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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-15
(45)【発行日】2024-10-23
(54)【発明の名称】ＱＰＴ遺伝子が操作された植物細胞、及びその利用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20241016BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241016BHJP
A01H 5/00 20180101ALI20241016BHJP
A01H 6/82 20180101ALI20241016BHJP
C12N 15/29 20060101ALN20241016BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N5/10
A01H5/00 A ZNA
A01H6/82
C12N15/29
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2022562348
(86)(22)【出願日】2022-05-31
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-09
(86)【国際出願番号】 KR2022007757
(87)【国際公開番号】W WO2022270788
(87)【国際公開日】2022-12-29
【審査請求日】2022-12-06
(31)【優先権主張番号】10-2021-0080363
(32)【優先日】2021-06-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】519217032
【氏名又は名称】ケーティー アンド ジー コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】110000877
【氏名又は名称】弁理士法人ＲＹＵＫＡ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】セオ、ヒョ セオク
(72)【発明者】
【氏名】リー、ヨウン ギ
(72)【発明者】
【氏名】リー、ジェオン ヘオン
(72)【発明者】
【氏名】ジャン、ドン スン
(72)【発明者】
【氏名】キム、クワン チュル
(72)【発明者】
【氏名】ナ、ウーン ヒュン
【審査官】田中 晴絵
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０２１／０７２２８８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００２／１００１９９（ＷＯ，Ａ２）
【文献】国際公開第２０１８／２２２６６７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Phytochemistry，2013年，94 ，10-27
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ａ０１Ｈ ５／００
Ａ０１Ｈ ６／８２
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１３の塩基配列をガイド配列として含む第１ポリヌクレオチドを、ガイドＲＮＡとして含み、かつ、Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコーディングする遺伝子を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであって、Ｎ．ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓに由来するＱＰＴ２（Ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２）遺伝子に変異を導入するための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム。
【請求項2】
母細胞に比べ、前記ＱＰＴ２遺伝子またはＱＰＴ２タンパク質の発現または活性が低減されるように、請求項１に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって遺伝的に操作された植物細胞であって、前記植物細胞は、栽培タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）の細胞である、植物細胞。
【請求項3】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４及びＣｐｆ１からなる群のうちから選択されたＣａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコーディングする遺伝子を含み、
前記Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコーディングする遺伝子は、ＮＬＳ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｉｇｎａｌ：核位置化配列）を含むものである、請求項２に記載の植物細胞。
【請求項4】
請求項２または３に記載の植物細胞を含む植物。
【請求項5】
請求項１に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む、ノルニコチン、アナタビン及びアナバシンからなる群のうちから選択される少なくとも１以上である、アルカロイド生合成抑制用組成物。
【請求項6】
請求項１に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む、ニコチン生合成抑制用組成物。
【請求項7】
請求項１に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む、ＱＰＴ２遺伝子操作用組成物。
【請求項8】
請求項１に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含むベクターを植物細胞に導入させる段階を含み、前記植物細胞は、栽培タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）の細胞である、ニコチン生合成が抑制された植物細胞の製造方法。
【請求項9】
請求項１に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含むベクターを植物細胞に導入させる段階を含み、前記植物細胞は、栽培タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）の細胞である、植物細胞のＱＰＴ２遺伝子操作方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＱＰＴ遺伝子が操作された植物細胞、及びその利用方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ＱＰＴ（Ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子は、タバコ植物のニコチン生合成に必須な役割を行うと知られており、ＱＰＴ１遺伝子は、植物の生育に必須な遺伝子であると究明され、ＱＰＴ２遺伝子は、ニコチン生合成時期に、選択的に発現量が高くなると明らかにされた（（Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）。
【0003】
なお、従来技術においては、タバコ植物のニコチン生合成に係わる遺伝子の機能をＧＭＯ技術（ＲＮＡｉなど）を介して抑制させることにより、ニコチン含量を少なくした。しかしながら、以前技術の限界により、遺伝子の機能を１００％抑制することができず、ニコチン含量を少なくするのに限界があった。
【0004】
それにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを利用して、タバコ植物のニコチン生合成に係わる遺伝子であるＱＰＴ２遺伝子に突然変異を誘発させることにより、「外部遺伝子が導入されていないｎｏｎ－ＧＭＯ」でありながら、「ニコチンの含量が顕著に少ないタバコ」植物体を開発するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
一態様は、ＱＰＴ（Ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子またはＱＰＴタンパク質の発現または活性が低減されるように、遺伝的に操作された植物細胞を提供する。
【0006】
一態様は、前記植物細胞を含む植物を提供する。
【0007】
一態様は、配列番号９から１９の塩基配列を含むポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドからなる群のうちから選択される１以上の第１ポリヌクレオチド、または前記１以上の第１ポリヌクレオチドが転写された第２ポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを提供する。
【0008】
他の態様は、アルカロイド生合成抑制用組成物、ニコチン生合成抑制用組成物及びＱＰＴ遺伝子操作用組成物を提供する。
【0009】
また他の態様は、ニコチン生合成が抑制された植物細胞の製造方法及び植物細胞のＱＰＴ遺伝子操作方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0010】
一態様は、ＱＰＴ（Ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子またはＱＰＴタンパク質の発現または活性が低減されるように、遺伝的に操作された植物細胞を提供する。
【0011】
「母細胞」は、一態様によるＱＰＴ遺伝子またはＱＰＴタンパク質の発現または活性が低減されるように人為的な操作を行っていない細胞であり、植物から分離されたばかりの細胞、及びそれを培養した細胞を意味する。
【0012】
前記ＱＰＴ遺伝子は、ニコチン生合成関連遺伝子でもあり、また前記ＱＰＴ遺伝子は、ニコチナ・シルウェストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）に由来するＱＰＴ遺伝子、ニコチナ・トメントシフォルミス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ）に由来するＱＰＴ遺伝子、及び／または栽培タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）のＱＰＴ遺伝子でもある。例えば、前記ＱＰＴ遺伝子は、ＱＰＴ１ｓ、ＱＰＴ１ｔ、ＱＰＴ２ｓ及びＱＰＴ２ｔからなる群のうちから選択される少なくとも１以上の遺伝子でもある。前記ＱＰＴ１ｓ遺伝子は、Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓに由来するＱＰＴ１遺伝子でもあり、ＱＰＴ２ｓ遺伝子は、Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓに由来するＱＰＴ２遺伝子でもあり、ＱＰＴ１ｔ遺伝子は、Ｎ．ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓに由来するＱＰＴ１遺伝子でもあり、ＱＰＴ２ｔ遺伝子は、Ｎ．ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓに由来するＱＰＴ２遺伝子でもある。前記ＱＰＴ２ｓは、本明細書内において、ＮｔＱＰＴ２ｓ、ＮｔＱＰＴ２ｓｙｌまたはＱＰＴ２＿ｓｙｌと混用しても使用され、前記ＱＰＴ２ｔは、本明細書内において、ＮｔＱＰＴ２ｔ、ＮｔＱＰＴ２ｔｏｍまたはＱＰＴ２＿ｔｏｍと混用しても使用される。
【0013】
前記ＱＰＴ遺伝子は、それぞれＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋに現在登録されている配列ＩＤとして、それぞれＡＪ７４８２６３、ＡＪ７４８２６２、ＮＷ＿００９５４１１０９．１、ＮＷ＿０１５８４２１０３．１、ＮＷ＿００８９１９０８４．１、ＮＷ＿０１５８５２９６８．１、ＮＷ＿００９３５０２２６、ＮＷ＿０１５８２４１８６．１、ＮＷ＿００８９１９２６７．１、ＮＷ＿０１５８５２９６８．１、ＮＷ＿０１５８４２１０３．１、ＮＷ＿０１５８２４１８６．１、ＮＷ＿０１５８５２９６８．１、ＮＷ＿０１５８５２９６８．１に該当しうる。また、該ＱＰＴ遺伝子は、それぞれＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋに現在登録されている遺伝子ＩＤとして、１０７８２５８４９、１０４２４００１４、１０７８２９１２３、１０７８２９１２２、１０４２１７２６９、１０７８２００７８、１０４１２１０４６、１０４１２１１４０に該当しうる。当業者であるならば、前記配列ＩＤまたは遺伝子ＩＤ登録番号を利用し、配列を容易に確認することができるであろう。ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ ＢｒｏｗｓｅｒまたはＧｅｎＢａｎｋに登録されている前記配列ＩＤ番号に該当する具体的な配列は、経時的に若干変更されうる。本発明の範囲は、前述の変更された配列にも及ぶということは、当業者に自明であろう。さらに具体的には、前記ＱＰＴ遺伝子は、ニコチン生合成誘導信号である傷あるいはジャスモン酸メチル処理に反応して発現されるＱＰＴ２遺伝子であり、それは、ＱＰＴ２ｓ遺伝子及びＱＰＴ２ｔ遺伝子からなる群のうちから選択される１以上の遺伝子を含むものでもある。
【0014】
また、本明細書において用語「遺伝的操作（ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」または「遺伝的に操作された（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」は、細胞に対し、１以上の遺伝的変形（ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を導入する行為、またはそれによって作られた細胞を示す。
【0015】
前記遺伝的操作は、物理的な方法により、ＱＰＴ遺伝子の塩基配列内変形によって誘導されるものでもある。前記物理的な方法は、例えば、Ｘ線照射、ガンマ線照射などでもある。
【0016】
前記遺伝的操作は、化学的な方法により、ＱＰＴ遺伝子の塩基配列内変形または遺伝子発現の変化によって誘導されるものでもある。前記化学的な方法は、例えば、エチルメタンスルホネート（ｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）処理、ジメチルスルフェート（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）処理などでもある。
【0017】
前記遺伝的操作は、遺伝子編集システムにより、ＱＰＴ遺伝子の塩基配列内変形によって誘導されるものでもある。前記遺伝子編集システムは、例えば、メガヌクレアーゼ（ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ）システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）システム、ターレン（ＴＡＬＥＮ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）システム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなどでもある。例えば、前記遺伝的操作は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ：ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）システムにより、ＱＰＴ遺伝子から転写されたｍＲＮＡに結合し、遺伝子発現の変化によって誘導されるものでもある。
【0018】
従って、前記植物細胞になされる遺伝的操作は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）システム、メガヌクレアーゼシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼシステム、ターレン（ＴＡＬＥＮ）システム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、Ｘ線照射、ガンマ線照射、エチルメタンスルホネート処理、ジメチルスルフェート処理からなる群のうちから選択される少なくとも一つによっても誘導される。
【0019】
用語：ＱＰＴ遺伝子またはＱＰＴ遺伝子によってコーディングされるタンパク質の「発現または活性の低減」またはＱＰＴ遺伝子の「不活性化」、ＱＰＴタンパク質の「発現または活性の低減」、あるいはＱＰＴ遺伝子の「不活性化」された遺伝的に操作された植物細胞は、前記ＱＰＴ遺伝子またはＱＰＴ遺伝子によってコーディングされるタンパク質が、比較可能な同一種の植物細胞、またはその母細胞で測定されたＱＰＴ遺伝子またはＱＰＴ遺伝子によってコーディングされるタンパク質の発現レベルまたは活性レベルより低い程度に発現または活性が示されるか、あるいは発現または活性がないことを意味する。すなわち、該植物細胞において、ＱＰＴ遺伝子またはＱＰＴ遺伝子によってコーディングされるタンパク質の発現または活性が、本来操作されていない植物細胞の発現または活性より、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上または約１００％低減されたものでもある。ＱＰＴ遺伝子またはＱＰＴ遺伝子によってコーディングされるタンパク質の発現または活性が低減された遺伝的に操作された植物細胞は、当業界に公知された任意の方法を使用しても確認される。用語「不活性化（ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」は、全く発現がなされていない遺伝子、または発現がなされていても、その活性がないタンパク質が生成されるものを意味しうる。用語「低減（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は、ＱＰＴ遺伝子が操作されていない植物細胞に比べ、低レベルに発現されるか、あるいはＱＰＴ遺伝子によってコーディングされるタンパク質の発現がなされてもその活性が低いものを意味しうる。
【0020】
前記遺伝的操作は、ＱＰＴ遺伝子の核酸配列内変形によって誘導され、前記核酸配列内変形は、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより、人為的にも起こるのである。
【0021】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに含まれる前記第２ポリヌクレオチドは、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ）を含むｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）でもあり、前記第１ポリヌクレオチドは、第２ポリヌクレオチドをコーディングする遺伝子でもある。
【0022】
一般的に、周知の遺伝子校正手段である「ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）システム」は、集合的に、Ｃａｓ遺伝子をコーディングする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ－メート配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの脈絡において、「直接反復部」及びｔｒａｃｒＲＮＡ－加工部分直接反復部を含む）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの脈絡において、「スペーサ」とも称する）、ガイドＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からのその他配列、並びに転写物を含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ：ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）遺伝子の発現に伴われるか、あるいはその活性を誘導する転写物、及び他の要素を称する。一部具現例において、ＣＲＩＳＰＲシステムの１以上の要素は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムまたはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに由来する。一部具現例において、ＣＲＩＳＰＲシステムの１以上の要素は、内因性ＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定有機体、例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する。一般的に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の部位において、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を増進させる要素（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの脈絡において、プロトスペーサとも称する）を特徴とする。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の脈絡において、「標的配列」または「標的遺伝子」は、ガイド配列が相補性を有するように設計された配列を称し、ここで、該標的配列と該ガイド配列との混成化は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を増進させる。本質的に、完全な相補性が必要ではないが、混成化を引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を増進させる十分な相補性が存在する。該標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドを含むものでもある。一部具現例において、該標的配列は、細胞核内または細胞質内に位置する。一部具現例において、該標的配列は、真核細胞の細胞器官、例えば、ミトコンドリア内または葉緑体内に存在しうる。
【0023】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質及びまたはそのバリアントを含むものでもある。前記Ｃａｓタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と呼ばれる２つのＲＮＡと複合体を形成するとき、活性エンドヌクレアーゼまたはニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）を形成する。前記Ｃａｓタンパク質の非制限的な例は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２とも知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、あるいはその相同体、またはその変形されたバージョンを含む。それら酵素が知られており、例えば、化膿性レンサ球菌Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、受託番号Ｑ９９ＺＷ２下において、スイスプロット（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）データベースから得ることができる。一部具現例において、非変形ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９は、ＤＮＡ切断活性を有する。
【0024】
また、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４及びＣｐｆ１からなる群のうちから選択されたＣａｓタンパク質、または前記タンパク質をコーディングする遺伝子、及びＮＬＳ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｉｇｎａｌ）タンパク質、またはＮＬＳタンパク質をコーディングする遺伝子を含むものでもある。
【0025】
具体的には、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、前記第１ポリヌクレオチド、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９）タンパク質、またはＣａｓ９タンパク質をコーディングする遺伝子、及びＮＬＳ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｉｇｎａｌ）タンパク質、またはＮＬＳタンパク質をコーディングする遺伝子を含むものでもある。
【0026】
一部具現例において、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、Ｃａｓ９タンパク質であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを活用することができる。前記Ｃａｓ９タンパク質は、化膿性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレブトコッカス・サーモフィス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質、黄色ブドウ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質及び髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質からなる群のうちから選択される少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質でもあり、具体的には、化膿性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質でもある。一部具現例において、Ｃａｓ９タンパク質は、真核細胞における発現のために、コドン最適化され、前記化膿性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質を使用する場合、ＱＰＴ遺伝子またはＱＰＴタンパク質の発現または活性が最大に低減されうる。
【0027】
一部具現例において、Ｃａｓ９タンパク質は、真核細胞内の核内に位置するために、Ｃａｓ９タンパク質の５'－または３'－、あるいは両末端部分に、ＮＬＳ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｒ Ｓｉｇｎａｌ）を含むものでもあり、前記ＮＬＳは、１またはそれ以上でもある。
【0028】
本明細書において、用語「核位置化配列または核位置化信号（ＮＬＳ：Ｎｕｃｌｅａｒ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｒ Ｓｉｇｎａｌ）」は、特定物質（例えば、タンパク質）を細胞核内に運搬する役割を行うアミノ酸配列を意味し、大体のところ、核孔（ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｒｅ）を介し、細胞核内に運搬する作用を行う。前記核位置化配列は、真核生物において、ＣＲＩＳＰＲ複合体活性に必要ではないが、そのような配列を含み、システムの活性を増進させ、特に、核内の核酸分子を標的化すると見られる。
【0029】
また、ＲＮＡ遺伝子ハサミ（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＣＲＩＳＰＲ）関連ヌクレアーゼＣａｓ９は、標的遺伝子のノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）、転写活性化及びｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（すなわち、ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ融合転写体）を利用した抑制に係わる画期的な技術を提供し、該技術は、数多くの遺伝子位置をターゲッティングすると知られている。
【0030】
Ｃａｓ９（または、Ｃｐｆ１）タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて必須なタンパク質要素を意味し、前述のＣａｓ９（または、Ｃｐｆ１）遺伝子及びＣａｓ９（または、Ｃｐｆ１）タンパク質の情報は、国立生命工学情報センター（ＮＣＢＩ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋから求めることができるが、それに制限されるものではない。Ｃａｓ（または、Ｃｐｆ１）タンパク質を暗号化するＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子は、約４０個以上の互いに異なるＣａｓ（または、Ｃｐｆ１）タンパク質ファミリーが存在すると知られており、ｃａｓ遺伝子と反復構造（ｒｅｐｅａｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）との特定組み合わせにより、８個のＣＲＩＳＰＲ下位類型（Ｅｃｏｌｉ、Ｙｐｅｓｔ、Ｎｍｅｎｉ、Ｄｖｕｌｇ、Ｔｎｅａｐ、Ｈｍａｒｉ、Ａｐｅｒｎ及びＭｔｕｂｅ）を定義することができる。従って、前記各ＣＲＩＳＰＲ下位類型が反復単位をなし、ポリリボヌクレオチド・タンパク質複合体を形成することができる。
【0031】
前記遺伝子ノックアウトは、遺伝子の全部または一部（例えば、１以上のヌクレオチド）の欠失、置換、及び／または１以上のヌクレオチドの挿入による遺伝子の活性調節、例えば、不活性化を意味するものでもある。前記遺伝子不活性化は、遺伝子の発現抑制または発現低減（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、あるいは本来の機能を喪失したタンパク質をコーディングするように変形されたことを意味する。また、該遺伝子調節は、ターゲット遺伝子の１以上のエクソンを取り囲んでいる両側イントロン部位を同時にターゲッティングすることによるエクソン部位の欠失によって得られるタンパク質の構造変形、ドミナントネガティブ形態のタンパク質発現、可溶性形態で分泌される競争的阻害剤発現などの結果による遺伝子の機能変化を意味するものでもある。具体的には、前記第２ポリヌクレオチドは、前記ＱＰＴ遺伝子のエクソン１から８によってなる部位において、少なくとも１つの部位に結合されるものでもあり、さらに具体的には、前記ＱＰＴ２遺伝子のエクソン１から８の部位に結合されるものでもあり、さらに具体的には、前記ＱＰＴ２遺伝子エクソン２及び３の部位に結合されるものでもある。
【0032】
前述のＱＰＴ遺伝子またはＱＰＴタンパク質の発現または活性が低減されるように、人為的になされる遺伝子操作は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質によっても誘導される。一態様の植物細胞において、母細胞に比べ、ＱＰＴ遺伝子またはＱＰＴタンパク質の発現または活性が低減されるように、遺伝的に操作することができ、それは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによっても行われ、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、一態様は、配列番号９から１９の塩基配列を含むポリヌクレオチドからなる群のうちから選択される１以上の第１ポリヌクレオチド、または前記１以上の第１ポリヌクレオチドが転写された第２ポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含むものでもある。
【0033】
それにより、一態様による植物細胞は、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを前記植物細胞に伝達し、ニコチン生合成に参与するＱＰＴ遺伝子を不活性化させて変形されたＱＰＴタンパク質が発現され、ニコチン生合成を抑制することができる。
【0034】
前述ＱＰＴ遺伝子または前記ＱＰＴタンパク質の発現または活性が低減されるのは、前記ＱＰＴをコーディングする遺伝子の一部または全部が、変異、置換、削除されるか、あるいは前記遺伝子に１以上の塩基が挿入されることによるものでもあり、ＱＰＴ遺伝子校正手段であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによるものでもある。
【0035】
前記ノックアウトされたＱＰＴ遺伝子が、ＱＰＴ２ｓ及びＱＰＴ２ｔであり、前記２つの遺伝子がいずれもノックアウトされる場合、ニコチン生合成が最大に抑制されうる。
【0036】
前記植物は、栽培タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）でもあり、具体的には、黄色種、バーレー（ｂｕｒｌｅｙ）種、在来種、黒タバコ種またはオリエント種でもあり、さらに具体的には、バーレー種または黄色腫でもある。
【0037】
前記Ｃａｓタンパク質がＤＮＡによって暗号化され、個体または細胞に伝達される場合、前記ＤＮＡは、一般的に（しかしながら、必須ではない）、ターゲット細胞において作動可能な調節要素（例えば、プローモーター）を含むものでもある。前記Ｃａｓタンパク質発現のためのプローモーターは、例えば、ＣＭＶ，ＥＦ－ｌａ，ＥＦＳ，ＭＳＣＶ，ＰＧＫまたはＣＡＧプローモーターでもある。ｇＲＮＡ発現のためのプローモーターは、例えば、ＨＩ，ＥＦ－ｌａ，ｔＲＮＡまたはＵ６プローモーターでもある。また、前記Ｃａｓタンパク質において、Ｃａｓ９をコーディングする遺伝子の配列は、ＮＬＳ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｉｇｎａｌ）（例：ＳＶ４０ ＮＬＳ）を含むものでもある。一例において、前記プローモーターは、組織特異性または細胞特異性を有するものでもある。
【0038】
前記ＱＰＴ遺伝子またはＱＰＴタンパク質の発現または活性が低減されるように、人為的に行われる遺伝子操作は、ＱＰＴ遺伝子を構成する核酸配列内ＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ－Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ）配列内、またはその５'末端または３'末端に隣接して位置する連続する１ｂｐから５０ｂｐの塩基配列部位内の遺伝子の全部または連続する塩基配列部位の１以上のヌクレオチドの欠失、野生型遺伝子と異なるヌクレオチドへの置換、それぞれ独立して、Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧのうちから選択された１から２３個のヌクレオチドの挿入、または前記変形の組み合わせによるものでもある。
【0039】
一具現例において、前記第２ポリヌクレオチドは、前記植物細胞内の少なくとも１つの対立遺伝子のＱＰＴ遺伝子に結合されるものでもあり、具体的には、全ての対立遺伝子のＱＰＴ遺伝子に結合されるものでもある。全ての対立遺伝子のＱＰＴ遺伝子に第２ポリヌクレオチドが結合し、ＱＰＴ遺伝子をノックアウトさせる場合、同一世代だけではなく、後世代の植物細胞においても、ニコチン生合成が最大に抑制されうる。
【0040】
一具現例において、前記植物細胞において、ＱＰＴ遺伝子をノックアウトさせるために使用したターゲットシーケンスは、例えば、ＱＰＴ遺伝子のエクソン１から８によってなる部位において、少なくとも１つの部位でもあり、さらに具体的には、ＱＰＴ２遺伝子のエクソン１から８の部位でもある。
【0041】
前記ＱＰＴ遺伝子またはＱＰＴタンパク質の発現または活性が低減されるように、人為的に行われる遺伝子操作は、ＱＰＴ遺伝子からコーディングされるタンパク質が、本来の機能を有するタンパク質形態に発現されないようにするものでもある。前記遺伝子の操作は、以下のうち、１以上によって誘導されたものでもある：
１）ＱＰＴ遺伝子の全部または一部の欠失、例えば、ＱＰＴ遺伝子の１ｂｐ以上のヌクレオチド、例えば、１から３０個、１から２７個、１から２５個、１から２３個、１から２０個、１から１５個、１から１０個、１から５個、１から３個、または１個のヌクレオチドの欠失、
２）ＱＰＴ遺伝子の１ｂｐ以上のヌクレオチド、例えば、１から３０個、１から２７個、１から２５個、１から２３個、１から２０個、１から１５個、１から１０個、１から５個、１から３個、または１個のヌクレオチドの本来（野生型）と異なるヌクレオチドへの置換、
３）１以上のヌクレオチド、例えば、１から３０個、１から２７個、１から２５個、１から２３個、１から２０個、１から１５個、１から１０個、１から５個、１から３個、または１個のヌクレオチド（それぞれ独立して、Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧのうちから選択される）のターゲット遺伝子の任意位置への挿入、並びに
４）前記１）から３）のうちから選択された２種以上の組み合わせ。
１）ＱＰＴ遺伝子の全部または一部の欠失、例えば、ＱＰＴ遺伝子の１ｂｐ以上のヌクレオチド、例えば、１から３０個、１から２７個、１から２５個、１から２３個、１から２０個、１から１５個、１から１０個、１から５個、１から３個、または１個のヌクレオチドの欠失、
２）ＱＰＴ遺伝子の１ｂｐ以上のヌクレオチド、例えば、１から３０個、１から２７個、１から２５個、１から２３個、１から２０個、１から１５個、１から１０個、１から５個、１から３個、または１個のヌクレオチドの本来（野生型）と異なるヌクレオチドへの置換、
３）１以上のヌクレオチド、例えば、１から３０個、１から２７個、１から２５個、１から２３個、１から２０個、１から１５個、１から１０個、１から５個、１から３個、または１個のヌクレオチド（それぞれ独立して、Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧのうちから選択される）のターゲット遺伝子の任意位置への挿入、並びに
４）前記１）から３）のうちから選択された２種以上の組み合わせ。
【0042】
前記ＱＰＴ遺伝子の変形される一部（「ターゲット部位」）は、前記遺伝子における、１ｂｐ以上、３ｂｐ以上、５ｂｐ以上、７ｂｐ以上、１０ｂｐ以上、１２ｂｐ以上、１５ｂｐ以上、１７ｂｐ以上、２０ｂｐ以上、例えば、１ｂｐから３０ｂｐ、３ｂｐから３０ｂｐ、５ｂｐから３０ｂｐ、７ｂｐから３０ｂｐ、１０ｂｐから３０ｂｐ、１２ｂｐから３０ｂｐ、１５ｂｐから３０ｂｐ、１７ｂｐから３０ｂｐ、２０ｂｐから３０ｂｐ、１ｂｐから２７ｂｐ、３ｂｐから２７ｂｐ、５ｂｐから２７ｂｐ、７ｂｐから２７ｂｐ、１０ｂｐから２７ｂｐ、１２ｂｐから２７ｂｐ、１５ｂｐから２７ｂｐ、１７ｂｐから２７ｂｐ、２０ｂｐから２７ｂｐ、１ｂｐから２５ｂｐ、３ｂｐから２５ｂｐ、５ｂｐから２５ｂｐ、７ｂｐから２５ｂｐ、１０ｂｐから２５ｂｐ、１２ｂｐから２５ｂｐ、１５ｂｐから２５ｂｐ、１７ｂｐから２５ｂｐ、２０ｂｐから２５ｂｐ、１ｂｐから２３ｂｐ、３ｂｐから２３ｂｐ、５ｂｐから２３ｂｐ、７ｂｐから２３ｂｐ、１０ｂｐから２３ｂｐ、１２ｂｐから２３ｂｐ、１５ｂｐから２３ｂｐ、１７ｂｐから２３ｂｐ、２０ｂｐから２３ｂｐ、１ｂｐから２０ｂｐ、３ｂｐから２０ｂｐ、５ｂｐから２０ｂｐ、７ｂｐから２０ｂｐ、１０ｂｐから２０ｂｐ、１２ｂｐから２０ｂｐ、１５ｂｐから２０ｂｐ、１７ｂｐから２０ｂｐ、２１ｂｐから２５ｂｐ、１８ｂｐから２２ｂｐ、または２１ｂｐから２３ｂｐの連続する塩基配列部位でもある。
【0043】
一例において、前記遺伝子ノックアウトは、まれな切断エンドヌクレアーゼを含む遺伝体校正システムによってターゲットされた遺伝子内の特定部位の一本鎖または二本鎖の切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）を触媒化させてターゲットされた遺伝子であるＱＰＴ遺伝子発現を低減させるものでもある。前記まれな切断エンドヌクレアーゼによって触媒される核酸鎖損傷（ｂｒｅａｋｓ）は、相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）組み換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）または非相同末端連結（ＮＨＥＪ：Ｎｏｎ－Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ Ｅｎｄ Ｊｏｉｎｉｎｇ）のようなメカニズムを介しても修繕される。その場合、ＮＨＥＪメカニズムが起これば、切断位置（ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）において、ＤＮＡ配列に変化が誘発され、それにより、遺伝子が不活性化されうる。ＮＨＥＪを介する修繕は、短い遺伝子断片の置換、挿入または欠失を引き起こし、当該遺伝子ノックアウトの誘導にも使用される。前記変形は、１以上のヌクレオチド、例えば、１から３０ｂｐ、１から２７ｂｐ、１から２５ｂｐ、１から２３ｂｐ、１から２０ｂｐ、１から１５ｂｐ、１から１０ｂｐ、１から５ｂｐ、１から３ｂｐ、または１ｂｐのヌクレオチドの置換、欠失及び／または挿入でもある。
【0044】
前記まれな切断エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（Ｃａｓ９タンパク質）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１（Ｃｐｆ１タンパク質）及びＴＡＬＥ－ヌクレアーゼからなる群のうちから選択された１以上でもある。一具体例において、前記まれな切断エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質でもある。
【0045】
用語である「キメラＲＮＡ」、「キメラガイドＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ」、「単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ））」及び「合成ガイドＲＮＡ」は、相互交換可能に使用され、ガイド配列、ｔｒａｃｒ配列及び／またはｔｒａｃｒメート配列を含むポリヌクレオチド配列を称する。用語「ガイド配列」は、標的部位を指定するガイドＲＮＡ内の約２０ｂｐ配列を称し、用語「ガイド」または「スペーサ」と相互交換可能に使用されうる。また、用語「ｔｒａｃｒメート配列」は、用語「直接反復部」と相互交換可能に使用されうる。前記ガイドＲＮＡは、２つのＲＮＡ、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒＲＮＡ）からなっているものでもあり、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの部分を含み、前記標的ＤＮＡと混成化される一本鎖ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ＲＮＡ））でもある。
【0046】
一般的に、該ガイド配列は、標的配列と混成化され、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を誘導するに十分な、標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。また、ＱＰＴ遺伝子またはＱＰＴタンパク質の発現または活性を低減させるための遺伝子操作に利用することができる塩基配列であるならば、制限なしにガイドＲＮＡとして利用することができ、例えば、前記塩基配列は、ＱＰＴ遺伝子と混成化することができる配列でもある。また、前記ガイドＲＮＡの機能を変形／増進させるために、ガイドＲＮＡ塩基配列の一部分を変形することができる。また、一部具現例において、ガイド配列と、その相応する標的配列との相補性の程度は、適切な整列アルゴリズムを使用して最適に整列される場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上である。最適の整列は、配列を整列するのに適切な任意のアルゴリズムの使用によっても決定され、その非制限的な例は、スミス・ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズム、ニードルマン・ブンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズム、バローズ・ホイーラー変換（Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）に基づくアルゴリズム（例えば、バローズ・ホイーラーアライナ（Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ ａｌｉｇｎｅｒ））、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ）（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳＡ））、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて利用可能）及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて利用可能）を含む。一部具現例において、該ガイド配列は、例えば、約５個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、７５個以上のヌクレオチド長である。一部具現例において、該ガイド配列は、約７５個、５０個、４５個、４０個、３５個、３０個、２５個、２０個、１５個、１２個以下のヌクレオチド長である。標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を誘導するガイド配列の能力は、任意の適切な検定によっても評価される。例えば、試験されるガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲシステムの成分は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ配列の成分をエンコーディングするベクターへのトランスフェクション後、例えば、本願に記述されているようなサーベイヤー検定による標的配列内の優先的な切断の評価によるところのように、相応する標的配列を有する宿主細胞にも提供される。類似して、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、試験されるガイド配列、及び試験ガイド配列と異なる対照群ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の成分を提供し、該標的配列において、試験と対照群とのガイド配列反応間の結合または切断の比率を比較することにより、試験管においても評価される。他の検定が可能であり、当業者に容易に使用されうるであろう。
【0047】
該ガイド配列は、任意の標的配列を標的化するようにも選択される。一部具現例において、該標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。例示的な標的配列は、標的ゲノムにおいて、独特のものを含む。一態様のガイド配列は、配列番号９から１９の塩基配列によってなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドからなる群のうちから選択される少なくとも一つでもあり、具体的には、配列番号１３によってなるポリヌクレオチドを含むｓｇ５、及び／または配列番号１５によってなるポリヌクレオチドを含むｓｇ７に該当するものでもある。前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、少なくとも１以上の配列番号９から１９の塩基配列を含むポリヌクレオチドを含むものでもあり、具体的には、１個、２個または３個以上の配列番号９から１９の塩基配列を含むポリヌクレオチドを含むものでもある。
【0048】
一具現例において、前記遺伝子操作は、前記第１ポリヌクレオチド、前記Ｃａｓ９タンパク質をコーディングする遺伝子、及び前記ＮＬＳをコーディングする遺伝子を含むベクターを形質転換させてもなされる。
【0049】
前記形質転換において、当業界に周知された形質転換方法として、栽培タバコの遺伝子の形質転換が可能な方法であるならば、特別に制限されるものではないが、具体的な例を挙げれば、アグロバクテリウム媒介形質転換法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）媒介プロトプラスト形質転換法、遺伝子ガン法、電極（ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）形質転換法、真空浸潤（ｖａｃｕｕｍ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）形質転換法及び炭化ケイ素繊維媒介形質転換法からなる群のうちから選択された一つによって遂行されるものでもあり、稲の特性と、形質転換率とを考慮するとき、アグロバクテリウム媒介形質転換法を使用することができる。
【0050】
用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、宿主細胞において、目的遺伝子を発現させるための手段を意味する。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター及びバクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターを含む。前記組み換えベクターとしても使用されるベクターは、当業界で折々使用されるプラスミド（例えば、Ｖ２ｋ＿ＧＥ、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ及びｐＵＣ１９など）、ファージまたはウイルス（例えば、ＳＶ４０など）を操作しても作製される。
【0051】
前記ベクターにおいて、前記１ポリヌクレオチド、前述のＣａｓタンパク質またはその変異体をコーディングする遺伝子、及び前記ＮＬＳをコーディングする遺伝子は、プローモーターに作動可能にも連結される。用語「作動可能に連結（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、ヌクレオチド発現調節配列（例えば、プローモーター配列）と異なるヌクレオチド配列間の機能的な結合を意味する。前記調節配列は、「作動可能に連結」されることにより、他のヌクレオチド配列の転写及び／または解読を調節することができる。
【0052】
前記ベクターは、典型的には、クローニングのためのベクター、または発現のためのベクターとしても構築される。前記発現用ベクターは、当業界において、植物、動物または微生物において、外来のタンパク質を発現するところに使用される通常のものを使用することができる。前記ベクターは、当業界に公知された多様な方法を介しても構築される。
【0053】
前記ベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主にしても構築される。例えば、使用されるベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主にする場合には、転写を進めることができる強力なプローモーター（例えば、ＣＭＶプローモーター、ｔｒｐプローモーター、ｌａｃプローモーター、ｔａｃプローモーター、Ｔ７プローモーターなど）、解読開始のためのリボソーム結合サイト、及び転写／解読終結配列を含むものが一般的である。真核細胞を宿主にする場合には、ベクターに含まれる真核細胞で作動する複製原点は、ｆ１複製原点、ＳＶ４０複製原点、ｐＭＢ１複製原点、アデノ複製原点、ＡＡＶ複製原点及びＢＢＶ複製原点などを含むが、それらに限定されるのではない。また、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプローモーター（例えば、メタロチオニンプローモーター）、または哺乳動物ウイルスに由来するプローモーター（例えば、アデノウイルス後期プローモーター、バックシニアウイルス７．５Ｋプローモーター、ＳＶ４０プローモーター、サイトメガロウイルスプローモーター及びＨＳＶのｔｋプローモーター）が利用され、転写終結配列として、ポリアデニル化配列を一般的に有する。
【0054】
他の態様は、前記植物細胞を含む植物を提供する。
【0055】
前記植物は、同一世代だけではなく、後世代においても、ニコチンまたはノルニコチン、アナバシン、及びアナタビンを含むアルカロイドの生合成が抑制された植物でもあり、それにより、続けて、ニコチンまたはノルニコチン、アナバシン、及びアナタビンを含むアルカロイドの生産が低減化された植物を得ることができる。
【0056】
一具体例において、前記植物は、ＱＰＴ２ｓ及びＱＰＴ２ｔが同時に突然変異を誘導された植物でもある。
【0057】
一態様は、配列番号９から１９の塩基配列を含むポリヌクレオチドからなる群のうちから選択される１以上の第１ポリヌクレオチド、または前記１以上の第１ポリヌクレオチドが転写された第２ポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを提供する。
【0058】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ）タンパク質、またはＣａｓタンパク質をコーディングする遺伝子と、ＮＬＳ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｉｇｎａｌ）タンパク質、またはＮＬＳタンパク質をコーディングする遺伝子と、を含むものでもある。
【0059】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに含まれるＣａｓタンパク質は、例えば、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２との知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、またはその相同体またはその変異体を含むものでもある。
【0060】
また、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、植物細胞のＱＰＴ遺伝子またはＱＰＴタンパク質の発現または活性が低減されるように、遺伝的に操作することにより、前記ＱＰＴ遺伝子は、ニコチナ・シルウェストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）に由来するＱＰＴ遺伝子（ＮｔＱＰＴｓ）、及びニコチナ・トメントシフォルミス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ）に由来するＱＰＴ遺伝子（ＮｔＱＰＴｔ）、またはＮｔＱＰＴｓとＮｔＱＰＴｔとの組み合わせでもある。具体的には、前記ＮｔＱＰＴｓは、ＱＰＴ２ｓでもあり、前記ＮｔＱＰＴｔは、ＱＰＴ２ｔでもある。
【0061】
他の態様は、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含むノルニコチン、アナタビン及びアナバシンからなる群のうちから選択される少なくとも１つのアルカロイド生合成抑制用及びニコチン生合成抑制用の組成物を提供する。
【0062】
前記組成物は、配列番号９から１９の塩基配列を含むポリヌクレオチドからなる群のうちから選択される少なくとも１以上のポリヌクレオチドをガイドＲＮＡとして含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含んでおり、ＱＰＴ２ｓ遺伝子及びＱＰＴ２ｔ遺伝子に同型接合突然変異を誘導することができ、ニコチンの生合成が効率的に抑制され、ニコチン以外に、ノルニコチン、アナバシン、アナタビンを含むアルカロイドも、約６８％以上低減させることができる。従って、前記組成物は、発ガン物質であるＴＳＮＡｓ（ＮＮＫ、ＮＮＮ、ＮＡＢ、ＮＡＴ）まで抑制することができる。
【0063】
さらに他の態様は、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含むＱＰＴ遺伝子操作用組成物を提供する。
【0064】
前記操作は、ＱＰＴ２ｓ遺伝子及びＱＰＴ２ｔ遺伝子のいずれにおいても、同型接合突然変異の誘導でもある。
【0065】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに含まれるＣａｓタンパク質は、例えば、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、その相同体またはその変異体を含むものでもある。
【0066】
さらに他の態様は、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含むノルニコチン、アナタビン及びアナバシンからなる群のうちから選択される少なくとも１つのアルカロイド生合成抑制、ニコチン生合成抑制及び／またはＱＰＴ遺伝子操作の用途を提供する。
【0067】
さらに他の態様は、配列番号９から１９の塩基配列を含むポリヌクレオチドからなる群のうちから選択される１以上の第１ポリヌクレオチド、または前記１以上の第１ポリヌクレオチドが転写された第２ポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含むベクターを植物細胞に導入させる段階を含むニコチン生合成が抑制された植物細胞の製造方法を提供する。
【0068】
さらに他の態様は、配列番号９から１９の塩基配列を含むポリヌクレオチドからなる群のうちから選択される１以上の第１ポリヌクレオチド、または前記１以上の第１ポリヌクレオチドが転写された第２ポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含むベクターを植物細胞に導入させる段階を含む植物細胞のＱＰＴ遺伝子操作方法を提供する。
【0069】
前記方法を介して製造されたニコチン生合成が抑制された植物細胞は、栽培タバコである。
【0070】
また、前述の方法を介するＱＰＴ遺伝子操作方法を活用すれば、栽培タバコ植物細胞のＮｔＱＰＴｓ遺伝子及び／またはＮｔＱＰＴｔ遺伝子を効果的に抑制し、ＱＰＴタンパク質の発現または活性が低減され、ニコチンまたはノルニコチン、アナタビン、及びアナバシンからなる群のうちから選択される少なくとも１つのアルカロイド生合成を抑制することができる。
【0071】
重複する内容は、本明細書の複雑性を考慮して省略し、本明細書において、取り立てて定義されていない用語は、本発明が属する技術分野において一般的に使用される意味を有する。
【発明の効果】
【0072】
一態様により、植物細胞内ＱＰＴ遺伝子を遺伝的に操作すれば、ニコチンの生合成が効率的に抑制され、ニコチンが約９７％以上低減され、ニコチン以外に、アルカロイド（ノルニコチン、アナバシン、アナタビン）も、およそ６８％以上低減されるために、発ガン物質であるＴＳＮＡｓ（ＮＮＫ、ＮＮＮ、ＮＡＢ及びＮＡＴ）も低減された植物細胞を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【0073】
【図1】タバコ植物体で起こるニコチン生合成経路を示した図である。
【図2】ＮＣＢＩ ｇｅｎｅ ｂａｎｋに公開されたＱＰＴ遺伝子を比較した結果を示した図である。
【図3】遺伝子キャリア作製に使用した植物発現遺伝子キャリア（Ｖ２ｋ＿ＧＥ）を示した図である。
【図4】植物発現最終遺伝子キャリア及び発現ブロックを示した図であり、具体的には、（Ａ）は、遺伝子キャリア植物用発現ベクターであるＶ２ｋ＿ＧＥ＿Ｑ２を示したものであり、（Ｂ）は、遺伝子ハサミ発現ブロックである最終遺伝子キャリアに含まれた遺伝子ハサミ及び遺伝子ハサミガイドのスキームを示した図である。
【図5】段階別植物組織培養写真を示した図であり、具体的には、（Ａ）は、葉組織を切り、アグロバクテリウムと共に培養して形質転換させる段階であり、（Ｂ）は、カルス分化及びシュート分化を誘導する段階、（Ｃ）は、ルート分化を誘導する段階、（Ｄ）は、分化が完了した小植物体状態を示す。
【図6】野生型（Ａ）と、個体番号９番突然変異型（Ｂ）とのＱＰＴ２＿ｓｙｌ遺伝子塩基配列分析プロファイルを示した図である（単一塩基が挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）された部分は、赤色四角形で表示される）。
【図7】Ｆ１世代突然変異植物体の導入遺伝子存在いかん確認のためのリアルタイムＰＣＲ結果を示した図である。
【図8】バーレー種対照群（ＷＴ）と、突然変異型（ＭＴ）とのＱＰＴｓ遺伝子突然変異様相を示した図であり、具体的には、ＤＮＡ塩基配列（上）をアミノ酸配列（下）で変換して正常ではなく早く終止コドン（別表）が作われるところを確認した図である。
【図9】バーレー種対照群（ＷＴ）と突然変異型（ＭＴ）とのＱＰＴｔ遺伝子突然変異様相を示した図であり、具体的には、ＤＮＡ塩基配列（上）をアミノ酸配列（下）に変換し、正常ではなくいち早く終止コドン（別表）が作われるところを確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【0074】
以下、本発明について、実施例を介し、さらに詳細に説明する。しかしながら、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【0075】
１．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用した低ニコチンタバコ生産
（１）ニコチン生合成遺伝子選定及び遺伝子キャリア作製
タバコ内には、ＱＰＴ１遺伝子及びＱＰＴ２遺伝子が存在し、ニコチン生合成誘導信号である傷あるいはジャスモン酸メチル（ジャスモン酸メチル）処理に反応して発現される遺伝子は、ＱＰＴ２と知られている。
（１）ニコチン生合成遺伝子選定及び遺伝子キャリア作製
タバコ内には、ＱＰＴ１遺伝子及びＱＰＴ２遺伝子が存在し、ニコチン生合成誘導信号である傷あるいはジャスモン酸メチル（ジャスモン酸メチル）処理に反応して発現される遺伝子は、ＱＰＴ２と知られている。
【0076】
それにより、低ニコチン植物細胞を製造するために、ニコチン生合成関連遺伝子ＱＰＴ（Ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を含む２種の遺伝子であるＱＰＴ１及びＱＰＴ２を選定した。
【0077】
（２）ニコチン生合成関連遺伝子（ＮｔＱＰＴ１及びＮｔＱＰＴ２）塩基配列の確認
研究対象植物体であるバーレー（ｂｕｒｌｅｙ）種タバコ（ＫＢ１０８）内のＮｔＱＰＴ遺伝子塩基配列を確認するために、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）データベースに公開された塩基配列情報を基に、各遺伝子に特異的なプライマーを作製し、遺伝子増幅反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、塩基配列分析サービスを依頼した。各遺伝子に特異的なプライマーの配列及びＰＣＲ条件は、下記表１に示した。
研究対象植物体であるバーレー（ｂｕｒｌｅｙ）種タバコ（ＫＢ１０８）内のＮｔＱＰＴ遺伝子塩基配列を確認するために、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）データベースに公開された塩基配列情報を基に、各遺伝子に特異的なプライマーを作製し、遺伝子増幅反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、塩基配列分析サービスを依頼した。各遺伝子に特異的なプライマーの配列及びＰＣＲ条件は、下記表１に示した。
【0078】
【表1】
【0079】
ＫＢ１０８品種のエクソン１～エクソン８を含むｇＤＮＡ領域を増幅し、塩基配列を分析した結果、公開された塩基配列とほとんど一致することを確認することができた。具体的には、ニコチナ・シルウェストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）に由来すると確認されるＱＰＴ２遺伝子（以下、ＱＰＴ２ｓ）遺伝子と、ニコチナ・トメントシフォルミス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ）に由来すると確認されるＱＰＴ２遺伝子（以下、ＱＰＴ２ｔ）との塩基配列情報を確認することができた。具体的には、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ＧｅｎＢａｎｋデータベースに公開されたタバコ（Ｎ．Ｔａｂａｃｕｍ）のＮｔＱＰＴ１（ＡＪ７４８２６２）、ＮｔＱＰＴ２（ＡＪ７４８２６３）遺伝子の塩基配列情報を下記表２に示した。
【0080】
【表2】
【0081】
それにより、前記ＮｔＱＰＴ１遺伝子及び前記ＮｔＱＰＴ２遺伝子の塩基配列を利用し、ＮＣＢＩ参照配列（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と相同遺伝子があるか否かということを比較し、その結果を介して確認した相同性が高い塩基配列リストを下記表３に示した。
【0082】
【表3】
【0083】
前記表３において確認したように、参照配列と類似度が高い８個配列を確認し、それを選別した。表２の公開されたＱＰＴ遺伝子配列と、表３の選別された８種のＱＰＴ遺伝子配列とのＣＤＳ部位塩基配列の相同性類似度を比較し、その結果を表４及び図２に示した。
【0084】
【表4】
【0085】
前述の表４及び図２において確認したように、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋに登録されているＮｔＱＰＴ１（ＡＪ７４８２６２）とＮｔＱＰＴ２（ＡＪ７４８２６３）は、ニコチナ・シルウェストリス（Ｎ．Ｓｙｌｖｅｓｔｒｉ）ｓのＱＰＴ１、ＱＰＴ２遺伝子とそれぞれ９９％以上の相同性を示すので、Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓに由来することを確認し、ニコチナ・トメントシフォルミス（Ｎ．Ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ）に由来するＱＰＴ１とＱＰＴ２との塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋから抜けているということが分かった。また、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ（ＴＮ９０）には、親世代のＮ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｎ．Ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓにそれぞれ由来するＱＰＴ１ｓ（遺伝子ＩＤ：１０７８２５８４９）、ＱＰＴ１ｔ（遺伝子ＩＤ：１０７８２９１２３）、ＱＰＴ２ｓ（遺伝子ＩＤ：１０４２４００１４）、ＱＰＴ２ｔ（遺伝子ＩＤ：１０７８２９１２２）遺伝子が存在することを確認した。
【0086】
（３）遺伝子ハサミブロックデザイン及びキャリア組み換え
ＱＰＴ目標遺伝子だけ特異的に切断することができる遺伝子固有部位１１ヵ所選定し、１つの遺伝子キャリア内の３つの部位を切断することができる遺伝子キャリアを作製した。具体的には、ＮｔＱＰＴ遺伝子のエクソン１からエクソン８の領域に切断位置を選定した。また、ＮｔＱＰＴ２ｓ遺伝子とＮｔＱＰＴ２ｔ遺伝子とのいずれをも切断することができる共通部位を選定し、それを下記表５に示した。
ＱＰＴ目標遺伝子だけ特異的に切断することができる遺伝子固有部位１１ヵ所選定し、１つの遺伝子キャリア内の３つの部位を切断することができる遺伝子キャリアを作製した。具体的には、ＮｔＱＰＴ遺伝子のエクソン１からエクソン８の領域に切断位置を選定した。また、ＮｔＱＰＴ２ｓ遺伝子とＮｔＱＰＴ２ｔ遺伝子とのいずれをも切断することができる共通部位を選定し、それを下記表５に示した。
【0087】
【表5】
【0088】
また、作製した植物発現遺伝子キャリア（Ｖ２ｋ＿ＧＥ、配列番号２０）を図３に示し、前記遺伝子キャリア内に遺伝子ハサミキャリアをクローニングし、最終遺伝子キャリア（Ｖ２ｋ＿ＧＥ＿Ｑ２、配列番号２１）を作製し、それを図４の（Ａ）に、前記最終遺伝子キャリアに含まれた遺伝子ハサミ、及び遺伝子ハサミガイドスキームを図４の（Ｂ）に示した。ｐＢＩ１２１は、Ｅ．ｃｏｌｉとアグロバクテリウムとで複製可能なバイナリーベクターであり、植物形質転換に汎用されている。従って、具体的には、図４の（Ａ）及び（Ｂ）で確認されているように、ｐＢＩ１２１をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩとに切断し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに必要なＧＥ＿ｂｌｏｃｋをクローニングすることができるように準備した。ＧＥ＿ｂｌｏｃｋは、順番通り、ＣａＭＶ ３５Ｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｗｉｔｈ ｄｕａｌ ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｐ＿３５Ｓｄ）、ＴＥＶ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＴＥＶｌｓ）、Ｃａｓ９ブロックをクローニングするためのＭＣＳ（Ｍｕｌｔｉ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ）、ＣａＭＶ３５Ｓ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（Ｔ＿３５Ｓ）、リンカーシーケンス、及びｓｇＲＮＡブロックをクローニングするためのＭＣＳによって構成されており、両端にはＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩとの認識塩基配列が追加されている。ＧＥ＿ｂｌｏｃｋの各ブロックは、ＤＮＡ合成で準備され、順次にクローニングして完成された。ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩとに切断されたｐＢＩ１２１とＧＥ＿ｂｌｏｃｋとをライゲーションし、Ｖ２ｋ＿ＧＥを作製した。
【0089】
Ｃａｓ９＿ｂｌｏｃｋは、Ｃａｓ９ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＣＤＳ）、Ｃ－ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＮＬＳ）によって構成され、両末端には、ＢａｍＨＩとＳａｃＩとの認識塩基配列が追加されたブロック（Ｃａｓ９＿ｂｌｏｃｋ）；並びにｓｇＲＮＡが発現されうるブロック（ｓｇＲＮＡ＿ＱＰＴ）としての、Ｕ６ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｐ＿Ｕ６）及びｓｇＲＮＡ、ｐｏｌｙ Ｔによって構成されたブロック、Ｕ６ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｐ＿Ｕ６）及びｓｇＲＮＡ、そしてｐｏｌｙ Ｔで構成されたブロック；によってなっている。ＱＰＴ遺伝子に特異的に結合することができる１１種類のｓｇＲＮＡブロックをｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ技法を介し、１つの連続したＤＮＡに連結し、ｓｇＲＮＡ＿ＱＰＴを完成させた。ｓｇＲＮＡ＿ＱＰＴの両端には、ＳａｌＩ、ＳｐｅＩの認識塩基配列が存在する。
【0090】
ＢａｍＨＩとＳａｃＩとに切断されたＶ２ｋ＿ＧＥとＣａｓ９＿ｂｌｏｃｋとを、ライゲーション反応を介して繋げ付けた後、ＳａｌＩとＳｐｅＩとに切断し、ｓｇＲＮＡ＿ＱＰＴを挿入し、Ｖ２ｋ＿ＧＥ＿Ｑ２を作製した。
【0091】
（４）遺伝子伝達微生物（アグロバクテリウム）内組み換えキャリアの導入
凍結溶解法（ｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ ｍｅｔｈｏｄ）実験法により、植物用キャリアを、アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４ ｓｔｒａｉｎに形質転換させた。
凍結溶解法（ｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ ｍｅｔｈｏｄ）実験法により、植物用キャリアを、アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４ ｓｔｒａｉｎに形質転換させた。
【0092】
具体的には、アグロバクテリウムを、ＹＥＰ液体培地（酵母エキス（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）１０ｇ、ｂａｃｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅ １０ｇ、ＮａｃＣｌ ５ｇ）に接種した後、１６時間、２８℃、２５０ｒｐｍ条件で振盪培養した。培養液を、３，０００ｇの速度及び４℃条件でもって、２０分間遠心分離して細胞を分離させ、２０ｍＭ ＣａＣｌ２に浮遊させ、コンピテントセルを作った。コンピテントセル１００μＬに、プラスミドＤＮＡ（植物用キャリア）５μＬを添加した後、液体窒素において、５分間、３７℃温度で５分間培養した。ＹＥＰ液体培地１ｍＬを添加し、２８℃、２５０ｒｐｍ条件でもって、２時間振盪培養した。１００μＬ培養液を、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌが含まれたＹＥＰ固体培地にスプレッディングした後、２８℃温度で３日間培養した。単一コロニーをそれぞれ継代培養した後、プラスミドＤＮＡが形質転換されたか否かということをＰＣＲを介して確認した。
【0093】
（５）植物組織培養
１）植物形質転換
アグロバクテリウムをＹＥＰ液体培地（７０ｍｇ／Ｌカナマイシン、７０ｍｇ／Ｌストレプトマイシンを含む）、２８℃条件で２４時間培養した。
１）植物形質転換
アグロバクテリウムをＹＥＰ液体培地（７０ｍｇ／Ｌカナマイシン、７０ｍｇ／Ｌストレプトマイシンを含む）、２８℃条件で２４時間培養した。
【0094】
発芽後１ヵ月経った植物体の葉を、７０％エタノールとラックスとで滅菌した後、３ｍｍＸ３ｍｍサイズ切片に切り、ＭＳ液体培地が５ｍｌ込められているペトリディッシュに切片を載せた後、アグロバクテリウム培養液１ｍＬを等しく振り撒き、２５℃、暗条件で４８時間培養させることにより、タバコ葉切片を準備した。
【0095】
２）植物組織培養
葉切片を２００μｇ／ｍｌセフォタキシムが含まれた滅菌蒸溜水で４回洗浄した後、シューティング培地（ＭＳ培地、２ｍｇ／Ｌ ＢＡ、０．１ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ、２００ｍｇ／Ｌセフォタキシム、１００ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む）に浸し置き、２５℃、１６時間／８時間の光周期条件で培養し、２週ごとに新たな培地に継代培養し、洗浄培地及び選択培地に浸し置いた。
葉切片を２００μｇ／ｍｌセフォタキシムが含まれた滅菌蒸溜水で４回洗浄した後、シューティング培地（ＭＳ培地、２ｍｇ／Ｌ ＢＡ、０．１ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ、２００ｍｇ／Ｌセフォタキシム、１００ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む）に浸し置き、２５℃、１６時間／８時間の光周期条件で培養し、２週ごとに新たな培地に継代培養し、洗浄培地及び選択培地に浸し置いた。
【0096】
また、葉切片に分化されたシュートを切断し、ルーティング培地（２００ｍｇ／Ｌセフォタキシムが含まれたＭＳ培地）に浸し置き、２５℃、１６時間／８時間の光周期条件で培養することにより、ルーティング培地に浸し置いた。
【0097】
前述のようなアグロバクテリウム媒介形質転換（ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）方法により、タバコ葉組織を形質転換させた後（図５の（Ａ））、カルス分化（図５の（Ｂ））、葉分化（図５の（Ｃ））、根分化（図５の（Ｄ））が順に良好になされたことを確認し、組織培養を介し、葉、茎、根を備えた組織培養小植物体個体５７個体を確保した。
【0098】
（６）Ｆ０世代からＦ１世代の突然変異型選別
１）目標遺伝子内突然変異発生いかん、及びその様相の確認
健康な葉組織１００ｍｇをサンプリングし、均一に粉砕した後、シリカカラムを利用する商用化キット（例：Ｎｕｃｌｅｏ ｓｐｉｎ ９６ ｐｌａｎｔ ＩＩ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、ドイツ）を利用してゲノム（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡを抽出して精製した。葉組織からｇＤＮＡを抽出／精製した後、ＰＣＲを介し、目標遺伝子部位を増幅し、塩基配列分析を行った。
１）目標遺伝子内突然変異発生いかん、及びその様相の確認
健康な葉組織１００ｍｇをサンプリングし、均一に粉砕した後、シリカカラムを利用する商用化キット（例：Ｎｕｃｌｅｏ ｓｐｉｎ ９６ ｐｌａｎｔ ＩＩ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、ドイツ）を利用してゲノム（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡを抽出して精製した。葉組織からｇＤＮＡを抽出／精製した後、ＰＣＲを介し、目標遺伝子部位を増幅し、塩基配列分析を行った。
【0099】
具体的には、組織培養体のＱＰＴ２ｓ遺伝子、ＱＰＴ２ｔ遺伝子をそれぞれ増幅し、塩基配列を分析し、ガイド配列であるｓｇ１からｓｇ１１を介する突然変異発生いかん、及びその様相を確認し、それを表６に示した。
【0100】
【表6】
【0101】
前記表６において 確認されるように、ｓｇ５ ｓｇＲＮＡ結合部位の塩基配列において、突然変異が頻繁に誘発されるということを確認した。それ以外に、ｓｇ７及びｓｇ１１の順序で、突然変異が誘発されることを確認した。その後、ＱＰＴ２遺伝子に突然変異が誘導された組織培養体８種を選別完了し、前記組織培養体８個体のＱＰＴ（ＱＰＴ２ｓ及びＱＰＴ２ｔ）遺伝子内突然変異様相を下記表７に示し、野生型（図６の（Ａ））と、表７の個体番号９番突然変異型（図６の（Ｂ））とのＱＰＴ２ｓ遺伝子塩基配列分析プロファイルを図６の（Ａ）及び（Ｂ）に示した。
【0102】
【表7】
【0103】
２）植物体順化（ａｃｃｌｉｍａｔｉｚａｔｉｏｎ）
突然変異が確認された組織培養体８個体を上土が込められた植木鉢に移植し、温室で栽培した。
突然変異が確認された組織培養体８個体を上土が込められた植木鉢に移植し、温室で栽培した。
【0104】
３）Ｆ１世代種子確保、及び導入遺伝子除去の確認
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９発現のために導入された遺伝子ブロックを除去するために、自家受精を介し、Ｆ１世代種子を確保した。前記組織培養体のうち、個体番号９番植物の種子を播種して育てた１９２区トレイに播種し、３０日間育てた後、葉を採取し、均一に粉砕した後、シリカカラムを利用する商用化キット（例：Ｎｕｃｌｅｏ ｓｐｉｎ ９６ ｐｌａｎｔ ＩＩ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、ドイツ）を利用し、ゲノムＤＮＡを抽出して精製した。ＣａＭＶ（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）３５Ｓプローモーター存在いかんを、ＴａｑＭａｎプローブ方式のリアルタイムＰＣＲ技法を利用し、外部導入遺伝子が除去された植物体を選別した。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９発現のために導入された遺伝子ブロックを除去するために、自家受精を介し、Ｆ１世代種子を確保した。前記組織培養体のうち、個体番号９番植物の種子を播種して育てた１９２区トレイに播種し、３０日間育てた後、葉を採取し、均一に粉砕した後、シリカカラムを利用する商用化キット（例：Ｎｕｃｌｅｏ ｓｐｉｎ ９６ ｐｌａｎｔ ＩＩ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、ドイツ）を利用し、ゲノムＤＮＡを抽出して精製した。ＣａＭＶ（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）３５Ｓプローモーター存在いかんを、ＴａｑＭａｎプローブ方式のリアルタイムＰＣＲ技法を利用し、外部導入遺伝子が除去された植物体を選別した。
【0105】
前記組織培養体のうち、個体番号９番植物の種子を播種して育てた１９２個のＦ１世代植物体のｐ３５Ｓプローモーター存在いかんを、リアルタイムＰＣＲで確認し、それを図７に示した。図７において確認されるように、４８個の植物体において、ｐ３５Ｓプローモーターがないことを確認した。
【0106】
４）最終選別されたＦ１世代植物体のＱＰＴ同型接合突然変異型の選別
前記実施例（６）－３）を介して突然変異が示されたｐ３５Ｓ－植物体のうち、目標遺伝子であるＱＰＴ２ｓ遺伝子及びＱＰＴ２ｔ遺伝子に、それぞれ同型接合突然変異（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ）が誘発された植物体ＭＴ＿ＱＰＴ２ｓｔ＿Ｆ１を最終選別した。その後、最終選別された植物体のＱＰＴ２ｓ遺伝子及びＱＰＴ２ｔ遺伝子に係わる突然変異様相を分析し、それを表８に示した。
前記実施例（６）－３）を介して突然変異が示されたｐ３５Ｓ－植物体のうち、目標遺伝子であるＱＰＴ２ｓ遺伝子及びＱＰＴ２ｔ遺伝子に、それぞれ同型接合突然変異（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ）が誘発された植物体ＭＴ＿ＱＰＴ２ｓｔ＿Ｆ１を最終選別した。その後、最終選別された植物体のＱＰＴ２ｓ遺伝子及びＱＰＴ２ｔ遺伝子に係わる突然変異様相を分析し、それを表８に示した。
【0107】
前記分析方法により、ＱＰＴ２遺伝子の突然変異様相を確認するために使用したプライマーは、前記表１に示されている。具体的には、ＱＰＴ２ｓ遺伝子を増幅するために、表１のＦ＿Ｑ２ｓプライマー、Ｒ＿Ｑ２ｓプライマーを使用し、ＱＰＴ２ｔ遺伝子を増幅するために、表１のＦ＿Ｑ２ｔプライマー、Ｒ＿Ｑ２ｔプライマーを使用した。また、塩基配列分析のために、共通してＲ１ｑ＿Ｑ２プライマーを利用し、その場合、使用されたＲ１ｑ＿Ｑ２の塩基配列は、ＧＧＣＣＡＣＡＴＡＴＴＡＧＧＴＡＡＴＴＡＣＡ（配列番号３２）であった。
【0108】
併せて、バーレー種対照群（ＷＴ）と突然変異型ＭＴ＿ＱＰＴ２ｓｔ＿Ｆ１とのＱＰＴ２ｓ遺伝子突然変異様相を図８に示し、バーレー種対照群（ＷＴ）と突然変異型ＭＴ＿ＱＰＴ２ｓｔ＿Ｆ１とのＱＰＴ２ｔ遺伝子突然変異様相を図９に示した。
【0109】
【表8】
【0110】
図８及び図９において確認されるように、ＭＴ＿ＱＰＴ２ｓｔ＿Ｆ１のＱＰＴ２ｓ遺伝子とＱＰＴ２ｔ遺伝子とのＤＮＡ配列を、野生型バーレー種タバコの塩基配列と整列させ、さらにそれをアミノ酸配列に変換し、ＱＰＴ２ｓ及びＱＰＴ２ｔのアミノ酸配列と比較した結果、突然変異型（ＭＴ＿ＱＰＴ２ｓｔ＿Ｆ１）は、正常ではない形で終止コドンがいち早く生成されることを確認した。
【0111】
（７）最終突然変異型遺伝型の分析
前述の実施例を介して選別されたＦ１植物体（ＭＴ＿ＱＰＴ２ｓｔ＿Ｆ１）を、野生型ＫＢ１０８品種と交配させ、Ｆ２交雑品種を得た。その後、それを自家交配させて得られたＦ３植物体のうち、ＱＰＴ２ｓ遺伝子にだけ突然変異が誘導された植物、ＱＰＴ２ｔ遺伝子にだけ突然変異が誘導された植物、ＱＰＴ２ｓ遺伝子とＱＰＴ２ｔ遺伝子とのいずれにも突然変異が誘導された植物をそれぞれ選別し、Ｆ１世代からＦ３世代の最終選別された突然変異型の突然変異様相を下記表９に整理した。
前述の実施例を介して選別されたＦ１植物体（ＭＴ＿ＱＰＴ２ｓｔ＿Ｆ１）を、野生型ＫＢ１０８品種と交配させ、Ｆ２交雑品種を得た。その後、それを自家交配させて得られたＦ３植物体のうち、ＱＰＴ２ｓ遺伝子にだけ突然変異が誘導された植物、ＱＰＴ２ｔ遺伝子にだけ突然変異が誘導された植物、ＱＰＴ２ｓ遺伝子とＱＰＴ２ｔ遺伝子とのいずれにも突然変異が誘導された植物をそれぞれ選別し、Ｆ１世代からＦ３世代の最終選別された突然変異型の突然変異様相を下記表９に整理した。
【0112】
【表9】
【0113】
２．最終選別されたＦ３世代のＱＰＴ突然変異型ニコチン含量分析
ＱＰＴ２遺伝子において、どの遺伝子を非活性化させる場合、タバコのニコチン及びアルカロイドの含量まで具体的に低減させることができるかということを確認するための実験を行った。特に、前記実施例で製造されたＦ３植物体は、それぞれＱＰＴ２ｓ遺伝子だけに突然変異が誘導された植物体、ＱＰＴ２ｔ遺伝子だけに突然変異が誘導された植物体、及びＱＰＴ２ｓ遺伝子とＱＰＴ２ｔ遺伝子とのいずれにも突然変異の誘導された植物体がいずれも存在するので、最終選別されたＭＴ＿ＱＰＴ２ｓ、ＭＴ＿ＱＰＴ２ｔ及びＭＴ＿ＱＰＴ２ｓｔのニコチン及びアルカロイドの含量を確認した。
ＱＰＴ２遺伝子において、どの遺伝子を非活性化させる場合、タバコのニコチン及びアルカロイドの含量まで具体的に低減させることができるかということを確認するための実験を行った。特に、前記実施例で製造されたＦ３植物体は、それぞれＱＰＴ２ｓ遺伝子だけに突然変異が誘導された植物体、ＱＰＴ２ｔ遺伝子だけに突然変異が誘導された植物体、及びＱＰＴ２ｓ遺伝子とＱＰＴ２ｔ遺伝子とのいずれにも突然変異の誘導された植物体がいずれも存在するので、最終選別されたＭＴ＿ＱＰＴ２ｓ、ＭＴ＿ＱＰＴ２ｔ及びＭＴ＿ＱＰＴ２ｓｔのニコチン及びアルカロイドの含量を確認した。
【0114】
温室環境において６０日間栽培した植物体の花軸を切った後、２週後、Ｆ０世代植物体の全ての葉を収穫した。収穫された葉を、６５℃ドライオーブンで４８時間乾燥させた後、ガラスビードが入れられた容器に入れ、ジャイロシェーカーを利用して粉砕した。その後、ＧＣ／ＭＳ分析を介するニコチン含量及びアルカロイドの含量分析を行い、その結果を表１０に示した。
【0115】
【表10】
【0116】
前記表１０において確認されるように、ＫＢ１０８（野生型（ＷＴ））と、前記３種突然変異型とのニコチン含量を定量分析した結果、野生型（ＷＴ）のニコチン含量は、乾燥葉重量基準平均２４．５５ｍｇ／ｇであり、ＱＰＴ２ｓだけの突然変異型試料は、ニコチン含量低減が示されず、ＱＰＴ２ｔだけの突然変異型試料は、野生型より若干減った平均２０．１２ｍｇ／ｇと示されることを確認した。一方、ＱＰＴ２ｓ及びＱＰＴ２ｔに突然変異が示されたＭＴ＿ＱＰＴ２ｓｔにおいては、ニコチンが平均０．６ｍｇ／ｇと、確実にニコチン含量が低減されることを確認した。
【0117】
また、ニコチン以外のアルカロイドにおいても、野生型対比で、ＱＰＴ２ｓ及びＱＰＴ２ｔに突然変異が示されたＭＴ＿ＱＰＴ２ｓｔにおいては、アナバシン、アナタビンは、検出限界値未満に示され、ノルニコチンも、確実に含量が低減されたことを具体的に確認した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5(A)】
【図5(B)】
【図5(C)】
【図5(D)】
【図6(A)】
【図6(B)】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】