特許 7570087 病的バリアントを利用した前立腺がんの検査方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-10-10

(45)【発行日】2024-10-21

(54)【発明の名称】病的バリアントを利用した前立腺がんの検査方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6869 20180101AFI20241011BHJP

   C12Q 1/6886 20180101ALI20241011BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20241011BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6869 Z

C12Q1/6886 Z

C12N15/12 ZNA

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2020092629

(22)【出願日】2020-05-27

(65)【公開番号】P2021185787

(43)【公開日】2021-12-13

【審査請求日】2023-03-10

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 第２５回日本家族性腫瘍学会学術集会 開催日 令和１年６月１４日～１５日 第７８回日本癌学会学術総会 令和１年９月２６日～２８日 ＪＮＣＩ Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ（２０２０）１１２（４）：ｄｊｚ１２４ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ７１５６９２８／ 令和１年６月１９日

(73)【特許権者】

【識別番号】503359821

【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所

(74)【代理人】

【識別番号】110002860

【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】桃沢 幸秀

(72)【発明者】

【氏名】岩▲崎▼ 雄介

【審査官】田中 晴絵

(56)【参考文献】

【文献】Lancet，2016年，387，70-82

【文献】JCO Precision Oncology，2020年03月04日，4，139-151

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／６８－ １／６８９７

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

前立腺がんの可能性および／または発症リスクの検査方法であって、対象由来の試料を用い、表１に記載の１３６種類の病的バリアントのうち、BRCA2、HOXB13、ATM遺伝子上の病的バリアントであるＮｏ.8～43、45～74、77～90、および111～115から選択される１つ以上の存在について解析することを特徴とする、方法であって、
前記病的バリアントを含む塩基配列の表１記載の塩基（Ref）に相当する塩基における
多型を分析し、該分析結果に基づいて、
病的バリアントを含む塩基配列の表１記載の塩基（Ref）に相当する塩基が、表１記載
の塩基（Alt）である場合、
前立腺がんの可能性および／または発症リスクが高いと判定される、方法。

【表1-1】

【表1-2】

【請求項2】

前記表１の１３６種類の病的バリアントのうち、Ｎｏ. 8、10、11、13、15、17、18、22～27、29、30、32、34、36、39～41、45～56、59、61、62、64～74、77～86、88～90、111、および113～115から選択される１つ以上の病的バリアントの存在を解析することを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

少なくとも、下記Ｎｏ. 24、61、および114から選択される１つ以上の病的バリアント
の存在について解析する、請求項２に記載の方法。

【表2】

【請求項4】

表１に記載の病的バリアントのうち、少なくとも１０種類以上の病的バリアントについて解析する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前立腺がんが若年性の前立腺がんである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

表１に記載の１３６種類の病的バリアントのうちのBRCA2、HOXB13、ATM遺伝子上の病的
バリアントであるＮｏ.8～43、45～74、77～90、および111～115から選択される１つ以上の病的バリアントの存在を解析するためのプローブを含む、前立腺がんの発症リスクの検査用試薬であって、
前記プローブは、前記病的バリアントを含む塩基配列において、表１記載の塩基（Alt
）の塩基を含む１５塩基以上の配列の相補配列を有するプローブである、検査用試薬。

【表3-1】

【表3-2】

【請求項7】

表１に記載の１３６種類の病的バリアントのうちのBRCA2、HOXB13、ATM遺伝子上の病的バリアントであるＮｏ.8～43、45～74、77～90、および111～115から選択される１つ以上の病的バリアントの存在を解析するためのプライマーを含む、前立腺がんの発症リスクの検査用試薬であって、
前記プライマーは、前記病的バリアントを含む塩基配列において、表１記載の塩基（Alt）に相当する塩基を含む領域を増幅することのできるプライマーである、検査用試薬。

【表4-1】

【表4-2】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は遺伝子配列解析に基づく前立腺がんの検査方法に関する。より詳細には病的バリアントの遺伝子検査を利用した前立腺がんの検査方法に関する。

【背景技術】

【0002】

前立腺がんは、世界で2番目に、日本人男性では4番目に患者数の多いがんであり、患者数が急激に増加している。前立腺がんは遺伝性が強いがんとして知られているが、その原因として、（１）これまでゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）により明らかにされてきた、疾患発症に及ぼす影響は小さいものの頻度が高い「一塩基多型（ＳＮＰ）」および（２）頻度は非常に低いものの疾患発症リスクを大きく上げる「病的バリアント」の寄与が挙げられる。前者としては、第５染色体短腕１５領域またはＩＲＸ４遺伝子のＳＮＰ、ＧＰＲＣ６Ａ／ＲＦＸ６遺伝子のＳＮＰ、第１３染色体長腕２２領域のＳＮＰ、Ｃ２ｏｒｆ４３遺伝子のＳＮＰ、ＦＯＸＰ４遺伝子のＳＮＰが報告されている（特許文献１）。後者に関しては、前立腺がんの原因遺伝子としては、乳がんの原因遺伝子としても知られるＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２を含め、８種類が報告されている（非特許文献１）。

【0003】

前立腺患者がＢＲＣＡ１やＢＲＣＡ２に病的バリアントを持つ場合には、乳がんの場合と同様、ＰＡＲＰ阻害剤などの薬が効果的であることが知られている。そのため、ある前立腺がん患者がこれらの病的バリアントを持つことが遺伝子検査によって明らかになれば、乳がんと同じようにＰＡＲＰ阻害剤による治療効果が期待される。さらに、同じ遺伝子が寄与する他のがんの早期発見、近親者に対する遺伝子検査も利用した発症予防が期待される。

【0004】

このような「ゲノム医療」を行うには、遺伝子検査結果の解釈、病的バリアント保有者の発症リスク、臨床的特徴についての大規模なデータが不可欠である。発明者のグループは2018年に、日本人の遺伝性乳がんの病的バリアントデータベースを構築した。しかし、前立腺がんは乳がんと異なり、このようなデータが世界的に不足しており、ゲノム情報を用いた診療のガイドラインもないのが現状である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】特開2012-157283

【非特許文献】

【0006】

【文献】Lancet. 2016 Jan 2;387(10013):70-82.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、前立腺がんについて、原因遺伝子・疾患発症リスク・臨床情報の関係を大規模なサンプルで明らかにすること、それにより、前立腺がんのリスクを効率よく予測してゲノム医療を可能とすることを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者は上記課題を解決すべく、バイオバンク・ジャパンによって収集された前立腺がん患者（疾患群）7,636人および対照群12,366人のDNAを、独自に開発したゲノム解析手法（Hum Mol Genet. 2016;25(22):5027-5034.）を用いて、前立腺がんの原因として知られる8遺伝子について解析し、1,456個の遺伝子バリアントを同定した。そして、同定された
遺伝子バリアントを国際的データベースClinVar（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）で確認するとともに、米国臨床遺伝・ゲノム学会（ACMG）が作成したガイドラインを使用して、1,456個の遺伝子バリアントについて、一つ一つ病的バリアントか否かを調べた結果、最終的にClinVarの結果と合わせて、同定した遺伝子バリアント1,456個中136個（9.3％）が病的バリアントであると判定した。そして、これらの病的バリアントを有する頻度が健常人と比較して前立腺がん患者、特に５９歳以下の前立腺がん患者で有意に多いことを見出し、同定した病的バリアントの保有の有無により、前立腺がんリスクの検査を効率よく行うことができることを見出し、本発明を完成させた。

【0009】

本発明の要旨は以下の通りである。
［１］前立腺がんの検査方法であって、対象由来の試料を用い、表１に記載の１３６種類の病的バリアントのうち、１つ以上の存在について解析することを特徴とする、方法。
［２］前記表１の１３６種類の病的バリアントのうち、Ｎｏ.3、5、7、8、10、11、13、15、17、18、22～27、29、30、32、34、36、39～41、44～56、59、61、62、64～75、77～86、88～93、95、101～111、113～116、118、122～124、126、128、129、および131～136から選択される１つ以上の病的バリアントの存在を解析することを特徴とする、［１］に記載の方法。
［３］前記病的バリアントのうち、BRCA2、HOXB13またはATM遺伝子上の病的バリアントの存在を解析する、［１］または［２］に記載の方法。
［４］少なくとも、表２に記載された、No. 24、No. 61、No. 75およびNo. 114のうちの、１つ以上の病的バリアントの存在について解析する、［３］に記載の方法。
［５］表１に記載の病的バリアントのうち、少なくとも１０種類以上の病的バリアントについて解析する、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前立腺がんが若年性の前立腺がんである、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記表１に記載の１３６種類の病的バリアントのうちの１つ以上の病的バリアントの存在を解析するための試薬を含む、前立腺がんの検査用試薬。

【発明の効果】

【0010】

本発明によれば、病的バリアントの解析に基づき、前立腺がんの発症リスクを効率よく予測することができる。これにより、バリアントの種類に応じたゲノム医療を実現することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】各遺伝子について病的バリアントの位置と保有人数を示した、ロリプロット図。横軸がアミノ酸の位置、縦軸がその病的バリアントを保有する人数を示す。10人以上が共有していた４つの病的バリアントを図中に示した。例えば「p.Arg 2318*」はBRCA2遺伝子の2318番目のArg（アルギニン）が終止コドンに変わるという意味である。下線が引かれた病的バリアント（p.Asp1540Aspとp.Gly132Glu）は、本発明の研究で初めて明らかになったものを示す。なお、機能欠失はアミノ酸の翻訳が止まったり、フレームシフト（fs:塩基の欠失や挿入によってコドンの読み枠がずれる）を起こしたりすることでアミノ酸の機能がなくなるバリアント、非同義置換はアミノ酸配列が変わるバリアント、同義置換はアミノ酸配列が変わらないバリアントを指す。

【図2】前立腺がん診断年齢ごとの病的バリアント保有者の割合を示したグラフ。Ａ）病的バリアントを有する患者の比率を示す。両側コクラン・アーミテージ検定を使用した（Ｐ＜０．００１）。Ｂ）病的バリアントを含む遺伝子の比率を示す。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明の前立腺がん検査方法は、対象由来の試料を用い、表１に記載の１３６種類の病的バリアントのうち、１つ以上の存在について解析することを特徴とする。表１に記載され
た病的バリアントのうち、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、10個以上、20個以上、30個以上、40個以上、または50個以上について解析することが好ましい。
なお、「病的バリアントの存在について解析する」とは、病的バリアントを含む領域の塩基配列を解析し、該当配列が病的バリアントを含むか否かを解析することをいう。

【0013】

【表1-1】

【表1-2】

【0014】

前立腺がんは前立腺に発生する悪性腫瘍であれば特に制限されないが、５９歳以下の対象者に発生する若年性前立腺がんであってもよい。

【0015】

病的バリアントとは、遺伝子配列における置換、欠失、挿入、転位などの変異のうち、疾患発症の原因となる変異をいう。

【0016】

表１のNo.1～No.7はNBN遺伝子上に存在する病的バリアントである。
NBN遺伝子は、DNA二本鎖切断修復機構やDNA損傷チェックポイント機構に関わるタンパク質をコードする遺伝子であり、前立腺がんとの関連性が知られている（非特許文献１）。例えば、No.5の病的バリアントはGenome Research Consortium human genome build 37/UCSC human genome 19（GRCh37/Hg19）に登録されている第8染色体のゲノム配列の90992961番目の塩基におけるC/A多型であり、この塩基が変異型（Alt）のAである場合に病的バリアントを保有しているということができる。

【0017】

表１のNo.8～No.38はATM遺伝子上に存在する病的バリアントである。
ATM遺伝子は細胞周期チェックポイントキナーゼであり、がん抑制タンパクp53やBRCA1などの制御に関わるタンパク質をコードする遺伝子であり、前立腺がんとの関連性が知られている（非特許文献１）。例えば、No.1の病的バリアントはGRCh37/Hg19に登録されている第11染色体のゲノム配列の108098418番目の塩基におけるC/T多型であり、この塩基が変異型（Alt）のTである場合に病的バリアントを保有しているということができる。

【0018】

表１のNo.39～No.90はBRCA2遺伝子上に存在する病的バリアントである。
BRCA2（breast cancer susceptibility gene II）遺伝子はがん抑制遺伝子として知られている遺伝子であり、乳がんの原因遺伝子であるが、前立腺がんとの関連性も知られている（非特許文献１）。例えば、No.39の病的バリアントはGRCh37/Hg19に登録されている第13染色体のゲノム配列の32893464番目の塩基におけるT/C多型であり、この塩基が変異型（Alt）のCである場合に病的バリアントを保有しているということができる。

【0019】

表１のNo.91～No.96はPALB2遺伝子上に存在する病的バリアントである。
PALB2遺伝子はBRCA2タンパクと結合し、核内の安定した局在や集積に関わるタンパク質をコードする遺伝子であり、前立腺がんとの関連性が知られている（非特許文献１）。例えば、No.91の病的バリアントはGRCh37/Hg19に登録されている第16染色体のゲノム配列の23634387番目の塩基におけるT/A多型であり、この塩基が変異型（Alt）のAである場合に病的バリアントを保有しているということができる。

【0020】

表１のNo.97～No.110はBRCA1遺伝子上に存在する病的バリアントである。
BRCA1（breast cancer susceptibility gene I）遺伝子はがん抑制遺伝子として知られている遺伝子であり、乳がんの原因遺伝子であるが、前立腺がんとの関連性も知られている（非特許文献１）。例えば、No.101の病的バリアントはGRCh37/Hg19に登録されている第17染色体のゲノム配列の41226411番目の塩基におけるG/A多型であり、この塩基が変異型（Alt）のAである場合に病的バリアントを保有しているということができる。

【0021】

表１のNo.111～No.115はHOXB13遺伝子上に存在する病的バリアントである。
HOXB13遺伝子は転写因子の一つであり、胚発生に重要なタンパク質をコードする遺伝子であり、前立腺がんとの関連性が知られている（非特許文献１）。例えば、No.111の病的バリアントはGRCh37/Hg19に登録されている第17染色体のゲノム配列の46804205番目の塩基におけるG/A一塩基多型変異であり、この塩基が変異型（Alt）のAである場合に病的バリアントを保有しているということができる。

【0022】

表１のNo.116～No.127はBRIP1遺伝子上に存在する病的バリアントである。
BRIP1遺伝子はBRCA1タンパクと複合体を形成し、DNA二本鎖切断修復機構を有するタンパク質をコードする遺伝子であり、前立腺がんとの関連性が知られている（非特許文献１）。例えば、No.116の病的バリアントはGRCh37/Hg19に登録されている第16染色体のゲノム配列の59760814番目の塩基の次の位置におけるTの挿入変異であり、この塩基が変異型（Alt）のTの挿入である場合に病的バリアントを保有しているということができる。

【0023】

表１のNo.128～No.136はCHEK2遺伝子上に存在する病的バリアントである。
CHEK2遺伝子は細胞周期チェックポイント制御およびがん抑制の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であり、前立腺がんとの関連性が知られている（非特許文献１）。例えば、No.128の病的バリアントはGRCh37/Hg19に登録されている第22染色体のゲノム配列の29083910番目の塩基におけるGの欠失変異であり、この塩基が変異型（Alt）の欠失型である場合に病的バリアントを保有しているということができる。

【0024】

これらの中では、表１のＮｏ.3、5、7、8、10、11、13、15、17、18、22～27、29、30、32、34、36、39～41、44～56、59、61、62、64～75、77～86、88～93、95、101～111、113～116、118、122～124、126、128、129、および131～136のうちの１以上の病的バリアントについて解析することが好ましい。
なお、表１のうち、上記以外のバリアントは今回の解析では健常人で高い割合で検出されたものの、解析の母集団を増やすことで、前立腺がん患者での割合が多い結果になると考えられるので、上記以外の病的バリアントについてもその存在によって前立腺がんリスクを解析可能である。

【0025】

上記８遺伝子の中では、BRCA2、HOXB13、ATM遺伝子の一以上の遺伝子における病的バリアントを解析することが好ましい。

【0026】

特に、今回の解析において、前立腺がん患者において高頻度で見いだされた以下の４つの病的バリアントの１つ以上、２つ以上、３つ以上、または４つ全てについて解析することが好ましい。

【0027】

【表2】

【0028】

バリアントNo. 24は第11染色体のATM遺伝子上に位置する一塩基多型変異であり、GenBank
Accession No. NC_000011.10の108,164,048番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）／チミン（Ｔ）の一塩基多型変異を意味し、この塩基がTである場合が病的バリアントであり、前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。また、対立遺伝子を考慮して解析した場合は、TT＞CT＞CCの順で前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がTである被験者には、前立腺がんの予防または治療を行うことが考えられる。

【0029】

バリアントNo. 24について、変異を含む領域の塩基配列を、配列番号１（野生型: Ref.）、配列番号２（変異型: Alt.）に示した。
Ref. TTTTAAATTATATTTAGGTATTGGACTTGTTGAAATACTTAGTGATAGATA（配列番号１）
Alt. TTTTAAATTATATTTAGGTATTGGATTTGTTGAAATACTTAGTGATAGATA（配列番号２）

【0030】

バリアントNo. 61（rs80359520）は第13染色体のBRCA2遺伝子上に位置する欠失変異であり、GenBank Accession No. NC_000013.10の32914068_32914071番目の塩基（AATT）が欠失する変異（del）を意味し、この塩基が欠失した場合が病的バリアントであり、前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。また、対立遺伝子を考慮して解析した場合は、（del/del）＞（AATT/del）＞（AATT/AATT）の順で前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がdelである被験者には、前立腺がんの予防または治療を行うことが考えられる。

【0031】

rs80359520について、変異を含む領域の塩基配列を、配列番号３（野生型: Ref.）、配列番号４（変異型: Alt.）に示した。
Ref. AAATCGTTTGTGTTTCACATGAAACAATTAAAAAAGTGAAAGACATATTTACAG（配列番号３）
Alt. AAATCGTTTGTGTTTCACATGAAAC AAAAAAGTGAAAGACATATTTACAG（配列番号４）

【0032】

バリアントNo. 75（rs80358920）は第13染色体のBRCA2遺伝子上に位置する一塩基多型変異であり、GenBank Accession No. NC_000013.10の32,920,978番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）／チミン（Ｔ）の一塩基多型変異を意味し、この塩基がTである場合が病的バリアントであり、前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。また、対立遺伝子を考慮して解析した場合は、TT＞TC＞CCの順で前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がTである被験者には、前立腺がんの予防または治療を行うことが考えられる。

【0033】

rs80358920について、変異を含む領域の塩基配列を、配列番号５（野生型: Ref.）、配列
番号６（変異型: Alt.）に示した。
Ref. TTGTTTCCTAGGCACAATAAAAGATCGAAGATTGTTTATGCATCATGTTTC（配列番号５）
Alt. TTGTTTCCTAGGCACAATAAAAGATTGAAGATTGTTTATGCATCATGTTTC（配列番号６）

【0034】

バリアントNo. 114は第17染色体のHOXB13遺伝子上に位置するSNPであり、GenBank Accession No. NC_000017.10の46,805,561番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）／チミン（Ｔ）の一塩基多型変異を意味し、この塩基がTである場合が病的バリアントであり、前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。また、対立遺伝子を考慮して解析した場合は、TT＞CT＞CCの順で前立腺がんの可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がTである被験者には、前立腺がんの予防または治療を行うことが考えられる。

【0035】

バリアントNo. 114について、変異を含む領域の塩基配列を、配列番号７（野生型: Ref.）、配列番号８（変異型: Alt.）に示した。
Ref. CATAGGCTGGTAGGTTCCCGGATATCCCGGATAGAAGGCAAACTCAGTGGG（配列番号７）
Alt. CATAGGCTGGTAGGTTCCCGGATATTCCGGATAGAAGGCAAACTCAGTGGG（配列番号８）

【0036】

なお、表１における病的バリアントの位置の特定は、データベースに登録されているヒトゲノム配列におけるものであり、人種の違いなどによって上記配列が病的バリアント以外の位置で若干変化することがあるので、そのような場合には、表１における病的バリアントの位置と比較し、それに相当する位置において該当塩基を解析すればよい。

【0037】

また、本発明において解析するバリアントは上記のものに限定されず、上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基の変異を分析してもよい。ここで「上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基」とは、上記の塩基と好ましくはｒ²＞０．８、さらに好ましくはｒ²＞０．９の関係を満たす塩基をいう。ｒ²は連鎖不平衡係数である。連鎖不平衡にある塩基は、例えば、HapMapデータベース(http://www.hapmap.org/index.html.ja)等を用いて同定することができる。

【0038】

上記のように、病的バリアントの存在に基づいて、前立腺がんの検査を行うことができる。例えば、表１の病的バリアント、好ましくはBRCA2、HOXB13およびATM遺伝子から選択される１以上の遺伝子における病的バリアントについてその存在を解析し、対象が病的バリアントを１以上、２以上、３以上、４以上、または５以上有する場合に、前立腺がんの発症リスクや進行リスクが高いと判定することができる。すなわち、本発明は、前立腺がんの診断のためのデータを提供することができる。

【0039】

表１の病的バリアントは組み合わせて解析することが好ましい。
この場合、各バリアントの対立遺伝子の数とオッズ比を考慮してリスクスコアを算出し、得られたリスクスコアに基づき、前立腺がんのリスクを判定することもできる。
なお、表１に記載の病的バリアントと、それ以外のSNPなどのバリアントと組み合わせて解析してもよい。

【0040】

上記バリアントにおける塩基の種類を調べ、１つまたはそれ以上の病的バリアントの存在もしくは病的バリアントの存在に基づくリスクスコアを前立腺がんと関連付けることにより、前立腺がんを検査することができる。
なお、いずれのバリアントも、二本鎖DNAのどちらの鎖を解析してもよい。例えば、各配列はセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス鎖を解析してもよい。

【0041】

本発明において、解析の対象はヒトであり、例えば、前立腺がんのリスクが疑われるヒトである。人種は特に制限されないが、例えば、日本人を含むアジア人である。
病的バリアントの存在の解析（以下、単に、バリアント解析とよぶ）に用いる試料は、対
象由来の、染色体DNAを含む試料であれば特に制限されない。バリアントの解析に用いる試料としては、例えば、血液、尿、髄液等の体液、子宮頸部や口腔粘膜などの細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。バリアントの解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体DNAを常法により単離し、これを用いて解析することが好ましい。

【0042】

バリアントの解析は、通常の遺伝子配列解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、PCR、ハイブリダイゼーション、インベーダー法などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0043】

シークエンス解析は通常の方法により行うことができる。具体的には、病的バリアントが存在する部位（以下、単に、バリアント部位とよぶ）の塩基の５’側 数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンス反応の前に、あらかじめバリアント部位を含む断片をPCRなどによって増幅しておくことが好ましい。

【0044】

また、バリアントの解析は、PCRによる増幅の有無を調べることによって行うことができる。例えば、バリアント部位の塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、３’末端が各塩基に対応するプライマーをそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してPCRを行い、増幅産物の有無によってどのタイプの塩基であるかを決定することができる。また、LAMP法（特許第3313358号明細書）、NASBA法（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許2843586号明細書）、ICAN法（特開2002-233379号公報）、SmartAmp法（特許第3897805号明細書）などによって増幅の有無を調べることもできる。その他、単鎖増幅法を用いてもよい。

【0045】

また、バリアント部位を含むDNA断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによってどのタイプの塩基であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、PCR-SSCP（single-strand conformation polymorphism）法（Genomics. 1992 Jan 1;12(1): 139-146.）が挙げられる。具体的には、まず、目的のバリアントを含むDNAを増幅し、増幅したDNAを一本鎖DNAに解離させる。次いで、解離させた一本鎖DNAを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの塩基であるかを決定することができる。

【0046】

さらに、バリアント部位の塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（RFLP法）。この場合、まず、DNA試料を制限酵素により切断する。次いで、DNA断片を分離し、検出されたDNA断片の大きさによってどのタイプの塩基であるかを決定することができる。

【0047】

また、ハイブリダイゼーションの有無を調べることによって塩基の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによってバリアントがいずれの塩基であるか、すなわち、病的バリアントであるか否か、を調べることもできる。

【0048】

このようにしてバリアントがいずれの塩基であるかを解析することで、病的バリアントの存在を決定することができ、それにより、前立腺がんを検査するためのデータを得ることができる。
本発明の方法により判定された結果は、必要に応じて医師等に提供される。結果を提供された医師等は、血液検査、X線検査、CT検査等の必要な検査を行った上で、発症リスクや進行リスクを診断することができる。医師等が前立腺がんの発症リスクや進行リスクが高いと診断した場合には、手術、抗がん剤治療等の治療を施すことができる。また、リスク
が低いと診断した場合には、患者に取って負担が大きいこれらの治療を回避することができる。

【0049】

＜２＞本発明の前立腺がん検査用試薬
本発明はまた、前立腺がんを検査するためのプライマーやプローブなどの検査試薬を提供する。このようなプローブとしては、上記バリアント部位をカバーする塩基配列を含み、ハイブリダイズの有無によってバリアント部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号１～８（病的バリアントの配列は配列番号２、４、６、８）のいずれかに示す塩基配列のバリアント部位の塩基を含む配列、またはその相補配列を有する１５塩基以上の長さのプローブが挙げられる。プローブの長さは好ましくは、１５～３５塩基であり、より好ましくは２０～３５塩基である。

【0050】

また、プライマーとしては、上記バリアント部位を増幅するためのPCRに用いることのできるプライマー、または上記バリアント部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号１～８（病的バリアントの配列は配列番号２、４、６、８）のいずれかに示す塩基配列のバリアント部位を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは１５～５０塩基が好ましく、１５～３５塩基がより好ましく、２０～３５塩基がさらに好ましい。

【0051】

上記バリアント部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、バリアント部位の塩基の５’側領域、好ましくは３０～１００塩基上流の配列を有するプライマーや、バリアント部位の塩基の３’側領域、好ましくは３０～１００塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。ＰＣＲによる増幅の有無でバリアントの種類を判定するために用いるプライマーとしては、バリアント部位を含む塩基配列を有し、バリアント塩基を３’末端に含むプライマーや、バリアント部位を含む塩基配列の相補配列を有し、バリアント塩基の相補塩基を３’末端に含むプライマーなどが例示される。

【0052】

なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、PCR用のポリメラーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬などを含むものであってもよい。

【実施例】

【0053】

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の態様には限定されない。

【0054】

＜方法＞
研究サンプル
２００３年～２０１８年に、日本全国から、前立腺がんを含む様々な病気の患者からＤＮＡおよび臨床情報を集めるバイオバンク・ジャパンのデータベースから全研究サンプルを得た。本研究では、前立腺がん患者７，７４４名および男性対照１２，５２０名において病院登録研究を行った。全参加者は、インフォームドコンセントの同意書を提出した。本研究は、東京大学医科学研究所倫理委員会および理化学研究所生命医科学研究センターにより承認された。

【0055】

配列およびバイオインフォマティクス解析
非特許文献１において前立腺がんに関係する報告された８つの遺伝子（ＡＴＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＣＡ１相互作用タンパク質Ｃ末端ヘリカーゼ１［ＢＲＩＰ１］、ＣＨＥＫ２、ＨＯＸＢ１３、ＮＢＮ、およびＰＡＬＢ２）を選択した。
マルチＰＣＲベースの標的配列法（Hum Mol Genet. 2016;25(22):5027-5034.）によって全８遺伝子（３７，９８２ｂｐ）の完全コード領域および２ｂｐフランキングイントロン
配列を解析した。その結果、最終的に、患者７，６３６名の患者および対照個体１２，３６６名において１４５６遺伝子バリアントを同定し、標的領域の９９．９８％を少なくとも２０シーケンスリードによりカバーした。

【0056】

バリアントのアノテーション
米国遺伝医学とゲノム会議および分子病理学協会（ＡＣＭＧ／ＡＭＰ）ガイドライン（Genet Med. 2015;17(5):405-424, Nat Rev Genet. 2017;18(10):599-612.）、ならびにＣｌｉｎＶａｒに登録された疾患関連性に関する基準（Nucleic Acids Res. 2016;44(D1):D862-D868.）を使用して臨床的有意性を決定した。そして、ＡＣＭＧ／ＡＭＰガイドラインによる疾患関連性分類および／またはＣｌｉｎＶａｒにおける疾患関連性の分類に基づいて病的バリアントを決定とした。

【0057】

統計解析
症例－対照関連分析を、支配的モデル下、フィッシャーの直接確率検定を使用して行った。病的バリアントと個体群統計的および臨床特徴との関連を調査するため、連続変数に対するｔ検定および離散変数に対するフィッシャーの直接確率検定またはコクラン・アーミテージ検定を使用した。全統計検定は両側であり、０．０５未満のＰはボンフェローニ補正を８遺伝子およびＰＣａの各々の間の関連分析に適用する場合を除いて、統計的に有意とした（Ｐ＜０．００６＝０．０５／８）。Ｒ統計パッケージ（バージョン３．１．３）を使用して全解析を行った。

【0058】

＜結果＞
バイオバンク・ジャパンによって収集された前立腺がん患者（疾患群）7,636人および対照群12,366人のDNAを、前立腺がんの原因として知られる8遺伝子について解析した結果、1,456個の遺伝子バリアントを同定した。同定された遺伝子バリアントを国際的データベースClinVar（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）で確認したところ、登録されていたのは670個（46.0％）だけであった。また、そのうち58個は病的バリアント、216個は病的バリアントではない遺伝子バリアント、残りの396個は判定不能であった。そこで、米国臨床遺伝・ゲノム学会（ACMG）が作成したガイドラインを使用して、1,456個の遺伝子バリアントについて、一つ一つ病的バリアントか否かを調べたところ、最終的にClinVarの結果と合わせて、今回同定した遺伝子バリアント1,456個中136個（9.3％）が病的バリアントであると判定された（表１）。

【0059】

次に、遺伝子ごとに病的バリアントのアミノ酸の位置とその頻度を確認するために、ロリプロットを作成した。その結果、多く（78.8％）の病的バリアントは7,636人の患者群の中で1人しか持っておらず、極めて頻度が低いことが分った。
一方、10人以上で共有する頻度が高い病的バリアントが、ATM遺伝子では1個、BRCA2遺伝子では2個、HOXB13遺伝子では1個見つかった（図１）。このうち、ATMとHOXB13で見つかった2個のバリアントは、これまでClinVarに登録のない新しい病的バリアントであった。

【0060】

また、これら136個の病的バリアントを、疾患群・対照群それぞれがどのくらいの割合で持っているかを調べた。その結果、8遺伝子全体では、疾患群の2.9％、対照群の0.8％が病的バリアントを持っており、病的バリアントを持つことで前立腺がんへのなりやすさが約3.7倍高まることが明らかになった（表３）。また遺伝子ごとでは、BRCA2、HOXB13、ATMの3遺伝子が前立腺がん発症に寄与していることが分かった（表３）。

【0061】

【表3】

【0062】

次に、病的バリアント保有者がどのような臨床的特徴を持っているかを調べたところ、病的バリアント保有者は非保有者よりも前立腺がんと診断される年齢が2歳若いこと、喫煙歴や飲酒歴がある人が多いこと、また家族に乳がん、膵がん、肺がん、肝がん患者がいる割合が大きいこと、臨床症状もTNM分類、グリソンスコア、PSA（前立腺特異抗原）などの項目が悪いことが明らかになった（表４）。

【0063】

【表4】

【0064】

前立腺がん診断年齢ごとに遺伝子バリアント保有者の割合を調べたところ、60歳未満では7.9％と高い割合で見つかり、年齢が上がるごとにその割合は少なくなったが、65歳以上では2-3％程度でほぼ変わらないことが分かった（図2）。一つの病的バリアントにより発症する遺伝性疾患は、通常は早期に発症すると考えられているが、乳がんの場合と同様に、高齢であっても一定の寄与があり、遺伝子検査をする意義があることが分かった。

【図1】

【図2】

【配列表】

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