃棄物ストリームをろ過して粗大な繊維を除去し、それによって廃棄物ストリームろ液を得るステップをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記廃棄物ストリームに前記カルシウム含有ミネラルを添加するステップの前に、前記廃棄物ストリームろ液について、ろ別されない固体を沈降させてデカンテーションし、それによってデカンテーションされた廃棄物ストリームを得るステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記廃棄物ストリームに前記カルシウム含有ミネラルを添加し、前記カルシウム含有ミネラルの存在中で前記廃棄物ストリームを加熱処理して前記廃棄物ストリームを滅菌することにより前記処理廃棄物ストリームを製造することを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記廃棄物ストリームに前記カルシウム含有ミネラルを添加するステップの前に、前記デカンテーションされた廃棄物ストリームを洗浄して洗浄固体を得るステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記デカンテーションされた廃棄物ストリームの洗浄は、前記デカンテーションされた廃棄物ストリームを遠心分離して遠心分離固体を得るステップを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記廃棄物ストリームに前記カルシウム含有ミネラルを添加するステップの前に、前記廃棄物ストリーム中の浮遊物質（ＳＳ）濃度を所定の濃度である５ｇ／Ｌから５０ｇ／Ｌの間に調整して調質廃棄物ストリームを得るステップと、
前記カルシウム含有ミネラルを前記調質廃棄物ストリームに添加するステップと
をさらに含み、前記廃棄物ストリームの加熱処理が、前記調質廃棄物ストリームを加熱処理するステップを含む、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記所定の濃度は、１０ｇ／Ｌから２０ｇ／Ｌの間である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記第２の炭素源は、カルボン酸、単糖類、油、アルコール、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記発酵ステップは、前記培養液のｐＨを６．５から７．５の間に維持するステップ、および／または温度を２５℃から３５℃の間に維持するステップを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記発酵ステップの前および／または前記発酵ステップ中に、前記培養液にミネラル源を添加するステップをさらに含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記ＰＨＡ産生微生物の少なくとも１つの株は、ＰＨＡ産生微生物の単一株である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記ＰＨＡ産生微生物の少なくとも１つの株は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ １１５９９、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｕｅｚｅｎｎｅｉ ｂｉｏｖａｒ．Ｔｉｋｅｈａｕ、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、組み換えＥ．ｃｏｌｉ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＡＴＭ、Ｐｌａｓｔｉｃｉｃｕｍｕｌａｎｓ ａｃｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｅｑｕｉｌｅｎｓｉｓ、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｈ．ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ａ２ａ５、およびＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６からなる群から選択される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記発酵混合物を細胞破砕に供する工程は、前記ＰＨＡ産生微生物の少なくとも一部を溶解させるよう発酵混合物を加熱処理し、それによって前記ＰＨＡを放出させるステップを含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記ＰＨＡ産生微生物の炭素消費量に基づき、前記培養液中の炭素濃度を最適炭素濃度に維持するステップを含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
[001]本技術分野は、全体として、バイオプラスチックの分野に関する。より具体的には、本技術分野は、紙パルプ製造から出る廃棄物ストリームといった廃棄物からのポリヒドロキシアルカン酸の製造に関する。
【背景技術】
【0002】
[002]ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）は、生分解性および生体適合性を有する熱可塑性プラスチック類であり、微生物によって産生されうる。通常、生体高分子の製造、特にＰＨＡ製造における費用効率は、必要な原材料の価格によって決まる。例えば、原材料の価格は、費用の５０％にまで相当することもある。従って、ＰＨＡ製造において経済的実現可能性を達成するには、廃材由来の安価な炭素源を使用することにより、効率的な発酵プロセスを開発する必要がある。
【発明の概要】
【0003】
[003]一態様において、リグノセルロース材料を含む廃棄物ストリームを提供するステップと、廃棄物ストリームにカルシウム含有ミネラルを添加するステップと、カルシウム含有ミネラルの存在中で廃棄物ストリームを加熱処理して廃棄物ストリームを滅菌し、処理廃棄物ストリームを得るステップと、炭素源として処理廃棄物ストリームを含む培養培地中で、ＰＨＡ産生微生物の少なくとも１つの株を発酵させてＰＨＡを製造するステップと、ＰＨＡ産生微生物からＰＨＡを抽出するステップとを含む、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）を製造する方法が提供される。
【0004】
[004]別の態様において、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）を製造するための炭素源を調製する方法であって、リグノセルロース材料を含む廃棄物ストリームを提供するステップと、廃棄物ストリームにカルシウム含有ミネラルを添加するステップと、カルシウム含有ミネラルの存在中で廃棄物ストリームを加熱処理して廃棄物ストリームを滅菌し、ＰＨＡを製造するための炭素源として処理廃棄物ストリームを得るステップとを含む、方法が提供される。
【0005】
[005]一部の実施形態において、廃棄物ストリームは、紙パルプ活性汚泥ストリームである。
[006]一部の実施形態において、カルシウム含有ミネラルは、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、および酸化カルシウムの少なくとも１つを含む。
[006]一部の実施形態において、カルシウム含有ミネラルは、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、および酸化カルシウムの少なくとも１つを含む。
【0006】
[007]一部の実施形態において、カルシウム含有ミネラルは、水酸化カルシウムを含む。
[008]一部の実施形態において、カルシウム含有ミネラルは、石灰を含む。
[008]一部の実施形態において、カルシウム含有ミネラルは、石灰を含む。
【0007】
[009]一部の実施形態において、廃棄物ストリームにカルシウム含有ミネラルを添加するステップは、廃棄物ストリームの加熱処理の前に行われる。
[010]一部の実施形態において、廃棄物ストリームにカルシウム含有ミネラルを添加するステップは、廃棄物ストリームの加熱処理中に行われる。
[010]一部の実施形態において、廃棄物ストリームにカルシウム含有ミネラルを添加するステップは、廃棄物ストリームの加熱処理中に行われる。
【0008】
[011]一部の実施形態において、廃棄物ストリームの加熱処理は、少なくとも１２０℃の温度で行われる。
[012]一部の実施形態において、方法は、廃棄物ストリームにカルシウム含有ミネラルを添加するステップの前に、廃棄物ストリームをろ過して粗大な繊維を除去し、それによって廃棄物ストリームろ液を得るステップをさらに含む。
[012]一部の実施形態において、方法は、廃棄物ストリームにカルシウム含有ミネラルを添加するステップの前に、廃棄物ストリームをろ過して粗大な繊維を除去し、それによって廃棄物ストリームろ液を得るステップをさらに含む。
【0009】
[013]一部の実施形態において、方法は、廃棄物ストリームにカルシウム含有ミネラルを添加するステップの前に、廃棄物ストリームろ液について、ろ別されない固体を沈降させてデカンテーションし、それによってデカンテーションされた廃棄物ストリームを得るステップをさらに含む。
【0010】
[014]一部の実施形態において、方法は、廃棄物ストリームにカルシウム含有ミネラルを添加するステップの前に、デカンテーションされた廃棄物ストリームを洗浄して洗浄固体を得るステップをさらに含む。
【0011】
[015]一部の実施形態において、デカンテーションされた廃棄物ストリームの洗浄は、デカンテーションされた廃棄物ストリームを遠心分離して遠心分離固体を得るステップを含む。
【0012】
[016]一部の実施形態において、方法は、水性媒体中に遠心分離固体を再懸濁させて懸濁液を得るステップと、懸濁液を再遠心分離して遠心分離固体を得るステップとをさらに含む。
【0013】
[017]一部の実施形態において、方法は、廃棄物ストリームにカルシウム含有ミネラルを添加するステップの前に、廃棄物ストリーム中の浮遊物質（ＳＳ：ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ ｓｏｌｉｄｓ）濃度を所定の濃度に調整して調質廃棄物ストリームを得るステップと、カルシウム含有ミネラルを調質廃棄物ストリームに添加するステップとをさらに含み、廃棄物ストリームの加熱処理が、調質廃棄物ストリームを加熱処理するステップを含む。
【0014】
[018]一部の実施形態において、ＳＳ濃度の調整は、洗浄固体に対して行われる。
[019]一部の実施形態において、所定の濃度は、５ｇ／Ｌから５０ｇ／Ｌの間である。
[020]一部の実施形態において、所定の濃度は、１０ｇ／Ｌから２０ｇ／Ｌの間である。
[019]一部の実施形態において、所定の濃度は、５ｇ／Ｌから５０ｇ／Ｌの間である。
[020]一部の実施形態において、所定の濃度は、１０ｇ／Ｌから２０ｇ／Ｌの間である。
【0015】
[021]一部の実施形態において、方法は、発酵ステップの前および／または発酵ステップ中に、培養培地に第２の炭素源を添加するステップをさらに含む。
[022]一部の実施形態において、第２の炭素源は、カルボン酸、単糖類、油、アルコール、またはそれらの組み合わせを含む。
[022]一部の実施形態において、第２の炭素源は、カルボン酸、単糖類、油、アルコール、またはそれらの組み合わせを含む。
【0016】
[023]一部の実施形態において、カルボン酸は、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、その塩、またはそれらの組み合わせを含む。
[024]一部の実施形態において、単糖類は、グルコース、マンニトール、スクロース、またはそれらの組み合わせを含む。
[024]一部の実施形態において、単糖類は、グルコース、マンニトール、スクロース、またはそれらの組み合わせを含む。
【0017】
[025]一部の実施形態において、油は、オリーブ油、コーン油、パーム油、またはそれらの組み合わせを含む。
[026]一部の実施形態において、アルコールは、グリセロールを含む。
[026]一部の実施形態において、アルコールは、グリセロールを含む。
【0018】
[027]一部の実施形態において、発酵ステップは、廃棄物ストリームのｐＨを６．５から７．５の間に維持するステップ、および／または温度を２５℃から３５℃の間に維持するステップを含む。
【0019】
[028]一部の実施形態において、方法は、発酵ステップの前および／または発酵ステップ中に、培養培地にミネラル源を添加するステップをさらに含む。
[029]一部の実施形態において、ＰＨＡ産生微生物の少なくとも１つの株は、ＰＨＡ産生微生物の単一株である。
[029]一部の実施形態において、ＰＨＡ産生微生物の少なくとも１つの株は、ＰＨＡ産生微生物の単一株である。
【0020】
[030]一部の実施形態において、ＰＨＡ産生微生物の少なくとも１つの株は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ １１５９９、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｕｅｚｅｎｎｅｉ ｂｉｏｖａｒ．Ｔｉｋｅｈａｕ、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、組み換えＥ．ｃｏｌｉ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＡＴＭ、Ｐｌａｓｔｉｃｉｃｕｍｕｌａｎｓ ａｃｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｅｑｕｉｌｅｎｓｉｓ、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｈ．ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ａ２ａ５、およびＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６からなる群から選択される。
【0021】
[031]一部の実施形態において、ＰＨＡ産生微生物からのＰＨＡの抽出は、ＰＨＡ産生微生物の少なくとも一部を溶解させるよう発酵混合物を加熱処理し、それによってＰＨＡを放出させるステップを含む。
【0022】
[032]一部の実施形態において、発酵混合物の加熱処理は、８０℃から１２５℃の間の温度で行われる。
[033]一部の実施形態において、方法は、ＰＨＡを含む抽出混合物を乾燥させるステップをさらに含む。
[033]一部の実施形態において、方法は、ＰＨＡを含む抽出混合物を乾燥させるステップをさらに含む。
【0023】
[034]一部の実施形態において、方法は、ＰＨＡ産生微生物の炭素消費量に基づき、培養培地中の炭素濃度を、最適炭素濃度に維持するステップをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】[035]炭素源として廃棄物ストリームを使用してＰＨＡを合成する方法のプロセスフロー図である。
【図3】[037]調質プロセスの様々なステップを示すプロセスフロー図である。
【図4】[038]炭素源として廃棄物ストリームを使用してＰＨＡを合成するための様々なステップおよび条件を示すフローチャートである。
【図5】[039]合成培地中とグルコースで強化された汚泥培地中でのＰＨＡ産生微生物の増殖の比較を示すグラフである。
【図6】[040]Ｃａ（ＯＨ）２およびグルコースで処理された調質廃棄物ストリームを含む炭素源を使用する流加発酵中の時間関数としてＰＨＡ製造中に観察される様々なパラメータを示すグラフである。
【図7】[041]Ｃａ（ＯＨ）２および粗グリセロールで処理された調質（洗浄）廃棄物ストリームを含む炭素源を使用する流加発酵中の時間関数としてＰＨＡ製造中に観察される様々なパラメータを示すグラフである。
【図8】[042]Ｃａ（ＯＨ）２および粗グリセロールで処理された非調質（非洗浄）廃棄物ストリームを含む炭素源を使用する流加発酵中の時間関数としてＰＨＡ製造中に観察される様々なパラメータを示すグラフである。
【図9】[043]Ｃａ（ＯＨ）２および粗グリセロールで処理された、浮遊物質濃度の高い調質廃棄物ストリームを含む炭素源を使用する流加発酵中の時間関数としてＰＨＡ製造中に観察される様々なパラメータを示すグラフである。
【図10】[044]Ｃａ（ＯＨ）２および酢酸で処理された、浮遊物質濃度の高い調質廃棄物ストリームを含む炭素源を使用する流加発酵中の時間関数としてＰＨＡ製造中に観察される様々なパラメータを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0025】
[045]上述のように、廃棄物ストリーム源（一般または産業、例えば紙パルプ産業の活性汚泥）からのＰＨＡ製造において、改良された技術が求められている。ｉ）その高い栄養素および複合炭素源含有量、ならびにｉｉ）総廃水処理費用の６０％を占めうる紙パルプ産業における汚泥処理問題を解決する可能性に起因し、これらの廃棄物ストリーム源が考慮されうる。
【0026】
[046]二次汚泥処理にかかる費用は、より高度な廃水処理基準、埋立地容量の減少、および燃料費用の増加を受け、特に北アメリカおよびヨーロッパで増大すると予想される。
[047]研究者らは、非滅菌パルプ製紙工場活性汚泥（ＰＰＭＡＳ）を直接ＰＨＡ製造に利用することにより、二次汚泥処理および高いＰＨＡ製造費用という課題を解決するよう継続的に努めている。無菌条件の維持にかかる費用、合成培地の調製、および純粋培養の維持管理（Ｓｉｎｇｈら、２０１４年）に関する課題を解決する可能性のある技術として、混合微生物培養（すなわち活性汚泥）に基づくＰＨＡ製造方法を研究した。この方法において、主な問題は、ＰＨＡ濃度のバッチ間の変動である。従って、ＰＨＡ産生（蓄積）は、（同一の排水処理工場から異なる時間に回収された汚泥、および異なる廃水処理工場から回収された汚泥について）再現性がない。ＰＨＡ蓄積量の変動は、汚泥中の微生物群の組成および活性汚泥の化学組成の変化に起因しえ、さらにパルプ製紙工場内で紙パルプの製造に使用される方法の性質に依存する。さらに、汚泥微生物群は、有機物供給負荷、化学物質の添加、ＳＲＴの変化、ＨＲＴ、温度、ｐＨの操作などのような廃水処理プロセスのパラメータ変化に対し敏感である。
[047]研究者らは、非滅菌パルプ製紙工場活性汚泥（ＰＰＭＡＳ）を直接ＰＨＡ製造に利用することにより、二次汚泥処理および高いＰＨＡ製造費用という課題を解決するよう継続的に努めている。無菌条件の維持にかかる費用、合成培地の調製、および純粋培養の維持管理（Ｓｉｎｇｈら、２０１４年）に関する課題を解決する可能性のある技術として、混合微生物培養（すなわち活性汚泥）に基づくＰＨＡ製造方法を研究した。この方法において、主な問題は、ＰＨＡ濃度のバッチ間の変動である。従って、ＰＨＡ産生（蓄積）は、（同一の排水処理工場から異なる時間に回収された汚泥、および異なる廃水処理工場から回収された汚泥について）再現性がない。ＰＨＡ蓄積量の変動は、汚泥中の微生物群の組成および活性汚泥の化学組成の変化に起因しえ、さらにパルプ製紙工場内で紙パルプの製造に使用される方法の性質に依存する。さらに、汚泥微生物群は、有機物供給負荷、化学物質の添加、ＳＲＴの変化、ＨＲＴ、温度、ｐＨの操作などのような廃水処理プロセスのパラメータ変化に対し敏感である。
【0027】
[048]本明細書に記載される様々な技術は、栄養素および炭素源として廃棄物ストリーム源を使用するＰＨＡの合成を可能とする。廃棄物ストリーム源の非限定的な例は、紙パルプ活性汚泥である。
方法の概要
[049]図１を参照すると、廃棄物ストリーム源１１を使用してＰＨＡを合成する方法１００が与えられる。廃棄物ストリーム１１は、例えば、紙パルプ活性汚泥ストリーム、または紙パルプ活性汚泥ストリームに由来するストリームを含みうる。「紙パルプ活性汚泥ストリームに由来するストリーム」という表現は、ろ過、沈降、デカンテーション、遠心分離、洗浄、水系媒体（例えば、水）への懸濁、および浮遊物質濃度の調整から選択される１つまたは幾つかのステップを使用して前処理されたかまたは調質された汚泥ストリームを意味すると理解されるべきである。例えば、廃棄物ストリーム１１は、紙パルプ製造工場から生じる紙パルプ活性汚泥ストリームでありうる。
方法の概要
[049]図１を参照すると、廃棄物ストリーム源１１を使用してＰＨＡを合成する方法１００が与えられる。廃棄物ストリーム１１は、例えば、紙パルプ活性汚泥ストリーム、または紙パルプ活性汚泥ストリームに由来するストリームを含みうる。「紙パルプ活性汚泥ストリームに由来するストリーム」という表現は、ろ過、沈降、デカンテーション、遠心分離、洗浄、水系媒体（例えば、水）への懸濁、および浮遊物質濃度の調整から選択される１つまたは幾つかのステップを使用して前処理されたかまたは調質された汚泥ストリームを意味すると理解されるべきである。例えば、廃棄物ストリーム１１は、紙パルプ製造工場から生じる紙パルプ活性汚泥ストリームでありうる。
【0028】
[050]廃棄物ストリーム１１は、炭素源として使用することができる幾つかの炭素含有化合物、およびＰＨＡを製造するための他の栄養素を含む。カルシウム含有ミネラル１２は、廃棄物ストリーム１１に添加され、廃棄物ストリーム１１中に存在しうるか、または廃棄物ストリーム１１の処理中に形成されうる加水分解されたリグノセルロース材料といった特定のミネラルによる阻害作用を軽減しうる。廃棄物ストリーム１１は、廃棄物ストリームを滅菌するよう、カルシウム含有ミネラル１２の存在中、加熱処理ステップ１３（本明細書において、滅菌ステップまたは解毒ステップとも称される）で加熱処理され、処理廃棄物ストリーム１４を得ることができる。
【0029】
[051]驚くべきことに、加熱処理ステップ１３の前または加熱処理ステップ１３中に廃棄物ストリーム１１にカルシウム含有ミネラル１２を添加することで、汚泥浮遊物質の可溶化を助け、かつ栄養素をより容易にＰＨＡ産生微生物に利用できるようにすることが可能であることが見出された。さらに驚くべきことに、加熱処理ステップ１３の前または加熱処理ステップ１３中に廃棄物ストリーム１１にカルシウム含有ミネラル１２を添加することで、初期に廃棄物ストリーム中に存在するリグノセルロース材料の加水分解の結果として加熱処理中に通常生じる阻害物質の減少を助けることが可能であることが見出された。
【0030】
[052]処理廃棄物ストリーム１４は、次いで、発酵混合物１６を得るよう発酵ステップ１５で発酵され、ＰＨＡ２４を含む抽出混合物２０を得るよう抽出ステップ１８で抽出されうる。任意選択で、ＰＨＡ２４を乾燥させるよう乾燥ステップ２２が行われうる。
【0031】
[053]図１の方法１００に示されるように、廃棄物ストリーム１１は、加熱処理ステップ１３に直接供されうる。代替的に、図２の方法２００に示されるように、廃棄物ストリーム１１は、加熱処理ステップ１３の前に、調質プロセス３００で調質されうる。このような場合、調質廃棄物ストリーム１１４が加熱処理ステップ１３に供される。調質プロセス３００は、本明細書でさらに詳細に検討される。
【0032】
[054]方法のステップ、およびＰＨＡ製造技術の他の態様は、以下にさらに詳細に記載される。
ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）
[055]「ポリヒドロキシアルカン酸」または「ＰＨＡ」という用語は、下記式Ｉの繰り返し単位で表されうる高分子、または異なる式Ｉの繰り返し単位の単量体を少なくとも２つ含む共重合体を意味すると理解されるべきであり、ここでＲは、Ｈ、アルキル、またはアルケニルであり、ｍおよびｎは整数である。
ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）
[055]「ポリヒドロキシアルカン酸」または「ＰＨＡ」という用語は、下記式Ｉの繰り返し単位で表されうる高分子、または異なる式Ｉの繰り返し単位の単量体を少なくとも２つ含む共重合体を意味すると理解されるべきであり、ここでＲは、Ｈ、アルキル、またはアルケニルであり、ｍおよびｎは整数である。
【0033】
【化1】
【0034】
[056]一部のＰＨＡは、工業的に応用されており、非限定的な代表例は、ＰＨＢ（ポリ－３－ヒドロキシブチラート）、ＰＨＢＶ（ポリ（ヒドロキシブチラート－ｃｏ－ヒドロキシバレラート））、Ｐ４ＨＢ（ポリ（４－ヒドロキシブチラート）、Ｐ３ＨＢ４ＨＢ（ポリ（３－ヒドロキシブチラート－ｃｏ－４－ヒドロキシブチラート）、ＰＨＶ（ポリヒドロキシバレラート）、およびＰＨＨｘ（ポリヒドロキシヘキサノアート）である。
【0035】
[057]任意選択で、ｎは、１００から３００００の間の整数でありうる。任意選択で、ｍは、１から４の間の整数でありうる。任意選択で、Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、または置換アルケニルでありうる。例えば、Ｒは、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、またはブチルでありうる。
廃棄物ストリーム源
[058]廃棄物ストリーム１１は、様々な発生源に由来しうると理解されるべきである。一部の実施形態において、廃棄物ストリーム１１は、一般廃水、でん粉製造廃水、チーズ製造廃水、紙パルプ製造からの廃棄物ストリーム、またはその組み合わせから得られる。さらに、本明細書に言及されるあらゆる廃棄物ストリームは、一次汚泥、二次汚泥、またはそれらの組み合わせから得られうる。「一次汚泥」は、一次処理プロセスにおける、例えば一次清澄器内で行われうる、主に重力分離を通した浮遊物質および有機物質の捕捉による産物であると理解される。また、「二次汚泥」は、廃水中に存在する有機物を消費する微生物を使用する二次処理プロセスにおいて廃水を処理することによって得られると理解される。微生物は、通常、例えば曝気槽中で、廃水中に存在する生分解性物質を餌とし、次いでバイオマスが沈降して二次汚泥として除去される二次清澄器に流入する。廃棄物ストリームが生じるプロセスおよび微生物の活性の結果、廃棄物ストリーム１１は、通常、ＰＨＡを製造するためのＰＨＡ産生微生物の炭素源として使用されうる有機物質を含有する。
廃棄物ストリーム源
[058]廃棄物ストリーム１１は、様々な発生源に由来しうると理解されるべきである。一部の実施形態において、廃棄物ストリーム１１は、一般廃水、でん粉製造廃水、チーズ製造廃水、紙パルプ製造からの廃棄物ストリーム、またはその組み合わせから得られる。さらに、本明細書に言及されるあらゆる廃棄物ストリームは、一次汚泥、二次汚泥、またはそれらの組み合わせから得られうる。「一次汚泥」は、一次処理プロセスにおける、例えば一次清澄器内で行われうる、主に重力分離を通した浮遊物質および有機物質の捕捉による産物であると理解される。また、「二次汚泥」は、廃水中に存在する有機物を消費する微生物を使用する二次処理プロセスにおいて廃水を処理することによって得られると理解される。微生物は、通常、例えば曝気槽中で、廃水中に存在する生分解性物質を餌とし、次いでバイオマスが沈降して二次汚泥として除去される二次清澄器に流入する。廃棄物ストリームが生じるプロセスおよび微生物の活性の結果、廃棄物ストリーム１１は、通常、ＰＨＡを製造するためのＰＨＡ産生微生物の炭素源として使用されうる有機物質を含有する。
【0036】
[059]一部の実施形態において、廃棄物ストリームは、紙パルプ製造からの廃棄物ストリームである。任意選択で、紙パルプ製造からの廃棄物ストリームは、二次廃棄物ストリームを含む。任意選択で、紙パルプ製造からの廃棄物ストリームは、本質的に二次廃棄物ストリームからなる。廃水処理工場から排出される二次汚泥または活性汚泥は、ＰＨＡ製造のための廃材として使用されうる。一部の状況において、活性汚泥は、他の炭素源（例えば、バイオディーゼル産業の廃棄生成物である粗グリセロール、グルコース、酢酸、廃棄調理油、または同様の一般もしくは産業廃棄物など）と組み合わされうる。
廃棄物ストリームの調質
[060]図３を参照すると、続くＰＨＡ製造のために廃棄物ストリーム１１を調質するプロセス３００が示される。廃棄物ストリーム１１は、カルシウム含有ミネラルを添加する前、かつ加熱処理ステップ１３および発酵ステップ１５の前に調質されうる。
廃棄物ストリームの調質
[060]図３を参照すると、続くＰＨＡ製造のために廃棄物ストリーム１１を調質するプロセス３００が示される。廃棄物ストリーム１１は、カルシウム含有ミネラルを添加する前、かつ加熱処理ステップ１３および発酵ステップ１５の前に調質されうる。
【0037】
[061]一部の実施形態において、廃棄物ストリーム１１は、カルシウム含有ミネラル１２を添加する前にろ過ステップ１０３に供され、廃棄物ストリームろ液１０４を得る。ろ過ステップ１０３は、初期に廃棄物ストリーム１１中に存在しうる木材残渣および／または粗繊維といった粗大な物質の除去を可能にすることができる。例えば、ろ過ステップ１０３は、１００ｍｍから１５００ｍｍのフィルタ、または５００ｍｍから１０００ｍｍのフィルタ、または７００ｍｍから９００ｍｍのフィルタ、または８００ｍｍのフィルタを使用して行われうる。
【0038】
[062]一部の実施形態において、廃棄物ストリームろ液１０４は、廃棄物ストリームにカルシウム含有ミネラル１２を添加する前に、沈降ステップまたはデカンテーションステップ１０５に供され、デカンテーションされた廃棄物ストリーム１０６を得ることができる。沈降ステップまたはデカンテーションステップ１０５は、数時間、例えば２時間から１２時間の間、または５時間から７時間の間、または約６時間、廃棄物ストリームろ液１０４をデカンテーションするステップを含みうる。廃棄物ストリームろ液１０４のデカンテーションは、ろ別されない固体に対するデカンテーションを可能にする。一部の実施形態において、汚泥の液体分は捨てられてよく、デカンテーションされた廃棄物ストリーム１０６は、大部分が濃縮沈降汚泥固体を主に含みうる。一部の状況において、濃縮沈降汚泥固体は、残った固体をさらに乾燥させることなく、または処理することなく汚泥の液体分を捨てることによって得られる。
【0039】
[063]一部の実施形態において、デカンテーションされた廃棄物ストリーム１０６は、洗浄されうる。デカンテーションされた廃棄物ストリーム１０６の洗浄は、廃棄物ストリームにカルシウム含有ミネラル１２を添加する前に、遠心分離ステップ１０７を含み、遠心分離固体１０８を得ることができる。一部の実施形態において、デカンテーションされた廃棄物ストリーム１０６の洗浄は、懸濁ステップ１０９において、水性媒体（例えば、水）中に遠心分離固体を再懸濁して再懸濁固体１１０を得るステップをさらに含む。一部の実施形態において、デカンテーションされた廃棄物ストリーム１０６の洗浄は、第２の遠心分離ステップ１１１において、再懸濁固体１１０を再遠心分離するステップをさらに含み、遠心分離固体１１２を得る。
【0040】
[064]一部の実施形態において、デカンテーションステップ１０５、第１の遠心分離ステップ１０７、および／または第２の遠心分離ステップ１１１の後に得られた液体分（または上清）は、捨てられうる。デカンテーションステップ１０５、第１の遠心分離ステップ１０７、および／または第２の遠心分離ステップ１１１の後に得られた固体分は、続くステップの前に、任意選択で水性媒体（例えば、水）中に再懸濁されうる。
【0041】
[065]本明細書に記載される調質ステップの各々は、任意選択であり、解毒ステップ１３の後に処理廃棄物ストリーム１４を得るために必ずしも行われる必要がないことも理解されるべきである。例えば、一部の状況において、沈降またはデカンテーションステップ１０５は、省略されてよく、第１の遠心分離ステップ１０７は、廃棄物ストリームろ液１０４に直接行われうる。一部の状況において、廃棄物ストリーム１１は、ろ過ステップ１０３（例えば、ろ別されるべき粗大な物質がないかまたは少量である場合）を必要としない場合がある。別の例において、懸濁ステップ１０９は、デカンテーションされた廃棄物ストリーム１０６に直接行われてよく、遠心分離ステップ１０７は、省略されうる。一部の状況において、第２の遠心分離ステップ１１１も省略されうることも理解されるべきである。一部の状況において、単一の遠心分離ステップのみが行われうる。他の状況において、２つ以上の遠心分離ステップが行われうる。
【0042】
[066]一部の実施形態において、第１および／または第２の遠心分離ステップは、８０００ｘｇから１００００ｘｇの間で行われる。一部の実施形態において、第１および／または第２の遠心分離ステップは、室温（２０～２５℃）で行われる。一部の実施形態において、第１および／または第２の遠心分離ステップは、５分から２０分の間で行われる。
【0043】
[067]一部の実施形態において、廃棄物ストリーム１１の調質は、浮遊物質（ＳＳ）濃度を所定の濃度に調整するステップをさらに含む。一部の実施形態において、所定の濃度は、５ｇ／Ｌから５０ｇ／Ｌの間、または１０ｇ／Ｌから２０ｇ／Ｌの間、またはやはり約１５ｇ／Ｌである。一部の実施形態において、浮遊物質濃度は、水性媒体（例えば、水）の添加によって調整される。ＳＳ濃度の調整は、廃棄物ストリーム１１に直接行われうるか、または調質プロセスの最後に行われるステップの後に行われうる。すなわち、ＳＳ濃度の調整は、どのストリームが調質プロセス３００で得られた最後のストリームであるかに応じ、廃棄物ストリーム１１、廃棄物ストリームろ液１０４、デカンテーションされた廃棄物ストリーム１０６、遠心分離固体１０８、再懸濁固体１１０、または遠心分離固体１１２のうちの１つに対して行われうる。
カルシウム含有ミネラルおよび加熱処理ステップ
[068]廃棄物ストリーム１１が紙パルプ活性汚泥ストリーム、または様々な木材源または植物（例えば、木材、小麦、米など）に由来する様々な天然物質の処理から生じるストリームである場合、有機物質は、リグノセルロース材料を含む。リグノセルロース材料が加水分解される場合、幾つかの加水分解物が放出され、ＰＨＡ製造を抑制しうる。驚くべきことに、加熱処理ステップ１３の前または加熱処理ステップ１３中に、廃棄物ストリーム１１または調質廃棄物ストリーム１１４にカルシウム含有ミネラル１２を添加することで、汚泥浮遊物質の可溶化を助けることができ、かつＰＨＡ産生微生物に対する栄養素の有効性を増大させることができることが見出された。さらに驚くべきことに、加熱処理ステップ１３の前または加熱処理ステップ１３中に、廃棄物ストリーム１１または調質廃棄物ストリーム１１４にカルシウム含有ミネラル１２を添加することで、初期に廃棄物ストリーム１１中に存在するリグノセルロース材料の加水分解の結果として、加熱処理中に通常生じる阻害物質の減少を助けることが可能であることが見出された。
カルシウム含有ミネラルおよび加熱処理ステップ
[068]廃棄物ストリーム１１が紙パルプ活性汚泥ストリーム、または様々な木材源または植物（例えば、木材、小麦、米など）に由来する様々な天然物質の処理から生じるストリームである場合、有機物質は、リグノセルロース材料を含む。リグノセルロース材料が加水分解される場合、幾つかの加水分解物が放出され、ＰＨＡ製造を抑制しうる。驚くべきことに、加熱処理ステップ１３の前または加熱処理ステップ１３中に、廃棄物ストリーム１１または調質廃棄物ストリーム１１４にカルシウム含有ミネラル１２を添加することで、汚泥浮遊物質の可溶化を助けることができ、かつＰＨＡ産生微生物に対する栄養素の有効性を増大させることができることが見出された。さらに驚くべきことに、加熱処理ステップ１３の前または加熱処理ステップ１３中に、廃棄物ストリーム１１または調質廃棄物ストリーム１１４にカルシウム含有ミネラル１２を添加することで、初期に廃棄物ストリーム１１中に存在するリグノセルロース材料の加水分解の結果として、加熱処理中に通常生じる阻害物質の減少を助けることが可能であることが見出された。
【0044】
[069]カルシウム含有ミネラル１２の非限定的な例として、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、酸化カルシウム、石灰、またはそれらの混合物が挙げられる。好ましくは、カルシウム含有ミネラルは、水酸化カルシウムを含む。
【0045】
[070]加熱処理ステップ１３は、通常、滅菌ステップ（すなわち、廃棄物ストリーム１１または調質廃棄物ストリーム１１４中に存在する微生物（例えば、細菌）を死滅させるかまたは不活化するのに十分に高い温度で、かつ十分に長い時間加熱するステップ）であると理解されるべきである。一部の実施形態において、廃棄物ストリーム１１または調質廃棄物ストリーム１１４の加熱処理は、少なくとも１２０℃の温度で行われる。
【0046】
[071]一部の実施形態において、添加されるＣａ含有ミネラルの量は、ＳＳ濃度に基づく。例えば、いつＣａ含有ミネラルが添加されるかに応じ、廃棄物ストリーム１１または調質廃棄物ストリーム１１４中に存在するＳＳ固体１ｇ当たり、０．０５ｇから０．５ｇの間、または０．０５ｇから０．２ｇの間、または０．１ｇから０．２ｇの間、または約０．１ｇのＣａ含有ミネラルが添加されうる。より具体的には、０．０５ｇから０．５ｇの間、または０．０５ｇから０．２ｇの間、または０．１ｇから０．２ｇの間、または約０．１ｇの水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、酸化カルシウム、または石灰が、廃棄物ストリーム１１または調質廃棄物ストリーム１１４に添加されうる。ＳＳ固体濃度は、ＡＳＴＭ－Ｄ５９０７、ＥＰＡ１８０．１、および／またはＩＳＯ７０２７といった標準化された手順を使用して測定されうると理解されるべきである。
発酵ステップ
[072]Ｃａ含有ミネラルの存在中で廃棄物ストリーム１１または調質廃棄物ストリーム１１４が滅菌された後、処理廃棄物ストリーム１４は、発酵ステップ１５において発酵される。
発酵ステップ
[072]Ｃａ含有ミネラルの存在中で廃棄物ストリーム１１または調質廃棄物ストリーム１１４が滅菌された後、処理廃棄物ストリーム１４は、発酵ステップ１５において発酵される。
【0047】
[073]一部の実施形態において、発酵ステップ１５は、バッチ式発酵、流加発酵、オープン式発酵、および／または連続発酵を含みうる。好ましくは、発酵ステップ１５は、流加発酵を含む。一部の状況において、発酵ステップ１５は、流加発酵からなる。本明細書で使用される「流加発酵」という用語は、成分の一部が発酵中に添加される、バッチ式発酵の一変形例を意味すると理解されるべきである。これにより、通常、発酵プロセスの各段階に対するより良好な制御が可能となる。特に、二次代謝産物の産生量は、非指数増殖期中に、限定された量の特定の栄養素を添加することによって増大されうる。一部の実施形態において、発酵ステップ１５は、バッチ操作に挟まれる流加操作を含む。
【0048】
[074]一部の実施形態において、発酵ステップ１５は、２０℃から４０℃の間の温度で行われる。温度は、ＰＨＡ産生微生物として使用される菌株または複数の菌株に基づいて選択されうることも理解されるべきである。一部の実施形態において、廃棄物ストリーム１１または調質廃棄物ストリーム１１４の加熱処理は、Ｃａ含有ミネラルの存在中、発酵槽中で行われうる。このような場合、発酵槽は、加熱処理のために所望の温度で加熱されてよく、次いで発酵温度まで冷却される。
【0049】
[075]一部の実施形態において、発酵ステップは、廃棄物ストリームのｐＨを６．５から７．５の間に維持するステップ、および／または温度を２５℃から３５℃の間に維持するステップを含む。
【0050】
[076]一部の実施形態において、第２の炭素源は、発酵ステップ１５の前、および／または発酵ステップ１５中に、培養培地に添加されうる。同様に、ミネラル源は、発酵ステップ１５の前、および／または発酵ステップ１５中に、培養培地に添加されうる。通常、ＰＨＡ産生微生物も、発酵ステップ１５の前、および／または発酵ステップ１５中に、培養培地に添加される。
ＰＨＡ産生微生物
[077]ＰＨＡ産生微生物は、ＰＨＡを産生することが知られる任意の菌株でありうる。ＰＨＡ産生微生物の非限定的な例を以下の表１に列挙する。
ＰＨＡ産生微生物
[077]ＰＨＡ産生微生物は、ＰＨＡを産生することが知られる任意の菌株でありうる。ＰＨＡ産生微生物の非限定的な例を以下の表１に列挙する。
【0051】
【表1】
【0052】
[078]一部の実施形態において、菌株の接種前材料中の細胞数は、２４時間の増殖で１０８から１０９の間でありうる。しかし、より少ないかまたはより多い接種前材料中の細胞数が可能であり、全体的に、ＰＨＡ産生のプロセスに大きな影響を与えないことが理解されるべきである。
【0053】
[079]一部の実施形態において、ＰＨＡ産生微生物は、培養培地に導入される前に培養される。例えば、ＰＨＡ産生微生物は、培養培地に導入される前に、１２時間から４８時間まで、または１２時間から２４時間の間、または約２４時間培養されうる。そのようにして得られた接種前材料は、次いで、発酵ステップ１５の前および／または発酵ステップ１５中に培養培地に添加されうる。
【0054】
[080]一部の実施形態において、ＰＨＡ産生微生物は、ＰＨＡ産生微生物の単一株である。他の実施形態において、ＰＨＡ産生微生物は、１つより多いＰＨＡ産生微生物の株を含みうる。
ミネラル源
[081]一部の実施形態において、ミネラル源は、培地に添加され、発酵プロセス中にＰＨＡ産生を助けることができる。添加されうるミネラルの非限定的な例は、ＮＨ４Ｃｌ（例えば、０．２～１．０ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＨＰＯ４（例えば、０．５～６．０ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（例えば、０．２～２．４ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ（例えば、０．０４～０．５ｇ／Ｌ）、およびそれらの組み合わせである。以下の成分は、発酵プロセス中にＰＨＡ産生を助長するよう培地に添加されうる。他のミネラルが使用されうること、および上記で示された濃度は例として与えられ、限定するものであると解釈されるべきでないことが理解されるべきである。
追加の炭素源
[082]一部の実施形態において、方法は、発酵ステップ１５の前および／または発酵ステップ１５中に、培養培地に第２の炭素源を添加するステップをさらに含む。例えば、第２の炭素源は、カルボン酸、単糖類、油、アルコール、またはそれらの組み合わせを含みうる。カルボン酸は、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、その塩、またはそれらの組み合わせを含みうる。単糖類は、グルコース、マンニトール、スクロース、またはそれらの組み合わせを含みうる。油は、オリーブ油、コーン油、ヤシ油、またはそれらの組み合わせといった植物油を含みうる。アルコールは、純または粗グリセロールといったグリセロールを含みうる。
抽出ステップ
[083]発酵ステップ１５の後に得られる発酵混合物１６は、抽出ステップ１８で抽出されるべきＰＨＡ２４を含む微生物細胞を含有する。従って、ＰＨＡ２４を回収するために、発酵ステップ１５は停止され、発酵混合物１６はさらに処理される。一部の実施形態において、抽出ステップ１８は、加熱処理ステップ、超音波破砕ステップ、および酸化処理ステップの少なくとも１つを含みうる。
ミネラル源
[081]一部の実施形態において、ミネラル源は、培地に添加され、発酵プロセス中にＰＨＡ産生を助けることができる。添加されうるミネラルの非限定的な例は、ＮＨ４Ｃｌ（例えば、０．２～１．０ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＨＰＯ４（例えば、０．５～６．０ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（例えば、０．２～２．４ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ（例えば、０．０４～０．５ｇ／Ｌ）、およびそれらの組み合わせである。以下の成分は、発酵プロセス中にＰＨＡ産生を助長するよう培地に添加されうる。他のミネラルが使用されうること、および上記で示された濃度は例として与えられ、限定するものであると解釈されるべきでないことが理解されるべきである。
追加の炭素源
[082]一部の実施形態において、方法は、発酵ステップ１５の前および／または発酵ステップ１５中に、培養培地に第２の炭素源を添加するステップをさらに含む。例えば、第２の炭素源は、カルボン酸、単糖類、油、アルコール、またはそれらの組み合わせを含みうる。カルボン酸は、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、その塩、またはそれらの組み合わせを含みうる。単糖類は、グルコース、マンニトール、スクロース、またはそれらの組み合わせを含みうる。油は、オリーブ油、コーン油、ヤシ油、またはそれらの組み合わせといった植物油を含みうる。アルコールは、純または粗グリセロールといったグリセロールを含みうる。
抽出ステップ
[083]発酵ステップ１５の後に得られる発酵混合物１６は、抽出ステップ１８で抽出されるべきＰＨＡ２４を含む微生物細胞を含有する。従って、ＰＨＡ２４を回収するために、発酵ステップ１５は停止され、発酵混合物１６はさらに処理される。一部の実施形態において、抽出ステップ１８は、加熱処理ステップ、超音波破砕ステップ、および酸化処理ステップの少なくとも１つを含みうる。
【0055】
[084]抽出ステップ１８は、ＰＨＡを含む微生物細胞の少なくとも一部を溶解させるために発酵混合物１６を加熱処理するステップを含みうる。一部の状況において、発酵混合物１６に含有されるＰＨＡは、微生物細胞によって分解される。そのような場合、加熱処理を施すことにより、分解を最小限にすることを助けることができる。
【0056】
[085]一部の実施形態において、ＰＨＡ濃度が（例えば、酢酸／酢酸塩といった炭素源の消費速度が一定となり、最小値に達する際に決定される）最大値に達すると、発酵混合物１６は、（例えば、８０℃から１２５℃の間まで、例えば約１０分間から４５分間の間または約１５分間から３０分間の間）加熱されうる。任意選択で、加熱ステップの間、発酵槽中の酢酸の濃度は正に維持されうる。この加熱ステップは、通常、微生物細胞の少なくとも一部を溶解させ、従って微生物細胞中に含有されるＰＨＡを放出させる。ＰＨＡは、通常、これらの温度で分解しないと理解される。「細胞からＰＨＡが放出される」という表現は、初期に細胞内ＰＨＡであったＰＨＡが、加熱処理によって引き起こされる細胞の溶解／細胞破壊によって細胞外に出される（すなわち、細胞外ＰＨＡが得られる）ことを意味すると理解される。さらに、ＰＨＡ濃度は、細胞壁の成分の可溶化といった細胞内容の可溶化によって増大されうる。
【0057】
[086]一部の実施形態において、発酵混合物１６の加熱処理は、加熱処理促進化合物を含む。加熱処理促進化合物は、より低い温度での加熱処理の実施を可能にすることができると理解される。一部の実施形態において、加熱処理促進化合物は、洗浄剤を含む。一部の実施形態において、洗浄剤は、界面活性剤、キレート剤、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態において、洗浄剤は、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（商標）４０、Ｔｗｅｅｎ（商標）６０、２－ドデシル硫酸ナトリウム、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、またはそれらの組み合わせを含む。発酵混合物１６の熱処理中に洗浄剤が添加される場合、加熱処理は、８０℃から９５℃の間の温度で行われうる。
【0058】
[087]バイオマスからＰＨＡを分離する抽出ステップ１８は、クロロホルム、塩化メチレン、および／または１，２－ジクロロエタンといった塩素化溶媒を使用して行われうる。これらの塩素化溶媒と他の溶媒との組み合わせも抽出に使用されうる。抽出されたＰＨＡは、次いで溶媒の蒸発によって、またはアセトンもしくはアルコール（例えば、メタノールまたはエタノール）といった極性溶媒を添加して高分子を沈殿させることよって、溶媒から分離されうる。代替的に、非ＰＨＡ細胞物質は、アルカリ性化合物および上記で列挙された洗浄剤といった異なる化学物質を使用して分解されうる。洗浄剤によるＰＨＡ回収方法は、溶媒による抽出と、洗浄剤はＰＨＡを実質的に完全な状態のまま残して細胞成分を破壊しうる点で異なる。
【0059】
[088]細胞破壊を引き起こさせる別の方法は、例えば市販されている２０から４０ｋＨｚの間の周波数で作動する装置を使用する、超音波破砕の使用である。一部の実施形態において、発酵混合物１６は、加熱処理の前、加熱処理中、または加熱処理後に超音波破砕されうる。一部の実施形態において、加熱処理された発酵混合物は超音波破砕され、細胞をさらに破壊し、ＰＨＡを培地中に放出させる。超音波破砕は、数分間、例えば１分から３０分の間行われうる。一部の実施形態において、超音波破砕は、２から５分間、または３分間行われる。
【0060】
[089]一部の実施形態において、抽出ステップ１８は、発酵混合物に酸化剤を添加するステップを含みうる。例えば、酸化剤は、過酸化物、次亜塩素酸塩、またはそれらの組み合わせを含みうる。一部の実施形態において、次亜塩素酸塩は、次亜塩素酸ナトリウムを含み、１から５％ｗ／ｖの間の濃度で使用されうる。一部の実施形態において、過酸化物は、過酸化水素を含み、１から５％ｖ／ｖの間の濃度で使用されうる。一部の実施形態において、次亜塩素酸ナトリウムは、過酸化水素の前に使用される。酸化剤の使用は、発酵混合物の脱色を容易にすることができ、次いでＰＨＡの脱色をもたらすことができると理解される。一部の実施形態において、酸化処理は、加熱処理ステップの後に行われる。一部の実施形態において、酸化ステップは、超音波破砕ステップの後に行われる。
【0061】
[090]一部の実施形態において、抽出ステップ１８は、遠心分離を含みうる。例えば、遠心分離は、加熱処理の後、超音波破砕ステップの後、および／または酸化処理のうちの１つの後に行われうる。一部の実施形態において、抽出プロセスは、幾つかの遠心分離ステップを含む。例えば、遠心分離ステップは、加熱処理ステップと超音波破砕ステップの間、超音波破砕ステップと次亜塩素酸ナトリウム処理ステップの間、および／または次亜塩素酸ナトリウム処理ステップおよび／または過酸化水素処理ステップの間に行われうる。
乾燥ステップ
[091]ＰＨＡを含む抽出混合物は、例えば噴霧乾燥によって乾燥されうる。
乾燥ステップ
[091]ＰＨＡを含む抽出混合物は、例えば噴霧乾燥によって乾燥されうる。
【実施例】
【0062】
実施例１
[092]一方で合成培地（グルコース）を、他方でグルコースで強化された滅菌パルプ製紙工場活性汚泥（ＰＰＭＡＳ）を使用し、ＰＨＡ産生微生物の増殖を比較する実験を行った。
[092]一方で合成培地（グルコース）を、他方でグルコースで強化された滅菌パルプ製紙工場活性汚泥（ＰＰＭＡＳ）を使用し、ＰＨＡ産生微生物の増殖を比較する実験を行った。
【0063】
[093]実験は、第１および第２の接種前材料の調製から開始された。第１の接種前材料は、ミネラル寒天平板培地からのＰＨＡ産生微生物を、（蒸留水１リットル当たり）２０ｇのグルコース、６．０ｇのリン酸水素ナトリウム十二水和物（Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ）、２．４ｇのリン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、１．０ｇの塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、０．５０ｇの硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）を含有する、ミネラル培地（ＭＭ）または合成培地（ＳＭ）培養液に接種することによって調製された。リン酸塩（Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、ＫＨ２ＰＯ４）および塩化アンモニウムをグルコースと共に滅菌し、一方で、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを、別途１２１℃で１５分間オートクレーブ処理し、冷却後にこれらの溶液を無菌状態で混合した。培地のｐＨを６．８に維持し、接種前材料を１５０ｒｐｍの攪拌状態で、３０℃で２４時間維持した。与えられる全ての実施例において、接種前材料１は、同じ組成および培養条件に従う。
【0064】
[094]その後、２～１０％（ｖ／ｖ）の接種前材料を、ａ）合成培地（グルコース、１０ｇ／Ｌ）およびｂ）１０ｇ／Ｌのグルコースで強化された汚泥（１０ｇ／ＬのＳＳ（浮遊物質）培地の各々に移した（第２の接種前材料）。他のミネラル組成は、第１の接種前材料培地と同じであった。第２の接種前材料も３０℃、１５０ｒｐｍで２４時間維持し、その後２～１０％（ｖ／ｖ）の第２の接種前材料を、１Ｌの振とう三角フラスコ中の２００ｍＬの産生培地に移した。産生培地の組成は、汚泥産生培地中に１５ｇ／ＬのＳＳを使用した以外は第２の接種前材料培地と同じとし、汚泥および合成産生培地の両方の場合において使用されるグルコース濃度は、２０ｇ／Ｌであった。ＰＨＡ産生のための産生培地のインキュベーションは、１５０ｒｐｍ、３０℃で９６時間行った。微生物発酵から得られた試料を２４時間後毎に採取し、ＣＦＵ（コロニー形成単位）を測定した。
【0065】
[095]汚泥を添加しない合成培地と比較し、基質として滅菌ＰＰＭＡＳ（パルプ製紙工場活性汚泥）を使用すると、微生物の増殖は、１ログサイクル（ｏｎｅ ｌｏｇ ｃｙｃｌｅ）高かった（結果を図５にまとめる）。
【0066】
実施例２
[096]異なる実験を、異なるパラメータを変動させ、振とうフラスコ中で行い、洗浄および非洗浄汚泥について、微生物の増殖およびＰＨＡ産生の比較を行った。さらに、汚泥固体を最大限可溶化するため、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の投与量を変化させた。選択されたＮａＯＨ投与量をさらに適用し、ＳＳ濃度が増殖およびＰＨＡ産生に与える影響を検討した。
[096]異なる実験を、異なるパラメータを変動させ、振とうフラスコ中で行い、洗浄および非洗浄汚泥について、微生物の増殖およびＰＨＡ産生の比較を行った。さらに、汚泥固体を最大限可溶化するため、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の投与量を変化させた。選択されたＮａＯＨ投与量をさらに適用し、ＳＳ濃度が増殖およびＰＨＡ産生に与える影響を検討した。
【0067】
[097]洗浄（調質）および非洗浄汚泥を（追加の炭素源およびミネラルで強化せずに）使用するＰＨＡ産生：汚泥基質の未同定成分は、バイオマスの増殖およびＰＨＡの蓄積を適度に阻害しうる。ＰＨＡ蓄積中に必要となる栄養素の量は非常に限られ、栄養素が活性汚泥固体中に組み込まれていると仮定し、汚泥を遠心分離し、そうして得られた上清を捨て、汚泥バイオマス（または遠心分離ペレット）を水道水中に再懸濁し、ＰＨＡ蓄積用の基質（部分的な炭素および栄養素源）として使用した（調質汚泥）。従って、非洗浄（１０、１５、２０、２５、３０ｇ／Ｌ）および洗浄汚泥（１５、２０、２５、３０、および３５ｇ／Ｌ）について異なる浮遊物質濃度を使用して汚泥産生培地を調製し、微生物の増殖およびＰＨＡ蓄積に対するそれらの影響を検討した。汚泥浮遊物質を１２１℃で３０分間滅菌した。滅菌後、浮遊物質を室温まで冷却させ、その後、４ＮのＮａＯＨ（水酸化ナトリウム）またはＨ２ＳＯ４（硫酸）を使用して、無菌条件下でｐＨを６．８に調整した。全ての振とうフラスコに、産生培地（追加の炭素源およびミネラルで強化されない、様々なＳＳ濃度の洗浄および非洗浄汚泥）と同様に調製された前培養２の接種材料を２～１０％（ｖ／ｖ）接種し、３０℃のインキュベーションを１５０ｒｐｍで９６時間維持した。
【0068】
[098]ＳＳが１５ｇ／Ｌ（表２）の洗浄汚泥を使用すると、最大の細胞増殖およびＰＨＡ含有量が得られた。他のＳＳ値でも同等のＰＨＡ含有量を得ることができる。
【0069】
【表2】
【0070】
[099]汚泥の前処理のためのアルカリ（水酸化ナトリウム）投与量：前処理プロセスの目的は、リグノセルロース材料の主成分を分画し、最大汚泥固形分を溶解させ、溶菌させることで、増殖する微生物によって利用されうる栄養素の放出をもたらすことである。従って、この実験において、１０および３０ｇ／Ｌの浮遊物質濃度を使用し、異なる水酸化ナトリウム投与量（ＮａＯＨ０．０５、０．０７、０．０９、０．１１、０．１３ｇ／浮遊物質のｇ）で処理した。その後、汚泥を１２１℃で３０分間滅菌した。各フラスコについて、１０ｍＬの試料を採取して浮遊物質濃度を測定した。汚泥固体が最も多く溶解した水酸化ナトリウムの投与量を、さらなる実験用に選択した。
【0071】
[100]１０ｇ／Ｌ（処理後の最終ＳＳ濃度－４．１ｇ／Ｌ）および３０ｇ／Ｌ（処理後の最終ＳＳ濃度－１１．３ｇ／Ｌ）のＳＳについて、ＮａＯＨ０．１３ｇ／ＳＳのｇで汚泥の加水分解は最大であった。
【0072】
[101]ＰＨＡ産生のための浮遊物質濃度：微生物の増殖およびＰＨＡの蓄積を阻害しうる脂肪酸、フェノール類、およびフラン誘導体といった様々な阻害物質が、水酸化ナトリウム処理中に放出されえた。より高いＳＳでより多量の阻害物質が水酸化ナトリウムによる前処理中に放出されるため、阻害物質は、浮遊物質の濃度の増加に伴い増加し、増殖およびＰＨＡの蓄積に直接影響しうる。従って、ＳＳ（１０、１５、２０、２５、３０ｇ／Ｌ）濃度を変化させる前処理は、ＮａＯＨ０．１３３ｇ／ＳＳのｇのＮａＯＨ濃度で行った。１２１℃で３０分間汚泥を滅菌した後、前処理浮遊物質を室温にし、４ＮのＨ２ＳＯ４を使用して無菌条件下でｐＨを６．８に調整した。全ての振とうフラスコに、産生培地（追加の炭素およびミネラルを補わない、様々なＳＳ濃度）と同様に調製された前培養２を２～１０％（ｖ／ｖ）接種した。インキュベーションのため、フラスコを１５０ｒｐｍ、３０℃で９６時間維持し、試料の浮遊物質濃度、ＣＦＵ（コロニー形成単位）、およびＰＨＡ濃度を分析した。
【0073】
[102]ＳＳ濃度を変化させて洗浄汚泥をアルカリ処理（ＮａＯＨ０．１３３ｇ／ＳＳのｇ）した後、浮遊物質濃度を１５、２０、２５、および３０ｇ／Ｌから４．７、５．０、８．０、および１３ｇ／Ｌにそれぞれ減少させた。バイオマスのＰＨＡ含有量（９．６７％ｗ／ｗ）は、２４時間でＳＳ濃度１５ｇ／Ｌを使用したとき最大であった。しかし、得られたＰＨＡ含有量（９．６７％ｗ／ｗ）は、同じＳＳ濃度で加熱処理洗浄汚泥のみを使用して得られたＰＨＡ含有量（１１．４６％ｗ／ｗ）と比較して低かった。アルカリ処理を使用したときのより低いＰＨＡ蓄積量は、加水分解中に形成された有害成分に起因するものであった可能性がある。
【0074】
実施例３
[103]水酸化ナトリウムを使用する汚泥の加水分解中に放出された有害物質は、ＰＨＡ蓄積を阻害することが見出された。汚泥の加水分解中に生成される阻害成分を減少させるために石灰または水酸化カルシウム処理を使用した。
[103]水酸化ナトリウムを使用する汚泥の加水分解中に放出された有害物質は、ＰＨＡ蓄積を阻害することが見出された。汚泥の加水分解中に生成される阻害成分を減少させるために石灰または水酸化カルシウム処理を使用した。
【0075】
[104]異なるフラスコ内で、ＳＳ濃度１５ｇ／Ｌの洗浄汚泥に異なる投与量の水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２０．０５、０．０７、０．０９、０．１１、０．１３ｇ／浮遊物質のｇ）を添加した。汚泥の滅菌後、グルコース（２０ｇ／Ｌ）、塩化アンモニウム（１ｇ／Ｌ）、およびミネラルを各フラスコ内に補った（実施例１と同じ組成）。４Ｎの硫酸を使用してｐＨを６．８に調整し、２～１０％（ｖ／ｖ）の前培養２を使用して接種を行った（産生培地と同じ組成であり、前培養は２４時間増殖させる）。その後、３０℃、１５０ｒｐｍで９６時間インキュベーションを行った。バイオマス濃度（ｇ／Ｌ）、還元糖消費量（ｇ／Ｌ）、ＣＦＵ、およびＰＨＡ濃度（ｇ／Ｌ）を目的として試料を２４時間後毎に回収した。
【0076】
[105]水酸化カルシウム０．１１ｇ／ＳＳのｇで、細胞増殖およびＰＨＡ蓄積量が最大となることが見出された。振とうフラスコ内での水酸化カルシウム解毒を使用すると、ＰＨＡ濃度は１．１０ｇ／Ｌ（ＮａＯＨ処理汚泥を使用）から４．４５ｇ／Ｌまで上昇した。下記表３に示されるように、他の水酸化カルシウム濃度でも、ＮａＯＨによる制御と比較し、高い細胞増殖およびＰＨＡ蓄積をもたらす。
【0077】
【表3】
【0078】
実施例４
[106]追加の炭素源としてグルコースで強化され、かつ滅菌前に水酸化カルシウムで処理された汚泥を使用して実験を行い、ＰＨＡを産生させた（流加発酵）。
[106]追加の炭素源としてグルコースで強化され、かつ滅菌前に水酸化カルシウムで処理された汚泥を使用して実験を行い、ＰＨＡを産生させた（流加発酵）。
【0079】
[107]紙パルプ活性汚泥（ＰＰＡＳ）を使用する純粋細菌培養において、５Ｌまたは７Ｌの発酵槽中で流加発酵を行い、ＰＨＡ蓄積の安定性および整合性を検証した。ＰＨＡ蓄積を増大させるため追加の炭素基質としてグルコース（純炭素基質）を使用した。
【0080】
[108]本検証においては、振とうフラスコでの実験から得た濃度１５ｇ／Ｌの浮遊物質を使用し、滅菌前の洗浄汚泥に濃度Ｃａ（ＯＨ）２０．１１ｇ／ＳＳのｇの水酸化カルシウムを添加した。汚泥の滅菌後、無菌条件において、滅菌グルコースおよびミネラルで培地を補った。ジャケットに水を循環させることによって温度を３０℃に維持した。コンピュータ制御蠕動式ポンプを通し、４Ｎの硫酸および４ＮのＮａＯＨを使用して発酵ｐＨを６．８±０．１に自動制御した。ポーラログラフ溶存酸素プローブおよびｐＨセンサ（Ｍｅｔｔｌｅｒ－Ｔｏｌｅｄｏ、ＵＳＡ）によってＤＯおよびｐＨの両方をそれぞれ連続的に観察した。
【0081】
[109]３０℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養した前培養２（ＳＳ（１０ｇ／Ｌ）およびグルコース（１０ｇ／Ｌ）濃度が低い以外産生培地と同じ組成を使用した）を、汚泥産生培地に移した。０、１２、および２４時間で同じ濃度の窒素およびミネラルを補い、２４時間以降、発酵の間中、低濃度のミネラルおよび窒素を補った（３６、４２、６０、７２、および８４時間の５回の供給）。汚泥産生培地の組成および供給溶液を図４に示す。グルコースの供給は、発酵の間中、消費量に基づいて行われた。
【0082】
【表4】
【0083】
[110]調質され、かつＣａ（ＯＨ）２処理された滅菌汚泥（ＳＳ濃度－１５ｇ／Ｌ）は、（図６にみられるように）最大ＰＨＡ含有量８６．５％（ｗ／ｗ）、バイオマス濃度５１．９７ｇ／Ｌ、およびＰＨＡ濃度４４．９７ｇ／Ｌをもたらした。異なる時間で回収されたＰＰＭＡＳを使用して同じ実験を繰り返したところ、結果は再現可能であり、従来技術におけるＰＨＡ蓄積の不整合やばらつきに関する典型的な課題を解決する。
【0084】
[111]さらに、グルコースで強化された汚泥を使用し、ＰＨＡ０．６０ｇ／消費グルコースのｇ（ＰＨＡ１．５ｇ／消費炭素のｇ）の高いＰＨＡ収量が達成された。しかし、汚泥を添加せずに基質としてグルコースのみを使用して、０．３６ｇ／消費グルコースのｇ（ＰＨＡ０．９ｇ／消費炭素のｇ）の低いＰＨＡ収量が達成された（表５）。
【0085】
【表5】
【0086】
実施例５
[112]追加の炭素源として高濃度で石鹸を含有する粗グリセロール（表６の組成）で強化され、かつ滅菌前に水酸化カルシウムで処理された汚泥を使用して実験を行い、ＰＨＡを産生させた。
[112]追加の炭素源として高濃度で石鹸を含有する粗グリセロール（表６の組成）で強化され、かつ滅菌前に水酸化カルシウムで処理された汚泥を使用して実験を行い、ＰＨＡを産生させた。
【0087】
【表6】
【0088】
[113]２つの異なる発酵槽中でＳＳ濃度１５ｇ／Ｌの非調質（非洗浄）および調質（洗浄）汚泥を使用した。滅菌前に濃度Ｃａ（ＯＨ）２０．１１ｇ／ＳＳのｇを汚泥（カナダ、ケベック・シティの白樺紙パルプ事業から回収）に添加した。汚泥の滅菌後、無菌条件下で滅菌粗グリセロール溶液（炭素８ｇ／Ｌ）およびミネラルで培地を補った。
【0089】
[114]３０℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養した前培養２（ＳＳ（１０ｇ／Ｌ）および粗グリセロール（炭素４ｇ／Ｌ）濃度が低い以外産生培地と同じ組成を使用した）を汚泥産生培地に移した。０、１２、および２４時間で同じ濃度の窒素およびミネラルを補い、２４時間以降、発酵の間中、低濃度のミネラルおよび窒素を補った（３６、４２、６０、７２、および８４時間の５回の供給）。汚泥産生培地の組成および供給溶液を図４に示す。粗グリセロール溶液の供給は、発酵の間中、グリセロールおよび石鹸の消費量に基づいて行われた。
【0090】
[115]（図７にみられるように）初期ＳＳが１５ｇ／Ｌの調質汚泥を使用し、ＰＨＡ含有量７２．１％（ｗ／ｗ）およびＰＨＡ濃度２９．７ｇ／Ｌで最大バイオマス濃度４１．２ｇ／Ｌが達成された。しかし、（図８にみられるように）初期ＳＳが１５ｇ／Ｌの非調質汚泥を使用し、ＰＨＡ含有量５５．７％（ｗ／ｗ）およびＰＨＡ濃度２１．９ｇ／Ｌでバイオマス濃度３８．９ｇ／Ｌが達成された。汚泥洗浄における有毒化合物の除去後にＰＨＡ含有量およびＰＨＡ濃度がそれぞれ１７％および８ｇ／Ｌ増大するため、これらの結果は、汚泥の洗浄がＰＨＡの蓄積に影響を及ぼすことを示す。
【0091】
[116]粗グリセロールで強化された調質汚泥を使用した実験においてＰＨＡ０．９８ｇ／消費炭素（石鹸及びグリセロールの両方）のｇの高いＰＨＡ収量が達成された。しかし、汚泥を添加せずに基質として粗グリセロールのみを使用した実験においてＰＨＡ０．７３ｇ／消費炭素（石鹸及びグリセロールの両方）のｇ低いＰＨＡ収量が達成された（表７）。
【0092】
【表7】
【0093】
実施例６
[117]滅菌前に水酸化カルシウムで処理された、より高いＳＳ濃度を有する汚泥を使用して実験を行い、ＰＨＡを産生させた。
[117]滅菌前に水酸化カルシウムで処理された、より高いＳＳ濃度を有する汚泥を使用して実験を行い、ＰＨＡを産生させた。
【0094】
[118]２５ｇ／Ｌの高いＳＳ濃度の調質汚泥を使用し、濃度Ｃａ（ＯＨ）２０．１１ｇ／ＳＳのｇの水酸化カルシウムを滅菌前の汚泥に添加した。汚泥の滅菌後、無菌条件下で滅菌粗グリセロール溶液（炭素８ｇ／Ｌ、表６の組成）およびミネラルで培地を補った。
【0095】
[119]３０℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養した前培養２（ＳＳ（１０ｇ／Ｌ）および粗グリセロール（炭素４ｇ／Ｌ）濃度が低い以外産生培地と同じ組成を使用した）を汚泥産生培地に移した。０、１２、および２４時間で同じ濃度の窒素およびミネラルを補い、２４時間以降、発酵の間中、低濃度のミネラルおよび窒素を補った（３６、４２、６０、７２、および８４時間の５回の供給）。汚泥産生培地の組成および供給溶液を図４に示す。粗グリセロール溶液の供給は、発酵の間中、消費量に基づいて行われた。
【0096】
[120]高い固体濃度の調質汚泥は、（図９に示されるように）４８．７ｇ／Ｌのバイオマス濃度、６８％（ｗ／ｗ）のＰＨＡ含有量、および３３．２ｇ／ＬのＰＨＡ濃度をもたらし、ＰＨＡ０．８６ｇ／消費炭素（石鹸及びグリセロールの両方）のｇのＰＨＡ収量が得られた。
【0097】
[121]２５ｇ／Ｌの初期ＳＳ濃度を使用したときのバイオマスおよびＰＨＡ濃度は、より低いＳＳ濃度（１５ｇ／Ｌ）を使用することで達成されたバイオマスおよびＰＨＡ濃度と比較し、高かった。発酵プロセスにおいて高い固体濃度を使用することで、特定の工場で生じた規定量の汚泥を処理するのに必要とされる発酵槽の容積を最終的に低減することができる。これは、次いでＰＨＡの創成費用を低減する。
【0098】
実施例７
[122]追加の炭素源として酢酸で強化され、かつ滅菌前に水酸化カルシウムで処理された調質汚泥を使用して実験を行い、ＰＨＡを産生させた。
[122]追加の炭素源として酢酸で強化され、かつ滅菌前に水酸化カルシウムで処理された調質汚泥を使用して実験を行い、ＰＨＡを産生させた。
【0099】
[123]ｐＨ－ｓｔａｔ流加法を使用し、汚泥と共に追加の炭素基質として酢酸も検討した。発酵槽内の培養液のｐＨが６．８から６．８５まで増大すると（ｐＨの偏差０．０５）、アシッドポンプによって発酵槽中に酢酸を自動的に供給した。酢酸を使用する全ての実験のための前培養２は、粗グリセロール溶液を使用して調製した。ＳＳ濃度２５ｇ／Ｌの調質紙パルプ汚泥を使用し、濃度Ｃａ（ＯＨ）２０．１１ｇ／ＳＳのｇの水酸化カルシウムを滅菌前の汚泥に添加した。汚泥の滅菌後、無菌条件下で、ミネラルで培地を補った。３０℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養した前培養２（ＳＳ（１０ｇ／Ｌ）および粗グリセロール（炭素４ｇ／Ｌ）濃度が低い以外産生培地と同じ組成（表６に示される組成）を使用した）を汚泥産生培地に移した。０、１２、および２４時間で同じ濃度の窒素およびミネラルを補い、２４時間以降、発酵の間中、低濃度のミネラルおよび窒素を補った（３６、４２、６０、７２、および８４時間の５回の供給）。ｐＨに基づく流加法に基づき発酵槽中に酢酸を自動的に添加した。
【0100】
[124]（図１０にみられるように）初期ＳＳ２５ｇ／Ｌの調質汚泥を使用し、ＰＨＡ含有量６８％（ｗ／ｗ）およびＰＨＡ濃度３０．５ｇ／Ｌで最大バイオマス濃度４４．７ｇ／Ｌが達成された。調質汚泥および追加の炭素基質として酢酸を使用し、ＰＨＡ０．６０ｇ／消費酢酸のｇ（ＰＨＡ１．５ｇ／消費炭素のｇ）の高いＰＨＡ収量が達成された。
【0101】
[125]ＰＨＡ０．２ｇ／消費された炭素基質の混合物（酢酸、酪酸、コハク酸、および、プロピオン酸）のｇの比較的低いＰＨＡ収量がＣｈａｋｒａｂｏｒｔｙら（２０１２年）によって報告された。Ｙｕら（２００２年）による別の研究において、ＰＨＡ０．３９ｇ／消費された炭素基質の混合物（酢酸、酪酸、および、プロピオン酸）のｇの平均ＰＨＡ収量が報告された。
【0102】
実施例８
[126]異なる紙パルプ事業から回収された非調質汚泥を使用し、実験を行った。
[127]汚泥の組成は、工場毎に変化する。この一連の実験において、紙パルプ汚泥は、アルマおよびドルボーといった異なる紙パルプ事業から回収される。汚泥は、時間および事業内で使用されるプロセスの性質と共に変動すると考えられる。さらに、廃水中、汚泥微生物群は、プロセスストリーム中の有機物供給負荷、化学物質の添加、ＳＲＴの変化、ＨＲＴ、温度、ｐＨの操作などのような変化に対し敏感であり、それによってＰＨＡ含有量を変化させる。汚泥組成は、事業毎に異なることも仮定できる。従って、この節では、方法の持続可能性を確認するため、異なる事業から回収された紙パルプ汚泥を使用するＰＨＡ産生に、確立された方法を使用した。
[126]異なる紙パルプ事業から回収された非調質汚泥を使用し、実験を行った。
[127]汚泥の組成は、工場毎に変化する。この一連の実験において、紙パルプ汚泥は、アルマおよびドルボーといった異なる紙パルプ事業から回収される。汚泥は、時間および事業内で使用されるプロセスの性質と共に変動すると考えられる。さらに、廃水中、汚泥微生物群は、プロセスストリーム中の有機物供給負荷、化学物質の添加、ＳＲＴの変化、ＨＲＴ、温度、ｐＨの操作などのような変化に対し敏感であり、それによってＰＨＡ含有量を変化させる。汚泥組成は、事業毎に異なることも仮定できる。従って、この節では、方法の持続可能性を確認するため、異なる事業から回収された紙パルプ汚泥を使用するＰＨＡ産生に、確立された方法を使用した。
【0103】
[128]異なる実験で、非洗浄のアルマおよびドルボー汚泥にＣａ（ＯＨ）２０．１１ｇ／ＳＳのｇの濃度の水酸化カルシウムを滅菌前に添加した。汚泥の滅菌後、無菌条件下で滅菌粗グリセロール溶液（炭素８ｇ／Ｌ）（表６に示される組成）およびミネラルを培地に補った。
【0104】
[129]３０℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養した前培養２（ＳＳ（１０ｇ／Ｌ）および粗グリセロール（炭素４ｇ／Ｌ）濃度が低い以外産生培地と同じ組成（表６に示される組成）を使用した）を汚泥産生培地に移した。０、１２、および２４時間で同じ濃度の窒素およびミネラルを補い、２４時間以降、発酵の間中、低濃度のミネラルおよび窒素を補った（３６、４２、６０、７２、および８４時間で５回の粗グリセロールの供給）。汚泥産生培地の組成および供給溶液を図４に示す。粗グリセロール溶液の供給は、発酵の間中、石鹸およびグリセロールの消費量に基づいて行われた。
【0105】
追加の炭素基質として粗グリセロール溶液を有する、初期ＳＳ濃度が１５ｇ／Ｌの非洗浄アルマ汚泥は、４０．１２ｇ／Ｌの最大バイオマス濃度および５３．４５％（ｗ／ｗ）のバイオマスＰＨＡ含有量および２１．４４ｇ／ＬのＰＨＡ濃度をもたらした。ドルボー非洗浄汚泥の発酵プロセスと同様の条件下での同様の実験研究において、５５．２％（ｗ／ｗ）のＰＨＡ含有量および２２．８ｇ／ＬのＰＨＡ濃度で４１．３２ｇ／Ｌの最大バイオマス濃度が達成された。これらの結果は、同様の発酵条件下で白樺紙パルプ事業の非洗浄汚泥を使用して得られた結果と同様であった。３つの異なる紙パルプ事業の廃水処理工場から回収された汚泥を使用して得られた結果から、混合培養を用いるＰＨＡ産生の主たる障害である汚泥の組成は、純粋培養プロセスを使用するＰＨＡ産生に影響を与えないことが明白である。
【0106】
実施例９
[130]１５０Ｌの大規模発酵槽を使用して実験を行い、ＰＨＡを産生させた。
[131]ドルボーから得られた非調質汚泥（デカンテーションなし）および追加の炭素基質として粗グリセロールを含む１５０Ｌ（総容積）の発酵槽でもＰＨＡを産生させ、開発された方法の整合性を確認した。
[130]１５０Ｌの大規模発酵槽を使用して実験を行い、ＰＨＡを産生させた。
[131]ドルボーから得られた非調質汚泥（デカンテーションなし）および追加の炭素基質として粗グリセロールを含む１５０Ｌ（総容積）の発酵槽でもＰＨＡを産生させ、開発された方法の整合性を確認した。
【0107】
[132]３０℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養した前培養２（ＳＳ（１０ｇ／Ｌ）および粗グリセロール（炭素４ｇ／Ｌ）濃度が低い以外産生培地と同じ組成を使用した）を前培養３（ＳＳ（１０ｇ／Ｌ）および粗グリセロール（炭素４ｇ／Ｌ濃度が低い以外産生培地と同じ組成を使用した、表６に示される組成）に移し、培養条件は、前培養２と同じであった。２４時間後、ワーキングボリュームが１００Ｌの１５０Ｌの発酵槽に前培養３を移した。０、１２、および２４時間で窒素およびミネラルを補い、２４時間以降、発酵の間中、低濃度のミネラルおよび窒素を補った（３６、４２、６０、７２、および８４時間の５回の供給）。汚泥産生培地の組成および供給溶液を図４に示す。粗グリセロール溶液の供給は、発酵の間中、石鹸およびグリセロールの消費量に基づいて行われた。
【0108】
[133]初期ＳＳ１５ｇ／Ｌの非調質汚泥を使用し、５４％（ｗ／ｗ）のＰＨＡ含有量および２１．５ｇ／ＬのＰＨＡ濃度で４０ｇ／Ｌの最大バイオマス濃度が達成された。これらの結果は、１５ｇ／Ｌの非調質汚泥を含む５Ｌの発酵槽を使用して行われた実験と同様であり、異なる規模での新規のＰＨＡ産生方法の整合性を示す。
【0109】
[134]汚泥が、単独で、または（粗グリセロールなどのような）他の廃棄物質と組み合わせて、純粋培養に使用することができる基質であることが示された。方法は、微生物混合培養を使用するＰＨＡ産生中に得られるＰＨＡ濃度に一貫性がなく、ＰＨＡ含有量が低く、ＰＨＡ収量が低いという課題を少なくとも部分的に解決することができる。さらに、発酵中に産生されたバイオマス中のＰＨＡ濃度が高いため、ＰＨＡのさらなる抽出および精製に必要とされる化学的処理が少ない。
【0110】
実施例１０
[135]バイオマス濃度、ＰＨＡ濃度、およびＰＨＡ収量をさらに高めるために、追加の炭素源として高濃度で石鹸を含有する粗グリセロール（表６の組成）で強化され、滅菌前に水酸化カルシウムで処理された調質汚泥を使用し、５Ｌの発酵槽において実験を行った。連続炭素流加法を使用し、発酵の間中、微生物に最適な炭素濃度（粗グリセロール溶液の炭素８±１ｇ／培地のＬ）を維持した。
[135]バイオマス濃度、ＰＨＡ濃度、およびＰＨＡ収量をさらに高めるために、追加の炭素源として高濃度で石鹸を含有する粗グリセロール（表６の組成）で強化され、滅菌前に水酸化カルシウムで処理された調質汚泥を使用し、５Ｌの発酵槽において実験を行った。連続炭素流加法を使用し、発酵の間中、微生物に最適な炭素濃度（粗グリセロール溶液の炭素８±１ｇ／培地のＬ）を維持した。
【0111】
[136]５Ｌの発酵槽に関し、３０℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養した前培養２（ＳＳ（１０ｇ／Ｌ）および粗グリセロール（炭素４ｇ／Ｌ）濃度が低い以外産生培地と同じ組成を使用した）を汚泥産生培地に移した。
【0112】
[136]０、１２、および２４時間で同じ濃度の窒素およびミネラルを補い、２４時間以降、発酵の間中、低濃度のミネラルおよび窒素を補った（３６、４２、６０、７２、および８４時間の５回の供給）。汚泥産生培地の組成および供給溶液を表８に示す。
【0113】
【表8】
【0114】
[137]流加発酵中、グリセロールおよび石鹸の消費量に基づき、粗グリセロール溶液を間欠的に添加した。しかし、発酵の間中、培地中で維持される微生物に最適な炭素濃度（炭素８ｇ／Ｌ）をもたらすために、連続流加法が代替的に使用されうる。連続流加法は、発酵の間中、Ｃ／Ｎ比を維持することも助けうる。
【0115】
[138]従って、０時間において、粗グリセロール溶液（炭素２０ｇ／グリセロールのＬ、または炭素８ｇ／Ｌに等しい炭素当量）が培地に添加された。その後、粗グリセロール溶液は、（蠕動式ポンプの流量を調整し、間欠流加法において最適化された必要量の粗グリセロール溶液を添加することによって）自動的に添加された。間欠流加法の間、消費量に基づいて炭素が添加され、微生物は、１２時間毎に粗グリセロール溶液４ｇＣ／培地のＬを要した。従って、連続流加法において、１２時間の期間中に蠕動式ポンプの流量を調整することにより、発酵槽に同量の炭素をゆっくり添加した。従って、発酵の間中、同一の炭素濃度が維持されることが観察された。
【0116】
[139]従って、基質としてＣａ（ＯＨ）２処理ＰＰＭＡＳを、追加の炭素基質として粗グリセロールを用いて連続炭素流加法を使用することにより、間欠炭素流加法で得られた４１．２ｇ／Ｌのバイオマス濃度および２９．７ｇ／ＬのＰＨＡ濃度と比較し、４２ｇ／ＬのＰＨＡ濃度で５８ｇ／Ｌのバイオマス濃度がもたらされた。また、連続炭素流加発酵法を使用することにより、間欠炭素流加法で得られたＰＨＡ０．９８ｇ／消費炭素のｇのＰＨＡ収量と比較し、ＰＨＡ１．１７ｇ／消費炭素のｇのＰＨＡ収量がもたらされた（表９）。
【0117】
【表9】
【0118】
実施例１１
[140]１５０Ｌの大規模発酵槽を使用して実験を行い、ＰＨＡを産生させた。ドルボーから得られた調質汚泥および追加の炭素基質として粗グリセロール（第２の炭素源）を含む１５０Ｌ（総容積）の連続流加法用発酵槽でもＰＨＡを産生させ、開発された方法の整合性を確認した。
[140]１５０Ｌの大規模発酵槽を使用して実験を行い、ＰＨＡを産生させた。ドルボーから得られた調質汚泥および追加の炭素基質として粗グリセロール（第２の炭素源）を含む１５０Ｌ（総容積）の連続流加法用発酵槽でもＰＨＡを産生させ、開発された方法の整合性を確認した。
【0119】
[141]３０℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養した前培養２（濃度が低いＳＳ（１０ｇ／Ｌ）および粗グリセロール（炭素４ｇ／Ｌ）を使用した以外産生培地と同じ組成である）を前培養３（濃度が低いＳＳ（１０ｇ／Ｌ）および粗グリセロール（炭素４ｇ／Ｌ）を使用した以外産生培地と同じ組成である、表６に示される組成）に移し、培養条件は、前培養２と同じであった。２４時間後、ワーキングボリュームが１００Ｌの１５０Ｌの発酵槽に前培養３を移した。０、１２、および２４時間で窒素およびミネラルを補い、２４時間以降、発酵の間中、低濃度のミネラルおよび窒素を補った（３６、４２、６０、７２、および８４時間の５回の供給）。汚泥産生培地の組成および供給溶液を表８に示す。
【0120】
[142]実施例１０で検討される連続炭素流加発酵法において、発酵槽に同じ濃度の炭素をゆっくり添加した。オートクレーブ中で粗グリセロール溶液を１２１℃で１５分間滅菌し、室温まで冷却した。無菌条件下、層流空気中で、粗グリセロール溶液を滅菌供給プラスチックタンクに移した。その後、滅菌供給プラスチックタンク（炭素供給タンク）を発酵槽に接続した。粗グリセロール溶液は互いに混ざらない石鹸およびグリセロールからなるという事実により、粗グリセロール溶液を連続して混合するために、炭素供給タンクをマグネチックスターラー上に置いた。発酵槽への粗グリセロール溶液の供給流量は、蠕動式ポンプの回転周波数を５ｒｐｍに設定することによって手動で設定した（１７秒毎にオン、６０秒間オンおよびオフ）。従って、発酵槽内で時間とともに増大した発酵培養液の体積を考慮し、消費量に基づき、発酵培地（培養培地）中で最適炭素濃度（炭素８±１ｇ／Ｌ）を維持した（６時間毎に、グリセロールおよび石鹸濃度について試料を分析した）。従って、発酵槽内に添加された粗グリセロール溶液の容積は増大した（時間間隔（オン）を２０秒まで増大させた）。
【0121】
[143]１５０Ｌの発酵槽における連続流加法で、初期ＳＳ１５ｇ／Ｌの調質汚泥を使用し、７０％（ｗ／ｗ）のバイオマスＰＨＡ含有量および４０ｇ／ＬのＰＨＡ濃度で５８．４ｇ／Ｌの最大バイオマス濃度を達成した。これらの結果は、１５ｇ／Ｌの調質汚泥を含む５Ｌの発酵槽を使用して行われた実験と同様であり、異なる規模でのＰＨＡ産生方法の整合性を示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
