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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-10
(45)【発行日】2024-10-21
(54)【発明の名称】クロマトグラフィーを含まない抗体精製方法
(51)【国際特許分類】
C07K 1/34 20060101AFI20241011BHJP
C07K 1/30 20060101ALI20241011BHJP
C07K 1/36 20060101ALI20241011BHJP
【ＦＩ】
C07K1/34
C07K1/30
C07K1/36
【請求項の数】
30
(21)【出願番号】P 2021543578
(86)(22)【出願日】2019-10-08
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-19
(86)【国際出願番号】 EP2019077172
(87)【国際公開番号】W WO2020074483
(87)【国際公開日】2020-04-16
【審査請求日】2022-08-08
(31)【優先権主張番号】18199137.3
(32)【優先日】2018-10-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】505166225
【氏名又は名称】アブリンクス エン．ヴェー．
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(72)【発明者】
【氏名】ペーター・カステールス
(72)【発明者】
【氏名】ヴィレム・ファン・デ・ヴェルデ
(72)【発明者】
【氏名】アントニー・ファン・デ・ピュッテ
(72)【発明者】
【氏名】シンディ・デ・フリーゼ
【審査官】田ノ上 拓自
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２００４／００７２３２２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／１４４６５８（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
溶液からタンパク質を精製するための方法であって：（ａ）第１の濾過工程であって：
（ｉ）前記溶液を第１の膜に通して、前記タンパク質を含む第１の透過液を得る工程であって、
前記第１の膜は、４０ｋＤａから１００ｋＤａの間の公称分画分子量（ＮＭＷＣＯ）の孔径を有し、前記第１の膜のＮＭＷＣＯは、前記タンパク質の公称分子量（ＮＭＷ）より大きい、前記第１の透過液を得る工程
を含む、前記第１の濾過工程と；
（ｂ）第２の濾過工程であって：
（ｉ）第２の膜を使用して工程（ａ）の終わりに得られた第１の透過液を濃縮して、前記タンパク質を含む第１の保持液を得る工程であって、
前記第２の膜は、２ｋＤａから５０ｋＤａの間のＮＭＷＣＯの孔径を有し、前記第２の膜のＮＭＷＣＯは、精製するタンパク質のＮＭＷより小さい、第１の保持液を得る工程
を含む、第２の濾過工程と；
（ｃ）沈殿、洗浄および再懸濁工程であって：
（ｉ）前記タンパク質を含む沈殿物が形成されるまで、工程（ｂ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む前記第１の保持液を沈殿させる工程と；
（ｉｉ）第３の膜を使用して前記タンパク質を含む前記沈殿物を洗浄する工程と；
（ｉｉｉ）工程（ｃ）（ｉｉ）の終わりに得られた洗浄した沈殿物を再懸濁して、前記タンパク質を含む第２の保持液を得る工程と；
（ｉｖ）工程（ｃ）（ｉｉｉ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第２の保持液を前記第３の膜に通して濾過して、前記タンパク質を含む第２の透過液を得る工程であって、
前記第３の膜は、０．０５～０．３５μｍの間の孔径を有する、第２の透過液を得る工程と
を含む沈殿、洗浄および再懸濁工程と；
（ｄ）限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）工程であって：
（ｉ）第４の膜を使用して工程（ｃ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第２の透過液を透析濾過して、前記タンパク質を含む第１の透析濾過液を得る工程であって、前記第４の膜は、２ｋＤａから５０ｋＤａの間のＮＭＷＣＯの孔径を有し、前記第４の膜のＮＭＷＣＯは、精製するタンパク質のＮＭＷより小さい、第１の透析濾過液を得る工程と；
（ｉｉ）前記第４の膜を使用して工程（ｄ）（ｉ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第１の透析濾過液を濃縮して、前記タンパク質を含む第３の保持液を得る工程と；
（ｉｉｉ）前記第４の膜を使用して工程（ｄ）（ｉｉ）の前記タンパク質を含む第３の保持液を透析濾過して、前記タンパク質を含む第２の透析濾過液を得る工程と
を含む限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）工程と；
を含み、前記タンパク質は、１５ｋＤａから１００ｋＤａの間の分子量（ＭＷ）を有する、前記方法。
【請求項2】
（ｅ）製剤化および最終濾過工程であって：（ｉ）製剤化緩衝液中で、工程（ｄ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む前記第２の透析濾過液を製剤化して、前記タンパク質を含む製剤化製品を得る工程
をさらに含む、請求項１に記載の溶液からタンパク質を精製するための方法。
【請求項3】
工程（ｅ）は（ｉｉ）前記製剤化製品を濾過する工程
をさらに含む、請求項２に記載の溶液からタンパク質を精製するための方法。
【請求項4】
前記第１の濾過工程（ａ）、および／または前記第２の濾過工程（ｂ）、および／または前記沈殿させる工程（ｃ）（ｉ）、および／または前記洗浄する工程（ｃ）（ｉｉ）、および／または前記再懸濁する工程（ｃ）（ｉｉｉ）、および／または前記濾過する工程（ｃ）（ｉｖ）、および／または前記透析濾過する工程（ｄ）（ｉ）、および／または前記濃縮する工程（ｄ）（ｉｉ）および／または前記透析濾過する工程（ｄ）（ｉｉｉ）は、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）において、またはノーマルフロー濾過（ＮＦＦ）によって行われる、請求項１～３のいずれか１項に記載の溶液からタンパク質を精製するための方法。
【請求項5】
全ての工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）（ｉ）、（ｃ）（ｉｉ）、（ｃ）（ｉｉｉ）、（ｃ）（ｉｖ）、（ｄ）（ｉ）、（ｄ）（ｉｉ）および（ｄ）（ｉｉｉ）は、１つおよび同じデバイスで行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記第１の膜、および／または前記第２の膜、および／または前記第３の膜、および／または前記第４の膜は、修飾されたポリエーテル－スルホン（ｍＰＥＳ）、再生セルロース、ポリプロピレン、酢酸セルロース、ポリ乳酸、セラミック、ポリエーテル－スルホン、ポリアリールスルホン、ポリスルホン、ポリイミド、ポリアミドまたはポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）を含む、請求項４または５に記載の溶液からタンパク質を精製するための方法。
【請求項7】
前記第１の濾過工程（ａ）は、２～４透析濾過体積（ＤＶ）の精製水で濾過することを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の溶液からタンパク質を精製するための方法。
【請求項8】
５０％～１００％の間の前記タンパク質が、第１の透過液中に回収される、請求項１～７のいずれか１項に記載の溶液からタンパク質を精製するための方法。
【請求項9】
前記タンパク質を含む前記第１の透過液は、前記溶液より１０％～１００％少ない不純物を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の溶液からタンパク質を精製するための方法。
【請求項10】
前記第２の濾過工程（ｂ）は精製水を使用することを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の溶液からタンパク質を精製するための方法。
【請求項11】
前記第１の保持液中のタンパク質は、５０～２００ｍｇ／ｍｌの間の濃度に濃縮される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の溶液からタンパク質を精製するための方法。
【請求項12】
前記沈殿させる工程は、混和性溶媒、非イオン性親水性ポリマー、多価金属イオン、および中性塩からなる群から選択される沈殿剤を含む沈殿溶液によって行われる、請求項１～１１のいずれか１項に記載の溶液からタンパク質を精製するための方法。
【請求項13】
前記沈殿させる工程は、１．４～２．２Ｍの（（ＮＨ4）+）2（ＳＯ4）2-で行われる、請求項１２に記載の溶液からタンパク質を精製するための方法。
【請求項14】
工程（ｃ）（ｉｉ）の前記タンパク質を含む前記沈殿物の洗浄は、沈殿溶液を洗浄溶液に置き換えること、および２～８ＤＶの洗浄溶液で前記沈殿物を洗浄することを含む、請求項１２または１３に記載の溶液からタンパク質を精製するための方法。
【請求項15】
前記洗浄溶液は、１．４～２．２Ｍの間の濃度で沈殿剤を含む、請求項１４に記載の溶液からタンパク質を精製するための方法。
【請求項16】
前記洗浄溶液に含まれる前記沈殿剤は（（ＮＨ4）+）2（ＳＯ4）2-である、請求項１５に記載の溶液からタンパク質を精製するための方法。
【請求項17】
工程（ｃ）（ｉｉ）の終わりに得られた洗浄した沈殿物は、０．８～０．４Ｍの間の濃度で沈殿剤を含む再懸濁溶液中に再懸濁される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の溶液からタンパク質を精製するための方法。
【請求項18】
前記再懸濁溶液に含まれる前記沈殿剤は（（ＮＨ4）+）2（ＳＯ4）2-である、請求項１７に記載の溶液からタンパク質を精製するための方法。
【請求項19】
工程（ｃ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第２の透過液は、１～４透析濾過体積（ＤＶ）の間の一次緩衝液で透析濾過される、請求項１～１８のいずれか１項に記載の溶液からタンパク質を精製するための方法。
【請求項20】
前記第３の保持液中のタンパク質は、１０～１００ｍｇ／ｍｌの間の濃度を有する、請求項１～１９のいずれか１項に記載の溶液からタンパク質を精製するための方法。
【請求項21】
工程（ｄ）（ｉｉ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第３の保持液は、１～８透析濾過体積（ＤＶ）の一次緩衝液で透析濾過される、請求項１～２０のいずれか１項に記載の溶液からタンパク質を精製するための方法。
【請求項22】
製剤化製品は、－ １０～１００ｍｇ／ｍｌの間の濃度のタンパク質と；
－ 一次緩衝液と
を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の溶液からタンパク質を精製するための方法。
【請求項23】
前記一次緩衝液は、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、酢酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液からなる群から選択される、請求項２２に記載の溶液からタンパク質を精製するための方法。
【請求項24】
前記一次緩衝液のｐＨは５～７．５である、請求項２２に記載の溶液からタンパク質を精製するための方法。
【請求項25】
前記一次緩衝液の濃度は５ｍＭ～５０ｍＭである、請求項２２に記載の溶液からタンパク質を精製するための方法。
【請求項26】
前記一次緩衝液は２０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６．０である、請求項２２に記載の溶液からタンパク質を精製するための方法。
【請求項27】
前記製剤化製品は、１～１２％の、スクロース、ソルビトール、マンニトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニン、および塩酸アルギニンからなる群から選択される安定剤をさらに含む、請求項２２に記載の溶液からタンパク質を精製するための方法。
【請求項28】
前記安定化剤はマンニトールである、請求項２７に記載の溶液からタンパク質を精製するための方法。
【請求項29】
前記安定化剤は１０ｍｇ／ｍｌの濃度である、請求項２７に記載の溶液からタンパク質を精製するための方法。
【請求項30】
前記製剤化製品は、０．００１％～０．６％の濃度で、ポリソルベート－２０、ポリソルベート－４０、ポリソルベート－６０、ポリソルベート－６５、ポリソルベート－８０、ポリソルベート－８５、ポロキサマー－１８８、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリラウレート、ソルビタントリステアレートおよびソルビタントリオレエートからなる群から選択される界面活性剤をさらに含む、請求項２２に記載の溶液からタンパク質を精製するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
１ 発明の分野
本発明は抗体を精製するための方法に関し、前記方法は、優れた純度で高収率の精製抗体を得ることを依然として可能にしながら、限定された数の工程を含む。簡潔に述べると、この方法は、濾過および沈殿工程のみを含み、クロマトグラフィー工程を必要としない。
本発明は抗体を精製するための方法に関し、前記方法は、優れた純度で高収率の精製抗体を得ることを依然として可能にしながら、限定された数の工程を含む。簡潔に述べると、この方法は、濾過および沈殿工程のみを含み、クロマトグラフィー工程を必要としない。
【背景技術】
【0002】
２ 背景
抗体精製はバイオプロダクションの最も費用のかかる態様の１つであり得る。抗体（Ａｂ）およびその断片は一般に、各クロマトグラフィー工程において特定の樹脂および緩衝液系を使用する多段階クロマトグラフィープロセスを使用して精製される。この従来の精製プロセスは、捕捉工程と、それに続くイオン交換工程とを包含し、ＵＦ／ＤＦ工程により終了する。産生のために使用される細胞培養力価およびより多くの細胞培養体積の増加に伴い、下流の処理は産業界において障害とみなされている。これは特に、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）産生に関連し、焦点はバッチ体積から下流の処理能力に向かってシフトしている。さらに、初期の前臨床および臨床段階の研究は、より迅速に産生することができる大量の抗体を必要とする。さらに、クロマトグラフィー工程は商品原価（ＣｏＧ）を決定する最も重要な要因の１つである。
抗体精製はバイオプロダクションの最も費用のかかる態様の１つであり得る。抗体（Ａｂ）およびその断片は一般に、各クロマトグラフィー工程において特定の樹脂および緩衝液系を使用する多段階クロマトグラフィープロセスを使用して精製される。この従来の精製プロセスは、捕捉工程と、それに続くイオン交換工程とを包含し、ＵＦ／ＤＦ工程により終了する。産生のために使用される細胞培養力価およびより多くの細胞培養体積の増加に伴い、下流の処理は産業界において障害とみなされている。これは特に、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）産生に関連し、焦点はバッチ体積から下流の処理能力に向かってシフトしている。さらに、初期の前臨床および臨床段階の研究は、より迅速に産生することができる大量の抗体を必要とする。さらに、クロマトグラフィー工程は商品原価（ＣｏＧ）を決定する最も重要な要因の１つである。
【0003】
産業界は、抗体精製のために使用される工程の数を減らすことを探求した。
【0004】
特許文献１は抗体を精製するための方法を開示し、前記方法は２または３のクロマトグラフィー工程を含み、第１のクロマトグラフィー工程はプロテインＡカラムの使用を含み、第２のクロマトグラフィー工程はカチオン交換クロマトグラフィーカラムの使用を含み、場合による第３のクロマトグラフィー工程はアニオン交換クロマトグラフィーカラムの使用を含む。
【0005】
特許文献２は、プロテインＡカラム溶出緩衝液において従来使用されているものよりも高いｐＨでのマルチモーダル樹脂クロマトグラフィーのローディングを開示しており、２つのクロマトグラフィー工程の間の緩衝液交換の必要性を示唆している。
【0006】
特許文献３は、母液から作製された４つの緩衝溶液を使用する、タンパク質、特にｍＡｂの小規模および大規模精製のための３段階クロマトグラフィープロセスに関する。
【0007】
特許文献４は、母液から作製された４つの緩衝溶液のみを使用する、タンパク質を精製するための２段階クロマトグラフィープロセスを使用する抗体精製方法を記載している。
【0008】
特許文献５は、とりわけ２つのクロマトグラフィー工程を使用するＮａｎｏｂｏｄｙ精製プロセスを記載している。
【0009】
抗体精製におけるクロマトグラフィー工程の広範な使用は、最終的にヒトにおいて使用することができる精製製品の品質におけるこのプロセスの成功によって説明することができる。したがって、新規の精製方法はいずれも、最終製品をヒトにおいて使用することができる品質を保持しなければならないことが好ましい。
【0010】
クロマトグラフィー工程の数をわずか２に減らすと、処理時間およびＣｏＧが低下した。
【0011】
しかしながら、好ましくは品質を保持しながら、抗体産生のＣｏＧおよび処理時間をさらに減少させる等、抗体精製を最適化する必要性が依然として存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0012】
【文献】ＷＯ２０１１／０９０７１９
【文献】ＷＯ２００９／１１１３４７
【文献】ＷＯ２０１４／１８０８５２
【文献】ＷＯ２０１３／０７５７４０
【文献】ＷＯ２０１０／０５６５５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
３ 発明の概要
宿主細胞からＡｂのような目的のタンパク質を精製することに伴う問題は、不純物の膨大な量およびサイズである。これらの不純物は、目的のタンパク質よりも大きいことも、目的のタンパク質よりも小さいこともあり、または目的のタンパク質と同じサイズを有することすらある。これは、精製プロセスを困難なタスクとし、今のところ、長時間にわたる高価なクロマトグラフィー方法によって対処されている。
宿主細胞からＡｂのような目的のタンパク質を精製することに伴う問題は、不純物の膨大な量およびサイズである。これらの不純物は、目的のタンパク質よりも大きいことも、目的のタンパク質よりも小さいこともあり、または目的のタンパク質と同じサイズを有することすらある。これは、精製プロセスを困難なタスクとし、今のところ、長時間にわたる高価なクロマトグラフィー方法によって対処されている。
【課題を解決するための手段】
【0014】
本発明者らは、抗体を精製するための新規方法を見出し、前記方法は、優れた純度で高収率の精製抗体を得ることを依然として可能にしながら、限定された数の工程を含む。簡潔に述べると、この方法は、濾過および沈殿工程のみを含む。精製タンパク質を得る際の適合性を実証した後、本発明者らはまた、プロセスが容易に拡張可能であることを示した。本発明の精製方法の商品原価は、従来のクロマトグラフィープロセスよりもかなり低かった。実際、１００Ｌへのアップスケーリングは、同等のクロマトグラフィー方法よりも既に８６％安価であった。さらに、カセットおよび緩衝液の交換のみを必要とする、単一のタンジェンシャルフロー濾過デバイスを使用することによってプロセスをさらに簡素化することができた。ＣｏＧをさらに最小化するために、必要な純度を維持しながら、ＤＶ工程の数を最小化することができる。
【0015】
本質的に、溶液からタンパク質を精製するための本発明の方法は：
（ａ）目的のタンパク質がより大きな不純物から分離される、第１の濾過工程と；
（ｂ）目的のタンパク質がより小さな不純物から分離される、第２の濾過工程と；
（ｃ）目的のタンパク質があらゆるさらなる残存不純物から分離される、沈殿、洗浄および再懸濁工程と；
（ｄ）目的のタンパク質が一次緩衝液中に濃縮される、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）工程と
を本質的に含む。
（ａ）目的のタンパク質がより大きな不純物から分離される、第１の濾過工程と；
（ｂ）目的のタンパク質がより小さな不純物から分離される、第２の濾過工程と；
（ｃ）目的のタンパク質があらゆるさらなる残存不純物から分離される、沈殿、洗浄および再懸濁工程と；
（ｄ）目的のタンパク質が一次緩衝液中に濃縮される、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）工程と
を本質的に含む。
【0016】
次に、一次緩衝液は、凍結乾燥、投与などのような、精製タンパク質についての特定の必要性に応じて賦形剤を添加することによって容易に適合される。必要に応じて、得られた製剤化タンパク質を長期間保存するために濾過することができる（場合による工程（ｅ））。
【0017】
特に、本発明は、溶液からタンパク質を精製するための方法であって：
（ａ）第１の濾過工程であって：（ｉ）前記溶液を第１の膜に通して、第１の透過液を得る工程であって、前記第１の膜は、４０ｋＤａから１００ｋＤａの間、好ましくは４０ｋＤａから８０ｋＤａの間、さらにより好ましくは５０ｋＤａの公称分画分子量（ＮＭＷＣＯ）の孔径を有する、前記第１の透過液を得る工程を含む、前記第１の濾過工程と；
（ｂ）第２の濾過工程であって：（ｉ）第２の膜を使用して工程（ａ）の終わりに得られた第１の透過液を濃縮して、前記タンパク質を含む第１の保持液を得る工程であって、前記第２の膜は、４ｋＤａから４０ｋＤａの間、６ｋＤａから３０ｋＤａの間、８ｋＤａから２０ｋＤａの間のような２ｋＤａから５０ｋＤａの間、より好ましくは１０ｋＤａまたは１５ｋＤａのＮＭＷＣＯの孔径を有する、前記第１の保持液を得る工程を含む、前記第２の濾過工程と；
（ｃ）沈殿、洗浄および再懸濁工程であって：（ｉ）前記タンパク質を含む沈殿物が形成されるまで、工程（ｂ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む前記第１の保持液を沈殿させる工程と；（ｉｉ）第３の膜を使用して前記タンパク質を含む前記沈殿物を洗浄する工程と；（ｉｉｉ）工程（ｃ）（ｉｉ）の終わりに得られた洗浄した沈殿物を再懸濁して、前記タンパク質を含む第２の保持液を得る工程と；（ｉｖ）工程（ｃ）（ｉｉｉ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第２の保持液を第３の膜に通して濾過して、前記タンパク質を含む第２の透過液を得る工程であって、前記第３の膜は、０．１～０．３μｍのような０．０５～０．３５μｍの間または０．２μｍのような０．１５～０．２５μｍの間の孔径を有する、前記第２の透過液を得る工程とを含む前記沈殿、洗浄および再懸濁工程と；
（ｄ）限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）工程であって：（ｉ）第４の膜を使用して工程（ｃ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第２の透過液を透析濾過して、前記タンパク質を含む第１の透析濾過液を得る工程であって、前記第４の膜は、４ｋＤａから４０ｋＤａの間、６ｋＤａから３０ｋＤａの間、８ｋＤａから２０ｋＤａの間のような２ｋＤａから５０ｋＤａの間、より好ましくは１０ｋＤａまたは１５ｋＤａ（ＮＭＷＣＯ）の孔径を有する、第１の透析濾過液を得る工程と；（ｉｉ）前記第４の膜を使用して工程（ｄ）（ｉ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第１の透析濾過液を濃縮して、前記タンパク質を含む第３の保持液を得る工程と；（ｉｉｉ）前記第４の膜を使用して工程（ｄ）（ｉｉ）の前記タンパク質を含む第３の保持液を透析濾過して、前記タンパク質を含む第２の透析濾過液を得る工程とを含む前記限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）工程と；
（ｅ）場合により、製剤化および最終濾過工程であって：（ｉ）製剤化緩衝液中で、工程（ｄ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む前記第２の透析濾過液を製剤化して、前記タンパク質を含む製剤化製品を得る工程と；（ｉｉ）場合により、製剤化製品を濾過する工程とを含む前記製剤化および最終濾過工程と
を含み、タンパク質は５ｋＤａ～２００ｋＤａの間の分子量（ＭＷ）を有し、好ましくは前記タンパク質は、１０ｋＤａから１５０ｋＤａの間、好ましくは１５ｋＤａから１００ｋＤａの間、さらにより好ましくは、約１５ｋＤａまたは２０ｋＤａのような、１５～３０ｋＤａの間のような、１５から５０ｋＤａの間のＭＷを有する、前記方法に関する。
（ａ）第１の濾過工程であって：（ｉ）前記溶液を第１の膜に通して、第１の透過液を得る工程であって、前記第１の膜は、４０ｋＤａから１００ｋＤａの間、好ましくは４０ｋＤａから８０ｋＤａの間、さらにより好ましくは５０ｋＤａの公称分画分子量（ＮＭＷＣＯ）の孔径を有する、前記第１の透過液を得る工程を含む、前記第１の濾過工程と；
（ｂ）第２の濾過工程であって：（ｉ）第２の膜を使用して工程（ａ）の終わりに得られた第１の透過液を濃縮して、前記タンパク質を含む第１の保持液を得る工程であって、前記第２の膜は、４ｋＤａから４０ｋＤａの間、６ｋＤａから３０ｋＤａの間、８ｋＤａから２０ｋＤａの間のような２ｋＤａから５０ｋＤａの間、より好ましくは１０ｋＤａまたは１５ｋＤａのＮＭＷＣＯの孔径を有する、前記第１の保持液を得る工程を含む、前記第２の濾過工程と；
（ｃ）沈殿、洗浄および再懸濁工程であって：（ｉ）前記タンパク質を含む沈殿物が形成されるまで、工程（ｂ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む前記第１の保持液を沈殿させる工程と；（ｉｉ）第３の膜を使用して前記タンパク質を含む前記沈殿物を洗浄する工程と；（ｉｉｉ）工程（ｃ）（ｉｉ）の終わりに得られた洗浄した沈殿物を再懸濁して、前記タンパク質を含む第２の保持液を得る工程と；（ｉｖ）工程（ｃ）（ｉｉｉ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第２の保持液を第３の膜に通して濾過して、前記タンパク質を含む第２の透過液を得る工程であって、前記第３の膜は、０．１～０．３μｍのような０．０５～０．３５μｍの間または０．２μｍのような０．１５～０．２５μｍの間の孔径を有する、前記第２の透過液を得る工程とを含む前記沈殿、洗浄および再懸濁工程と；
（ｄ）限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）工程であって：（ｉ）第４の膜を使用して工程（ｃ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第２の透過液を透析濾過して、前記タンパク質を含む第１の透析濾過液を得る工程であって、前記第４の膜は、４ｋＤａから４０ｋＤａの間、６ｋＤａから３０ｋＤａの間、８ｋＤａから２０ｋＤａの間のような２ｋＤａから５０ｋＤａの間、より好ましくは１０ｋＤａまたは１５ｋＤａ（ＮＭＷＣＯ）の孔径を有する、第１の透析濾過液を得る工程と；（ｉｉ）前記第４の膜を使用して工程（ｄ）（ｉ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第１の透析濾過液を濃縮して、前記タンパク質を含む第３の保持液を得る工程と；（ｉｉｉ）前記第４の膜を使用して工程（ｄ）（ｉｉ）の前記タンパク質を含む第３の保持液を透析濾過して、前記タンパク質を含む第２の透析濾過液を得る工程とを含む前記限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）工程と；
（ｅ）場合により、製剤化および最終濾過工程であって：（ｉ）製剤化緩衝液中で、工程（ｄ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む前記第２の透析濾過液を製剤化して、前記タンパク質を含む製剤化製品を得る工程と；（ｉｉ）場合により、製剤化製品を濾過する工程とを含む前記製剤化および最終濾過工程と
を含み、タンパク質は５ｋＤａ～２００ｋＤａの間の分子量（ＭＷ）を有し、好ましくは前記タンパク質は、１０ｋＤａから１５０ｋＤａの間、好ましくは１５ｋＤａから１００ｋＤａの間、さらにより好ましくは、約１５ｋＤａまたは２０ｋＤａのような、１５～３０ｋＤａの間のような、１５から５０ｋＤａの間のＭＷを有する、前記方法に関する。
【0018】
本発明はまた、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記第１の濾過工程（ａ）、および／または前記第２の濾過工程（ｂ）、および／または前記沈殿させる工程（ｃ）（ｉ）、および／または前記洗浄する工程（ｃ）（ｉｉ）、および／または前記再懸濁する工程（ｃ）（ｉｉｉ）、および／または前記濾過する工程（ｃ）（ｉｖ）、および／または前記透析濾過する工程（ｄ）（ｉ）、および／または前記濃縮する工程（ｄ）（ｉｉ）および／または前記透析濾過する工程（ｄ）（ｉｉｉ）は、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）において、またはノーマルフロー濾過（ＮＦＦ）によって行われ、好ましくは全ての工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）（ｉ）、（ｃ）（ｉｉ）、（ｃ）（ｉｉｉ）、（ｃ）（ｉｖ）、（ｄ）（ｉ）、（ｄ）（ｉｉ）および（ｄ）（ｉｉｉ）は、１つおよび同じデバイスにおいて行われる、方法に関する。
【0019】
本発明はまた、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記第１の膜、および／または前記第２の膜、および／または前記第３の膜、および／または前記第４の膜は、再生セルロース、ポリプロピレン、酢酸セルロース、ポリ乳酸、セラミック、ポリエーテル－スルホン、ポリアリールスルホン、ポリスルホン、ポリイミド、ポリアミド、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）を含む、方法に関する。
【0020】
本発明はまた、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記第１の濾過工程（ａ）は、３透析濾過体積（ＤＶ）のような２～４ＤＶの精製水で濾過することを含む、方法に関する。
【0021】
本発明はまた、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、６０％～１００％の間、またはさらに８０％～１００％の間のような、前記タンパク質の５０％～１００％の間が、第１の透過液中に回収される、方法に関する。
【0022】
本発明はまた、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記タンパク質を含む前記第１の透過液は、前記溶液より２０％～１００％、３０％～１００％、４０％～１００％、５０％～１００％、６０％～１００％、７０％～１００％、またはさらに８０％～１００％少ない不純物のような、前記溶液より１０％～１００％少ない不純物を含む、方法に関する。
【0023】
本発明はまた、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記第２の濾過工程（ｂ）は精製水を使用することを含む、方法に関する。
【0024】
本発明はまた、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記第１の保持液中のタンパク質は、７５～１７５ｍｇ／ｍｌのような５０～２００ｍｇ／ｍｌの間、または約１２０ｍｇ／ｍｌもしくは１２５ｍｇ／ｍｌのような１００～１５０ｍｇ／ｍｌの間の濃度に濃縮される、方法に関する。
【0025】
本発明はまた、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記沈殿させる工程は、混和性溶媒、非イオン性親水性ポリマー、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋またはＦｅ２＋のような多価金属イオン、および中性塩、好ましくはコスモトロープ（ｋｏｓｍｏｔｒｏｐｅ）、最も好ましくは（（ＮＨ４）＋）２（ＳＯ４）２－からなる群から選択される沈殿剤を含む沈殿溶液によって行われる、方法に関する。
【0026】
本発明はまた、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記沈殿させる工程は、１．６～２．０Ｍのような１．４～２．２Ｍ、好ましくは約１．８Ｍの（（ＮＨ４）＋）２（ＳＯ４）２－で行われる、方法に関する。
【0027】
本発明はまた、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、工程（ｃ）（ｉｉ）の前記タンパク質を含む前記沈殿物の洗浄は、沈殿溶液を洗浄溶液に置き換えること、および好ましくは４～６ＤＶのような２～８ＤＶまたは５ＤＶの洗浄溶液で前記沈殿物を洗浄することを含み、好ましくは前記洗浄溶液は、１．６～２．０Ｍのような１．４～２．２Ｍの間、好ましくは約１．８Ｍの濃度で沈殿剤を含み、好ましくは前記沈殿剤は（（ＮＨ４）＋）２（ＳＯ４）２－である、方法に関する。
【0028】
本発明はまた、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、工程（ｃ）（ｉｉ）の終わりに得られた洗浄した沈殿物は、０．７～０．５Ｍのような０．８～０．４Ｍの間、好ましくは約０．６Ｍの濃度で沈殿剤を含む再懸濁溶液中に再懸濁され、好ましくは前記沈殿剤は（（ＮＨ４）＋）２（ＳＯ４）２－である、方法に関する。
【0029】
本発明はまた、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、工程（ｃ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第２の透過液は、１透析濾過体積（ＤＶ）のような、１～４ＤＶの間の一次緩衝液で透析濾過される、方法に関する。
【0030】
本発明はまた、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記第３の保持液中のタンパク質は、２５～８０ｍｇ／ｍｌのような１０～１００ｍｇ／ｍｌの間、または約５０ｍｇ／ｍｌもしくは５５ｍｇ／ｍｌのような４０～６０ｍｇ／ｍｌの間の濃度を有する、方法に関する。
【0031】
本発明はまた、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、工程（ｄ）（ｉｉ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第３の保持液は、３～６のような１～８透析濾過体積（ＤＶ）、または４ＤＶもしくは５ＤＶの一次緩衝液で透析濾過される、方法に関する。
【0032】
本発明はまた、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記製剤化製品は、
－ ２５～８０ｍｇ／ｍｌのような１０～１００ｍｇ／ｍｌ、または約５０ｍｇ／ｍｌもしくは５５ｍｇ／ｍｌタンパク質のような４０～６０ｍｇ／ｍｌの間の濃度のタンパク質と；
－ リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、酢酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液のような一次緩衝液であって、好ましくは一次緩衝液のｐＨは約５～約７．５であり、好ましくは一次緩衝液の濃度は約５ｍＭ～約５０ｍＭであり、より好ましくは一次緩衝液は２０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６．０である、一次緩衝液と；
－ 場合により、約１～１２％の、スクロース、ソルビトール、マンニトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニン、および塩酸アルギニンからなる群から選択される安定剤、好ましくはマンニトール、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌと；
－ 場合により、ポリソルベート－２０、ポリソルベート－４０、ポリソルベート－６０、ポリソルベート－６５、ポリソルベート－８０、ポリソルベート－８５、ポロキサマー－１８８、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリラウレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタントリオレエートからなる群から選択される、約０．００１％～０．６％の濃度の界面活性剤と
を含む、方法に関する。
－ ２５～８０ｍｇ／ｍｌのような１０～１００ｍｇ／ｍｌ、または約５０ｍｇ／ｍｌもしくは５５ｍｇ／ｍｌタンパク質のような４０～６０ｍｇ／ｍｌの間の濃度のタンパク質と；
－ リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、酢酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液のような一次緩衝液であって、好ましくは一次緩衝液のｐＨは約５～約７．５であり、好ましくは一次緩衝液の濃度は約５ｍＭ～約５０ｍＭであり、より好ましくは一次緩衝液は２０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６．０である、一次緩衝液と；
－ 場合により、約１～１２％の、スクロース、ソルビトール、マンニトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニン、および塩酸アルギニンからなる群から選択される安定剤、好ましくはマンニトール、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌと；
－ 場合により、ポリソルベート－２０、ポリソルベート－４０、ポリソルベート－６０、ポリソルベート－６５、ポリソルベート－８０、ポリソルベート－８５、ポロキサマー－１８８、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリラウレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタントリオレエートからなる群から選択される、約０．００１％～０．６％の濃度の界面活性剤と
を含む、方法に関する。
【0033】
４ 図面の説明
【図面の簡単な説明】
【0034】
【図1】ＭＩＰ試行の異なるサンプルの異なるＳＥ－ＨＰＬＣ分析のオーバーレイの図である。
【発明を実施するための形態】
【0035】
５ 詳細な説明
別段の指示または定義がない限り、使用される全ての用語は、当業者には明らかである、当該技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版） Ｖｏｌｓ．１～３、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）、Ｌｅｗｉｎ（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９８５）、Ｏｌｄら（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（第２版） Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ、１９８１）；Ｒｏｉｔｔら（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第６版） Ｍｏｓｂｙ／Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ、２００１）、Ｒｏｉｔｔら（Ｒｏｉｔｔ’ｓ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第１０版） Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ＵＫ、２００１）、およびＪａｎｅｗａｙら（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（第６版） Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ／Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００５）のような標準的なハンドブック、ならびに本明細書に引用される一般的な背景技術を参照のこと。
別段の指示または定義がない限り、使用される全ての用語は、当業者には明らかである、当該技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版） Ｖｏｌｓ．１～３、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）、Ｌｅｗｉｎ（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９８５）、Ｏｌｄら（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（第２版） Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ、１９８１）；Ｒｏｉｔｔら（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第６版） Ｍｏｓｂｙ／Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ、２００１）、Ｒｏｉｔｔら（Ｒｏｉｔｔ’ｓ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第１０版） Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ＵＫ、２００１）、およびＪａｎｅｗａｙら（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（第６版） Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ／Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００５）のような標準的なハンドブック、ならびに本明細書に引用される一般的な背景技術を参照のこと。
【0036】
別段の指示がない限り、当業者に明らかなように、具体的に詳細に記載されていない全ての方法、工程、技法および操作はそれら自体が公知の様式で実行することができ、実行されている。例えば、再び、本明細書に述べられている標準的なハンドブックおよび一般的な背景技術、ならびにそれらに引用されるさらなる参考文献を参照のこと；同様に例えば以下の概説である、Ｐｒｅｓｔａ（Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５８（５～６）：６４０～５６、２００６）、ＬｅｖｉｎおよびＷｅｉｓｓ（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．２（１）：４９～５７、２００６）、Ｉｒｖｉｎｇら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８（１～２）：３１～４５、２００１）、Ｓｃｈｍｉｔｚら（Ｐｌａｃｅｎｔａ ２１ Ｓｕｐｐｌ．Ａ：Ｓ１０６～１２、２０００）、Ｇｏｎｚａｌｅｓら（Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．２６（１）：３１～４３、２００５）を参照のこと。それらは、親和性成熟のようなタンパク質工学についての技法ならびに免疫グロブリンのようなタンパク質の特異性および他の所望の特性を改善するための他の技法を記載している。
【0037】
アミノ酸配列は、文脈に応じて、単一のアミノ酸または２つもしくはそれ以上のアミノ酸の非分岐配列を意味すると解釈される。ヌクレオチド配列は、３つまたはそれ以上のヌクレオチドの非分岐配列を意味すると解釈される。
【0038】
アミノ酸は、天然に存在するタンパク質に一般的に見出されるそれらのＬ－アミノ酸である。アミノ酸残基は、標準的な３文字または１文字のアミノ酸コードに従って示される。例えば、ＷＯ０８／０２００７９の４８ページの表Ａ－２を参照のこと。Ｄ－アミノ酸を含有するこれらのアミノ酸配列は、この定義に包含されるようには意図されていない。翻訳後修飾アミノ酸を含有する任意のアミノ酸配列は、修飾された位置；例えば、ヒドロキシル化またはグリコシル化により、この表Ａ－２に示される記号を使用して最初に翻訳されるアミノ酸配列として記載することができるが、これらの修飾はアミノ酸配列において明示的に示されていない。配列修飾連結、架橋および末端キャップ、非ペプチジル結合などとして発現することができる任意のペプチドまたはタンパク質が、この定義に包含される。
【0039】
特に断らない限り、数値に関連する「およそ」、「約」または「実質的に」という用語は、前記値の±１０％の範囲内を意味する。
【0040】
本明細書に記載される濾過工程は、不純物から目的のタンパク質を精製する、例えば分離する機械的、物理的または生物学的操作の任意の適切な手段によって実行することができる。好ましくは、濾過工程は半透膜を使用して実行される。濾過は１つまたは複数のデバイスを用いて行うことができ、供給タンパク質含有溶液は並列または直列フローにおいてデバイスと接触される。
【0041】
本明細書で使用される場合、「半透膜」は、他の分子を保持しながら、ある特定の分子またはイオンが、拡散、促進拡散、受動輸送または能動輸送によって通過することを可能にする細孔を含む、任意の種類の生物学的または合成のポリマー膜に関する。通過速度は、いずれかの側の分子または溶質の圧力、濃度および温度、ならびに各溶質に対する膜の透過性に依存する。膜および溶質に応じて、透過性は、溶質のサイズ、溶解性、特性および化学的性質に依存し得る。「半透膜」および「膜」という用語は、本開示全体を通して交換可能に使用され、各々が、本開示の目的のために同じ意味を有する。膜の孔径に応じて、精密濾過および限外濾過のために使用される膜を区別することができる。精密濾過のための膜は典型的に０．１μｍから１０μｍの間の孔径を有する。限外濾過のために使用される膜は典型的に０．１μｍ未満の孔径を有する（例えば、１０ｋＤおよび５０ｋＤの膜）。
【0042】
一部の実施形態では、膜は、例えば、第１の濾過工程（ａ）において、４０ｋＤａから１００ｋＤａの間、好ましくは４０ｋＤａから８０ｋＤａの間、さらにより好ましくは５０ｋＤａの公称分画分子量（ＮＭＷＣＯ）の孔径を有する。
【0043】
一部の実施形態では、膜は、例えば、第２の濾過工程（ｂ）またはＵＦ／ＤＦ工程（ｄ）において、４ｋＤａから４０ｋＤａの間、６ｋＤａから３０ｋＤａの間、８ｋＤａから２０ｋＤａの間のような、２ｋＤａから５０ｋＤａの間、より好ましくは１０ｋＤａまたは１５ｋＤａのＮＭＷＣＯの孔径を有する。
【0044】
実施形態では、膜は、例えば、沈殿、洗浄および再懸濁工程（ｃ）において、０．１～０．３μｍのような０．０５～０．３５μｍの間または０．２μｍのような０．１５～０．２５μｍの間の孔径を有する。
【0045】
本発明の方法において利用することができる代表的な適切な膜には、再生セルロース、ポリプロピレン、酢酸セルロース、ポリ乳酸、セラミック、ポリエーテル－スルホン、ポリアリールスルホン、ポリスルホン、ポリイミド、ポリアミド、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）などから形成されるものが含まれる。これらの膜は、例えば、カートリッジ（例えば、ＮＦＦ）形態で、またはカセット（例えば、ＴＦＦ用）として供給することができる。ある特定の実施形態では、膜は、Ｓａｔｏｒｉｕｓ ＳＴＩＣ（登録商標）膜、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｑ膜（Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標））、またはＳａｒｔｏｒｉｕｓ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ（登録商標）膜である。
【0046】
本明細書で使用される場合、「限外濾過」または「ＵＦ」とは、ＵＦ膜中の粒径および細孔のサイズに基づいて溶液から粒子および／またはイオンを物理的および選択的に除去するために半透膜を使用する濾過技法を指す。一般に、半透膜は、膜を横切る圧力差を使用して供給ストリームにおける分子を選別または濃縮するために非常に小さい（０．００１μｍ～０．１μｍ）細孔を有する。ＵＦ膜は、時々、孔径よりもむしろ分画分子量（ＭＷＣＯ）に基づいて分類される。
【0047】
限外濾過はまた、目的のタンパク質を濃縮するために使用することができる。ＵＦによる濃縮は、溶質分子を保持しながら、溶液から流体を除去することを含む単純なプロセスである。溶質の濃度は溶液体積の減少に正比例して増加する、すなわち、体積を半分にすると、濃度は効果的に２倍になる。サンプルを濃縮するために、保持されるタンパク質の分子量より実質的に低いＭＷＣＯを用いてＵＦ膜を選択し、これは目的のタンパク質の保持および高回収率を確実にする（本発明の第２の濾過工程（ｂ）およびＵＦ／ＤＦ工程（ｄ）を参照のこと）。
【0048】
限外濾過はまた、膜を通過できない、宿主細胞およびプロセス関連不純物のような、より大きな不純物から、目的のタンパク質のような、より小さな分子を精製するために使用することができる（本発明の第１の濾過工程（ａ）を参照のこと）。
【0049】
時々、公称分子量限界（ＮＭＷＬ）または公称分画分子量（ＮＭＷＣＯ）と呼ばれる膜の分画分子量（ＭＷＣＯ）は、規定された分子量の所与のパーセンテージの球状溶質を保持するその能力によって規定される。溶質保持は、分子形状、構造、溶質濃度、他の溶質の存在およびイオン条件に起因して変化することがある。したがって、当業者はＭＷＣＯ定格が球状分子に基づき、一方で、３次元のうちの２次元において小さな直径を有し得る、より線状の分子が、記載されたＭＷＣＯを超える分子量を有するにもかかわらず、細孔をより自由に通過することができることがあることを理解するであろう。目的のタンパク質の適切な保持を確実にするために、当業者は、いくつかの慣例的な実験を実行することによって、必要とされる特性を有する膜を選択することができる。良好な一般規則は、保持される目的のタンパク質の分子量の３～６分の１のＭＷＣＯを有する膜を選択することである。
【0050】
従来、膜のＭＷＣＯとは、膜を横切って効果的に拡散しない標準分子の最小平均分子質量を指す。本明細書で使用される場合、「分画分子量」または「ＭＷＣＯ」とは、溶質の９０％が膜によって保持される最低分子量溶質（ダルトン）、または膜によって９０％保持される分子（例えば、球状タンパク質）の分子量を指す。２ｋＤａ、３．５ｋＤａ、５ｋＤａ、７ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａおよび２０ｋＤａ、さらにより好ましくは１０ｋＤａの公称ＭＷＣＯ定格を有する好ましいＵＦ膜。例えば、ＵＦは本発明の工程（ｂ）および工程（ｄ）において使用される。
【0051】
本明細書で使用される場合、「濃縮」部分の間、初期体積Ｖ０は最終保持体積（「Ｖ」）に濃縮され、したがって、体積濃度係数（ＶＣＦ）は、ＶＣＦ＝Ｖ０／Ｖとして定義することができる。（透析）濾過の間、透析体積（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）（ＤＶ）は、（透析）濾過工程の間に実行された緩衝液交換の程度の尺度である。一定体積の（透析）濾過が実行されており、保持液体積（Ｖ）が一定に保たれ、（透析）濾過体積ＶＤが、濾液が出るのと同じ速度で入る場合、ＤＶはＤＶ＝ＶＤ／Ｖとして計算される。工程性能に影響を及ぼし得る他の動作パラメータには、フィルター設計（チャネルサイズおよび形状など）、ならびに材料および構造が含まれ、これらの全ては当業者に公知であり、これらの全ては定期的に分析され、例えば、適切な膜についてのスクリーニングの間に評価される。
【0052】
本明細書で使用される場合、「膜間圧」または「ＴＭＰ」は、膜を通る液体輸送のための駆動力に関する。それは、膜に加えられた平均圧力から任意の濾過圧を引いたものとして計算される。ほとんどの場合、濾液ポートにおける圧力はゼロに等しい。
【0053】
本明細書で使用される場合、「透析濾過」または「ＤＦ」とは、膜を通過することができない、より大きな分子（保持液）を、膜を通過することができる、より小さな分子（透過液）から分離する半透膜を使用する技法を指す。ＤＦは、半透膜を通る、より小さな分子（透過液）を洗浄し、保持液中により大きな分子を残す。ＤＦは、溶液から塩または溶媒の濃度を完全に除去する、置き換える、または低下させるために使用することができる（本発明の工程（ａ）、（ｃ）および（ｄ）を参照のこと）。ＤＦは、連続的または不連続的のいずれかで実行することができる。
【0054】
連続透析濾過では、ＤＦ溶液は、濾液が生成されるのと同じ速度でサンプル供給リザーバに添加される。その結果、サンプルリザーバ内の体積は一定のままであるが、膜を透過する、より小さな分子は洗い流される。
【0055】
不連続透析濾過では、ＤＦ溶液は初期体積を増加させるために最初に希釈され、次いで濾液が生成されると濃縮される。次いでこのプロセスは、サンプルリザーバ中に残存する小分子の所望の濃度が達成されるまで繰り返される。
【0056】
不連続透析濾過は、連続透析濾過と同程度または小さい分子の透過液減少を達成するために、より多くの濾液体積を必要とする。
【0057】
ＤＦプロセスは、時々、ＤＦ溶液が添加される前の溶液の体積を指す、透析濾過体積を使用する。各々のさらなる透析濾過体積（ＤＶ）は塩濃度をさらに減少させる。一般に、５透析濾過体積を使用すると、連続透析濾過でイオン強度が約９９％減少する。
【0058】
本明細書で使用される濾過に関して、「保持液」という用語は、膜の保持液側に保持され、本発明の工程（ａ）における不純物、または本発明の工程（ｂ）における目的のタンパク質のような、膜を通過するには大きすぎる分子を含有する溶液を指す。
【0059】
簡潔さのために、「ＵＦ」、「ＤＦ」および「ＵＦ／ＤＦ」（または「ＵＦＤＦ」）という頭文字を、説明全体にわたって使用することができ、以下のように理解されるべきである：「ＵＦ」は「限外濾過」を意味し、「ＤＦ」は「透析濾過」を意味し、「ＵＦ／ＤＦ」（または「ＵＦＤＦ」）は「限外濾過／透析濾過」を意味する。
【0060】
「タンジェンシャルフロー濾過」（「ＴＦＦ」）または「クロスフロー濾過」とは、一部が膜（透過液）を通過する際に供給流が膜面に平行して通過し、一方で、残り（保持液）が供給リザーバに再循環されて戻される濾過を指す。それは、多くの場合、供給流が膜に垂直に適用される、「ノーマルフロー濾過」、（「ＮＦＦ」）の代わりに使用される。ＮＦＦは膜において混合物の圧縮を引き起こし、不十分な分離を引き起こすことがあるので、ＴＦＦが好ましい。
【0061】
本明細書で使用される場合、「濾液」（本明細書では、時々、「透過液」としても指定される）は、膜を通って流れたサンプルである。
【0062】
本明細書で使用される場合、「回収率」は、例えば、濾過前の出発サンプル中の量と比較した、処理後、例えば、濾過後に回収されたタンパク質の量（量、質量または活性）に関する。回収率は通常、本明細書では出発材料のパーセンテージとして表される。
【0063】
本発明者らは、２Ｌ、１０Ｌ、１００Ｌおよびさらに２０００Ｌの出発材料を使用することによって本発明の方法のスケーラビリティを実証した（実施例を参照のこと）。当業者は、本発明の方法を、必要に応じてさらにスケールアップまたはスケールダウンすることができることを理解するであろう。本明細書で使用される場合、「膜ローディング」は、濾過工程においてロードされる目的のタンパク質の量をフィルター（膜）の面積で割ったものとして定義される。このパラメータは濾過工程のスケールアップおよびスケールダウンのために使用することができ、それによって、スケーリングアプローチは膜ローディングを同一に維持することを含む。
【0064】
本発明は、夾雑物をさらに減少させるために沈殿および洗浄工程を使用する（本発明の工程（ｃ）を参照のこと）。
【0065】
当業者は、沈殿の基礎となる機構に精通しており、その機構は、より具体的には、沈殿薬の添加によって、溶質、すなわち、目的のタンパク質の溶解度を低下させることによって溶媒の溶媒和ポテンシャルを変化させることである。
【0066】
一般に、タンパク質沈殿物の形成（「沈殿」）は段階的なプロセスで発生する。最初に、沈殿剤（「沈殿薬」）を含有する沈殿溶液を加え、溶液を安定に混合する。混合により、沈殿薬およびタンパク質を衝突させる。次に、タンパク質は核形成相に入り、そこで超顕微鏡的サイズのタンパク質凝集体または粒子が生成される。最後の工程の間、タンパク質沈殿粒子は繰り返し衝突し、接着し、次いで、安定な平均タンパク質粒径に達するまでばらばらにされる（「エージング」）。タンパク質粒子の機械的強度は、平均剪断速度と、Ｃａｍｐ数として知られるエージング時間との積と相関する。エージングは、不溶性固体タンパク質粒子（沈殿物）が、サイズを減少させることなく、ポンプおよび遠心分離供給ゾーンにおいて遭遇する流体剪断力に耐えるのに役立つ。
【0067】
本明細書で使用される場合、「沈殿物」とは、標的タンパク質を含む不溶性固体を指す。沈殿物は懸濁物として現れ得る。本明細書で使用される場合、「沈殿薬」とは、固体を液体溶液中で形成させる任意の化学物質を指す。
【0068】
等電沈殿、混和性溶媒による沈殿、非イオン性親水性ポリマーを介する沈殿、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋またはＦｅ２＋のような多価金属イオンを介する沈殿、および塩析を介する沈殿のような、沈殿のための任意の適切な方法、好ましくは塩析を介する沈殿を本発明の方法において使用することができる。
【0069】
本発明のタンパク質は、タンパク質を沈殿させるために使用される最も一般的な方法である塩誘導沈殿（「塩析」）によって沈殿させることができる。中性塩の添加は溶媒和層を圧縮し、タンパク質間相互作用を増加させる。溶液の塩濃度が増加するにつれて、タンパク質の表面上の電荷は水ではなく、塩と相互作用し、それによって、タンパク質表面上の疎水性パッチを露出させ、タンパク質を溶液から抽出させる（凝集および沈殿させる）。好ましい中性塩はコスモトロープまたは「水構造安定剤」であり、これはタンパク質周囲の溶媒和層からの水の散逸／分散を促進する。好ましい中性塩は、（ＰＯ４）３－、（ＳＯ４）２－、ＳＯＯ－、およびＣｌ－と、（ＮＨ４）＋、Ｋ＋、およびＮａ＋との組合せであり、最も好ましくは、塩は（（ＮＨ４）＋）２（ＳＯ４）２－である。
【0070】
本発明のタンパク質はまた、例えば、トリクロロ酢酸を用いた等電沈殿によって沈殿させることもできる。例えば、沈殿は、媒体のｐＨを変化させることによって達成することができる。低いｐＨでは、アミドが余分なプロトンを獲得するので、タンパク質は正味の正電荷を有する。高いｐＨでは、それらは、タンパク質骨格上のカルボキシルがそのプロトンを失うことに起因して、正味の負電荷を有する。それらのｐＩ値では、タンパク質は正味の電荷を有さない。これは、タンパク質が媒体と相互作用することができず、次いで溶液から抽出するので、溶解度の低下をもたらす。トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）は、比較的低い濃度（典型的に約１５％周囲）で大きな結果を見るので、沈殿のために一般に使用される。アセトンのような有機溶媒もまた、多くの場合、ＴＣＡと併用してタンパク質沈殿のために使用することができる。有機溶媒は、有機溶媒の誘電率を低下させ、その結果、溶解性を喪失し、したがって沈殿が生じる。
【0071】
不純物の量をさらに減少させるために、沈殿物を「洗浄溶液」で洗浄することができる。収率を最大にするために、この洗浄工程は、沈殿物が沈殿したままであること、例えば、沈殿物が再懸濁されないか、または実質的に再懸濁されないことのみを必要とする。他方で、洗浄工程は、不純物のようなさらなる化合物を凝集させないことが好ましい。当業者は、例えば、イオン強度、モル濃度などを分析することを含む、この洗浄工程のための適切な洗浄溶液を選択することができる。好ましい洗浄溶液は、例えば、混和性溶媒、非イオン性親水性ポリマー、多価金属イオン、または中性塩、好ましくは中性塩を含む溶液のような沈殿のために使用される溶液と同一または類似である。
【0072】
好ましくは、洗浄溶液は、好ましくは１．６～２．０Ｍの間、さらにより好ましくは１．８Ｍの濃度で、中性塩、より好ましくは（（ＮＨ４）＋）２（ＳＯ４）２－含む。
【0073】
目的のタンパク質のさらなる操作のために、タンパク質を溶解するか、またはタンパク質を溶液に入れることが好ましい。本明細書で使用される場合、「再懸濁」とは、溶質、すなわち、目的のタンパク質を溶媒、すなわち、再懸濁溶液に溶解することを指す。得られた溶液は再懸濁された製品を含む。再び、当業者は、適切な再懸濁溶液およびそれらを適用する方法について完全に精通している。例えば、精製水を添加することによって洗浄工程に使用される洗浄溶液の濃度を低下させると、沈殿したタンパク質を既に溶解させることができる。好ましい実施形態では、例えば、（（ＮＨ４）＋）２（ＳＯ４）２－のような中性塩の濃度は、約０．４Ｍ～約０．８Ｍ、好ましくは約０．６Ｍに低下される。
【0074】
「タンパク質」、「ペプチド」、「タンパク質／ペプチド」、および「ポリペプチド」という用語は、本開示全体を通して交換可能に使用され、各々は本開示の目的のために同じ意味を有する。各用語は、２つまたはそれ以上のアミノ酸の直鎖からなる有機化合物を指す。その化合物は、１０個またはそれ以上のアミノ酸；２５個またはそれ以上のアミノ酸；５０個またはそれ以上のアミノ酸；１００個またはそれ以上のアミノ酸、２００個またはそれ以上のアミノ酸、さらに３００個またはそれ以上のアミノ酸を有することができる。当業者は、ポリペプチドが一般に、タンパク質よりも少ないアミノ酸を含むが、ポリペプチドとタンパク質を区別するアミノ酸の数の当該技術分野で認識されているカットオフポイントは存在しないこと；ポリペプチドは化学合成または組換え方法によって作製することができること；およびタンパク質が一般に、当該技術分野で公知の組換え方法によってｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで作製されることを理解するであろう。本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、天然タンパク質の配列を有する分子、すなわち、天然に存在する、特に非組換え細胞、または遺伝子操作された細胞もしくは組換え細胞によって産生されるタンパク質を指し、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または天然配列の１つもしくはそれ以上のアミノ酸からの欠失、それらへの付加および／もしくはそれらの置換を有する分子を含む。ある特定の態様では、精製されるタンパク質は抗体である。本明細書で意図されるように、「タンパク質」という用語は、「ポリペプチド」、「免疫グロブリン」、「抗体」および「抗体断片」の両方を含む。
【0075】
別段の指示がない限り、「免疫グロブリン」および「免疫グロブリン配列」という用語は、重鎖抗体または従来の４本鎖抗体を指すために本明細書で使用されるかどうかにかかわらず、フルサイズ抗体、その個々の鎖、およびその全ての部分、ドメインまたは断片（限定されないが、それぞれ、ＶＨＨドメインまたはＶＨ／ＶＬドメインのような抗原結合ドメインまたは断片を含む）の両方を含む一般的な用語として使用される。
【0076】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、インタクトな抗体、または特異的結合についてインタクトな抗体と競合するその結合断片を指す。結合断片には、限定されないが、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および一本鎖抗体が含まれる。
【0077】
本明細書で使用される場合、（ポリペプチドまたはタンパク質の）「ドメイン」という用語は、タンパク質の残りとは独立して、その三次構造を保持する能力を有する折り畳まれたタンパク質構造を指す。一般に、ドメインはタンパク質の別個の機能特性に関与し、多くの場合、タンパク質および／またはドメインの残りの機能を失うことなく、他のタンパク質に付加、除去または転移される。
【0078】
本明細書で使用される場合、「免疫グロブリンドメイン」という用語は、抗体鎖の球状領域（例えば、従来の４本鎖抗体または重鎖抗体の鎖など）、またはそのような球状領域から本質的になるポリペプチドを指す。免疫グロブリンドメインは、それらが抗体分子の免疫グロブリン折り畳み特性を保持することを特徴とし、その抗体分子は、場合により、保存されたジスルフィド結合によって安定化された、２つのベータシートとして配置された約７個の逆平行ベータ鎖の２層サンドイッチからなる。
【0079】
本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン可変ドメイン」という用語は、当該技術分野および本明細書以下において、それぞれ、「フレームワーク領域１」または「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」；および「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」と称される４つの「フレームワーク領域」から本質的になる免疫グロブリンドメインを意味し；それらのフレームワーク領域は、当該技術分野および本明細書以下において、それぞれ、「相補性決定領域１」または「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」；および「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」と称される３つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」によって中断される。したがって、免疫グロブリン可変ドメインの一般的な構造または配列は、以下のように示すことができる：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４。それは、抗原結合部位、特にＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を担持することによって、抗原に対する抗体に特異性を付与するＩＳＶＤである。
【0080】
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（「ＩＳＶ」または「ＩＳＶＤ」）という用語は、「単一可変ドメイン」と交換可能に使用され、抗原結合部位が、単一免疫グロブリンドメイン上に存在し、単一免疫グロブリンドメインによって形成される分子を定義する。これは「従来の」免疫グロブリンまたはそれらの断片とは別にＩＳＶを設定し、２つの免疫グロブリンドメイン、特に２つの可変ドメインは相互作用して抗原結合部位を形成する。典型的に、従来の免疫グロブリンにおいて、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は相互作用して抗原結合部位を形成する。この場合、ＶＨおよびＶＬの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）は抗原結合部位に寄与し、すなわち、合計６個のＣＤＲが抗原結合部位形成に関与する。
【0081】
上記の定義を考慮すると、従来の４本鎖抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ分子など；当該技術分野で公知）またはＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド連結ＦｖもしくはｓｃＦｖ断片のようなＦｖ断片、またはこのような従来の４本鎖抗体に由来するダイアボディ（全て、当該技術分野で公知）の抗原結合ドメインは、通常、ＩＳＶとはみなされず、なぜなら、これらの場合、抗原のそれぞれのエピトープへの結合は通常、１つ（単一）の免疫グロブリンドメインによって生じるのではなく、軽鎖および重鎖可変ドメインのような１対の（会合する）免疫グロブリンドメインによって、すなわち、それぞれの抗原のエピトープに一緒に結合する免疫グロブリンドメインのＶＨ－ＶＬ対によって生じるからである。
【0082】
対照的に、ＩＳＶは、さらなる免疫グロブリン可変ドメインと対合することなく、抗原のエピトープに特異的に結合することができる。ＩＳＶの結合部位は、単一ＶＨ、単一ＶＨＨまたは単一ＶＬドメインによって形成される。したがって、ＩＳＶの抗原結合部位は３つ以下のＣＤＲによって形成される。
【0083】
したがって、単一可変ドメインは、単一抗原結合単位（すなわち、単一抗原結合ドメインが機能抗原結合単位を形成するために別の可変ドメインと相互作用する必要がないように、単一可変ドメインから本質的になる機能抗原結合単位）を形成することができる限り；軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ配列）もしくはその適切な断片；または重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列またはＶＨＨ配列）もしくはその適切な断片であってもよい。
【0084】
本発明の一実施形態では、ＩＳＶは重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列）であり；より具体的には、ＩＳＶは、従来の４本鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列または重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列であり得る。
【0085】
例えば、ＩＳＶは、（単一）ドメイン抗体、（単一）ドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸、（単一）ドメイン抗体として使用するのに適した免疫グロブリン、「ｄＡｂ」もしくはｄＡｂ、またはｄＡｂとして使用するのに適したアミノ酸、またはＮａｎｏｂｏｄｙ（本明細書で定義され、限定されないが、ＶＨＨを含む）；ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、親和性成熟によって得られたＶＨＨ配列、他の単一可変ドメイン、免疫グロブリン単一重鎖可変ドメインまたはそれらのいずれか１つの任意の適切な断片であってもよい。
【0086】
特に、ＩＳＶは、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（本明細書で定義される）またはその適切な断片であってもよい。［注記：Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）およびＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）は、Ａｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．の登録商標である。］Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの一般的な説明については、以下のさらなる説明、および例えば、ＷＯ０８／０２００７９（１６ページ）に記載されているような、本明細書に引用される先行技術を参照のこと。
【0087】
ＶＨＨ、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ抗体断片、およびＶＨＨ抗体としても知られる「ＶＨＨドメイン」は、「重鎖抗体」（すなわち、「軽鎖を欠く抗体」；Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６～４４８、１９９３）の抗原結合免疫グロブリン（可変）ドメインとして最初に記載されている。「ＶＨＨドメイン」という用語は、これらの可変ドメインを、従来の４本鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン（本明細書では「ＶＨドメイン」または「ＶＨドメイン」と称する）および従来の４本鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（本明細書では「ＶＬドメイン」または「ＶＬドメイン」と称する）と区別するために選択されている。ＶＨＨおよびＮａｎｏｂｏｄｉｅｓのさらなる説明については、例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓによる総説（Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７４：２７７～３０２、２００１）ならびにＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．によるＷＯ０４／０４１８６７、ＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ０４／０４１８６５、ＷＯ０４／０４１８６３、ＷＯ０４／０６２５５１、ＷＯ０５／０４４８５８、ＷＯ０６／４０１５３、ＷＯ０６／０７９３７２、ＷＯ０６／１２２７８６、ＷＯ０６／１２２７８７およびＷＯ０６／１２２８２５、ならびにＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．によるさらなる公開された特許出願を参照のこと。これらの出願において述べられているさらなる先行技術、特に国際出願ＷＯ０６／０４０１５３の４１～４３ページに述べられている参考文献のリストも参照のこと。それらのリストおよび参考文献は参照によって本明細書に組み入れる。これらの参考文献に記載されているように、ＩＳＶ、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（特に、ＶＨＨ配列および部分的にヒト化されたＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ）は特に、フレームワーク配列の１つまたはそれ以上における１つまたはそれ以上の「ホールマーク残基」の存在によって特徴付けることができる。Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓのヒト化および／またはラクダ化、ならびに他の修飾、部分または断片、誘導体または「Ｎａｎｏｂｏｄｙ融合物」、多価構築物（リンカー配列の一部の非限定的な例を含む）、ならびにＩＳＶ、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓおよびそれらの調製物の半減期を増加させるための異なる修飾を含む、ＩＳＶ、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓのさらなる説明は、例えば、ＷＯ０８／１０１９８５およびＷＯ０８／１４２１６４に見出すことができる。Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓのさらなる一般的な説明については、例えば、ＷＯ０８／０２００７９（１６ページ）に記載されているような、本明細書に引用されている先行技術を参照のこと。
【0088】
「Ｄａｂ」（複数も含む）、「ドメイン抗体」および「ｄＡｂ」としても知られている「ドメイン抗体」（「ドメイン抗体」および「ｄＡｂ」という用語は、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ企業グループによって商標として使用されている）は、例えば、ＥＰ０３６８６８４、Ｗａｒｄら（Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４～５４６、１９８９）、Ｈｏｌｔら（Ｔｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：４８４～４９０、２００３）およびＷＯ０３／００２６０９および例えばＷＯ０４／０６８８２０、ＷＯ０６／０３０２２０、ＷＯ０６／００３３８８ならびにＤｏｍａｎｔｉｓ Ｌｔｄの他の公開特許出願に記載されている。ドメイン抗体は、本質的には、非ラクダ科哺乳動物、特にヒトの４本鎖抗体のＶＨまたはＶＬドメインに対応する。単一抗原結合ドメインとして、すなわち、それぞれＶＬまたはＶＨドメインと対合せずに、エピトープに結合するために、例えば、ヒト単一ＶＨまたはＶＬドメイン配列のライブラリーを使用することによって、このような抗原結合特性についての特異的選択が必要とされる。ドメイン抗体は、ＶＨＨのようにおよそ１３～およそ１６ｋＤａの分子量を有し、完全ヒト配列に由来する場合、例えば、ヒトにおける治療的使用のためにヒト化する必要はない。
【0089】
例えば、限定されないが、１つまたはそれ以上のＩＳＶは、ポリペプチドを製造するための「結合単位」、「結合ドメイン」または「ビルディングブロック」（これらの用語は交換可能に使用される）として使用することができ、それらは場合により、結合単位として機能することができる（すなわち、同じもしくは別のエピトープに対する、および／または１つもしくはそれ以上の他の抗原、タンパク質もしくは標的に対する）１つまたはそれ以上のさらなるＩＳＶを含有することができる。
【0090】
１つより多いＩＳＶを含む多価ポリペプチドを製造するための方法は、本発明の２つまたはそれ以上のＩＳＶおよび例えば１つまたはそれ以上のリンカーを適切な様式で互いに連結する工程を少なくとも含んでもよい。本発明のＩＳＶ（およびリンカー）は、当該技術分野で公知の任意の方法によって、および本明細書にさらに記載されるようにカップリングすることができる。好ましい技法は、本発明のＩＳＶ（およびリンカー）をコードする核酸配列を連結して、多価ポリペプチドを発現する遺伝子構築物を製造することを含む。アミノ酸または核酸を連結するための技法は当業者には明らかであり、上述のＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌらのような標準的なハンドブック、ならびに以下の実施例を再度参照のこと。
【0091】
好ましい実施形態では、目的のタンパク質は、２つまたは３つのような１つまたはそれ以上のＶＨＨを含むポリペプチドである。
【0092】
目的のタンパク質は任意の適切な宿主細胞において発現し、分泌することができる。適切な宿主または宿主細胞は当業者には明らかであり、例えば、任意の適切な真菌、原核もしくは真核細胞もしくは細胞株または任意の適切な真菌、原核もしくは（非ヒト）真核生物、例えば：
－ 限定されないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の株；プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）の株、例えばプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）の株；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の株、例えばシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の株のようなグラム陰性株；ならびにバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の株、例えばバシラス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の株またはバシラス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）の株；ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の株、例えばストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）の株；スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の株、例えばスタフィロコッカス・カルノサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）の株；およびラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）の株、例えばラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）の株のようなグラム陽性株を含む、細菌株；
－ 限定されないが、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の種、例えばトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来；ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）の種、例えばニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）由来；ソルダリア（Ｓｏｒｄａｒｉａ）の種、例えばソルダリア・マクロスポラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）由来；アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来もしくはアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）由来；または他の糸状菌由来の細胞を含む、真菌細胞；
－ 限定されないが、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の種；シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種、例えばシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）の種；ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）の種、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の種またはピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）の種；ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）の種、例えばハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の種；クルイウェロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）の種、例えばクルイウェロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）の種；アルクスラ（Ａｒｘｕｌａ）の種、例えばアルクスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）の種；ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の種、例えばヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の種由来の細胞を含む、酵母細胞；
－ アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞のような両生類細胞または細胞株；
－ 限定されないが、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）ＳＦ９およびＳｆ２１細胞またはシュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）およびＫｃ細胞のようなショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）に由来する細胞／細胞株を含む、鱗翅目に由来する細胞／細胞株のような昆虫由来の細胞または細胞株；
－ 植物または植物細胞、例えばタバコ植物；ならびに／または
－ 哺乳動物細胞または細胞株、例えばヒトに由来する細胞または細胞株、限定されないが、ＣＨＯ細胞（例えばＣＨＯ－Ｋ１細胞）、ＢＨＫ細胞を含む哺乳動物由来の細胞または細胞株、およびＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＣａｋｉおよびＨＥＫ２９３Ｈ細胞のようなヒト細胞または細胞株；
ならびに抗体および抗体断片（限定されないが、（単一）ドメイン抗体およびＳｃＦｖ断片を含む）の発現および産生のためのそれ自体が公知の全ての他の宿主細胞または（非ヒト）宿主であってもよく、これらは当業者には明らかであろう。本明細書上記に引用されている一般的な背景技術、ならびに例えば、ＷＯ９４／２９４５７；ＷＯ９６／３４１０３；ＷＯ９９／４２０７７；Ｆｒｅｎｋｅｎら（Ｒｅｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：５８９～９９、１９９８）；ＲｉｅｃｈｍａｎｎおよびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ（１９９９）、前出；ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８０：２６１～７０、２０００）；Ｊｏｏｓｔｅｎら（Ｍｉｃｒｏｂ． Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．２：１、２００３）；Ｊｏｏｓｔｅｎら（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６６：３８４～９２、２００５）；ならびにそれらに引用されているさらなる参考文献も参照のこと。
－ 限定されないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の株；プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）の株、例えばプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）の株；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の株、例えばシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の株のようなグラム陰性株；ならびにバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の株、例えばバシラス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の株またはバシラス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）の株；ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の株、例えばストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）の株；スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の株、例えばスタフィロコッカス・カルノサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）の株；およびラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）の株、例えばラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）の株のようなグラム陽性株を含む、細菌株；
－ 限定されないが、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の種、例えばトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来；ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）の種、例えばニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）由来；ソルダリア（Ｓｏｒｄａｒｉａ）の種、例えばソルダリア・マクロスポラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）由来；アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来もしくはアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）由来；または他の糸状菌由来の細胞を含む、真菌細胞；
－ 限定されないが、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の種；シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種、例えばシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）の種；ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）の種、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の種またはピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）の種；ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）の種、例えばハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の種；クルイウェロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）の種、例えばクルイウェロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）の種；アルクスラ（Ａｒｘｕｌａ）の種、例えばアルクスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）の種；ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の種、例えばヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の種由来の細胞を含む、酵母細胞；
－ アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞のような両生類細胞または細胞株；
－ 限定されないが、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）ＳＦ９およびＳｆ２１細胞またはシュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）およびＫｃ細胞のようなショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）に由来する細胞／細胞株を含む、鱗翅目に由来する細胞／細胞株のような昆虫由来の細胞または細胞株；
－ 植物または植物細胞、例えばタバコ植物；ならびに／または
－ 哺乳動物細胞または細胞株、例えばヒトに由来する細胞または細胞株、限定されないが、ＣＨＯ細胞（例えばＣＨＯ－Ｋ１細胞）、ＢＨＫ細胞を含む哺乳動物由来の細胞または細胞株、およびＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＣａｋｉおよびＨＥＫ２９３Ｈ細胞のようなヒト細胞または細胞株；
ならびに抗体および抗体断片（限定されないが、（単一）ドメイン抗体およびＳｃＦｖ断片を含む）の発現および産生のためのそれ自体が公知の全ての他の宿主細胞または（非ヒト）宿主であってもよく、これらは当業者には明らかであろう。本明細書上記に引用されている一般的な背景技術、ならびに例えば、ＷＯ９４／２９４５７；ＷＯ９６／３４１０３；ＷＯ９９／４２０７７；Ｆｒｅｎｋｅｎら（Ｒｅｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：５８９～９９、１９９８）；ＲｉｅｃｈｍａｎｎおよびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ（１９９９）、前出；ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８０：２６１～７０、２０００）；Ｊｏｏｓｔｅｎら（Ｍｉｃｒｏｂ． Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．２：１、２００３）；Ｊｏｏｓｔｅｎら（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６６：３８４～９２、２００５）；ならびにそれらに引用されているさらなる参考文献も参照のこと。
【0093】
本発明のタンパク質の発現を産生／得るために、宿主細胞または宿主生物は一般に、本発明の（所望の）ポリペプチドが発現／産生されるような条件下で維持、持続および／または培養される。適切な条件は当業者には明らかであり、通常、使用される宿主細胞／宿主生物、および本発明のタンパク質の発現を制御する調節要素に依存するであろう。
【0094】
溶液からタンパク質を精製するための本発明の方法は、とりわけ、目的のタンパク質が、より大きな不純物から分離され（方法の工程（ａ））、目的のタンパク質が、より小さな不純物から分離される；（方法の工程（ｂ））、種々の濾過工程に依存する。当業者は、タンパク質の公称サイズが、種々の工程において使用される膜のＭＷＣＯの調整を必要とし得ることを理解するであろう。例えば、約１５０ｋＤａのサイズを有するインタクトなＩｇＧ抗体は、１０分の１小さいサイズを有するＶＨＨと異なる第１および第２の膜を必要とし得る。本発明の教示を考慮して、当業者は、目的のタンパク質に応じて膜の孔径を即時に調整することができる。
【0095】
好ましくは、目的のタンパク質は、５０ｋＤａより小さく、例えば、それぞれ、約１３～１６ｋＤａ、２６～３２ｋＤａまたは３９～４８ｋＤａのサイズを有する、１、２または３個のＶＨＨを含むポリペプチド、さらにより好ましくは、約２０ｋＤａまで、より好ましくは約１３～１６ｋＤａのサイズを有する、１個のＶＨＨを含むポリペプチドである。
【0096】
本明細書に開示される方法は溶液からタンパク質を精製することを意図する。本明細書で使用される場合、「精製された」および「精製すること」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質の効果的な使用を可能にする最終的な純度を指す。ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏでの適用において有用なタンパク質に関して、例えば、そのような適用においてそのタンパク質の使用を妨げる可能性があるか、または少なくとも目的のタンパク質と共に含めることが望ましくない、夾雑物、他のタンパク質、宿主細胞、製品関連バリアントおよび／または化学物質のような、不純物を実質的に含むべきではない。そのような適用には、治療用組成物の製造、治療用組成物でのタンパク質の投与、および本明細書に開示される他の方法が含まれる。好ましくは、本明細書で参照される場合、「精製された」タンパク質は、目的のタンパク質が、所与の組成物中に少なくとも約８０％重量／総タンパク質の重量、所与の組成物中に、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９１％、より好ましくは少なくとも約９２％、より好ましくは少なくとも約９３％、より好ましくは少なくとも約９４％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、より好ましくは少なくとも約９７％、より好ましくは少なくとも約９８％、より好ましくは少なくとも約９９％重量／総タンパク質の重量を含むように、不純物または他のタンパク質成分から精製されているタンパク質である。
【0097】
標的タンパク質、およびサンプル中に存在し得る夾雑タンパク質は任意の適切な手段によってモニターすることができる。したがって、純度は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動法）またはクロマトグラフ（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）のような、当該技術分野で公知であるか、または実施例の節に記載される慣例の方法によって決定することができる。タンパク質純度の評価のための方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９～８７（２００７）を参照のこと。好ましくは、技法は、約２百万分率（ｐｐｍ）（精製するタンパク質１ミリグラムあたりのナノグラムとして計算）から５００ｐｐｍの間の範囲で夾雑物を検出するのに十分な感度であるべきである。例えば、当該技術分野で周知の方法である、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、第２のタンパク質によるタンパク質の夾雑を検出することができる。例えば、その全体を参照によって本明細書に組み入れる、Ｒｅｅｎ（１９９４）、Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）、Ｂａｓｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：４６１～４６６を参照のこと。一態様では、そのような他のタンパク質によるタンパク質の夾雑は、本明細書に記載される方法の後に、好ましくは約２分の１以下、より好ましくは約３分の１以下、より好ましくは約５分の１以下、より好ましくは約１０分の１以下、より好ましくは約２０分の１以下、より好ましくは約３０分の１以下、より好ましくは約４０分の１以下、より好ましくは約５０分の１以下、より好ましくは約６０分の１以下、より好ましくは約７０分の１以下、より好ましくは約８０分の１以下、より好ましくは約９０分の１以下、最も好ましくは約１００分の１以下に減少させることができる。
【0098】
別の態様では、本明細書に記載される方法の後のそのような他のタンパク質によるタンパク質の夾雑は、約１０，０００ｐｐｍ以下、好ましくは約２５００ｐｐｍ以下、より好ましくは約４００ｐｐｍ以下、より好ましくは約３６０ｐｐｍ以下、より好ましくは約３２０ｐｐｍ以下、より好ましくは約２８０ｐｐｍ以下、より好ましくは約２５０ｐｐｍ以下である。そのような夾雑は、検出不可能なレベルから約１０ｐｐｍまたは約１０ｐｐｍから約１０，０００ｐｐｍの範囲とすることができる。目的のタンパク質を薬理学的使用のために精製する場合、当業者は、第２の夾雑タンパク質の好ましいレベルは患者あたりに投与される目的のタンパク質の１週間用量に依存する場合があり、患者が１週間あたりにある特定の量を超える夾雑タンパク質を受容しないことを目的とすることを理解するであろう。
【0099】
精製するタンパク質のサンプル中に存在し得るＤＮＡの量は、任意の適切な方法によって決定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を利用したアッセイを使用することができる（実施例の節を参照のこと）。場合により、この技法はタンパク質１ミリグラムあたり１０ピコグラムおよびそれ以上のレベルのＤＮＡ夾雑を検出することができる。ＤＮＡレベルは、ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）によって、場合により約２分の１、好ましくは約５分の１、より好ましくは約１０分の１、より好ましくは約１５分の１、最も好ましくは約２０分の１に減少させることができる。場合により、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーのようなＨＩＣ後のＤＮＡのレベルは、タンパク質１ミリグラムあたり約２０ピコグラム未満、好ましくはタンパク質１ミリグラムあたり１５ピコグラム未満、より好ましくはタンパク質１ミリグラムあたり１０ピコグラム未満、最も好ましくはタンパク質１ミリグラムあたり５ピコグラム未満である。
【0100】
「タンパク質製剤」（本明細書では「製剤」としても示される）という用語は、目的のタンパク質、一次緩衝液および場合により賦形剤を含む最終製品を指定する。治療的使用を意図するタンパク質を指す場合、「原薬」という用語を「タンパク質製剤」の代わりに使用することができ、目的のタンパク質を「有効成分」または「製品」という用語として指定することができる。本明細書で使用される場合、「一次緩衝液」は、賦形剤が添加されるか否かにかかわらず、さらなる処理または使用に適した任意の緩衝液である。一般に、一次緩衝液は５．０～７．５のｐＨを有し、投与に適している。「賦形剤」は、「タンパク質」または「有効成分」ではない、「タンパク質製剤」の構成要素全てによって定義される。賦形剤は典型的に、リオプロテクタント（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）；界面活性剤；充填剤；等張化剤；安定剤；および保存剤を含む。
【0101】
好ましい実施形態では、一次緩衝液には、限定されないが、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、酢酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液および／またはクエン酸緩衝液が含まれ、好ましくはクエン酸緩衝液である。許容される塩には、限定されないが、塩化ナトリウム、塩化アンモニウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、チオシアン酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ならびにそれらのカリウム、マグネシウムおよびカルシウム塩、ならびにそれらの塩の組合せを含むことができる。リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、酢酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液および／またはクエン酸緩衝液の濃度は、約５ｍＭ～約５０ｍＭ、約５ｍＭ～約４０ｍＭ、約５ｍＭ～約３０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、または約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、もしくは約３０ｍＭである。他の実施形態では、製剤中の緩衝液は、約５ｍＭ～約５０ｍＭ未満、約５ｍＭ～約４０ｍＭ未満、約５ｍＭ～約３０ｍＭ未満、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ未満、または約１０ｍＭ未満、約２０ｍＭ未満、もしくは約３０ｍＭ未満の濃度で存在するＴｒｉｓ緩衝液である。製剤の緩衝液のｐＨは一般に約５から７の間である。一部の特定の実施形態では、製剤の緩衝液のｐＨは、約５～約７．５、約５．５～約７．２である。例えば、緩衝液のｐＨは、約５、５．５、５．８～６．１、６、６．１、６．５または７であってもよい。好ましくは、一次緩衝液は、２０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ６．０である。
【0102】
ある特定の実施形態では、タンパク質、例えば、「タンパク質製剤」中に１、２または３個のＶＨＨを含むＮａｎｏｂｏｄｙまたはポリペプチドは、約０．５ｍｇ／ｍＬ～約３５０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ～約２５０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ～約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍｌ～約１３０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍｌ～約１３０ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍＬ、約８８ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍＬまたは約１０ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ、約８０ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１３０ｍｇ／ｍｌ、約１５０ｍｇ／ｍｌ、約２００ｍｇ／ｍｌ、約２５０ｍｇ／ｍｌもしくは約３００ｍｇ／ｍｌの濃度である。
【0103】
他の実施形態では、製剤のリオプロテクタントは、糖、例えば、スクロース、ソルビトールまたはトレハロースである。例えば、リオプロテクタントは、約２．５％～約１０％、約５％～約１０％、約５％～約８％、または約４％、約４．５％、約５％、約５．５％、約６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％もしくは約９％（重量／体積）の濃度のスクロース、ソルビトールまたはトレハロースであってもよい。
【0104】
一部の実施形態では、製剤は、約０．００１％～０．６％、例えば、約０．０１％～０．６％、約０．１％～０．６％、約０．１％～０．５％、約０．１％～０．４％、約０．１％～０．３％、約０．１％～０．２％、または約０．０１％～０．０２％の濃度で界面活性剤を含む。一部の場合、製剤は、０％より大きく約０．６％以下｛例えば、約０．１％～０．２％｝のポリソルベート－２０、ポリソルベート－４０、ポリソルベート－６０、ポリソルベート－６５、ポリソルベート－８０、ポリソルベート－８５、ポロキサマー－１８８、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリラウレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタントリオレエート、またはそれらの組合せを含有する。特定の実施形態では、製剤は、約０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．００９％、０．０１％～０．０２％、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１％～０．２％、０．１１％、０．１２％、０．１３％、０．１４％、０．１５％、０．１６％、０．１７％、０．１８％、０．１９％または０．２％のポリソルベート－８０を含有する。あるいは、製剤は、約０．０１％～０．６％、約０．１％～０．６％、約０．１％～０．５％、約０．１％～０．４％、約０．１％～０．３％、または約０．１％～０．２％でポロキサマー－１８８を含んでもよい。
【0105】
ある特定の実施形態では、製剤は、約１０～約２００ｍＭ、約２５～約１７５ｍＭ、約５０～約１５０ｍＭ、約７５～約１２５ｍＭ、または約１００ｍＭの濃度で充填剤、例えば、グリシンを含む。
【0106】
他の実施形態では、製剤は、等張化剤、例えば、製剤をヒト血液と実質的に等張または等浸透圧にする分子をさらに含む。例示的な等張化剤には、スクロース、ソルビトール、グリシン、メチオニン、マンニトール、デキストロース、イノシトール、塩化ナトリウム、アルギニンおよび塩酸アルギニンが含まれる。
【0107】
さらに他の実施形態では、製剤は、安定剤、例えば、目的のタンパク質と組み合わせると、凍結乾燥、液体または保存形態で目的のタンパク質の化学的および／または物理的不安定性を実質的に阻止または減少させる分子をさらに含む。例示的な安定剤には、スクロース、ソルビトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニンおよび塩酸アルギニンが含まれる。ある特定の実施形態では、製剤は、以下の範囲：約１％～約１２％（例えば、約５％、約７．５％、約８％または約１０％）のスクロース；約１％～約７％（例えば、約３％、約４％、約５％）のソルビトール；約１％～約５％のイノシトール；約１０ｍＭ～約１２５ｍＭ（例えば、約２５ｍＭ～１００ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭまたは約１００ｍＭ）のグリシン；約１０ｍＭ～１５０ｍＭ（例えば、約２５ｍＭ～１００ｍＭ、約５５ｍＭ）の塩化ナトリウム；約１０ｍＭ～約１００ｍＭ（例えば、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約１００ｍＭ）のメチオニン；約１０ｍＭ～約１２５ｍＭ（例えば、約２５ｍＭ～約１２０ｍＭまたは約１００ｍＭ）のアルギニン；約１０ｍＭ～約７０ｍＭ（例えば、約１０ｍＭ～約６５ｍＭまたは約５５ｍＭ）の塩酸アルギニンのうちの１つまたはそれ以上で安定剤を含む。
【0108】
他の実施形態では、製剤は、約１０～約２００ｍＭ、約２５～約１７５ｍＭ、約５０～約１５０ｍＭ、約７５～約１２５ｍＭまたは約１００ｍＭの濃度でメチオニンをさらに含んでもよい。
【0109】
一実施形態では、製剤の成分は、リオプロテクタント、等張化剤および／または安定剤のうちの１つまたはそれ以上として機能することができる。例えば、成分、例えば、スクロースの濃度に応じて、それは、リオプロテクタント、等張化剤および／または安定剤のうちの１つまたはそれ以上として役立つことができる。他の実施形態では、成分のいくつかが製剤中に必要とされる場合、異なる成分が使用される。例えば、製剤が、リオプロテクタント、等張化剤および安定剤を必要とする場合、異なる成分が使用される（例えば、スクロース、グリシンおよびイノシトールを組み合わせて使用して、それぞれ、リオプロテクタント、等張化剤および安定化剤の組合せをもたらすことができる）。
【0110】
好ましくは、タンパク質製剤は安定である。「安定な」製剤は、その中のタンパク質が、保存時にその物理的および化学的安定性ならびに完全性を本質的に保持する製剤である。タンパク質安定性を測定するための種々の分析技術が当該技術分野で利用可能であり、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２４７～３０１、Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、Ｐｕｂｓ．（１９９１）、およびＪｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９～９０（１９９３）において概説されている。安定性は、選択した期間、選択した温度で測定することができる。迅速なスクリーニングのために、製剤は、２週間～１ヵ月間、４０℃で維持することができ、その時に安定性が測定される。製剤が２～８℃で保存される場合、一般に、製剤は、少なくとも１ヵ月間、３０℃もしくは４０℃で安定であるべきであるか、および／または少なくとも２年間、２～８℃で安定であるべきである。他の実施形態では、タンパク質製剤の安定性は、生物活性アッセイを使用して測定することができる。
【0111】
本発明のプロセスは、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または任意の他の一般的に使用されるタンパク質精製技術のような、他のタンパク質精製方法と組み合わせて使用することができる。しかしながら、本発明のプロセスは、他の精製工程についての必要性を取り除くか、またはかなり減少させることが企図される。
【0112】
特定の実施形態では、本発明は、溶液からタンパク質を精製するための方法であって：
（ａ）第１の濾過工程と；
（ｂ）第２の濾過工程と；
（ｃ）沈殿、洗浄および再懸濁工程と；
（ｄ）限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）工程と；
（ｅ）場合により、製剤化および最終濾過工程と
を含み、前記タンパク質は５ｋＤａ～２００ｋＤａの間の分子量（ＭＷ）を有し、好ましくは前記タンパク質は、１０ｋＤａから１５０ｋＤａの間、好ましくは１２ｋＤａから１００ｋＤａの間、さらにより好ましくは約１２～１５ｋＤａのような１２から３０ｋＤａの間のような１２から４５ｋＤａの間、２４～３０ｋＤａ、３６～４５ｋＤａまたは約２０ｋＤａのＭＷを有する、方法に関する。
（ａ）第１の濾過工程と；
（ｂ）第２の濾過工程と；
（ｃ）沈殿、洗浄および再懸濁工程と；
（ｄ）限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）工程と；
（ｅ）場合により、製剤化および最終濾過工程と
を含み、前記タンパク質は５ｋＤａ～２００ｋＤａの間の分子量（ＭＷ）を有し、好ましくは前記タンパク質は、１０ｋＤａから１５０ｋＤａの間、好ましくは１２ｋＤａから１００ｋＤａの間、さらにより好ましくは約１２～１５ｋＤａのような１２から３０ｋＤａの間のような１２から４５ｋＤａの間、２４～３０ｋＤａ、３６～４５ｋＤａまたは約２０ｋＤａのＭＷを有する、方法に関する。
【0113】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記第１の濾過工程（ａ）は：（ｉ）前記溶液を第１の膜に通して、前記タンパク質を含む第１の透過液を得る工程と；（ｉｉ）場合により、前記タンパク質を含む第１の透過液を濾過する工程であって、好ましくは前記第１の膜は、４０ｋＤａから１００ｋＤａの間、好ましくは４０ｋＤａから８０ｋＤａの間、さらにより好ましくは５０ｋＤａの公称分画分子量（ＮＭＷＣＯ）の孔径を有する、第１の透過液を濾過する工程とを含む、方法に関する。第１の濾過工程において、第１の膜のＮＭＷＣＯは、精製するタンパク質の公称分子量（ＮＭＷ）より大きいことは理解されるであろう。
【0114】
目的のタンパク質を含む溶液は、第１の濾過工程に適用される場合、４～１５ｇ／Ｌのような好ましくは３～２０ｇ／Ｌ細胞培養液、または５～１２ｇ／Ｌもしくは６～１０ｇ／Ｌ、または７ｇ／Ｌもしくは８ｇ／Ｌもしくは９ｇ／Ｌの細胞培養液である。
【0115】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記第１の膜は、再生セルロース、ポリプロピレン、酢酸セルロース、ポリ乳酸、セラミック、ポリエーテル－スルホン、修飾ポリエーテル－スルホン（ｍＰＥＳ）、ポリアリールスルホン、ポリスルホン、ポリイミド、ポリアミド、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）を含む、方法に関する。
【0116】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記第１の濾過工程は、好ましくは、２または３透析濾過体積（ＤＶ）のような２～４ＤＶの間で濾過することを含む、好ましくは、０．５～１．５ｂａｒ、０．７５～１．２５ｂａｒまたは約１．０ｂａｒのような０．２５～１．７５ｂａｒの間の膜間圧（ＴＭＰ）で、好ましくは精製水を使用して、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）またはノーマルフロー濾過（ＮＦＦ）、好ましくはＴＦＦによって行われる、方法に関する。
【0117】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、６０％～１００％の間、またはさらに８０％～１００％の間のような、前記タンパク質の５０％～１００％の間が第１の透過液中に回収される、方法に関する。
【0118】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記タンパク質を含む前記第１の透過液は、前記溶液より８５％少ない不純物のような、前記溶液より２０％～１００％、３０％～１００％、４０％～１００％、５０％～１００％、６０％～１００％、７０％～１００％またはさらに８０％～１００％少ない不純物のような、前記溶液より１０％～１００％少ない不純物を含む、方法に関する。
【0119】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記タンパク質は、前記溶液と比較して前記第１の透過液中に２０％～１００％、３０％～１００％、４０％～１００％、５０％～１００％、６０％～１００％、７０％～１００％またはさらに８０％～１００％の間のような１０％～１００％の間で精製される、方法に関する。
【0120】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記タンパク質を含む前記第１の透過液は、好ましくは、１５００Ｌ／ｍ２のような１０００Ｌ～２０００Ｌの間の第１の透過液体積／ｍ２で０．２μｍフィルターを通して濾過され、場合により、７２時間まで、室温（ＲＴ）で保存される、方法に関する。
【0121】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記第１の濾過工程（ａ）は：（ｉ）精製水を使用して約１ｂａｒのＴＭＰにてＴＦＦにより２ＤＶで前記溶液を第１の膜に通し、前記第１の膜は約５０ｋＤａのＮＭＷＣＯの孔径を有し、ｍＰＥＳから作製され；前記タンパク質を含む第１の透過液を得る工程と；（ｉｉ）場合により、約１５００Ｌの第１の透過液体積／ｍ２で、０．２μｍフィルターを通して前記タンパク質を含む第１の透過液を濾過する工程とを含む、方法に関する。
【0122】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記第２の濾過工程（ｂ）は：（ｉ）第２の膜を使用して工程（ａ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第１の透過液を濃縮して、前記タンパク質を含む第１の保持液を得る工程と；（ｉｉ）場合により、前記タンパク質を含む第１の保持液を濾過する工程であって、好ましくは前記第２の膜は、４ｋＤａから４０ｋＤａの間、６ｋＤａから３０ｋＤａの間、８ｋＤａから２０ｋＤａの間のような２ｋＤａから５０ｋＤａの間、より好ましくは１０ｋＤａまたは１５ｋＤａの公称分画分子量（ＮＭＷＣＯ）の孔径を有する、第１の保持液を濾過する工程とを含む、方法に関する。第２の濾過工程において、第２の膜のＮＭＷＣＯは精製するタンパク質のＮＭＷより小さいことは理解されるであろう。
【0123】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記第２の膜は、再生セルロース、ポリプロピレン、酢酸セルロース、ポリ乳酸、セラミック、ポリエーテル－スルホン、修飾ポリエーテル－スルホン（ｍＰＥＳ）、ポリアリールスルホン、ポリスルホン、ポリイミド、ポリアミド、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）を含む、方法に関する。
【0124】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記第２の濾過工程は、好ましくは、１．０～１．５ｂａｒのような０．７５～１．７５ｂａｒの間または約１．２５ｂａｒの膜間圧（ＴＭＰ）で、好ましくは精製水を使用してＴＦＦまたはＮＦＦ、好ましくはＴＦＦによって行われる、方法に関する。
【0125】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記第１の保持液中のタンパク質は、７５～１７５ｍｇ／ｍｌのような５０～２００ｍｇ／ｍｌの間、または約１２０～１２５ｍｇ／ｍｌのような１００～１５０ｍｇ／ｍｌの間の濃度に濃縮される、方法に関する。
【0126】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、６０％～１００％の間、またはさらに８０％～１００％の間のような、前記タンパク質の５０％～１００％の間が第１の保持液中に回収される、方法に関する。
【0127】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記タンパク質を含む前記第１の保持液は、前記タンパク質を含む前記第１の透過液より２０％～１００％、３０％～１００％、４０％～１００％、５０％～１００％、６０％～１００％、７０％～１００％、またはさらに８０％～１００％少ない不純物のような、前記タンパク質を含む前記１の透過液より１０％～１００％少ない不純物を含む、方法に関する。
【0128】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記タンパク質は、前記第１の透過液中のタンパク質と比較して前記第１の保持液中に２０％～１００％、３０％～１００％、４０％～１００％、５０％～１００％、６０％～１００％、７０％～１００％のような１０％～１００％の間、またはさらに８０％～１００％の間で精製される、方法に関する。
【0129】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記タンパク質を含む前記第１の保持液は、好ましくは、１０～７５ｋｇタンパク質／ｍ２の間、約２５ｋｇ／ｍ２のような１５～５０ｋｇ／ｍ２で、０．２μｍフィルターを通して濾過され、場合により、７２時間まで室温（ＲＴ）で保存される、方法に関する。
【0130】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記第２の濾過工程（ｂ）は：（ｉ）工程（ａ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第１の透過液を、精製水を用いて約１．２５ｂａｒでＴＦＦにより第２の膜を使用して約１２０～１２５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、前記第２の膜は約１０ｋＤａのＮＭＷＣＯの孔径を有し、ｍＰＥＳから作製され、前記タンパク質を含む第１の保持液を得る工程と；（ｉｉ）場合により、約２５ｋｇタンパク質／ｍ２で０．２μｍフィルターを通して前記タンパク質を含む第１の保持液を濾過する工程とを含む、方法に関する。
【0131】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記沈殿、洗浄および再懸濁工程（ｃ）は：
（ｉ）前記タンパク質を含む沈殿物が形成されるまで、工程（ｂ）の終わりに得られた前記第１の保持液中に前記タンパク質を沈殿させる工程と；
（ｉｉ）前記タンパク質を含む前記沈殿物を洗浄する工程と；
（ｉｉｉ）工程（ｃ）（ｉｉ）の終わりに得られた洗浄した沈殿物を再懸濁して、前記タンパク質を含む第２の保持液を得る工程と；
（ｉｖ）場合により、第３の膜を通して工程（ｃ）（ｉｉｉ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第２の保持液を濾過して、前記タンパク質を含む第２の透過液を得る工程と；
（ｖ）場合により、前記タンパク質を含む第２の透過液を濾過する工程と
を含む、方法に関する。
（ｉ）前記タンパク質を含む沈殿物が形成されるまで、工程（ｂ）の終わりに得られた前記第１の保持液中に前記タンパク質を沈殿させる工程と；
（ｉｉ）前記タンパク質を含む前記沈殿物を洗浄する工程と；
（ｉｉｉ）工程（ｃ）（ｉｉ）の終わりに得られた洗浄した沈殿物を再懸濁して、前記タンパク質を含む第２の保持液を得る工程と；
（ｉｖ）場合により、第３の膜を通して工程（ｃ）（ｉｉｉ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第２の保持液を濾過して、前記タンパク質を含む第２の透過液を得る工程と；
（ｖ）場合により、前記タンパク質を含む第２の透過液を濾過する工程と
を含む、方法に関する。
【0132】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記沈殿させる工程（ｃ）（ｉ）、および／または前記洗浄する工程（ｃ）（ｉｉ）、および／または前記再懸濁する工程（ｃ）（ｉｉｉ）、および／または前記濾過する工程（ｃ）（ｉｖ）は、ＴＦＦデバイスにおいて行われ、好ましくは全ての工程（ｃ）（ｉ）、（ｃ）（ｉｉ）、（ｃ）（ｉｉｉ）および（ｃ）（ｉｖ）は、１つおよび同じデバイスにおいて行われ、前記ＴＦＦデバイスおよび前記ＮＦＦデバイスは前記第３の膜を含み、好ましくは第３の膜は、再生セルロース、ポリプロピレン、酢酸セルロース、ポリ乳酸、セラミック、ポリエーテル－スルホン、ｍＰＥＳ、ポリアリールスルホン、ポリスルホン、ポリイミド、ポリアミド、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）を含み、より好ましくは前記第３の膜は、０．１～０．３μｍのような０．０５～０．３５μｍの間、または０．２μｍのような０．１５～０．２５μｍの間、好ましくは１０～７５ｋｇタンパク質／ｍ２の間、約２０または２５ｋｇ／ｍ２のような１５～５０ｋｇ／ｍ２の孔径を有する、方法に関する。
【0133】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記沈殿させる工程は、混和性溶媒、非イオン性親水性ポリマー、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋またはＦｅ２＋のような多価金属イオン、および中性塩、好ましくはコスモトロープ、最も好ましくは（（ＮＨ４）＋）２（ＳＯ４）２－からなる群から選択される沈殿剤を含む沈殿溶液によって行われ、好ましくは前記沈殿させる工程は、１．６～２．０Ｍのような１．４～２．２Ｍ、好ましくは約１．８Ｍの（（ＮＨ４）＋）２（ＳＯ４）２－で行われる、方法に関する。
【0134】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記沈殿させる工程は、沈殿物が形成されるまで、工程（ｂ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第１の保持液を溶液と混合することによって行われ、好ましくは前記溶液は前記第１の保持液に徐々に添加され、より好ましくは前記溶液は撹拌することによって前記第１の保持液と混合され、より好ましくは前記溶液は、３．０～３．２Ｍのような２．８～３．４Ｍの間、好ましくは約３．１Ｍの（（ＮＨ４）＋）２（ＳＯ４）２－を含む、方法に関する。
【0135】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、沈殿物は、２５～７０ｍｇ／ｍｌのような２０～８０ｍｇ／ｍｌの間、または約５０ｍｇ／ｍｌのような３０～６０ｍｇ／ｍｌの間の濃度を有する、方法に関する。
【0136】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、工程（ｃ）（ｉｉ）の前記タンパク質を含む前記沈殿物の洗浄は、沈殿溶液を洗浄溶液と置き換えることを含み、好ましくは４～６ＤＶのような２～８ＤＶ、または５ＤＶの洗浄溶液を用いて前記沈殿物を洗浄することを含む、方法に関する。
【0137】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記洗浄する工程（ｃ）（ｉｉ）は、０．２～１．０ｂａｒ、０．３～０．７５ｂａｒまたは約０．５ｂａｒのような０．１～１．５ｂａｒの間の膜間圧（ＴＭＰ）で行われる、方法に関する。
【0138】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記洗浄溶液は、１．６～２．０Ｍのような１．４～２．２Ｍの間、好ましくは約１．８Ｍの濃度で沈殿剤を含み、好ましくは前記沈殿剤は（（ＮＨ４）＋）２（ＳＯ４）２－であり、より好ましくは前記洗浄溶液は１．８Ｍの（（ＮＨ４）＋）２（ＳＯ４）２－である、方法に関する。
【0139】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、工程（ｃ）（ｉｉ）の終わりに得られた洗浄した沈殿物は、０．７～０．５Ｍのような０．８～０．４Ｍの間、好ましくは約０．６Ｍの濃度で沈殿剤を含む再懸濁溶液中で再懸濁され、好ましくは前記沈殿剤は（（ＮＨ４）＋）２（ＳＯ４）２－であり、より好ましくは前記再懸濁溶液は０．６Ｍの（（ＮＨ４）＋）２（ＳＯ４）２－である、方法に関する。
【0140】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、６０％～１００％の間、またはさらに８０％～１００％の間のような、前記タンパク質の５０％～１００％の間が第２の透過液中に回収される、方法に関する。
【0141】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記タンパク質を含む前記第２の透過液は、前記第１の保持液より２０％～１００％、３０％～１００％、４０％～１００％、５０％～１００％、６０％～１００％、７０％～１００％、またはさらに８０％～１００％少ない不純物のような、前記第１の保持液より１０％～１００％少ない不純物を含む、方法に関する。
【0142】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記タンパク質は、前記第１の保持液と比較して前記第２の透過液中に２０％～１００％、３０％～１００％、４０％～１００％、５０％～１００％、６０％～１００％、７０％～１００％のような１０％～１００％の間、またはさらに８０％～１００％の間で精製される、方法に関する。
【0143】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記沈殿、洗浄および再懸濁工程（ｃ）は、約２０～２５ｋｇ／ｍ２の孔径を有するｍＰＥＳを含む第３の膜を含むＴＦＦデバイスにおいて行われ、前記方法は：
（ｉ）前記タンパク質を含む沈殿物が形成されるまで、工程（ｂ）の終わりに得られた前記第１の保持液中に前記タンパク質を沈殿させる工程であって；前記沈殿させる工程は、沈殿物が形成されるまで、工程（ｂ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第１の保持液を３．１Ｍの（（ＮＨ４）＋）２（ＳＯ４）２－と混合することによって行われ、前記（（ＮＨ４）＋）２（ＳＯ４）２－は前記第１の保持液に徐々に添加され、約１．８Ｍの（（ＮＨ４）＋）２（ＳＯ４）２－および５０ｍｇ／ｍｌのタンパク質の最終濃度が得られるまで、撹拌することによって前記第１の保持液と混合される、沈殿させる工程と；
（ｉｉ）約０．５ｂａｒのＴＭＰで約１．８Ｍの（（ＮＨ４）＋）２（ＳＯ４）２－を含む５ＤＶの洗浄溶液を用いて前記タンパク質を含む前記沈殿物を洗浄する工程と；
（ｉｉｉ）約０．６Ｍの（（ＮＨ４）＋）２（ＳＯ４）２－の最終濃度（再懸濁溶液）まで精製水を添加することによって工程（ｃ）（ｉｉ）の終わりに得られた洗浄した沈殿物を再懸濁して、前記タンパク質を含む第２の保持液を得る工程と；
（ｉｖ）場合により、前記第３の膜を通して工程（ｃ）（ｉｉｉ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第２の保持液を濾過して、前記タンパク質を含む第２の透過液を得る工程と
を含む、方法に関する。
（ｉ）前記タンパク質を含む沈殿物が形成されるまで、工程（ｂ）の終わりに得られた前記第１の保持液中に前記タンパク質を沈殿させる工程であって；前記沈殿させる工程は、沈殿物が形成されるまで、工程（ｂ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第１の保持液を３．１Ｍの（（ＮＨ４）＋）２（ＳＯ４）２－と混合することによって行われ、前記（（ＮＨ４）＋）２（ＳＯ４）２－は前記第１の保持液に徐々に添加され、約１．８Ｍの（（ＮＨ４）＋）２（ＳＯ４）２－および５０ｍｇ／ｍｌのタンパク質の最終濃度が得られるまで、撹拌することによって前記第１の保持液と混合される、沈殿させる工程と；
（ｉｉ）約０．５ｂａｒのＴＭＰで約１．８Ｍの（（ＮＨ４）＋）２（ＳＯ４）２－を含む５ＤＶの洗浄溶液を用いて前記タンパク質を含む前記沈殿物を洗浄する工程と；
（ｉｉｉ）約０．６Ｍの（（ＮＨ４）＋）２（ＳＯ４）２－の最終濃度（再懸濁溶液）まで精製水を添加することによって工程（ｃ）（ｉｉ）の終わりに得られた洗浄した沈殿物を再懸濁して、前記タンパク質を含む第２の保持液を得る工程と；
（ｉｖ）場合により、前記第３の膜を通して工程（ｃ）（ｉｉｉ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第２の保持液を濾過して、前記タンパク質を含む第２の透過液を得る工程と
を含む、方法に関する。
【0144】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記（ｄ）限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）工程は：
（ｉ）工程（ｃ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第２の透過液を透析濾過して、前記タンパク質を含む第１の透析濾過液を得る工程と；
（ｉｉ）工程（ｄ）（ｉ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第１の透析濾過液を濃縮して、前記タンパク質を含む第３の保持液を得る工程と；
（ｉｉｉ）工程（ｄ）（ｉｉ）の前記タンパク質を含む第３の保持液を透析濾過して、前記タンパク質を含む第２の透析濾過液を得る工程と；
（ｉｖ）場合により、前記タンパク質を含む前記第２の透析濾過液を濾過する工程と
を含む、方法に関する。
（ｉ）工程（ｃ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第２の透過液を透析濾過して、前記タンパク質を含む第１の透析濾過液を得る工程と；
（ｉｉ）工程（ｄ）（ｉ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第１の透析濾過液を濃縮して、前記タンパク質を含む第３の保持液を得る工程と；
（ｉｉｉ）工程（ｄ）（ｉｉ）の前記タンパク質を含む第３の保持液を透析濾過して、前記タンパク質を含む第２の透析濾過液を得る工程と；
（ｉｖ）場合により、前記タンパク質を含む前記第２の透析濾過液を濾過する工程と
を含む、方法に関する。
【0145】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記透析濾過する工程（ｄ）（ｉ）、および／または濃縮する工程（ｄ）（ｉｉ）、および／または前記透析濾過する工程（ｄ）（ｉｉｉ）はＴＦＦデバイスにおいて行われ、好ましくは全ての工程（ｄ）（ｉ）、（ｄ）（ｉｉ）および（ｄ）（ｉｉｉ）は１つおよび同じデバイスにおいて行われ、前記ＴＦＦデバイスおよび前記ＮＦＦデバイスは、第４の（ＵＦ）膜を含み、好ましくは前記透析濾過する工程（ｄ）（ｉ）、および／または濃縮する工程（ｄ）（ｉｉ）、および／または前記透析濾過する工程（ｄ）（ｉｉｉ）は、好ましくは、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、酢酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液のような一次緩衝液を用いて１．０～１．５ｂａｒのような０．７５～１．７５ｂａｒの間、または約１．２ｂａｒの膜間圧（ＴＭＰ）で行われ、好ましくは、一次緩衝液のｐＨは、約５、５．５、５．８～６．１、６、６．１、６．５または７のｐＨのような、約５～約７．５、約５．５～約７．２であり、好ましくは、一次緩衝液の濃度は、約５ｍＭ～約５０ｍＭ、約５ｍＭ～約４０ｍＭ、約５ｍＭ～約３０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、または約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、もしくは約３０ｍＭである、方法に関する。他の実施形態では、製剤中の緩衝液は、約５ｍＭ～約５０ｍＭ未満、約５ｍＭ～約４０ｍＭ未満、約５ｍＭ～約３０ｍＭ未満、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ未満、または約１０ｍＭ未満、約２０ｍＭ未満、もしくは約３０ｍＭ未満の濃度で存在するＴｒｉｓ緩衝液であり、より好ましくは、一次緩衝液は２０ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ６．０である。
【0146】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記第４の（ＵＦ）膜は、再生セルロース、ポリプロピレン、酢酸セルロース、ポリ乳酸、セラミック、ポリエーテル－スルホン、ポリアリールスルホン、ポリスルホン、ｍＰＥＳ、ポリイミド、ポリアミド、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）を含み、より好ましくは、前記第４の（ＵＦ）膜は、４ｋＤａから４０ｋＤａの間、６ｋＤａから３０ｋＤａの間、８ｋＤａから２０ｋＤａの間のような２ｋＤａから５０ｋＤａの間、より好ましくは１０ｋＤａまたは１５ｋＤａの公称分画分子量（ＮＭＷＣＯ）の孔径を有する、方法に関する。ＵＦ／ＤＦ工程において、第４の（ＵＦ）膜のＮＭＷＣＯは精製するタンパク質のＮＭＷより小さいことは理解されるであろう。
【0147】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、工程（ｃ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第２の透過液は、好ましくは一次緩衝液を用いて１透析濾過体積（ＤＶ）のような１～４ＤＶの間で透析濾過される、方法に関する。
【0148】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記濃縮する工程（ｄ）（ｉｉ）は、工程（ｄ）（ｉ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む前記第１の透析濾過液を、前記一次緩衝液中で２５～８０ｍｇ／ｍｌのような１０～１００ｍｇ／ｍｌの間、または約５０ｍｇ／ｍｌもしくは５５ｍｇ／ｍｌのような４０～６０ｍｇ／ｍｌの間の濃度で前記タンパク質を含む第３の保持液に濃縮することを含む、方法に関する。
【0149】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、工程（ｄ）（ｉｉ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第３の保持液は、好ましくは前記一次緩衝液を用いて、３～６のような１～８透析濾過体積（ＤＶ）、または４ＤＶもしくは５ＤＶで透析濾過される、方法に関する。
【0150】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記タンパク質を含む第３の保持液と比較して、６０％～１００％の間、またはさらに８０％～１００％の間、好ましくは、９５％超のような９０％超のような、前記タンパク質の５０％～１００％の間が前記第２の透析濾過液中に回収される、方法に関する。
【0151】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記タンパク質を含む前記第２の透析濾過液は、好ましくは、１５～６０ｋｇ／ｍ２、２０～５０ｋｇ／ｍ２のような１０～７５ｋｇ／ｍ２の間、または約３０ｋｇ／ｍ２もしくは４０ｋｇ／ｍ２で０．２μｍフィルターを通して濾過され、場合により、７２時間まで室温（ＲＴ）で保存される、方法に関する。
【0152】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記ＵＦ／ＤＦ工程（ｄ）は、一次緩衝液を用いて約１．２ｂａｒのＴＭＰにて約１０ｋＤａのＮＭＷＣＯでｍＰＥＳを含む第４の（ＵＦ）膜を含むＴＦＦデバイスにおいて行われ、
（ｉ）１ＤＶの一次緩衝液を用いて、工程（ｃ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第２の透過液を透析濾過して、前記タンパク質を含む第１の透析濾過液を得；
（ｉｉ）前記一次緩衝液中で約５０～５５ｍｇ／ｍｌまで、工程（ｄ）（ｉ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第１の透析濾過液を濃縮して、前記タンパク質を含む第３の保持液を得；
（ｉｉｉ）４または５ＤＶの一次緩衝液を用いて工程（ｄ）（ｉｉ）の前記タンパク質を含む第３の保持液を透析濾過して、前記タンパク質を含む第２の透析濾過液を得；
（ｉｖ）場合により、約３０～４０ｋｇ／ｍ２で０．２μｍフィルターを通して前記タンパク質を含む前記第２の透析濾過液を濾過する、方法に関する。
（ｉ）１ＤＶの一次緩衝液を用いて、工程（ｃ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第２の透過液を透析濾過して、前記タンパク質を含む第１の透析濾過液を得；
（ｉｉ）前記一次緩衝液中で約５０～５５ｍｇ／ｍｌまで、工程（ｄ）（ｉ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む第１の透析濾過液を濃縮して、前記タンパク質を含む第３の保持液を得；
（ｉｉｉ）４または５ＤＶの一次緩衝液を用いて工程（ｄ）（ｉｉ）の前記タンパク質を含む第３の保持液を透析濾過して、前記タンパク質を含む第２の透析濾過液を得；
（ｉｖ）場合により、約３０～４０ｋｇ／ｍ２で０．２μｍフィルターを通して前記タンパク質を含む前記第２の透析濾過液を濾過する、方法に関する。
【0153】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記製剤および最終濾過工程（ｅ）は：
（ｉ）工程（ｄ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む前記第２の透析濾過液を製剤化して、タンパク質製剤を得る工程と；
（ｉｉ）場合により、タンパク質製剤を濾過する工程と
を含む、方法に関する。
（ｉ）工程（ｄ）の終わりに得られた前記タンパク質を含む前記第２の透析濾過液を製剤化して、タンパク質製剤を得る工程と；
（ｉｉ）場合により、タンパク質製剤を濾過する工程と
を含む、方法に関する。
【0154】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記製剤化する工程（ｅ）（ｉ）は、前記タンパク質を含む前記第２の透析濾過液に賦形剤を添加する工程を含む、方法に関する。
【0155】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記賦形剤は、リオプロテクタント、界面活性剤、充填剤、等張化剤、安定剤および保存剤から選択される、方法に関する。
【0156】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記タンパク質製剤は、
－ ２５～８０ｍｇ／ｍｌのような１０～１００ｍｇ／ｍｌ、または約５０ｍｇ／ｍｌもしくは５５ｍｇ／ｍｌタンパク質のような４０～６０ｍｇ／ｍｌの間の濃度のタンパク質と；
－ リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、酢酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液のような一次緩衝液であって、好ましくは一次緩衝液のｐＨは約５～約７．５であり、好ましくは一次緩衝液の濃度は約５ｍＭ～約５０ｍＭであり、より好ましくは一次緩衝液は２０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ６．０である、一次緩衝液と；
－ 場合により、約１～１２％の、スクロース、ソルビトール、マンニトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニンおよび塩酸アルギニンからなる群から選択される安定剤であって、好ましくはマンニトール、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌである、安定剤と；
－ 場合により、ポリソルベート－２０、ポリソルベート－４０、ポリソルベート－６０、ポリソルベート－６５、ポリソルベート－８０、ポリソルベート－８５、ポロキサマー－１８８、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリラウレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタントリオレエートからなる群から選択される、約０．００１％～０．６％の濃度の界面活性剤と
を含む、方法に関する。
－ ２５～８０ｍｇ／ｍｌのような１０～１００ｍｇ／ｍｌ、または約５０ｍｇ／ｍｌもしくは５５ｍｇ／ｍｌタンパク質のような４０～６０ｍｇ／ｍｌの間の濃度のタンパク質と；
－ リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、酢酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液のような一次緩衝液であって、好ましくは一次緩衝液のｐＨは約５～約７．５であり、好ましくは一次緩衝液の濃度は約５ｍＭ～約５０ｍＭであり、より好ましくは一次緩衝液は２０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ６．０である、一次緩衝液と；
－ 場合により、約１～１２％の、スクロース、ソルビトール、マンニトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニンおよび塩酸アルギニンからなる群から選択される安定剤であって、好ましくはマンニトール、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌである、安定剤と；
－ 場合により、ポリソルベート－２０、ポリソルベート－４０、ポリソルベート－６０、ポリソルベート－６５、ポリソルベート－８０、ポリソルベート－８５、ポロキサマー－１８８、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリラウレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタントリオレエートからなる群から選択される、約０．００１％～０．６％の濃度の界面活性剤と
を含む、方法に関する。
【0157】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記タンパク質製剤は、好ましくは、１５～６０ｋｇ／ｍ２、２０～５０ｋｇ／ｍ２のような１０～７５ｋｇ／ｍ２の間、または約３０ｋｇ／ｍ２もしくは４０ｋｇ／ｍ２で０．２μｍフィルターを通して濾過される、方法に関する。
【0158】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記タンパク質製剤は安定であり、１６８時間まで室温（ＲＴ）で、または－２０℃で２年間まで、またはさらにより長い時間、保存することができる、方法に関する。
【0159】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記タンパク質製剤は患者に投与される、方法に関する。
【0160】
ある特定の実施形態では、タンパク質製剤は、注射によって（例えば、皮下、血管内、筋肉内または腹腔内）、吸入によって、経口的に、または直腸的に対象に投与される。
【0161】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される溶液からタンパク質を精製するための方法であって、前記タンパク質製剤は凍結乾燥される、方法に関する。
【0162】
一実施形態では、本発明は、本発明のタンパク質製剤および場合により、使用するためのリーフレットを含むキットに関する。
【0163】
以下の実施例は、開示される方法およびその種々の使用の特定の実施形態の例示である。それらは例示目的のみのために示され、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。
【実施例】
【0164】
６ 実施例
この目的は、適切な品質を保持しながら、標準的なプロセスと比較してＣｏＧが減少した、組換えにより発現され、分泌されたＮａｎｏｂｏｄｉｅｓのための代替的およびロバストな精製プロセスを開発することであった。さらなる目的はプロセスのスケーラビリティであった。
この目的は、適切な品質を保持しながら、標準的なプロセスと比較してＣｏＧが減少した、組換えにより発現され、分泌されたＮａｎｏｂｏｄｉｅｓのための代替的およびロバストな精製プロセスを開発することであった。さらなる目的はプロセスのスケーラビリティであった。
【0165】
６．１ 材料および方法
全てのタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）工程に関して、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ製のＳａｒｔｏｆｌｏｗ（登録商標）ＳＭＡＲＴシステム（２Ｌ発酵槽相当）およびＳａｒｔｏＪｅｔ（登録商標）ポンプセットアップ（１０Ｌおよび１００Ｌ発酵槽相当）を使用した。
全てのタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）工程に関して、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ製のＳａｒｔｏｆｌｏｗ（登録商標）ＳＭＡＲＴシステム（２Ｌ発酵槽相当）およびＳａｒｔｏＪｅｔ（登録商標）ポンプセットアップ（１０Ｌおよび１００Ｌ発酵槽相当）を使用した。
【0166】
特に明記しない限り、全ての工程は室温（ＲＴ）で実行した。
【0167】
全ての分析は、以下を含む、当業者によって公知の慣例的な方法を使用して社内で実行した：
－ ＯＤ２８０測定：ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ－１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）１０００）での２８０ｎｍ吸光度測定によるタンパク質濃度決定。
－ ＤＮＡ測定は、精製サンプル中の残留宿主細胞ＤＮＡの検出および定量のためのｑＰＣＲベースのアッセイによって行った。
－ ＳＥ－ＨＰＬＣ：サイズ排除高速液体クロマトグラフィーによるＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）の純度アッセイ。
－ ＰＡ－ＨＰＬＣ：ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）の濃度決定のためのプロテインＡアフィニティー高速液体クロマトグラフィー（ＰＡ－ＨＰＬＣ）アッセイ。
－ ＯＤ２８０測定：ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ－１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）１０００）での２８０ｎｍ吸光度測定によるタンパク質濃度決定。
－ ＤＮＡ測定は、精製サンプル中の残留宿主細胞ＤＮＡの検出および定量のためのｑＰＣＲベースのアッセイによって行った。
－ ＳＥ－ＨＰＬＣ：サイズ排除高速液体クロマトグラフィーによるＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）の純度アッセイ。
－ ＰＡ－ＨＰＬＣ：ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）の濃度決定のためのプロテインＡアフィニティー高速液体クロマトグラフィー（ＰＡ－ＨＰＬＣ）アッセイ。
【0168】
６．２ 出発材料
出発材料は、本質的にいずれかに記載されているピキア・パストリスによって発現され、分泌されたＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙを含有する細胞培養液であった（Ｊｏｏｓｔｅｎら、２００３ Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．３０：１、Ｒａｈｂａｒｉｚａｄｅｈら、２００６ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：４２６～４３５）。標的最終濃度は９ｇ／Ｌ細胞培養液であった（ＰＡ－ＨＰＬＣにより測定した）。ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙは、１つのＶＨＨを含み、１３．４ｋＤａの分子量を有する一価ポリペプチドであった（非還元状態）。
出発材料は、本質的にいずれかに記載されているピキア・パストリスによって発現され、分泌されたＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙを含有する細胞培養液であった（Ｊｏｏｓｔｅｎら、２００３ Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．３０：１、Ｒａｈｂａｒｉｚａｄｅｈら、２００６ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：４２６～４３５）。標的最終濃度は９ｇ／Ｌ細胞培養液であった（ＰＡ－ＨＰＬＣにより測定した）。ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙは、１つのＶＨＨを含み、１３．４ｋＤａの分子量を有する一価ポリペプチドであった（非還元状態）。
【0169】
６．３ 第１の濾過工程（清澄化）
第１の濾過工程（透析濾過）の目的は、分泌された標的製品からピキア・パストリス宿主細胞を分離し、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡおよび色のようなプロセス関連不純物ならびに高分子量（ＨＭＷ）夾雑物のような製品関連バリアントのレベルを減少させることであった（清澄化）。
第１の濾過工程（透析濾過）の目的は、分泌された標的製品からピキア・パストリス宿主細胞を分離し、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡおよび色のようなプロセス関連不純物ならびに高分子量（ＨＭＷ）夾雑物のような製品関連バリアントのレベルを減少させることであった（清澄化）。
【0170】
Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ製のＳａｒｔｏｆｌｏｗ ＳＭＡＲＴシステム（２Ｌ発酵槽相当）およびＳａｒｔｏＪｅｔポンプセットアップ（１０Ｌおよび１００Ｌ発酵槽相当）を使用した。ＴＦＦ膜は、５０ｋＤａのＮＭＷＣＯの孔径を有するｍＰＥＳ中空繊維フィルターモジュール（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ）であった。精製水を、出発材料のｐＨ調整または伝導率調整をせずに、第１の濾過工程に使用した。
【0171】
膜を精製水、続いて細胞培養液でプライミングした後、透過液バルブを開き、膜間圧（ＴＭＰ）を１ｂａｒに調整した。第１の濾過工程を、２ＤＶ（透析濾過体積）の精製水を用いて実行した。
【0172】
通常、ＰＡ－ＨＰＬＣによって測定して、製品の８０％超を（第１の）透過液中に回収した。
【0173】
ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙを保存する場合、０．４５／０．２μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して、濾過工程を実行した。この濾過工程の後、濾液をＲＴで７２時間まで保存した。
【0174】
６．４ 第２の濾過工程（濃縮工程）
第２の濾過工程（限外濾過）の目的は２つあった。第１に、この工程を使用して透過液を１２０±１０ｍｇ／ｍｌの標的濃度まで濃縮した。第２に、この工程を使用して種々の小さな不純物の量を減少させた。
第２の濾過工程（限外濾過）の目的は２つあった。第１に、この工程を使用して透過液を１２０±１０ｍｇ／ｍｌの標的濃度まで濃縮した。第２に、この工程を使用して種々の小さな不純物の量を減少させた。
【0175】
Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ製のＳａｒｔｏｆｌｏｗ ＳＭＡＲＴシステム（２Ｌ発酵槽相当）およびＳａｒｔｏＪｅｔポンプセットアップ（１０Ｌおよび１００Ｌ発酵槽相当）を操作した。第２の濾過工程に関して、ＴＦＦ膜は、１０ｋＤａの孔径（Ｓａｒｔｏｃｏｎ（登録商標）Ｓｌｉｃｅカセット；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）を有する中空繊維フィルターモジュール（Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ（登録商標））であった。また、精製水を、再び、出発材料のｐＨ調整または伝導率調整をせずに、第２の濾過工程に使用した。ロード量は、膜表面積１ｍ２あたり０．７～１ｋｇのＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙであった。
【0176】
膜を水、続いて第１の透過液でプライミングした後、透過液バルブを開き、ＴＭＰを１．２５ｂａｒに調整した。１２０±１０ｍｇ／ｍｌ（総タンパク質）の濃度に達したとき、ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙを含む第１の保持液を収集した。
【0177】
概して、ＰＡ－ＨＰＬＣによって測定して、製品の１００％を第１の保持液中に回収した。
【0178】
ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙを保存する場合、０．４５／０．２μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して濾過工程を実行した。この濾過工程の後、濾液を室温で７２時間まで保存した。
【0179】
６．５ 沈殿、洗浄および再懸濁工程
沈殿、洗浄および再懸濁工程の目的は、ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙを沈殿させ、沈殿物を洗浄し、プロセス関連不純物（例えば、細胞壁由来成分）を再懸濁し、０．２μｍの孔径を有する膜を通した濾過により減少させながら、ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）を沈殿させたままにすることであった。特に、沈殿物は膜を通過することができなかった。次に、ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙの再懸濁を精製水での希釈によって実行し、その後、可溶性ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙを、全ての残存する固体不純物を保持しながら、前記膜を通して濾過した。
沈殿、洗浄および再懸濁工程の目的は、ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙを沈殿させ、沈殿物を洗浄し、プロセス関連不純物（例えば、細胞壁由来成分）を再懸濁し、０．２μｍの孔径を有する膜を通した濾過により減少させながら、ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）を沈殿させたままにすることであった。特に、沈殿物は膜を通過することができなかった。次に、ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙの再懸濁を精製水での希釈によって実行し、その後、可溶性ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙを、全ての残存する固体不純物を保持しながら、前記膜を通して濾過した。
【0180】
沈殿、洗浄および再懸濁工程は全て、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ製のＳａｒｔｏｆｌｏｗ ＳＭＡＲＴシステム（２Ｌ発酵槽相当）およびＳａｒｔｏＪｅｔポンプセットアップ（１０Ｌまたは４＊１０Ｌ発酵槽相当）において実行した。
【0181】
沈殿は、１．８Ｍの硫酸アンモニウムおよび約５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度の最終濃度を目標とする３．１Ｍの硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）のストック溶液の添加によって実行した。３．１Ｍの硫酸アンモニウムストック溶液を、沈殿が形成されるまで、ＲＴで穏やかに撹拌しながら徐々に添加した。
【0182】
沈殿後、沈殿物を室温で２時間～２４時間まで保存した。
【0183】
ＴＦＦ膜、すなわち、０．２μｍの孔径（Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅカセット；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）を有するカセットフィルターモジュール（Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ）、および膜表面積１ｍ２あたり０．６～０．８ｋｇのＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙのロード量を使用して洗浄工程を実行した。
【0184】
５ＤＶの１．８Ｍの硫酸アンモニウムを用いて透析濾過を行った。
【0185】
ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙ沈殿物（第２の保持液）を再懸濁するために、精製水を添加して０．６Ｍの硫酸アンモニウムの最終濃度に到達させた。続いて、再懸濁した可溶性ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙを含む第２の保持液を、膜（孔径０．２μｍ）を通して濾過し、第２の透過液を得た。
【0186】
概して、沈殿、洗浄、再懸濁および濾過（第２の透過物）後、ＰＡ－ＨＰＬＣによって測定して、タンパク質の７５％～８０％超を回収した。
【0187】
直ちに処理を計画しなかったとき、０．６Ｍの硫酸アンモニウムの第２の透過液サンプルを、０．４５／０．２μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通して濾過した。この濾過工程の後、濾液をＲＴで７２時間まで保存した。
【0188】
６．６ 限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）工程
ＵＦ／ＤＦ工程の目的は製品を濃縮し、０．６Ｍの硫酸アンモニウム緩衝液を一次緩衝液と交換することであった。
ＵＦ／ＤＦ工程の目的は製品を濃縮し、０．６Ｍの硫酸アンモニウム緩衝液を一次緩衝液と交換することであった。
【0189】
ＵＦ／ＤＦ工程は、上記のＳａｒｔｏｒｉｕｓ製のＳａｒｔｏｆｌｏｗ ＳＭＡＲＴシステム（２Ｌ発酵槽相当）およびＳａｒｔｏＪｅｔポンプセットアップ（１０Ｌおよび１００Ｌ発酵槽相当）で行った。ＴＦＦ膜は、１０ｋＤａのカットオフ（ＨｙｄｒｏＳａｒｔ）を有するカセットフィルターモジュール（Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｓｌｉｃｅカセット、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ製）であった。一次緩衝液は２０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ６．０であった。
【0190】
膜を水、続いて工程６．５の第２の透過液でプライミングした後、透過液バルブを開き、膜間圧（ＴＭＰ）を１．２ｂａｒに調整した。第１のＤＦ工程は、１ＤＶの一次緩衝液（ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙを含む第１の透析濾過液）を用いて実行した。次に、ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙが５５ｍｇ／ｍｌの濃度（第３の保持液）に達するまでＵＦ工程を完了した。続いて、第２のＤＦ工程を、４ＤＶの一次緩衝液（ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙを含む第２の透析濾過液）を用いて実行した。
【0191】
通常、ＰＡ－ＨＰＬＣによって測定して、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌの濃度でＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙの９８％超を回収した。
【0192】
ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙを保存する場合、０．４５／０．２μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して濾過工程を実行した。この濾過工程の後、濾液をＲＴで７２時間まで保存した。
【0193】
６．７ 製剤化および最終濾過工程
沈殿および濾過工程のみを必要とする、一般的および単純化された精製プロセスは上記されており、それらは全て同じ装置で行った。最終製品は一次緩衝液中の精製タンパク質であったが、さらなる賦形剤は含まなかった。
沈殿および濾過工程のみを必要とする、一般的および単純化された精製プロセスは上記されており、それらは全て同じ装置で行った。最終製品は一次緩衝液中の精製タンパク質であったが、さらなる賦形剤は含まなかった。
【0194】
しかしながら、例えば、保存、投与の容易さ、凍結乾燥などのような種々の理由のために、最終製剤は、ＵＦ／ＤＦ工程に影響を及ぼしてもよいか、または及ぼさなくてもよい賦形剤を必要とし得る。製剤化および最終濾過工程は本発明の精製方法の明確な部分ではないが、本発明の精製プロセスに別の製剤化工程を加えることは、一方で、前述の精製プロセス方法の一般性を促進し、他方で、最終製剤を調整する可能性を開く。
【0195】
この場合、ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙ２０ｍｇ／ｍｌが得られるまで、２０ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ６．０中のＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙ５０ｍｇ／ｍｌを、ＲＴでの連続撹拌下でマンニトール１６．６ｍｇ／ｍｌ（ｐＨ６．０の２０ｍＭのクエン酸緩衝液中）で希釈した。
【0196】
Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ ２フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）での０．４５／０．２μｍの無菌濾過工程を標準条件下で実行した。バルク液体精製ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙを－２０℃以下で保存した。さらに、液体精製ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙは、濾過後、ＲＴで１６８時間より長い間、活性を喪失することなく保存できることが示された。
【0197】
通常、ＰＡ－ＨＰＬＣによって測定して、製品の９６％超を回収した。
【0198】
６．８ クロマトグラフィーを含まないＤＳＰのケーススタディーの結論
上記は、記載される一般的および単純化された精製手順であり、クロマトグラフィー工程を使用する従来のＤＳＰプロセスに匹敵する製品の品質で、溶液中のタンパク質の出発量と比較して少なくとも６２％の最終プロセス回収率を得た。ＨＣＰ含有量のみがわずかに高いが、種々の目的について許容される基準内である。
上記は、記載される一般的および単純化された精製手順であり、クロマトグラフィー工程を使用する従来のＤＳＰプロセスに匹敵する製品の品質で、溶液中のタンパク質の出発量と比較して少なくとも６２％の最終プロセス回収率を得た。ＨＣＰ含有量のみがわずかに高いが、種々の目的について許容される基準内である。
【0199】
６．９ スケーラビリティ（ＭＩＰ試行）
上記の精製プロセスは１０Ｌスケールで実行した。精製プロセスのスケーラビリティを評価し、ＣＭＯへの効率的かつ首尾よい移行を確実にするために、１００Ｌ発酵スケールでのＭａｎ－ｉｎ－Ｐｌａｎｔ（ＭＩＰ）試行を行った。さらに、２０００Ｌの試行を実行した。
上記の精製プロセスは１０Ｌスケールで実行した。精製プロセスのスケーラビリティを評価し、ＣＭＯへの効率的かつ首尾よい移行を確実にするために、１００Ｌ発酵スケールでのＭａｎ－ｉｎ－Ｐｌａｎｔ（ＭＩＰ）試行を行った。さらに、２０００Ｌの試行を実行した。
【0200】
本質的に、上記の精製プロセスを、より大きなスケールではあるが、繰り返した。
【0201】
６．９．１ 出発材料
清澄化のための出発材料はＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙを含有するおよそ１０９Ｌの細胞培養液であり、これは最小培地中でピキア・パストリスによって発現され、分泌された。発酵槽の最終濃度は９．１ｇ／Ｌ細胞培養液（１１．９ｇ／Ｌ無細胞）であった（ＰＡ－ＨＰＬＣ法により測定した）。
清澄化のための出発材料はＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙを含有するおよそ１０９Ｌの細胞培養液であり、これは最小培地中でピキア・パストリスによって発現され、分泌された。発酵槽の最終濃度は９．１ｇ／Ｌ細胞培養液（１１．９ｇ／Ｌ無細胞）であった（ＰＡ－ＨＰＬＣ法により測定した）。
【0202】
出発材料のｐＨまたは伝導率の調整は実行しなかった。
【0203】
６．９．２ 第１の濾過工程
第１の濾過工程は上記の通りであったが、ここで、ＭＩＰ試行の清澄化工程のために使用した中空繊維は、フィルター高さ６５ｃｍを有するＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｓ製の表面積５１００ｃｍ２を有するＭｉｎｉＫｒｏｓ膜ＮＯ６－ＥＯ５０－１０－Ｎであった。
第１の濾過工程は上記の通りであったが、ここで、ＭＩＰ試行の清澄化工程のために使用した中空繊維は、フィルター高さ６５ｃｍを有するＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｓ製の表面積５１００ｃｍ２を有するＭｉｎｉＫｒｏｓ膜ＮＯ６－ＥＯ５０－１０－Ｎであった。
【0204】
透析濾過体積の有効性を評価するために、（ｉ）２ＤＶ、すなわち以前に記載した通り；および（ｉｉ）３ＤＶを使用して２つのモードを試験した。
【0205】
２ＤＶおよび３ＤＶの両方は本質的に同じ結果をもたらした。
【0206】
６．９．３ 第２の濾過工程
第２の濾過工程は、使用したフィルターを含めて、本質的に上記の通りであった。
第２の濾過工程は、使用したフィルターを含めて、本質的に上記の通りであった。
【0207】
６．９．４ 沈殿、洗浄および再懸濁工程
沈殿、洗浄および再懸濁工程は、使用したフィルターを含めて、本質的に上記の通りであった。
沈殿、洗浄および再懸濁工程は、使用したフィルターを含めて、本質的に上記の通りであった。
【0208】
６．９．５ ＵＦ／ＤＦ工程
ＵＦ／ＤＦ工程は、使用したフィルターを含めて、本質的に上記の通りであった。得られたＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙの濃度は５２ｍｇ／ｍＬであった。
ＵＦ／ＤＦ工程は、使用したフィルターを含めて、本質的に上記の通りであった。得られたＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙの濃度は５２ｍｇ／ｍＬであった。
【0209】
６．９．６ 製剤化および最終濾過工程
製剤化工程は、マンニトール１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度に達するようにマンニトール１６．３ｍｇ／ｍｌのストック濃度を使用したことを除いて本質的に上記の通り実行した。
製剤化工程は、マンニトール１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度に達するようにマンニトール１６．３ｍｇ／ｍｌのストック濃度を使用したことを除いて本質的に上記の通り実行した。
【0210】
６．１０ 品質分析
ＭＩＰ試行の間、液体精製ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（「第２の透析濾過液」）の最終的に得られた濃度は１９．４ｍｇ／ｍＬであった。異なるプロセス工程の回収率は７７～１００％の範囲であり、６３％の全体のプロセス回収率を得た。
ＭＩＰ試行の間、液体精製ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（「第２の透析濾過液」）の最終的に得られた濃度は１９．４ｍｇ／ｍＬであった。異なるプロセス工程の回収率は７７～１００％の範囲であり、６３％の全体のプロセス回収率を得た。
【0211】
６．１０．１ ＲＰ－ＵＨＰＬＣ
ＲＰ－ＵＨＰＬＣを、ＭＩＰ試行から得た中間体および最終サンプルの特徴付けのために使用した。この方法は、存在する場合、製品関連バリアント、対になっていないシステインバリアントおよびカルバミル化バリアントについての限界試験として適格とされている。Ｓ－Ｓを欠くバリアント（ｍｉｓｓｉｎｇ Ｓ－Ｓ ｖａｒｉａｎｔ）およびカルバミル化バリアントの相対量は、全表面積のものに対してＲＰ－ＵＨＰＬＣカラムから溶出したそれぞれのピークのピーク後表面積を測定することによって決定した（％として表す）。
ＲＰ－ＵＨＰＬＣを、ＭＩＰ試行から得た中間体および最終サンプルの特徴付けのために使用した。この方法は、存在する場合、製品関連バリアント、対になっていないシステインバリアントおよびカルバミル化バリアントについての限界試験として適格とされている。Ｓ－Ｓを欠くバリアント（ｍｉｓｓｉｎｇ Ｓ－Ｓ ｖａｒｉａｎｔ）およびカルバミル化バリアントの相対量は、全表面積のものに対してＲＰ－ＵＨＰＬＣカラムから溶出したそれぞれのピークのピーク後表面積を測定することによって決定した（％として表す）。
【0212】
逆相超高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＵＨＰＬＣ）分析により、液体精製ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙが０．６％のＳ－Ｓを欠くバリアントおよび１．８％のカルバミル化バリアントを含有することが示された。
【0213】
６．１０．２ ＳＥ－ＨＰＬＣ
ＳＥ－ＨＰＬＣを使用して、精製プロセスの異なる中間工程および最終製品についてＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙの高分子量（ＨＭＷ）種のレベルをモニターした（図１）。さらに、インタクトなＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙ（主ピーク）および低分子量（ＬＭＷ、タンパク質分解、ピーク後として存在する）も検出することができた。
ＳＥ－ＨＰＬＣを使用して、精製プロセスの異なる中間工程および最終製品についてＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙの高分子量（ＨＭＷ）種のレベルをモニターした（図１）。さらに、インタクトなＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙ（主ピーク）および低分子量（ＬＭＷ、タンパク質分解、ピーク後として存在する）も検出することができた。
【0214】
ＭＩＰ試行からの中間体および最終サンプルのＳＥ－ＨＰＬＣ分析により、精製プロセスの間に、濾過された１０ｋＤの限外濾過保持液についての５．１％から最終的な液体精製ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙについての３．１％へのＨＭＷ種の減少（プレピーク％）が示された。ＭＩＰ試行の異なるサンプルの異なるＳＥ－ＨＰＬＣ分析のオーバーレイを図１に示す。
【0215】
６．１０．３ ＣＥ－ＩＥＦ製品分析
ＭＩＰ試行からの異なる中間体サンプルおよび最終的な液体精製ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙを、キャピラリー等電点電気泳動（ＣＥ－ＩＥＦ）によって分析して、酸性バリアントおよび塩基性バリアントのような製品関連バリアントのレベルを決定した。
ＭＩＰ試行からの異なる中間体サンプルおよび最終的な液体精製ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙを、キャピラリー等電点電気泳動（ＣＥ－ＩＥＦ）によって分析して、酸性バリアントおよび塩基性バリアントのような製品関連バリアントのレベルを決定した。
【0216】
ＭＩＰ試行の中間体サンプルのＣＥ－ＩＥＦ分析により、精製プロセスの間に酸性バリアントのパーセンテージの減少が示された。塩基性バリアントのパーセンテージは既に低く（１～１．２％）、限界クリアランス（０．６％）のみを示した。他方で酸性バリアントのパーセンテージは、液体精製ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙにおいて１９．８～２２．７％から３．４％に低下した。
【0217】
６．１０．４ 有効性分析
ＭＩＰ試行の液体精製ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙの有効性を、適格な細胞ベースの機能的有効性アッセイにおいて評価した。
ＭＩＰ試行の液体精製ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙの有効性を、適格な細胞ベースの機能的有効性アッセイにおいて評価した。
【0218】
最終的な液体精製ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙは１０８％の相対有効性を有した。
【0219】
６．１０．５ 還元ＣＧＥによる純度
ＭＩＰ試行からの異なる中間体および最終液体精製ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙサンプルの純度を、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）によって分析した。この方法は電荷を帯びた製品関連バリアントの存在について試験した。
ＭＩＰ試行からの異なる中間体および最終液体精製ＡＬＸ－Ｎａｎｏｂｏｄｙサンプルの純度を、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）によって分析した。この方法は電荷を帯びた製品関連バリアントの存在について試験した。
【0220】
異なるサンプルについてのＣＧＥ積分データ（主ピーク％）の概要を表１に示す。
【0221】
【表1】
【0222】
６．１１ 一般的結論
この精製プロセス（１０Ｌ、１００Ｌおよび２０００Ｌ発酵スケール）によって得られた結果は、これに関してロバスト性を実証した（特に、プロセスは本質的に同じ結果で既に何度も繰り返されている）。これらの結果に基づいて、プロセスをロックし、ＧＭＰ準拠の原薬（ＤＳ）製造に適しているとみなした。
この精製プロセス（１０Ｌ、１００Ｌおよび２０００Ｌ発酵スケール）によって得られた結果は、これに関してロバスト性を実証した（特に、プロセスは本質的に同じ結果で既に何度も繰り返されている）。これらの結果に基づいて、プロセスをロックし、ＧＭＰ準拠の原薬（ＤＳ）製造に適しているとみなした。
【0223】
記載される精製プロセスは、６３％の下流のプロセス回収率範囲をもたらし、ＨＣＰ、マンナン、ＤＮＡ、色のようなプロセス関連不純物、およびＨＭＷ種のような製品関連バリアントを減少させた。
【0224】
表２に、クロマトグラフィーを含む標準的な従来の下流プロセス（ＤＳＰ）精製方法および本発明のクロマトグラフィーを含まないＤＳＰ精製方法を使用したタンパク質品質の比較を提供する。
【0225】
本発明の精製プロセスは一価Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（１２～１５ｋＤａの間の分子量）について広範に試験されているが、二価Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（２４～３０ｋＤａの間の分子量を含む）および三価Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（３６～４５ｋＤａの間の分子量を含む）について同様に使用することができる。一価Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓについてと同様の条件を二価および三価Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓについて使用することができる。それにもかかわらず、必要と考えられる場合、二価および三価Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓについて本発明のプロセスをさらに最適化するための適合は標準的な実務である。
【0226】
本発明のプロセスは、従来のクロマトグラフィープロセスより高いプロセス回収率および有意に低い商品原価を有する。１００Ｌスケールで従来のＤＳＰを本発明の精製プロセスと比較すると、コストの８６％の減少が達成されたが、品質は適正であった。
【0227】
【表2】
【図1】