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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-10
(45)【発行日】2024-10-21
(54)【発明の名称】微生物を含む炎症性疾患の診断または治療用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 35/741 20150101AFI20241011BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20241011BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20241011BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20241011BHJP
A61K 9/48 20060101ALI20241011BHJP
A61K 9/20 20060101ALI20241011BHJP
A61K 9/16 20060101ALI20241011BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20241011BHJP
A61K 9/02 20060101ALI20241011BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20241011BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20241011BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20241011BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241011BHJP
【ＦＩ】
A61K35/741
A61P1/04
C12N15/11 Z ZNA
C12N1/20 E
A61K9/48
A61K9/20
A61K9/16
A61K9/14
A61K9/02
A61K9/10
A61K45/00
A61P1/00
A61P43/00 121
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2023519442
(86)(22)【出願日】2021-09-27
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-16
(86)【国際出願番号】 KR2021013152
(87)【国際公開番号】W WO2022065957
(87)【国際公開日】2022-03-31
【審査請求日】2023-06-09
(31)【優先権主張番号】10-2020-0126243
(32)【優先日】2020-09-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【微生物の受託番号】KCTC KCTC 13783BP
(73)【特許権者】
【識別番号】521440334
【氏名又は名称】シージェイ バイオサイエンス， インク．
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】ホン， サン ヒ
(72)【発明者】
【氏名】リ， ジェ ヒ
(72)【発明者】
【氏名】チェ， ギョンジン
(72)【発明者】
【氏名】ユン， ソクファン
(72)【発明者】
【氏名】オ， ヒョンソク
(72)【発明者】
【氏名】キム， ヒョン
(72)【発明者】
【氏名】キム， ダヘ
【審査官】渡邉 潤也
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１６－５１１２７２（ＪＰ，Ａ）
【文献】Molecular Medicine Reports，2019年，20，25-32
【文献】Accession No. MF185398.1，GenBank[online](retrieved on 2024 May 23)，2017年，retrieved from the Internet<URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/MF185398.1?>
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のヌクレオチド配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を含むバクテリア菌株（ｂａｃｔｅｒｉａ ｓｒａｉｎ）の菌体および前記微生物の培養物からなる群より選択された１種以上を含み、前記バクテリア菌株は、受託番号ＫＣＴＣ １３７８３ＢＰで寄託されたフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスである、
炎症性疾患の予防または治療用組成物。
【請求項2】
前記炎症性疾患は、炎症性胃腸管疾患である、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記炎症性胃腸管疾患は、潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ、ＵＣ）またはクローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＣＤ）である、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
前記バクテリア菌株は、免疫調節能または抗炎症活性を有するものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
前記バクテリア菌株は、サイトカインの調節による免疫調節能を有するものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項6】
前記サイトカインは、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－８およびＩＬ－１０からなる群より選択された１種以上である、請求項５に記載の組成物。
【請求項7】
前記バクテリア菌株は、組成物の総重量を基準として１×１０３～１×１０１５ＣＦＵ／ｇ含むものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項8】
前記バクテリアは、生きているバクテリアである、請求項１に記載の組成物。
【請求項9】
前記組成物は、抗－炎症剤、副腎皮質ホルモン剤、免疫調節剤、抗生剤、腫瘍壊死因子抑制剤、ヤーヌスキナーゼ抑制剤、抗インテグリン製剤、およびインターロイキン抑制剤からなる群より選択された１種以上の薬物を追加的に含むものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項10】
前記バクテリアは、下記の特性の中から選択された１種以上を有するものである、請求項１に記載の組成物：前記微生物は、１７：０ ｉｓｏ ３ＯＨ脂肪酸を含まないもの、
前記微生物は、腫瘍の成長抑制活性または癌細胞のアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘発する抗癌活性を有するもの、
前記微生物を癌細胞株を移植した動物モデルに投与した時、微生物を投与しない対照群に比べて相対的な腫瘍体積の減少率は５％以上、
前記微生物を癌細胞株を移植した動物モデルに投与した時、微生物を投与しない対照群に比べて腫瘍の重量に応じた腫瘍成長抑制率が５％以上、および
前記微生物は、２５～４０℃の温度および嫌気条件下で培養されるもの。
【請求項11】
前記組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤、担体または希釈剤を追加的に含むものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項12】
前記組成物は、カプセル、錠剤、顆粒、粉末、トローチ、座薬、または懸濁液である、請求項１に記載の組成物。
【請求項13】
前記組成物は、プロバイオティクスである、請求項１に記載の組成物。
【請求項14】
前記組成物は、プロバイオティクスとプレバイオティクスを含むものである、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、フィーカリバクテリウム属微生物を含む炎症性疾患の診断または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
炎症は個体の免疫系が侵入病原菌のような有害成分に対応しようとする時に発生する。免疫調節細胞、サイトカインおよびアポトーシスが含まれている免疫調節機序は、病原菌を防ぐための過度の反応で発生する免疫反応を調節する。このようなメカニズムが欠乏する場合、炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｌ ｄｉｓｅａｓｅ、ＩＢＤ）をはじめとする多様な炎症疾患として現れる。前記炎症性疾患は、例えば、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）、過敏性大腸症候群、慢性消化障害（ｃｏｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、伝染性大腸炎（例えば、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）によって起因する）、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、その他の胃腸管－関連の疾病、およびそれらの何らかの組み合わせからなる群より選択された、炎症性胃腸管疾患を含む。
【0003】
炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ、ＩＢＤ）は、胃腸管の慢性的な炎症状態で崩れた粘膜構造、腸内微生物の組成変化および全身生化学的異常が特徴的である。ＩＢＤは、炎症の臨床様相と腸内局所化により潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ、ＵＣ）とクローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＣＤ）とに分けられる。ＩＢＤの正確な病因は知られていないが、腸内細菌叢の変化や病原性微生物による環境的要因によって引き起こされた過度の免疫反応が主要病因として知られている。
【0004】
ＩＢＤは複合的でよく知られていない病因による疾病であるため、ＩＢＤの治療は非常に制限的であり、治療よりは症状を好転させて寛解を誘導し、寛解維持に焦点を合わせている。病変の範囲、重症度および臨床様相、合併症などを考慮して最適な治療方法を選択する。
【0005】
炎症性腸疾患の治療剤は、多様な作用機序により効果を示すため、精巧な臨床指針に従って段階的に使用されており、５－ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌａｔｅとｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄは、軽症乃至中等症のＩＢＤに一次療法としてよく使用され、ＴＮＦ－α抑制剤（例、ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ、ａｄａｌｉｍｕｍａｂ ａｎｄ ｇｏｌｉｍｕｍａｂなど）のような生物学的製剤は、一次薬剤に反応がなかったり失敗した患者に二次薬剤として使用されるように推奨されている。しかし、疾病初期に高濃度のＴＮＦ－α抑制剤を投与する患者が幾何級数的に増加している。強力な免疫抑制剤の長期使用による深刻な副作用の問題があり、代替治療剤に対する持続的な臨床的必要性（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｎｅｅｄｓ）が求められている。
【0006】
ＩＢＤと腸内細菌叢との間の関連性は世界的に多くの研究から確認されているが、ＩＢＤ患者における善玉菌（ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ）の欠乏が特徴的な微生物群集不均衡（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ）が現れることが報告されており、微生物群集不均衡がＩＢＤの免疫病因（ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）として考えられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の一例は、フィーカリバクテリウム属微生物を用いた、炎症性疾患、具体的には、炎症性胃腸管疾患の発病危険度の予測または炎症性疾患、具体的には、炎症性胃腸管疾患、例えば、炎症性腸疾患を診断したり、前記微生物を用いて炎症性疾患、具体的には、炎症性胃腸管疾患、例えば、炎症性腸疾患の予防、改善または治療反応性を予測または評価する組成物、キットまたは方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明の一例は、フィーカリバクテリウム属微生物の菌体；前記微生物の培養物；前記微生物の破砕物；および前記微生物、培養物および破砕物からなる群より選択された１種以上の抽出物；からなる群より選択された１種以上を含む、炎症性疾患、具体的には、炎症性胃腸管疾患、例えば、炎症性腸疾患の予防、改善または治療用組成物を提供する。前記組成物は、医薬または食品であってもよい。
【0009】
また、本発明は、炎症性疾患、具体的には、炎症性胃腸管疾患、例えば、炎症性腸疾患の診断、例えば、投与する対象を選択または炎症性疾患、具体的には、炎症性胃腸管疾患、例えば、炎症性腸疾患の予防、改善または治療効能の評価に関する。
【0010】
本発明の一例は、フィーカリバクテリウム属微生物の菌体；前記微生物の培養物；前記微生物の破砕物；および前記微生物、培養物および破砕物からなる群より選択された１種以上の抽出物；からなる群より選択された１種以上を含む腸疾患の診断方法、組成物またはキット、フィーカリバクテリウム属微生物の菌体などを投与する対象を選択する方法、組成物またはキット、または対象にフィーカリバクテリウム属微生物の菌体などを投与して炎症性疾患、具体的には、炎症性胃腸管疾患、例えば、炎症性腸疾患の予防、改善または治療効能を評価する方法、組成物またはキットを提供する。
【0011】
本発明の一例は、本発明によるフィーカリバクテリウム属微生物の菌体；前記微生物の培養物；前記微生物の破砕物；および前記微生物、培養物および破砕物からなる群より選択された１種以上の抽出物；からなる群より選択された１種以上とともに、抗－炎症剤、副腎皮質ホルモン剤（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ）、免疫調節剤（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ）、抗生剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）、腫瘍壊死因子抑制剤（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α ａｇｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＴＮＦ－α ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ヤーヌスキナーゼ抑制剤（例、トファシチニブなど）、抗インテグリン製剤（例、ベドリズマブなど）、インターロイキン抑制剤（例、ウステキヌマブなど）などから構成された群より選択された１種以上を含む、炎症性疾患、具体的には、炎症性胃腸管疾患または炎症性腸疾患の予防、改善または治療用組成物に関する。抗－炎症剤の例は、５－アミノサリチル酸、スルファサラジンおよびオルサラジンを含む。ステロイド類の例は、コルチコステロイド類、グルココルチコステロイド類、プレドニゾン、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾンおよびアドレノコルチコトロピックホルモン（Ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ ｈｏｒｍｏｎｅ）（以下、「ＡＣＴＨ」と略称する。）を含む。免疫調節剤の例は、脱糖脂質化された、脱糖脂質化されたマイコバクテリウムバッカエ）（ｄｅｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄａｔｅｄ、ｄｅｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄａｔｅｄ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｃｃａｅ）（以下、「ＰＶＡＣ」と略称する。）、抗－腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー５（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ５）（以下、「抗－ＣＤ４０」と略称する。）リガンド、抗－ＣＤ４０、ナタリズマブ（ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）（ＡｎｔｅｇｒｅｎＴＭ）、抗－脈管接着分子－１（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ－１）（以下、「抗－ＶＣＡＭ１」と略称する。）および抗－細胞間接着分子－１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ－１）（以下、「抗－ＩＣＡＭ１」と略称する。）を含む。サイトカインの例は、インターロイキン－１０（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１０）（以下、「ＩＬ－１０」と略称する。）を含む。ＴＮＦ拮抗体の例は、インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）（Ｒｅｍｉｃａｄｅ０）、エタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）（ＥｎｂｒｅｌＯＯ）、アダリムマブ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）（Ｈｕｍｉｒａ）、およびセルトリズマブペゴル（Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ Ｐｅｇｏｌ）（以下、「ＣＤＰ８７０」と略称する。）を含む。ヤーヌスキナーゼ抑制剤の例は、トファシチニブ（Ｔｏｆａｃｉｔｉｎｉｂ）（Ｘｅｌｊａｎｚ）、抗インテグリン製剤の例は、ベドリズマブ（ｖｅｄｏｌｉｚｕｍａｂ）（ＫｙｎｔｅｌｅｓＲ）、インターロイキン抑制剤の例は、ウステキヌマブ（ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）（Ｓｔｅｌａｒａ ｐｆｓ）を含む。
【0012】
本発明の一例は、フィーカリバクテリウム属微生物を用いて、フィーカリバクテリウム属微生物の投与対象を選別する組成物、キットまたは方法を提供する。具体的には、本発明は、試験対象の試料からフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスを検出して、炎症性胃腸管疾患、例えば、炎症性腸疾患の発病危険度の予測または胃腸管疾患、例えば、炎症性腸疾患を診断したり、前記微生物の投与による炎症性胃腸管疾患、例えば、炎症性腸疾患の予防、改善または治療反応性を予測または評価するものであり、これによって前記対象が胃腸管疾患、例えば、炎症性腸疾患の改善または治療を受けられるかを決定することができる。
【0013】
本発明の一例は、フィーカリバクテリウム属微生物を用いて、フィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンス（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ）が投与された対象においてフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスの効能または反応性を評価する組成物、キットまたは方法を提供する。具体的には、本発明の一例は、試験対象の生物学的試料においてフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンス（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ）微生物を検出する製剤を含む、胃腸管疾患、例えば、炎症性腸疾患の発病危険度の予測または胃腸管疾患、例えば、炎症性腸疾患を診断したり、胃腸管疾患、例えば、炎症性腸疾患の予防、改善または治療反応性を予測または評価するための組成物またはキットに関する。
【0014】
本発明のさらなる一例は、試験対象の生物学的試料においてフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンス微生物を検出する段階を含む、炎症性疾患、具体的には、炎症性胃腸管疾患、例えば、炎症性腸疾患の発病危険度の予測または炎症性疾患、具体的には、炎症性胃腸管疾患、例えば、炎症性腸疾患を診断したり、胃腸管疾患、例えば、炎症性腸疾患の予防、改善または治療反応性を予測または評価するための方法に関する。
【0015】
本発明は、健康な対照群においてフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスのレベルに比べて減少したフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスのレベルに関連する疾患または障害の予防、改善または治療方法を提供し、ここで、方法は、対象をフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスの減少したレベルを有するものとして決定する段階、およびフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスの減少したレベルが存在するものと決定されると、前記フィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスを含む組成物を対象に投与する段階を含む。
【0016】
本発明の一例は、フィーカリバクテリウム属微生物の菌体；前記微生物の培養物；前記微生物の破砕物；および前記微生物、培養物および破砕物からなる群より選択された１種以上の抽出物；からなる群より選択された１種以上を含む、抗炎症剤に関する。前記フィーカリバクテリウム属微生物は、抗炎症活性を有するものであってもよい。
【0017】
前記組成物は、薬学的組成物または食品組成物であってもよく、プロバイオティクス単独、またはプロバイオティクスとプレバイオティクスをともに含むことができる。
【0018】
本明細書において、炎症性疾患は、各種炎症を含むことができ、例えば、炎症性胃腸管疾患、好ましくは、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）、過敏性大腸症候群、慢性消化障害（ｃｏｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、伝染性大腸炎（例えば、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）によって起因する）、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、その他の胃腸管－関連の疾病、およびそれらの何らかの組み合わせからなる群より選択された、炎症性胃腸管疾患である。あるいは、前記炎症性疾患は、炎症性自己免疫疾患であり、ここで、バランスの悪い微生物叢（ｄｙｓ－ｂａｌａｎｃｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ）および低級粘膜炎症（ｌｏｗ ｇｒａｄｅ ｍｕｃｏｓａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）は、糖尿病（タイプ１および２）、喘息およびアトピー疾患のような、疾患の病因に関連するものであってもよい。
本発明において、菌株によって発揮される免疫調節または炎症性疾患の改善、治療または予防の効果は、炎症抑制および免疫調節に関与するサイトカインの増加または減少、具体的には、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－８、ＩＬ－６およびＴＮＦ－αなどの分泌減少およびＩＬ－１０の分泌増加のいずれか１つ以上の機序によって誘導されることを特徴とする。
本発明において、菌株によって発揮される免疫調節または炎症性疾患の改善、治療または予防の効果は、炎症抑制および免疫調節に関与するサイトカインの増加または減少、具体的には、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－８、ＩＬ－６およびＴＮＦ－αなどの分泌減少およびＩＬ－１０の分泌増加のいずれか１つ以上の機序によって誘導されることを特徴とする。
【0019】
ＩＦＮ－γの役割は、代表的に、ＮＫ細胞活性化、マクロファージ活性化、ＭＨＣ発現増加などがあり、ＩＦＮ－γに対する慢性露出は自己免疫疾患および炎症性疾患のような様々な非感染性病理に関与することが知られている。
【0020】
炎症発生時、Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌは、腸上皮細胞間の間隔（ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）により腸の内腔まで移動したりもして炎症をさらに悪化させる役割を果たすことができ、この時、炎症性サイトカインに相当するＩＬ－８は、当該Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌを炎症部位に引き寄せるのに重要な役割を果たす因子であって、Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌを腸粘膜の固有層内に浸潤させて炎症媒介物質を分泌させることによって、組織の損傷をもたらす役割を果たすことが知られている。
【0021】
ＩＬ－６は、Ｔリンパ球や大食細胞など多様な細胞から分泌されて免疫反応を促進し、この場合は、感染、外傷、特に火傷や炎症につながる組織損傷をもたらすことがある。また、ＩＬ－６は、Ｔｈ１７細胞分化を誘導することでＲＯＲγｔやＩＬ－１７の分泌を促進することによって、炎症をさらに促進させる役割を果たすことが知られている。
【0022】
炎症を誘発する主要因子の１つであるＴＮＦ－αは、主に活性化された大食細胞から分泌され、補助Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、そして損傷したニューロンなどの多様な細胞から分泌される。そして、最も重要な役割は免疫細胞の調節で、ＩＬ－１とＩＬ－６の生産を誘発することができ、リウマチ関節炎やクローン病、潰瘍性大腸炎などの多様な炎症性疾患において炎症反応を促進する役割を果たすことが知られている。
【0023】
また、ＩＬ－１０は、補助Ｔ細胞、Ｂ細胞、単核細胞など多様な細胞で生成される重要な免疫調節サイトカインで、主要機能は炎症反応の抑制であって、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αを含む前炎症性サイトカインの生成を抑制するなどの免疫抑制および抗炎症特性を有している。
【0024】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、下痢、血便、腹痛および体重損失によって特徴づけられる胃腸管の慢性炎症性疾患であり、原因不明の慢性、再発する炎症である。ＩＢＤは、２つの主な疾患状態、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）およびクローン疾病（ＣＤ）を含み、さらに詳しくは、慢性または急性潰瘍性大腸炎およびクローン疾患を含む。ＵＣは、主に大腸または結腸の粘膜の層に影響を及ぼす。これに対し、ＣＤは、小腸および大腸の部分（ｓｅｇｍｅｎｔｓ）を含むことができる貫壁性肉芽腫性炎症（ｔｒａｎｓｍｕｒａｌ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｕｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）として定義されたものである。
【0025】
本発明において、プロバイオティクスバクテリア（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ）は、抗－炎症性（プロバイオティクス）組成物、例えば、機能性食品、ニュートラシューティカルズ（ｎｅｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）または薬剤学的組成物に含まれてもよいし、胃腸管においてプロバイオティクスの生存を促進するための方法が提供される。
【0026】
本発明において、前記フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属微生物は、例えば、配列番号１のポリヌクレオチド配列と９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有する１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を含むバクテリア菌株（ｂａｃｔｅｒｉａ ｓｒａｉｎ）であってもよいし、配列番号１のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を含むバクテリア菌株、好ましくは、受託番号ＫＣＴＣ １３７８３ＢＰを有するフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスＣＬＣＣ１菌株であってもよい。前記微生物またはバクテリア菌株（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎ）は、下記の特性からなる群より選択された１種以上の特性を有するものである：
（１）配列番号１のヌクレオチド配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡまたはこれとヌクレオチド配列同一性が９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡを有する；
（２）脂質生産パターン、詳しくは、１７：０ ｉｓｏ ３ＯＨ脂肪酸を含まないものであり、さらに詳しくは、１５：１ ｗ８ｃ脂肪酸、１９：０ ｃｙｃｌｏ ｗ１０ｃ／１９ｗ６脂肪酸、２０：１ ｗ９ｃ脂肪酸、１４：０ ３ＯＨ／１６：１ ｉｓｏ Ｉ脂肪酸、１５：０ ３ＯＨ脂肪酸、１６：０ ｉｓｏ脂肪酸および１６：０ ｉｓｏ ３ＯＨ脂肪酸からなる群より選択される１つ以上の脂肪酸を含み、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉにはないＰＬ３を含む；
（３）フィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスＣＬＣＣ１菌株の遺伝体配列に比べて、平均ヌクレオチド一致度（ａｖｅｒａｇｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ、ＡＮＩ）値が９５％以下である；
（４）免疫調節能および／または抗炎活性、例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＩＬ－８およびＴＮＦ－αからなる群より選択された１種以上の炎症性サイトカインのレベルを減少させるものであるか、および／またはＩＬ－１０およびＴＮＦ－βからなる群より選択された１種以上の抗炎症性サイトカインのレベルを増加させるものであって、抗炎活性と免疫調節活性、例えば、免疫抑制能を有する；
（５）抗癌活性、具体的には、癌の発生を防止、腫瘍の成長速度を遅延または阻害したり、腫瘍の大きさまたは体積を減少させたり、または癌の転移を抑制または遅延させる活性であり、一例として、フィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスは、癌細胞株を皮下移植したマウスに投与した時、前記微生物を投与しない対照群に比べて腫瘍の体積を１０～９０％に減少させる活性を有し、
さらに詳しくは、腫瘍の成長抑制活性または癌細胞のアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘発する抗癌活性を有するもの；
癌細胞株を移植した動物モデルに投与した時、微生物を投与しない対照群に比べて相対的な腫瘍体積の減少率は５％以上；または
癌細胞株を移植した動物モデルに投与した時、微生物を投与しない対照群に比べて腫瘍の重量に応じた腫瘍成長抑制率が５％以上を有する；
（６）培養温度２０～４０℃であるか、嫌気条件下で培養され、具体的には、２０～４０℃の温度、２５～４０℃の温度、３０～４０℃の温度、３５～４０℃または３７℃の温度で培養できる；および
（７）高い酪酸含有量、詳しくは、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ ＡＴＣＣ ２７７６８菌株に比べて２倍～５０倍を有する。
（１）配列番号１のヌクレオチド配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡまたはこれとヌクレオチド配列同一性が９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡを有する；
（２）脂質生産パターン、詳しくは、１７：０ ｉｓｏ ３ＯＨ脂肪酸を含まないものであり、さらに詳しくは、１５：１ ｗ８ｃ脂肪酸、１９：０ ｃｙｃｌｏ ｗ１０ｃ／１９ｗ６脂肪酸、２０：１ ｗ９ｃ脂肪酸、１４：０ ３ＯＨ／１６：１ ｉｓｏ Ｉ脂肪酸、１５：０ ３ＯＨ脂肪酸、１６：０ ｉｓｏ脂肪酸および１６：０ ｉｓｏ ３ＯＨ脂肪酸からなる群より選択される１つ以上の脂肪酸を含み、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉにはないＰＬ３を含む；
（３）フィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスＣＬＣＣ１菌株の遺伝体配列に比べて、平均ヌクレオチド一致度（ａｖｅｒａｇｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ、ＡＮＩ）値が９５％以下である；
（４）免疫調節能および／または抗炎活性、例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＩＬ－８およびＴＮＦ－αからなる群より選択された１種以上の炎症性サイトカインのレベルを減少させるものであるか、および／またはＩＬ－１０およびＴＮＦ－βからなる群より選択された１種以上の抗炎症性サイトカインのレベルを増加させるものであって、抗炎活性と免疫調節活性、例えば、免疫抑制能を有する；
（５）抗癌活性、具体的には、癌の発生を防止、腫瘍の成長速度を遅延または阻害したり、腫瘍の大きさまたは体積を減少させたり、または癌の転移を抑制または遅延させる活性であり、一例として、フィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスは、癌細胞株を皮下移植したマウスに投与した時、前記微生物を投与しない対照群に比べて腫瘍の体積を１０～９０％に減少させる活性を有し、
さらに詳しくは、腫瘍の成長抑制活性または癌細胞のアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘発する抗癌活性を有するもの；
癌細胞株を移植した動物モデルに投与した時、微生物を投与しない対照群に比べて相対的な腫瘍体積の減少率は５％以上；または
癌細胞株を移植した動物モデルに投与した時、微生物を投与しない対照群に比べて腫瘍の重量に応じた腫瘍成長抑制率が５％以上を有する；
（６）培養温度２０～４０℃であるか、嫌気条件下で培養され、具体的には、２０～４０℃の温度、２５～４０℃の温度、３０～４０℃の温度、３５～４０℃または３７℃の温度で培養できる；および
（７）高い酪酸含有量、詳しくは、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ ＡＴＣＣ ２７７６８菌株に比べて２倍～５０倍を有する。
【0027】
本発明の具体的なＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓは、前記特性の中から選択された少なくとも１つ以上の特性を有することができる。例えば、前記（１）～（７）の特性をすべて有する菌株（ｓｔｒａｉｎ）をＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１は、かつて分離および報告されていない新規な種（ｓｐｅｃｉｅｓ）であることが分かる。前記方法で同定されたＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属菌株をフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスＣＬＣＣ１と名付け、２０１９年１月３日付で韓国生命工学研究院生物資源センターに寄託して受託番号ＫＣＴＣ １３７８３ＢＰを与えられた。
さらに詳しくは、フィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスＣＬＣＣ１菌株の遺伝体解読および近縁種との比較結果、フィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスＣＬＣＣ１菌株は、全体遺伝体レベルにおいて最も近い近縁種のＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉと遺伝体レベルにおいて８５．９９％の平均ヌクレオチド一致度（ａｖｅｒａｇｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ、ＡＮＩ）値を示して、かつて分離および報告されていない新規な種（ｓｐｅｃｉｅｓ）であることが分かる。
さらに詳しくは、フィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスＣＬＣＣ１菌株の遺伝体解読および近縁種との比較結果、フィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスＣＬＣＣ１菌株は、全体遺伝体レベルにおいて最も近い近縁種のＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉと遺伝体レベルにおいて８５．９９％の平均ヌクレオチド一致度（ａｖｅｒａｇｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ、ＡＮＩ）値を示して、かつて分離および報告されていない新規な種（ｓｐｅｃｉｅｓ）であることが分かる。
【0028】
さらに詳しくは、本発明による抗癌活性は、大腸癌および／または肝癌に対する抗癌活性であってもよいし、例えば、肝癌および／または大腸癌の発生または進行を抑制する活性であってもよい。具体的には、腫瘍の発生を遅延または腫瘍の成長速度を阻害するものであってもよいし、腫瘍の成長速度の阻害による癌の転移予防活性を追加的に有することができる。
【0029】
本発明によるＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物は、健康な成人男性の糞便から分離して、ヒト癌細胞株、癌細胞株を皮下移植したマウスモデル、または癌細胞株を当該組織に移植したマウスモデルにおいて癌発生の抑制、癌腫の成長を抑制、または癌の転移を抑制または遅延させる活性を有する。具体的には、本発明の一実施例において、健康な成人男性の糞便からＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１微生物を分離して、大腸癌または肝癌を誘導または移植したマウスにおいて腫瘍の成長を抑制する効果を確認した。前記腫瘍成長抑制活性は、例えば、腫瘍の体積／大きさまたは腫瘍の重量を用いて測定できる。
【0030】
本発明が提供するＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓは、癌細胞株を皮下移植した動物モデルに投与した時、微生物を投与しない対照群に比べて、腫瘍の重量に応じた腫瘍成長抑制率が５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、または３０％以上であってもよいし、前記腫瘍の重量に応じた腫瘍成長抑制率は、下記数式１によって計算される。
【数1】
【0031】
前記数式１中、ＩＲは腫瘍の重量に応じた腫瘍の成長抑制率（Ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ、ＩＲ）、Ｔ１は各実験群グループにおける平均腫瘍重量であり、Ｃ１は陰性対照群における平均腫瘍重量である。
【0032】
本発明が提供するＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓは、癌細胞株を皮下移植した動物モデルに投与した時、微生物を投与しない対照群に比べて、腫瘍の体積に応じた相対的な腫瘍体積の減少率は５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、または３０％以上であってもよいし、前記腫瘍の体積に応じた腫瘍成長抑制率は、下記数式２によって計算される。
【数2】
【0033】
前記数式２中、Ｔ２は各実験群グループにおける平均腫瘍体積であり、Ｃ２は陰性対照群における平均腫瘍体積である。
【0034】
本発明の一例により、癌細胞株を移植した腫瘍動物モデルにＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１を投与した時、前記微生物を投与しない陰性対照群の腫瘍体積１００％を基準として、腫瘍体積が９０％以下、８５％以下、８０％以下、７７％以下、７０％以下、６７％以下であってもよいし、腫瘍体積が下限値１０％以上、１５％以上、１８％以上、および２０％以上から選択された数値と、上限値９０％以下、８５％以下、８０％以下、７７％以下、７０％以下、および６７％以下から選択された数値と組み合わせた数値範囲を有するものであってもよい。
【0035】
前記癌が大腸癌の場合、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１微生物は、前記微生物を投与した時、前記微生物を投与しない陰性対照群の腫瘍体積１００％を基準として、腫瘍体積が１０～９０％、１０～８５％、１０～８０％、１０～７７％、１０～７０％、１０～６７％、２０～９０％、２０～８０％、２０～７０％、２０～６７％、３０～９０％、３０～８０％、３０～７０％、３０～６７％、４０～９０％、４０～８０％、４０～７０％、４０～６７％、５０～９０％、５０～８０％、５０～７０％、５０～６７％または６０～６７％のレベルに減少する活性を有するものであってもよい。
【0036】
具体的には、ヒト大腸癌細胞株を用いたマウス皮下腫瘍モデルに微生物の投与を開始した当日（１日）の平均腫瘍サイズは、微生物を投与しない陰性対照群対比約６０～６７％の腫瘍体積を有することが確認されたことから、フィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスの大腸癌成長抑制効果を確認した。
【0037】
前記癌が肝癌の場合、本発明が提供するＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１微生物は、前記微生物を投与した時、前記微生物を投与しない対照群の肝癌腫瘍体積１００％を基準として、腫瘍体積が９０％以下、８５％以下、８０％以下、７７％以下、１０～９０％、１０～８５％、１０～８０％、１０～７７％、１５～９０％、１５～８５％、１５～８０％、１５～７７％、１８～９０％、１８～８５％、１８～８０％、または１８～７７％のレベルに減少する活性を有するものであってもよい。
【0038】
本発明による肝癌の腫瘍体積の減少は、平均的に、対照群に比べて、ＣＬＣＣ１を経口投与した実験群において肝癌腫瘍の体積が１９．５％～７５．３％、平均３２．９％程度低い数値を示した。したがって、経口投与されたＣＬＣＣ１微生物が肝癌において腫瘍の発生および進行を抑制する活性を有することが分かる。
【0039】
本発明によるＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓは、既存のフィーカリバクテリウム属微生物であるフィーカリバクテリウムプラウスニッツイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）とは異なる脂質生産パターンを示す特性がある。
【0040】
本発明によるＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓは、１７：０ ｉｓｏ ３ＯＨ脂肪酸を含まない。本発明の一実施例において、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１微生物とＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ種の極性脂質含有量を分析した結果、ＣＬＣＣ１は、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉにはないＰＬ３を追加的に有していることを確認した（図３Ｂ）。本発明によるＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓは、１５：１ ｗ８ｃ脂肪酸、１９：０ ｃｙｃｌｏ ｗ１０ｃ／１９ｗ６脂肪酸、２０：１ ｗ９ｃ脂肪酸、１４：０ ３ＯＨ／１６：１ ｉｓｏ Ｉ脂肪酸、１５：０ ３ＯＨ脂肪酸、１６：０ ｉｓｏ脂肪酸および１６：０ ｉｓｏ ３ＯＨ脂肪酸からなる群より選択される１つ以上の脂肪酸を含むものであってもよい。
【0041】
本発明の一実施例において、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１微生物と、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ種の脂肪酸の構成をガスクロマトグラフィー分析を行って比較した結果、２つの微生物間で主要脂肪酸の構成に差があることが分かった。具体的には、１５：１ ｗ８ｃ脂肪酸、１９：０ ｃｙｃｌｏ ｗ１０ｃ／１９ｗ６脂肪酸、２０：１ ｗ９ｃ脂肪酸、１４：０ ３ＯＨ／１６：１ ｉｓｏ Ｉ脂肪酸、１５：０ ３ＯＨ脂肪酸、１６：０ ｉｓｏ脂肪酸および１６：０ ｉｓｏ ３ＯＨ脂肪酸はＣＬＣＣ１微生物でのみ検出され、１７：０ ｉｓｏ ３ＯＨ脂肪酸はＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ ＡＴＣＣ ２７７６８でのみ検出された。
【0042】
本発明によるＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓは、短鎖脂肪酸（ｓｈｏｒｔ ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ；ＳＣＦＡ）のうち酪酸の生産量が高い。具体的には、本発明のＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株の酪酸生産量は、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ種に比べて２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、６．５倍以上、または７倍以上であってもよいし、具体的には、２～５０倍、２～４０倍、２～３０倍、２～２０倍、２～１５倍、２～１０倍、５～５０倍、５～４０倍、５～３０倍、５～２０倍、５～１５倍、５～１０倍、６～３０倍、６～２０倍、６～１５倍、６～１０倍、７～３０倍、７～２０倍、７～１５倍、または７～１０倍であってもよい。具体的な一例において、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株およびＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ種の培養上澄液のＳＣＦＡ分析結果、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株は、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ種に比べて７．８倍高い酪酸含有量を示した（図３Ｃ～３Ｄ）。
【0043】
本発明によるＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ菌株は、寒天培地に塗抹して培養する場合、３ｍｍ以内または２ｍｍ以内のコロニーを形成し、光学顕微鏡で観察した時、長い棒状の細胞形状を有する。本発明の一実施例において、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓは、２．９Ｍｂｐの遺伝体サイズを有し、タンパク質暗号化部位（ＣＤＳ）の数は２６９５個であり、ＧＣ比率は５６．１％、ｒＲＮＡ遺伝子の数は２１個、全体ｔＲＮＡ遺伝子の数は６９個となった。本発明によるＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１は、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉに比べて７．８倍高い含有量の酪酸（ｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）が検出された（図３Ｃ～３Ｄ）。
【0044】
本発明の具体的な一例において、ＤＳＳで誘導される大腸炎モデルは、組織学的に腺窩（ｃｒｙｐｔ）形態の変化および喪失、潰瘍、炎症細胞の浸潤などがヒトの潰瘍性大腸炎（ＵＣ；Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）と類似し、大腸炎モデルに多く使用されている。本発明によるフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスＣＬＣＣ１を２ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｈｅａｄおよび２ｘ１０８ｃｅｌｌｓ／ｈｅａｄの用量で１回／日の頻度で２４日間投与して用量に応じた差、２ｘ１０８ｃｅｌｌｓ／ｈｅａｄの用量で１回／日の頻度で１０日間投与して投与期間に応じた差、死滅菌２ｘ１０８ｃｅｌｌｓ／ｈｅａｄの用量で１回／日の頻度で２４日間投与して生菌と死菌による大腸炎の改善効果を確認した。
【0045】
その結果、３％ＤＳＳで大腸炎を誘発した陰性対照群の体重は急激に減少し、血便を含む軟便および下痢が観察され、大腸の長さは減少し、組織病理学的に腺窩構造が崩れ、粘膜の生成に関与するＧｏｂｌｅｔ細胞が無くなり、全層炎症が発生し、炎症細胞が観察された。また、陰性対照群において炎症性サイトカインであるＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６の発現は増加する。
【0046】
ＤＳＳで誘発されたＢＡＬＢ／ｃ ｍｏｕｓｅ大腸炎の動物モデルにフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスＣＬＣＣ１生菌の繰り返し投与は、大腸炎による体重減少を低くし、大腸の長さが減少することを改善させ、大腸粘膜の組織損傷を低減し、炎症性サイトカインＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６の発現を抑制することによって、大腸炎の改善に効果がある。具体的には、炎症性サイトカインＩＦＮ－γおよびＩＬ－６の発現は、陰性対照群に比べて統計学的に有意に減少し、ＴＮＦ－αも減少する傾向を示した。菌数および投与期間による大きな変化なくすべての測定項目で類似の結果が導出された。死滅菌２ｘ１０８ｃｅｌｌｓ／ｈｅａｄ２４回投与群の体重減少および大腸の長さは、陰性対照群と類似していた。また、炎症性サイトカインＩＦＮ－γおよびＩＬ－６は、陰性対照群に比べて減少した。
【0047】
本発明による炎症性胃腸管、例えば、ＩＢＤの予防、改善または治療用組成物は、フィーカリバクテリウム属微生物が菌体自体を含むか、または菌体を含まないｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ形態であってもよい。前記破砕物は、前記フィーカリバクテリウム属微生物菌体を破砕した破砕物または前記破砕物を遠心分離して得られた上澄液を意味するものである。本明細書において、別途の言及がない限り、フィーカリバクテリウム属微生物は、前記微生物の菌体；前記微生物の培養物；前記微生物の破砕物；および前記微生物、培養物および破砕物からなる群より選択された１種以上の抽出物；からなる群より選択された１種以上を意味するものとして使用される。
【0048】
本発明による組成物は、凍結乾燥した菌体を含むことができる。微生物菌体の凍結乾燥は、通常の技術者が当業界にて公知の方法で行うことができる。代案的に、本発明の組成物は、生きている微生物の培養物を含むことができる。一例において、本発明による微生物は、前記フィーカリバクテリウム属微生物が菌体自体を含む場合、生菌、死菌、またはこれらの混合物であってもよい。
【0049】
本発明によるＩＢＤの予防、改善または治療用組成物は、治療有効量の本発明の微生物を含む。治療有効量の微生物は、患者に有用な効果を発揮するのに十分である。バクテリア性菌株の治療学的有効量は、患者の腸内輸送および／または部分的または全体コロニー化をきたすのに十分であり得る。前記バクテリアまたは抽出物は、例えば、対象の類型、疾病の深刻性および投与の経路に応じて異なる、治療学的有効量で対象に投与されるように剤形化される。例えば、成人ヒトに対するバクテリアの適した１日投与量は、約１ｘ１０３～約１ｘ１０１５コロニー形成単位（ＣＦＵ）であってもよく、例えば、約１ｘ１０３～約１ｘ１０１５ＣＦＵ、約１ｘ１０３～約１ｘ１０１４ＣＦＵ、約１ｘ１０３～約１ｘ１０１３ＣＦＵ、約１ｘ１０３～約１ｘ１０１２ＣＦＵ、約１ｘ１０３～約１ｘ１０１１ＣＦＵ、約１ｘ１０５～約１ｘ１０１５ＣＦＵ、約１ｘ１０５～約１ｘ１０１４ＣＦＵ、約１ｘ１０５～約１ｘ１０１３ＣＦＵ、約１ｘ１０５～約１ｘ１０１２ＣＦＵ、約１ｘ１０５～約１ｘ１０１１ＣＦＵ、約１ｘ１０７～約１ｘ１０１５ＣＦＵ、約１ｘ１０７～約１ｘ１０１４ＣＦＵ、約１ｘ１０７～約１ｘ１０１３ＣＦＵ、約１ｘ１０７～約１ｘ１０１２ＣＦＵ、約１ｘ１０７～約１ｘ１０１１ＣＦＵであってもよいし、前記バクテリア菌株投与量の単位は、前記炎症性胃腸管、例えば、ＩＢＤの予防、改善または治療用組成物の総重量を基準として、／ｇコロニー形成単位（ＣＦＵ）、つまり、ＣＦＵ／ｇであってもよい。
【0050】
前記バクテリアの投与は、何らかの適切な経路を通して投与される。例えば、本発明の前記特定のフィーカリバクテリウム属微生物は、経口的に消化可能な形態で動物（ヒトを含む）に投与されてもよい。食品組成物またはニュートラシューティカルズの場合に、前記バクテリアは、通常の食品物品または食品補充物に単純に含まれてもよい。代表的な薬剤学的剤形は、カプセル、マイクロカプセル、錠剤、顆粒、粉末、トローチ、丸薬、座薬、懸濁液およびシロップを含む。他の実施形態において、前記組成物は、例えば、直腸の座薬または浣腸のような動物（ヒトを含む）に対する直腸投与のための形態である。適切な剤形は、通常の有機および無機添加剤を用いて通常適用された方法によって製造されてもよい。医学組成物における有効成分の量は、所望の治療学的効果を達成するレベルであってもよい。
【0051】
本発明の組成物は、フィーカリバクテリウム属微生物を腸内に輸送できるようにカプセル化される。カプセル化は、例えば、圧力、酵素活性またはｐＨの変化によって誘発されうる物理的崩壊のような化学的または物理的刺激による破裂により標的位置に輸送されるまで組成物が分解されないように保護する。任意の適切なカプセル化方法が使用できる。例示的なカプセル化技術は、多孔性マトリックス内の捕捉、固体担体表面上の付着または吸着、凝集または架橋結合剤による自己凝集および微細多孔性膜またはマイクロカプセル後の機械的封鎖を含む。
【0052】
本発明による炎症性疾患、例えば、炎症性胃腸管疾患の予防、改善または治療用薬学組成物は、フィーカリバクテリウム属微生物の菌体；前記微生物の培養物；前記微生物の破砕物；および前記微生物、培養物および破砕物からなる群より選択された１種以上の抽出物；からなる群より選択された１種以上を有効成分として含み、および許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含むことができる。治療的使用のための許容可能な担体または希釈剤は、薬学分野にてよく知られている。
【0053】
本発明の薬学組成物の投与用量は、患者の年齢、体重、性別、投与形態、健康状態および疾患程度に応じて異なっていてもよいし、医師または薬剤師の判断により一定時間間隔で１日１回～数回に分割投与してもよい。例えば、有効成分の含有量を基準として１日投与量が０．１～５００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．５～３００ｍｇ／ｋｇであってもよい。前記投与量は、平均的な場合を例示したものであって、個人的な差によりその投与量が高かったり低くてもよい。
【0054】
本発明の組成物は、プロバイオティクスであってもよいし、プロバイオティクスは、少なくとも１つの適したプレバイオティクス化合物と配合される。前記プレバイオティクス化合物は、一般に、オリゴ－またはポリサッカライドまたは砂糖アルコールのような非－消化性炭水化物であり、これは上部消化管で分解または吸収されない。公知のプレバイオティクスは、イヌリンおよびトランスガラクト－オリゴサッカライドのような市販中の製品を含む。シンバイオティクス（Ｓｙｎｂｉｏｔｉｃｓ）は、相乗作用の形態でプロバイオティクスおよびプレバイオティクスを結合した栄養上の補充物（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）を示す。
【0055】
本発明の一例は、抗炎症活性を有するフィーカリバクテリウム属微生物の菌体；前記微生物の培養物；前記微生物の破砕物；および前記微生物、培養物および破砕物からなる群より選択された１種以上の抽出物；からなる群より選択された１種以上を含む炎症性腸疾患の予防または改善のための食品組成物、例えば、炎症性腸疾患の予防または改善用食品組成物または抗癌機能性食品組成物に関する。
【0056】
通常の意味としての食品、食品添加剤、健康機能性食品、飲料および飲料添加剤などをすべて含む意図である。本発明において、飲料とは、渇きを解消したり味を楽しむために飲むものの総称を意味し、機能性飲料を含む意図である。前記飲料は、液状、シロップおよび／またはゲル形態であってもよい。
【0057】
前記食品組成物に含有された有効成分としてのフィーカリバクテリウム属微生物の含有量は、食品の形態、所望する用途などに応じて適切に特別な制限がなく、例えば、全体食品重量の有効成分であるフィーカリバクテリウム属微生物の菌体、前記微生物の培養物、前記微生物の破砕物および前記微生物の抽出物からなる群より選択された１種以上は、０．００００１重量％～１００重量％、０．００１重量％～９９．９重量％、０．１重量％～９９重量％、さらに好ましくは、１重量％～５０重量％、０．０１～１５重量％加えられる。例えば、食品組成物は、１００ｍｌを基準として０．０２～１０ｇ、好ましくは０．３～１ｇの比率で加えられる。
【0058】
本発明の組成物は、食品として剤形化されてもよい。例えば、食品は、栄養補充剤のように、本発明の治療効果以外に栄養的な利益を提供することができる。
【0059】
本願において、用語、「危険度の予測」または「発病可能性の予測」とは、対象が特定疾患が発病する可能性があるかを判別することをいい、特定疾病の発病危険性の高い患者を特別かつ適切な管理により発病時期を遅らせたり発病しないようにしたり、最も適切な治療方式を選択することによって治療決定をするために臨床的に使用できる。また、「診断」とは、病理状態の存在または特徴を確認することを意味し、本発明の目的上、診断は、疾病の発病の有無を確認することを意味することができる。
【0060】
前記「対象」は、炎症性腸疾患の発病危険度の予測または癌診断、フィーカリバクテリウム属微生物の治療反応性を予測または評価、前記微生物の投与可能性がある対象、または前記微生物の投与を受けて微生物効能のモニタリングが必要な対象であってもよいし、例えば、炎症性腸疾患の発病危険が疑われる対象、炎症性腸疾患の診断を受けた対象、または抗炎症性腸疾患治療を受ける対象であってもよい。前記対象は、好ましくは、ヒトである。
【0061】
本明細書において、対象の生物学的試料は、炎症性腸疾患を有したりまたは炎症性腸疾患を有するものと疑われる哺乳類から分離された試料のような、被検者から分離された細胞抽出物、何らかの器官、組織、細胞、唾液、または大便などが含まれてもよい。例えば、前記試料は、非制限的に、胃腸管のある部分（非限定的に、結腸、胃、大便、肛門、直腸、十二指腸を含む）からの細胞または組織（例えば、生体検査または剖検（ａｕｔｏｐｓｙ）からの）、患者（ヒトまたは動物）、実験対象や実験的動物から得た胃腸の細胞溶解物（ｌｙｓａｔｅ）、または被検者の排出物を含むことができる。好ましくは、試料は、大便であってもよい。
【0062】
本発明の一例において、フィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンス微生物の検出は、試料中の微生物の存否の確認、微生物の同定、微生物のレベル測定、および相対的占有率の分析を含む。具体的には、試験対象の試料からフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンス微生物を検出したり微生物のレベルを測定することは、フィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンス微生物に特異的なバイオマーカとして、核酸配列、アミノ酸配列、代謝産物、または微生物自体を用いて行ったり、試料中に存在する微生物群集の全体遺伝体、または少なくとも１つ以上の特定遺伝子の塩基配列情報を取得して微生物レベルを評価することを含むことができる。
【0063】
具体的には、ＰａｃＢｉｏシーケンシングライブラリーキットを用いてシーケンシングライブラリーの作製後、ＰａｃＢｉｏ ＲＳ ＩＩプラットフォームを用いて全体遺伝体シーケンシングを行い、自社の遺伝体データ分析プラットフォームであるＢＩＯｉＰＬＵＧのＷｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ分析パイプラインを用いて遺伝体シーケンシング情報を分析することができ、その結果、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株の全体遺伝体サイズは約２．９Ｍｂｐであり、タンパク質暗号化部位（ＣＤＳ）の数は２６９５個であり、ＣＤＳ部位またはＩｎｔｒｏｎ部位などフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスに特異的な部位を選択してバイオマーカとして活用することができる。
【0064】
例えば、前記微生物の検出は、試験対象の腸内微生物群集に関する属（ｇｅｎｕｓ）または種（ｓｐｅｃｉｅｓ）レベルで区別される微生物とこれらの微生物においてフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスの相対的な占有比率（ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を求めて、フィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスのレベルを測定して行われる。
【0065】
前記微生物のレベル測定は、対象の試料、例えば、腸パイオプシスまたは大便試料からフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンス菌株の比率を測定するものであってもよい。前記菌株の比率測定方法は、通常の技術者が当業界の技術常識により適切に選択して使用可能であり、例えば、定量的重合酵素連鎖反応（ｑＰＣＲ）、大容量塩基配列分析法（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、蛍光インサイチュー混成化（ＦＩＳＨ）、マイクロアレイおよびＰＣＲ－ＥＬＩＳＡからなる群より選択される分子的方法を用いて行われるが、これに制限されない。
【0066】
例えば、前記試験対象の試料中のフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスの微生物レベルを測定し、参照対象の微生物レベルと比較して、前記試験対象の微生物レベルが参照対象の微生物レベルに比べて低い場合、前記試験対象が腸疾患の発病の危険性を有すると決定するものであってもよい。
【0067】
前記方法は、前記試験対象の試料中のフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスの微生物レベルを測定し、参照対象の微生物レベルと比較して、前記試験対象の微生物レベルが参照対象の微生物レベルに比べて低い場合、前記試験対象が腸疾患の発病の危険性を有すると決定する段階を追加的に含むことができる。
【0068】
本発明による人体由来試料を用いたメタゲノム分析により癌発病の危険度を予め予測することによって、癌の危険群を早期に診断および予測して適切な管理により発病時期を遅らせたり発病を予防することができ、発病後にも早期診断が可能で癌の発病率を低くし、治療効果を高めることができる。また、癌と診断された患者におけるメタゲノム分析により原因因子の露出を避けることによって、癌の経過を良くしたり、再発を防ぐことができる。
【0069】
試験対象の試料からフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスを検出したり微生物のレベルを測定する方法を、以下にさらに詳しく説明する。
【0070】
本発明の一例として、特定遺伝子、例えば、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を利用して前記微生物の検出またはレベルを測定する方法を提供することができる。
【0071】
具体的には、前記微生物のレベルは、好ましくは、前記試料における特定核酸配列のレベルを決定することによって測定可能であり、前記核酸配列は、好ましくは、前記１つ以上のバクテリアの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列、さらに好ましくは、前記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の領域、例えば、前記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の可変領域Ｖ１および／またはＶ６のうちの１つ以上であってもよい。
【0072】
このため、前記微生物の検出は、試験対象の腸内微生物群集に関する種（ｓｐｅｃｉｅｓ）レベルで区別される菌種とこれらの菌種においてフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスの占有比率を得て、相対的なフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスのレベルを測定して行われるものであってもよい。前記腸内微生物の遺伝体情報から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝情報を得る段階；および前記腸内微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ情報を分析して試験対象の腸内微生物群集に含まれている菌種の占有比率を得る段階を含むものであってもよい。
【0073】
試験対象の遺伝体情報は、格納媒体に格納された遺伝情報であるか、試験対象の試料から分離された微生物の遺伝体情報であってもよい。前記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝情報を得る段階は、次世代遺伝体塩基配列分析（ＮＧＳ）プラットフォームを用いて、前記抽出されたＤＮＡの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を分析する段階であってもよい。
【0074】
前記抽出されたＤＮＡの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を分析する段階は、１６Ｓ ｒＲＮＡの可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）を特異的に増幅できるプライマーセットを用いてＰＣＲを行う段階、好ましくは、１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ３～Ｖ４領域を特異的に増幅できるプライマーセットを用いてＰＣＲを行う段階、さらに好ましくは、下記の配列を有するｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲを行ってアンプリコンを生成する段階を含むことができる。
【0075】
前記腸内微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ情報を分析して試験対象の腸内微生物群集に関する種（ｓｐｅｃｉｅｓ）レベルで区別される菌種とこれらの菌種の占有比率を得る腸内微生物群集情報を分析することができる。
前記微生物群集を分析する段階は、１６Ｓ ｒＲＮＡデータベースを用いて微生物を属または種レベルで同定および分類する段階、および／または各微生物群集規模（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を分析する段階を含むものであってもよい。前記微生物の同定および分類に用いられるデータベースは、必要に応じて当業者が適切に選択して使用可能であり、例えば、ＥｚＢｉｏＣｌｏｕｄ、ＳＩＬＶＡ、ＲＤＰおよびＧｒｅｅｎｇｅｎｅからなる群より選択される１つ以上のデータベースであってもよいが、これに制限されるわけではない。
前記微生物群集を分析する段階は、１６Ｓ ｒＲＮＡデータベースを用いて微生物を属または種レベルで同定および分類する段階、および／または各微生物群集規模（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を分析する段階を含むものであってもよい。前記微生物の同定および分類に用いられるデータベースは、必要に応じて当業者が適切に選択して使用可能であり、例えば、ＥｚＢｉｏＣｌｏｕｄ、ＳＩＬＶＡ、ＲＤＰおよびＧｒｅｅｎｇｅｎｅからなる群より選択される１つ以上のデータベースであってもよいが、これに制限されるわけではない。
【0076】
前記微生物群集規模は、全体腸内微生物菌叢において特定微生物群集が占める比率（％）で表される。前記微生物群集の占める比率（％）は、全体シーケンシングリード数のうち特定微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡリード数の頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）の百分率で表される。前記特定微生物は、本発明が提供するフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンス（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ）である。
【0077】
微生物群集分析をしてどのような微生物が存在するかを知ろうとする場合、種同定のための標識遺伝子（ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅ）だけを選択的に増幅した後、その増幅産物の塩基配列を分析するアンプリコンシーケンシング（ａｍｐｌｉｃｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）方法を用いることによって、分析に必要な費用と時間を低減することができる。細菌群集分析をするためには、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標識遺伝子として使用するが、この遺伝子はすべての細菌に存在し、保存領域と変異領域（ｖ１－ｖ９）を適切に含んでいて、系統分析と生態研究に適合する。
【0078】
本発明のさらなる一例として、フィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスに特異的なバイオマーカーを用いて前記微生物の検出またはレベルを測定する方法を提供する。
【0079】
本発明において、フィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンス微生物に特異的なバイオマーカーとして、核酸配列、アミノ酸配列、および代謝産物を含むことができる。このため、本発明のバイオマーカーを検出できる製剤は、試料中の当該微生物に特異的に存在するタンパク質、核酸、脂質、糖脂質、糖タンパク質または糖（単糖類、二糖類、オリゴ糖類など）などのような有機生体分子を特異的に検出できるプライマー、プローブ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、および抗体などを使用することができる。
一例として、本発明において、前記微生物を検出できる製剤は、当該微生物を検出できるプローブ、または前記プローブを増幅するためのプライマーであってもよい。前記プライマーは、当該微生物の特定プローブ遺伝子を特異的に検出し、他の微生物の遺伝体配列には特異的な結合をしないことが好ましい。
一例として、本発明において、前記微生物を検出できる製剤は、当該微生物を検出できるプローブ、または前記プローブを増幅するためのプライマーであってもよい。前記プライマーは、当該微生物の特定プローブ遺伝子を特異的に検出し、他の微生物の遺伝体配列には特異的な結合をしないことが好ましい。
【0080】
本発明の具体的な一例は、フィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスを他の微生物種または亜種と区別して特異的に検出することができ、試料中に少量存在するフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスを敏感に検出できるフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンス検出用プローブ、プライマーセット、キット、組成物、および検出方法に関する。前記フィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンス検出用プローブの一例は、Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ｄａｍ）であってもよいが、これに限定されるものではない。また、前記プローブは、検出標識と連結可能である。前記検出標識は、本技術分野にて知られたいかなる方法によって検出できるいかなる化学的モイエティであってもよい。本発明のプライマーはまた、検出可能なシグナルを直接的または間接的に提供できる標識を用いて変形させることができる。標識の例としては、放射性同位元素、蛍光性分子、ビオチンなどがある。プライマーを用いた配列増幅方法は、当業界にて知られた多様な方法を使用することができる。
本発明の一例において、前記分析する段階は、ゲル電気泳動、毛細管電気泳動、塩基配列分析、ＤＮＡチップ、放射性測定、蛍光測定、および燐光測定からなる群より選択された１種以上の方法を行うものであってもよい。
本発明の一例において、前記分析する段階は、ゲル電気泳動、毛細管電気泳動、塩基配列分析、ＤＮＡチップ、放射性測定、蛍光測定、および燐光測定からなる群より選択された１種以上の方法を行うものであってもよい。
【発明の効果】
【0081】
本発明は、フィーカリバクテリウム属微生物を含む炎症性疾患、例えば、炎症性胃腸管疾患の診断または治療用組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【0082】
【図1A】図１Ａは、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１をＲｅｉｎｆｏｒｃｅｄ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｍｅｄｉａ（ＲＣＭ）培地に３日間培養した後に形成されたコロニー形態を示す写真と、液体培養時に対数期状態（ｅｘｐｏｎｅｎｅｔｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ）で細胞の外形を光学顕微鏡で観察した写真である。
【図1B】図１Ｂは、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１の液体培養時に対数期状態（ｅｘｐｏｎｅｎｅｔｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ）で細胞を走査電子顕微鏡で撮影した写真である。
【図4A-4C】図４Ａ～４Ｃは、実施例３－１により肝癌を誘導したマウスにおいてＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１の癌発生抑制効果を測定するために肝癌誘導後、時間に応じた腫瘍の体積変化を示すグラフである。図４Ａは、各個体を点で示した点グラフ、図４Ｂは、実験群と対照群の平均値を比較したグラフ、図４Ｃは、各個体別腫瘍の体積変化をそれぞれ示した折れ線グラフである。
【図5A-5C】図５Ａ～図５Ｃは、実施例３－２により肝移植モデルにおけるＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株の癌発生抑制効果試験の結果および各結果の点グラフと折れ線グラフである。図５Ａは、腫瘍の大きさを直接比較した結果、図５Ｂは、腫瘍の大きさ変化を倍数（ｆｏｌｄ）で表現した結果、図５Ｃは、デルタ値を意味する。
【図6A-6C】図６Ａは、実施例４－１によりヒト大腸癌細胞株を皮下移植したマウスにおいてＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株の投与量に応じた腫瘍の体積変化を示し、図６Ｂは、腫瘍の重量変化を示し、図６Ｃは、腫瘍の大きさ変化を肉眼観察した結果である。
【図6D】図６Ｄは、実施例４－１によりヒト大腸癌細胞株を皮下移植したマウスにおいてＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株の投与期間終了後、陰性対照群（Ｇ１）および各実験群（Ｇ２～Ｇ４）における腫瘍組織を分離して肉眼観察した結果である。
【図6E】図６Ｅは、ヒト大腸癌細胞株を皮下移植したマウスの腫瘍組織においてＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株の投与による細胞壊死を確認するためにＨ＆Ｅ染色を行った結果である。
【図6F】図６Ｆは、ヒト大腸癌細胞株を皮下移植したマウスの腫瘍組織においてＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株の投与による細胞自滅死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を確認するためにＴＵＮＥＬ染色を行った結果である。
【図7】図７は、マウス大腸癌細胞株を皮下移植したマウスの腫瘍組織においてＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株の投与による腫瘍の大きさ変化を観察した結果である。
【図9】図９は、実施例５及び６によりＡｃｕｔｅ ＤＳＳ－ｃｏｌｉｔｉｓを有する動物モデルを用いた大腸炎の予防および治療効果実験においてＤＡＩ（ｄｉｓｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）を測定した結果を示す。
【図11A-11C】図１１Ａ～図１１Ｃは、実施例５及び６によりＡｃｕｔｅ ＤＳＳ－ｃｏｌｉｔｉｓを有する動物モデルを用いた大腸炎の予防および治療効果実験においてサイトカインの発現レベルを測定した結果である。
【発明を実施するための形態】
【0083】
本発明は、下記の例示的な実施例を挙げてさらに詳細に説明するが、本発明の範囲が下記の実施例に限定される意図ではない。
【0084】
実施例１．微生物の分離および同定
１－１：微生物分離
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株は、健康な２０代成人男性の糞便をＲｅｉｎｆｏｒｃｅｄ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｍｅｄｉａ（ＲＣＭ）培地に稀釈塗抹した後、３７℃の常温嫌気培養条件で培養して分離した。
具体的には、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１は、ＲＣＭ寒天培地で３日間培養すれば、最大２～３ｍｍのコロニーを形成し、光学顕微鏡で観察した時、長い棒状の細胞形状を示す特性がある。図１Ａは、前記コロニー形態および光学顕微鏡を用いた細胞の形態の観察結果を示し、図１Ｂは、走査電子顕微鏡を用いて細胞の形態を撮影した写真を示した。
１－１：微生物分離
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株は、健康な２０代成人男性の糞便をＲｅｉｎｆｏｒｃｅｄ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｍｅｄｉａ（ＲＣＭ）培地に稀釈塗抹した後、３７℃の常温嫌気培養条件で培養して分離した。
具体的には、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１は、ＲＣＭ寒天培地で３日間培養すれば、最大２～３ｍｍのコロニーを形成し、光学顕微鏡で観察した時、長い棒状の細胞形状を示す特性がある。図１Ａは、前記コロニー形態および光学顕微鏡を用いた細胞の形態の観察結果を示し、図１Ｂは、走査電子顕微鏡を用いて細胞の形態を撮影した写真を示した。
【0085】
１－２：１６Ｓ ｒＲＮＡ分析を用いた系統分類学的分析
実施例１の方法で分離されたＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株をＲＣＭ液体培地で３７℃の常温嫌気培養条件で１日間培養後、遠心分離して微生物を得た。ＦａｓｔＤＮＡ ＳＰＩＮ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｏｉｌ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いて得られた微生物から全体遺伝体を分離した。
実施例１の方法で分離されたＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株をＲＣＭ液体培地で３７℃の常温嫌気培養条件で１日間培養後、遠心分離して微生物を得た。ＦａｓｔＤＮＡ ＳＰＩＮ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｏｉｌ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いて得られた微生物から全体遺伝体を分離した。
【0086】
ＰａｃＢｉｏシーケンシングライブラリーキットを用いてシーケンシングライブラリーの作製後、ＰａｃＢｉｏ ＲＳ ＩＩプラットフォームを用いて全体遺伝体シーケンシングを行い、自社の遺伝体データ分析プラットフォームであるＢＩＯｉＰＬＵＧのＷｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ分析パイプラインを用いて遺伝体シーケンシング情報を分析した。
【0087】
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株の遺伝体特性を示した。Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株の全体遺伝体サイズは約２．９Ｍｂｐであり、タンパク質暗号化部位（ＣＤＳ）の数は２６９５個であり、ＧＣ比率（ＧＣ ｒａｔｉｏ、％）は５６．１％となった。全体ｒＲＮＡ遺伝子は２１個、全体ｔＲＮＡ遺伝子は６９個となった。
【0088】
前記方法で配列分析されたＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株のｒＲＮＡを分析して系統分類学的分析を行った。Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列は配列番号１に表した。
【0089】
具体的には、ＥｚＢｉｏＣｌｏｕｄデータベースの１６Ｓ－ｂａｓｅｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅパイプラインを用いて１６Ｓ ｒＲＮＡの類似性分析を行い、ＭＥＧＡプログラムを用いて系統分類学的分析を行った。図２Ａに１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子ヌクレオチド配列を分析して同定したＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株の系統分類学的位置を表示した。
【0090】
１－３：核心遺伝子を用いた系統分類学分析
実施例１－２の方法で得られた遺伝体配列データを用いて遺伝子配列間の分析による系統分類学分析を行った。具体的には、バクテリアのｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｍａｒｋｅｒとして使用できる９２個の遺伝子（ｕｐ－ｔｏ－ｄａｔｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｒｅ ｇｅｎｅ（ＵＢＣＧ））の類似性を用いて系統分類学分析を行った。前記９２個の遺伝子はＵＢＣＧ（ｕｐ－ｔｏ－ｄａｔｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｒｅ ｇｅｎｅ）パイプラインで提供する遺伝子を意味する（Ｎａ，Ｓ．Ｉ．，Ｋｉｍ，Ｙ．Ｏ．，Ｙｏｏｎ，Ｓ．Ｈ．，Ｈａ，Ｓ．Ｍ．，Ｂａｅｋ，Ｉ．＆Ｃｈｕｎ，Ｊ．（２０１８））。図２Ｂに９２個の核心遺伝子を分析して得た近縁種との系統分類学的位置を示す図を示した。
実施例１－２の方法で得られた遺伝体配列データを用いて遺伝子配列間の分析による系統分類学分析を行った。具体的には、バクテリアのｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｍａｒｋｅｒとして使用できる９２個の遺伝子（ｕｐ－ｔｏ－ｄａｔｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｒｅ ｇｅｎｅ（ＵＢＣＧ））の類似性を用いて系統分類学分析を行った。前記９２個の遺伝子はＵＢＣＧ（ｕｐ－ｔｏ－ｄａｔｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｒｅ ｇｅｎｅ）パイプラインで提供する遺伝子を意味する（Ｎａ，Ｓ．Ｉ．，Ｋｉｍ，Ｙ．Ｏ．，Ｙｏｏｎ，Ｓ．Ｈ．，Ｈａ，Ｓ．Ｍ．，Ｂａｅｋ，Ｉ．＆Ｃｈｕｎ，Ｊ．（２０１８））。図２Ｂに９２個の核心遺伝子を分析して得た近縁種との系統分類学的位置を示す図を示した。
【0091】
１－４：平均ヌクレオチド一致度（Ａｖｅｒａｇｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ、ＡＮＩ）を用いた類縁関係の分析
実施例１－２の方法で得た遺伝体分析データを用いて、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株と近縁種との間のＡＮＩ値を比較して類縁関係を分析した。
実施例１－２の方法で得た遺伝体分析データを用いて、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株と近縁種との間のＡＮＩ値を比較して類縁関係を分析した。
【0092】
具体的には、（株）Ｃｈｕｎ Ｌａｂで提供する分析プラットフォームであるＧｅｎｏｍｅ－ｂａｓｅｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅ（ＴｒｕｅＢＡＣ ＩＤ）パイプラインを用いてＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株と他の近縁種との間の全体遺伝体配列を比較して遺伝体の類似度値を分析した。
【0093】
図２ＣにＡＮＩ値に基づいたＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株および近縁種の類縁関係図を示した。図２ＤにＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株および近縁種のＡＮＩ値の比較表を示した。各行と列は、１はＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１、２はＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ ＡＴＣＣ ２７７６８（Ｔ）、３はＦｏｕｒｎｉｅｒｅｌｌａ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ ＡＴ２（Ｔ）、４はＩｎｔｅｓｔｉｎｉｍｏｎａｓ ｂｕｔｙｒｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＤＳＭ ２６５８８（Ｔ）、５はＩｎｔｅｓｔｉｎｉｍｏｎａｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ ＧＤ２（Ｔ）、６はＰｓｅｕｄｏｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓ ＡＴＣＣ ２９７９９（Ｔ）、７はＲｕｔｈｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔａｔｉｆｏｒｍａｎｓ ５８５－１（Ｔ）、８はＳｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ ｖａｒｉａｂｉｌｅ ＤＳＭ １５１７６（Ｔ）、９はＧｅｍｍｉｇｅｒ ｆｏｒｍｉｃｉｌｉｓ ＡＴＣＣ ２７７４９（Ｔ）を意味する。各種名の後の（Ｔ）はｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎを意味する。
【0094】
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株の遺伝体解読および近縁種との比較結果、ＣＬＣＣ１菌株は全体遺伝体レベルにおいて最も近い近縁種のＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｌと遺伝体レベルにおいて８５．９９％の平均ヌクレオチド一致度（ａｖｅｒａｇｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ、ＡＮＩ）値を示して、かつて分離および報告されていない新規な種（ｓｐｅｃｉｅｓ）であることが分かる。上記の方法で同定されたＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属菌株をＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１と名付けた。
【0095】
実施例２．微生物の理化学的特性分析
２－１：脂肪酸の含有量分析
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株の分子生物学的特性を分析するために、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株とＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉの脂肪酸（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ）の構成を比較した。
２－１：脂肪酸の含有量分析
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株の分子生物学的特性を分析するために、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株とＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉの脂肪酸（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ）の構成を比較した。
【0096】
具体的には、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株とＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ菌株をそれぞれＲＣＭ培地で３７℃の温度および嫌気条件で培養後、約４０ｍｇの菌体を用いてＭｉｌｌｅｒの方法（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ｔ．（１９８２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８，８６１－８６７）により脂肪酸を得た。
【0097】
前記抽出された脂肪酸の分析にはＡｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ６８９０ Ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙが用いられ、ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎはＡ３０ｍＸ０．３２０ｍｍＸ０．２５μｍ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ Ｍｅｔｈｙｌ ｓｉｌｏｘａｎｅ ｃｏｌｕｍｎ（ＨＰ－１）を使用した。図３ＡにＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株とＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ菌株（ＡＴＣＣ ２７７６８）の脂肪酸の構成を比較したガスクロマトグラフィー分析の結果グラフを示した。図３Ａのグラフにて各ピーク（ｐｅａｋ）が意味する脂肪酸の名前とその数値（％、ｗ／ｖ）を下記表１に示した。
【0098】
【表1】
【0099】
前記表１に示したように、１５：１ ω８ｃ脂肪酸、１９：０ ｃｙｃｌｏ ω１０ｃ／１９ω６脂肪酸、２０：１ ω９ｃ脂肪酸、１４：０ ３ＯＨ／１６：１ ｉｓｏ Ｉ脂肪酸、１５：０ ３ＯＨ脂肪酸、１６：０ ｉｓｏ脂肪酸および１６：０ ｉｓｏ ３ＯＨ脂肪酸はＣＬＣＣ１菌株でのみ検出され、１７：０ ｉｓｏ ３ＯＨ脂肪酸はＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ ＡＴＣＣ ２７７６８菌株でのみ検出された。
【0100】
前記分子生物学的特徴の比較分析結果、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株はＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓに含まれると知られた種であるＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉとは異なる種であることを確認できた。２つの微生物の脂肪酸（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ）の構成を比較した時、２つの微生物間で主要脂肪酸の構成に差があることが分かり、当該結果は図３Ａと表１に示した。
【0101】
２－２：極性脂質（Ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄ）分析
極性脂質（ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄ）の構成を比較するために、薄層クロマトグラフィー（Ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＴＬＣ）分析を行った。
具体的には、５０ｍｇの微生物凍結乾燥試料からＭｉｎｉｋｉｎの方法（Ｍｉｎｉｋｉｎ，Ｄ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（１９８４）．Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｍｅｔｈ２，２３３－２４１．）を用いて極性脂質を抽出した。そして、クロロホルム、メタノールおよび水６５：２５：３．８（ｖ／ｖ）の比率である溶媒（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ：ｍｅｔｈａｎｏｌ：ｗａｔｅｒ＝６５：２５：３．８（ｖ／ｖ））で一次展開を行った。以後、クロロホルム、メタノール、酢酸および水の比率４０：７．５：６：１．８（ｖ／ｖ）である溶媒（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ：ｍｅｔｈａｎｏｌ：ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ：ｗａｔｅｒ＝４０：７．５：６：１．８（ｖ／ｖ））下で二次展開を行った。二次展開後、５％（ｗ／ｖ）エタノーリックモリブデンリン酸（ｅｔｈａｎｏｌｉｃ ｍｏｌｙｂｄａｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ）を用いて染色した。
極性脂質（ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄ）の構成を比較するために、薄層クロマトグラフィー（Ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＴＬＣ）分析を行った。
具体的には、５０ｍｇの微生物凍結乾燥試料からＭｉｎｉｋｉｎの方法（Ｍｉｎｉｋｉｎ，Ｄ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（１９８４）．Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｍｅｔｈ２，２３３－２４１．）を用いて極性脂質を抽出した。そして、クロロホルム、メタノールおよび水６５：２５：３．８（ｖ／ｖ）の比率である溶媒（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ：ｍｅｔｈａｎｏｌ：ｗａｔｅｒ＝６５：２５：３．８（ｖ／ｖ））で一次展開を行った。以後、クロロホルム、メタノール、酢酸および水の比率４０：７．５：６：１．８（ｖ／ｖ）である溶媒（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ：ｍｅｔｈａｎｏｌ：ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ：ｗａｔｅｒ＝４０：７．５：６：１．８（ｖ／ｖ））下で二次展開を行った。二次展開後、５％（ｗ／ｖ）エタノーリックモリブデンリン酸（ｅｔｈａｎｏｌｉｃ ｍｏｌｙｂｄａｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ）を用いて染色した。
【0102】
また、極性脂質（Ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄ）の組成を比較した時、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１とＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉは、１個のホスファチジルグリセロール（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ＰＧ）、２個の未確認のリン脂質（ｕｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ：ＰＬ１、ＰＬ２）、そして多数の未確認の脂質（ｕｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｌｉｐｉｄ、Ｌ）を有していることを確認した。また、ＣＬＣＣ１はＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉにはないｕｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ（ＰＬ３）を追加的に有していることを確認し、当該結果は図３Ｂに示した。前記結果から確認できるように、本発明によるＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１とＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉの極性脂質生産パターンが異なることが分かる。
【0103】
２－３：短鎖脂肪酸（ｓｈｏｒｔ ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ；ＳＣＦＡ）分析
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉとＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１微生物の短鎖脂肪酸生産パターンの差異点を調べるために、韓国医科学研究院に分析依頼をして短鎖脂肪酸の分布分析を行った。
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉとＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１微生物の短鎖脂肪酸生産パターンの差異点を調べるために、韓国医科学研究院に分析依頼をして短鎖脂肪酸の分布分析を行った。
【0104】
具体的には、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉと、本発明のＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株をＲＣＭ培地で１６時間培養後、遠心分離（４℃、４，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）により細胞を沈殿させて上澄液を収集した。前記収集された上澄液は０．２２ｕｍのフィルタを用いてフィルタリング後、冷蔵保管した。前記上澄液からＳＣＦＡ分析のためのＧＣ－ＭＳ用試料はＴａｋｅｓｈｉ Ｆｕｒｕｈａｓｈｉの方法（Ｔａｋｅｓｈｉ Ｆｕｒｕｈａｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ５４３，２０１８，Ｐａｇｅｓ５１－５４）を用いて用意し、ＧＣ－ＭＳを用いた短鎖脂肪酸の分析にはＡｇｉｌｅｎｔ社の６８９０シリーズ装置を用いた。
【0105】
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１と、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の知られた他の種であるＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉの培養上澄液に存在する短鎖脂肪酸（Ｓｈｏｒｔ ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ、ＳＣＦＡ）を比較分析した結果、２つの試料とも、ＳＣＦＡは酪酸（ｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）のみ検出された。また、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ試料に比べてＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１試料から７．８倍高い含有量の酪酸（ｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）が検出された。図３Ｃ～３ＤにＧＣ－ＭＳ分析の結果グラフを示した。
【0106】
また、各試料中の酪酸の比率でみた時、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１培養上澄液では９１．６４％が酪酸となり、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉの培養上澄液では７６．４０％が酪酸であった。表２にＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株の短鎖脂肪酸分析の結果を、表３にＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉの短鎖脂肪酸分析の結果を示した。下記表２～表３に記されたその他の物質は物質ライブラリーデータベース上で探知されたものの、マッチング率（ｑｕａｌｉｔｙ）が非常に低くて正確に物質を特定できないノイズシグナルとして分類された。
【0107】
下記表２および表３にて、ＲＴは滞留時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）を意味する。
【表2】
【表3】
【0108】
本発明のＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株は、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉに比べて短鎖脂肪酸中の酪酸の生産量が高くて、優れた抗癌活性を示すことを予測できる。
【0109】
実施例３．肝癌に対する効能評価
３－１：皮下腫瘍モデルにおける癌発生抑制効能試験
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株の癌発生抑制能を確認するために、マウス肝癌細胞株を用いた皮下腫瘍モデルにおける癌発生抑制効能試験を行った。６週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス１０個体で肝癌細胞株（Ｈｅｐ５５．１ｃ）の皮下腫瘍移植実験により肝癌を発生させ、５５日間の肝癌発生過程でＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株の経口投与が肝癌細胞の成長に及ぼす影響を調べた。前記肝癌細胞株Ｈｅｐ５５．１ｃはマウス由来肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｍａ）である。
３－１：皮下腫瘍モデルにおける癌発生抑制効能試験
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株の癌発生抑制能を確認するために、マウス肝癌細胞株を用いた皮下腫瘍モデルにおける癌発生抑制効能試験を行った。６週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス１０個体で肝癌細胞株（Ｈｅｐ５５．１ｃ）の皮下腫瘍移植実験により肝癌を発生させ、５５日間の肝癌発生過程でＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株の経口投与が肝癌細胞の成長に及ぼす影響を調べた。前記肝癌細胞株Ｈｅｐ５５．１ｃはマウス由来肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｍａ）である。
【0110】
具体的には、マウス肝癌細胞株をマウス皮下組織に移植する４日前からＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１を経口投与した。経口投与４日目にマウス肝癌細胞株（Ｈｅｐ５５．１ｃ）を２．０ｘ１０６ｃｅｌｌｓとなるようにして右脇腹皮下組織に移植した。
【0111】
前記マウス肝癌細胞株を用いた皮下腫瘍モデルに対して、５５日間１日１回、週５回Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株を経口投与した。以後、移植当日（０日）から５５日になるまで７日間隔でＭａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＭＲ）撮影を用いて肝癌腫瘍の大きさ（ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ）を測定した。
【0112】
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株はＲＣＭ培地で培養後、濃縮してＰＢＳバッファーとグリセロールを用いて最終グリセロール濃度１５％（ｖ／ｖ）となるようにして冷凍保管した。そして、マウスに投与直前に解凍後、１匹あたり２００ｕｌ（２ｘ１０８ｃｅｌｌｓ）となるように経口投与した。対照群としてはＣＬＣＣ１菌株を投与しないマウス１０個体を用いた。対照群は菌株が含まれていないＰＢＳおよびグリセロール（１５％、ｖ／ｖ）溶液を２００ｕｌずつ経口投与した。
【0113】
下記表４および表５に皮下腫瘍モデルにおける分離菌株の肝癌発生抑制効能試験で対照群と試験菌の腫瘍サイズの結果を示す。表４には対照群に関する腫瘍の体積（ｖｏｌｕｍｅ）変化の結果であり、表５は、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株を投与した実験群の腫瘍の大きさ（ｖｏｌｕｍｅ）変化の結果である。表にてＳ．Ｄは標準偏差を意味する。
【表4】
【表5】
【0114】
図４は、マウスに癌を誘導した後、時間の変化に応じた腫瘍の体積（ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ）を測定してグラフに示し、前記表４～表５に腫瘍の大きさ変化を数値で表した。
実験結果、ＣＬＣＣ１を経口投与した実験群で対照群に比べて統計的に有意に肝癌の発生および進行が抑制されることが確認された。平均的に、対照群に比べてＣＬＣＣ１を経口投与した実験群で腫瘍の体積が１９．５％から７５．３％程度、平均３２．９％低い数値を示して、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株が投与された実験群における肝癌の発生が遅れ、腫瘍の成長進行速度が阻害されることが確認された。手術後初の腫瘍サイズ測定日の４日で、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株を投与した実験群で腫瘍の大きさが対照群に比べて明確に小さくて、癌発生抑制効果があることを確認できる。したがって、経口投与されたＣＬＣＣ１菌株が肝癌の発生および進行を抑制する活性を有することが分かる。
実験結果、ＣＬＣＣ１を経口投与した実験群で対照群に比べて統計的に有意に肝癌の発生および進行が抑制されることが確認された。平均的に、対照群に比べてＣＬＣＣ１を経口投与した実験群で腫瘍の体積が１９．５％から７５．３％程度、平均３２．９％低い数値を示して、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株が投与された実験群における肝癌の発生が遅れ、腫瘍の成長進行速度が阻害されることが確認された。手術後初の腫瘍サイズ測定日の４日で、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株を投与した実験群で腫瘍の大きさが対照群に比べて明確に小さくて、癌発生抑制効果があることを確認できる。したがって、経口投与されたＣＬＣＣ１菌株が肝癌の発生および進行を抑制する活性を有することが分かる。
【0115】
３－２：肝移植動物モデルにおける癌発生抑制効能試験
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株が肝癌細胞の成長に及ぼす影響を調べるために、８週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス４個体で肝癌細胞株の肝移植実験により肝癌を発生させ、３９日間の肝癌発生過程でＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ細菌ＣＬＣＣ１の経口投与が肝癌細胞の成長に及ぼす影響を調べた。
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株が肝癌細胞の成長に及ぼす影響を調べるために、８週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス４個体で肝癌細胞株の肝移植実験により肝癌を発生させ、３９日間の肝癌発生過程でＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ細菌ＣＬＣＣ１の経口投与が肝癌細胞の成長に及ぼす影響を調べた。
【0116】
具体的には、肝癌細胞株はＨｅｐ５５．１ｃを用い、８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスの上腹部を開腹して、肝の左葉に５．０ｘ１０５ｃｅｌｌｓとなるように肝癌細胞株を移植した。肝に腫瘍細胞株を移植後、４日間の回復期間を経た後、ＭＲＩ撮影により腫瘍の大きさを確認し、腫瘍がよく形成された４匹を選別して後の実験に用いた。
【0117】
移植手術当日（０日）から３９日間ＣＬＣＣ１菌株を実施例４と同様の方法で用意して、移植手術を完了したマウス４匹に経口投与し、対照群の４匹にはＣＬＣＣ１菌株を投与しなかった。対照群は菌株が含まれていないＰＢＳおよびグリセロール（１５％、ｖ／ｖ）溶液を２００ｕｌずつ経口投与した。以後、周期的に腫瘍の大きさと相対的な大きさおよび成長の相対数値を測定した。
【0118】
腫瘍の大きさは７日間隔で磁気共鳴（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＭＲ）撮影により測定され、腫瘍サイズの相対数値は移植当日の腫瘍サイズに対する相対的な大きさを計算して導出した。図５Ａ～図５Ｃに肝移植モデルにおけるＣＬＣＣ１菌株の癌発生抑制効果試験の結果とグラフを示した。
【0119】
図５Ａは、腫瘍の大きさを直接比較した点グラフおよび折れ線グラフ、図５Ｂは、腫瘍の大きさ変化を倍数（ｆｏｌｄ）で表現した点および折れ線グラフ、図５Ｃは、腫瘍の大きさ変化量（測定日の腫瘍サイズと前の測定日の腫瘍サイズとの差）値を示した点および折れ線グラフである。
【0120】
その結果、ＣＬＣＣ１を経口投与した実験群で分離株を投与しない対照群に比べて統計的に有意に肝癌の発生と進行が抑制されることを確認した。肝癌の発生抑制に対する結果および腫瘍の大きさ変化データは、図５Ａ～５Ｃに示した。
表６に腫瘍サイズの相対数値表（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｒｏｗｔｈ；Ｆｏｌｄ）および表７には腫瘍成長の相対数値表（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｒｏｗｔｈ；Ｄｅｌｔａ）を示す。
表６に腫瘍サイズの相対数値表（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｒｏｗｔｈ；Ｆｏｌｄ）および表７には腫瘍成長の相対数値表（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｒｏｗｔｈ；Ｄｅｌｔａ）を示す。
【表6】
【表7】
【0121】
表６および表７と図５Ａ～５Ｂから確認できるように、ＣＬＣＣ１菌株を経口投与したマウスの腫瘍成長が対照群に比べて際立って抑制されることを確認できた。したがって、フィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスＣＬＣＣ１菌株が腫瘍の成長抑制能に優れていることを確認できる。
【0122】
実施例４．大腸癌に対する効能評価
４－１．皮下腫瘍モデルにおける抗癌効果の確認
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株の癌発生抑制能を確認するために、ヒト大腸癌細胞株を用いた皮下腫瘍モデルにおける癌発生抑制効能試験を行った。前記大腸癌細胞株はＨＣＴ－１１６細胞を用い、マウスはヌードマウス（ＣＡｎＮ．Ｃｇ－Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ＣｒｌＯｒｉ、ＳＰＦ）を用いた。前記ＨＣＴ－１１６はヒト由来結直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）に相当する癌細胞株である。
４－１．皮下腫瘍モデルにおける抗癌効果の確認
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株の癌発生抑制能を確認するために、ヒト大腸癌細胞株を用いた皮下腫瘍モデルにおける癌発生抑制効能試験を行った。前記大腸癌細胞株はＨＣＴ－１１６細胞を用い、マウスはヌードマウス（ＣＡｎＮ．Ｃｇ－Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ＣｒｌＯｒｉ、ＳＰＦ）を用いた。前記ＨＣＴ－１１６はヒト由来結直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）に相当する癌細胞株である。
【0123】
具体的には、１週間の順化期間を経たマウスに大腸癌細胞株ＨＣＴ－１１６（２．５ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を使い捨て注射器を用いてマウスの右背皮下に０．２ｍＬ／ｈｅａｄずつ投与して移植した。癌細胞移植後、癌細胞の大きさが約８５～１１９ｍｍ３まで成長した時、ＣＬＣＣ１を投与しない陰性対照群とＣＬＣＣ１を濃度別に投与する実験群の３グループに相当するマウスを１群あたり１０匹ずつ分類した。具体的には、実験群はＣＬＣＣ１の濃度に応じて低、中、高の３グループに分け、低濃度は２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｈｅａｄ、中農度は２ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｈｅａｄ、高濃度は２ｘ１０８ｃｅｌｌｓ／ｈｅａｄの濃度でＦ．ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株を投与した。菌株の投与は３６日間毎日１回注射器で経口投与した。陰性対照群は賦形剤（グリセロールが１５％（ｖ／ｖ）含まれているＰＢＳ溶液）だけを投与した。下記表８に陰性対照群と各実験群の情報を示した。
【表8】
【0124】
（１）腫瘍の大きさ変化および成長抑制率
Ｆ．ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株の抗大腸癌効果を確認するために、腫瘍の大きさ変化を確認した。具体的には、前記菌株投与試験開始後、毎日１回ずつ外観、行動、排泄物などの一般症状を観察し、週１回体重を測定し、週２回腫瘍の大きさを測定し、体積を計算した。図６Ｃおよび６Ｄに腫瘍の大きさを肉眼観察した結果を示した。
Ｆ．ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株の抗大腸癌効果を確認するために、腫瘍の大きさ変化を確認した。具体的には、前記菌株投与試験開始後、毎日１回ずつ外観、行動、排泄物などの一般症状を観察し、週１回体重を測定し、週２回腫瘍の大きさを測定し、体積を計算した。図６Ｃおよび６Ｄに腫瘍の大きさを肉眼観察した結果を示した。
【0125】
前記腫瘍の体積（Ｔｖ）は腫瘍の短軸（ｐｅｒｐｅｎｄｉｃｕｌａｒ ｗｉｄｔｈ、Ｗ）と長軸（ｍａｘｉｍｕｍ ｌｅｎｇｔｈ、Ｌ）をそれぞれ測定して、下記数式３の方法で計算された。
【数3】
【0126】
３６日かけて腫瘍の体積変化を確認した結果を下記表９および図６Ａに示した。陰性対照群（Ｇ１）に比べて、ＣＬＣＣ１菌株を投与した実験群ですべて統計的に有意に腫瘍の大きさが減少したことを確認した。下記表９にて、Ｍｅａｎは平均体積を、Ｓ．Ｄ．は標準偏差（ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔａｉｏｎ）を意味する。
* p＜0.05, Dunnett's t-testによる陰性対照群（G1）との有意差。
** p＜0.01, Dunnett's t-testによる陰性対照群（G1）との有意差。
【表9】
** p＜0.01, Dunnett's t-testによる陰性対照群（G1）との有意差。
【0127】
具体的には、微生物の投与を開始した当日（１日）の平均腫瘍サイズは４グループでいずれも１０５ｍｍ３と同一であったが、３６日経過後には、陰性対照群で平均腫瘍体積が４３３０ｍｍ３となったのに対し、ＣＬＣＣ１菌株が投与された実験群ではいずれも３０００ｍｍ３以下の体積を示して、対照群対比約６０～６７％の腫瘍体積を有することが確認されたことから、フィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンス微生物の大腸癌成長抑制効果を確認した。
【0128】
また、腫瘍の重量測定結果に基づいて各実験群における腫瘍成長抑制率（Ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ、ＩＲ）を下記数式１の方法で計算した。
【数1】
【0129】
前記数式１中、Ｔは各実験群グループにおける平均腫瘍重量であり、Ｃは陰性対照群における平均腫瘍重量である。
【0130】
下記表１０および図６Ｂに菌株投与実験の終了後、各グループにおける腫瘍重量の測定結果を示し、下記表１１に実験の進行による各グループマウスの平均体重の測定結果を示した。
** p＜0.01, Dunnett's t-testによる陰性対照群(G1)との有意差
【表10】
【表11】
【0131】
陰性対照群（Ｇ１）では剖検後に摘出された腫瘍重量が約３．２１ｇとなったが、実験群では低、中、高濃度でそれぞれ１．９４、２．１７および１．９５ｇとなり、腫瘍の重量が統計的に有意に減少したのに対し、各グループにおける全体体重は対照群と実験群との間で大差を示さなかった。
【0132】
低濃度の実験群では腫瘍成長抑制率が３９．６％、中濃度の実験群では腫瘍成長抑制率が３２．４％、高濃度の実験群では腫瘍成長抑制率が３９．３％となり、すべての実験群で腫瘍の成長が３０％以上抑制されたことを確認した。
【0133】
（２）腫瘍細胞の壊死（Ｎｅｃｒｏｓｉｓ）および細胞自滅死（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）
３６日間のＣＬＣＣ１菌株の投与終了後に剖検して、腫瘍組織中の腫瘍細胞の壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）をみるためのＨ＆Ｅ染色（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆Ｅｏｓｉｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ）と、細胞自滅死（ａｐｏｔｏｓｉｓ）をみるためのＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙを行った。
３６日間のＣＬＣＣ１菌株の投与終了後に剖検して、腫瘍組織中の腫瘍細胞の壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）をみるためのＨ＆Ｅ染色（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆Ｅｏｓｉｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ）と、細胞自滅死（ａｐｏｔｏｓｉｓ）をみるためのＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙを行った。
【0134】
図６Ｅに腫瘍細胞の壊死分析のためのＨ＆Ｅ染色結果の写真を示した。陰性対照群と試験群との間の腫瘍細胞の壊死レベルには大差が見つからなかった。したがって、本願のフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンス細胞株は、腫瘍の壊死による炎症反応を誘発しないことが分かる。
【0135】
図６Ｆに腫瘍細胞の自滅死分析のためのＴＵＮＥＬ染色分析結果の写真を示した。陰性対照群に比べてフィーカリバクテリウム投与実験群で腫瘍細胞の自滅死が統計的に有意に増加したことが確認された。したがって、各フィーカリバクテリウム投与群における腫瘍体積の減少が腫瘍の壊死によるものではない、腫瘍の細胞自滅死によるものであって、炎症反応を誘発しないことを確認した。
【0136】
下記表１２に腫瘍細胞の壊死と自滅死を比較した結果を示した。下記表にて、細胞死滅の程度に応じて、±は最小（ｍｉｎｉｍａｌ）、＋は弱い（ｍｉｌｄ）、＋＋は普通（ｍｏｄｅｒａｔｅ）、＋＋＋は顕著（ｍａｒｋｅｄ）、＋＋＋＋は激しい（ｓｅｖｅｒｅ）を示す。各記号の下に当該段階に相当する死滅細胞の個数を示した。
## p＜0.01, Steel's t-testによる陰性対照群(G1)との有意差。
【表12】
【0137】
前記表１２から確認できるように、対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｇ１）では約１０．３３％の細胞死滅比率を示し、低濃度の実験群（Ｇ２）では対照群と類似の細胞死滅比率を示したが、中農度（Ｇ３）および高濃度（Ｇ４）実験群では１２．４％以上の細胞死滅が観察された。したがって、フィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンス微生物の投与によって腫瘍細胞の自滅が増加することが確認された。
【0138】
４－２：大腸癌皮下腫瘍モデルを用いた効能評価
ＣＬＣＣ１菌株の投与時に大腸癌に対する抗癌効能を確認するために、大腸癌細胞を皮下移植したマウスを用い、米国の非臨床委託試験機関であるＣｈａｍｐｉｏｎ’ｓ ｏｎｃｏｌｏｇｙで試験を行った。大腸癌細胞はマウス由来大腸癌細胞株のＭＣ３８細胞を用い、マウスｓｔｒａｉｎはＣ５７ＢＬ／６を用いた。前記ＭＣ３８細胞はマウス由来結直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）に相当する癌細胞株である。試験グループは以下の通りであり、グループあたり１０匹のマウスが含まれている。
ＣＬＣＣ１菌株の投与時に大腸癌に対する抗癌効能を確認するために、大腸癌細胞を皮下移植したマウスを用い、米国の非臨床委託試験機関であるＣｈａｍｐｉｏｎ’ｓ ｏｎｃｏｌｏｇｙで試験を行った。大腸癌細胞はマウス由来大腸癌細胞株のＭＣ３８細胞を用い、マウスｓｔｒａｉｎはＣ５７ＢＬ／６を用いた。前記ＭＣ３８細胞はマウス由来結直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）に相当する癌細胞株である。試験グループは以下の通りであり、グループあたり１０匹のマウスが含まれている。
【0139】
具体的には、６週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて大腸癌細胞株のＭＣ３８細胞株の皮下腫瘍移植実験により大腸癌を発生させ、大腸癌の発生過程でＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株の経口投与が大腸癌細胞の成長に及ぼす影響を調べた。
【0140】
実施例４－１の対照群および実験群の試験製剤の製造方法と実質的に同様の方法で、実施例１のＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１菌株はＲＣＭ培地で培養後、濃縮してＰＢＳバッファーとグリセロールを用いて最終グリセロール濃度１５％（ｖ／ｖ）となるようにして冷凍保管した。そして、マウスに投与直前に解凍後、１匹あたり２００ｕｌの含有量で低濃度生菌（２ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｄｏｓｅ）（試料１は実施例４－１のＧ３に相応）と高濃度生菌（２ｘ１０８ｃｅｌｌｓ／ｄｏｓｅ）１匹あたり２００ｕｌ（２ｘ１０８ｃｅｌｌｓ）（試料２は実施例４－１のＧ４に相応）となるように経口投与した。対照群としてはＣＬＣＣ１菌株を投与しないマウス１０個体を用いた。
【0141】
試料３は前記製造された試料２を１００℃の温度のオーブンで２時間処理して高濃度死菌（２ｘ１０８ｃｅｌｌｓ／ｄｏｓｅ）として用いた。
【0142】
具体的には、対照群と試料１～３の試験製剤を癌細胞接種する２週前から投与を開始して、計４０日間１日１回投与した。具体的には、対照群と試料１～３の試験製剤を４０日間１日１回ずつ経口投与し、投与開始日から１４日経過後に、大腸癌細胞（５ｘ１０５ ＭＣ３８ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ０．１ｍｌ ＰＢＳ）を左横腹の皮下組織に接種し、１週間の生着期間を経た後、腫瘍の大きさを観察２２日目から開始して４０日目まで１８日間行った。腫瘍観察の開始日である２２日を０日と見なして、１８日間Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＭＲ）撮影を用いて大腸癌腫瘍の大きさ（ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ）を測定した。腫瘍の大きさ変化は、癌細胞の生着後２２日間腫瘍の長軸（ｍａｘｉｍｕｍ ｌｅｎｇｔｈ、Ｌ）と短軸（ｐｅｒｐｅｎｄｉｃｕｌａｒ ｗｉｄｔｈ、Ｗ）を測定し、下記数式３に代入して腫瘍の体積（ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ、ＴＶ）を計算した。前記１８日間測定された腫瘍体積を下記表１３と図７に示した。
【数3】
【数2】
【0143】
下記表１３にて、Ｍｅａｎは平均腫瘍体積を、Ｓ．Ｄ．は標準偏差（ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔａｉｏｎ）を意味する。表１３は対照群、試料１～３による分離菌株の大腸癌細胞株を移植した皮下腫瘍モデルにおける腫瘍の体積（ｖｏｌｕｍｅ、ｍｍ３）変化の結果である。
【表13】
【0144】
前記結果、対照群に比べて試料１～３の菌株を投与したグループで得られた腫瘍の体積変化を図７にそれぞれ示した。測定最終日を基準として、対照群の腫瘍体積を１００％に設定して試料１～試料３の腫瘍体積をパーセントで計算した結果、試料１は８９．９％（１０．１％減少）、試料２は７４．２％（２５．８％減少）、試料３は７５．９％（２４．１減少）であって、試験結果、対照群に比べてＣＬＣＣ１を投与した大腸癌モデルマウスにおいて統計的に有意に腫瘍の成長が抑制されることを確認した。
【0145】
ＣＬＣＣ１の死菌体を投与した時も、統計的に有意に腫瘍の成長が抑制されることを確認した。また、ＣＬＣＣ１菌株の生菌を使用するが、濃度を異なって設定した試料１と試料２の腫瘍体積の減少を調べると、同一の実験条件で濃度依存的方式で抗癌活性が増加することを確認できた。
【0146】
また、試験製剤を投与した日の後、１～３日間隔で外観、体重、行動、排泄物などの一般症状を観察した。試験は試験製剤の投与後から計４０日間行われ、癌細胞の生着後１８日間観察した。前記測定された実験動物の体重（Ｋｇ）を下記表１４に示した。
【表14】
【0147】
実験動物の全体体重は、癌細胞の生着後、対照群グループに相当するマウスの体重が試験群より低い傾向を示すが、全体的には対照群と試験群との間で大差がなかった。
【0148】
実施例５：Ａｃｕｔｅ ＤＳＳ－ｃｏｌｉｔｉｓを有する動物モデルに対する予防効能評価
５－１：モデル動物の製造および試料投与
雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（約６週齢）を供給業者から受けて、順応期間（約７日）を経て実験を進行させた。順応期間の後に、試験物質投与開始３週目に７日間、正常対照群は正常な飲水を供給し、正常対照群を除いたすべての群は３％ＤＳＳを飲水瓶に入れて自由給水して大腸炎を誘発した。雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢）を６日間の順化期間を経て、１群あたり６匹（７週齢）で本実験を進行させた。試験動物は計６群で進行させ、群の構成は次の通りである。
５－１：モデル動物の製造および試料投与
雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（約６週齢）を供給業者から受けて、順応期間（約７日）を経て実験を進行させた。順応期間の後に、試験物質投与開始３週目に７日間、正常対照群は正常な飲水を供給し、正常対照群を除いたすべての群は３％ＤＳＳを飲水瓶に入れて自由給水して大腸炎を誘発した。雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢）を６日間の順化期間を経て、１群あたり６匹（７週齢）で本実験を進行させた。試験動物は計６群で進行させ、群の構成は次の通りである。
【表15】
【0149】
対照群は正常対照群（Ｇ１）、陰性対照群（Ｇ２）および陽性対照群（Ｇ３）に設定した。Ｇ１およびＧ２は試験開始日から賦形剤の１５％ｇｌｙｃｅｒｏｌを投与し、Ｇ３はＳａｌｉｃｙｌａｚｏｓｕｌｆａｐｙｒｉｄｉｎｅ（ＳＡＳＰ）を２００ｍｇ／ｋｇ投与した。試験物質投与群は生菌群（Ｇ４、Ｇ５）と死菌群（Ｇ７）とに分けて進行させた。生菌群Ｇ４とＧ５、および死菌群（Ｇ７）は試験開始日から終了日まで１日１回２４日間ＣＬＣＣ１を投与してＣＬＣＣ１の予防効果を確認しようとした。大腸炎は試験物質投与開始３週目に７日間３％ＤＳＳを飲水瓶に入れて自由給水して誘発した。
【0150】
本実験において体重減少評価、疾病活性指数（Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ、ＤＡＩ）、大腸の長さを測定し、大腸組織の組織病理学的検査を行った。
【0151】
５－２：体重減少評価
体重は投与開始日から試験終了日まで２回／週の間隔で測定し、各投与日の投与前に測定した。３％ＤＳＳ給水前に測定された体重を基準として体重の変化を百分率で計算し、その結果を図８に示す。
体重は投与開始日から試験終了日まで２回／週の間隔で測定し、各投与日の投与前に測定した。３％ＤＳＳ給水前に測定された体重を基準として体重の変化を百分率で計算し、その結果を図８に示す。
【0152】
ＤＳＳを給水した場合、６日後からすべての群（Ｇ２～Ｇ７）において給水前に比べて体重が減少し始めて試験終了日まで減少率が増加する傾向が現れた。体重減少は炎症性腸疾患が重要であり潜在的に危険な副作用である。Ｇ２に比べて、Ｇ４、およびＧ５群において体重減少率が統計的に有意に減少した。（＊ｐ＜０．０５ ａｎｄ ＊＊ｐ＜０．０１、Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔ－ｔｅｓｔ）Ｇ７はＧ２と差を示さなかった。したがって、ＣＬＣＣ１生菌の投与は大腸炎による体重減少を改善させることが確認された。
【0153】
５－３：ＤＡＩ（ｄｉｓｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）
ＤＡＩは３％ＤＳＳ投与日から体重（ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ）、便の状態（ｓｔｏｏｌ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）および糞便内の血液の有無（ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｆｅｃａｌ ｂｌｏｏｄ）により点数化して合計で表した。具体的には、疾病活性指数は体重減量（例えば、体重増加またはベースライン対比１％以内維持（点数０）；１．５％体重減少（点数１）；５～１０％体重減少（点数２）；１０～１５％体重減少（点数３）；＞１５％体重減少（点数４））；大便一貫性（例えば、正常（点数０）；柔らかい大便（点数２）；下痢（点数４））；および出血（例えば、出血なし（点数０）、中等度出血（点数２）、激しい出血（点数４））に基づいて点数を付ける。
ＤＡＩは３％ＤＳＳ投与日から体重（ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ）、便の状態（ｓｔｏｏｌ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）および糞便内の血液の有無（ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｆｅｃａｌ ｂｌｏｏｄ）により点数化して合計で表した。具体的には、疾病活性指数は体重減量（例えば、体重増加またはベースライン対比１％以内維持（点数０）；１．５％体重減少（点数１）；５～１０％体重減少（点数２）；１０～１５％体重減少（点数３）；＞１５％体重減少（点数４））；大便一貫性（例えば、正常（点数０）；柔らかい大便（点数２）；下痢（点数４））；および出血（例えば、出血なし（点数０）、中等度出血（点数２）、激しい出血（点数４））に基づいて点数を付ける。
【0154】
前記評価結果を図９に示す。Ｇ３～Ｇ６はＤＳＳ投与後にＤＡＩ点数が増加したが、試験終了時点ではＧ２に比べて低い点数を示した。試験終了時点でＧ３、およびＧ４およびＧ６の平均点数は７．０点、および６．７点で、Ｇ２に比べて統計学的に有意に低かった。（＊ｐ＜０．０５ ａｎｄ ＊＊ｐ＜０．０１、Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔ－ｔｅｓｔ）Ｇ５のＤＡＩ点数は試験終了時点で平均７．３点で、Ｇ２に比べて低かったが、統計学的に有意な差ではなかった。Ｇ７のＤＡＩ点数は試験終了時点で平均１１．３点で、Ｇ２と差を示さなかった。
【0155】
したがって、ＣＬＣＣ１生菌の投与でＧ２に比べてＤＡＩ点数が統計的に有意に減少することを確認し、これは体重、便の状態および糞便内の血液の有無のような症状が改善されたことを意味した。
【0156】
５－４：大腸の長さ測定
試験終了後、動物は麻酔し、開腹して放血した後、個体別に大腸組織を摘出した。摘出した大腸は写真撮影をし、長さを測定した。前記測定された結果を図１０に示す。
試験終了後、動物は麻酔し、開腹して放血した後、個体別に大腸組織を摘出した。摘出した大腸は写真撮影をし、長さを測定した。前記測定された結果を図１０に示す。
【0157】
ＤＳＳで大腸炎を誘発すれば、大腸の長さが減少する。Ｇ２の大腸長さはＧ１に比べて統計学的に有意に減少した。（††ｐ＜０．０１、Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔ－ｔｅｓｔ）生菌投与群Ｇ４、およびＧ５の大腸の長さはＧ２に比べて統計学的に有意に少なく減少した。（＊ｐ＜０．０５、Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔ－ｔｅｓｔ）これは生菌投与群がＧ２に比べて大腸の萎縮を阻害して大腸の長さが減少するのを防止または改善することを意味した。
【0158】
したがって、ＣＬＣＣ１生菌の投与は結腸の萎縮を阻害して大腸の長さが減少するのを改善することが確認された。
【0159】
５－５：Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ分析
大腸からＲＮＡを抽出して、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γの遺伝子発現をＲＴ－ｑＰＣＲにより分析した。
大腸からＲＮＡを抽出して、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γの遺伝子発現をＲＴ－ｑＰＣＲにより分析した。
【0160】
摘出した大腸組織はＰＢＳに水洗後、ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｌｏｔ Ｎｏ．：００８３３２８１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）に入れて保管した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｌｏｔ Ｎｏ．：１５７０３１９２９、ＱＩＡＧＥＮ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のマニュアルによりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。抽出されたｔｏｔａｌ ＲＮＡは核酸定量器（ＩＦＮｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ、Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて２６０ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｍａｃｈｉｎｅ（ＣＦＸ３８４、ＢＩＯ－ＲＡＤ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いてＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－６のＲＴ－ｑＰＣＲを次の条件で実施した。
【0161】
ＲＴ－ｑＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅの組成は下記表１６に示し、ＲＴ－ｑＰＣＲの条件は下記表１７に示す。ＲＴ－ｑＰＣＲの結果は２－ΔΔＣｔ方法を用いて遺伝子発現量を比較した。
【表16】
【表17】
【0162】
前記測定された結果を図１１Ａ～図１１Ｃに示す。
ＤＳＳで大腸炎誘発時、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１７、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－２５、ＩＬ－３３、ＩＬ－８、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－３α、ＣＸＣＬ１およびＩＬ－２３など）は発現が増加し、抗炎症性サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＦＮ－α、ＴＧＦ－βなど）は発現が減少する。このうち、本実験では、炎症性サイトカインとしてＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、およびＴＮＦ－αの発現レベルを測定した。
ＤＳＳで大腸炎誘発時、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１７、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－２５、ＩＬ－３３、ＩＬ－８、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－３α、ＣＸＣＬ１およびＩＬ－２３など）は発現が増加し、抗炎症性サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＦＮ－α、ＴＧＦ－βなど）は発現が減少する。このうち、本実験では、炎症性サイトカインとしてＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、およびＴＮＦ－αの発現レベルを測定した。
【0163】
生菌投与群（Ｇ４～Ｇ５）でいずれも陰性対照群（Ｇ２）に比べてＩＦＮ－γ、およびＩＬ－６のレベルが統計的に有意に低かった。ＴＮＦ－αのレベルはＣＬＣＣ１高濃度生菌投与群（Ｇ５）でＧ２に比べて統計的に有意に低かった。（＊ｐ＜０．０５、Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔ－ｔｅｓｔ）したがって、ＣＬＣＣ１生菌の投与はＩＦＮ－γ、ＩＬ－６およびＴＮＦ－αのような炎症性サイトカインのレベルを低くすることが確認された。
【0164】
５－６：組織病理学的検査
摘出された組織を１０％中性ホルマリンに固定した。摘出して固定させた大腸組織は４～５μｍの厚さに組織切片を作製して薄切してスライドに付着させた。Ｈ＆Ｅ ｓｔａｉｎｉｎｇの後、ｐｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＮＪ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）で封入して顕微鏡（ＣＫＸ４１、Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｊａｐａｎ）で観察して、写真撮影を実施した。
摘出された組織を１０％中性ホルマリンに固定した。摘出して固定させた大腸組織は４～５μｍの厚さに組織切片を作製して薄切してスライドに付着させた。Ｈ＆Ｅ ｓｔａｉｎｉｎｇの後、ｐｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＮＪ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）で封入して顕微鏡（ＣＫＸ４１、Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｊａｐａｎ）で観察して、写真撮影を実施した。
【0165】
前記試験群Ｇ２の大腸粘膜はｃｒｙｐｔ構造が喪失しながら粘液を分泌するｇｏｂｌｅｔ細胞が消失し、全層炎症（ｔｒａｎｓｍｕｒａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）が発生した。組織内の赤血球と白血球が多量観察された。Ｇ３～Ｇ５でｃｒｙｐt構造が維持され、炎症が減少することが観察された。Ｇ７はｃｒｙｐｔ構造が喪失し、組織内の赤血球と白血球が観察された。前記観察された結果を図１２に示す。したがって、ＣＬＣＣ１生菌の投与は損傷した腸組織病理を改善させることを確認した。
【0166】
実施例６：Ａｃｕｔｅ ＤＳＳ－ｃｏｌｉｔｉｓを有する動物モデルに対する治療効能評価
６－１：モデル動物の製造および試料投与
雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（約６週齢）を供給業者から受けて、順応期間（約７日）を経て実験を進行させた。順応期間の後に、試験物質投与開始３週目に７日間、正常対照群は正常な飲水を供給し、正常対照群を除いたすべての群は３％ＤＳＳを飲水瓶に入れて自由給水して大腸炎を誘発した。雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢）を６日間の順化期間を経て、１群あたり６匹（７週齢）で本実験を進行させた。試験動物は計４群で進行させ、群の構成は次の通りである。
６－１：モデル動物の製造および試料投与
雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（約６週齢）を供給業者から受けて、順応期間（約７日）を経て実験を進行させた。順応期間の後に、試験物質投与開始３週目に７日間、正常対照群は正常な飲水を供給し、正常対照群を除いたすべての群は３％ＤＳＳを飲水瓶に入れて自由給水して大腸炎を誘発した。雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢）を６日間の順化期間を経て、１群あたり６匹（７週齢）で本実験を進行させた。試験動物は計４群で進行させ、群の構成は次の通りである。
【表18】
【0167】
対照群は正常対照群（Ｇ１）、陰性対照群（Ｇ２）および陽性対照群（Ｇ３）に、治療群（試験物質投与群４）は生菌群Ｇ６にそれぞれ設定した。Ｇ１およびＧ２は試験開始日から賦形剤の１５％ｇｌｙｃｅｒｏｌを投与し、Ｇ３はＳａｌｉｃｙｌａｚｏｓｕｌｆａｐｙｒｉｄｉｎｅ（ＳＡＳＰ）を２００ｍｇ／ｋｇ投与した。試験物質投与群Ｇ６は、生菌群としてＤＳＳで大腸炎を誘発した時点から１０日間１日１回投与して、ＣＬＣＣ１の治療効果をみようとした。大腸炎は試験物質投与開始３週目に７日間３％ＤＳＳを飲水瓶に入れて自由給水して誘発した。
【0168】
前記実施例５と実質的に同様の方法で、体重減少評価、疾病活性指数（Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ、ＤＡＩ）、大腸の長さを測定し、大腸組織の組織病理学的検査を行った。
【0169】
６－２：体重減少評価
前記実施例５と実質的に同様の方法で、体重は投与開始日から試験終了日まで２回／週の間隔で測定し、各投与日の投与前に測定した。３％ＤＳＳ給水前に測定された体重を基準として体重の変化を百分率で計算し、その結果を図８に示す。
ＤＳＳを給水した場合、６日後からすべての群（Ｇ２～Ｇ７）で給水前に比べて体重が減少し始めて試験終了日まで減少率が増加する傾向が現れた。体重減少は炎症性腸疾患の重要かつ潜在的に危険な副作用である。Ｇ２に比べて、Ｇ６群において体重減少率が統計的に有意に減少した。（＊ｐ＜０．０５ ａｎｄ ＊＊ｐ＜０．０１、Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔ－ｔｅｓｔ）したがって、ＣＬＣＣ１生菌の投与は大腸炎による体重減少を改善させることが確認された。
前記実施例５と実質的に同様の方法で、体重は投与開始日から試験終了日まで２回／週の間隔で測定し、各投与日の投与前に測定した。３％ＤＳＳ給水前に測定された体重を基準として体重の変化を百分率で計算し、その結果を図８に示す。
ＤＳＳを給水した場合、６日後からすべての群（Ｇ２～Ｇ７）で給水前に比べて体重が減少し始めて試験終了日まで減少率が増加する傾向が現れた。体重減少は炎症性腸疾患の重要かつ潜在的に危険な副作用である。Ｇ２に比べて、Ｇ６群において体重減少率が統計的に有意に減少した。（＊ｐ＜０．０５ ａｎｄ ＊＊ｐ＜０．０１、Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔ－ｔｅｓｔ）したがって、ＣＬＣＣ１生菌の投与は大腸炎による体重減少を改善させることが確認された。
【0170】
６－３：ＤＡＩ（ｄｉｓｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）
前記実施例５と実質的に同様の方法で、ＤＡＩは点数を付与し、前記評価結果を図９に示す。Ｇ６はＤＳＳ投与後にＤＡＩ点数が増加したが、試験終了時点ではＧ２に比べて低い点数を示した。試験終了時点でＧ６の平均点数は６．２点で、Ｇ２に比べて統計学的に有意に低かった。（＊ｐ＜０．０５ ａｎｄ ＊＊ｐ＜０．０１、Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔ－ｔｅｓｔ）
したがって、ＣＬＣＣ１生菌の投与でＧ２に比べてＤＡＩ点数が統計的に有意に減少することを確認し、これは体重、便の状態および糞便内の血液の有無のような症状が改善されたことを意味した。
前記実施例５と実質的に同様の方法で、ＤＡＩは点数を付与し、前記評価結果を図９に示す。Ｇ６はＤＳＳ投与後にＤＡＩ点数が増加したが、試験終了時点ではＧ２に比べて低い点数を示した。試験終了時点でＧ６の平均点数は６．２点で、Ｇ２に比べて統計学的に有意に低かった。（＊ｐ＜０．０５ ａｎｄ ＊＊ｐ＜０．０１、Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔ－ｔｅｓｔ）
したがって、ＣＬＣＣ１生菌の投与でＧ２に比べてＤＡＩ点数が統計的に有意に減少することを確認し、これは体重、便の状態および糞便内の血液の有無のような症状が改善されたことを意味した。
【0171】
６－４：大腸の長さ測定
前記実施例５と実質的に同様の方法で、実験動物の大腸組織を摘出し、摘出した大腸は写真撮影をし、長さを測定した。前記測定された結果を図１０に示す。ＤＳＳで大腸炎を誘発すれば、大腸の長さが減少する。
前記実施例５と実質的に同様の方法で、実験動物の大腸組織を摘出し、摘出した大腸は写真撮影をし、長さを測定した。前記測定された結果を図１０に示す。ＤＳＳで大腸炎を誘発すれば、大腸の長さが減少する。
【0172】
Ｇ２の大腸の長さはＧ１に比べて統計学的に有意に減少した。（††ｐ＜０．０１、Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔ－ｔｅｓｔ）生菌投与群Ｇ６の大腸長さはＧ２に比べて統計学的に有意に少なく減少した。（＊ｐ＜０．０５、Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔ－ｔｅｓｔ）これは生菌投与群がＧ２に比べて大腸の萎縮を阻害して大腸の長さが減少するのを防止または改善することを意味した。
【0173】
したがって、ＣＬＣＣ１生菌の投与は結腸の萎縮を阻害して大腸の長さが減少するのを改善することが確認された。
【0174】
６－５：Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ分析
前記実施例５と実質的に同様の方法で、大腸からＲＮＡを抽出して、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γの遺伝子発現をＲＴ－ｑＰＣＲにより分析した。前記測定された結果を図１１Ａ～図１１Ｃに示す。
前記実施例５と実質的に同様の方法で、大腸からＲＮＡを抽出して、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γの遺伝子発現をＲＴ－ｑＰＣＲにより分析した。前記測定された結果を図１１Ａ～図１１Ｃに示す。
【0175】
ＤＳＳで大腸炎誘発時、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１７、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－２５、ＩＬ－３３、ＩＬ－８、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－３α、ＣＸＣＬ１およびＩＬ－２３など）は発現が増加し、抗炎症性サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＦＮ－α、ＴＧＦ－βなど）は発現が減少する。このうち、本実験では、炎症性サイトカインとしてＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、およびＴＮＦ－αの発現レベルを測定した。
【0176】
生菌投与群（Ｇ６）でいずれも陰性対照群（Ｇ２）に比べてＩＦＮ－γ、およびＩＬ－６のレベルが統計的に有意に低かった。ＴＮＦ－αのレベルはＣＬＣＣ１高濃度生菌投与群（Ｇ６）でＧ２に比べて統計的に有意に低かった。（＊ｐ＜０．０５、Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔ－ｔｅｓｔ）したがって、ＣＬＣＣ１生菌の投与はＩＦＮ－γ、ＩＬ－６およびＴＮＦ－αのような炎症性サイトカインのレベルを低くすることが確認された。
【0177】
６－６：組織病理学的検査
前記実施例５と実質的に同様の方法で、摘出して固定させた大腸組織の切片を顕微鏡（ＣＫＸ４１、Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｊａｐａｎ）で観察し、写真撮影を実施した。
前記実施例５と実質的に同様の方法で、摘出して固定させた大腸組織の切片を顕微鏡（ＣＫＸ４１、Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｊａｐａｎ）で観察し、写真撮影を実施した。
【0178】
前記試験群Ｇ２の大腸粘膜はｃｒｙｐｔ構造が喪失しながら粘液を分泌するｇｏｂｌｅｔ細胞が消失し、全層炎症（ｔｒａｎｓｍｕｒａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）が発生した。組織内の赤血球と白血球が多量観察された。Ｇ６においてｃｒｙｐt構造が維持され、炎症が減少することが観察された。前記観察された結果を図１２に示す。したがって、ＣＬＣＣ１生菌の投与は損傷した腸組織病理を改善させることを確認した。
【0179】
実施例７：炎症性サイトカインの減少評価（ＨＴ－２９およびＲＡＷ ２６４．７）
７－１：ＨＴ－２９およびＲＡＷ ２６４．７細胞株の培養
ＨＴ－２９（韓国細胞株銀行、ＫＣＬＢ ３００３８）とＲＡＷ ２６４．７（韓国細胞株銀行、ＫＣＬＢ ４００７１）細胞は３７℃、５％のＣＯ２条件下で１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（１００μｇ／ｍＬ）、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、２～３日に１回ずつ継代培養を進行させた。
７－１：ＨＴ－２９およびＲＡＷ ２６４．７細胞株の培養
ＨＴ－２９（韓国細胞株銀行、ＫＣＬＢ ３００３８）とＲＡＷ ２６４．７（韓国細胞株銀行、ＫＣＬＢ ４００７１）細胞は３７℃、５％のＣＯ２条件下で１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（１００μｇ／ｍＬ）、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、２～３日に１回ずつ継代培養を進行させた。
【0180】
７－２：菌株の培養および回収
本実験に使用されたＦ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ Ａ２－１６５はＤＳＭＺ（ＤＳＭＺ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）（ＤＳＭ Ｎ°１７６７７）から入手した。
本実験に使用されたＦ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ Ａ２－１６５はＤＳＭＺ（ＤＳＭＺ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）（ＤＳＭ Ｎ°１７６７７）から入手した。
【0181】
使用されたＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物のＦ．ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１およびＦ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ Ａ２－１６５は絶対嫌気性菌株で、すべての培養過程は嫌気チャンバで進行させ、ｍＲＣＭのｍｅｄｉａで培養し、１８～２３時間間隔で計２回の継代培養（Ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）により活性化させた後、実験に用いた。得られた培養液を３２００×ｇ、５ｍｉｎの条件で遠心分離した後、沈殿物を除いた上澄液を回収して、実施例７および実施例８の実験に用いた。
【0182】
７－３：ＨＴ－２９細胞におけるＩＬ－８に対する効能評価
ＨＴ－２９細胞を用いた免疫調節特性評価（Ｉｍｍｕｎｏ－Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｕｓｉｎｇ ＨＴ－２９ Ｃｅｌｌｓ）を行った（ＥＬＩＳＡ）。
ＨＴ－２９細胞を用いた免疫調節特性評価（Ｉｍｍｕｎｏ－Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｕｓｉｎｇ ＨＴ－２９ Ｃｅｌｌｓ）を行った（ＥＬＩＳＡ）。
【0183】
具体的には、ヒト大腸上皮細胞のＨＴ－２９を用いて２４－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに５×１０＾４Ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつｃｕｌｔｕｒｅした後、ＣＬＣＣ１およびＡ２－１６５の上澄液とｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅする１日前に、ＲＰＭＩ１６４０に１０％ＦＢＳが含まれている培地に入れ替える。Ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ当日に、ＲＰＭＩ１６４０（＋１０％ＦＢＳ）培地にＣＬＣＣ１およびＡ２－１６５上澄液またはｍＲＣＭのｍｅｄｉａを１０％となるように入れる。３７℃、５％ＣＯ２ ｉｎｃｕｂａｔｏｒで６時間ＴＮＦ－α（５～１０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＮＪ）を処理した後、ｃｕｌｔｕｒｅを行った。すべてのサンプルは３繰り返しを行った。Ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ後に培養上澄液を収集し、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－８（ＩＬ－８）をＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）により測定した。結果はｐｇ／ｍｌで表現され、ｍＲＣＭのｍｅｄｉａのみ処理したものをｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌにＩＬ－８基準値として用いてｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎした。
【0184】
前記ＥＬＩＳＡで分析したＨＴ－２９細胞におけるヒトＩＬ－８の分泌量を図１３に示す。この検査によりＦ．ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１およびＦ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ Ａ２－１６５上澄液がＨＴ－２９ ｃｅｌｌでｍＲＣＭのｍｅｄｉａのみ処理した対照群と比較する時、統計的に有意にＩＬ－８が減少することを確認できた。
【0185】
これはＦ．ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１がＴＮＦ－αによって増加した炎症反応を減少させられることを示し、また、ＩＬ－８によって誘導されうるＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌによる腸粘膜の浸潤および炎症媒介物質の分泌を抑制することによって、炎症性腸疾患の治療剤として活用可能であることを意味する（図１３）。
【0186】
７－４：ＲＡＷ ２６４．７細胞におけるＩＬ－６およびＴＮＦ－αに対する効能評価
ＲＡＷ ２６４．７細胞を用いた免疫調節特性評価（Ｉｍｍｕｎｏ－Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｕｓｉｎｇ ＲＡＷ ２６４．７）を行った。（ＥＬＩＳＡ）
ＲＡＷ ２６４．７細胞を用いた免疫調節特性評価（Ｉｍｍｕｎｏ－Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｕｓｉｎｇ ＲＡＷ ２６４．７）を行った。（ＥＬＩＳＡ）
【0187】
具体的には、マウス大食細胞由来細胞株のＲＡＷ ２６４．７を用いて、２４－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに５×１０＾４ Ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつｃｕｌｔｕｒｅした後、Ｆ．ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣおよびＡ２－１６５の上澄液とｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅする１日前に、ＲＰＭＩ１６４０に１０％ＦＢＳが含まれている培地に入れ替える。Ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ当日に、ＲＰＭＩ１６４０（＋１０％ＦＢＳ）培地にＣＬＣＣ１およびＡ２－１６５上澄液またはｍＲＣＭのｍｅｄｉａを１０％となるように入れる。３７℃、５％ＣＯ２ ｉｎｃｕｂａｔｏｒで６時間ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ、Ｌ４３９１）を処理した後、ｃｕｌｔｕｒｅを行った。すべてのサンプルは３繰り返しを行った。Ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ後に培養上澄液を収集し、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６（ＩＬ－６）およびＴＮＦ－αをＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）により測定した。結果はｐｇ／ｍｌで表現され、ｍＲＣＭのｍｅｄｉａのみ処理したものをｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌにＩＬ－６およびＴＮＦ－α基準値として用いてｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎした。
【0188】
前記ＥＬＩＳＡで分析したＲＡＷ ２６４．７細胞におけるマウスＩＬ－６およびＴＮＦ－αの分泌量を図１４および図１５に示す。この検査によりＦ．ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１およびＦ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ Ａ２－１６５上澄液がＲＡＷ ２６４．７ ｃｅｌｌでｍＲＣＭのｍｅｄｉａのみ処理した対照群と比較する時、統計的に有意にＩＬ－６およびＴＮＦ－αが減少することを確認できた。
【0189】
これはＣＬＣＣ１がＬＰＳによって増加した炎症反応が減少できることを示し、ＩＬ－６によって誘導されうるＴｈ１７細胞分化によるＲＯＲγＴやＩＬ－１７の分泌を抑制することによって、炎症の改善を期待することができ、また、ＴＮＦ－αでは様々な免疫細胞の調節により炎症関連ｃｙｔｏｋｉｎｅの発現に関与することによって、炎症性腸疾患の治療剤として活用可能であることを意味した（図１４および１５）。
【0190】
実施例８：炎症性サイトカインの抑制活性評価（ＨＰＢＭＣ）
８－１：ＨＰＢＭＣ Ｃｕｌｔｕｒｅ
ＨＰＢＭＣ（Ｌｏｎｚａ、４Ｗ－２７０）は３７℃、５％のＣＯ２条件下で１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）を添加したＬＧＭ－３ＴＭ（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ－３２１１）培地でＣｕｌｔｕｒｅして実験を進行させた。
８－１：ＨＰＢＭＣ Ｃｕｌｔｕｒｅ
ＨＰＢＭＣ（Ｌｏｎｚａ、４Ｗ－２７０）は３７℃、５％のＣＯ２条件下で１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）を添加したＬＧＭ－３ＴＭ（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ－３２１１）培地でＣｕｌｔｕｒｅして実験を進行させた。
【0191】
８－２：ＨＰＢＭＣにおけるヒトＩＬ－１０に対する効能評価
ＨＰＢＭＣを用いた免疫調節特性評価（Ｉｍｍｕｎｏ－Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｕｓｉｎｇ ＨＰＢＭＣ）を行った。
ＨＰＢＭＣを用いた免疫調節特性評価（Ｉｍｍｕｎｏ－Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｕｓｉｎｇ ＨＰＢＭＣ）を行った。
【0192】
具体的には、ヒト末梢血液単核細胞（Ｈｕｍａｎ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌｓ、ＨＰＢＭＣ）を１２－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１×１０６Ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつｃｕｌｔｕｒｅした後、ＣＬＣＣ１とＡ２－１６５の上澄液およびＰＢＳを１０％となるように入れた。３７℃、５％ＣＯ２ ｉｎｃｕｂａｔｏｒで２４時間反応後にｃｕｌｔｕｒｅを行った。すべてのサンプルは３繰り返しを行った。Ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅの後に培養上澄液を収集し、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１０（ＩＬ－１０）をＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）により測定した。結果はｐｇ／ｍｌで表現され、ＰＢＳのみ処理したものをｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌにＩＬ－１０基準値として用いてｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎした。
【0193】
前記分析したＨＰＢＭＣにおけるヒトＩＬ－１０に対する効能結果を図１６に示す。この検査によりＦ．ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１とＦ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ Ａ２－１６５上澄液をＨＰＢＭＣでＰＢＳのみ処理した対照群と比較して、統計的にＣＬＣＣ１上澄液が有意にＩＬ－１０が増加することを確認できた。
【0194】
これはＦ．ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１がヒト末梢血液単核細胞における抗炎症関ｃｙｔｏｋｉｎｅのうちＩＬ－１０の発現に関与することによって、抗炎症作用が可能であることを意味し、これは炎症性腸疾患の治療剤として活用可能であることを意味する（図１６）。
【0195】
８－３：ＨＰＢＭＣにおけるＩＬ－６に対する効能評価
ＨＰＢＭＣを用いた免疫調節特性評価（Ｉｍｍｕｎｏ－Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｕｓｉｎｇ ＨＰＢＭＣ）を行った。
ＨＰＢＭＣを用いた免疫調節特性評価（Ｉｍｍｕｎｏ－Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｕｓｉｎｇ ＨＰＢＭＣ）を行った。
【0196】
具体的には、ヒト末梢血液単核細胞（Ｈｕｍａｎ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌｓ、ＨＰＢＭＣ）を２４－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１×１０５Ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつｃｕｌｔｕｒｅした後、ＣＬＣＣ１上澄液およびＰＢＳを１０％となるように入れる。３７℃、５％ＣＯ２ ｉｎｃｕｂａｔｏｒで６時間ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ、Ｌ４３９１）を処理した後、ｃｕｌｔｕｒｅを行った。すべてのサンプルは３繰り返しを行った。Ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅの後に培養上澄液を収集し、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６（ＩＬ－６）をＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）により測定した。結果はｐｇ／ｍｌで表現され、ＰＢＳのみ処理したものをｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌにＩＬ－６基準値として用いてｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎした。
【0197】
前記分析したＨＰＢＭＣにおけるヒトＩＬ－６に対する効能結果を図１７に示す。この検査によりＦ．ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１上澄液がＨＰＢＭＣでＰＢＳのみ処理した対照群と比較して、統計的に有意にＩＬ－６が減少することを確認できた。
【0198】
これはＦ．ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣ１がヒト末梢血液単核細胞における炎症関連ｃｙｔｏｋｉｎｅのうちＩＬ－６の発現に関与することによって、炎症反応を抑制できることを意味し、これは炎症性腸疾患の治療剤として活用可能であることを意味した（図１７）。
【0199】
実施例９：ＰＣＲを用いた微生物検出
９－１：試料およびプライマーの用意
前記菌株ゲノムＤＮＡはＤＮＡ ｐｒｅｐ ｋｉｔ（例．ＭＯ ＢＩＯ’ｓ ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて用意した。
９－１：試料およびプライマーの用意
前記菌株ゲノムＤＮＡはＤＮＡ ｐｒｅｐ ｋｉｔ（例．ＭＯ ＢＩＯ’ｓ ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて用意した。
【0200】
ｂｌａｓｔｎプログラムを用いた分析により、Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ｄａｍ）が他の微生物では検索されず、Ｆ．ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣＬに特異的であることを確認した。より容易かつ迅速正確にリアルタイムにＦ．ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣＬの特異的検出確認のために、前記ｄａｍ遺伝子配列に基づいて、正方向および逆方向プライマーから構成されたプライマー対を用いて試料にリアルタイム（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ）ＰＣＲ増幅反応を実施した。
【0201】
９－２：カーブ値（Ｃｔ値）を用いた検出
リアルタイム（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ）ＰＣＲ増幅反応はＢｉｏ－ｒａｄ社のＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲシステム（ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を用いて実施し、リアルタイムＰＣＲ増幅反応はＳＹＢＲ ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（２ｘ）（ＴＡＫＡＲＡ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｊａｐａｎ）と前記プライマーをそれぞれ１０ｐＭを含有するリアルタイム（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ）ＰＣＲ混合液で計２０μｌの量で行った。リアルタイムＰＣＲ混合液に添加した菌株のゲノムＤＮＡの量は約２５ｎｇであった。リアルタイム（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ）ＰＣＲ増幅反応は９５℃で３０秒間変性し、９５℃で５秒、６０℃で３０秒で４０回（４０ｃｙｃｌｅｓ）繰り返した後、９５℃で１５秒間反応した。以後、融解曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）と融解ピーク（ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｅａｋ）を導出するために、６５～９５℃まで５秒ごとに０．５℃ずつ増加させた。サイクルの数による相対的蛍光（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｕｉｎｔｓ；ＲＦＵ）を測定した。
リアルタイム（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ）ＰＣＲ増幅反応はＢｉｏ－ｒａｄ社のＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲシステム（ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を用いて実施し、リアルタイムＰＣＲ増幅反応はＳＹＢＲ ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（２ｘ）（ＴＡＫＡＲＡ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｊａｐａｎ）と前記プライマーをそれぞれ１０ｐＭを含有するリアルタイム（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ）ＰＣＲ混合液で計２０μｌの量で行った。リアルタイムＰＣＲ混合液に添加した菌株のゲノムＤＮＡの量は約２５ｎｇであった。リアルタイム（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ）ＰＣＲ増幅反応は９５℃で３０秒間変性し、９５℃で５秒、６０℃で３０秒で４０回（４０ｃｙｃｌｅｓ）繰り返した後、９５℃で１５秒間反応した。以後、融解曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）と融解ピーク（ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｅａｋ）を導出するために、６５～９５℃まで５秒ごとに０．５℃ずつ増加させた。サイクルの数による相対的蛍光（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｕｉｎｔｓ；ＲＦＵ）を測定した。
【0202】
Ｆ．ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣＬ ＤＮＡを含む試料でのみ特異的にカーブ値（Ｃｔ値）が確認され、前記結果から本発明のプライマーセットおよびプローブはＦ．ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓを特異的に検出できることが分かった。
【0203】
９－３：定量分析
Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ｄａｍ）遺伝子を活用してフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスの量を、すでに量を測定済みの物質（例．プラスミド、ｏｒｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）を用いて、ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅをとった後、これを活用して濃度を測定した。
Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ｄａｍ）遺伝子を活用してフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスの量を、すでに量を測定済みの物質（例．プラスミド、ｏｒｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）を用いて、ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅをとった後、これを活用して濃度を測定した。
【0204】
全体バクテリアの量は１６Ｓ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒを用いて糞便試料の全体微生物のゲノムを抽出した後、これを同様に、すでに量を測定済みの物質（例、プラスミド、ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）を用いて、ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅをとった後、これを活用して濃度を測定した。
【0205】
相対定量のために、前記計算したＦ．ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣＬの量を全体バクテリアの量で割った値を用いた。
【0206】
実施例１０：メタゲノム分析を用いた微生物検出
分析に用いられたデータは大便の微生物に対してショットガンメタゲノム塩基配列分析法を行って得られたデータとして分析に用いられたデータのうち、Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ＣａｎｃｅｒおよびＣｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ集団に比べて、健康群（Ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎｔｒｏｌのうちＳａｍｐｌｅＩｄがＥＲＲで始まるデータ）の場合、論文で発表された（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｕｔ．ｂｍｊ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／６６／１／７０）公開データのダウンロードを受け、その他の潰瘍性大腸炎、クローン病および健康群データは共同研究により自体収集した大便微生物のショットガンメタゲノム塩基配列データを用いた。
分析に用いられたデータは大便の微生物に対してショットガンメタゲノム塩基配列分析法を行って得られたデータとして分析に用いられたデータのうち、Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ＣａｎｃｅｒおよびＣｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ集団に比べて、健康群（Ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎｔｒｏｌのうちＳａｍｐｌｅＩｄがＥＲＲで始まるデータ）の場合、論文で発表された（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｕｔ．ｂｍｊ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／６６／１／７０）公開データのダウンロードを受け、その他の潰瘍性大腸炎、クローン病および健康群データは共同研究により自体収集した大便微生物のショットガンメタゲノム塩基配列データを用いた。
【0207】
それぞれの試料データはショットガンメタゲノムデータを用いて種レベルで微生物の種に対する豊富度を計算するコア遺伝子に対するＫ－ｍｅｒ完全一致方法（韓国特許公開公報１０－２０２０－００２７９００）で分析して、試料中の微生物種の豊富度に対するプロファイルを得た。Ｆ．ｃａｎｃｅｒｉｎｈｉｂｅｎｓ ＣＬＣＣＬ菌株の豊富度分析のために、まず、種レベルで既存の遺伝体と区別されることを確認するために、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ ＡＴＣＣ ２７７６８の遺伝体とＡＮＩ（Ａｖｅｒａｇｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）分析を行って、種レベルの基準類似度である９５に比べて明確に低い８５．７４の数値で新種であることを確認して、参照微生物遺伝体データベースに追加した。
【0208】
各試料に対してフィーカリバクテリウムキャンサーインヒベンスＣＬＣＣ１の遺伝体が含まれている前記参照データベースを用いてそれぞれの疾病群と健康群における分布を比較した。前記実験結果を下記表１９と図１８に示した。
【表19】
【0209】
本発明によるＣＬＣＣ１菌株は、健康群と潰瘍性大腸炎群、健康群とクローン病群との間で有意に差がある結果を示し、これは腸内微生物として常在しながら分布量の差で疾病群を区分できることを示す。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】