特許 7570341 高分子量種のインビボでの可逆性

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-10-10

(45)【発行日】2024-10-21

(54)【発明の名称】高分子量種のインビボでの可逆性

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20241011BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20241011BHJP

   G01N 33/536 20060101ALI20241011BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20241011BHJP

   C07K 1/22 20060101ALI20241011BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68 ZNA

G01N33/53 D

G01N33/536 D

G01N30/88 J

C07K1/22

【請求項の数】 18

(21)【出願番号】P 2021551927

(86)(22)【出願日】2020-03-04

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-20

(86)【国際出願番号】 US2020020956

(87)【国際公開番号】W WO2020180967

(87)【国際公開日】2020-09-10

【審査請求日】2023-02-28

(31)【優先権主張番号】62/944,758

(32)【優先日】2019-12-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/813,529

(32)【優先日】2019-03-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500049716

【氏名又は名称】アムジエン・インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】シェン，ドン

(72)【発明者】

【氏名】ジャン，チンチュン

(72)【発明者】

【氏名】ジュベール，マリーサ

(72)【発明者】

【氏名】マンロー，トレント・シー

(72)【発明者】

【氏名】デ・グズマン，ロナンドゥロ

【審査官】北条 弥作子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１６－５１５５１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１５－５０２１４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１９－５０３６７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１４－５３１５９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５０３７９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００８－５２１８２８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ３３／４８

Ａ６１Ｋ３９／００～３９／４４

Ａ６１Ｋ４９／００～５１／１２

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

治療用タンパク質の高分子量（ＨＭＷ）種のインビボでのレベルをアッセイするインビトロ方法であって、
ａ．（ｉ）前記治療用タンパク質を含むサンプルと、（ｉｉ）血清又は枯渇血清の画分とを含む混合物をインキュベートすることであって、前記サンプル中に存在するＨＭＷ種のレベルは、前記混合物をインキュベートする前に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定されるか、又は前記混合物をインキュベートする前に前記サンプル中に存在するＨＭＷ種のレベルは、既知であること、
ｂ．工程（ａ）後の１つ又は複数の時点で、前記混合物中に存在する前記治療用タンパク質のＨＭＷ種のレベルをＳＥＣによって決定すること、
ｃ．前記混合物中に存在するＨＭＷ種のレベルを、（ａ）のインキュベート前のサンプル中に存在するＨＭＷ種のレベルと比較すること、及び
ｄ．前記治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性の割合を算出すること
を含み、
（ｉ）前記治療用タンパク質は、抗体若しくはその抗原結合断片、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子、又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、及び（ｉｉ）前記ＨＭＷ種は、約０．１ミクロン未満のサイズである、
インビトロ方法。

【請求項2】

前記ＨＭＷ種は、約１０ｎｍ～約９９ｎｍのサイズである、請求項１に記載のインビトロ方法。

【請求項3】

前記ＨＭＷ種は、前記治療用タンパク質の二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、及び八量体の内の１つ又は複数を含む、請求項１に記載のインビトロ方法。

【請求項4】

方程式１：

【数1】

に従って、前記治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性の割合が算出される、請求項１～３のいずれか一項に記載のインビトロ方法。

【請求項5】

工程（ａ）は、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１８時間、又は少なくとも約２４時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４２時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、又は少なくとも約１週間にわたり前記混合物をインキュベートすることを含む、請求項１に記載のインビトロ方法。

【請求項6】

前記治療用タンパク質は、約１０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬの最終濃度で前記混合物中に存在する、請求項１に記載のインビトロ方法。

【請求項7】

前記混合物は、約８７％（ｖ／ｖ）を超える血清又は枯渇血清の画分を含む、請求項１に記載のインビトロ方法。

【請求項8】

前記混合物は、枯渇血清の画分を含み、及び前記血清の枯渇画分は、ＩｇＧ枯渇血清画分である、請求項１に記載のインビトロ方法。

【請求項9】

前記血清の枯渇画分は、約３０ｋＤａ～約３００ｋＤａの、予め選択された分子量範囲を有する分子が枯渇した画分である、請求項８に記載のインビトロ方法。

【請求項10】

前記枯渇画分は、２回枯渇画分である、請求項８に記載のインビトロ方法。

【請求項11】

前記混合物は、全血清を含む、請求項１に記載のインビトロ方法。

【請求項12】

前記全血清は、ヒト血清である、請求項１１に記載のインビトロ方法。

【請求項13】

前記治療用タンパク質は、蛍光標識を含むか、又は前記方法は、工程（ａ）前に、前記治療用タンパク質を蛍光標識で標識することをさらに含む、請求項１２に記載のインビトロ方法。

【請求項14】

工程（ａ）後に且つ工程（ｂ）前に、希釈工程をさらに含む、請求項１３に記載のインビトロ方法。

【請求項15】

工程（ａ）後に且つ工程（ｂ）前に、前記混合物の成分を分離することをさらに含む請求項１に記載のインビトロ方法。

【請求項16】

前記成分を、親和性クロマトグラフィーにより分離する、請求項１５に記載のインビトロ方法。

【請求項17】

前記親和性クロマトグラフィーは、酸性溶出緩衝液により前記治療用タンパク質を溶出させることを含む、請求項１６に記載のインビトロ方法。

【請求項18】

前記溶出させることにより、前記治療用タンパク質を含む溶出液が得られ、及び前記方法は、前記溶出液中に存在する前記治療用タンパク質のＨＭＷ種のレベルをＳＥＣによって決定することを含む、請求項１７に記載のインビトロ方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
２０１９年３月４日に出願された米国仮出願第６２／８１３，５２９号及び２０１９年１２月６日に出願された米国仮出願第６２／９４４，７５８号の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下での利益が本明細書により主張されており、これらの内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

電子的に提出された資料の参照による組み込み
本明細書と同時に提出されたコンピュータ可読のヌクレオチド／アミノ酸の配列表は、その全体が参照により組み込まれ、下記のように識別される：「５３９９０＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称の２７０，２３４バイトＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル、２０２０年３月４日作成。

【背景技術】

【0003】

タンパク質の天然構造は、このタンパク質の環境内での変化に適応するように設計されている。タンパク質の生物学的機能には構造の柔軟性が必要とされているが、医薬用途の治療用タンパク質の開発では、多くの課題も存在する。生物学的活性の喪失及びタンパク質の免疫原性と関連しているアミノ酸残基の化学的改変、構造変化、凝集、及び沈殿により、治療薬としてのある特定のタンパク質の開発の困難さが増している。治療用タンパク質を投与するまでの多くの工程（例えば、産生、回収、精製、製剤化、保存、及び送達）のそれぞれの最中に、このタンパク質は改変及び構造変化を受けやすく、その結果、様々な種が形成される。治療用タンパク質の高分子量（ＨＭＷ）種の形成は、このタンパク質の投与前工程の最中に起こり得る改変の１種である。ＨＭＷ種は、安全性及び有効性の観点からバイオ医薬品業界にとって依然として懸念事項となっており、なぜならば、ＨＭＷ種は、治療効果の低下を示す可能性があり、且つ患者に投与されると望ましくない免疫反応を引き起こす可能性があるからである。同様に、ＨＭＷ種の個々の成分（治療用タンパク質）は、非共有結合を介して互いに連結されており、且つインビボでの環境は、インビトロでの状況（例えば、この治療用タンパク質のパッケージされた製剤）とは実質的に異なることを考慮すると、ＨＭＷ種の量及び種類は、患者に投与されると変化する可能性がある。従って、治療用タンパク質のＨＭＷ種の量及び種類を、患者への投与前だけでなく投与後のインビボでの状況においても決定することが望ましい。多くの研究者が、インビトロでの状況での（例えば、治療用タンパク質が、他のタンパク質から単離された緩衝液中に存在するチューブ中での）ＨＭＷ種形成の現象を研究しているが、そのような研究は、患者への投与後のＨＭＷ種の運命を予測するものではない。インビトロアッセイでの、よりインビボでの状況（例えば、血液タンパク質及び／又は血液細胞の存在下）における治療用タンパク質のＨＭＷ種の会合及び解離を分析することを目的としている研究者は、そのような状況下でＨＭＷ種を測定するために使用される技術には限界があることから、ほとんどいない。例えば、インビボでの状況で見出されるタンパク質は、治療用タンパク質及びそのＨＭＷ種のシグナルを隠す。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

従って、患者の体内に入った治療用タンパク質のＨＭＷ種の量及び種類を予測し得ることが非常に望ましく、そのため、関連するインビボでの状況下での治療用タンパク質のＨＭＷ種のレベルをアッセイするインビトロ方法が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0005】

初めて本明細書で説明されているのは、治療用タンパク質（及びそのＨＭＷ種）が、投与後のインビボでの状況を模倣する環境中に存在する間に、この治療用タンパク質のＨＭＷ種のレベルをアッセイするインビトロ方法である。本明細書で示されているデータは、治療用タンパク質及びそのＨＭＷ種のシグナルを通常はマスクする血清タンパク質が存在するにもかかわらず、本開示の方法が、人工的なインビボでの状況下で経時的にＨＭＷ種の量及び種類を成功裏にモニタリングし得ることを裏付ける。本開示の方法は、インビボでの状況下での治療用タンパク質のＨＭＷ種形成の可逆性を有利に決定し得、この特性又はパラメータは、本明細書では、治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性として参照される。

【0006】

従って、本開示は、治療用タンパク質の高分子量（ＨＭＷ）種のインビボでのレベルをアッセイするインビトロ方法を提供する。例示的な実施形態での第１の態様では、この方法は、（Ａ）（ｉ）この治療用タンパク質を含むサンプルと、（ｉｉ）血清又はその枯渇画分とを含む混合物をインキュベートすること、及び（Ｂ）工程（ａ）後の１つ又は複数の時点で、この混合物中に存在する治療用タンパク質のＨＭＷ種のレベルをアッセイすることを含む。或いは、又は加えて、この混合物中の治療用タンパク質のＨＭＷ種のレベルを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりアッセイする。

【0007】

同様に提供されるのは、第２の態様では、治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性を決定する方法である。例示的な実施形態では、この方法は、（Ａ）第１の態様に係る治療用タンパク質の高分子量（ＨＭＷ）種のインビボでのレベルをアッセイすることであって、（ｉ）この方法は、インキュベートする工程（工程（Ａ））前にサンプル中に存在するＨＭＷ種のレベルをアッセイすることをさらに含むか、又は（ｉｉ）インキュベートする工程（工程（Ａ））前にサンプル中に存在するＨＭＷ種のレベルは既知である、アッセイすること、及び（Ｂ）混合物中に存在するＨＭＷ種のレベルと、インキュベートする工程（工程（Ａ））前にサンプル中に存在するＨＭＷ種のレベルとを比較することを含む。

【0008】

例示的な実施形態では、治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性を決定する方法は、この治療用タンパク質を含むサンプルと、枯渇血清とを含む混合物をインキュベートすることであって、血清の枯渇画分は、予め選択された分子量範囲を有する分子が枯渇した画分であり、任意選択的に、この予め選択された分子量範囲は、約３０ｋＤａ～約３００ｋＤａであるか、又はより高く、任意選択的に、この枯渇画分は、サイズに基づくろ過により得られる、インキュベートすること、ＳＥＣにより、工程（ａ）後の１つ又は複数の時点で、この混合物中に存在する治療用タンパク質のＨＭＷ種のレベルをアッセイすること、工程（ｂ）でアッセイされる際に混合物中に存在するＨＭＷ種のレベルと、工程（ａ）前にサンプル中に存在するＨＭＷ種のレベルとを比較すること、及びこの治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性の割合を算出することを含む。

【0009】

例示的な実施形態では、治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性を決定する方法は、この治療用タンパク質を含むサンプルと、枯渇血清とを含む混合物をインキュベートすることであって、この枯渇血清は、ＩｇＧ枯渇血清画分であり、任意選択的に、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより血清からＩｇＧを除去することにより得られるＩｇＧ枯渇血清画分である、インキュベートすること、捕捉分子による親和性クロマトグラフィーにより、この混合物の成分を分離して、治療用タンパク質及びそのＨＭＷ種を含む画分を得ること、ＳＥＣにより、この画分中に存在する治療用タンパク質のＨＭＷ種のレベルをアッセイすること、工程（ｃ）でアッセイされる際に画分中に存在するＨＭＷ種のレベルと、工程（ａ）前にサンプル中に存在するＨＭＷ種のレベルとを比較すること、並びにこの治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性の割合を算出することを含む。

【0010】

例示的な実施形態では、治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性を決定する方法は、この治療用タンパク質を含むサンプルと、全血清とを含む混合物をインキュベートすることであって、この治療用タンパク質は、蛍光標識を含む、インキュベートすること、この混合物を希釈すること、ＳＥＣにより、工程（ａ）後の１つ又は複数の時点で、この混合物中に存在する治療用タンパク質のＨＭＷ種のレベルをアッセイすること、工程（ｃ）でアッセイされる際に混合物中に存在するＨＭＷ種のレベルと、工程（ａ）前にサンプル中に存在するＨＭＷ種のレベルとを比較すること、及びこの治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性の割合を算出することを含む。

【0011】

例示的な実施形態では、治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性を決定する方法は、この治療用タンパク質を含むサンプルと、全血清とを含む混合物をインキュベートすること、捕捉分子による親和性クロマトグラフィーにより、この混合物の成分を分離して、治療用タンパク質及びそのＨＭＷ種を含む画分を得ること、ＳＥＣにより、この画分中に存在する治療用タンパク質のＨＭＷ種のレベルをアッセイすること、工程（ｃ）でアッセイされる際に画分中に存在するＨＭＷ種のレベルと、工程（ａ）前にサンプル中に存在するＨＭＷ種のレベルとを比較すること、並びにこの治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性の割合を算出することを含む。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性を決定する４種の例示的な方法の概要である。

【図2】インキュベーション期間中の様々な時点で採取されたアリコートのＳＥＣクロマトグラムの重ね合わせである。この混合物は、枯渇ヒト血清中のＴＰ２（１０％ ＨＭＷ）の希釈サンプルを含んだ。ＨＭＷ種（ＨＭＷ）と単量体の治療用タンパク質（単量体）とのピークを示す。

【図3】インキュベーション期間中の様々な時点で採取された混合物のアリコートのＳＥＣクロマトグラムの重ね合わせである。この混合物は、枯渇ヒト血清中のＴＰ２（５％ ＨＭＷ）の希釈サンプルを含んだ。ＨＭＷ種（ＨＭＷ）と単量体の治療用タンパク質（単量体）とのピークを示す。

【図4】治療用タンパク質単量体、ＨＭＷ種、及び共溶出血清成分（「ピーク後」）の代表的なピークを示す一連のＳＥＣ－ＨＰＬＣスペクトルである。

【図5】様々な溶出緩衝液を使用して得られた一連のＳＥＣ－ＨＰＬＣスペクトルである。

【図6】潜在的な溶出緩衝液及び洗浄緩衝液での初期ＴＰ１安定性評価中に得られた一連のＳＥＣ－ＨＰＬＣスペクトルである。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本開示は、治療用タンパク質の高分子量（ＨＭＷ）種のインビボでのレベルをアッセイするインビトロ方法を提供する。例示的な実施形態では、この方法は、（Ａ）（ｉ）この治療用タンパク質を含むサンプルと、（ｉｉ）血清又はその枯渇画分とを含む混合物をインキュベートすること、及び（Ｂ）工程（ａ）後の１つ又は複数の時点で、この混合物中に存在する治療用タンパク質のＨＭＷ種のレベルをアッセイすることを含む。例示的な態様では、この混合物中の治療用タンパク質のＨＭＷ種のレベルを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりアッセイする。

【0014】

「アッセイする」は、「試験する」、又は「分析する」、又は「決定する」を意味する。一部の態様では、「アッセイする」は、「測定する」を意味する。本開示の方法によりアッセイされるか又は決定されるレベルは、相対的な測定であり得、例えば、このレベルは、参照レベルより高いか、又は低いか、又は参照レベルと同一であるという決定であり得る。例示的な態様では、この参照レベルは、血清又はその枯渇画分と混合される前のＨＭＷ種のレベルであるか、又は対象に投与される製剤中のＨＭＷ種のレベルである。そのような態様では、本開示の方法は、ＨＭＷ種のレベルをアッセイし、ＨＭＷ種のレベルが、血清と混合される前のＨＭＷ種のレベルよりも高いか、若しくは低いか、若しくはこのレベルと同一であることを決定し得るか、又は対象に投与される製剤中のＨＭＷ種のレベルよりも高いか、若しくは低いか、若しくはこのレベルと同一であることを決定し得る。「アッセイする」は、一部の態様では、正規化された測定値を得ることができる。例えば、正規化された測定値は、参照タンパク質（例えば血清アルブミン）に対して正規化され得る。「アッセイする」は、ある特定の場合では、絶対測定値（例えば、正規化されていなければ参照レベルに対して相対的でもない）を得る。

【0015】

本開示のインビトロ方法によりアッセイされる「治療用タンパク質の高分子量（ＨＭＷ）種のインビボでのレベル」は、例示的な場合では、この治療用タンパク質（及びそのＨＭＷ種）をインビボ様の状況に置くことに基づく、この治療用タンパク質のＨＭＷ種の予測レベルである。例示的な態様では、「治療用タンパク質の高分子量（ＨＭＷ）種のインビボでのレベル」は、対象への投与後に治療用タンパク質のＨＭＷ種にインビボで何が起こるかを予測するのに有用なレベルである。治療用タンパク質の高分子量（ＨＭＷ）種のインビボでのレベルをアッセイする本開示の方法の例示的な態様では、この方法は、インキュベートする工程（工程（ａ））前にサンプル中に存在するＨＭＷ種のレベルをアッセイすることをさらに含む。様々な場合では、インキュベートする工程（工程（ａ））前にサンプル中に存在するＨＭＷ種のレベルは、既知である。インキュベートする工程（工程（ａ））前にサンプル中に存在するＨＭＷ種のレベルをアッセイする方法を、任意の既知の適切な技術に従って実施し得る。一部の態様では、ＨＭＷのレベルは、本明細書で説明されているようにアッセイされ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）－高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む。

【0016】

本明細書で使用される場合、治療用タンパク質に関連する「ＨＭＷ種」は、非共有結合により連結された２個以上の分子（治療用タンパク質）の形成された凝集体を意味する。ＨＭＷ種として下記が挙げられるが、これらに限定されない：治療用組成物の二量体（２個の治療用タンパク質を含む）、三量体（３個の治療用タンパク質を含む）、四量体（４個の治療用タンパク質を含む）、五量体（５個の治療用タンパク質を含む）、六量体（６個の治療用タンパク質を含む）、七量体（７個の治療用タンパク質を含む）、及び八量体（８個の治療用タンパク質を含む）。例示的な態様では、ＨＭＷ種は、より高次であり得、例えば、８個超の治療用タンパク質を含み得る。例えば、ＨＭＷ種は下記であり得る：九量体（ｅｎｎｅａｍｅｒ）（９個の治療用タンパク質を含む）、十量体（１０個の治療用タンパク質を含む）、十一量体（１１個の治療用タンパク質を含む）、十二量体（１２個の治療用タンパク質を含む）、十三量体（ｔｒｉａｄｅｃａｍｅｒ）（１３個の治療用タンパク質を含む）、十四量体（ｑｕａｔｒｏｄｅｃａｍｅｒ）（１４個の治療用タンパク質を含む）、十五量体（ｑｕｉｎｄｅｃａｍｅｒ）（１５個の治療用タンパク質を含む）、十六量体（ｓｅｘｄｅｃａｍｅｒ）（１６個の治療用タンパク質を含む）、十七量体（ｓｅｐｔｅｎｄｅｃａｍｅｒ）（１７個の治療用タンパク質を含む）、十八量体（ｏｃｔｏｄｅｃａｍｅｒ）（１８個の治療用タンパク質を含む）、又は十九量体（ｎｏｖｅｎｄｅｃａｍｅｒ）（１９個の治療用タンパク質を含む）。様々な実施形態では、本開示の方法によりアッセイされるＨＭＷ種は、治療用タンパク質の二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、及び八量体の内の１つ又は複数を含み得る。

【0017】

例示的な態様では、本開示の方法によりアッセイされるＨＭＷ種のサイズは、約０．１ミクロン（１００ｎｍ）未満である。任意選択的に、このＨＭＷ種のサイズは、約９９ｎｍ以下である。例示的な態様では、このＨＭＷ種のサイズは、約１０ｎｍ超であり且つ約９９ｎｍ未満である。例示的な態様では、このＨＭＷ種のサイズは、約１５ｎｍ超であり且つ約９９ｎｍ未満である。例示的な態様では、このＨＭＷ種のサイズは、約１５ｎｍ～約９９ｎｍ、約２０ｎｍ～約９９ｎｍ、約３０ｎｍ～約９９ｎｍ、約４０ｎｍ～約９９ｎｍ、約５０ｎｍ～約９９ｎｍ、約６０ｎｍ～約９９ｎｍ、約７０ｎｍ～約９９ｎｍ、約８０ｎｍ～約９９ｎｍ、約９０ｎｍ～約９９ｎｍである。例示的な場合では、このＨＭＷ種のサイズは、約１５ｎｍ～約９０ｎｍ、約１５ｎｍ～約８０ｎｍ、約１５ｎｍ～約７０ｎｍ、約１５ｎｍ～約６０ｎｍ、約１５ｎｍ～約５０ｎｍ、約１５ｎｍ～約４０ｎｍ、約１５ｎｍ～約３０ｎｍ、又は約１５ｎｍ～約２０ｎｍである。

【0018】

様々な態様では、このＨＭＷ種のサイズは、約１５ｎｍ未満である。任意選択的に、このＨＭＷ種のサイズは、約１０ｎｍ未満又は約５ｎｍ未満である。

【0019】

例示的な態様では、本方法は、工程（ａ）前の治療用タンパク質の二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、及び八量体の内の１つ又は複数のレベルをアッセイすることをさらに含む。様々な場合では、工程（ａ）前のサンプル中に存在する治療用タンパク質の二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、及び八量体の内の１つ又は複数のレベルは、既知である。例示的な態様では、アッセイする工程（工程（ｂ））は、治療用タンパク質の二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、又は八量体のそれぞれのレベルをアッセイすることを含む。

【0020】

本明細書で使用される場合、「治療用ポリペプチド」と同義である用語「治療用タンパク質」は、疾患又は病状の処置のために対象に投与された場合に治療効果を有するか又は有することが意図されている少なくとも１本のポリペプチド鎖を含む、天然起源であり得るか又は非天然起源であり得る（例えば、操作され得るか若しくは合成であり得る）あらゆるタンパク質又はポリペプチド分子を指す。２個の治療用タンパク質が同一のアミノ酸配列を有する場合、これら２個の治療用タンパク質は、同一の治療用タンパク質と見なされる。

【0021】

例示的な態様では、治療用タンパク質は、組換えタンパク質である。「組換えタンパク質」は、生細胞内での組換えＤＮＡの発現により生じるあらゆるタンパク質又はポリペプチドを意味する。用語「組換えＤＮＡ」は、任意の天然起源のゲノム中に見出されないＤＮＡ分子を作製するために複数の供給源からの遺伝物質の遺伝子組換え（例えば分子クローニング）により形成された、あらゆるＤＮＡ分子を意味する。この複数の供給源は、異なる分子由来であってもよいし、同一分子の異なる部分由来であってもよい。組換えＤＮＡは、一部の態様では、天然起源のタンパク質をコードする。他の態様では、組換えＤＮＡは、天然には存在しない（例えば非天然起源の）タンパク質をコードする。

【0022】

様々な態様では、治療用タンパク質は、抗体、抗体の抗原結合断片、又は抗体タンパク質製品である。例示的な態様では、治療用タンパク質は、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、リンホカイン、融合タンパク質、細胞表面受容体、又はこれらの任意のリガンドである。例示的な治療用タンパク質は、当技術分野で既知であり、且つ本明細書でも説明されている。

【0023】

ＨＭＷ種のインビボでのレベルをアッセイする本開示の方法に関して、この方法は、混合物をインキュベートすることであって、この混合物は、治療用タンパク質を含むサンプルと、血清又はその枯渇画分とを含む、インキュベートすることを含む。例示的な態様では、この治療用タンパク質は、約１０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬの最終濃度で、この混合物中に存在する。ある特定の場合には、この治療用タンパク質は、下記の最終濃度で、この混合物中に存在する：約１０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１５０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約７５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約７５μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約１５０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、又は約２５０μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ（例えば、５０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、７０μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、９０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、１１０μｇ／ｍＬ、１２０μｇ／ｍＬ、１３０μｇ／ｍＬ、１４０μｇ／ｍＬ、１５０μｇ／ｍＬ、１６０μｇ／ｍＬ、１７０μｇ／ｍＬ、１８０μｇ／ｍＬ、１９０μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、２１０μｇ／ｍＬ、２２０μｇ／ｍＬ、２３０μｇ／ｍＬ、２４０μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、２６０μｇ／ｍＬ、２７０μｇ／ｍＬ、２８０μｇ／ｍＬ、２９０μｇ／ｍＬ、及び３００μｇ／ｍＬ）。任意選択的に、この治療用タンパク質は、約１００μｇ／ｍＬ超の最終濃度又は約２００μｇ／ｍＬ超の最終濃度で、この混合物中に存在する。一部の態様では、この治療用タンパク質は、約３００μｇ／ｍＬ超の最終濃度又は約５００μｇ／ｍＬをさらに超える最終濃度で、この混合物中に存在する。

【0024】

用語「血清」は、本明細書で使用される場合、凝固タンパク質及び血液細胞が除去された後に残る血液の画分を指す。「血清の枯渇画分」又は「枯渇画分」は、本明細書で使用される場合、１種又は複数種の成分が除去されている血清の画分を意味する。用語「非枯渇血清」又は「全血清」は、成分が除去されていない血清である。例示的な態様では、混合物は、全血清を含む。例示的な態様では、この全血清は、ヒト血清、ウシ血清（例えばウシ胎児血清）、ウサギ血清、マウス血清、ラット血清、カニクイザル血清、ウマ血清、又はブタ血清である。好ましい実施形態では、この全血清は、ヒト血清である。例示的な態様では、血清の枯渇画分は、ＩｇＧ枯渇血清画分又は分子量範囲枯渇血清（「枯渇画分血清」又は「血清の枯渇画分」）である。例示的な態様では、ＩｇＧ枯渇血清画分は、（例えば、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーで）プロテインＡを使用して血清からＩｇＧを除去することにより得られたものである。例示的な態様では、血清の枯渇画分は、予め選択された分量範囲を有する分子が枯渇した画分である。例示的な場合では、この予め選択された分子量範囲は、約３０ｋＤａ～約３００ｋＤａであるか、又はより高い。様々な態様では、枯渇画分を、サイズに基づくろ過、又は遠心分離、又は限外ろ過法により得る（例えば、Ｋｏｒｎｉｌｏｖ ｅｔ ａｌ．．，Ｊ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ７（１）：１４２２６７４（２０１８）を参照されたい）。様々な態様では、枯渇血清を、商業的供給業者（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）、Ｑｕｉｄｅｌ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、及びＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｔｙｌｅｒ，ＴＸ））を介して得る。例示的な態様では、枯渇画分は、２回枯渇画分であり、任意選択的に、ＩｇＧが２回枯渇した画分、又は予め選択された分子量を有する分子が２回枯渇した画分である。「２回枯渇した」は、枯渇技術又は除去技術を２回受けている血清の画分を指す。

【0025】

例示的な場合では、混合物は、インキュベートする工程（工程（ａ））の開始時に、８０％（ｖ／ｖ）超の血清又は枯渇血清を含み、任意選択的に約８５％（ｖ／ｖ）超の血清又は枯渇血清を含む。例示的な態様では、混合物は、インキュベートする工程（工程（ａ））の開始時に、約９０％（ｖ／ｖ）超の血清又は枯渇血清を含み、任意選択的に、約９２％（ｖ／ｖ）～約９８％（ｖ／ｖ）（例えば、約９２％（ｖ／ｖ）、約９３％（ｖ／ｖ）、約９４％（ｖ／ｖ）、約９５％（ｖ／ｖ）、約９６％（ｖ／ｖ）、約９７％（ｖ／ｖ）、約９８％（ｖ／ｖ）、さらには約９９％（ｖ／ｖ）、又はより多く）の血清又は枯渇血清を含む。様々な態様では、混合物は、工程（ａ）の開始時に、約８７％（ｖ／ｖ）超の血清又は枯渇血清を含み、任意選択的に、約９０％（ｖ／ｖ）超の血清又は枯渇血清（例えば、約９２％～約９８％（ｖ）の血清又は枯渇血清）を含む。

【0026】

例示的な態様では、サンプルは、蛍光標識を含む治療用タンパク質を含む。例示的な場合では、本方法は、インキュベートする工程（工程（ａ））前に、治療用タンパク質を蛍光標識で標識することをさらに含む。この蛍光標識は、原理上、通常はコンジュゲーションによりタンパク質に付着し得るあらゆる蛍光標識であり得、例示的な態様では、下記からなる群から選択される：フルオレセイン、ローダミン、ヒドロキシクマリン、アミノクマリン、メトキシクマリン、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｏｒａｎｇｅ、Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ、ＮＢＤ、フィコエリトリン（ＰＥ）、ＰＥ－Ｃｙ５、ＰＥ－Ｃｙ７、Ｒｅｄ ６１３ ＰｅｒＣＰ、ＴｒｕＲｅｄ、ＦｌｕｏｒＸ、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ、Ｇ－Ｄｙｅ１００、Ｇ－Ｄｙｅ２００、Ｇ－Ｄｙｅ３００、Ｇ－Ｄｙｅ４００、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＴＲＩＴＣ、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＡＰＣ－Ｃｙ７、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、及び同類のもの。一部の態様では、この蛍光標識は、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ色素の内のいずれか１つであり、例えば下記である：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０、又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７９０。

【0027】

「インキュベートする」は、成長又は反応に有利な条件下で維持することを意味する。例示的な態様では、インキュベートする工程（工程（ａ））は、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、又は少なくとも約４時間にわたり、混合物をインキュベートすることを含み、任意選択的に、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１８時間、又は少なくとも約２４時間にわたり、混合物をインキュベートすることを含む。例示的な態様では、工程（ａ）は、少なくとも約３０時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４２時間、及び／又は少なくとも約４８時間にわたり、混合物をインキュベートすることを含み、任意選択的に、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、又は少なくとも約１週間にわたり、混合物をインキュベートすることを含む。例示的な態様では、インキュベートする工程（工程（ａ））は、約２５℃～約４０℃、約３０℃～約４０℃、又は約３５℃～約４０℃で起こる。任意選択的に、インキュベートすることは、約３７℃±２℃で起こる。インキュベートする工程（工程（ａ））のさらなる条件は、実施例で例示されているように本明細書で説明されている。

【0028】

例示的な態様では、本方法は、インキュベートする工程（工程（ａ））後に且つアッセイする工程（工程（ｂ））前に、希釈工程をさらに含む。任意選択的に、混合物を、アッセイする工程（工程（ｂ））前に水又は緩衝液で希釈し、一部の態様では、水又は緩衝液で希釈する。この緩衝液は、当技術分野で既知のいずれか１つ（例えば、限定されないが、表Ａで列挙されているもの）であり得る。

【0029】

【表1】

【0030】

例示的な態様では、アッセイする工程（工程（ｂ））は、ＳＥＣにより、血清又はその枯渇画分を含む混合物中のＨＭＷ種のレベルをアッセイすることを含む。例示的な態様では、このＳＥＣは、ＳＥＣ－高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、又はＳＥＣ蛍光（ＳＥＣ－Ｆｌｕｏｒ）、又はＳＥＣ－ＵＶである。加えて、又は或いは、アッセイする工程（工程（ｂ））は、混合物中のＨＭＷ種のレベルをアッセイするための他の技術、又は最終的には混合物中のＨＭＷ種のレベルの決定を達成するために治療用タンパク質の低分子量（ＬＭＷ；この治療用タンパク質よりも小さい種）種若しくは単量体のレベルをアッセイするための他の技術を含む。アッセイする工程（工程（ｂ））は、下記の内の１つ又は複数を含み得る：質量分析（ＭＳ）、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）に接続され得るＳＥＣ。

【0031】

例示的な態様では、親和性精製は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、親和性クロマトグラフィー、結合標的標識ビーズ（ｂｉｎｄｉｎｇ ｔａｒｇｅｔ－ｌａｂｅｌｅｄ ｂｅａｄ）を使用する沈殿（例えば、ＦｃＲｎ標識ビーズによる沈殿）、標的が表面上で発現される細胞による沈殿（例えば、ＦｃＲｎ受容体が表面で発現される細胞による沈殿）、フリーフロー分画（ｆｒｅｅ ｆｌｏｗ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）（ＦＦＦ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、又は超遠心分離（ＵＣ）である。

【0032】

例示的な態様では、本方法は、インキュベーション工程（工程（ａ））後に且つアッセイする工程（工程（ｂ））前に、分離工程であって、混合物の成分を分離する分離工程をさらに含む。例示的な態様では、混合物の成分をクロマトグラフィーにより分離し、任意選択的に、親和性クロマトグラフィーにより分離する。親和性クロマトグラフィーは、当技術分野で既知である。例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｅｄｓ． Ｈａｇｅ ａｎｄ Ｃａｚｅｓ，Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ（２００５）を参照されたい。代替態様では、混合物の成分を、別の種類のクロマトグラフィーにより分離し、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、及び同類のもので分離する。例えば、Ｃｏｓｋｕｎ，Ｎｏｒｔｈ Ｃｌｉｎ Ｉｓｔａｎｂ ３（２）：１５６－１６０（２０１６）を参照されたい。例示的な態様では、親和性クロマトグラフィーは、プロテインＡ、プロテインＬ、又は治療用タンパク質に特異的な抗体、又は他の適切な捕捉タンパク質による親和性クロマトグラフィーである。親和性クロマトグラフィー工程で使用される捕捉タンパク質の選択は、一部の態様では、治療用タンパク質に依存する。一般的態様では、捕捉タンパク質は、治療用タンパク質に結合する。例示的な態様では、治療用タンパク質が、抗体、抗体の抗原結合断片、又は抗体タンパク質製品である場合には、捕捉タンパク質は、この治療用タンパク質が結合する抗原である。例示的な態様では、プロテインＡ、又は治療用タンパク質に特異的な抗体、又は他の適切な捕捉タンパク質を、親和性クロマトグラフィーカラムで使用される樹脂にカップリングさせる。インキュベーション工程（工程（ａ））後に、混合物を、親和性クロマトグラフィーカラムにロードするか、又は捕捉タンパク質、プロテインＡ、プロテインＬ、若しくは治療用タンパク質に特異的な抗体が結合した樹脂と混合し、樹脂に、治療用タンパク質及びそのＨＭＷ種を含む画分が結合する。様々な場合では、プロテインＡ、プロテインＬ、又は治療用タンパク質に特異的な抗体が結合した樹脂を、混合物と共に、１時間未満にわたりインキュベートし、任意選択的に、約３０分未満、約２０分未満、約１５分未満、又はより短い時間にわたりインキュベートする。様々な場合では、プロテインＡ、プロテインＬ、又は治療用タンパク質に特異的な抗体が結合した樹脂を、混合物と共に、約５分～約１０分にわたりインキュベートする。結合した画分を、既知であり得るか又は経験的に決定され得る条件を使用して、樹脂から溶出させる。例示的な実施形態では、親和性クロマトグラフィーは、酸性溶出緩衝液により溶出させることを含む溶出工程を含む。任意選択的に、この酸性溶出緩衝液は、グリシン、又は酢酸、又はクエン酸塩を含む。様々な態様では、この酸性溶出緩衝液は、ｐＨが約２．５～約４．５であり、任意選択的に約２．７５～約４．０である。例示的な場合では、溶出工程により、治療用タンパク質を含む溶出液が得られ、本方法は、この溶出液中に存在する治療用タンパク質のＨＭＷ種のレベルをアッセイすることを含む。

【0033】

例示的な態様では、本方法は、アッセイする抗体（工程（ｂ））でアッセイされる際に混合物中に存在するＨＭＷ種のレベルと、インキュベートする工程（工程（ａ））前にサンプル中に存在するＨＭＷ種のレベルとを比較することをさらに含む。任意選択的に、アッセイする工程（工程（ｂ））でアッセイされる際に混合物中に存在する治療用タンパク質の二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、及び八量体の内の１つ又は複数のレベルを、インキュベートする工程（工程（ａ））前のサンプル中の治療用タンパク質の二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、又は八量体のレベルと比較する。例示的な態様では、本方法は、方程式１：

【数1】

に従って、治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性の割合を算出することをさらに含む。

【0034】

従って、本開示は、治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性を決定する方法を提供する。本開示は、治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性を決定する方法であって、（Ａ）既に説明されている方法の内のいずれかに従って治療用タンパク質の高分子量（ＨＭＷ）種のインビボでのレベルをアッセイすることであり、（ｉ）この方法は、インキュベートする工程（工程（Ａ））前にサンプル中に存在するＨＭＷ種のレベルをアッセイすることをさらに含むか、又は（ｉｉ）インキュベートする工程（工程（ａ））前にサンプル中に存在するＨＭＷ種のレベルは既知である、アッセイすること、及び（Ｂ）混合物中に存在するＨＭＷ種のレベルと、インキュベートする工程（工程（ａ））前にサンプル中に存在するＨＭＷ種のレベルとを比較することを含む方法を提供する。本開示はまた、治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性を決定する方法であって、この治療用タンパク質を含むサンプルと、枯渇血清とを含む混合物をインキュベートすることであり、血清の枯渇画分は、予め選択された分子量範囲を有する分子が枯渇した画分であり、任意選択的に、この予め選択された分子量範囲は、約３０ｋＤａ～約３００ｋＤａであるか、又はより高く、任意選択的に、この枯渇画分は、サイズに基づくろ過により得られる、インキュベートすること、ＳＥＣにより、工程（ａ）後の１つ又は複数の時点で、この混合物中に存在する治療用タンパク質のＨＭＷ種のレベルをアッセイすること、工程（ｂ）でアッセイされる際に混合物中に存在するＨＭＷ種のレベルと、工程（ａ）前にサンプル中に存在するＨＭＷ種のレベルとを比較すること、及びこの治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性の割合を算出することを含む方法も提供される。例示的な態様では、治療用タンパク質は、分子量が約１５ｋＤａであるか、又はより高い。同様に、治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性を決定する方法であって、この治療用タンパク質を含むサンプルと、枯渇血清とを含む混合物をインキュベートすることであり、この枯渇血清は、ＩｇＧ枯渇血清画分であり、任意選択的に、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより血清からＩｇＧを除去することにより得られるＩｇＧ枯渇血清画分である、インキュベートすること、捕捉分子による親和性クロマトグラフィーにより、この混合物の成分を分離して、治療用タンパク質及びそのＨＭＷ種を含む画分を得ること、ＳＥＣにより、この画分中に存在する治療用タンパク質のＨＭＷ種のレベルをアッセイすること、工程（ｃ）でアッセイされる際に画分中に存在するＨＭＷ種のレベルと、工程（ａ）前にサンプル中に存在するＨＭＷ種のレベルとを比較すること、並びにこの治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性の割合を算出することを含む方法が提供される。例示的な態様では、捕捉分子は、プロテインＡであり、治療用タンパク質は、プロテインＡに結合し、任意選択的に、この治療用タンパク質は、プロテインＡ結合部位を含む抗体、Ｆｃ融合タンパク質、又は抗体タンパク質製品である。例示的な態様では、工程（ｂ）は、（ｉ）混合物を親和性クロマトグラフィーカラムにロードして、治療用タンパク質を含む結合画分を得ること、及び（ｉｉ）この結合画分をカラムから溶出させることを含む。本開示は、治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性を決定する方法であって、この治療用タンパク質を含むサンプルと、全血清とを含む混合物をインキュベートすることであり、この治療用タンパク質は、蛍光標識を含む、インキュベートすること、この混合物を希釈すること、ＳＥＣにより、工程（ａ）後の１つ又は複数の時点で、この混合物中に存在する治療用タンパク質のＨＭＷ種のレベルをアッセイすること、工程（ｃ）でアッセイされる際に混合物中に存在するＨＭＷ種のレベルと、工程（ａ）前にサンプル中に存在するＨＭＷ種のレベルとを比較すること、及びこの治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性の割合を算出することを含む方法をさらに提供する。本開示は、治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性を決定する方法であって、この治療用タンパク質を含むサンプルと、全血清とを含む混合物をインキュベートすること、捕捉分子による親和性クロマトグラフィーにより、この混合物の成分を分離して、治療用タンパク質及びそのＨＭＷ種を含む画分を得ること、ＳＥＣにより、この画分中に存在する治療用タンパク質のＨＭＷ種のレベルをアッセイすること、工程（ｃ）でアッセイされる際に画分中に存在するＨＭＷ種のレベルと、工程（ａ）前にサンプル中に存在するＨＭＷ種のレベルとを比較すること、並びにこの治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性の割合を算出することを含む方法をさらに提供する。例示的な態様では、この捕捉分子は、治療用タンパク質に結合する抗体又は抗体以外の分子である。例示的な態様では、アッセイする工程（工程（ｂ））は、（ｉ）混合物を親和性クロマトグラフィーカラムにロードして、治療用タンパク質を含む結合画分を得ること、及び（ｉｉ）この結合画分をカラムから溶出させることを含む。例示的な態様では、治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性の割合を、方程式１に従って算出する。

【0035】

例示的な治療用タンパク質
例示的な態様では、治療用タンパク質は、抗体である。本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、重鎖及び軽鎖を含み、且つ可変領域及び定常領域を含む、従来の免疫グロブリン構成を有するタンパク質を指す。例えば、抗体は、２個の同一ペアのポリペプチド鎖の「Ｙ字形」構造であるＩｇＧであり得、各ペアは、１本の「軽」（典型的には、分子量が約２５ｋＤａ）及び１本の「重」鎖（典型的には、分子量が約５０～７０ｋＤａ）を有する。抗体は、可変領域及び定常領域を有する。ＩｇＧ型では、可変領域は、一般に、約１００～１１０個又はより多くのアミノ酸であり、３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、主に抗原認識に関与し、異なる抗原に結合する抗体間で実質的に異なる。定常領域は、抗体が免疫系の細胞及び分子を動員することを可能にする。可変領域は、各軽鎖及び重鎖のＮ末端領域からできているが、定常領域は、重鎖及び軽鎖のそれぞれのＣ末端部分からできている。（Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，４ｔｈｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．／Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，（１９９９））。

【0036】

抗体のＣＤＲの一般的な構造及び性質は、当技術分野で説明されている。簡潔に説明すると、抗体の骨格において、ＣＤＲは、重鎖及び軽鎖の可変領域中のフレームワーク内に埋め込まれており、そこで抗原結合及び抗原認識に大きい役割を果たす領域を構成する。可変領域は、典型的には、少なくとも３個の重鎖ＣＤＲ又は軽鎖ＣＤＲを含み（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎ．Ｉ．Ｈ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３も参照されたい）、これらは、フレームワーク領域（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１によりフレームワーク領域１～４、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４と呼ばれている；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７、前掲も参照されたい）中にある。

【0037】

抗体は、当技術分野で既知のあらゆる定常領域を含み得る。ヒト軽鎖は、カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、又はイプシロンに分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥと定義する。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４が挙げられるがこれらに限定されないいくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２が挙げられるがこれらに限定されないサブクラスを有する。本開示の実施形態は、抗体のそのようなクラス又はアイソタイプの全てを含む。軽鎖定常領域は、例えば、カッパ型又はラムダ型の軽鎖定常領域であり得、例えば、ヒトカッパ型又はヒトラムダ型の軽鎖定常領域であり得る。重鎖定常領域は、例えば、アルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型、又はミュー型の重鎖定常領域であり得、例えば、ヒトアルファ型、ヒトデルタ型、ヒトイプシロン型、ヒトガンマ型、又はヒトミュー型の重鎖定常領域であり得る。従って、例示的な実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４の内のいずれか１つを含む、アイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭの抗体である。

【0038】

抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。一部の実施形態では、抗体は、哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ハムスター、ヒト、及び同類のもの）により産生された天然起源の抗体に実質的に類似する配列を含む。この点において、抗体は、哺乳動物抗体（例えば、マウス抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ウマ抗体、ニワトリ抗体、ハムスター抗体、ヒト抗体、及び同類のもの）と見なされ得る。ある特定の態様では、抗体は、ヒト抗体である。ある特定の態様では、抗体は、キメラ抗体又はヒト化抗体である。用語「キメラ抗体」は、２種以上の異なる抗体由来のドメインを含む抗体を指す。キメラ抗体は、例えば、ある種由来の定常ドメインと、別の種由来の可変ドメインとを含み得るか、又はより一般的には、少なくとも２つの種由来のアミノ酸配列のストレッチを含み得る。キメラ抗体はまた、同一種内の２種以上の異なる抗体のドメインも含み得る。用語「ヒト化」は、抗体に関して使用される場合、本来の源の抗体よりも真のヒト抗体に類似する構造及び免疫機能を有するように操作されている、非ヒト源由来の少なくともＣＤＲ領域を有する抗体を指す。例えば、ヒト化は、マウス抗体等の非ヒト抗体からヒト抗体へのＣＤＲの移植を含み得る。ヒト化はまた、非ヒト配列をヒト配列にさらに類似させるために選択アミノ酸置換も含み得る。

【0039】

抗体を、例えばパパイン及びペプシン等の酵素により切断して断片にし得る。パパインは、抗体を切断して、２個のＦａｂ断片及び単一のＦｃ断片を生じる。ペプシンは、抗体を切断して、Ｆ（ａｂ’）２断片及びｐＦｃ’断片を生じる。本開示の例示的態様では、治療用タンパク質は、抗原結合断片又は抗体である。本明細書で使用される場合、用語「抗原結合性抗体断片」は、抗体の抗原に結合し得る部分を指し、「抗原結合断片」又は「抗原結合部分」としても知られている。例示的な場合では、抗原結合性抗体断片は、Ｆａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片である。

【0040】

様々な態様では、治療用タンパク質は、抗体タンパク質製品である。本明細書で使用される場合、用語「抗体タンパク質製品」は、様々な場合で抗体の構造をベースとするが天然には見出されないいくつかの抗体代替品の内のいずれか１つを指す。一部の態様では、抗体タンパク質製品は、分子量が少なくとも約１２～１５０ｋＤａの範囲内である。ある特定の態様では、抗体タンパク質製品は、結合価（ｎ）の範囲が、より高次の結合価ではないかもしれないが、単量体（ｎ＝１）から二量体（ｎ＝２）、三量体（ｎ＝３）、四量体（ｎ＝４）までである。抗体タンパク質製品は、一部の態様では、完全な抗体構造に基づくもの、及び／又は完全な抗原結合能を保持する抗体断片を模倣するもの（例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂ、及びＶＨＨ／ＶＨ（下記で考察する）ものである。完全な抗原結合性部位を保持する最小の抗原結合性抗体断片は、専ら可変（Ｖ）領域からなるＦｖ断片である。可溶性で柔軟なアミノ酸ペプチドリンカーを使用して、Ｖ領域をｓｃＦｖ（一本鎖断片可変）断片に連結させて分子を安定化させるか、又は定常（Ｃ）ドメインをＶ領域に加えて、Ｆａｂ断片［断片、抗原結合性］を生成する。ｓｃＦｖ断片及びＦａｂ断片の両方を、宿主細胞（例えば原核生物宿主細胞）中で容易に産生させ得る。他の抗体タンパク質製品として、ジスルフィド結合安定化ｓｃＦｖ（ｄｓ－ｓｃＦｖ）、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、並びにオリゴマー化ドメインに連結されたｓｃＦｖからなる異なる形式を含む、ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディ、又はミニボディ（ミニＡｂ）のような二量体抗体形式及び多量体抗体形式が挙げられる。最小の断片は、ラクダ類重鎖Ａｂ及び単一ドメインＡｂ（ｓｄＡｂ）のＶＨＨ／ＶＨである。新規の抗体形式を作製するために最も頻繁に使用される構築ブロックは、約１５個のアミノ酸残基のペプチドリンカーにより連結された重鎖及び軽鎖（ＶＨドメイン及びＶＬドメイン）由来のＶドメインを含む一本鎖可変（Ｖ）－ドメイン抗体断片（ｓｃＦｖ）である。ペプチボディ又はペプチド－Ｆｃ融合体は、さらに別の抗体タンパク質製品である。ペプチボディの構造は、Ｆｃドメインに移植された生物学的に活性なペプチドからなる。ペプチボディは、当技術分野で十分に説明されている。例えば、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ４（５）：５８６－５９１（２０１２）を参照されたい。

【0041】

他の抗体タンパク質製品として、一本鎖抗体（ＳＣＡ）；ダイアボディ；トリアボディ；テトラボディ；二重特異性抗体又は三重特異性抗体；及び同類のものが挙げられる。二重特異性抗体は、下記の５つの主要なクラスに分類され得る：ＢｓＩｇＧ、付加ＩｇＧ（ａｐｐｅｎｄｅｄ ＩｇＧ）、ＢｓＡｂ断片、二重特異性融合タンパク質、及びＢｓＡｂコンジュゲート。例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７（２）Ｐａｒｔ Ａ：９７－１０６（２０１５）を参照されたい。

【0042】

例示的な態様では、治療用タンパク質は、人工の二重特異性モノクローナル抗体である二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ）（ＢｉＴＥ（登録商標））分子である。標準的なＢｉＴＥ（登録商標）分子は、異なる抗体の２個のｓｃＦｖを含む融合タンパク質である。一方はＣＤ３に結合し、他方は標的抗原に結合する。ＢｉＴＥ（登録商標）分子は、当技術分野で既知である。例えば、Ｈｕｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．．，Ｉｍｍｕｎｏ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９３（３）：２９０－２９６（２０１５）；Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．．，ＭＡｂｓ ６（２）：３８１－９１（２０１４）；Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １２（８）：ｅ０１８３３９０を参照されたい。

【0043】

例示的な態様では、治療用タンパク質は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。キメラ抗原受容体は、典型的には免疫細胞により発現される他の天然起源の分子の複数のドメインから構成される遺伝子操作された融合タンパク質である。いくつかの態様では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン又は抗原認識ドメイン、シグナル伝達ドメイン、及び共刺激ドメインを含む。ＣＡＲは、当技術分野で説明されている。例えば、Ｍａｕｓ ｅｔ ａｌ．．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２２（８）：１８７５－１８８４（２０１６）；Ｄｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．．，Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｖ（２０１４）２５７（１）：１０．１１１１／ｉｍｒ．１２１３１；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０１２）：１８（１０）：２７８０－２７９０；及びＪｕｎｅ ａｎｄ Ｓａｄｅｌａｉｎ，ＮＥＪＭ ３７９：６４－７３（２０１８）を参照されたい。

【0044】

例示的な治療用タンパク質として下記が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＤタンパク質、増殖因子、増殖因子受容体タンパク質（例えば、ＨＥＲ受容体ファミリタンパク質）、細胞接着分子（例えば、ＬＦＡ－Ｉ、ＭｏＩ、ｐｌ５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－Ｉ、ＶＣＡＭ、及びアルファｖ／ベータ３ インテグリン）、ホルモン（例えばインスリン）、凝固因子、凝固関連タンパク質、コロニー刺激因子及びその受容体、並びに他の受容体、及びこれらの受容体の受容体関連タンパク質又はリガンド、ウイルス抗原。

【0045】

例示的な治療用タンパク質として、例えば、ＣＤタンパク質の内のいずれか１つが挙げられ、例えば下記が挙げられる：ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ１１Ｃ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１５ｓ、ＣＤ１６、ＣＤｗ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１，ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤｗ６０、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６６ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７６、ＣＤ７９α、ＣＤ７９β、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤｗ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤｗ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤｗ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤｗ１２８、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤｗ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤｗ１３６、ＣＤｗ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５０、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８ａ、ＣＤ１５８ｂ、ＣＤ１６１、ＣＤ１６２、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、及びＣＤ１８２。

【0046】

例示的な増殖因子として、例えば下記が挙げられる：血管内皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ミュラー管阻害物質（ＭＩＳ）、ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ－Ｉ－アルファ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、例えばＮＧＦ－ベータ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、例えばａＦＧＦ及びｂＦＧＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えば、特にＴＧＦ－α及びＴＧＦ－β、例えばＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β４、又はＴＧＦ－β５、インスリン様増殖因子Ｉ及びインスリン様成増殖子ＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）、ｄｅｓ（ｌ－３）－ＩＧＦ－Ｉ（脳ＩＧＦ－Ｉ）、並びに骨誘導因子。一部の態様での治療用タンパク質は、インスリン又はインスリン関連タンパク質であり、例えば、インスリン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、及びインスリン様増殖因子結合タンパク質である。例示的な増殖因子受容体として、上記の増殖因子の内のいずれかの任意の受容体が挙げられる。様々な態様では、増殖因子受容体は、ＨＥＲ受容体ファミリタンパク質（例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、及びＥＧＦ受容体）、ＶＥＧＦ受容体、ＴＳＨ受容体、ＦＳＨ受容体、ＬＨ受容体、ＧＨＲＦ受容体、ＰＴＨ受容体、ＭＩＳ受容体、ＭＩＰ－１－アルファ受容体、ＥＰＯ受容体、ＮＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ＥＧＦ受容体、（ＥＧＦＲ）、ＴＧＦ受容体、又はインスリン受容体である。

【0047】

例示的な凝固及び凝固関連タンパク質として、例えば、下記が挙げられる：第ＶＩＩＩ因子、組織因子、フォン・ヴィレブランド因子、プロテインＣ、アルファ－１－アンチトリプシン、プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼ及び組織プラスミノーゲン活性化因子（「ｔ－ＰＡ」）、ボンバジン（ｂｏｍｂａｚｉｎｅ）、トロンビン、及びトロンボポエチン；（ｖｉｉ）他の血液タンパク質及び血清タンパク質、例えば、限定されないが、アルブミン、ＩｇＥ、及び血液型抗原。数ある中でも下記が挙げられるコロニー刺激因子及びその受容体：Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＧ－ＣＳＦ、並びにこれらの受容体、例えばＣＳＦ－１受容体（ｃ－ｆｍｓ）。例えば、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体、肥満（ＯＢ）受容体、ＬＤＬ受容体、成長ホルモン受容体、トロンボポエチン受容体（「ＴＰＯ－Ｒ」、「ｃ－ｍｐｌ」）、グルカゴン受容体、インターロイキン受容体、インターフェロン受容体、Ｔ細胞受容体、ｃ－Ｋｉｔ等の幹細胞因子受容体、及び他の受容体が挙げられる受容体及び受容体関連タンパク質。例えば、ＯＸ４０受容体のリガンドであるＯＸ４０Ｌが挙げられる受容体リガンド。骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、及びニューロトロフィン－３、－４、－５、又は－６（ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＮＴ－５、又はＮＴ－６）が挙げられる神経栄養因子。リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、及びプロリラキシン；インターフェロン及びインターフェロン受容体、例えば、インターフェロン－α、－β、及び－γ、並びにこれらの受容体。数ある中でもＩＬ－１～ＩＬ－３３及びＩＬ－１～ＩＬ－３３受容体（例えばＩＬ－８受容体）が挙げられるインターロイキン及びインターロイキン受容体。ＡＩＤＳエンベロープウイルス抗原が挙げられるウイルス抗原。リポタンパク質、カルシトニン、グルカゴン、心房性ナトリウム利尿因子、肺界面活性物質、腫瘍壊死因子アルファ及びベータ、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｌｙ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、ＤＮＡｓｅ、インヒビン、及びアクチビン。インテグリン、プロテインＡ又はＤ、リウマチ因子、免疫毒素、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、スーパーオキシド・ジスムターゼ、表面膜タンパク質、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＡＩＤＳエンベロープ、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレシン、調節タンパク質、イムノアドヘシン、抗体。さらなる例示的な治療用タンパク質として、例えば下記が挙げられる：ミオスタチン、ＴＡＬＬタンパク質、例えばＴＡＬＬ－Ｉ、アミロイドタンパク質、例えば、限定されないがアミロイドベータタンパク質、胸腺間質性リンパ球新生因子（「ＴＳＬＰ」）、ＲＡＮＫリガンド（「ＯＰＧＬ」）、ｃ－ｋｉｔ、ＴＮＦ受容体、例えばＴＮＦ受容体１型、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、アンジオポエチン、及び前述の内の何れかの生物活性断片又は類似体又は変異体。

【0048】

例示的態様では、治療用タンパク質は、下記として既知の治療薬の内のいずれか１つである：Ａｃｔｉｖａｓｅ（登録商標）（アルテプラーゼ）；アリロクマブ、Ａｒａｎｅｓｐ（登録商標）（ダルベポエチン－アルファ）、Ｅｐｏｇｅｎ（登録商標）（エポエチンアルファ若しくはエリスロポエチン）；Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）（インターフェロンβ－１ａ）；Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）（トシツモマブ）；Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）（インターフェロンβ）；ボコシズマブ（Ｌ１Ｌ３と指定された抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体、米国特許第８０８０２４３号明細書を参照されたい）；Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）（アレムツズマブ）；Ｄｙｎｅｐｏ（登録商標）（エポエチンデルタ）；Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）（ボルテゾミブ）；ＭＬＮ０００２（抗α４β７ ｍＡｂ）；ＭＬＮ１２０２（抗ＣＣＲ２ケモカイン受容体ｍＡｂ）；Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト）；Ｅｐｒｅｘ（登録商標）（エポエチンアルファ）；Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）；エボロクマブ；Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（登録商標）（ソマトロピン）；Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）；Ｈｕｍａｔｒｏｐｅ（登録商標）（ソマトロピン［ｒＤＮＡ由来］注射液）；Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）（アダリムマブ）；Ｉｎｆｅｒｇｅｎ（登録商標）（インターフェロンアルファコン－１）；Ｎａｔｒｅｃｏｒ（登録商標）（ネシリチド）；Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標）（アナキンラ）、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）（サルガモスチム）；ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ（登録商標）（エプラツズマブ）；Ｂｅｎｌｙｓｔａ（商標）（ベリムマブ）；Ｍｅｔａｌｙｓｅ（登録商標）（テネクテプラーゼ）；Ｍｉｒｃｅｒａ（登録商標）（メトキシポリエチレングリコールエポエチンベータ）；Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）（ゲムツズマブオゾガマイシン）；Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標）（エファリズマブ）；Ｃｉｍｚｉａ（登録商標）（セルトリズマブペゴル）；Ｓｏｌｉｒｉｓ（商標）（エクリズマブ）；ペキセリズマブ（抗Ｃ５補体）；ＭＥＤＩ－５２４（Ｎｕｍａｘ（登録商標））；Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）（ラニビズマブ）；エドレコロマブ（Ｐａｎｏｒｅｘ（登録商標））；Ｔｒａｂｉｏ（登録商標）（レルデリムマブ）；ＴｈｅｒａＣｉｍ ｈＲ３（ニモツズマブ）；Ｏｍｎｉｔａｒｇ（ペルツズマブ、２Ｃ４）；Ｏｓｉｄｅｍ（登録商標）（ＩＤＭ－Ｉ）；ＯｖａＲｅｘ（登録商標）（Ｂ４３．１３）；Ｎｕｖｉｏｎ（登録商標）（ビジリズマブ）；カンツズマブメルタンシン（ｈｕＣ２４２－ＤＭｌ）；ＮｅｏＲｅｃｏｒｍｏｎ（登録商標）（エポエチンベータ）；Ｎｅｕｍｅｇａ（登録商標）（オプレルベキン）；Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標）（ＰＥＧ化フィルガストリム、ＰＥＧ化Ｇ－ＣＳＦ、ＰＥＧ化ｈｕ－Ｍｅｔ－Ｇ－ＣＳＦ）；Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）（フィルグラスチム）；Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ ＯＫＴ３（登録商標）（ムロモナブ－ＣＤ３）、Ｐｒｏｃｒｉｔ（登録商標）（エポエチンアルファ）；Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）（インフリキシマブ）、Ｒｅｏｐｒｏ（登録商標）（アブシキシマブ）、Ａｃｔｅｍｒａ（登録商標）（抗ＩＬ６受容体ｍＡｂ）、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ）、ＨｕＭａｘ－ＣＤ４（ザノリムマブ）、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ）；Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）（エルロチニブ）；Ｒｏｆｅｒｏｎ－Ａ（登録商標）（インターフェロンアルファ－２ａ）；Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標）（バシリキシマブ）；Ｓｔｅｌａｒａ（商標）（ウステキヌマブ）；Ｐｒｅｘｉｇｅ（登録商標）（ルミラコキシブ）；Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）（パリビズマブ）；１４６Ｂ７－ＣＨＯ（抗ＩＬ１５抗体、米国特許第７１５３５０７号明細書を参照されたい）、Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）（ナタリズマブ）；Ｖａｌｏｒｔｉｍ（登録商標）（ＭＤＸ－１３０３、抗炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）防御抗原ｍＡｂ）；ＡＢｔｈｒａｘ（商標）；Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）；Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）（オマリズマブ）、ＥＴＩ２１１（抗ＭＲＳＡ ｍＡｂ）、ＩＬ－Ｉ Ｔｒａｐ（ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分及び両ＩＬ－Ｉ受容体成分（１型受容体及び受容体補助タンパク質）の細胞外ドメイン）、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ（ＩｇＧ１ Ｆｃと融合したＶＥＧＦＲ１のＩｇドメイン）、Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）（ダクリズマブ）；Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）（ダクリズマブ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン）、Ｚｅｔｉａ（エゼチマイブ）、アタシセプト（ＴＡＣＩ－Ｉｇ）、抗α４β７ ｍＡｂ（ベドリズマブ）；ガリキシマブ（抗ＣＤ８０モノクローナル抗体）、抗ＣＤ２３ ｍＡｂ（ルミリキシマブ）；ＢＲ２－Ｆｃ（ｈｕＢＲ３／ｈｕＦｃ融合タンパク質、可溶性ＢＡＦＦ拮抗薬）；Ｓｉｍｐｏｎｉ（商標）（ゴリムマブ）；マパツズマブ（ヒト抗ＴＲＡＩＬ受容体－１ ｍＡｂ）；オクレリズマブ（抗ＣＤ２０ヒトｍＡｂ）；ＨｕＭａｘ－ＥＧＦＲ（ザルツムマブ）；Ｍ２００（ボロシキシマブ、抗α５β１インテグリンｍＡｂ）；ＭＤＸ－０１０（イピリムマブ、抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂ及びＶＥＧＦＲ－１（ＩＭＣ－１８Ｆ１）；抗ＢＲ３ ｍＡｂ；抗Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ及び毒素Ｂ Ｃ ｍＡｂｓ ＭＤＸ－０６６（ＣＤＡ－Ｉ）及びＭＤＸ－１３８８）；抗ＣＤ２２ ｄｓＦｖ－ＰＥ３８コンジュゲート（ＣＡＴ－３８８８及びＣＡＴ－８０１５）；抗ＣＤ２５ ｍＡｂ（ＨｕＭａｘ－ＴＡＣ）；抗ＴＳＬＰ抗体；抗ＴＳＬＰ受容体抗体（米国特許第８１０１１８２号明細書）；Ａ５と指定された抗ＴＳＬＰ抗体（米国特許第７９８２０１６号明細書）；（抗ＣＤ３ ｍＡｂ（ＮＩ－０４０１））；アデカツムマブ（ＭＴ２０１、抗ＥｐＣＡＭ－ＣＤ３２６ ｍＡｂ）；ＭＤＸ－０６０、ＳＧＮ－３０、ＳＧＮ－３５（抗ＣＤ３０ ｍＡｂ）；ＭＤＸ－１３３３（抗ＩＦＮＡＲ）；ＨｕＭａｘ ＣＤ３８（抗ＣＤ３８ ｍＡｂ）；抗ＣＤ４０Ｌ ｍＡｂ；抗Ｃｒｉｐｔｏ ｍＡｂ；抗ＣＴＧＦ特発性肺線維症第１期フィブロゲン（ＦＧ－３０１９）；抗ＣＴＬＡ４ ｍＡｂ；抗エオタキシン１ ｍＡｂ（ＣＡＴ－２１３）；抗ＦＧＦ８ ｍＡｂ；抗ガングリオシドＧＤ２ ｍＡｂ；抗スクレロスチン抗体（米国特許第８７１５６６３号明細書又は同第７５９２４２９号明細書を参照されたい）、Ａｂ－５と指定された抗スクレロスチン抗体（米国特許第８７１５６６３号明細書又は同第７５９２４２９号明細書）；抗ガングリオシドＧＭ２ ｍＡｂ；抗ＧＤＦ－８ヒトｍＡｂ（ＭＹＯ－０２９）；抗ＧＭ－ＣＳＦ受容体ｍＡｂ（ＣＡＭ－３００１）；抗ＨｅｐＣ ｍＡｂ（ＨｕＭａｘ ＨｅｐＣ）；ＭＥＤＩ－５４５、ＭＤＸ－１１０３（抗ＩＦＮα ｍＡｂ）；抗ＩＧＦ１Ｒ ｍＡｂ；抗ＩＧＦ－１Ｒ ｍＡｂ（ＨｕＭａｘ－Ｉｎｆｌａｍ）；抗ＩＬ１２／ＩＬ２３ｐ４０ ｍＡｂ（ブリアキヌマブ）；抗ＩＬ－２３ｐ１９ ｍＡｂ（ＬＹ２５２５６２３）；抗ＩＬ１３ ｍＡｂ（ＣＡＴ－３５４）；抗ＩＬ－１７ ｍＡｂ（ＡＩＮ４５７）；抗ＩＬ２Ｒａ ｍＡｂ（ＨｕＭａｘ－ＴＡＣ）；抗ＩＬ５受容体ｍＡｂ；抗インテグリン受容体ｍＡｂ（ＭＤＸ－Ｏｌ８、ＣＮＴＯ９５）；抗ＩＰＩＯ潰瘍性大腸炎ｍＡｂ（ＭＤＸ－１１００）；抗ＬＬＹ抗体；ＢＭＳ－６６５１３；抗マンノース受容体／ｈＣＧβ ｍＡｂ（ＭＤＸ－１３０７）；抗メソテリンｄｓＦｖ－ＰＥ３８コンジュゲート（ＣＡＴ－５００１）；抗ＰＤｌｍＡｂ（ＭＤＸ－１ １０６（ＯＮＯ－４５３８））；抗ＰＤＧＦＲα抗体（ＩＭＣ－３Ｇ３）；抗ＴＧＦβ ｍＡｂ（ＧＣ－１００８）；抗ＴＲＡＩＬ受容体－２ヒトｍＡｂ（ＨＧＳ－ＥＴＲ２）；抗ＴＷＥＡＫ ｍＡｂ；抗ＶＥＧＦＲ／Ｆｌｔ－１ ｍＡｂ；抗ＺＰ３ ｍＡｂ（ＨｕＭａｘ－ＺＰ３）；ＮＶＳ抗体＃１；ＮＶＳ抗体＃２、又はアミロイドベータモノクローナル抗体。

【0049】

治療用タンパク質のさらなる例として、表Ｂで示されている抗体、及び下記の内のいずれかが挙げられる：インフリキシマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ラニビズマブ、パリビズマブ、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アクトクスマブ、アダリムマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ、アラシズマブペゴル、ａｌｄ５１８、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブマフェナトクス、アンルキンズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アセリズマブ、アルチヌマブ（ａｌｔｉｎｕｍａｂ）、アトリズマブ、アトロリムマブ、トシリズマブ、バピヌズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベルチリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ビシロマブ、ビバツズマブ、ビバツズマブメルタンシン、ブリナツモマブ、ブロソズマブ、ブレンツキシマブベドチン、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、カナキヌマブ、カンツズマブメルタンシン、カンツズマブメルタンシン、カプラシズマブ、カプロマブペンデチド、カルルマブ、カツマキソマブ、ｃｃ４９、セデリズマブ、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、シタツズマブボガトクス、シクスツムマブ、クラザキズマブ、クレノリキシマブ、クリバツズマブテトラキセタン、コナツムマブ、クレネズマブ、ｃｒ６２６１、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダロツズマブ、ダラツムマブ、デミシズマブ、デノスマブ、デツモマブ、ドルリモマブアリトクス、ドロジツマブ、デュリゴツマブ、デュピルマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドバコマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ、エロツズマブ、エルシリモマブ、エナバツズマブ、エンリモマブペゴル、エノキズマブ、エノチクマブ、エンシツキシマブ、エピツモマブシツキセタン、エピラツズマブ、エレヌマブ、エルリズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、エトロリズマブ、エボロクマブ、エキシビビルマブ、ファノレソマブ、ファラリモマブ、ファルレツズマブ、ファシヌマブ、ｆｂｔａ０５、フェルビズマブ、フェザキヌマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フォントリズマブ、フォラルマブ、フォラビルマブ、フレソリムマブ、フルラヌマブ、フツキシマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゲボキズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブベドチン、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ、ｇｓ６６２４、イバリズマブ、イブリツモマブチウキセタン、イクルクマブ、イゴボマブ、イムシロマブ、イムガツズマブ、インクラクマブ、インダツキシマブラブタンシン、インフリキシマブ、インテツムマブ、イノリモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ、イトリズマブ、イキセキズマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、レブリキズマブ、レマレソマブ、レルデリムマブ、レキサツムマブ、リビビルマブ、リゲリズマブ、リンツズマブ、リリルマブ、ロルボツズマブメルタンシン、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツズマブ、マスリモマブ、マブリリムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モガムリズマブ、モロリムマブ、モタビズマブ、モキセツモマブパスドトクス、ムロモナブ－ｃｄ３、ナコロマブタフェナトクス、ナミルマブ、ナプツモマブエスタフェナトクス、ナルナツマブ、ナタリズマブ、ネバクマブ、ネシツムマブ、ネレリモマブ、ネスバクマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブメルペンタン、オカラツズマブ、オクレリズマブ、オデュリモマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オロキズマブ、オマリズマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブモナトクス、オレゴボマブ、オルチクマブ、オテリキシズマブ、オキセルマブ、オザネズマブ、オゾラリズマブ、パジバキシマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パノバクマブ、パルサツズマブ、パスコリズマブ、パテクリズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペラキズマブ、ペルツズマブ、パキセリズマブ、ピジリズマブ、ピンツモマブ、プラクルマブ、ポネズマブ、プリリキシマブ、プリツムマブ、ＰＲＯ１４０、クイリズマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラフィビルマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、ロレデュマブ、ロモソズマブ、ロンタリズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、サマリズマブ、サリルマブ、サツモマブペンデチデ、セクキヌマブ、セビルマブ、シブロツズマブ、シファリムマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、シプリズマブ、シルクマブ、ソラネズマブ、ソリトマブ、ソネプシズマブ、ソンツズマブ、スタムルマブ、スレソマブ、スビズマブ、タバルマブ、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タネズマブ、タプリツモマブパプトクス、テフィバズマブ、テリモマブアリトクス、テナツモマブ、テフィバズマブ、テネリキシマブ、テプリズマブ、テプロツムマブ、テゼペルマブ、ＴＧＮ１４１２、トレメリムマブ、チシリムマブ、チルドラキズマブ、チガツズマブ、ＴＮＸ－６５０、トシリズマブ、トラリズマブ、トシツモマブ、トラロキヌマブ、トラスツズマブ、ＴＲＢＳ０７、トレガリズマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ツビルマブ、ウブリツキシマブ、ウレルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、バパリキシマブ、バテリズマブ、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ベセンクマブ、ビジリズマブ、ボロシキシマブ、ボルセツズマブマフォドチン、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザノリムマブ、ザツキシマブ、ジラリムマブ、ゾリモマブアリトクス。

【0050】

【表2】

【0051】

【表3】

【0052】

【表4】

【0053】

一部の実施形態では、治療用ポリペプチドは、ＢｉＴＥ（登録商標）分子である。ブリナツモマブ（ＢＬＩＮＣＹＴＯ（登録商標））は、ＣＤ１９に特異的なＢｉＴＥ（登録商標）分子の一例である。改変されているＢｉＴＥ（登録商標）分子（例えば、半減期を延長するように改変されているもの）も、本開示の方法で使用し得る。

【0054】

下記の実施例は、本発明を単に例示するために示されており、いかなる形であっても本発明の範囲を限定するものではない。

【実施例】

【0055】

下記の実施例は、治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性をアッセイする例示的な方法を説明する。各実施例では、治療用タンパク質のサンプルを、血清又は血清の枯渇画分のいずれかを含むサンプルに添加して、混合物を形成し、この混合物を、最大３日にわたり、緩やかに軌道運動（２００ｒｐｍ）させつつ３７℃でインキュベートした。インキュベーション期間中において０時間目、１時間目、４時間目又は６時間目、１日目、２日目、及び３日目に、この混合物のアリコートを採取した。次いで、このアリコートを使用して、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによりＨＭＷ種のレベルをアッセイした。標的分子のＨＭＷレベル及びプロファイルの変化を分析した。治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性の割合を、本明細書で説明されている方程式１に従って算出した。

【0056】

この研究では、下記の２種の治療用タンパク質を試験した：マウス／ヒトキメラ抗体である治療用タンパク質１（ＴＰ１）、及びＩｇＧ２抗体である治療用タンパク質２（ＴＰ２）。

【0057】

これらの治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性をアッセイする前に、最初の工程を行なって、（血清又は枯渇血清への添加前での）治療用タンパク質サンプル中のＨＭＷ種の％を高め、このことを、ＳＥＣ－セミ分取ＨＰＬＣにより行なった。この技術により、ＴＰ１のＨＭＷ種の％は４．６％となり、ＴＰ２のＨＭＷ種の％は５３％となった。ＴＰ２のＨＭＷ種の％が非常に高かったことから、治療用画分を、ＨＭＷ種が０．５％未満であるＴＰ２単量体を含む溶液で、５％のＨＭＷ種を含む溶液又は１０％のＨＭＷ種を含む溶液まで希釈した。ＴＰ２の希釈サンプル（５％のＨＭＷ種、１０％のＨＭＷ種）を、ＨＭＷ種のインビボでの可逆性をアッセイする方法で使用した。ＴＰ１は、わずか４．６％のＨＭＷ種しか有しなかったことから、ＴＰ１サンプルを、いかなる希釈工程を行なうことなく使用し得た。

【0058】

実施例１Ａ
この実施例は、大きなタンパク質が枯渇したヒト血清（Ｌａｒｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｐｌｅｔｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ）（ＬＰＤＳ）法と呼ばれる本開示の第１の例示的な方法を示す。

【0059】

この実施例では、治療用タンパク質を含むサンプルを、血清の枯渇画分を含むサンプルに添加して、混合物を形成した。この血清の枯渇画分を、正常なヒト血清サンプルをプールし、このプールした血清を、サイズに基づく遠心分離ろ過にかけて、３０ｋＤａを超える大きいタンパク質を除去することにより、得た。簡潔に説明すると、血清を、３０ｋＤａ分子量カットオフを有する新規の０．５ｍＬ容量のＡｍｉｃｏｎ（登録商標）濃縮器ユニットに移した。このフィルタユニットを１５分にわたり約１４，０００ｒｃｆで遠心分離して、大きいタンパク質が枯渇した（ＬＰＤ）ろ液を生成した。このＬＰＤろ液を、同一条件を使用する２回目のろ過に供した。この２回枯渇ろ液をプールし、分注し、４℃で保存し、４週間以内に使用した。この２回枯渇ろ液を、ＳＯＬＯ ＶＰＥシステム（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ Ｄｉｏｓｙｎｔｈｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＣ）を使用するＵＶ ＶＩＳ分光法により分析して、この血清の２回枯渇画分の成分を決定した。この分析に基づいて、この血清の２回枯渇画分は、無機成分及び有機成分の両方を含み、且つ（非枯渇画分と比較して）ヒト血清由来の４～５％の小さいタンパク質を含むことが分かった。

【0060】

この血清の２回枯渇画分のサンプルに、ＴＰ１のサンプル（ＨＭＷ種の最初の％は４．６％であった）を添加して、混合物を形成した。この混合物は、９７％（ｖ／ｖ）超が２回枯渇画分であり、この混合物中におけるＴＰ１の最終濃度は、２５０μｇ／ｍＬであった。この混合物を、上記で説明したようにインキュベートし、この混合物のアリコートを、このインキュベーション期間中の様々な時点で採取した。次いで、これらのアリコートを使用して、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによりＨＭＷ種のレベルをアッセイした。治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性の割合を、本明細書で説明されている方程式１に従って算出し、結果を表１に示す。

【0061】

【表5】

【0062】

表１に示すように、ＴＰ１のＨＭＷ種は、７２時間の時点で、最大４２％の可逆性を示した。この時間の後、可逆性の％は定常に達した。

【0063】

ＴＰ２に関しても、ＴＰ２のサンプルを希釈した後に枯渇血清に添加した以外は上記で説明したのと同一のプロトコルに従った。この研究では、下記のＴＰ２の２つの希釈画分を使用した。ＨＭＷ種の％が５％まで希釈された第１のもの、及びＨＭＷ種の％が１０％まで希釈された第２のもの。各希釈画分を２回枯渇画分に添加して、９９％（ｖ／ｖ）超が２回枯渇画分である混合物を得、この混合物中におけるＴＰ２の最終濃度は、２５０μｇ／ｍＬであった。５％のＨＭＷ種を含む混合物の結果を、表２に示す。ＳＥＣクロマトグラムを、図３に示す。

【0064】

【表6】

【0065】

表２に示すように、ＴＰ２のＨＭＷ種は、７２時間の時点で、最大４３％の可逆性を示した。この時間の後、可逆性の％は定常に達した。

【0066】

ＴＰ２の両方の希釈サンプルのさらなる結果を、表３に示す。

【0067】

【表7】

【0068】

上記の実施例は、２つの異なる治療用タンパク質のＨＭＷ種の可逆性の％を決定する方法を示した。

【0069】

実施例１Ｂ
この実施例は、ＢｉＴＥ（登録商標）分子タンパク質のＨＭＷ種の可逆性の％を決定する例示的な方法を示す。

【0070】

抗ＣＤ３及び腫瘍標的結合ドメインを有する標準的なＢｉＴＥ（登録商標）分子におけるＨＭＷ種の可逆性を、血清様環境下で評価した。この実施例では、大きいタンパク質が枯渇した血清（ＬＰＤＳ）を、本質的には実施例１Ａで説明したように使用した。簡潔に説明すると、抗ＣＤ３及び腫瘍標的結合ドメインを含む標準的なＢｉＴＥ（登録商標）分子構造を有する治療用タンパク質（ＴＰ３）のサンプル（ＨＭＷ種の最初の％は５．７６％であった）を、血清の２回枯渇画分のサンプルに添加して、混合物を形成した。この混合物は、８７％（ｖ／ｖ）超が２回枯渇画分であり、この混合物中におけるＴＰ３の最終濃度は、１００マイクログラム／ｍＬであった。この混合物を、実施例１Ａで説明したようにインキュベートし、この混合物のアリコートを、このインキュベーション期間中の様々な時点で採取した。次いで、これらのアリコートを使用して、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによりＨＭＷ種のレベルをアッセイした。結果を表４に示す。

【0071】

【表8】

【0072】

表４に示すように、ＴＰ３のＨＭＷ種は、２４時間の時点で、最大８６％の可逆性を示した。この時間の後、可逆性の％は定常に達した。

【0073】

この実施例は、ＬＰＤＳ法を使用して標準的なＢｉＴＥ（登録商標）分子の可逆性を決定し得ることを示した。

【0074】

実施例２
この実施例は、ＩｇＧが枯渇したヒト血清（ＩｇＧ Ｄｅｐｌｅｔｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ）（ＩｇＧＤＳ）法と呼ばれる本開示の第２の例示的な方法を示す。

【0075】

実施例１のように、治療用タンパク質を含むサンプルを、血清の枯渇画分を含むサンプルに添加して、混合物を形成した。しかしながら、この枯渇画分は、プールされた正常なヒト血清をプロテインＡ親和性クロマトグラフィーにかけることにより得られた血清の内在性免疫グロブリン枯渇画分であった。簡潔に説明すると、プロテインＡ樹脂（ＭａｂＳｕＲＥ Ｓｅｌｅｃｔ ＬＸ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、空のスピンカラムに移し、結合緩衝液、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７で条件付けた。このカラムに、プールしたヒト血清を入れ、このカラムを、１０分にわたるラボローター（ｌａｂ ｒｏｔａｔｏｒ）による緩やかな且穏やかな混合に供して、プロテインＡと血清免疫グロブリンとの相互作用を促進させた。その後、このカラムを遠心分離して、ＩｇＧ枯渇血清ろ液を回収した。この樹脂を、０．１％ 酢酸により再生し、再度条件付け、ＩｇＧ枯渇血清ろ液を、同一の工程に従って２回目のＩｇＧ枯渇に供した。この２回枯渇血清ろ液をＳＥＣ－ＨＰＬＣにより分析して、ＩｇＧ枯渇を確認した。確認後、この血清の２回枯渇画分を分注し、－２０℃で凍結保存した。

【0076】

この血清の２回Ｉｇ枯渇画分のサンプルに、ＴＰ１のサンプル（ＨＭＷ種の最初の％は４．６％であった）を添加して、混合物を形成した。この混合物は、９７％（ｖ／ｖ）超が２回Ｉｇ枯渇画分であり、この混合物中におけるＴＰ１の最終濃度は、２５０μｇ／ｍＬであった。この混合物を、上記で説明したようにインキュベートし、この混合物のアリコートを、このインキュベーション期間中に採取した。タンパク質濃度分析により示されるように、このＩｇＧ枯渇画分は、ほとんどが天然ＩｇＧ以外の血清成分からなった。そのため、ＳＥＣ分析前に精製工程で必要であると判断した。

【0077】

従って、ＳＥＣにより治療用タンパク質のＨＭＷ種のレベルをアッセイする前に、この混合物を、プロテインＡクロマトグラフィーに供して、ＨＭＷ種を含む所望の画分を単離した。簡潔に説明すると、プロテインＡ樹脂を空のスピンカラムに移し、結合緩衝液で条件付けた。このカラムに、混合物（枯渇血清及び治療用タンパク質を含む）を含むサンプルを入れ、このカラムを、１０分にわたるラボローターによる緩やかな且穏やかな混合に供して、プロテインＡと治療用タンパク質との相互作用を促進させた。その後、このカラムを遠心分離し、次いで結合緩衝液で完全に洗浄して、残留する非結合血清成分を洗い流した。次いで、樹脂に結合した種を、いくつかの少量の画分中の０．１％酢酸を使用する酸性溶出により溶出させた。画分の濃度を測定して、治療用タンパク質及びＨＭＷ種の含有量を決定し、ＨＭＷ種含有画分をプールした。次いで、プールしたＨＭＷ種含有画分を使用して、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによりＨＭＷ種のレベルをアッセイした。治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性の割合を、本明細書で説明されている方程式１に従って算出した。図２は、インキュベーション期間中の、１０％まで希釈されたＴＰ２のＳＥＣクロマトグラムの重ね合わせを示す。図２に示すように、ＴＰ２のＨＭＷ種の％は、経時的に減少した。各治療用タンパク質（ＴＰ１及びＴＰ２）の結果を、表５に示す。

【0078】

【表9】

【0079】

表３に示すように、ＴＰ１のＨＭＷ種のインビボでの可逆性の算出された割合は、（４時間の時点での）約１２％であった。ＴＰ２のＨＭＷ種のインビボでの可逆性の算出された割合は、５％のＨＭＷ種まで希釈されたＴＰ２サンプルの場合は（１時間の時点での）１１％の可逆性であり、１０％のＨＭＷ種まで希釈されたＴＰ２サンプルの場合は（６時間の時点での）２６％の可逆性であった。

【0080】

上記の実施例は、２つの異なる治療用タンパク質のＨＭＷ種の可逆性の％を決定する方法を示した。ここで、この方法を、任意のＦｃ含有治療用タンパク質に使用し得る。

【0081】

実施例３
この実施例は、蛍光標識を伴う全血清（ｗｈｏｌｅ ｓｅｒｕｍ ｗｉｔｈ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ）（ＷＳＦＬ）法と呼ばれる本開示の第３の例示的な方法を示す。

【0082】

この方法では、治療用タンパク質を含むサンプルを、蛍光標識で標識した。簡潔に説明すると、この治療用タンパク質の富化されたＨＭＷ種を、製造業者の指示に従ってＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８標識キットで最初に標識した。この標識画分を、３０ｋＤａ分子量カットオフを有する０．５ｍＬ容量のＡｍｉｃｏｎ（登録商標）濃縮器ユニットを使用して洗浄した。次いで、製造業者の指示に従って分光光度計によりタンパク質濃度を測定した。

【0083】

標識ＨＭＷ種を含むサンプルを、全血清（いかなる枯渇工程も経ていない血清）を含むサンプルに添加して、混合物を得た。この混合物中における治療用タンパク質の濃度は、２５０μｇ／ｍＬであり、この混合物中における全血清は、９０％（ｖ／ｖ）超であった。この混合物を、本質的には上記で説明したようにインキュベートし、この期間全体にわたりアリコートを採取し、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ－ＦＬＤにより分析した。ＨＭＷ種の％を使用して、治療用タンパク質のＨＭＷ種の可逆性の％を算出した。

【0084】

この方法の後、ＴＰ１のサンプルは、最大６時間で１０％未満の可逆性の％を示した。

【0085】

上記の実施例は、２つの異なる治療用タンパク質のＨＭＷ種の可逆性の％を決定する方法を示した。この方法を、あらゆるタイプの治療用タンパク質に使用し得る。

【0086】

実施例４
この実施例は、抗体捕捉を伴う全血清（Ｗｈｏｌｅ Ｓｅｒｕｍ ｗｉｔｈ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ）（ＷＳＡＣ）法と呼ばれる本開示の第４の例示的な方法を示す。

【0087】

この方法は、全血清が使用されるＷＳＦＬ法に類似している。この方法はまた、ＳＥＣの前に分離工程を実施するという点で、ＩｇＧＤＳ法にも類似している。

【0088】

この方法では、ＨＭＷ種を含むサンプルを、全血清（いかなる枯渇工程も経ていない血清）を含むサンプルに添加して、混合物を得た。この混合物中における治療用タンパク質の濃度は、２５０μｇ／ｍＬであり、この混合物は、９７％（ｖ／ｖ）超が全血清であった。次いで、この混合物を、上記で説明したようにインキュベートし、このインキュベーション期間中の様々な時点で、この混合物のアリコートを採取した。この混合物のアリコートの成分の分離を、セファロース樹脂に共有結合的にカップリングしている治療用タンパク質特異的抗体を使用する親和性クロマトグラフィーにより実行した。この分離工程により、ＨＭＷ種を含む所望の画分の単離が可能となった。抗体がカップリングした樹脂を、下記で説明するように生成した。親和性クロマトグラフィーカラムを配置して、このカラムに、混合物（血清及び治療用タンパク質を含む）のアリコートを入れ、このカラムを、１０分にわたるラボローターによる緩やかな且穏やかな混合に供して、抗体がカップリングした樹脂と治療用タンパク質との相互作用を促進させた。その後、このカラムを遠心分離し、次いで結合緩衝液で完全に洗浄して、残留する非結合血清成分を洗い流した。次いで、樹脂に結合した種を、いくつかの少量の画分中の１００ｍＭグリシン（ｐＨ３．０）を使用する酸性溶出により溶出させた。画分の濃度を測定して、治療用タンパク質及びＨＭＷ種の含有量を決定し、ＨＭＷ種含有画分をプールした。次いで、プールしたＨＭＷ種含有画分を使用して、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによりＨＭＷ種のレベルをアッセイした。治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性の割合を、本明細書で説明されている方程式１に従って算出した。

【0089】

抗体がカップリングした樹脂の生成：簡潔に説明すると、活性化された樹脂を空のスピンカラムに移し、不活性緩衝液で条件付けた。このカラムに、カップリング試薬及び抗治療用タンパク質抗体を、製造業者規定の濃度で又はこれに近い濃度で入れ、このカラムを、ラボローターによる緩やかな且穏やかな混合に供して、カップリング反応を促進させた。遊離抗体（治療用タンパク質に特異的な抗体）の濃度を１＋－時間間隔で測定して、カップリングの進行をモニタリングした。この反応を、室温で実施した。この反応を一晩延長させる必要がある場合には、反応装置を、５℃の低温室に移した。カップリングが完了すると（遊離抗治療用タンパク質抗体濃度のプラトーにより示される）、このカラムを遠心分離して反応溶液を除去し、次いで不活性緩衝液で完全に洗浄した。次いで、樹脂を、エタノールアミン及びカップリング試薬による２回目のカップリング反応に供して、樹脂中のあらゆる残余の活性なカップリング部位をブロックした。このカラムを、既に説明したように遠心分離して完全に洗浄し、アジ化ナトリウムを含む不活性緩衝液中で保存した。

【0090】

この方法では、ＨＭＷ種の可逆性を、全血清中で直接評価した。サンプルを、樹脂にカップリングしている、治療用タンパク質に特異的な抗体を使用する免疫ベースの捕捉により、血清から単離した。抗体がカップリングした樹脂を使用する分離の後、ＳＥＣ分析を実施して、ＨＭＷ種の量を測定した。治療用タンパク質のＨＭＷ種のインビボでの可逆性の割合を、本明細書で説明されている方程式１に従って算出した。ＴＰ１に関する結果を、表６に示す。

【0091】

【表10】

【0092】

ＴＰ１のＨＭＷ種（血清への添加前の最初は４．６％であった）は、最大６時間で９％の可逆性を示した。

【0093】

上記の実施例は、治療用タンパク質のＨＭＷ種の可逆性の％を決定する方法を示した。この方法を、あらゆるタイプの治療用タンパク質に使用し得る。

【0094】

実施例５
この実施例は、実施例２で説明されている方法を実施する代替方法を示す。

【0095】

一本鎖可変ドメインを有するがＦｃを有しない標準的なＢｉＴＥ（登録商標）分子構造を有する治療用タンパク質を、枯渇血清を使用する血清可逆性研究で使用した。この方法は、プロテインＡの代わりにプロテインＬを使用した以外は、実施例２で説明されているものと類似していた。プロテインＡとは異なり、プロテインＬは、カッパ軽鎖相互作用により抗体に結合する。プロテインＬは、全ての抗体クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、及びＩｇＤ）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、並びにＦａｂ断片に結合する。プロテインＬの枯渇後、カッパ軽鎖を有する全ての抗体及び抗体断片は、可逆性研究用の最終血清マトリックス中で除去される。

【0096】

この方法の第１の工程では、血清から、プロテインＬに結合する全ての成分を除去することにより、枯渇血清画分を調製した。この枯渇血清画分を、プロテインＬ樹脂を使用して調製した。この調製された枯渇血清画分に、ＴＰ３のサンプル（実施例１Ｂで説明されている；ＨＭＷ種の最初の％は５．２８％であった）を添加して、混合物を形成した。この混合物は、８７％（ｖ／ｖ）超が枯渇血清画分であり、この混合物中におけるＴＰ３の最終濃度は、１００マイクログラム／ｍＬであった。次いで、ＴＰ３を、様々な時点にわたり、この枯渇血清画分中でインキュベートした。この混合物をプロテインＬクロマトグラフィーに供して、ＴＰ３のＨＭＷ種を含む所望の画分を単離した。この特定の治療用タンパク質に関して、下記の２種の酸性溶出緩衝液を試験した：０．１％の酢酸、及び５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ３．３）。後者は、治療用タンパク質のＨＭＷの％を維持し、最初の評価かからの回復が良好である。最後に、ＴＰ３のＨＭＷ種のレベルを、ＳＥＣでアッセイした。結果を表７に示す。

【0097】

【表11】

【0098】

この実施例は、本開示の方法を、多くの種類の治療用タンパク質のインビボでの可逆性の試験に使用し得ることを示す。この実施例はまた、このタンパク質Ｌ法を使用して、ＢｉＴＥ（登録商標）分子の可逆性を評価し得ること、及びこのタンパク質Ｌ法は、ＩｇＧ枯渇法とほぼ同一の実験デザインを有することも示す。

【0099】

実施例６
この実施例は、実施例４で説明されている免疫分離工程中の混合時間を変更したＷＳＡＣ法を示す。

【0100】

セファロース樹脂に共有結合的にカップリングされている治療用タンパク質特異的抗体を使用する親和性クロマトグラフィーによる治療用タンパク質の分離中に混合時間を変更した以外は、実施例４で説明されているＷＳＡＣ法を実行した。この実験では、治療用タンパク質サンプルを全血清と混合し、この混合物（血清及び治療用タンパク質を含む）のアリコートを、この治療用タンパク質に特異的な抗体に付着した樹脂が入ったスピンカラムに入れた。このアリコートが入ったカラムを、約５分、３０分、又は約２時間にわたるラボローターによる緩やかな且穏やかな混合に供した。遠心分離して、樹脂からアリコートの非結合成分を分離した後、このスピンカラムを、ＤＰＢＳ又は０．５ＭのＮａＣｌを含む洗浄緩衝液で洗浄した。５分間のスピンカラムから洗浄緩衝液を溶出させる前に、このスピンカラムを、複数回、穏やかに反転させた。

【0101】

図４に示すように、洗浄工程中でのスピンカラムの穏やかな物理的反転を伴う５分間の混合時間は、ＨＭＷ種を検出するのに十分であり、且つ共溶出する血清成分と考えられる最小限のポストピークで治療用タンパク質を捕捉するのに十分であった。対照的に、洗浄工程中での穏やかな物理的反転を伴わない３０分及び２時間の混合時間は、５分間の混合時間と比較して、ポストピークが高くなり、ＨＭＷ種が検出されず、且つサンプル処理が長くなった。

【0102】

これらの結果は、治療用タンパク質／そのＨＭＷ種を樹脂に結合させるには樹脂と混合物との５分間の混合時間で十分であることを裏付ける。

【0103】

実施例７
この実施例は、実施例２及び実施例４の両方で説明されている免疫分離工程中での適切な溶出条件を特定するために実行した一連の実験を示す。

【0104】

ＨＭＷ種の形成を誘発する可能性がある濃縮工程を行なうことなく、溶出液をＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析に直接ロードし得ることを目標に、親和性樹脂と溶出体積との比率を調査した。プロテインＡ樹脂溶液（１００μＬ又は２００μＬ）を、２ｍＬの使い捨てスピンカラムに移した。カラムに試験サンプルを入れ、ラボローターにより１０分にわたりカラムを穏やかに混合することにより結合させた。試験したサンプルは、治療用タンパク質（２５０μｇ）を含むか若しくは含まないＩｇＧ枯渇血清１ｍＬを含むか、又は治療用タンパク質（２５０μｇ）を含む水１ｍＬを含んだ。その後、樹脂を不活性緩衝液で洗浄して、非結合成分を除去した。樹脂結合成分を、１００μＬ画分中の溶出緩衝液を使用して放出させた。各画分をＵＶ－ＶＩＳに供して、各画分に関するタンパク質濃度を決定した。各画分に関するタンパク質濃度を、表８に示す。

【0105】

【表12】

【0106】

この実験の結果は、プロテインＡ樹脂２００μＬを使用した場合に治療用タンパク質を完全に放出するためには、より多くの溶出緩衝液が必要であったことを裏付ける。放出は、画分３で明らかでった。プロテインＡ樹脂１００μＬを使用した場合には、結合した標的の大部分が最初の３つの画分で溶出しており、これらの画分をプールした場合には、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析に十分に高い濃度のタンパク質が得られた。

【0107】

実施例４の方法で使用される溶出緩衝液は、ＨＭＷの形成又は分解を誘発することなく治療用タンパク質と捕捉抗体との間の結合を解除し得なければならない。関連する研究では、ＷＳＡＣ法で使用される溶出緩衝液を、ＴＰ１及びＴＰ２の両方に関して評価した。ＴＰ１の場合には、０．１％の酢酸、グリシン（ｐＨ３．０）、グリシン（ｐＨ２．３）、又はグリシン（ｐＨ２．０）を使用して１ｍＬ又は０．５ｍＬの画分で樹脂結合成分を放出させることにより、溶出緩衝液の成分又はそのｐＨを試験した。簡潔に説明すると、ＴＰ１に特異的な捕捉抗体樹脂（２００μＬ）を、２ｍＬの使い捨てスピンカラムに入れ、不活性緩衝液で条件付けた。スピンカラムに、ＤＰＢＳ １ｍＬ中にＴＰ１ ２５０μｇをそれぞれ含む試験サンプルを入れた。次いで、このカラムを、ラボローターを使用して穏やかに混合した。樹脂結合成分を溶出緩衝液で放出させ、画分を回収した。これらの画分でＳＥＣ－ＨＰＬＣを実行した。

【0108】

結果を図５に示す。ｐＨが低いこれら２種のグリシン緩衝液は、高次のＨＭＷ（ＨＨＭＷ）種の形成を誘発した。ｐＨ３．０のグリシン及び酢酸緩衝液は、コントロールと同様のＨＭＷプロファイルを示した。これらのデータは、最初の治療用タンパク質用の溶出緩衝液としてのグリシンｐＨ３．０及び酢酸緩衝液の使用を裏付ける。

【0109】

ＴＰ２の場合には、ＴＰ２（２５０μｇ）のサンプルを、試験する多くの溶出緩衝液の内の１つに添加し、２時間超にわたり室温で維持した。次いで、このサンプルを、プラットフォームＳＥＣ－ＨＰＬＣ法を使用するＳＥＣ－ＨＰＬＣにより評価した。試験した溶出緩衝液は、グリシン（ｐＨ２．３）、グリシン（ｐＨ３．０）、０．１％の酢酸、クエン酸塩（ｐＨ３．０）、クエン酸塩（ｐＨ３．５）、クエン酸塩（ｐＨ４．０）、及び４ＭのＭｇＣｌ２であった。様々な添加溶出緩衝液に対して、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を実施した。スペクトルを図６に示す。洗浄緩衝液及び形成緩衝液にもＴＰ２を添加し、溶出緩衝液と同一の方法でＳＥＣ－ＨＰＬＣにより分析した。試験した洗浄緩衝液は、ＤＰＢＳ、０．５ＭのＮａＣｌ、形成緩衝液、及び水を含んだ。様々な洗浄緩衝液を使用するＳＥＣ－ＨＰＬＣスペクトルを、図６に示す。

【0110】

試験した溶出緩衝液の内、酢酸、クエン酸塩（ｐＨ３．５）、及びクエン酸塩（ｐＨ４．０）は、治療用タンパク質の変性の予防に有効であった。試験した他の溶出緩衝液は、凝集（高分子量種（ＨＭＷ）の増加、より高次の高分子量種（ＨＨＭＷ）の生成、及び非分解ＨＭＷの存在の可能性を示す単量体の前面化（ｆｒｏｎｔｉｎｇ））を誘発しており、このことは、この緩衝液がＴＰ２を変性することを示す。最後に、試験した洗浄緩衝液は全て、ＴＰ２を変性しなかった。

【0111】

本明細書で引用されている全ての参考文献（例えば、刊行物、特許出願、及び特許）は、各参考文献が参照により組み込まれると個別に及び明確に示されており、且つその全体が本明細書に記載されていた場合と同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。

【0112】

本開示の説明の文脈での（特に、下記の特許請求の範囲の文脈での）用語「１つの（ａ）」、及び「１つの（ａｎ）」、及び「その」、並びに類似の指示対象の使用は、別途本明細書で指示されない限り、又は文脈と明確に矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されなければならない。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特記しない限り、オープンエンドの用語（即ち、「含むが、限定されない」を意味する）と解釈されなければならない。

【0113】

本明細書における値の範囲の列挙は、別途本明細書で指示されない限り、この範囲及び各端点にある別個の値の各々を個々に指す簡略法の役割を果たすことが意図されているに過ぎず、別個の値及び端点の各々は、それが本明細書において個々に列挙されていたかのように本明細書に組み込まれる。

【0114】

本明細書で説明されている方法は全て、別途本明細書で指示されない限り、又は文脈と明確に矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書で提供されるありとあらゆる例又は例示的な言葉（例えば「等」）の使用は、本開示をより明らかにするすることが意図されているに過ぎず、別途特許請求されない限り、本開示の範囲の限定を課すものではない。本明細書におけるいかなる言葉も、任意の特許請求されていない要素を本開示の実施に必須として示していると解釈されるべきではない。

【0115】

本明細書では、本開示の好ましい実施形態が説明されており、例えば、本開示を実行するための本発明者らに既知の最良の形態が説明されている。前述の説明を読めば、この好ましい実施形態のバリエーションが当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者が必要に応じてそのようなバリエーションを採用することを期待し、且つ本発明者らは、本明細書で具体的に説明されている形態以外で本開示が実施されることを意図している。従って、本開示は、適用される法により認められる通り、本明細書に添付される特許請求の範囲に列挙されている主題の全ての変更形態及び均等物を含む。さらに、上記の要素の任意の組み合わせは、別途本明細書で指示されない限り、又は文脈と明確に矛盾しない限り、その全ての可能なバリエーションで本開示に包含される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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