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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-11
(45)【発行日】2024-10-22
(54)【発明の名称】医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 38/08 20190101AFI20241015BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241015BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20241015BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20241015BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241015BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20241015BHJP
C07K 7/06 20060101ALN20241015BHJP
【ＦＩ】
A61K38/08
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61P9/00
A61P9/10
A61P43/00 111
C07K14/47 ZNA
C07K7/06
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2021114809
(22)【出願日】2021-07-12
(65)【公開番号】P2023011148
(43)【公開日】2023-01-24
【審査請求日】2023-08-30
(73)【特許権者】
【識別番号】504209655
【氏名又は名称】国立大学法人佐賀大学
(74)【代理人】
【識別番号】100099634
【弁理士】
【氏名又は名称】平井 安雄
(72)【発明者】
【氏名】野出 孝一
(72)【発明者】
【氏名】白木 綾
(72)【発明者】
【氏名】木塚 貴浩
(72)【発明者】
【氏名】中神 啓徳
【審査官】岡部 佐知子
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１６／０００８３４２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２００５－５０８６１９（ＪＰ，Ａ）
【文献】Cui Y. et al.，Heavy chin single domain antibodies to detect native human soluble epoxide hydrolase.，Analytical and Bioanalytical Chemistry，2015年09月，407, 24，7275-7283
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ ７／０６
Ｃ０７Ｋ １４／４７
Ａ６１Ｐ ９／００－９／１４
Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／３８
Ａ６１Ｋ ３９／００－３９／４４
Ａ６１Ｐ ４３／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
可溶性エポキシドヒドロラーゼを阻害する抗体産生能を有し、ヒトｓＥＨのＮ末端アミノ酸を１位として、１２７位ないし１３５位のアミノ酸配列ＬＤＤＲＡＥＲＤＧ又は２９８位ないし３０７位のアミノ酸配列ＥＳＳＡＰＰＥＩＥＥからなるペプチドを含むことを特徴とする循環器病の予防及び／又は治療用医薬組成物。
【請求項2】
可溶性エポキシドヒドロラーゼを阻害する抗体産生能を有し、マウスｓＥＨのＮ末端アミノ酸を１位として、１２７位ないし１３５位のアミノ酸配列ＬＤＤＧＤＫＲＤＳ又は２９８位ないし３０７位のアミノ酸配列ＤＳＳＳＰＰＥＩＥＥからなるペプチドを含むことを特徴とする循環器病の予防及び／又は治療用医薬組成物。
【請求項3】
請求項１又は２に記載の医薬組成物において、前記循環器病が、心筋梗塞であることを特徴とする医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ｓＥＨを阻害し、ＥＥＴｓ／ＤＨＥＴｓ比を増加させて循環器病を予防及び／又は治療するためのペプチド及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
循環器疾患、例えば、心血管疾患は、経皮的冠動脈形成術、予防医学、及び慢性的な心筋梗塞後における最良の医学的治療を含む様々な治療法が開発されているにもかかわらず、依然として世界的に主要な死亡原因となっている。このうち、経皮的冠動脈形成術は心筋梗塞による死亡率を劇的に改善したが、心筋梗塞に関連する心不全患者数は、心筋梗塞の生存者が上昇するにつれて増加している。
すなわち、心不全を発症しない慢性期の心室リモデリングを抑制するためには、心筋梗塞による心筋障害の程度を最小限にすることが重要である。
すなわち、心不全を発症しない慢性期の心室リモデリングを抑制するためには、心筋梗塞による心筋障害の程度を最小限にすることが重要である。
【0003】
このような状況下において、近年、心臓保護剤としてエポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴｓ）が注目されている。ＥＥＴｓは、アラキドン酸のシトクロムＰ４５０エポキシゲナーゼ代謝物であり、強力な抗炎症、血管拡張、線維素溶解、抗アポトーシス、血管新生を促進することが知られている。
例えば、非特許文献１において、ＥＥＴｓは、心筋虚血モデルにおける虚血サイズ／リスク領域の減少効果を示すことが報告されている。
例えば、非特許文献１において、ＥＥＴｓは、心筋虚血モデルにおける虚血サイズ／リスク領域の減少効果を示すことが報告されている。
【0004】
ところが、ＥＥＴｓは、可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）によって非常に速くジヒドロキシエイコサトリエン酸（ＤＨＥＴｓ）へと代謝されてしまう。そこで、ｓＥＨを阻害することによって、ＥＥＴｓ活性を高めようとする試みがなされている。
例えば、マウスを用いたｅｘ－ｖｉｖｏ試験では、ＰＩ３Ｋ経路が関与する虚血再潅流障害に対するＥＥＴｓ及び／又はｓＥＨ阻害の有意な心筋保護作用が実証されている（非特許文献２及び３）。
また、ｓＥＨ阻害は、心筋梗塞後の心機能や心室リモデリングに有益な効果を発揮し、心細胞の線維化や肥大にも直接的な効果を発揮した。
例えば、マウスを用いたｅｘ－ｖｉｖｏ試験では、ＰＩ３Ｋ経路が関与する虚血再潅流障害に対するＥＥＴｓ及び／又はｓＥＨ阻害の有意な心筋保護作用が実証されている（非特許文献２及び３）。
また、ｓＥＨ阻害は、心筋梗塞後の心機能や心室リモデリングに有益な効果を発揮し、心細胞の線維化や肥大にも直接的な効果を発揮した。
【0005】
さらに、ｓＥＨ阻害剤は、マウスのＴＡＣ（大動脈縮窄）モデルにおいて、ＮＦ－κＢ活性化を阻止し、心肥大を減少させるといった報告もなされている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】Ｇｒｏｓｓ ＧＪ、Ｇａｕｔｈｉｅｒ ＫＭ、Ｍｏｏｒｅ Ｊ、Ｆａｌｃｋ ＪＲ、Ｈａｍｍｏｃｋ ＢＤ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＷＢ、ｅｔ ａｌ．、Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＥＥＴ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ，１４，１５－ＥＥＺＥ，ｏｎ ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｏｒ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＥＥＴｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｎｉｎｅ ｈｅａｒｔ、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２００８、２９４（６）、Ｈ２８３８－４４
【文献】Ｋｏｍｐａ ＡＲ、Ｗａｎｇ ＢＨ、Ｘｕ Ｇ、Ｚｈａｎｇ Ｙ、Ｈｏ ＰＹ、Ｅｉｓｅｎｎａｇｅｌ Ｓ、ｅｔ ａｌ．、Ｓｏｌｕｂｌｅ ｅｐｏｘｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｅｘｅｒｔｓ ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉ－ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｃｔｉｏｎｓ ｐｏｓｔ－ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ、２０１３、１６７（１）、２１０－９
【文献】Ｓｅｕｂｅｒｔ ＪＭ、Ｓｉｎａｌ ＣＪ、Ｇｒａｖｅｓ Ｊ、ＤｅＧｒａｆｆ ＬＭ、Ｂｒａｄｂｕｒｙ ＪＡ、Ｌｅｅ ＣＲ、ｅｔ ａｌ．、Ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｅｐｏｘｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｉｎ ｐｏｓｔｉｓｃｈｅｍｉｃ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｈｅａｒｔ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６、９９（４）、４４２－５０
【文献】Ｘｕ Ｄ、Ｌｉ Ｎ、Ｈｅ Ｙ、Ｔｉｍｏｆｅｙｅｖ Ｖ、Ｌｕ Ｌ、Ｔｓａｉ ＨＪ、ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ ｂｙ ｓｏｌｕｂｌｅ ｅｐｏｘｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ、２００６、１０３（４９）、１８７３３－８
【文献】Ｙａｎｇ Ｌ、Ｃｈｅｒｉｙａｎ Ｊ、Ｇｕｔｔｅｒｍａｎ ＤＤ、Ｍａｙｅｒ ＲＪ、Ａｍｅｎｔ Ｚ、Ｇｒｉｆｆｉｎ ＪＬ、ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ＣＯＰＤ ａｎｄ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｅｐｏｘｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ Ｓｍｏｋｅｒｓ、Ｃｈｅｓｔ、２０１７、１５１（３）、５５５－６３
【文献】Ｍｏｒｇａｎ ＬＡ、Ｏｌｚｉｎｓｋｉ ＡＲ、Ｕｐｓｏｎ ＪＪ、Ｚｈａｏ Ｓ、Ｗａｎｇ Ｔ、Ｅｉｓｅｎｎａｇｅｌ ＳＨ、ｅｔ ａｌ．Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｅｐｏｘｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｄｏｅｓ Ｎｏｔ Ｐｒｅｖｅｎｔ Ｃａｒｄｉａｃ Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ Ａｆｔｅｒ Ａｏｒｔｉｃ Ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｒａｔｓ ａｎｄ Ｍｉｃｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２０１３、６１（４）、２９１－３０１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
しかし、現状として、ヒトに対して臨床的に承認されたｓＥＨ阻害薬はない。低代謝安定性、高融点、限定的な水や有機溶媒に対する溶解度などの理由から、薬理的に使用することが困難であった。
【0008】
最近では、新規ｓＥＨ阻害薬として、ＧＳＫ２２５６２９４０が病理学的に有効であることが証明され、内皮血管拡張機能の増大が示された（非特許文献５）が、その心保護効果は比較的低く、ＴＡＣモデルにおいて心肥大を軽減する選択性が低いことが示されている（非特許文献６）。
【0009】
本発明は、上記課題を解消するためになされたものであり、ｓＥＨを阻害し、ＥＥＴｓ／ＤＨＥＴｓ比を増加させて循環器病を予防及び／又は治療するためのペプチド及び医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明に係るペプチドは、可溶性エポキシドヒドロラーゼを阻害する抗体産生能を有する。
【0011】
また、本発明に係る医薬組成物は、上記ペプチドを含む循環器病の予防及び／又は治療用医薬組成物である。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】実施例１におけるｓＥＨペプチドワクチン接種後のマウスの抗体価を示すグラフである。
【図2】実施例１におけるｓＥＨペプチドワクチン接種後のラットの抗体価を示すグラフである。
【図3】実施例２における生理食塩水群及びｓＥＨペプチドワクチン群の１４，１５－ＥＥＴ－ｄ１１／１４，１５－ＤＨＥＴ－ｄ１１比を示すグラフである。
【図4】実施例２における生理食塩水群及びｓＥＨペプチドワクチン群の１４，１５－ＥＥＴ－ｄ１１／１４，１５－ＤＨＥＴ－ｄ１１比を示すグラフである。
【図5】実施例３における生理食塩水群及びｓＥＨペプチドワクチン群の心エコー検査結果の一例を示す心エコー画像である。
【図6】実施例３における生理食塩水群及びｓＥＨペプチドワクチン群の心エコー検査結果を示すグラフである。
【図7】実施例４における心筋梗塞後の生理食塩水群及びｓＥＨペプチドワクチン群の短軸断面についての一例を示すアザン染色図である。
【図8】実施例４における心筋梗塞後の生理食塩水群及びｓＥＨペプチドワクチン群の損傷組織の割合を示すグラフである。
【図9】実施例５における心筋梗塞後の生理食塩水群及びｓＥＨペプチドワクチン群のＬＥＣＴＩＮによる免疫蛍光染色図及び血管密度を示すグラフである。
【図10】実施例５における心筋梗塞後の生理食塩水群及びｓＥＨペプチドワクチン群のＣＤ３１による免疫蛍光染色図及び血管数を示すグラフである。
【図11】実施例５における心筋梗塞後の生理食塩水群及びｓＥＨペプチドワクチン群のαＳＭＡによる免疫蛍光染色図及び血管数を示すグラフである。
【図12】実施例６における心筋梗塞後の生理食塩水群及びｓＥＨペプチドワクチン群のウエスタンブロット解析結果の一例を示す写真である。
【図13】実施例６における心筋梗塞後の生理食塩水群及びｓＥＨペプチドワクチン群のウエスタンブロット解析結果を示すグラフである。
【図14】実施例７における生理食塩水群及びｓＥＨペプチドワクチン群のＨＥ染色の一例を示す顕微鏡写真である。
【図15】実施例７における生理食塩水群及びｓＥＨペプチドワクチン群の血圧及び心拍数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
【0014】
本発明に係るペプチドは、可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）を阻害する抗体産生能を有することを特徴とする。すなわち、自身が体内に保有するタンパクに対する抗体をワクチンにより誘導し、薬効を得るものである。
ｓＥＨは、アラキドン酸のシトクロムＰ４５０エポキシゲナーゼ代謝物であるエポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴｓ）をジヒドロキシエイコサトリエン酸（ＤＨＥＴｓ）へと代謝させる酵素であり、ｓＥＨを阻害することができれば、ＥＥＴｓ／ＤＨＥＴｓ比を増大させることとなり、強力な抗炎症、血管拡張、線維素溶解、抗アポトーシス、血管新生を促進して、循環器病の予防及び／又は治療効果を得ることができる。
ｓＥＨは、アラキドン酸のシトクロムＰ４５０エポキシゲナーゼ代謝物であるエポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴｓ）をジヒドロキシエイコサトリエン酸（ＤＨＥＴｓ）へと代謝させる酵素であり、ｓＥＨを阻害することができれば、ＥＥＴｓ／ＤＨＥＴｓ比を増大させることとなり、強力な抗炎症、血管拡張、線維素溶解、抗アポトーシス、血管新生を促進して、循環器病の予防及び／又は治療効果を得ることができる。
【0015】
本発明に係るペプチドのアミノ酸配列は、高抗原性分析（エピトープマッピング）に基づいて予測されるエピトープ情報から適宜選択することが好ましく、より好ましくはｓＥＨのアミノ酸配列のうち、９又は１０連続するアミノ酸配列であり、更に好ましくはヒトｓＥＨのＮ末端アミノ酸を１位として、１２７位ないし１３５位、２９８位ないし３０７位、又は４６２位ないし４７１位のアミノ酸配列、又はマウスｓＥＨのＮ末端アミノ酸を１位として、１２７位ないし１３５位、２９６位ないし３０５位、又は４６１位ないし４７０位のアミノ酸配列であることが好ましい。
【0016】
ヒトｓＥＨにおける１２７位ないし１３５位、２９８位ないし３０７位、又は４６２位ないし４７１位のアミノ酸配列を以下に示す。
【0017】
ＬＤＤＲＡＥＲＤＧ（配列番号１）
ＥＳＳＡＰＰＥＩＥＥ（配列番号２）
ＰＬＮＷＹＲＮＭＥＲ（配列番号３）
ＥＳＳＡＰＰＥＩＥＥ（配列番号２）
ＰＬＮＷＹＲＮＭＥＲ（配列番号３）
【0018】
また、マウスｓＥＨにおける１２７位ないし１３５位、２９６位ないし３０５位、又は４６１位ないし４７０位のアミノ酸配列を以下に示す。
【0019】
ＬＤＤＧＤＫＲＤＳ（配列番号４）
ＤＳＳＳＰＰＥＩＥＥ（配列番号５）
ＰＬＮＷＹＲＮＴＥＲ（配列番号６）
ＤＳＳＳＰＰＥＩＥＥ（配列番号５）
ＰＬＮＷＹＲＮＴＥＲ（配列番号６）
【0020】
本発明に係るペプチドは、免疫原性を増強するために担体タンパク質と複合化又は連結させてもよい。
このような担体としては、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、サイログロブリン（ＴＧ）、免疫グロブリン、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ジフテリア毒素変異体ＣＲＭ１９７、肺炎球菌表面抗原Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌表面抗原Ｃ（ＰｓｐＣ）、肺炎球菌ヒスチジン蛋白Ａ（ＰｈｐＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ）、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）、Ｅ型肝炎ウイルスカプシド蛋白、ＨＩＶ－１エンベロープ糖蛋白、Ｃ型肝炎ウイルスエンベロープ糖蛋白、インフルエンザＭ２蛋白、インフルエンザヘマグルチニン蛋白（ＨＡ）、マラリア原虫スポロゾイト表面蛋白質、結核菌Ａｇ８５複合蛋白、結核菌熱ショック蛋白、結核菌低分子量分泌蛋白、ヒトパピローマウイルスＬ１カプシド蛋白、ヒトパピローマウイルス１６腫瘍性抗原、ナイセリア属ヘパリン結合性抗原（ＮＨＢＡ）、髄膜炎菌H因子結合蛋白（ｆＨｂｐ）、髄膜炎菌表面アドヘシンＡ（ＮａｄＡ）、コレラトキシンＢサブユニット（ＣＴＢ）、無毒変異型易熱性大腸菌毒素（ＬＴＢ）、ボツリヌス毒素重鎖Ｃ末ドメイン（ＢｏＨｃ）、ノロウイルスカプシド蛋白、ロタウイルス抗原などが挙げられ、中でもキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）が好ましい。
このような担体としては、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、サイログロブリン（ＴＧ）、免疫グロブリン、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ジフテリア毒素変異体ＣＲＭ１９７、肺炎球菌表面抗原Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌表面抗原Ｃ（ＰｓｐＣ）、肺炎球菌ヒスチジン蛋白Ａ（ＰｈｐＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ）、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ）、Ｅ型肝炎ウイルスカプシド蛋白、ＨＩＶ－１エンベロープ糖蛋白、Ｃ型肝炎ウイルスエンベロープ糖蛋白、インフルエンザＭ２蛋白、インフルエンザヘマグルチニン蛋白（ＨＡ）、マラリア原虫スポロゾイト表面蛋白質、結核菌Ａｇ８５複合蛋白、結核菌熱ショック蛋白、結核菌低分子量分泌蛋白、ヒトパピローマウイルスＬ１カプシド蛋白、ヒトパピローマウイルス１６腫瘍性抗原、ナイセリア属ヘパリン結合性抗原（ＮＨＢＡ）、髄膜炎菌H因子結合蛋白（ｆＨｂｐ）、髄膜炎菌表面アドヘシンＡ（ＮａｄＡ）、コレラトキシンＢサブユニット（ＣＴＢ）、無毒変異型易熱性大腸菌毒素（ＬＴＢ）、ボツリヌス毒素重鎖Ｃ末ドメイン（ＢｏＨｃ）、ノロウイルスカプシド蛋白、ロタウイルス抗原などが挙げられ、中でもキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）が好ましい。
【0021】
担体タンパク質は、適当なアシル化剤を用いてペプチドに結合させることができる。アシル化剤としては、Ｎ－（６－マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）などのＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いることができる。
ペプチドと担体タンパク質とを結合させる際には、担体タンパク質１モルに対して、ペプチドを５モル以上用いることが好ましい。
ペプチドと担体タンパク質とを結合させる際には、担体タンパク質１モルに対して、ペプチドを５モル以上用いることが好ましい。
【0022】
また、本発明に係る医薬組成物（以下、ｓＥＨワクチンともいう）は、上記ペプチドを含み、循環器病を予防及び／又は治療する。すなわち、上記ペプチドを使用した医薬組成物により生体内に抗体を産生し、当該抗体によってｓＥＨを阻害することによって、抗炎症、血管拡張、線維素溶解、抗アポトーシス、血管新生を促進して、循環器病の予防及び／又は治療効果を得るものである。
医薬組成物は、複数種の上記ペプチドを含んでいてもよい。
医薬組成物は、複数種の上記ペプチドを含んでいてもよい。
【0023】
循環器病としては、特に制限されず、例えば、慢性又は急性心不全、心筋梗塞及び狭心症を含む虚血性心疾患、心臓弁膜症、不整脈、動脈硬化症等が挙げられるが、好ましくは心筋梗塞である。
【0024】
医薬組成物は、細胞性免疫を効率的に確立するためのアジュバントを含んでいてもよい。アジュバントは、免疫学的活性を有する抗原（ペプチド）とともに（又は連続して）投与した場合に、当該抗原に対する免疫応答を増強する化合物である。
このようなアジュバントとしては、例えば、アルミニウム塩（リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、オキシ水酸化アルミニウム等）、ミョウバン、コレラ毒素、サルモネラ毒素、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、ＩＳＣＯＭａｔｒｉｘ、ＧＭ－ＣＳＦその他の免疫刺激性サイトカイン、ＣｐＧモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチド、水中油型エマルション、サポニン又はその誘導体、リピドＡ又はその誘導体等のリポ多糖、リポペプチド、ラクトフェリン、フラジェリン、二本鎖RNA又はその誘導体、バクテリアＤＮＡ、イミダゾキノリン、Ｃ型レクチンリガンド、ＣＤ１ｄリガンド、スクアレンエマルション、ＰＬＧＡなどが挙げられる。アジュバントは、単独で、又は２種以上を混合して用いることもできる。
アジュバントの添加量は、抗原に対する免疫応答を誘導し得る量であれば特に制限されず、アジュバントの種類等に応じて適宜選択される。
このようなアジュバントとしては、例えば、アルミニウム塩（リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、オキシ水酸化アルミニウム等）、ミョウバン、コレラ毒素、サルモネラ毒素、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、ＩＳＣＯＭａｔｒｉｘ、ＧＭ－ＣＳＦその他の免疫刺激性サイトカイン、ＣｐＧモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチド、水中油型エマルション、サポニン又はその誘導体、リピドＡ又はその誘導体等のリポ多糖、リポペプチド、ラクトフェリン、フラジェリン、二本鎖RNA又はその誘導体、バクテリアＤＮＡ、イミダゾキノリン、Ｃ型レクチンリガンド、ＣＤ１ｄリガンド、スクアレンエマルション、ＰＬＧＡなどが挙げられる。アジュバントは、単独で、又は２種以上を混合して用いることもできる。
アジュバントの添加量は、抗原に対する免疫応答を誘導し得る量であれば特に制限されず、アジュバントの種類等に応じて適宜選択される。
【0025】
医薬組成物は、薬理学的に許容され、本発明の効果を阻害しない範囲において、公知のその他成分を含有させることもでき、その他成分としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解剤、溶解補助剤、着色剤、矯味矯臭剤、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤などが挙げられる。
例えば、賦形剤としては、乳糖、白糖、Ｄ－マンニトール、デンプン、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸などが挙げられる。
例えば、賦形剤としては、乳糖、白糖、Ｄ－マンニトール、デンプン、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸などが挙げられる。
【0026】
医薬組成物の剤形としては、例えば、液剤（例えば、注射剤）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤（剤形）などが挙げられる。
医薬組成物は、上記各種成分を用いて、公知の方法により剤形化することができる。
医薬組成物は、上記各種成分を用いて、公知の方法により剤形化することができる。
【0027】
医薬組成物中におけるペプチドの含有量は、特に制限されないが、各種剤形化が可能な範囲内において、投与量との関係で適宜選択される。
【0028】
医薬組成物の対象としては、ヒト及びヒト以外の動物（例えば、イヌやネコ等の愛玩動物、ウシやブタ等の家畜動物、マウスやラット等の実験動物など）である。
【0029】
医薬組成物を、例えば、ヒトに投与する場合の投与量は、症状、患者の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与間隔、有効成分の種類、製剤の種類に応じて、適宜選択される。
【0030】
医薬組成物の投与方法としては、経口投与、又は非経口投与（例えば、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与、眼球注射を含む眼内投与、鼻腔内投与等）が挙げられ、好ましくは非経口投与、より好ましくは皮下投与又は筋肉内投与により投与することができる。
【実施例】
【0031】
以下、実施例を用いて本発明を説明するが、これに限定されるものではない。
下記各種実験は、ＡＲＲＩＶＥガイドラインに沿って、「研究動物使用に関する米国心臓協会の立場」に準拠し、佐賀大学動物実験委員会の承認を得て行った。
なお、各実施例の数値データは、サンプルサイズ（サンプル数）ｎにおける平均値±ＳＥＭで示している。統計分析は、一元配置分散分析に続くテューキー検定、又はスチューデントの両側ｔ検定によって実施した。すべての統計分析は、Ｅｘｃｅｌ及びＪＭＰソフトウェアプログラム（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）を使用して実行した。
下記各種実験は、ＡＲＲＩＶＥガイドラインに沿って、「研究動物使用に関する米国心臓協会の立場」に準拠し、佐賀大学動物実験委員会の承認を得て行った。
なお、各実施例の数値データは、サンプルサイズ（サンプル数）ｎにおける平均値±ＳＥＭで示している。統計分析は、一元配置分散分析に続くテューキー検定、又はスチューデントの両側ｔ検定によって実施した。すべての統計分析は、Ｅｘｃｅｌ及びＪＭＰソフトウェアプログラム（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）を使用して実行した。
【0032】
［実施例１］
（抗体価）
高抗原性分析に基づき、エピトープ情報から適格なペプチド構造を予測して、マウスｓＥＨのアミノ酸配列から以下に示す配列番号４及び配列番号５で表される抗原ペプチドを選択した。
（抗体価）
高抗原性分析に基づき、エピトープ情報から適格なペプチド構造を予測して、マウスｓＥＨのアミノ酸配列から以下に示す配列番号４及び配列番号５で表される抗原ペプチドを選択した。
【0033】
ＬＤＤＧＤＫＲＤＳ（配列番号４）
ＤＳＳＳＰＰＥＩＥＥ（配列番号５）
ＤＳＳＳＰＰＥＩＥＥ（配列番号５）
【0034】
これらの抗原ペプチドをもとにｓＥＨペプチドワクチンＡ（配列番号４のｓＥＨペプチド）及びＢ（配列番号５のｓＥＨペプチド）を合成し、合成したｓＥＨペプチドワクチンＡ及びＢ６．２５μｇを２週間ごとに８週齢のＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒＳｌｃマウス（オス）に４回（８週齢／ｄａｙ０、１０週齢／ｄａｙ１４、１２週齢／ｄａｙ２８、１４週齢／ｄａｙ４２）投与した。
なお、１回目（８週齢）のワクチン接種では、ペプチドのＮ末端にＣｙｓを加えた後、免疫応答を誘発するためのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、株式会社ペプチド研究所製））をＮ－（６－マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ、株式会社ペプチド研究所製）を用いて結合させて、等量の完全フロイントアジュバントを含むワクチンを皮下注射した。
２回目（１０週齢）ないし４回目（１４週齢）のワクチン接種では、ペプチドのＮ末端にＣｙｓを加えた後、ＫＬＨを結合させて、等量の不完全フロイントアジュバントを含むワクチンを皮下注射した。
ｓＥＨペプチドワクチンは、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、ｓＥＨペプチド０．１３ｍｇ／ｍｌ及びＫＬＨ０．８７ｍｇ／ｍｌを含んでいる。
なお、１回目（８週齢）のワクチン接種では、ペプチドのＮ末端にＣｙｓを加えた後、免疫応答を誘発するためのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、株式会社ペプチド研究所製））をＮ－（６－マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ、株式会社ペプチド研究所製）を用いて結合させて、等量の完全フロイントアジュバントを含むワクチンを皮下注射した。
２回目（１０週齢）ないし４回目（１４週齢）のワクチン接種では、ペプチドのＮ末端にＣｙｓを加えた後、ＫＬＨを結合させて、等量の不完全フロイントアジュバントを含むワクチンを皮下注射した。
ｓＥＨペプチドワクチンは、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、ｓＥＨペプチド０．１３ｍｇ／ｍｌ及びＫＬＨ０．８７ｍｇ／ｍｌを含んでいる。
【0035】
ｓＥＨペプチドワクチン接種後の抗体産生を確認するために、ｓＥＨペプチドに対する抗体価を８、１０、１２、１４及び１６週齢でＥＬＩＳＡにより測定した。
具体的には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ Ｎｕｎｃ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）上に、抗原ペプチド－ＢＳＡコンジュゲート（株式会社ペプチド研究所製）を１０μｇ／ｍｌの濃度でコーティングし、５０ｍＭ炭酸緩衝液を用いて４℃で一晩希釈した。
次いで、ウェルを５％スキムミルクを含むＰＢＳでブロッキングした後、血清をブロッキングバッファーで段階希釈して各ウェルに加え、４℃で一晩インキュベートした。
各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）で洗浄した後、マウス血清用のマウスＩｇＧ（１０００倍に希釈、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に特異的な西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗体を用いて、室温で３時間インキュベートした。
ＰＢＳ－Ｔでウェルを洗浄した後、ペルオキシダーゼ発色基質３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で発色させ、０．５Ｎ硫酸で反応を停止させた。
全自動比色計イムノミニＮＪ－２３００（バイオテック株式会社製）を用いて、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。最大抗体価の半量（ＯＤ５０％）は、各サンプルの希釈範囲の最高値に従って決定した。
その結果を図１に示す。
具体的には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ Ｎｕｎｃ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）上に、抗原ペプチド－ＢＳＡコンジュゲート（株式会社ペプチド研究所製）を１０μｇ／ｍｌの濃度でコーティングし、５０ｍＭ炭酸緩衝液を用いて４℃で一晩希釈した。
次いで、ウェルを５％スキムミルクを含むＰＢＳでブロッキングした後、血清をブロッキングバッファーで段階希釈して各ウェルに加え、４℃で一晩インキュベートした。
各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）で洗浄した後、マウス血清用のマウスＩｇＧ（１０００倍に希釈、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に特異的な西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗体を用いて、室温で３時間インキュベートした。
ＰＢＳ－Ｔでウェルを洗浄した後、ペルオキシダーゼ発色基質３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で発色させ、０．５Ｎ硫酸で反応を停止させた。
全自動比色計イムノミニＮＪ－２３００（バイオテック株式会社製）を用いて、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。最大抗体価の半量（ＯＤ５０％）は、各サンプルの希釈範囲の最高値に従って決定した。
その結果を図１に示す。
【0036】
図１に示されるように、血清中ｓＥＨ抗体価は、ｓＥＨペプチドワクチンＡでは、測定を開始してから４２日目（１４週齢）及び５６日目（１６週齢）に、ｓＥＨペプチドワクチンＢでは５６日目（１６週齢）に有効な抗体価の上昇が確認された。
以上の結果を踏まえ、ｓＥＨペプチドワクチンＡを用いて、ラットにおける抗体価の測定を行った。
以上の結果を踏まえ、ｓＥＨペプチドワクチンＡを用いて、ラットにおける抗体価の測定を行った。
【0037】
具体的には、合成したｓＥＨペプチドワクチンＡ６．２５μｇを２週間ごとに５週齢ラット（ｎ＝４）に４回（５週齢、７週齢、９週齢、１１週齢）投与した。
なお、１回目（５週齢）のワクチン接種では、ペプチドのＮ末端にＣｙｓを加えた後、免疫応答を誘発するためのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）をＮ－（６－マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ、株式会社ペプチド研究所製）を用いて結合させて、等量の完全フロイントアジュバントを含むワクチンを皮下注射した。
２回目（７週齢）ないし４回目（１１週齢）のワクチン接種では、ペプチドのＮ末端にＣｙｓを加えた後、ＫＬＨを結合させて、等量の不完全フロイントアジュバントを含むワクチンを皮下注射した。
ｓＥＨペプチドワクチンは、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、ｓＥＨペプチド０．１３ｍｇ／ｍｌ及びＫＬＨ０．８７ｍｇ／ｍｌを含んでいる。
なお、１回目（５週齢）のワクチン接種では、ペプチドのＮ末端にＣｙｓを加えた後、免疫応答を誘発するためのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）をＮ－（６－マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ、株式会社ペプチド研究所製）を用いて結合させて、等量の完全フロイントアジュバントを含むワクチンを皮下注射した。
２回目（７週齢）ないし４回目（１１週齢）のワクチン接種では、ペプチドのＮ末端にＣｙｓを加えた後、ＫＬＨを結合させて、等量の不完全フロイントアジュバントを含むワクチンを皮下注射した。
ｓＥＨペプチドワクチンは、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、ｓＥＨペプチド０．１３ｍｇ／ｍｌ及びＫＬＨ０．８７ｍｇ／ｍｌを含んでいる。
【0038】
ｓＥＨペプチドワクチン接種後の抗体産生を確認するために、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗体をラットＩｇＧに特異的な抗体（１０００倍に希釈、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に変更した以外は同様にして、ｓＥＨペプチドに対するラットの抗体価を５、７、９、１１及び１３週齢で上記と同様の手法にてＥＬＩＳＡにより測定した。
その結果を図２に示す。
その結果を図２に示す。
【0039】
図２に示されるように、血清中ｓＥＨ抗体価は、初回ワクチン接種した５週齢ではすべてのラットにおいて検出されなかったが、９週齢でｓＥＨ抗体価が上昇し、少なくとも１３週齢まで維持された。
以上にように、ｓＥＨペプチドワクチンが投与されたラットの抗体価は、実験期間中に良好に維持されていることが確認された。
以上にように、ｓＥＨペプチドワクチンが投与されたラットの抗体価は、実験期間中に良好に維持されていることが確認された。
【0040】
[実施例２]
（ｓＥＨに対する阻害能）
１４，１５－ＥＥＴ－ｄ１１の１４，１５－ＤＨＥＴ－ｄ１１への分解を測定し、抗体によるｓＥＨ活性の阻害能力を測定した。
１４，１５－ＥＥＴ－ｄ１１をラットの全血に添加し、抗体の上昇がｓＥＨ活性を阻害できることを明らかにするために試験した。１４，１５－ＥＥＴ－ｄ１１及び１４，１５－ＤＨＥＴ－ｄ１１の量は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムによって検出及び計算した。
（ｓＥＨに対する阻害能）
１４，１５－ＥＥＴ－ｄ１１の１４，１５－ＤＨＥＴ－ｄ１１への分解を測定し、抗体によるｓＥＨ活性の阻害能力を測定した。
１４，１５－ＥＥＴ－ｄ１１をラットの全血に添加し、抗体の上昇がｓＥＨ活性を阻害できることを明らかにするために試験した。１４，１５－ＥＥＴ－ｄ１１及び１４，１５－ＤＨＥＴ－ｄ１１の量は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムによって検出及び計算した。
【0041】
具体的には、まず、実施例１で使用したｓＥＨペプチドワクチンＡを注射した１４週齢のラットの尾から血液サンプルを採取した。ｄＨ２Ｏ５０μlを等容量の血液に加えて溶血させた。さらに、最終濃度として０．００１μｇ／μｌとなるように１４，１５－ＥＥＴ－ｄ１１（Ｎｏ.１０００６４１０、ケイマン社製）を添加し、ボルテックスした。これを３７℃で１５分間インキュベートした後、３ｍＭの硫酸亜鉛を加えて反応を止め、－２０℃でサンプルを保存した。このサンプルを等量の酢酸エチルで３回抽出した後、有機相を回収し、卓上遠心エバポレータ（ｍｉＶａｃ Ｄｕｏ、Ｇｅｎｅｖａｃ社製）で蒸発させた。
回収した有機相中の１４，１５－ＥＥＴ－ｄ１１及び１４，１５－ＤＨＥＴ－ｄ１１の量をＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムによって検出及び計算した。
回収した有機相中の１４，１５－ＥＥＴ－ｄ１１及び１４，１５－ＤＨＥＴ－ｄ１１の量をＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムによって検出及び計算した。
【0042】
また、比較として、ｓＥＨペプチドワクチンに代えて、１００μｌの生理食塩水を皮下注射した非免疫ラットを準備し、これを生理食塩水群として、１４，１５－ＥＥＴ－ｄ１１の１４，１５－ＤＨＥＴ－ｄ１１への分解をＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムによって測定した。
その結果を図３に示す。
その結果を図３に示す。
【0043】
また、同様の操作をｓＥＨペプチドワクチンＢを注射した１４週齢のラット及び生理食塩水を注射したラットについても行い、１４，１５－ＥＥＴ－ｄ１１の１４，１５－ＤＨＥＴ－ｄ１１への分解をＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムによって測定した。
その結果を図４に示す。
その結果を図４に示す。
【0044】
〈クロマトグラフィー条件〉
クロマトグラフィー測定には、トリプル四重極型質量分析計ＬＣＭＳ－８０３０（株式会社島津製作所製）を用いた。ＨＰＬＣ分離には、ＫｉｎｅｔｅｘＣ１８（粒子径１．７μｍ、細孔径１００Å、長さ１００ｍｍ×内径２．１ｍｍ）ＨＰＬＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を用いた。カラム温度は、４０℃に維持した。移動相の送液は、移動相Ａについては０．１％ギ酸水溶液、移動相Ｂについてはアセトニトリルとした。流速は、０．２ｍＬ／分とした。部分ループ注入モードを使用した場合の標準的な注入量は１０μＬであった。
クロマトグラフィー測定には、トリプル四重極型質量分析計ＬＣＭＳ－８０３０（株式会社島津製作所製）を用いた。ＨＰＬＣ分離には、ＫｉｎｅｔｅｘＣ１８（粒子径１．７μｍ、細孔径１００Å、長さ１００ｍｍ×内径２．１ｍｍ）ＨＰＬＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を用いた。カラム温度は、４０℃に維持した。移動相の送液は、移動相Ａについては０．１％ギ酸水溶液、移動相Ｂについてはアセトニトリルとした。流速は、０．２ｍＬ／分とした。部分ループ注入モードを使用した場合の標準的な注入量は１０μＬであった。
【0045】
〈質量分析条件〉
質量分析には、マイナスモードで動作するエレクトロスプレーインターフェース（ＥＳＩ）を搭載したＬＣＭＳ－８０３０（株式会社島津製作所製）を用いた。本装置は、ＬＣ装置から質量分析計に流速０．２ｍｌ／ｍｉｎで０．１％ギ酸水溶液／アセトニトリル（２５／７５、ｖ／ｖ）で流し、１４，１５－ＥＥＴ－ｄ１１及び１４，１５－ＤＨＥＴ－ｄ１１（Ｎｏ．１０００８０４０、ケイマンケミカル社製）の０．１μｇ／ｍｌアセトニトリル溶液を注入することにより最適化した。１４，１５－ＥＥＴ－ｄ１１及び１４，１５－ＤＨＥＴ－ｄ１１の多重反応モニタリング（ＭＲＭ）トランジション（プリカーサイオン及びプロダクトイオン）として、それぞれｍ／ｚ３３０→２１９、ｍ／ｚ３４８→２０７を選択した。ＭＲＭトランジションは、信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）及び選択性から選択した。
質量分析には、マイナスモードで動作するエレクトロスプレーインターフェース（ＥＳＩ）を搭載したＬＣＭＳ－８０３０（株式会社島津製作所製）を用いた。本装置は、ＬＣ装置から質量分析計に流速０．２ｍｌ／ｍｉｎで０．１％ギ酸水溶液／アセトニトリル（２５／７５、ｖ／ｖ）で流し、１４，１５－ＥＥＴ－ｄ１１及び１４，１５－ＤＨＥＴ－ｄ１１（Ｎｏ．１０００８０４０、ケイマンケミカル社製）の０．１μｇ／ｍｌアセトニトリル溶液を注入することにより最適化した。１４，１５－ＥＥＴ－ｄ１１及び１４，１５－ＤＨＥＴ－ｄ１１の多重反応モニタリング（ＭＲＭ）トランジション（プリカーサイオン及びプロダクトイオン）として、それぞれｍ／ｚ３３０→２１９、ｍ／ｚ３４８→２０７を選択した。ＭＲＭトランジションは、信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）及び選択性から選択した。
【0046】
１４，１５－ＤＨＥＴ－ｄ１１のＭＲＭトランジションは１．７分で取得され、１４，１５－ＥＥＴ－ｄ１１のＭＲＭトランジションは２．５分で取得された。ＤＬ温度は、３００℃とした。データは、Ｌａｂｓｏｌｕｔｉｏｎソフトウェア（株式会社島津製作所製）を用いて処理した。１４，１５－ＤＨＥＴ－ｄ１１と１４，１５－ＥＥＴ－ｄ１１のキャリブレーションプロットを作成し、各サンプルにおける１４，１５－ＥＥＴ－ｄ１１／１４，１５－ＤＨＥＴ－ｄ１１の比率を計算した。
【0047】
図３及び図４に示されるように、血液中の抗体により不活性化したｓＥＨは、１４，１５－ＥＥＴ－ｄ１１を１４，１５－ＤＨＥＴ－ｄ１１に加水分解できず、１４，１５－ＥＥＴ－ｄ１１／１４，１５－ＤＨＥＴ－ｄ１１比はｓＥＨペプチドワクチン群で有意に高く、ｓＥＨ酵素に対する抗体の阻害効果が確認された。
【0048】
［実施例３］
（心エコー検査）
日本エスエルシー株式会社から購入したＷｉｓｔａｒラットに対し、５、７、９及び１１週齢（計４回）でｓＥＨペプチドワクチンＡを皮下注射した（３０症例のｓＥＨペプチドワクチン接種群）。これとは別に、非免疫ラットを並行して使用し、非免疫ラットに生理食塩水（１００μｌ）を皮下注射した（４０症例の生理食塩水群）。
これら７０症例のラットを８週目にネンブタール（１００ｍｌ／ｋｇ）で麻酔し、人工呼吸器下に手術を行った。
左開胸術を行って心臓を露出させ、６－０プロリンで左前下行枝を結紮することにより心筋梗塞（ＭＩ）を作製した。
（心エコー検査）
日本エスエルシー株式会社から購入したＷｉｓｔａｒラットに対し、５、７、９及び１１週齢（計４回）でｓＥＨペプチドワクチンＡを皮下注射した（３０症例のｓＥＨペプチドワクチン接種群）。これとは別に、非免疫ラットを並行して使用し、非免疫ラットに生理食塩水（１００μｌ）を皮下注射した（４０症例の生理食塩水群）。
これら７０症例のラットを８週目にネンブタール（１００ｍｌ／ｋｇ）で麻酔し、人工呼吸器下に手術を行った。
左開胸術を行って心臓を露出させ、６－０プロリンで左前下行枝を結紮することにより心筋梗塞（ＭＩ）を作製した。
【0049】
２４時間以内に死亡した症例を手術関連死とみなし、また、手術直後に左室駆出率（ＥＦ）が１５％以上低減しなかったラットは除外した。２４時間後に生理食塩水群で２匹、ｓＥＨペプチドワクチン群で１匹の計３匹が死亡し、最終的には、生理食塩水群として３１症例、ｓＥＨペプチドワクチン群として２０症例の計５１症例について、手術前日及び手術後７日目に麻酔した後、経胸壁心エコー検査を実施した。１５ＭＨｚトランスデューサを備えた心エコー検査装置（株式会社東芝製）を用い、Ｍモードの左室心エコー図を記録した。Ｍモードによる２Ｄ短軸像を用いて、前壁の厚さ、左室収縮末期径（ＬＶＤｓ）及び左室拡張末期径（ＬＶＤｄ）を測定した。
その結果を図５及び図６に示す。
その結果を図５及び図６に示す。
【0050】
図５及び図６に示されるように、心筋梗塞誘発前の生理食塩水群とワクチン群との間で左室収縮末期径（ＬＶＤｓ）のベースラインに有意差は見られなかった（生理食塩水群のＬＶＤｓ：２．８±３．０ｍｍ、ｓＥＨペプチドワクチン群のＬＶＤｓ：３．０±０．１ｍｍ、ｐ＝０．１９）。同様に、心筋梗塞誘発前の左室内径短縮率（ＦＳ）（生理食塩水群のＦＳ：５０.７±１.９％、ｓＥＨペプチドワクチン群のＦＳ：４９.９±１.６％、ｐ＝０．７５）及び左室駆出率（ＥＦ）（生理食塩水群のＥＦ：８５．４±１．６％、ｓＥＨペプチドワクチン群のＥＦ：８５．１±１．３％、ｐ＜０．８９）にも差は見られなかった。これらの結果は、ワクチン接種自体がラットの心機能に影響を及ぼさなかったことを示している。
【0051】
また、手術後７日では、ｓＥＨペプチドワクチン群のＬＶＤｓは生理食塩水群のＬＶＤｓと比較してより小さな値を示した（生理食塩水群のＬＶＤｓ：５．８±０．１ｍｍ、ｓＥＨペプチドワクチン群のＬＶＤｓ５．１±０．２ｍｍ、ｐ＜０．００１）。ｓＥＨペプチドワクチン群の左室前壁（ＬＶＡＷ）の厚さ（１．２６±０．０５ｍｍ）は、生理食塩水群の左室前壁（ＬＶＡＷ）の厚さ（０．９８±０．０６ｍｍ)よりも厚く、ｓＥＨペプチドワクチンが心筋梗塞後の左室前壁（ＬＶＡＷ）の厚さを有意に保持したことが示された。ｓＥＨペプチドワクチン群の左室内径短縮率（ＦＳ）及び左室駆出率（ＥＦ）は、生理食塩水群と比較して高く保たれた。
【0052】
なお、左室内径短縮率（ＦＳ）及び左室駆出率（ＥＦ）は、それぞれ下記式（１）及び（２）を用いて算出した。
ＦＳ（％）＝（ＬＶＤｄ－ＬＶＤｓ）／ＬＶＤｄ×１００
ＥＦ（％）＝（ＬＶＤｄ３-ＬＶＤｓ３）／ＬＶＤｄ３×１００
ここで、ＬＶＤｄ３は左室拡張末期容積（ＬＶＥＤＶ）、ＬＶＤｓ３は左室収縮末期容積（ＬＶＥＳＶ）に相当する。
測定は、心臓の類似した部位で２回、異なる部位で２回行い、データとしてこれらを平均化したものを使用した。
ＦＳ（％）＝（ＬＶＤｄ－ＬＶＤｓ）／ＬＶＤｄ×１００
ＥＦ（％）＝（ＬＶＤｄ３-ＬＶＤｓ３）／ＬＶＤｄ３×１００
ここで、ＬＶＤｄ３は左室拡張末期容積（ＬＶＥＤＶ）、ＬＶＤｓ３は左室収縮末期容積（ＬＶＥＳＶ）に相当する。
測定は、心臓の類似した部位で２回、異なる部位で２回行い、データとしてこれらを平均化したものを使用した。
【0053】
生理食塩水群とｓＥＨペプチドワクチン群におけるラットの体重に大きな変化は見られなかった。
【0054】
以上から、ｓＥＨペプチドワクチンが、心筋梗塞による左心室の拡張を抑制し、収縮機能の悪化を抑制したことがわかる。
【0055】
［実施例４］
（線維化率）
実施例３におけるラットについて、心エコー検査後、ラットから心臓を採取し、心尖部、心室中部（結紮点の下）及び心基部の切片に分割した。このうち、心室中部の切片をホルマリンで固定した。
（線維化率）
実施例３におけるラットについて、心エコー検査後、ラットから心臓を採取し、心尖部、心室中部（結紮点の下）及び心基部の切片に分割した。このうち、心室中部の切片をホルマリンで固定した。
【0056】
この生理食塩水群（ｎ＝４）とｓＥＨペプチドワクチン群（ｎ＝６）における心臓の短軸断面の切片についてアザン染色を行った。その代表的な病理組織画像を図７に示す。病理組織画像では、心筋梗塞による線維化領域が青色部分、非梗塞領域が赤色部分として示された。
【0057】
これをもとに、線維化面積／全左室面積を計算し、損傷組織の割合を評価した。損傷組織の割合は、線維化面積、全左室面積を画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅ Ｊを用いて定量化して算出した。
その結果を図８に示す。
その結果を図８に示す。
【0058】
図８に示されるように、ｓＥＨペプチドワクチン群の梗塞誘発性線維質は、生理食塩水群と比較して、有意に減少することが示された（ワクチン群の損傷組織割合：１６．６％、生理食塩水群の損傷組織割合：２８．８％、ｐ＝０．０２９）。
以上から、ｓＥＨペプチドワクチンが、心筋梗塞に伴う心筋損傷を抑制することがわかる。
以上から、ｓＥＨペプチドワクチンが、心筋梗塞に伴う心筋損傷を抑制することがわかる。
【0059】
［実施例５］
（血管密度及び血管数）
実施例４における賦活化処理を施した生理食塩水群（ｎ＝７）とｓＥＨペプチドワクチン群（ｎ＝５）における心臓切片を、血管内皮細胞のオリゴ糖側鎖に特異的に結合するＧｒｉｆｆｏｎｉａ Ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ Ｌｅｃｔｉｎ Ｉ ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４（ＬＥＣＴＩＮ）（ＦＬ－１２０１、３０００倍に希釈、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、内皮細胞を標識するための抗ＣＤ３１（ａｂ２８３６４、１００倍に希釈、ａｂｃａｍ社製）、平滑筋細胞を標識するための抗α平滑筋アクチン（αＳＭＡ）（Ａ２５４７、１０００倍に希釈、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）で免疫染色し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ社製）で核を染色した。その結果を図９ないし図１１に示す。
（血管密度及び血管数）
実施例４における賦活化処理を施した生理食塩水群（ｎ＝７）とｓＥＨペプチドワクチン群（ｎ＝５）における心臓切片を、血管内皮細胞のオリゴ糖側鎖に特異的に結合するＧｒｉｆｆｏｎｉａ Ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ Ｌｅｃｔｉｎ Ｉ ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４（ＬＥＣＴＩＮ）（ＦＬ－１２０１、３０００倍に希釈、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、内皮細胞を標識するための抗ＣＤ３１（ａｂ２８３６４、１００倍に希釈、ａｂｃａｍ社製）、平滑筋細胞を標識するための抗α平滑筋アクチン（αＳＭＡ）（Ａ２５４７、１０００倍に希釈、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）で免疫染色し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ社製）で核を染色した。その結果を図９ないし図１１に示す。
【0060】
これらのデータを画像解析ソフトウェアＨＡＬＯ ＡＩ（ｉｎｄｉｃａ ｌａｂｓ社製)で解析し、内皮細胞マーカーであるＬＥＣＴＩＮ及びＣＤ３１についての血管密度（平均値）を算出し、また、ＣＤ３１及びαＳＭＡについて血管数をそれぞれ算出した。血管密度は、梗塞領域と非梗塞領域との境界領域の五つの領域（それぞれ１ｍｍ２）をランダムに選択して算出した。
【0061】
図９ないし図１１に示されるように、ｓＥＨペプチドワクチン群の毛細血管及び動脈を含む心筋血管密度及び心筋血管数は、生理食塩水群の心筋血管密度及び心筋血管数に比べ有意に多く、ｓＥＨの阻害により虚血領域と非虚血領域との境界領域における血管新生が促進されることが示唆された。
【0062】
［実施例６］
（血管内皮細胞増殖因子発現作用）
ＥＥＴｓは血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を介して血管新生を促進することが知られていることから、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を血管新生の主な原因であると仮定して、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）のタンパク質レベルをウェスタンブロッティングにより評価した。
（血管内皮細胞増殖因子発現作用）
ＥＥＴｓは血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を介して血管新生を促進することが知られていることから、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を血管新生の主な原因であると仮定して、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）のタンパク質レベルをウェスタンブロッティングにより評価した。
【0063】
具体的には、実施例４における生理食塩水群（ｎ＝４）とｓＥＨペプチドワクチン群（ｎ＝４）における心臓切片を、プロテアーゼ阻害剤を含有するＲＩＰＡバッファー中で均質化した。
次いで、心臓溶解物のサンプルを標準プロトコルに従って電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）により分離した。
次いで、心臓溶解物のサンプルを標準プロトコルに従って電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）により分離した。
【0064】
トランスブロットＴｕｒｂｏ転写システム（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）を用いて、タンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレンに転写した後、ＰＶＤＦメンブレンを一次抗体でプローブし、更に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合した二次抗体でプローブし、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｒｅｇｅｎｔｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を基質として免疫反応バンドを発現（化学発光）させた（図１２参照）。増強された化学発光をＦＵＳＩＯＮ ＦＸ（Ｖｉｌｂｅｒ－Ｌｏｕｒｍａｔ）で検出し、バンド密度を画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅ Ｊで定量化した。その結果を図１３（ｐ＜０．０５）に示す。
【0065】
一次抗体としては、ローディングコントロールとしてのβ－アクチンI‐１９（ｓｃ－１６１６、１０００倍に希釈、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ＶＥＧＦ（Ａ－２０）（ｓｃ－１５２、２００倍に希釈、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（＃９１０１、１０００倍に希釈、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、及びｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（＃９１０２、１０００倍に希釈、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製)を使用した。
【0066】
図１３に示されるように、ｓＥＨペプチドワクチン群のＶＥＧＦ発現は、生理食塩水群のＶＥＧＦ発現と比較して増加した（ｐ＝０．０４０）。
【0067】
加えて、ｓＥＨペプチドワクチン群において、ＶＥＧＦ活性化の下流の一つであるＰｈｏｓｐｈｏ－ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）は有意に上方制御された（ｐ＝０．０４７）。
これは、ｓＥＨの阻害が、ＥＥＴｓ－ＶＥＧＦを介して血管新生を引き起こす可能性を示唆している。
これは、ｓＥＨの阻害が、ＥＥＴｓ－ＶＥＧＦを介して血管新生を引き起こす可能性を示唆している。
【0068】
本発明に係るｓＥＨペプチドワクチンは、ＥＥＴｓを誘導し、ＶＥＧＦを上方制御したが、これは先に報告されている他の研究のものと矛盾しない。
また、実施例５で示されたように、ｓＥＨペプチドワクチンが境界領域の毛細血管及び動脈を増加させることを証明した。これらの証拠に基づき、ｓＥＨ阻害により誘導されたＶＧＥＦが虚血領域の境界で心筋細胞を救済することが示唆される。
また、実施例５で示されたように、ｓＥＨペプチドワクチンが境界領域の毛細血管及び動脈を増加させることを証明した。これらの証拠に基づき、ｓＥＨ阻害により誘導されたＶＧＥＦが虚血領域の境界で心筋細胞を救済することが示唆される。
【0069】
［実施例７］
（安全性）
ｓＥＨペプチドワクチンの安全性を評価した。
（安全性）
ｓＥＨペプチドワクチンの安全性を評価した。
【0070】
具体的には、実施例１におけるｓＥＨペプチドワクチンＡを注射した１３週齢のラット（心筋梗塞の施術せず）について、ｓＥＨペプチドワクチン群（ｎ＝１３）及び生理食塩水群（ｎ＝１１）の心臓、肺、腎臓、肝臓を取り出し、ホルマリンに固定後、ヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）を行い、病理学的変化の有無を確認した。その結果を図１４に示す。
【0071】
また、テールカフシステムＢＰ－９８Ａ（株式会社ソフトロン製）を用いて、１１週齢目のラットの血圧及び心拍数を計測した。その結果を図１５に示す。なお、ラットは、血圧及び心拍数の測定前に１週間以上装置に適応させた。
【0072】
図１４に示されるように、心臓、肺、腎臓及び肝臓において、ｓＥＨペプチドワクチン処理によって、目に見える病理学的変化は観察されなかった。これは、ｓＥＨペプチドワクチンが、臓器毒性作用がないことを示唆している。
【0073】
また、図１５に示されるように、生理食塩水群とｓＥＨペプチドワクチン群とにおける血圧測定において、両者の間に有意差は検出されなかった（生理食塩水群の血圧：１０２.８±３．２ｍｍＨｇ、ｓＥＨペプチドワクチン群の血圧９９．５±３．６ｍｍＨｇ、ｐ＝０．５１）。また、心拍数についても両群間に有意差はなかった（生理食塩水群の心拍数４１３．２±１２．８ｂｐｍ、ｓＥＨペプチドワクチン群の心拍数４０３．０±１３．６ｂｐｍ、ｐ＝０．５９）。
以上の結果から、ｓＥＨペプチドワクチン自体は、ラットに安全に投与され、血行動態に影響を及ぼさないことが確認された。
以上の結果から、ｓＥＨペプチドワクチン自体は、ラットに安全に投与され、血行動態に影響を及ぼさないことが確認された。
【0074】
ｓＥＨを阻害することは、病的高血圧モデルの降圧に有効であることが報告されている。しかし、上記血圧測定では、ｓＥＨペプチドワクチン群の血圧に有意な低下は認められなかった。この不一致の原因として、本実施例で用いたモデルが病理学的高血圧モデルではなく、健常なラットであることが考えられる。
【0075】
上記各実施例において示されているように、本発明に係るｓＥＨペプチドワクチンは、急性心筋梗塞において保護的役割を有し、虚血領域及び線維質の減少を示すことを明らかにした。また、心筋梗塞後のＶＥＧＦを上方制御し、心筋における血管密度を増加させた。
ヒトでの臨床応用のためには、ヒト又はマウスｓＥＨペプチドワクチンによって、ｓＥＨを阻害できる抗体がヒト血液中で上昇するか否かを確認する必要があるものの、心筋梗塞のリスクが高い患者、又は心筋梗塞の既往のある患者の二次予防に適応される可能性を示している。
ヒトでの臨床応用のためには、ヒト又はマウスｓＥＨペプチドワクチンによって、ｓＥＨを阻害できる抗体がヒト血液中で上昇するか否かを確認する必要があるものの、心筋梗塞のリスクが高い患者、又は心筋梗塞の既往のある患者の二次予防に適応される可能性を示している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】