特許 7570012 選別方法、選別装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-10-10

(45)【発行日】2024-10-21

(54)【発明の名称】選別方法、選別装置

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20241011BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20241011BHJP

   C12M 3/00 20060101ALI20241011BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20241011BHJP

【ＦＩ】

C12N5/071

C12M1/34 B

C12M3/00 Z

C12M1/00 A

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2021520649

(86)(22)【出願日】2020-04-13

(86)【国際出願番号】 JP2020016236

(87)【国際公開番号】W WO2020235253

(87)【国際公開日】2020-11-26

【審査請求日】2023-04-05

(31)【優先権主張番号】P 2019094520

(32)【優先日】2019-05-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(31)【優先権主張番号】P 2019094710

(32)【優先日】2019-05-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】314012076

【氏名又は名称】パナソニックＩＰマネジメント株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100109210

【弁理士】

【氏名又は名称】新居 広守

(74)【代理人】

【識別番号】100137235

【弁理士】

【氏名又は名称】寺谷 英作

(74)【代理人】

【識別番号】100131417

【弁理士】

【氏名又は名称】道坂 伸一

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 香織

(72)【発明者】

【氏名】辻 清孝

(72)【発明者】

【氏名】加藤 弓子

【審査官】手島 理

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第０２／０５５６５３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２００９／０３８０７９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】SHARF T., et al.，Non-contact monitoring of extra-cellular field potentials with a multi-electrode array，Lab Chip，2019年04月09日，Vol.19, No. 8，pp.1448-1457

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｍ １／００－ ３／１０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡＰｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

複数のスフェロイドを、複数の測定用電極と接触せずに保持する保持ステップと、
前記複数の測定用電極を用いて、前記複数のスフェロイドの複数の細胞外電位に関する複数の信号を取得する取得ステップと、前記複数のスフェロイドと前記複数の信号は１対１対応し、
前記複数のスフェロイドそれぞれの良否を、前記複数の信号に含まれる、前記スフェロイドに対応する信号に基づいて判定する判定ステップと、
前記複数のスフェロイドのうち、前記判定ステップにおいて、良と判定された一または複数のスフェロイドを回収する回収ステップと、を含み、
前記取得ステップは、
グルコースを第１濃度で含む第１溶液中でスフェロイドの細胞外電位に関する第１信号を取得する第１取得ステップと、
グルコースを前記第１濃度よりも高い第２濃度で含む第２溶液中で前記スフェロイドの細胞外電位に関する第２信号を取得する第２取得ステップと、
前記第１信号および前記第２信号をフーリエ変換して第１パワースペクトル密度および第２パワースペクトル密度を算出する算出ステップとを含み、
前記判定ステップでは、算出された前記第１パワースペクトル密度および前記第２パワースペクトル密度に基づいて、前記スフェロイドの良否を判定する、
選別方法。

【請求項2】

前記判定ステップでは、前記複数の信号に含まれる２つの信号の相関係数を算出し、前記相関係数が閾値よりも大きい場合に、前記２つの信号に対応する２つのスフェロイドを不良と判定する、
請求項１に記載の選別方法。

【請求項3】

複数のスフェロイドの複数の細胞外電位に関する複数の信号を取得する複数の測定用電極と、
前記複数のスフェロイドを前記複数の測定用電極と接触せずに保持する複数の保持部と、
算出部と、
判定部と、を備え、
前記複数のスフェロイドと前記複数の信号は１対１対応し、
前記複数の信号は、グルコースを第１濃度で含む第１溶液中でスフェロイドの細胞外電位に関する第１信号と、グルコースを前記第１濃度よりも高い第２濃度で含む第２溶液中で前記スフェロイドの細胞外電位に関する第２信号と、を含み、
前記算出部は、前記第１信号および前記第２信号をフーリエ変換して第１パワースペクトル密度および第２パワースペクトル密度を算出し、
前記判定部は、算出された前記第１パワースペクトル密度および前記第２パワースペクトル密度に基づいて、前記スフェロイドの良否を判定する、
選別装置。

【請求項4】

前記複数の保持部は、板体に設けられた複数の穴部であり、
前記複数のスフェロイドはスフェロイドｉを含み、
前記複数の測定用電極は測定用電極ｉを含み、
前記複数の穴部は開口部ｉを有する穴部ｉを含み、
前記測定用電極ｉの部分ｉは、前記穴部ｉに配置され、
前記穴部ｉの内側面ｉの箇所ｉは前記スフェロイドｉと接触し、これにより前記穴部ｉは前記スフェロイドｉを保持し、
前記部分ｉは、前記箇所ｉと前記穴部ｉの底部ｉの間に位置し、
１≦ｉ≦ｎ、前記ｉは自然数、前記ｎは２以上の自然数である、
請求項３に記載の選別装置。

【請求項5】

前記穴部ｉは、前記板体の平面視において円形である、
請求項４に記載の選別装置。

【請求項6】

前記穴部ｉは、前記開口部ｉから、前記穴部ｉの底部側に向かって前記板体の厚み方向と交差する方向における長さが短くなるテーパ構造を有する、
請求項４または５に記載の選別装置。

【請求項7】

前記内側面ｉは、前記箇所ｉよりも前記開口部ｉ側において、前記穴部ｉの内側に向けて突出する返し構造を有する、
請求項４～６のいずれか一項に記載の選別装置。

【請求項8】

前記判定ステップでは、算出された前記第１パワースペクトル密度および前記第２パワースペクトル密度の少なくとも一方におけるパワーのピーク値が第１閾値以下の場合に、前記スフェロイドを不良と判定する、
請求項１に記載の選別方法。

【請求項9】

さらに、算出された前記第１パワースペクトル密度におけるピーク周波数である第１周波数を特定する第１特定ステップと、
算出された前記第２パワースペクトル密度におけるピーク周波数である第２周波数を特定する第２特定ステップと、を含み、
前記第１周波数よりも前記第２周波数の方が大きい場合に、前記スフェロイドを良と判定する、
請求項１に記載の選別方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、スフェロイドの選別方法、および当該選別方法に用いられる選別装置に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、細胞培養に関する技術の発達に伴い、三次元的な細胞の塊であるスフェロイドの形成が可能となっている。スフェロイドは、個々の細胞どうしが接着した細胞塊であり、より生体内に近い細胞の状態を再現している。このような特性から、スフェロイドは、医療用途に応用されることが期待されている。従来、個々の細胞の医療用途への応用を想定した高速薬品スクリーニング装置が特許文献１に開示されている。特許文献１に開示された高速薬品スクリーニング装置は、個々の細胞が発生する細胞外電位を測定することにより、医薬品の候補化合物の細胞への影響を評価する装置である。

【0003】

スフェロイドを、医薬品の候補化合物のスクリーニングに用いることも可能である。スフェロイドを生体内に移植して、疾患により機能不全等を生じた臓器に代えて、臓器機能を発揮させる試みも行われている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】国際公開第２００２／０５５６５３号

【発明の概要】

【0005】

スフェロイドの生体内への移植を考えた場合には、移植されるスフェロイドにおいて、臓器機能が担保されることが望ましい。このように、スフェロイドは、その用途に適した良好な状態であることが望まれる。

【0006】

本開示は、上記に鑑みてなされ、良好なスフェロイドを選別するための技術を提供するものである。

【0007】

本開示の一態様に係る選別方法は、複数のスフェロイドを、複数の測定用電極と接触せずに保持する保持ステップと、前記複数の測定用電極を用いて、前記複数のスフェロイドの複数の細胞外電位に関する複数の信号を取得する取得ステップと、前記複数のスフェロイドと前記複数の信号は１対１対応し、前記複数のスフェロイドそれぞれの良否を、前記複数の信号に含まれる、前記スフェロイドに対応する信号に基づいて判定する判定ステップと、前記複数のスフェロイドのうち、前記判定ステップにおいて、良と判定された一または複数のスフェロイドを回収する回収ステップと、を含む。

【0008】

この包括的または具体的な態様は、装置、システムで実現されてもよく、装置、システム、方法の任意な組み合わせで実現されてもよい。

【0009】

本開示の技術によれば、良好なスフェロイドの選別が可能となる。本開示の一態様における更なる利点および効果は、明細書および図面から明らかにされる。かかる利点および／または効果は、いくつかの実施形態並びに明細書および図面に記載された特徴によってそれぞれ提供されるが、１つまたはそれ以上の同一の特徴を得るために必ずしも全てが提供される必要はない。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】図１は、実施の形態に係る選別装置を平面視した図

【図2】図２は、実施の形態に係る保持層を説明するための図

【図3】図３は、図１に示された領域Ａの拡大図および当該拡大図におけるｉｉｉ－ｉｉｉ線で切断した断面図

【図4】図４は、図１に示された領域Ｂの拡大図および当該拡大図におけるｉｖ－ｉｖ線で切断した断面図

【図5】図５は、実施の形態に係る選別装置と評価装置との関係を説明するブロック図

【図6】図６は、実施の形態に係る選別装置と評価装置との関係を説明する概略図

【図7A】図７Ａは、実施の形態に係るスフェロイドの選別方法および評価方法について説明するフローチャート

【図7B】図７Ｂは、複数のスフェロイドに適用される場合に追加で実施される選別方法および評価方法におけるサブフローチャート

【図7C】図７Ｃは、スフェロイドの良否を判定する他の判定ステップを示すサブフローチャート

【図8】図８は、実施例に係る第１単離膵島から得られた各種データについて説明する図

【図9】図９は、実施例に係る第２単離膵島から得られた各種データについて説明する図

【図10】図１０は、実施例に係る第３単離膵島から得られた各種データについて説明する図

【図11】図１１は、実施例および比較例に係る単離膵島のうち、判定ステップにおいて抽出された単離膵島の割合を示す第１の図

【図12】図１２は、実施例および比較例に係る単離膵島のうち、判定ステップにおいて抽出された単離膵島の割合を示す第２の図

【図13】図１３は、変形例に係る穴部形状を説明する図

【発明を実施するための形態】

【0011】

（開示の基礎となった知見）
スフェロイドは、単独で存在する細胞に比べ、より生体内に近い細胞の状態を再現することが知られている。このようなスフェロイドの特性を考慮し、スフェロイドを医療用途に応用することが期待されている。例えば、スフェロイドを生体内に移植する試みが行われている。生体内に移植されたスフェロイドは、スフェロイドを形成する細胞が有する機能を発現することが期待される。例えば、疾患により機能不全等を生じた臓器に代えて生体内に移植したスフェロイドを用いて不全である臓器機能を代行させることが考えられる。

【0012】

スフェロイドを生体内へ移植する場合に、移植されるスフェロイドにおいて臓器機能が担保されることが望ましい。また、生体内においてスフェロイドに臓器機能を代行させるためには、相応の数のスフェロイドを移植する必要がある。したがって、移植されるスフェロイドのそれぞれについて臓器機能が担保されるか否かを個別に判断することは困難である。

【0013】

ここで、細胞外電位を測定することにより、細胞の状態を推定するためのデバイスが特許文献１に開示されている。このようなデバイスをスフェロイドに適用することも可能ではある。しかしながら、このようなデバイスでは、測定に伴って細胞と測定用電極との接触が生じる。

【0014】

細胞と測定用電極との接触は、細胞に損傷または変性を生じさせる可能性がある。さらに、特許文献１に開示されたデバイスでは、吸引を行うことにより細胞に対する侵襲的な操作も実施する。このため、細胞に損傷または変性を生じさせる可能性がより高くなる。したがって、測定において臓器機能を有することが推定されても、測定後の細胞では、臓器機能が損なわれている場合がある。

【0015】

スフェロイドは、臓器機能を担保するための測定の後、そのまま生体内への移植が行われるため、スフェロイドに損傷または変性を生じさせずに測定可能なデバイスの開発が望まれている。

【0016】

本開示は、上記において臓器機能の有無として例示した、個々のスフェロイドにおける良否を判定するための測定を、多数のスフェロイドについて一挙に実施し、かつ、測定の前後におけるスフェロイドの損傷または変性を抑制することが可能なスフェロイドの選別方法等を提供する。これにより、良好なスフェロイドの選別を行うことができる。

【0017】

（開示の概要）
本開示に係る選別方法の一態様は、複数のスフェロイドを、複数の測定用電極と接触せずに保持する保持ステップと、前記複数の測定用電極を用いて、前記複数のスフェロイドの複数の細胞外電位に関する複数の信号を取得する取得ステップと、前記複数のスフェロイドと前記複数の信号は１対１対応し、前記複数のスフェロイドそれぞれの良否を、前記複数の信号に含まれる、前記スフェロイドに対応する信号に基づいて判定する判定ステップと、前記複数のスフェロイドのうち、前記判定ステップにおいて、良と判定された一または複数のスフェロイドを回収する回収ステップと、を含む。

【0018】

これによれば、複数のスフェロイドの複数の細胞外電位に関する複数の信号を取得し、複数のスフェロイドに含まれる各々のスフェロイドの良否判定を、複数の信号に含まれる、スフェロイドに対応する信号に基づいて行っても、複数のスフェロイドと複数の測定用電極との接触に伴う複数のスフェロイドの損傷および変性が抑制される。

【0019】

良否判定は、一例として、各々のスフェロイドが、対応する細胞外電位に基づいて臓器機能を有するか否かによって行う。したがって、臓器機能を有すると判定されたスフェロイドは、信号の取得における損傷および変性が抑制されている。これにより良好であるとして選別されたスフェロイドは、そのまま移植等の実使用に用いることができる。

【0020】

本開示における「スフェロイド」という文言は、「細胞塊」または「細胞凝集塊」と換言することもできる。

【0021】

前記判定ステップでは、前記複数の信号に含まれる２つの信号の相関係数を算出し、前記相関係数が閾値よりも大きい場合に、前記２つの信号に対応する２つのスフェロイドを不良と判定してもよい。

【0022】

これによれば、複数の信号に含まれる２つの信号の相関係数に基づいて２つの信号に対応する２つのスフェロイドが不良であるか否を判定する。よって、複数の信号に含まれる１つの信号に基づくスフェロイドの不良判断に比べて、より的確なスフェロイドの不良判定ができる。

【0023】

本開示に係る選別装置の一態様は、複数のスフェロイドの複数の細胞外電位に関する複数の信号を取得する複数の測定用電極と、前記複数のスフェロイドを前記複数の測定用電極と接触せずに保持する複数の保持部と、を備える。

【0024】

これによれば、複数のスフェロイドの複数の細胞外電位に関する複数の信号を取得し、複数のスフェロイドに含まれる各々のスフェロイドの良否判定を複数の信号に含まれる、スフェロイドに対応する信号に基づいて行っても、複数のスフェロイドと複数の測定用電極との接触に伴う複数のスフェロイドの損傷および変性が抑制される。

【0025】

良否判定は、一例として、各々のスフェロイドが、対応する細胞外電位に基づいて臓器機能を有するか否かによって行う。したがって、臓器機能を有すると判定されたスフェロイドは、信号の取得における損傷および変性が抑制されている。これにより良好であるとして選別されたスフェロイドは、そのまま移植等の実使用に用いることができる。

【0026】

前記複数の保持部は、板体に設けられた複数の穴部であり、前記複数のスフェロイドはスフェロイド_ｉを含み、前記複数の測定用電極は測定電極_ｉを含み、前記複数の穴部は開口部_ｉを有する穴部_ｉを含み、前記測定用電極_ｉの部分_ｉは、前記穴部_ｉに配置され、前記穴部_ｉの内側面_ｉの箇所_ｉは前記スフェロイド_ｉと接触し、これにより前記穴部_ｉは前記スフェロイド_ｉを保持し、前記部分_ｉは、前記箇所_ｉと前記穴部_ｉの底部_ｉの間に位置し、１≦ｉ≦ｎ、前記ｉは自然数、前記ｎは２以上の自然数であってもよい。

【0027】

これによれば、板体に形成された複数の穴部は複数のスフェロイドを保持できる。また、測定用電極_ｉは、スフェロイド_ｉと穴部_ｉの内側面_ｉとが接触する箇所_ｉよりも穴部_ｉの底部側に配置される。穴部_ｉの底部側は、複数のスフェロイドのうち、スフェロイド_ｉが最も近位となる位置である。したがって、スフェロイド_１～スフェロイド_ｉ－１、スフェロイド_ｉ+１～スフェロイド_ｎの影響を低減でき、測定用電極_ｉでは、より正確にスフェロイド_ｉの細胞外電位に関する信号を取得することができる。よって、正確に取得された細胞外電位に関する信号に基づいてスフェロイドの良否が判定されるため、良好なスフェロイドが選別される。

【0028】

前記穴部_ｉは、前記板体の平面視において円形であってもよい。

【0029】

スフェロイドは、略球形の形状であることが多い。したがって、穴部が平面視において円形であれば、穴部をスフェロイドの形状に適合させることができる。つまり、穴部およびスフェロイドの平面視における形状を略一致させることができる。スフェロイドと形状が略一致した穴部には、スフェロイドが収容された場合に、スフェロイドよりも穴部の底部側に閉空間が形成される。かかる閉空間の形成により、スフェロイドｉが収容された穴部_ｉに対応する測定用電極_ｉによって測定された細胞外電位に関する信号_ｉは、スフェロイド_１～スフェロイド_ｉ－１、スフェロイド_ｉ+１～スフェロイド_ｎに起因するノイズの影響を低減でき、測定用電極_ｉはスフェロイド_ｉの細胞外電位に関する信号_ｉを計測ことができる。よって、測定用電極では、より正確に、測定用電極に対応するスフェロイドの細胞外電位に関する信号を取得することができ、良好なスフェロイドが選別される。

【0030】

前記穴部_ｉは、前記開口部_ｉから、前記穴部_ｉの底部側に向かって前記板体の厚み方向と交差する方向における長さが短くなるテーパ構造を有してもよい。

【0031】

これによれば、テーパ構造により、穴部の各々は、当該穴部の開口部から、当該穴部の底部側に向かって穴部の深さ方向（つまり板体の厚み方向）と交差する方向における長さが短くなる。したがって、スフェロイドの大きさにばらつきがある場合であっても、穴部の深さ方向と交差する方向における長さがスフェロイドの大きさに対応する箇所において、スフェロイドが保持される。つまり、複数のスフェロイドの大きさにばらつきがある場合であっても、スフェロイドは、各々の穴部に収容され、保持される。よって、複数のスフェロイドの大きさにばらつきがある場合であっても、複数のスフェロイドの中から良好なスフェロイドを選別することができる。

【0032】

前記内側面_ｉは、前記箇所_ｉよりも前記開口部_ｉ側において、前記穴部_ｉの内側に向けて突出する返し構造を有してもよい。

【0033】

これによれば、穴部におけるスフェロイドが収容された箇所よりも開口部側において、穴部の深さ方向と交差する方向における長さが短くなるように突出する返し構造が形成される。したがって、このような返し構造により、穴部に収容されたスフェロイドが移動した際に、穴部からの当該スフェロイドの漏出が、物理的に抑制される。よって、より多くの測定用電極を用いて、より効率的に良好なスフェロイドを選別することができる。

【0034】

なお、これらの包括的または具体的な態様は、装置、システム、集積回路、コンピュータプログラムまたはコンピュータ読み取り可能なＣＤ－ＲＯＭ等の記録媒体で実現されてもよく、装置、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラムおよび記録媒体の任意な組み合わせで実現されてもよい。

【0035】

以下では、本開示の実施の形態について図面とともに説明する。

【0036】

なお、以下で説明する実施の形態は、いずれも包括的または具体的な例を示すものである。以下の実施の形態で示される数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置位置、および接続形態、ステップ、ステップの順序などは、一例であり、請求の範囲を限定する主旨ではない。また、以下の実施の形態における構成要素のうち、最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。

【0037】

なお、各図は、必ずしも厳密に図示したものではない。各図において、実質的に同一の構成については同一の符号を付し、重複する説明は省略または簡略化する。

【0038】

また、本明細書において、平行などの要素間の関係性を示す用語、および、矩形などの要素の形状を示す用語、ならびに、数値、および、数値範囲は、厳格な意味のみを表す表現ではなく、実質的に同等な範囲、例えば数％程度の誤差等の差異も含むことを意味する表現である。

【0039】

（実施の形態）
はじめに、実施の形態におけるスフェロイドの選別方法を実施するための選別装置について説明する。図１は、実施の形態に係る選別装置を平面視した図である。

【0040】

図１に示すように、本実施の形態における選別装置１００は、基板１１と、基準用配線２３、基準用接点２１、測定用配線３３および測定用接点３１を含む導体パターンと、絶縁膜１３と、保持層４１とを備える。

【0041】

基板１１は、ガラス等の材料を用いて形成された板状の部材である。なお、基板１１の材料は、ガラスに限られず、樹脂、セラミックス等の任意の材料を用いてもよい。基板１１は、実施の形態においては、矩形の主面を有する板状であり、当該主面上に後述する導体パターンが形成される。したがって、基板１１は、導体パターンの短絡が生じないよう絶縁性材料によって形成される。

【0042】

導体パターンは、スフェロイドによって発生する細胞外電位に関する信号を、選別装置１００に接続された測定装置（不図示）へと伝達するための導電線である。導体パターンは一例として、基板１１の表面に形成された酸化インジウム錫（ＩＴＯ）膜をフォトリソグラフィによりパターン加工して形成される。なお、導体パターンの成形は、他の公知の技術を用いて行ってもよい。

【0043】

導体パターンには、基準電位に関する基準信号を伝達するための基準用配線２３、および伝達された基準信号を取得するための測定装置の接続接点である基準用接点２１が含まれる。また、導体パターンには、スフェロイドによって発生する細胞外電位に関する信号を伝達するための測定用配線３３、および伝達された信号を取得するための測定装置の接続接点である測定用接点３１が含まれる。

【0044】

基準用配線２３は、基板１１の中央部におけるスフェロイドが配置されるエリアから、基板１１の外周部へと延設される。基準用配線２３の一端は、基準信号を取得するため、スフェロイドが浸漬される培地と電気的に接続された基準電極端２５（後述する図４参照）を有する。また、基準用配線２３の他端は、基板１１の外周部に形成された基準用接点２１に接続される。

【0045】

測定用配線３３は、基板１１の中央部におけるスフェロイドが配置されるエリアから、基板１１の外周部へと延設される。測定用配線３３の一端は、細胞外電位に関する信号を取得するため、スフェロイドが浸漬される培地と電気的に接続された測定電極端３５（後述する図３参照）を有する。また、測定用配線３３の他端は、基板１１の外周部に形成された測定用接点３１に接続される。

【0046】

このような構成により、基板１１の中央部においてスフェロイドが発生する細胞外電位に関する信号、および基準信号を、基板１１の中央部よりも平面視における面積が大きい外周部に配置された基準用接点２１および測定用接点３１において取得できる。したがって、選別装置１００では、測定装置を接続するための接点の面積を大きくとることができるため、測定装置との接続が容易になり、また接点の接触抵抗を低減することができる。

【0047】

なお、基準電極端２５および測定電極端３５は、基準電極メッキ２７および測定電極メッキ３７によりメッキ処理されている。基準電極メッキ２７および測定電極メッキ３７は、白金黒により実現される。これによれば、基準電極メッキ２７および測定電極メッキ３７は、基準電極端２５および測定電極端３５の上に凹凸構造を形成する。以下では、基準電極メッキ２７が形成された基準電極端２５を基準用電極２０（後述する図４参照）とよび、測定電極メッキ３７が形成された測定電極端３５を測定用電極３０（後述する図３参照）とよぶ。

【0048】

測定用電極３０は、基板１１の平面視において、８行８列の略正方形のマトリクス状に計６４個配置されている。これにより、６４個の測定用電極３０に対応する６４個のスフェロイドについて、一挙に細胞外電位に関する信号を取得することができる。なお、測定用電極３０の個数は、６４個よりも多くてもよく、少なくてもよい。基準用電極２０は、測定用電極３０が配置された正方形の四隅のそれぞれの外側に各１個の計４個が配置されている。基準用電極２０の個数は、４個よりも多くてもよく、少なくてもよい。

【0049】

絶縁膜１３は、基板１１および導体パターンを覆うことにより、スフェロイドが浸漬された培地と、導体パターンとの接触を抑制するための絶縁性の被膜である。絶縁膜１３は、例えば、感光性アクリル樹脂を用いて形成される。絶縁膜１３は、図１に示すように、基準用接点２１および測定用接点３１よりも基板１１の内側に形成される。したがって、基準用接点２１および測定用接点３１は、基板１１上において電気的に露出した状態である。絶縁膜１３上には、さらに保持層４１が配置される。

【0050】

保持層４１は、複数のスフェロイドのそれぞれを離間して保持するための板状の構造層である。保持層４１は、例えば、樹脂等の材料によって形成されるが、その他の任意の材料を用いてもよい。保持層４１は、スフェロイドと直接的に接触するため、細胞接着性の低い材料によって形成される、または、細胞接着性の低い材料によって表面が被覆されてもよい。保持層４１を絶縁膜１３上に設けることによって、有底の穴部４３ａが形成される。本実施の形態において、保持層４１は、略正方形状に配置された測定用電極３０の配置形状に対応する正方形である。なお、保持層４１の形状は、正方形でなくてもよく、円形または多角形等の任意の形状を用いることができる。

【0051】

ここで、図２を用いて、保持層４１をさらに詳細に説明する。図２は、実施の形態に係る保持層を説明するための図である。図２の（ａ）は、保持層４１を平面視した図である。また、図２の（ｂ）は、図２の（ａ）に示されたｉｉ－ｉｉ線において保持層４１を切断した断面図である。

【0052】

図２に示すように、保持層４１には、保持層４１を厚み方向に貫通する、スフェロイドが収容されるための貫通孔４３が形成されている。当該貫通孔４３は、絶縁膜１３上に保持層４１を設けることによって、絶縁膜１３による底部が形成され、当該底部とともに有底の穴部４３ａを形成する。

【0053】

つまり、保持層４１と絶縁膜１３と導体パターンと基板１１とを有する板体に有底の穴部４３ａが複数形成され、複数の穴部４３ａのそれぞれは、複数のスフェロイドの各々を収容することにより保持する。より詳しくは、複数の穴部４３ａのそれぞれに複数のスフェロイドの各々が収容されることにより、一のスフェロイドは、他のスフェロイドと離間した状態で保持される。なお、複数の穴部４３ａが形成された板体は、保持部の一例である。穴部４３ａ_１はスフェロイド_１を収容して保持し、～、穴部４３ａ_ｉはスフェロイド_ｉを収容して保持し、～、穴部４３ａ_ｎはスフェロイド_ｎを収容して保持してもよい（１≦ｉ≦ｎ、ｉは自然数、ｎは２以上の自然数）。

【0054】

また、貫通孔４３は、保持層４１を絶縁膜１３上に設ける際に、測定用電極３０に対応する箇所に形成されている。これにより、測定用電極３０は、対応する貫通孔４３に収容された（言い換えると穴部４３ａに収容された）スフェロイドから細胞外電位に関する信号を取得する。測定用電極３０_１は貫通孔４３_１に収容された（言い換えると穴部４３ａ_１に収容された）スフェロイド_１から細胞外電位に関する信号_１を取得し、～、測定用電極３０_ｉは貫通孔４３_ｉに収容された（言い換えると穴部４３ａ_ｉに収容された）スフェロイド_ｉから細胞外電位に関する信号_ｉを取得し、～、測定用電極３０_ｎは貫通孔４３_ｎに収容された（言い換えると穴部４３ａ_ｎに収容された）スフェロイド_ｎから細胞外電位に関する信号_ｎを取得してもよい。

【0055】

図１に戻り、絶縁膜１３上には、さらに、囲い部材１５が形成される。囲い部材１５は、絶縁膜１３上の保持層４１を囲み、絶縁膜１３の上面に対して立設される壁状に形成される。囲い部材１５は、絶縁膜１３と、シリコーン接着剤等の任意の接着剤を用いて接着されることにより、保持層４１を内部に含むチャンバ構造を形成する。ここで、囲い部材１５の立設される高さは、保持層４１の厚みよりも大きい。これにより、絶縁膜１３上に接着された囲い部材１５のチャンバ構造内に液体が注入された場合に、当該液体は、水面が保持層４１の上面よりも上に位置するまで注入されることが可能となる。

【0056】

次に、図３および図４を用いて、測定用電極３０および基準用電極２０の周辺構造についてより詳細に説明する。図３は、図１に示された領域Ａの拡大図および当該拡大図におけるｉｉｉ－ｉｉｉ線で切断した断面図である。また、図４は、図１に示された領域Ｂの拡大図および当該拡大図におけるｉｖ－ｉｖ線で切断した断面図である。

【0057】

図３の（ａ）は、図１に示された領域Ａの拡大図である。また、図３の（ｂ）は、図３の（ａ）に示されたｉｉｉ－ｉｉｉ線で切断した断面図である。

【0058】

図３の（ａ）に示すように、穴部４３ａは、保持層４１の平面視において略円形である。また、図３の（ｂ）に示すように、穴部４３ａは、当該穴部４３ａの開口部４５から、穴部４３ａの底部４７側に向かって保持層４１の厚み方向と交差する方向（紙面左右方向）における長さが短くなるテーパ構造を有する。したがって、本実施の形態における穴部４３ａは、逆円錐台形状の空間を有する。

【0059】

スフェロイド５０は、図３の（ｂ）に破線円形で示すように略球形の形状であることが多い。スフェロイド５０は、開口部４５から穴部４３ａの空間内に入り込み、穴部４３ａの深さ方向に沿って底部４７側へと進入する。このとき、穴部４３ａの空間が逆円錐台の形状であるため、穴部４３ａの深さ方向に沿って進入するスフェロイド５０は、穴部４３ａの内側面と接触して進入が停止される。よって、スフェロイド５０は、穴部４３ａの内側面と接触する箇所において保持される。

【0060】

複数のスフェロイド５０は、互いに異なるサイズを有する。スフェロイド５０を構成する細胞の大きさは異なり、一のスフェロイド５０を構成する細胞の個数は他のスフェロイド５０を構成する細胞の個数と異なるからである。穴部４３ａの空間がテーパ構造を有することにより、スフェロイド５０の大きさが小さいほど、スフェロイド５０は、穴部４３ａの内側面上の箇所であって、穴部４３ａの底に近い箇所で保持される。スフェロイド５０は、穴部４３ａの内側面上の箇所であって、スフェロイド５０の大きさに対応する穴部４３ａにおける深さを有する箇所で接触して保持される。つまり、スフェロイド５０は、大きさが異なるスフェロイド５０を収容できる。

【0061】

ここで、穴部４３ａの底部４７には、測定用電極３０が配置される。より詳しくは、図３の（ｂ）に示すように、測定用配線３３の一端には、絶縁膜１３で覆われていない領域が形成されており、この領域における測定用配線３３が測定電極端３５である。測定電極端３５は、測定電極メッキ３７によって被覆されている。これにより、測定用配線３３と穴部４３ａの空間とが、測定電極メッキ３７および測定電極端３５（つまり測定用電極３０）を介して電気的に接続された状態となる。つまり、穴部４３ａの空間において発生した電気信号は、測定用電極３０および測定用配線３３を介して、測定用接点３１へと伝導される。なお、測定用配線３３と穴部４３ａの空間とを電気的に接続することができれば、測定電極端３５は測定電極メッキ３７により被覆されていなくてもよい。

【0062】

本実施の形態においては、スフェロイド５０と、測定用電極３０（つまり測定用電極３０表面の測定電極メッキ３７）とは、接触しない。穴部４３ａの空間は、前述のように逆円錐台形状であるため、スフェロイド５０が接触した箇所から十分離れた位置に穴部４３ａの底部４７の位置を設定することで測定用電極３０と接触しない状態で、スフェロイド５０を収容することができる。なお、測定用電極３０の位置は、穴部４３ａの底部４７に限らず、穴部４３ａの内側面であってもよい。測定用電極３０は、スフェロイド５０と接触していなければ、その位置に特に限定はない。

【0063】

なお、スフェロイド５０と測定用電極３０との距離は、１００マイクロメートル以下に設定されるとよい。これは、後述する実施例においてスフェロイド５０のモデルとして用いる膵島スフェロイドに関して最適化された値である。したがって、その他の種のスフェロイド５０を用いる場合、スフェロイド５０と測定用電極３０との距離は、１００マイクロメートルより大きくてもよく、小さくてもよい。スフェロイド５０の種類ごとにスフェロイド５０と測定用電極３０との最適距離が異なる場合があるため、スフェロイド５０と測定用電極３０との距離は、予備試験等に基づいて適宜設定されてもよい。

【0064】

また、測定用電極３０の位置は、穴部４３ａの内側面においてスフェロイド５０と内側面とが接触する箇所よりも穴部４３ａの底部４７側の位置であってもよい。穴部４３ａの底部４７は、複数のスフェロイド５０のうち、測定用電極３０に対応するスフェロイド５０が最も近位となる位置である。つまり、測定用電極３０は、最も近位にある対応するスフェロイド５０から細胞外電位に関する信号を取得することができる。

【0065】

さらに、以上の測定用電極３０の位置、および、穴部４３ａの平面視形状が略円形であることにより、選別装置１００は、より正確に対応するスフェロイド５０から細胞外電位に関する信号を取得することができる。具体的には、穴部４３ａの平面視形状が略円形であることにより、穴部４３ａのいずれかの深さにおいて、スフェロイド５０の外面と穴部４３ａの内側面とが適合して収容される。

【0066】

これにより、穴部４３ａの内側面における収容されたスフェロイド５０に接する箇所を境に、穴部４３ａの空間は、開口部４５側と底部４７側とに分断される。穴部４３ａの空間は、開口部４５を除いて外部に連通していないため、スフェロイド５０の収容で分断されることにより底部４７側に外部とつながらない略密閉の空間が形成される。このような略密閉の空間は、他の物質の進入が抑制されている。

【0067】

また、測定用電極３０は、配置される位置が略密閉の空間内の位置であるため、複数のスフェロイド５０のうち、測定用電極３０に対応するスフェロイド５０が発生する細胞外電位に関する信号を効率的に取得することができる。例えば、複数のスフェロイド５０のうち、測定用電極３０に対応するスフェロイド５０ではない他のスフェロイド５０が発生する細胞外電位に関する信号は、分断により当該測定用電極３０への伝導が低減される。したがって、略密閉の空間では、対応するスフェロイド５０からの細胞外電位に関する信号に混入する、他のスフェロイド５０からの細胞外電位に関する信号を低減することができる。よって、測定用電極３０では、より正確に対応するスフェロイド５０から細胞外電位に関する信号を取得することができる。

【0068】

図４の（ａ）は、図１に示された領域Ｂの拡大図である。また、図４の（ｂ）は、図４の（ａ）に示されたｉｖ－ｉｖ線で切断した断面図である。

【0069】

図４の（ｂ）に示すように、基準用配線２３の一端には、絶縁膜１３で覆われていない領域が形成されており、この領域における基準用配線２３が基準電極端２５である。基準電極端２５は、基準電極メッキ２７によって被覆されている。これにより、基準用配線２３と絶縁膜１３の上面よりも上側とが、基準電極メッキ２７および基準電極端２５（つまり基準用電極２０）を介して電気的に接続された状態となる。つまり、絶縁膜１３の上面よりも上側において発生した電気信号は、基準用電極２０および基準用配線２３を介して、基準用接点２１へと伝導される。なお、基準用配線２３と絶縁膜１３の上面よりも上側とを電気的に接続することができれば、基準電極端２５は基準電極メッキ２７により被覆されていなくてもよい。

【0070】

次に、図５および図６を用いて、本実施の形態における選別装置１００と評価装置について説明する。図５は、実施の形態に係る選別装置と評価装置との関係を説明するブロック図である。

【0071】

図５に示すように、本実施の形態における選別装置１００は、評価装置２００と電気的に接続され、評価装置２００に対して、測定用電極３０において取得したスフェロイド５０の細胞外電位に関する信号、および基準電位に関する基準信号を送信する。

【0072】

評価装置２００は、一例として、プロセッサとメモリとを備える処理装置により実現される。評価装置２００は、スフェロイド５０の細胞外電位に関する信号を取得する取得部と、信号をフーリエ変換してパワースペクトル密度を算出する算出部と、算出されたパワースペクトル密度に基づいて、スフェロイドの良否を判定する判定部とを有する。

【0073】

取得部は、選別装置１００における測定用接点３１に接続された、評価装置２００の接続インタフェースから、測定用電極３０において取得されたスフェロイド５０の細胞外電位に関する信号を取得する。また、取得部は、選別装置１００における基準用接点２１に接続された、評価装置２００の接続インタフェースから、基準用電極２０において取得された基準電位に関する基準信号を取得する。

【0074】

取得部は、複数の測定用電極のそれぞれについて上記した処理を行う。これにより、取得部は、複数のスフェロイド５０各々の細胞外電位に関する信号を取得する。

【0075】

算出部は、取得された細胞外電位（Ｖ）に関する信号および基準電位（Ｖref）に関する信号を用いて、測定用電極３０におけるスフェロイド５０の細胞外電位の基準電位に対する電位差（ΔＶ＝Ｖ－Ｖref）の時間領域における変化をフーリエ変換により信号を周波数展開して、パワースペクトル密度を算出する。なお、基準用電極２０が接地されている場合、基準用電極２０の電位の計測は不要で、ΔＶ＝Ｖと考えてもよい。

【0076】

算出部は、複数の測定用電極の複数の細胞外電位（Ｖ）のそれぞれについて上記した処理を行う。これにより、算出部は、複数のスフェロイド５０各々に対応するパワースペクトル密度を算出する。

【0077】

判定部は、算出されたパワースペクトル密度の解析によりスフェロイド５０の良否の判定を行う。判定部による判定は、例えば、算出されたパワースペクトル密度のピーク周波数を周波数閾値と比較してもよく、パワースペクトル密度のパワーがパワー閾値以上かまたはパワー閾値よりも低いかの判定に基づいてもよい。

【0078】

判定部は、複数のスフェロイド５０各々に対応するパワースペクトル密度を解析し、複数のスフェロイド５０各々の良否判定を行う。

【0079】

また、判定部は、複数回にわたって取得された信号および基準信号を用いて、算出部により算出された複数のパワースペクトル密度を比較することによりスフェロイド５０の良否の判定を行ってもよい。判定部による判定は、スフェロイド５０の種類および用途に合わせたスフェロイド５０の良否に対して、良否のそれぞれが反映されたパワースペクトル密度上の特徴を演算により判別できればよい。判定部による判定については、後述の実施例において一例を説明する。

【0080】

図６は、実施の形態に係る選別装置と評価装置との関係を説明する概略図である。つまり、図６は、選別装置１００の断面図と、当該選別装置１００に接続された評価装置２００の一部（図中の電圧計６３よりも後段）とを示す概略図である。

【0081】

図６に示すように、本実施の形態においては、選別装置１００の複数の穴部４３ａのそれぞれにスフェロイド５０が配置される。各々のスフェロイド５０は、穴部４３ａの空間の逆円錐台形状により、測定用電極３０と接触しない状態で保持されている。また、スフェロイド５０のそれぞれは、囲い部材１５によるチャンバ構造を満たす培地６１により、浸漬された状態である。培地６１に浸漬されることにより、スフェロイド５０を形成する細胞は、細胞活動を維持可能な環境内に存在している。なお、スフェロイド５０は、測定用電極３０と空間的に接触しない状態、かつ、培地６１により測定用電極３０と電気的に接続された状態で保持されている。

【0082】

評価装置２００では、スフェロイド５０が発生する細胞外電位を時間領域において連続的に取得している。細胞外電位は、それぞれの測定用電極３０に接続された電圧計６３を用いて、測定用電極３０において取得される電位と、基準用電極２０において取得される電位との電位差に基づいて取得される。

【0083】

（実施例）
以下、実施の形態における実施例を以下に説明する。なお、以下では、随時図７Ａ、図７Ｂ、および図７Ｃを参照しながら、スフェロイド５０の選別方法および評価方法について説明する。図７Ａは、実施の形態に係るスフェロイドの選別方法および評価方法について説明するフローチャートである。また、図７Ｂは、複数のスフェロイドに適用される場合に追加で実施される選別方法および評価方法におけるサブフローチャートである。また、図７Ｃは、スフェロイドの良否を判定する他の判定ステップを示すサブフローチャートである。

【0084】

以下の実施例においては、複数のスフェロイドに適用される選別方法および評価方法について説明する。したがって、以下の実施例においては、図７Ａに示すフローチャート、および図７Ｂに示すサブフローチャートにおけるステップは、すべて実施される。ただし、前述したように、単一のスフェロイドに適用される評価方法を実施する場合、図７Ｂに示すサブフローチャートは実施されなくてもよい。

【0085】

また、図７Ｃに示すサブフローチャートにおけるステップは、他に適用され得る判定ステップを例示するものである。したがって、図７Ｃに示すサブフローチャートにおけるステップは、実施されなくてもよい。以下の実施例においては、図７Ｃに示すサブフローチャートにおけるステップが実施されないものとして説明する。

【0086】

また、以下の実施例においては、グルコースを第１濃度で含む第１溶液中、およびグルコースを第２濃度で含む第２溶液中のそれぞれにおいて、スフェロイド５０の細胞外電位に関する信号を取得する。また、以下では、スフェロイド５０として、特に膵島スフェロイドに準ずるモデル細胞塊の膵島（実施例中では単離膵島として説明する）を用いた実施例を説明する。

【0087】

したがって、本実施例における取得部は、第１溶液中で膵島スフェロイドの細胞外電位に関する第１信号を取得する第１取得部と、第２溶液中で膵島スフェロイドの細胞外電位に関する第２信号を取得する第２取得部とを有する。また、本実施例における算出部は、第１信号および第２信号をそれぞれフーリエ変換して、第１パワースペクトル密度および第２パワースペクトル密度を算出する。また、本実施例における判定部は、算出された第１パワースペクトル密度および第２パワースペクトル密度の少なくとも一方に基づいて、膵島スフェロイドの良否を判定する。

【0088】

［選別装置の作製］
まず、基板１１として正方形のガラス板が用意された。ガラス板は、０．７ミリメートルの厚みおよび、５０ミリメートル×５０ミリメートルの２５００平方ミリメートルの面積を有していた。

【0089】

次に、スパッタリング法によりガラス板の表面に１５０ナノメートルの厚みを有するＩＴＯ膜が形成された。また、フォトリソグラフィ技術を用いて、ＩＴＯ膜をパターン加工することで、導体パターンが形成された。導体パターンの形成は、測定用接点３１を６４個、基準用接点を４個の計６８個の接点、ならびに６４本の測定用配線３３、および４本の基準用配線２３として行われた。

【0090】

次いで、感光性アクリル樹脂を用いて、ガラス板およびガラス板上に形成された導体パターンの表面が厚さ１．５マイクロメートルの絶縁膜１３により被覆された。この際、６８個の接点ならびに、測定電極端３５および基準電極端２５を有する各配線の先端には絶縁膜１３による被覆が行われなかった。

【0091】

測定電極端３５は、８行８列に１．６ミリメートル間隔の等間隔で、６４個形成された。また、基準電極端２５は、ガラス板の中心から９．８ミリメートルの位置に、ガラス板の中心を対象に４個形成された。

【0092】

測定電極端３５は、ガラス板の平面視において縦横、各５０マイクロメートルの正方形とした。また、基準電極端２５は、ガラス板の平面視において縦横、各２００マイクロメートルの正方形とした。

【0093】

次に、保持層４１としてウェルが用意された。ウェルの材料には、アクリル樹脂が用いられた。また、ウェルは、縦横、各１３ミリメートルおよび、厚さ１ミリメートルの板状のものとした。また、ウェルには、上面から下面に向かって縮径するテーパ構造の貫通孔４３を形成させた。当該貫通孔４３は、測定電極端３５と同じ１．６ミリメートル間隔で、８行８列に６４個形成された。ウェルに形成された貫通孔４３は、ウェルの上面側が直径１ミリメートルの円形、ウェルの下面側が直径１００マイクロメートルの円形の逆円錐台形状とした。

【0094】

次に、絶縁膜１３上において、複数の測定電極端３５のそれぞれが、ウェルの平面視における複数の貫通孔４３の中央に配置される位置に、ウェルが接着された。ウェルの接着には、シリコーン接着剤が用いられた。次に、ウェルおよび基準電極端２５を内部に含むように、絶縁膜１３の表面に囲い部材１５が、シリコーン接着剤を用いて接着された。なお、囲い部材１５の材料としては、ガラスを用いた。また、囲い部材１５には、２２ミリメートルの内径、２５ミリメートルの外径、および１０ミリメートルの高さを有する円筒形のものを用いた。

【0095】

次に、露出している測定電極端３５および基準電極端２５が、白金黒を用いてメッキ処理された。具体的には、メッキ溶液を用いて、２０ｍＡ／ｃｍ^２の電流密度で２分間処理することにより、測定電極端３５および基準電極端２５は、メッキにより被覆された。なお、メッキ処理時には、測定用接点３１および基準用接点２１は、カソードとして用いられた。また、メッキ溶液は、以下の表１に示す組成の溶液が用いられた。このようなメッキ処理により、測定電極端３５および基準電極端２５は、白金黒の測定電極メッキ３７および基準電極メッキ２７により被覆された。

【0096】

選別装置１００は、以上のようにして作製された。

【0097】

【表1】

【0098】

［単離膵島の培養］
次に、スフェロイド５０のモデルとして、選別装置１００を用いて、ラットから単離された膵島（以下、単に「単離膵島」という）が培養された。その後、選別装置１００を用いて、単離膵島の細胞外電位の時間領域における変化が測定された。

【0099】

本実施例においては、培地中の単離膵島の中から直径が２００±５０マイクロメートルであるものを選択して用いた。

【0100】

選別装置１００には、あらかじめ滅菌処理（３０分間紫外線を照射）が行われた後、培地が供された。次に、単離膵島が、ウェルの貫通孔４３（つまり、穴部４３ａ）のそれぞれに１個ずつ播種（言い換えると配置）された。播種された単離膵島は、自重によりウェルに形成された穴部４３ａの空間内を底部４７に向かって沈んでいき、穴部４３ａの内側面によりそれ以上の沈降が制限される位置で保持された。測定用電極３０（つまり、測定電極メッキ３７の表面）と、保持された単離膵島とは、物理的に接触しなかった。

【0101】

次に、単離膵島は、３７℃、ＣＯ_２濃度５％雰囲気に管理されたインキュベータ内で２４時間静置された。

【0102】

以上により、単離膵島を測定用電極３０とは接触しない状態で保持する保持ステップ（図７ＡにおけるＳ１００）、および保持された単離膵島の培養が実施された。単離膵島は、測定用電極３０と接触せずに保持されるため、培養の過程において測定用電極３０に接着する等に伴って生じる回収された単離膵島の損傷および変性が抑制される。測定用電極３０への接着は、単離膵島に限らず、一般的なスフェロイド５０であれば生じ得るため、本実施例において説明した保持ステップ（Ｓ１００）による効果は、広く適用可能である。

【0103】

［細胞外電位の測定］
次に、以上のように培養された膵島単離の細胞外電位の時間領域における変化が以下の手順に沿って測定された。測定用培地（以下、ＫＢＲ Ｂｕｆｆｅｒという）は、以下の表２に示す組成の溶液が用いられた。

【0104】

単離膵島がウェルから脱離しないように選別装置１００上の培地が、グルコースを２．５ｍＭ（第１濃度）で含むＫＢＲ Ｂｕｆｆｅｒ（つまり、第１溶液）に置換された。

【0105】

次に、３７℃、ＣＯ_２濃度５％雰囲気に管理されたインキュベータ内で、測定用電極３０および基準用電極２０を用いて、各々の単離膵島の細胞外電位に関する信号（第１信号）を連続的に取得することにより、時間領域における細胞外電位の変化が６０分間にわたって測定された。なお、細胞外電位の測定には、細胞電位測定装置を用いた。細胞電位測定装置は、上記の実施の形態における評価装置２００の一部機能を実施する装置である。つまり、評価装置２００は、全ての機能が一体化された単一の装置として実現されてもよく、機能ごとにモジュール化された複数の装置により実現されてもよい。

【0106】

細胞電位測定装置により、６４個の単離膵島それぞれの細胞外電位の時間領域における変化が、それぞれの単離膵島が保持された穴部４３ａの底部４７に位置するそれぞれの測定用電極３０によって、略同時に測定された。それぞれの細胞外電位の時間領域における変化は、Ａ／Ｄ（アナログ／デジタル）変換器により、サンプリングレート２０キロヘルツ、１２ビット階調でデジタル変換されハードディスク等の記憶装置に保存された。

【0107】

以上により、第１溶液中で単離膵島の細胞外電位に関する第１信号を取得する第１取得ステップ（図７ＡにおけるＳ１０１）が実施された。すなわち、第１溶液中で単離膵島_１の細胞外電位_１に関する第１信号_１～単離膵島_６４の細胞外電位_６４に関する第１信号_６４を取得する第１取得ステップ（図７ＡにおけるＳ１０１）が実施された。単離膵島_１～単離膵島_６４と第１信号_１～第１信号_６４は１対１対応する。

【0108】

次に、単離膵島がウェルから脱離しないように選別装置１００上の第１溶液が、グルコースを第１濃度よりも高い２２．５ｍＭ（第２濃度）で含むＫＢＲ Ｂｕｆｆｅｒ（つまり、第２溶液）に置換（言い換えると、交換）された。

【0109】

つまり、第１溶液を第２溶液に交換するステップ（図７ＡにおけるＳ１０２）が実施された。

【0110】

次に、３７℃、ＣＯ_２濃度５％雰囲気に管理されたインキュベータ内で、測定用電極３０および基準用電極２０を用いて、各々の単離膵島の細胞外電位に関する信号（第２信号）を連続的に取得することにより、時間領域における細胞外電位の変化が６０分間にわたって測定された。なお、測定方法は、第１信号の取得と同様の方法により行った。

【0111】

以上により、第２溶液中で単離膵島の細胞外電位に関する第２信号を取得する第２取得ステップ（図７ＡにおけるＳ１０３）が実施された。すなわち、第２溶液中で単離膵島_１の細胞外電位_１に関する第２信号_１～単離膵島_６４の細胞外電位_６４に関する第２信号_６４を取得する第１取得ステップ（図７ＡにおけるＳ１０１）が実施された。単離膵島_１～単離膵島_６４と第２信号_１～第２信号_６４は１対１対応する。

【0112】

次に、単離膵島がウェルから脱離しないように選別装置１００上の第２溶液が培地に置換された。さらに、選別装置１００は、３７℃、ＣＯ_２濃度５％雰囲気に管理されたインキュベータ内に静置された。この培地の置換は、後述する、回収ステップにおいて単離膵島の回収までの間、単離膵島を構成する各細胞が細胞活動を維持可能な環境内におくために実施している。

【0113】

【表2】

【0114】

［単離膵島の良否判定］
単離膵島の良否の判定は、以下の手順で実施された。

【0115】

まず、第１信号の解析が行われた。つまり、第１信号_１～第１信号_６４の解析が行われた。ハードディスクに保存された６４個の単離膵島の第１信号、つまり、単離膵島_１の第１信号_１～単離膵島_６４の第１信号_６４においては、それぞれ１／１０００にダウンサンプリングされた後、６０分間の測定データのうち培地置換後の細胞外電位が十分に安定化するまでの期間である始めの１０分間の測定データが除外された。第１信号のうち除外されなかった後半の５０分間の測定データである解析用データが作成された。

【0116】

次に、上記の処理が適用された６４個の第１信号に含まれる解析用データについて、２つの単離膵島からなるペアの各々の第１信号どうしの相関を示す相関係数が算出された。相関係数は、２つのデータを用いた計算により得られる０以上かつ１以下の数値であり、数値が大きいほど計算に用いた２つのデータの類似性が高いことを示すものである。言い換えると、相関係数は、数値が小さいほど計算に用いた２つのデータの類似性が低い、つまり、独立したデータであることを示すものである。したがって、２つの単離膵島からなるペアの各々について第１信号の相関係数の算出により、ペアをなす２つの単離膵島のそれぞれから取得された第１信号どうしの独立性の程度が示された。

【0117】

本実施例において、単離膵島のそれぞれから取得された第１信号どうしの独立性の程度を用いて、単離膵島が不良であるか否かを判定する。より詳しくは、算出された相関係数が高い場合に、相関係数の算出に用いられた２つの第１信号が同じ単離膵島から取得されたものとみなす。つまり、このような場合に、２つの単離膵島のうち、一方の細胞外電位に関する第１信号が２つの測定用電極３０によって取得されたとみなす。したがって、２つの単離膵島のうち、一方の細胞外電位に関する第１信号が正確に取得されていなかったこととなる。２つの単離膵島のうち、どちらの単離膵島の細胞外電位が正確に取得されていなかったかは判別困難であるため、これら２つの単離膵島をいずれも不良と判定する。これにより、第１信号が正確に取得されていなかった単離膵島は、確実に不良と判定され、良好なスフェロイドが選別され、回収される。

【0118】

以上に基づき、第１信号と、他の６３個の第１信号との相関係数がいずれにおいても閾値（第２閾値）として設定した０．４以下の数値を示す第１信号を独立な単離膵島から取得された独立な第１信号として、該当する第１信号が抽出された（図７ＢにおけるＳ２０１でＹｅｓ）。一方、第１信号と、他の６３個の第１信号との相関係数がいずれにおいても閾値（第２閾値）として設定した０．４よりも大きい数値を示す２つの第１信号がそれぞれ取得された２つの単離膵島は（図７ＢにおけるＳ２０１でＮｏ）、不良と判定された（図７Ａおよび図７ＢにおけるＳ１１０）。なお、上記の閾値（第２閾値）は、０．４でなくてもよく、実験的に決定されてもよい。

【0119】

次に、第２信号の解析が行われた。つまり、第２信号_１～第２信号_６４の解析が行われた。ハードディスクに保存された６４個の単離膵島の第２信号、つまり、単離膵島_１の第２信号_１～単離膵島_６４の第２信号_６４においては、それぞれ１／１０００にダウンサンプリングされた後、６０分間の測定データのうち培地置換後の細胞外電位が十分に安定化するまでの期間である始めの１０分間の測定データが除外された。第２信号のうち除外されなかった後半の５０分間の測定データである解析用データが作成された。

【0120】

次に、上記の処理が適用された６４個の第２信号に含まれる解析用データについて、２つの単離膵島からなるペアの各々の第２信号どうしの相関を示す相関係数が算出された。２つの単離膵島からなるペアの各々について第２信号の相関係数の算出により、ペアをなす２つの単離膵島のそれぞれから取得された第２信号どうしの独立性の程度が示された。

【0121】

本実施例において、単離膵島のそれぞれから取得された第２信号どうしの独立性の程度を用いて、第１信号と同様に単離膵島が不良であるか否かを判定する。

【0122】

第２信号と、他の６３個の第２信号との相関係数がいずれにおいても閾値（第３閾値）として設定した０．４以下の数値を示す第２信号を独立な単離膵島から取得された独立な第２信号として、該当する第２信号が抽出された（図７ＢにおけるＳ２０２でＹｅｓ）。一方、第２信号と、他の６３個の第２信号との相関係数がいずれにおいても閾値（第３閾値）として設定した０．４よりも大きい数値を示す２つの第２信号がそれぞれ取得された２つの単離膵島は（図７ＢにおけるＳ２０２でＮｏ）、不良と判定された（図７Ａおよび図７ＢにおけるＳ１１０）。なお、上記の閾値（第３閾値）は、０．４でなくてもよく、実験的に決定されてもよい。

【0123】

なお、以上の第１信号に対する相関係数に基づく単離膵島の良否判定のステップ（Ｓ２０１）および第２信号に対する相関係数に基づく単離膵島の良否判定のステップ（Ｓ２０２）は、いずれか一方のみが行われてもよく、いずれも行われなくてもよい。選別装置１００の設計が十分であり、測定用電極３０が対応する単離膵島の細胞外電位に関する信号を正確に取得できる構成であれば、相関係数に基づく良否判定のステップ（Ｓ２０１およびＳ２０２）は、必須ではない。

【0124】

次に、抽出された独立な第１信号、および、独立な第２信号は、フーリエ変換（ＦＦＴ：Ｆａｓｔ Ｆｏｕｒｉｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）解析を行い、周波数成分の検出が行われた。ＦＦＴ解析では、第１信号および第２信号がフーリエ変換され、第１パワースペクトル密度および第２パワースペクトル密度の算出が行われた。

【0125】

算出された第１パワースペクトル密度および第２パワースペクトル密度におけるパワーのピーク値が閾値（第１閾値）として設定した１０より大きいものを抽出した（図７ＡにおけるＳ１０５でＹｅｓ）。一方で、算出された第１パワースペクトル密度および第２パワースペクトル密度におけるパワーのピーク値が閾値（第１閾値）として設定した１０以下であったパワースペクトル密度が算出された第１信号または第２信号が取得された単離膵島は（図７ＡにおけるＳ１０５でＮｏ）、不良と判定された（図７Ａおよび図７ＢにおけるＳ１１０）。ここで、パワースペクトル密度におけるパワーのピーク値とは、ノイズ成分に基づくピークを除く、例えば最大のパワーを示すピーク値である。したがって、例えば、高周波成分によるノイズをフィルタにより除外する、または、平均化によりノイズ成分を低減する等のノイズ処理を実施した後、ピーク値を決定してもよい。また、上記の閾値（第１閾値）は、１０でなくてもよく、実験的に決定されてもよい。このような閾値（第１閾値）は、第１パワースペクトルおよび第２パワースペクトルのそれぞれに個別に設定された異なる閾値であってもよい。

【0126】

複数の第１パワースペクトル密度のうち、ピーク値と閾値（第１閾値）との比較により抽出された第１パワースペクトル密度について、パワーが最大となる第１ピーク周波数（つまり、第１周波数）が特定された。つまり、第１特定ステップ（図７ＡにおけるＳ１０６）が実施された。また、特定された第１ピーク周波数を、対応する第１パワースペクトルに対応する単離膵島の第１溶液中における活動周波数とした。なお、第１ピーク周波数の特定においても、ノイズ成分に基づくピークを除く目的からノイズ処理を実施した後、第１ピーク周波数が特定されてもよい。

【0127】

次いで、複数の第２パワースペクトル密度のうち、ピーク値と閾値（第１閾値）との比較により抽出された第２パワースペクトル密度について、パワーが最大となる第２ピーク周波数（つまり、第２周波数）が特定された。つまり、第２特定ステップ（図７ＡにおけるＳ１０７）が実施された。また、特定された第２ピーク周波数を、対応する第２パワースペクトルに対応する単離膵島の第２溶液中における活動周波数とした。なお、第２ピーク周波数の特定においても、ノイズ成分に基づくピークを除く目的からノイズ処理を実施した後、第２ピーク周波数が特定されてもよい。

【0128】

次に、個々の単離膵島において特定された第１ピーク周波数および第２ピーク周波数（つまり第１溶液中および第２溶液中における活動周波数）の比較が実施された。

【0129】

一例として、第２ピーク周波数が第１ピーク周波数よりも大きいか否かの判定が行われた（図７ＡにおけるＳ１０８）。上記の例では、第２ピーク周波数が第１ピーク周波数よりも大きい場合（図７ＡにおけるＳ１０８でＹｅｓ）、単離膵島が良と判定された（図７ＡにおけるＳ１０９）。一方で、第２ピーク周波数が第１ピーク周波数以下である場合（図７ＡにおけるＳ１０８でＹｅｓ）、単離膵島が不良と判定された（図７Ａおよび図７ＢにおけるＳ１１０）。なお、実施例における単離膵島の良判定とは、単離膵島を構成する細胞が良好に活動していることを示している。

【0130】

また、個々の単離膵島における第１溶液中および第２溶液中における活動周波数それぞれについて個別に判定を行った結果を単離膵島の良否判定に用いてもよい。一例として、第１溶液中における活動周波数が第１規定周波数範囲（例えば、０．０２ヘルツ以上かつ０．０６ヘルツ以下）内であり、かつ第２溶液中における活動周波数が第２規定周波数範囲（例えば、０．０４ヘルツ以上かつ０．１４ヘルツ以下）内である場合に当該単離膵島が良と判定されてもよい。さらに、図７Ｃに示すように、単離膵島における活動周波数の個別の判定と上記の第１ピーク周波数および第２ピーク周波数の大小の比較が組み合わされてもよい。すなわち、第１溶液中における活動周波数が第１規定周波数範囲内であり（図７ＣにおけるＳ３０１でＹｅｓ）かつ第２溶液中における活動周波数が第２規定周波数範囲内であり（図７ＣにおけるＳ３０２でＹｅｓ）、かつ、第２ピーク周波数が第１ピーク周波数よりも大きい（図７ＡにおけるＳ１０８でＹｅｓ）単離膵島が良と判定されてもよい。なお、上記の例では、ステップ（Ｓ３０１、Ｓ３０２およびＳ１０８）のいずれかにおいて基準を満たさなかった場合（図７ＣにおけるＳ３０１もしくはＳ３０２または図７ＡにおけるＳ１０８のいずれかでＮｏ）、単離膵島を不良と判定してもよい。以上により、複数の単離膵島それぞれの良否を判定するための、ステップ（Ｓ１０５、Ｓ１０８、Ｓ２０１、およびＳ２０２）を含む判定ステップが実施された。

【0131】

さらに、第２取得ステップの後に３７℃、ＣＯ_２濃度５％雰囲気に管理されたインキュベータ内に静置された単離膵島を含む選別装置１００において、判定ステップで良と判定された単離膵島が選択的に回収される回収ステップ（図７ＡにおけるＳ１１１）が実施された。回収ステップでは、選別装置１００上に保持された単離膵島のうち、不良と判定された単離膵島へのレーザ照射または、細胞死を誘導する薬剤等の添加等の方法により、当該単離膵島を破壊することで、良と判定された単離膵島が選択的に回収されてもよい。また、良と判定された単離膵島が直接的かつ選択的に回収されてもよい。

【0132】

以下では、図８～図１０を用いて、実施例において得られたデータについて説明する。

【0133】

図８は、実施例に係る第１単離膵島から得られた各種データについて説明する図である。図８の（ａ）は、第１単離膵島から得られた第１溶液中における第１信号を示す図である。また、図８の（ｂ）は、図８の（ａ）に示した第１信号をフーリエ変換して算出された第１パワースペクトル密度を示す図である。また、図８の（ｃ）は、第１単離膵島から得られた第２溶液中における第２信号を示す図である。また、図８の（ｄ）は、図８の（ｃ）に示した第２信号をフーリエ変換して算出された第２パワースペクトル密度を示す図である。

【0134】

図８に示すように本実施例における第１単離膵島では、取得された第１信号に対してフーリエ変換を実施することで算出された第１パワースペクトル密度において、ピーク値が閾値（第１閾値）以下であった。したがって、第１単離膵島では、第１溶液中における活動周波数は、特定されなかった。また、第１単離膵島では、取得された第２信号に対してフーリエ変換を実施することで算出された第２パワースペクトル密度において、ピーク値が閾値（第１閾値）よりも大きかった。したがって、第１単離膵島では、第２溶液中における活動周波数が特定され、その値は、０．０７ヘルツであった。

【0135】

図９は、実施例に係る第２単離膵島から得られた各種データについて説明する図である。図９の（ａ）は、第２単離膵島から得られた第１溶液中における第１信号を示す図である。また、図９の（ｂ）は、図９の（ａ）に示した第１信号をフーリエ変換して算出された第１パワースペクトル密度を示す図である。また、図９の（ｃ）は、第２単離膵島から得られた第２溶液中における第２信号を示す図である。また、図９の（ｄ）は、図９の（ｃ）に示した第２信号をフーリエ変換して算出された第２パワースペクトル密度を示す図である。

【0136】

図９に示すように本実施例における第２単離膵島では、取得された第１信号に対してフーリエ変換を実施することで算出された第１パワースペクトル密度において、ピーク値が閾値（第１閾値）よりも大きかった。したがって、第２単離膵島では、第１溶液中における活動周波数が特定され、その値は、０．０３ヘルツであった。また、第２単離膵島では、取得された第２信号に対してフーリエ変換を実施することで算出された第２パワースペクトル密度において、ピーク値が閾値（第１閾値）以下であった。したがって、第２単離膵島では、第２溶液中における活動周波数は、特定されなかった。

【0137】

図１０は、実施例に係る第３単離膵島から得られた各種データについて説明する図である。図１０の（ａ）は、第３単離膵島から得られた第１溶液中における第１信号を示す図である。また、図１０の（ｂ）は、図１０の（ａ）に示した第１信号をフーリエ変換して算出された第１パワースペクトル密度を示す図である。また、図１０の（ｃ）は、第３単離膵島から得られた第２溶液中における第２信号を示す図である。また、図１０の（ｄ）は、図１０の（ｃ）に示した第２信号をフーリエ変換して算出された第２パワースペクトル密度を示す図である。

【0138】

図１０に示すように本実施例における第３単離膵島では、取得された第１信号に対してフーリエ変換を実施することで算出された第１パワースペクトル密度において、ピーク値が閾値（第１閾値）よりも大きかった。したがって、第３単離膵島では、第１溶液中における活動周波数が特定され、その値は、０．０４ヘルツであった。また、第３単離膵島では、取得された第２信号に対してフーリエ変換を実施することで算出された第２パワースペクトル密度において、ピーク値が閾値（第１閾値）よりも大きかった。したがって、第３単離膵島では、第２溶液中における活動周波数が特定され、その値は、０．１２ヘルツであった。

【0139】

一般的に膵島（つまり単離膵島）は、培地中におけるグルコース濃度が低い場合には、膵島に含まれるα細胞が活動し、グルカゴンを放出することが知られている。α細胞からのグルカゴンの放出は周期的に行われ、その周期の中でα細胞内の電位も同様の周期で変化する。よって、第１溶液中における活動周波数の逆数は、その膵島のグルカゴン放出に伴うα細胞の活動周期を反映している。

【0140】

特定された複数の単離膵島におけるグルコース濃度が低い第１溶液中の活動周波数の多くは、０．０２ヘルツ以上かつ０．０６ヘルツ以下の範囲内であった。このことから、当該範囲を第１溶液中において良好と考えられる膵島の活動周波数に対応する第１規定周波数範囲として規定した。

【0141】

また、膵島は、培地中におけるグルコース濃度が高い場合には、膵島に含まれるβ細胞が活動し、インスリンを放出することが知られている。β細胞からのインスリンの放出は周期的に行われ、その周期の中でβ細胞内の電位も同様の周期で変化する。よって、第２溶液中における活動周波数の逆数は、その膵島のインスリン放出に伴うβ細胞の活動周期を反映している。

【0142】

特定された複数の単離膵島におけるグルコース濃度が高い第２溶液中の活動周波数の多くは、０．０４ヘルツ以上かつ０．１４ヘルツ以下の範囲内であった。このことから、当該範囲を第２溶液中において良好と考えられる膵島の活動周波数に対応する第２規定周波数範囲として規定した。

【0143】

また、β細胞の活動周期は、α細胞の活動周期に比べて短いことが生理学的に知られている。これに基づき、第２ピーク周波数が第１ピーク周波数よりも大きい、つまり、第１溶液中の活動周波数＜第２溶液中の活動周波数であることを単離膵島が良判定であることの判定基準として規定した。

【0144】

上記の３つの単離膵島の中では、第３単離膵島が第１ピーク周波数および第２ピーク周波数の両方が抽出されており、α細胞とβ細胞の両方が活動していることが示された。さらに、第３単離膵島のβ細胞の活動周期はおおよそ８．３秒間であり、α細胞の活動周期はおおよそ２５秒間であったことから、以下のすべての条件を満たしていたため、第３単離膵島は、良判定とされた。

【0145】

０．０２ヘルツ≦第１溶液中の活動周波数（０．０４ヘルツ）≦０．０６ヘルツ
０．０４ヘルツ≦第２溶液中の活動周波数（０．１２ヘルツ）≦０．１４ヘルツ
第１溶液中の活動周波数（０．０４ヘルツ）＜第２溶液中の活動周波数（０．１２ヘルツ）
このように、培地中のグルコース濃度をα細胞が活動する低濃度にしたときの細胞外電位の周波数に基づく活動周期と、培地中のグルコース濃度をβ細胞が活動する高濃度にしたときの細胞外電位の周波数に基づく活動周期とを特定する。これにより、特定された活動周期が第１規定周波数範囲および第２規定周波数範囲に基づく活動周期の範囲を満たしているか否かを判定することで、複数の単離膵島を同時に、かつ、それぞれの良否を判定することができる。

【0146】

つまり、複数の単離膵島について個別に、単離膵島を構成する細胞の良好な活動によりグルコース濃度に応じて適切にグルカゴンおよびインスリン分泌を行う機能を有するか否かを判定することができる。さらに、本実施例において説明した選別方法では、単離膵島が測定用電極３０と物理的に接触することがないので、測定用電極３０との接触による物理的な損傷を抑制することができ、単離膵島の回収ステップ（Ｓ１１１）において、測定用電極３０との吸着（言い換えると接着）を物理的に剥がすことによる単離膵島の破損を抑制することができる。

【0147】

［比較例の作製］
上記の実施例と比較するための比較例として、ウェルの貫通孔４３における下面側の開口を直径２００マイクロメートルの円形に設定して、その他を実施例と同様に設定した。したがって、ウェルの貫通孔４３における下面側の開口の拡大に伴い、穴部４３ａに播種された一部の単離膵島は、測定用電極３０（つまり、測定電極メッキ３７の表面）と、保持された単離膵島とは、物理的に接触していた。

【0148】

［比較例との比較結果］
以下、図１１および図１２を用いて、上記実施例と比較例との比較結果について説明する。図１１は、実施例および比較例に係る単離膵島のうち、判定ステップにおいて抽出された単離膵島の割合を示す第１の図である。また、図１２は、実施例および比較例に係る単離膵島のうち、判定ステップにおいて抽出された単離膵島の割合を示す第２の図である。図１１は、第１溶液中における単離膵島から取得された第１信号に基づく判定ステップにおいて抽出された単離膵島の割合を百分率で表現した抽出率として示している。より詳しくは、図１１は、本実施例および比較例において、第１溶液中で取得されたそれぞれの第１信号の中から、相関係数に基づく良否判定のステップ（Ｓ２０１）において独立な第１信号として抽出された単離膵島の、全ての単離膵島に対する割合を示している。また、図１１は、第１パワースペクトル密度におけるパワーのピーク値が閾値（第１閾値）よりも大きく、第１溶液中における活動周波数が特定された単離膵島の、全ての単離膵島に対する割合を示している。

【0149】

また、図１２は、第２溶液中における単離膵島から取得された第２信号に基づく判定ステップにおいて抽出された単離膵島の割合を百分率で表現した抽出率として示している。より詳しくは、図１２は、本実施例および比較例において、第２溶液中で取得されたそれぞれの第２信号の中から、相関係数に基づく良否判定のステップ（Ｓ２０２）において独立な第２信号として抽出された単離膵島の、全ての単離膵島に対する割合を示している。また、図１２は、第２パワースペクトル密度におけるパワーのピーク値が閾値（第１閾値）よりも大きく、第２溶液中における活動周波数が特定された単離膵島の、全ての単離膵島に対する割合を示している。

【0150】

図１１および図１２から明らかなように、本実施例では５０％以上の単離膵島において、取得された第１信号が、独立な第１信号として抽出された単離膵島であったのに対し、比較例では約１０％の単離膵島から取得された第１信号しか抽出されなかった。同様に、本実施例では約４０％の単離膵島においてパワースペクトル密度におけるパワーのピーク値が閾値（第１閾値）よりも大きく、第１溶液中または第２溶液中における活動周波数が特定されたのに対し、比較例では約１０％の単離膵島から取得された第１信号または第２信号しか第１溶液中または第２溶液中における活動周波数が特定されなかった。

【0151】

これより、本実施例および比較例で使用された２００±５０マイクロメートルの直径を有する単離膵島の良否の判定には、ウェルの貫通孔４３における下面側の開口は、直径１００マイクロメートルの円形の方が適していることが分かった。

【0152】

（変形例）
以下では、実施の形態の変形例として穴部のその他の形状について、図１３を用いて説明する。

【0153】

図１３は、変形例に係る穴部形状を説明する図である。

【0154】

図１３の（ａ）には、実施の形態における穴部４３ａを比較のために示している。図１３の（ｂ）は、変形例の第１例に係る穴部の形状を説明する図である。図１３の（ｂ）に示すように、図１３の（ａ）に対して、変形例の第１例における穴部４３ｂは、テーパ構造を有さない点で異なっている。したがって、保持層４１ｂは、実施の形態とは異なる形状の貫通孔を有する。より具体的には、貫通孔は、スフェロイド５０の直径よりも大きい内径を有する第１筒部と、スフェロイド５０の直径よりも小さい内径を有する第２筒部とを有する。第１筒部は、第２筒部よりも穴部４３ｂの開口部側に形成される。これによれば、穴部４３ｂに収容されるスフェロイド５０は、第２筒部に入り、かつ第２筒部と第１筒部とが形成する段差部によって穴部４３ａに接触することで測定用電極３０と接触しない状態で保持される。

【0155】

図１３の（ｃ）は、変形例の第２例に係る穴部の形状を説明する図である。図１３の（ｃ）に示すように、図１３の（ａ）に対して、変形例の第２例における穴部４３ｃは、穴部４３ｃのテーパ構造の形状が異なる。より詳しくは、変形例の第２例における穴部４３ｃは、穴部４３ｃを、深さ方向に沿って切断する断面視において開口部側に凸となる湾曲したテーパ構造を有する。また、当該テーパ構造は、スフェロイド５０が穴部４３ｃに収容された際にスフェロイド５０が開口部よりも外側に突出する構造である。したがって、保持層４１ｃは、実施の形態における保持層４１よりも比較的厚みが薄く、浅い穴部４３ｃを形成している。これによれば、穴部４３ｃに収容されたスフェロイド５０は、穴部４３ｃに対する出入りが容易となる。したがって、スフェロイド５０を播種する際に、スフェロイド５０が容易に穴部４３ｃに入る。また、穴部４３ｃは構造上１つのスフェロイド５０のみを配置できる。つまり、１つの穴部４３ｃには、２個以上のスフェロイドが収容されることはない。したがって、測定用電極３０において２個以上のスフェロイド５０から細胞外電位に関する信号が取得されることが抑制される。

【0156】

図１３の（ｄ）は、変形例の第３例に係る穴部の形状を説明する図である。図１３の（ｄ）に示すように、図１３の（ａ）に対して、変形例の第３例における穴部４３ｄは、穴部４３ｄのテーパ構造の形状が異なる。より詳しくは、変形例の第３例における穴部４３ｄは、穴部４３ｄを、深さ方向に沿って切断する断面視において底部側に凹となる湾曲したテーパ構造を有する。保持層４１ｄは、このような穴部を実現するための貫通孔を有する。これによれば、開口部の直径を広げることなく（つまり、テーパ構造の傾斜角を広げることなく）、収容されるスフェロイド５０をより測定用電極に接近させることができる。測定用電極３０においては、スフェロイド５０と測定用電極３０とがある程度接近している方が、より正確に細胞外電位に関する信号が取得できるため、本例における穴部４３ｄの形状は、より微弱な細胞外電位を発生するスフェロイド５０に適用する場合に有効である。

【0157】

図１３の（ｅ）は、変形例の第４例に係る穴部の形状を説明する図である。図１３の（ｅ）に示すように、図１３の（ａ）に対して、変形例の第４例における穴部４３ｅは、テーパ構造等の形状が同等である。一方で、配置される測定用電極３０ｅの個数が複数である点で実施の形態における測定用電極３０と異なっている。なお、保持層４１ｅは、穴部４３ｅの底部側において、複数の測定用電極３０ｅが配置されるための第２空間を有する貫通孔を形成してもよい。これによれば、複数の測定用電極のそれぞれにおいて、スフェロイド５０の細胞外電位に関する信号を取得することができる。例えば、スフェロイド５０の部位によって発生する細胞外電位に差がある場合等にそれぞれの部位における細胞外電位に関する信号を取得することができる。したがって、本例によれば、より多様な判定を実施することができる。

【0158】

図１３の（ｆ）は、変形例の第５例に係る穴部の形状を説明する図である。図１３の（ｆ）に示すように、図１３の（ａ）に対して、変形例の第５例における穴部４３ｆは、テーパ構造等の形状が異なる。より詳しくは、保持層４１ｆにおいて穴部４３ｆの内側面は、スフェロイド５０と接触する箇所よりも穴部４３ｆの開口部側において、穴部４３ｆの内側に向けて突出する返し構造４９を有する。これによれば、実施例において説明した培地の最にスフェロイド５０が穴部４３ｆから脱離することが抑制される。よって、選別装置を用いる操作がより簡易となる。

【0159】

（その他の実施の形態）
以上、実施の形態等について説明したが、本開示は、上記実施の形態等に限定されるものではない。

【0160】

また、上記実施の形態等において計数装置を構成する構成要素について例示したが、計数装置が備える構成要素の各機能は、計数装置を構成する複数の部分にどのように振り分けられてもよい。

【0161】

その他、実施の形態等に対して当業者が思いつく各種変形を施して得られる形態、または、本開示の趣旨を逸脱しない範囲で実施の形態等における構成要素および機能を任意に組み合わせることで実現される形態も本開示に含まれる。

【0162】

例えば、フーリエ変換により算出されたパワースペクトル密度において、ピーク周波数を有する場合、当該スフェロイドを構成する細胞には周期的な活動があると考えられる。したがって、判定ステップでは、ピーク周波数の有無によりスフェロイドの良否を判定してもよい。

【0163】

また、例えば、実施例において単離膵島を用いて説明した膵島スフェロイドのように、スフェロイドは、α細胞およびβ細胞等の複数種類の細胞から構成される場合がある。このとき、スフェロイドに求める機能が複数種類のうちいずれかの細胞の機能である場合に、判定部は、当該機能を発現する細胞の活動に由来するパワースペクトル密度上の特徴を判別してスフェロイドの良否を判定してもよい。

【0164】

また、例えば、上記実施の形態等において説明したスフェロイドは、より高次な細胞塊であるオルガノイドであってもよい。

【0165】

また、上記実施例において選別装置を用いた膵島スフェロイド（実施例中では単離膵島として説明した）を用いる例を説明した。膵島を構成する細胞はグルコース応答性を有するため、溶液中のグルコース濃度に着目したが、例えば、その他のスフェロイドについて選別装置を用いる場合には、他の代謝産物に着目し、溶液または培地を調製してもよい。

【0166】

また、例えば、実施の形態の選別装置において、別体であるとして説明した各部材は、一体的に形成されてもよい。

【産業上の利用可能性】

【0167】

本開示は、スフェロイドの良否を判定する装置等に応用可能である。

【0168】

上記の開示内容から導出される発明には、下記の発明も含まれる。

【0169】

（項目１）
グルコースを第１濃度で含む第１溶液中で膵島スフェロイドの細胞外電位に関する第１信号を取得する第１取得ステップと、
グルコースを前記第１濃度よりも高い第２濃度で含む第２溶液中で前記膵島スフェロイドの細胞外電位に関する第２信号を取得する第２取得ステップと、
前記第１信号および前記第２信号をフーリエ変換して第１パワースペクトル密度および第２パワースペクトル密度を算出する算出ステップと、
算出された前記第１パワースペクトル密度および前記第２パワースペクトル密度に基づいて、前記膵島スフェロイドの良否を判定する判定ステップと、を含む、
膵島スフェロイドの評価方法。

【0170】

（項目２）
前記判定ステップでは、算出された前記第１パワースペクトル密度および前記第２パワースペクトル密度の少なくとも一方におけるパワーのピーク値が第１閾値以下の場合に、前記膵島スフェロイドを不良と判定する、
項目１に記載の膵島スフェロイドの評価方法。

【0171】

（項目３）
さらに、算出された前記第１パワースペクトル密度におけるピーク周波数である第１周波数を特定する第１特定ステップと、
算出された前記第２パワースペクトル密度におけるピーク周波数である第２周波数を特定する第２特定ステップと、を含み、
前記第１周波数よりも前記第２周波数の方が大きい場合に、前記膵島スフェロイドを良と判定する、
項目１または２に記載の膵島スフェロイドの評価方法。

【0172】

（項目４）
前記第１周波数は、０．０２ヘルツ以上かつ０．０６ヘルツ以下である、
項目３に記載の膵島スフェロイドの評価方法。

【0173】

（項目５）
前記第２周波数は、０．０４ヘルツ以上かつ０．１４ヘルツ以下である、
項目３または４に記載の膵島スフェロイドの評価方法。

【0174】

（項目６）
前記第１取得ステップでは、複数の前記膵島スフェロイドのそれぞれから複数の前記第１信号を取得し、
前記判定ステップでは、さらに、複数の前記膵島スフェロイドのうち２つの前記膵島スフェロイドからなるペアの各々について、第１信号の相関係数を算出し、当該相関係数が第２閾値よりも大きい場合に、前記ペアをなす２つの膵島スフェロイドを不良と判定する、
項目１～５のいずれか一項に記載の膵島スフェロイドの評価方法。

【0175】

（項目７）
前記第２取得ステップでは、複数の前記膵島スフェロイドのそれぞれから複数の前記第２信号を取得し、
前記判定ステップでは、さらに、複数の前記膵島スフェロイドのうち２つの前記膵島スフェロイドからなるペアの各々について、第２信号の相関係数を算出し、当該相関係数が第３閾値よりも大きい場合に前記ペアを成す２つの膵島スフェロイドを不良と判定する、
項目１～６のいずれか一項に記載の膵島スフェロイドの評価方法。

【符号の説明】

【0176】

１１ 基板
１３ 絶縁膜
１５ 囲い部材
２０ 基準用電極
２１ 基準用接点
２３ 基準用配線
２５ 基準電極端
２７ 基準電極メッキ
３０ 基準用電極
３０、３０ｅ 測定用電極
３１ 測定用接点
３３ 測定用配線
３５ 測定電極端
３７ 測定電極メッキ
４１、４１ｂ、４１ｃ、４１ｄ、４１ｅ、４１ｆ 保持層
４３ 貫通孔
４３ａ、４３ｂ、４３ｃ、４３ｄ、４３ｅ、４３ｆ 穴部
４５ 開口部
４７ 底部
４９ 返し構造
５０ スフェロイド
６１ 培地
６３ 電圧計
１００ 選別装置
２００ 評価装置

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】