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特許7572371養子移入療法（Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）におけるＴリンパ球及びＮＫ細胞の拡大増殖及び分化のための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-15
(45)【発行日】2024-10-23
(54)【発明の名称】養子移入療法（Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）におけるＴリンパ球及びＮＫ細胞の拡大増殖及び分化のための方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20241016BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20241016BHJP
C12N 5/02 20060101ALI20241016BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20241016BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241016BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
C12N5/0783
C12N5/02
A61K35/17
A61P35/00
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2021555590
(86)(22)【出願日】2020-03-09
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-10
(86)【国際出願番号】 CU2020050002
(87)【国際公開番号】W WO2020187340
(87)【国際公開日】2020-09-24
【審査請求日】2023-01-17
(31)【優先権主張番号】CU-2019-0021
(32)【優先日】2019-03-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CU
(73)【特許権者】
【識別番号】500185689
【氏名又は名称】セントロ ド インムノロジア モレキュラー
(73)【特許権者】
【識別番号】521420129
【氏名又は名称】ルートヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ リミテッド
(73)【特許権者】
【識別番号】518196309
【氏名又は名称】サントル オスピタリエ ユニヴェルシテール ヴォドア
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＨＯＳＰＩＴＡＬＩＥＲ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＩＲＥ ＶＡＵＤＯＩＳ
(73)【特許権者】
【識別番号】521420990
【氏名又は名称】ユニバーシティー オブ ローザンヌ
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】レオン モンゾン、カレット
(72)【発明者】
【氏名】モンタルヴォ ベロー、ガリア マジェラ
(72)【発明者】
【氏名】クーコス、ジョルジュ
(72)【発明者】
【氏名】アーヴィング、メリタ
(72)【発明者】
【氏名】クリビオリ、エリザベッタ
(72)【発明者】
【氏名】オルティス ミランダ、ヤケリン
(72)【発明者】
【氏名】コーリア オソリオ、アンゲル デ ヘスス
【審査官】斉藤 貴子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／１３６８１８（ＷＯ，Ａ２）
【文献】国際公開第２００９／０５３１０９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１４－５００８６８（ＪＰ，Ａ）
【文献】RAJAGOPALAN, A. et al.，Aptamer-Targeted Attenuation of IL-2 Signaling in CD8+ T Cells Enhances Antitumor Immunity，Molecular Therapy，2017年，Vol. 25, No. 1，P. 54-61，https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2016.10.021
【文献】HALLETT, W. H. D. et al.，Combination Therapy Using IL-2 and Anti-CD25 Results in Augmented Natural Killer Cell-Mediated Antitumor Responses，Biology of Blood and Marrow Transplantation，2008年10月，Vol. 14, Iss. 10，P. 1088-1099，https://doi.org/10.1016/j.bbmt.2008.08.001
【文献】BLAESCHKE, F. et al.，Induction of a central memory and stem cell memory phenotype in functionally active CD4+ and CD8+ CAR T cells produced in an automated good manufacturing practice system for the treatment of CD19+ acute lymphoblastic leukemia，Cancer Immunology, Immunotherapy，2018年，Vol. 67, No. 7，P. 1053-1066，DOI: 10.1007/s00262-018-2155-7
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
養子細胞移入療法（Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）において有用なセントラルメモリー表現型を有する、Ｔリンパ球及びＮＫ細胞の分化及び拡大増殖のための方法であって、２つの段階：ｉ）対象から抽出されたリンパ球系細胞の提供と、
ｉｉ）中間親和性ＩＬ－２受容体（ＩＬ２Ｒβγ）を介した優先的シグナル伝達を誘導しながらの、さらに遺伝子操作された、Ｔリンパ球及びＮＫ細胞のインビトロ拡大増殖及び分化と、
を含み、
リンパ球系細胞を拡大増殖しながら中間親和性ＩＬ２受容体（ＩＬ２Ｒβγ）を介した優先的シグナル伝達を誘導するための戦略が、
中間親和性ＩＬ２Ｒ（ＩＬ２Ｒβγ）と優先的に相互作用し、中間親和性ＩＬ２Ｒ（ＩＬ２Ｒβγ）を介して優先的にシグナル伝達する可溶性ＩＬ－２変異タンパク質とともにリンパ球系細胞を培養すること、及び
中間親和性ＩＬ２Ｒと優先的に相互作用し、中間親和性ＩＬ２Ｒを介して優先的にシグナル伝達するＩＬ２変異タンパク質を分泌するようにリンパ球系細胞を遺伝子操作することからなる群から選択され、
前記ＩＬ－２変異タンパク質が、
配列番号１、
配列番号２、
配列番号３、
配列番号４、
配列番号５、
配列番号６及び
配列番号７、
からなる群から選択される、方法。
【請求項2】
段階（ｉｉ）における中間親和性ＩＬ－２受容体によるシグナル伝達が、細胞培養の異なる時点で起こり得る、又は該シグナル伝達がインビトロ(ｉｎ ｖｉｔｒｏ)及びインビボ(ｉｎ ｖｉｖｏ)で維持され得る、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
移入された細胞の持続性並びにより高いインビトロ(ｉｎ ｖｉｔｒｏ)及びインビボ(ｉｎ ｖｉｖｏ)抗腫瘍効果を延長するための、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
請求項１に記載の培養する工程が、さらに、
ＩＬ１２、
ＩＬ１７、
ＩＬ１５及び
ＩＬ２１、
からなる群から選択される他のサイトカインと組み合わせて培養することを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記リンパ球系細胞が、以下のいずれか：Ｔ細胞の混合物；精製されたＣＤ４又はＣＤ８ Ｔ細胞；ＮＫ細胞；ＮＫＴ細胞であり得る、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記リンパ球系細胞が、ＣＡＲを発現し、所望の特異性のＴＣＲを発現し、細胞膜中で目的の他の受容体を発現し、目的の異なるサイトカイン又は可溶性タンパク質を分泌するようにさらに操作され得る、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記リンパ球系細胞が、腫瘍浸潤リンパ球又はキメラ抗原受容体Ｔ細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
養子細胞移入療法のための治療薬の製造における、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法により分化及び拡大増殖されたＴリンパ球及びＮＫ細胞の使用。
【請求項9】
前記養子細胞移入療法が、がんの治療のためのものである、請求項８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオテクノロジー及び免疫腫瘍学の分野に関する。本発明は、所望のセントラルメモリー表現型を有するリンパ球系細胞を得るための方法、及びがん患者における養子細胞移入療法のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
インターロイキン－２（ＩＬ２）は、分子的に特性決定されることが発見された最初のサイトカインであった。ＩＬ２は、主に、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の成長及び拡大増殖を支援することが示された（Ｍｏｒｇａｎら、１９７６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９３（４２５７）：１００７－１００８）。ＩＬ２は１９９２年に臨床使用が承認されたが、その受容体の生物学の正確な説明は依然として研究中である（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，２０１４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９２（１２）：５４５１－８；Ｓｍｉｔｈ，２００６，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４７６（９４３３）：５－３）。高用量でのＩＬ２投与（ＨＤ ＩＬ２）は、がん免疫療法として使用される。全身性ＨＤ ＩＬ２治療は、黒色腫及び腎がんがん腫の患者において長期の応答をもたらすが、比較的少ない割合の患者に過ぎない。さらに、全身性ＨＤ ＩＬ２治療は有意な毒性を誘発し、その臨床的妥当性をさらに制限する（Ａｔｋｉｎｓ，２００６，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１２：２３５３－２３５８）。
【0003】
ＩＬ２は、ＩＬ２Ｒαサブユニット（ＣＤ２５）のみを含有する低親和性受容体（Ｋｄ約１０－８Ｍ）；ＩＬ２Ｒβ及びＩＬ２Ｒγサブユニット（ＣＤ１２２及びＣＤ１３２）によって形成される中間親和性受容体（Ｋｄ約１０－９Ｍ）；及び３つのサブユニットＩＬ２Ｒα、ＩＬ２Ｒβ及びＩＬ２Ｒγを含有する高親和性受容体（Ｋｄ約１０－１１Ｍ）というリンパ球系細胞上の３種類の受容体（ＩＬ２Ｒ）と相互作用する。中間親和性受容体（ＩＬ２Ｒβγ）及び高親和性受容体（ＩＬ２Ｒαβγ）のみが機能的であり、細胞にシグナルを伝達することができる（Ｓｔａｕｂｅｒら、２００５，ＰＮＡＳ，１０３（８）：２７８８－２７９３；Ｗａｎｇ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１０（１８）：１１５９－１１６３）。
【0004】
ＩＬ２Ｒβ及びＩＬ２Ｒγサブユニットは免疫系のエフェクターリンパ球系細胞上に存在するが、ＩＬ２Ｒαサブユニットの恒常的発現は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に高親和性受容体を与え、したがってインビボにおいてＩＬ２の優先的使用を与える（Ｍａｌｅｋ，２００８，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２６：４５３－７９）。今日、がん患者における全身性ＨＤ ＩＬ２療法の有効性に対する制限の一部は、Ｔｒｅｇの優先的なＩＬ２駆動性拡大増殖によるものであり、次いで、これが抗腫瘍免疫を弱めることが知られている（Ｃｈｏｏ Ｓｉｍら、２０１４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１２４（１）：９９－１１０）。
【0005】
がんに対する全身性ＨＤ ＩＬ２療法の有効性を改善するために多くの試みがなされてきた。いくつかの研究は、リンパ球系細胞上のＩＬ２受容体サブユニットの差次的発現に基づいて、その生物学的特性の一部を増加又は減少させるように天然のＩＬ２を変異させることが可能であることを示している（Ｓｋｒｏｍｂｏｌａｓ ａｎｄ Ｆｒｅｌｉｎｇｅｒ，２０１４，Ｅｘｐｅｒｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０（２）：２０７－２１７））。初期の研究は、ＩＬ２Ｒαに対するＩＬ２親和性の増強に集中した（Ｒａｏら、２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１６（１２）：１０８１－１０８７）。その時点では明らかではなかったが、この戦略はＴｒｅｇの大規模な刺激の結果として、インビボで免疫応答を実際に下方制御することが現在理解されている。より最近になって、Ｌｅｖｉｎらは、中間親和性ＩＬ２受容体を過剰発現するエフェクター細胞を優先的に活性化する、ＩＬ２Ｒβサブユニットへの結合が増強されたＩＬ２変異体を１９９２年に得た（Ｌｅｖｉｎら、２０１２，Ｎａｔｕｒｅ，４８４（７３９５）：５２９－３３）。「スーパーカインＨ９」と呼ばれるこの変異タンパク質（ムテイン）は、改善されたインビボ抗腫瘍効果及び天然のＩＬ２より低い毒性を示した。Ｃａｒｍｅｎａｔｅらは、ヒトＩＬ２中への４つの変異の導入を報告し、これは二量体中間親和性受容体（ＩＬ２Ｒβγ）との相互作用に影響を及ぼすことなくＩＬ２Ｒαに対する親和性を効率的に低下させた。この変異タンパク質は、インビボで投与された場合、Ｔｒｅｇの拡大増殖を回避し、マウスモデルにおいて、天然のＩＬ２より効果的で、より低い毒性をもたらした（Ｃａｒｍｅｎａｔｅら、２０１３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９０（１２）：６２３０－８）。２つの他のＩＬ２変異タンパク質、すなわちＦ４２Ｋ及びＲ３８Ａも、ＩＬ２Ｒαに対するＩＬ２結合親和性を大幅に低下させ、インビトロ(ｉｎ ｖｉｔｒｏ)でＴｒｅｇを刺激することにおいてより低い効果を示したが、ＬＡＫ細胞を効果的に拡大増殖する（Ｈｅａｔｏｎら、１９９４，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．，１（３）：１９８－２０３）．
【0006】
全身性ＨＤ ＩＬ２療法を改善するための別の試みにおいて、いくつかの研究は、ＩＬ２のＰＥＧ化又は抗体（Ａｂ）のＦｃ部分へのＩＬ２の融合によって半減期を延長することに焦点を当てた。実際、これらの戦略のいくつかは、インビボでのＩＬ２寿命の効果的な増加をもたらし、全体的な抗腫瘍効果にプラスの影響を与えた（Ｚｈｕら、２０１５；Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２７：４９８－５０１；Ｃｈａｒｙｃｈら、２０１６，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２２（３）：６８０－９０）。
【0007】
養子細胞移入（ＡＣＴ）は、ドナーから細胞を回収し、インビトロで培養及び／又は操作し、次いで疾患の治療のために患者に投与する治療方法として定義される。がんの治療のために、ＡＣＴはしばしばリンパ球の移入を伴う（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉら、２００６，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎ．，６：３８３－３９３）。今日、ａ）エクスビボ（ｅx ｖｉｖｏ）拡大増殖された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の使用；ｂ）腫瘍抗原由来ペプチドに対して高いアフィニティ／アビディティでＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように遺伝子操作されたＴ細胞またＮＫ細胞の使用；ｃ）腫瘍抗原に対して特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作されたＴ細胞又はＮＫ細胞の使用、という３つの主な治療様式が普及している。多くの場合、後者の戦略は、インビボでリンパ球のエフェクター機能を増強するために、移入されたリンパ球のさらなる遺伝子操作、例えば、ＩＬ１２及びその他のような適切なサイトカインの分泌を操作することと組み合わされる。（Ｃａｓｓｉａｎ Ｙ．，２０１８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５１：１９７－２０３。
【0008】
抗腫瘍免疫を誘導する能力にもかかわらず、がんを治療するためのＡＣＴの広範な適用は、いくつかの周知の限界を有する。腫瘍反応性Ｔエフェクター細胞の移入は客観的応答を引き起こし得るが、ヒト及びマウスの両方において、セントラルメモリー表現型を有するＴ細胞が抗腫瘍応答の優れたメディエーターであることを実証する強固な証拠が存在する（Ｋｌｅｂａｎｏｆｆら、２００５，ＰＮＡＳ，１０２（２７）：９５７１－６）。セントラルメモリーＴ細胞は、末梢リンパ節への遊走に必要なＣＤ６２Ｌ分子を発現する、抗原を経験した細胞（ＣＤ４４＋）である（Ｒｉｄｅｌｌら、２０１４，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．，２０（２）：１４１－１４４）。抗原に再度遭遇したときに（ＴＣＦ１＋）、増殖し、ＩＬ２などのサイトカインを分泌する能力がより大きいためである可能性が最も高いが、セントラルメモリーＴ細胞はインビボでより長く持続する。対照的に、エフェクターメモリーＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ分子の有意な下方制御、阻害性受容体（ＰＤ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３）の上方制御、及びサイトカイン放出の障害を有する、抗原を経験した細胞である。エフェクターメモリーＴ細胞は、インビボで次第に疲弊する傾向がある（Ｋｉｓｈｔｏｎら、２０１７，Ｃｅｌｌ．Ｍｅｔａｂ．，２６（１）：９４－１０９；Ｋｌｅｂａｎｏｆｆら、２００５，ＰＮＡＳ，１０２（２７）：９５７１－６）。したがって、セントラルメモリー表現型を有する細胞の拡大増殖を促進する培養条件は、より良好なＡＣＴがん免疫療法を開発するために非常に望まれている。
【0009】
ＩＬ２は、インビトロでＴ細胞及びＮＫ細胞の活性化及び拡大増殖を促進し、したがって、がんのためのＡＣＴ療法の開発において主要な役割を果たしてきた。初期の戦略では、ＩＬ２は、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞を作製するために使用された。ＬＡＫの全身性ＨＤ ＩＬ２との同時投与は、全身性単独療法の臨床応答を増加させた。他のアプローチでは、腫瘍抽出物から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を主に拡大増殖させるために、高濃度のＩＬ２が使用される。ＴＩＬは、インビトロにおいて、ＴＣＲ刺激と組み合わせたＩＬ２の存在下でさらに急速な拡大増殖を経験する。拡大増殖されたＴＩＬは、全身性ＨＤ ＩＬ２レジームとともにがん患者に注入される。全身性ＨＤ ＩＬ２レジームは、移入された細胞のインビボでの持続性を維持するのに寄与する。全体的な結果として、ＴＩＬ＋ＨＤ ＩＬ２による治療は、いくつかの印象的な大きな腫瘍退縮をもたらしたが、全身性ＨＤ ＩＬ２療法の公知の限界を保持した（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，２０１４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９２（１２）５４５１－８）。ＡＣＴに対する補助として、全身性ＨＤ ＩＬ２の効力を増大させるためのより最近の試みでは、互いに対しては特異的に結合するが、野生型のヒト対応物には結合しない変異体ＩＬ２サイトカインと変異体ＩＬ２受容体を使用して、受容体－リガンドのオルソゴナル化（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）に基づく方法が開発された。この戦略を用いて、著者らは、操作された移入Ｔ細胞の選択的拡大増殖のために、オルソゴナルなＩＬ－２サイトカイン－受容体対を使用して、ＩＬ２の特異性を操作されたＴ細胞の方向に向け直すが、オフターゲット活性は限定的で、毒性は無視できる程度である。オルソＩＬ２中で拡大増殖されたオルソＩＬ２Ｒ Ｔ細胞は、ＡＣＴのマウスがんモデルにおいて使用した場合、腫瘍体積を低下させ、生存率を増加させる上で有効であった（Ｓｏｃｋｏｌｏｓｋｙら、２０１８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５９（６３７９）：１０３７－１０４２）。
【0010】
ＡＣＴに関連するＴ細胞応答を調節するためのＩＬ２の独特かつ効果的な役割にもかかわらず、メモリーＴ細胞の拡大増殖／分化に対するＩＬ２の正確な効果（正又は負の）は完全には理解されていない。ＩＬ２の存在下においてインビトロで拡大増殖させた細胞は強いエフェクター能力を示し、これも、インビボでの細胞の長期持続性及び生存を短縮する。ＩＬ２は、独特の様式でＴ細胞の活性化及び増殖を促進するが、活性化によって誘発される細胞死も誘導する（Ｓｐｏｌｓｋｉら、２０１８，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（１８）６４８－６５９）。研究により、インビトロ初回抗原刺激中のＩＬ２シグナル伝達を低下させることは、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の発達を促進し得ることが示されている。ＩＬ２シグナル伝達の減少は、主に、ＩＬ２濃度を低下させることによって又はインビトロ培養中の曝露時間を短縮することによって達成されている。他の著者らは、ＩＬ２の使用を共通のγ鎖ファミリーからの他のサイトカインで部分的に置き換えている。インビトロでのＴ細胞の活性化及び拡大増殖のための多くの戦略は、異なるプロトコルでＩＬ７、ＩＬ１５又はＩＬ２１を使用するが、典型的にはいくらかのＩＬ２と組み合わされる（Ｈｉｎｒｉｃｈｓら、２００８；Ｂｌｏｏｄ，１１１（１１）５３２６－５３３３；Ｍｕｅｌｌｅｒら、２００８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３８（１０）２８７４－８５；Ｚｅｎｇら、２００５，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０１（１）１３９－４８；Ｍａｒｋｌｅｙ ａｎｄ Ｓａｄｅｌａｉｎ，２０１０，Ｂｌｏｏｄ，１１５（１７）３５０８－３５１９；Ｚｈａｎｇら、２０１５，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２１（１０）：２２７８－８８）。したがって、ＩＬ２は、ＡＣＴ免疫療法におけるＴ細胞の活性化及び拡大増殖のための標準であり続けている。
【0011】
興味深いことに、ＩＬ２／ＩＬ２Ｒ相互作用の複雑さ及びＴ細胞分化に対するその意義は不明なままである。特に、インビトロでのリンパ球系細胞の拡大増殖／分化に対する、異なるＩＬ２Ｒ（高親和性対中間親和性）を介した優先的シグナル伝達の影響は、不明なままである。上記のＩＬ２変異タンパク質はいずれも、ＡＣＴのためにインビトロでＴ細胞を拡大増殖及び分化させるためにこれまで使用されておらず、ＩＬ２Ｒの周知の機能的形態の１つを介してＩＬ２シグナル伝達を優先的に導くためにＩＬ２／ＩＬ２Ｒ相互作用を合理的に改変する戦略も使用されたことがなかった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0012】
本出願の発明者らは、驚くべきことに、インビトロでの細胞活性化／拡大増殖中にＩＬ２／ＩＬ２Ｒα相互作用を破壊することによって、中間親和性ＩＬ２Ｒを介するようにＩＬ２シグナルを優先的に誘導する異なる薬剤／戦略を使用するときに、大きな利点を見出した。このような薬剤／戦略は、ある時点で天然のＩＬ２シグナル伝達を使用する従来の培養戦略と比較して、顕著なセントラルメモリー表現型及び巨大抗原特異的な殺滅能力を有する腫瘍特異的細胞の効率的な拡大増殖を誘導する。本発明は、がん患者において養子移入療法に対して使用する前に、インビトロで細胞を拡大増殖／分化するための現在のプロトコルを大幅に改善することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】天然のＩＬ２とともに又はＩＬ２Ｒβγを介して優先的シグナル伝達をするＩＬ２変異タンパク質とともに培養された場合に得られるＴ細胞表現型の比較である。Ａ）培養生存率、Ｂ）メモリー細胞及びエフェクター細胞の割合。
【図2】広範囲の用量で、天然のＩＬ２又は中間親和性受容体ＩＬ２Ｒβγを介して優先的にシグナル伝達するＩＬ２変異タンパク質とともに培養された場合にＴ細胞上に回収された表現型の比較である。Ａ）培養生存率、Ｂ）ＰＤ１陽性細胞の割合及びＣ）セントラルメモリー様表現型を有する細胞の割合。
【図3】ＩＬ７及びＩＬ１５サイトカインと組み合わせて、天然のＩＬ２又は中間親和性受容体ＩＬ２Ｒβγを介して優先的にシグナル伝達するＩＬ２変異タンパク質とともに培養された場合にＴ細胞上に回収された表現型の比較である Ａ）培養生存率、Ｂ）メモリー細胞及びエフェクター細胞の割合。
【図4】ＩＬ７及びＩＬ１５と組み合わせて、広範囲の用量で、天然のＩＬ２又は中間親和性受容体ＩＬ２Ｒβγを介して優先的にシグナル伝達するＩＬ２変異タンパク質とともに培養された場合にＴ細胞上に回収された表現型の比較である。Ａ）培養生存率、Ｂ）ＰＤ１陽性細胞の割合、及びＣ）セントラルメモリー様表現型を有する細胞の割合。
【図5】ＩＬ２もしくはＩＬ２変異タンパク質のみで、又はＩＬ７及びＩＬ１５と組み合わせたＩＬ２もしくはＩＬ２変異タンパク質で刺激された場合にＴ細胞上に回収された表現型の比較である。
【図6A】Ｔ細胞におけるＩＬ２又はＩＬ２変異タンパク質に対する形質導入の効率を測定する、ｅＧＦＰ陽性細胞の割合を示すヒストグラムである。
【図6B】天然のＩＬ２又はＩＬ２変異タンパク質を産生するためにＴリンパ球が形質導入された場合に、培養物中に回収されたセントラルメモリー及びエフェクターメモリー表現型を有する細胞の割合の比較である。
【図7A】異なるｓｈＲＮＡ構築物による形質導入後のＣＤ２５下方制御の効率を示すヒストグラムである。
【図7B】Ｔリンパ球がＣＤ２５の発現を低下させた場合のセントラルメモリー及びエフェクターメモリー表現型を有する細胞の割合である。
【図8】ＣＤ８＋Ｔ細胞に対して抗ＣＤ２５抗体を使用した場合のＩＬ２Ｒβγに偏ったＩＬ２シグナル伝達を提供することの効果の比較である Ａ）培養生存率及びＢ）メモリー細胞及びエフェクター細胞の割合。
【図9】ＩＬ２単独、ＩＬ２＋ＩＬ１５＋ＩＬ７、ＩＬ２－変異タンパク質単独又はＩＬ２－変異タンパク質＋ＩＬ１５＋ＩＬ７によるＣＤ８＋Ｔ細胞の機能的能力である。Ａ）ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬで再刺激されたＯＴＩ ＣＤ ８＋Ｔ細胞によるグランザイムβ産生、Ｂ）ＩＬ２、ＩＬ２変異タンパク質単独とともに又はＩＬ７及びＩＬ１５と組み合わせて培養されたＯＴ１細胞のＢ１６－ＯＶＡ細胞に対する腫瘍殺傷能力。
【図10】天然のＩＬ２又はＩＬ２変異タンパク質とともに培養されたＯＴ１細胞を受容したＭＢ１６ＯＶＡ腫瘍担持動物における腫瘍体積の測定である。
【図11】天然のＩＬ２又は中間親和性受容体ＩＬ２Ｒβγを介して優先的にシグナル伝達するＩＬ２変異タンパク質を産生するように形質導入されたＯＴ１ Ｔ細胞の抗腫瘍インビボ効果の比較である。Ａ）腫瘍体積、Ｂ）経時的な生存。
【図12】ＩＬ２又はＩＬ２変異タンパク質とともに培養する前及び後のＣＤ８＋ＴＩＬの特性決定である：Ａ）拡大増殖レベル、Ｂ）ＴＩＬによるＫｉ－６７発現割合、及びＣ）ナイーブＴ細胞（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４４－）、セントラルメモリー（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４４＋）及び（ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ４４＋）の分布。
【図13】ＩＬ２又はＩＬ２変異タンパク質とともに培養する前及び後のＣＤ８＋ＴＩＬの特性決定である：Ａ）阻害性マーカーの発現の割合、並びにＢ）ＩＦＮγ、ＴＮＦα及びグランザイムβ。
【図14】ＩＬ２又はＩＬ２変異タンパク質とともに培養されたＴＩＬにおけるＮＫ細胞の拡大増殖である：Ａ）ＮＫ細胞の割合及びＢ）ＮＫ細胞数。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明は、セントラルメモリー表現型を有するリンパ球の濃縮及び拡大増殖のためのインビトロ又はエクスビボ方法であって、対象から得られた試料中のリンパ球又はこのような試料から単離されたリンパ球を拡大増殖することを含み、拡大増殖することがβ／γ二量体ＩＬ－２受容体の活性化を含む、方法を提供する。
【0015】
本発明は、セントラルメモリー表現型を有するリンパ球の濃縮及び拡大増殖のためのインビトロ又はエクスビボ方法であって、対象から得られた試料中のリンパ球又はこのような試料から単離されたリンパ球を拡大増殖することを含み、拡大増殖することがβ／γ二量体ＩＬ－２受容体の活性化を含む、方法を提供する。
【0016】
本発明は、養子細胞移入療法において使用するためのセントラルメモリー表現型を有するリンパ球の濃縮及び拡大増殖のための方法であって、拡大増殖することがβ／γ二量体ＩＬ－２受容体の活性化を含む、方法を提供する。
【0017】
本発明は、３つの段階を含む、養子細胞移入療法において有用なセントラルメモリー表現型を有するリンパ球系細胞集団の拡大増殖及び／又は分化のための方法に関する。前記段階は、
ｉ）対象からのリンパ球系細胞の抽出、
ｉｉ）中間親和性ＩＬ－２受容体を介した優先的シグナル伝達（以下では、ＩＬ２Ｒβγに偏ったＩＬ２シグナル伝達と称する）を誘導しながらの、リンパ球系細胞又は必要に応じて、さらに遺伝子操作されたリンパ球系細胞のインビトロ拡大増殖、及び
ｉｉｉ）がんを有する対象中への活性化された／拡大増殖された細胞の移入、
である。
ｉ）対象からのリンパ球系細胞の抽出、
ｉｉ）中間親和性ＩＬ－２受容体を介した優先的シグナル伝達（以下では、ＩＬ２Ｒβγに偏ったＩＬ２シグナル伝達と称する）を誘導しながらの、リンパ球系細胞又は必要に応じて、さらに遺伝子操作されたリンパ球系細胞のインビトロ拡大増殖、及び
ｉｉｉ）がんを有する対象中への活性化された／拡大増殖された細胞の移入、
である。
【0018】
特に、この方法は、リンパ球系細胞を活性化／拡大増殖させながら、中間親和性ＩＬ２受容体を介した優先的シグナル伝達を誘導する（ＩＬ２Ｒβγに偏ったＩＬ２シグナル伝達を提供する）ための様々な戦略を使用する。これらの戦略は、以下のいずれかとすることができる。
－中間親和性ＩＬ２Ｒを介して優先的にシグナル伝達する可溶性ＩＬ－２変異タンパク質とともにリンパ球系細胞を培養すること。
－中間親和性ＩＬ２Ｒを介して優先的にシグナル伝達するＩＬ２変異タンパク質を分泌するためのリンパ球系細胞の遺伝子改変。
－リンパ球系細胞を天然のＩＬ－２とともに培養するが、
ａ）ＩＬ２－ＩＬ２Ｒα相互作用を遮断する薬剤を添加する、又は
ｂ）ＩＬ２－ＩＬ２Ｒα相互作用を遮断する可溶性タンパク質を分泌するためのリンパ球系細胞を遺伝子操作すること、又は
ｃ）細胞表面におけるＩＬ２Ｒα受容体サブユニット（ＣＤ２５）の発現を減少させるために、リンパ球系細胞を遺伝子操作すること、又は
ｄ）細胞表面における中間親和性ＩＬ－２受容体の発現を増加させるために、リンパ球系細胞を遺伝子操作すること。
－中間親和性ＩＬ２Ｒを介して優先的にシグナル伝達する可溶性ＩＬ－２変異タンパク質とともにリンパ球系細胞を培養すること。
－中間親和性ＩＬ２Ｒを介して優先的にシグナル伝達するＩＬ２変異タンパク質を分泌するためのリンパ球系細胞の遺伝子改変。
－リンパ球系細胞を天然のＩＬ－２とともに培養するが、
ａ）ＩＬ２－ＩＬ２Ｒα相互作用を遮断する薬剤を添加する、又は
ｂ）ＩＬ２－ＩＬ２Ｒα相互作用を遮断する可溶性タンパク質を分泌するためのリンパ球系細胞を遺伝子操作すること、又は
ｃ）細胞表面におけるＩＬ２Ｒα受容体サブユニット（ＣＤ２５）の発現を減少させるために、リンパ球系細胞を遺伝子操作すること、又は
ｄ）細胞表面における中間親和性ＩＬ－２受容体の発現を増加させるために、リンパ球系細胞を遺伝子操作すること。
【0019】
より具体的には、
本方法で使用されるＩＬ－２変異タンパク質は、本発明の配列番号１～６に対応する米国特許第９，２０６，２４３号に記載されているもの、本出願の配列番号７に対応するＬｅｖｉｎらによって２０１２年に開示されたＳｕｐｅｒｋｉｎｅ Ｈ９、並びに本発明の配列番号８に対応する国際公開第２０１７／２０２７８６号の配列番号１に記載されたＦ４２変異タンパク質を含む。しかし、これらの分子に限定されるものではない（Ｌｅｖｉｎら：Ｎａｔｕｒｅ（２０１２）．４８：５２９－５３５）。
本方法で使用されるＩＬ－２変異タンパク質は、本発明の配列番号１～６に対応する米国特許第９，２０６，２４３号に記載されているもの、本出願の配列番号７に対応するＬｅｖｉｎらによって２０１２年に開示されたＳｕｐｅｒｋｉｎｅ Ｈ９、並びに本発明の配列番号８に対応する国際公開第２０１７／２０２７８６号の配列番号１に記載されたＦ４２変異タンパク質を含む。しかし、これらの分子に限定されるものではない（Ｌｅｖｉｎら：Ｎａｔｕｒｅ（２０１２）．４８：５２９－５３５）。
【0020】
ＩＬ２－ＩＬ２Ｒα相互作用を遮断する使用される薬剤は、ＩＬ２Ｒα又はＩＬ２のいずれかに結合する抗体又は抗体断片；ＩＬ２Ｒα又はＩＬ２のいずれかに結合するペプチド又は化学的に定義された小分子；ＩＬ２Ｒαの可溶性形態（ＣＤ２５）又はその改変されたバリアントから選択される。しかし、これらに限定されない。
【0021】
本方法の段階ｉｉにおいて、ＩＬ２Ｒβγに偏ったＩＬ２シグナル伝達は、リンパ球系細胞の培養／拡大増殖の異なる時点で提供され得る。ＩＬ２Ｒβγに偏ったＩＬ２シグナル伝達は、インビトロ培養中のすべての時間に又は一部の時間のみに提供され得る。さらに、ＩＬ２Ｒβγに偏ったＩＬ２シグナル伝達は、細胞のインビボ移入後に維持され得る又は維持され得ない。
【0022】
段階ｉｉでは、リンパ球系細胞の拡大増殖は、他のサイトカイン、例えばＩＬ１２、ＩＬ１７、ＩＬ１５及びＩＬ２１の存在下で行われることができ、又は行われることができない。
【0023】
段階ｉｉｉでは、細胞移入は、段階ｉのドナー対象中に又は異なる対象中に行うことができる。
【0024】
いくつかの実施形態において、セントラルメモリー表現型を有するリンパ球の拡大増殖は、さらなるホルモン、サイトカイン、及びリンパ球拡大増殖のために最適化された培養条件の使用を含む。
【0025】
方法の対象となるリンパ球系細胞は、以下のいずれでもあり得る：Ｔ細胞の混合物、精製されたＣＤ４又はＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞。リンパ球系細胞は、末梢血単核球、腫瘍排出リンパ節又は腫瘍浸潤物から段階ｉにおいて取得することができる。
【0026】
本方法におけるリンパ球系細胞は、ＣＡＲを発現し、所望の特異性のＴＣＲを発現し、細胞膜中で関心対象の他の受容体を発現し、関心対象の異なるサイトカイン又は可溶性タンパク質を分泌するようにさらに操作された可能性があり、又は可能性がない。
【0027】
全体として、本発明の方法は、移入された細胞の持続性及びより高い抗腫瘍効果をエクスビボ、インビトロ及びインビボで延長することを可能にする。
【0028】
特定の実施形態において、試料は、排出リンパ節から得られる。他の実施形態において、試料は、処理されていない腫瘍断片、酵素処理された腫瘍断片、解離された／懸濁された腫瘍細胞、リンパ節試料又は体液（例えば、血液、腹水、又はリンパ）試料である。
【0029】
特定の実施形態において、対象はヒトである。
【0030】
別の態様では、腫瘍を治療することを必要とする対象において腫瘍を治療する方法であって、本明細書中に開示されている方法によって作製されたリンパ球の有効量を対象に投与する工程を含む、方法が本明細書中に記載されている。特定の実施形態では、腫瘍は固形腫瘍である。特定の実施形態では、腫瘍は液性腫瘍である。
【0031】
本発明の別の主題は、養子細胞移入療法における、具体的には腫瘍浸潤リンパ球又はキメラ抗原受容体Ｔを取得することにおける、より具体的にはがんの治療における前記方法の使用である。
【0032】
本発明の方法によって取得された細胞も本発明の主題である。
【0033】
発明の詳細な説明
本発明は、セントラルメモリー表現型を有するリンパ球の濃縮及び拡大増殖のためのエクスビボ方法であって、対象から得られた試料中のリンパ球又はこのような試料から単離されたリンパ球を拡大増殖することを含み、拡大増殖することがβ／γ二量体ＩＬ－２受容体の活性化を含む、方法を提供する。
本発明は、セントラルメモリー表現型を有するリンパ球の濃縮及び拡大増殖のためのエクスビボ方法であって、対象から得られた試料中のリンパ球又はこのような試料から単離されたリンパ球を拡大増殖することを含み、拡大増殖することがβ／γ二量体ＩＬ－２受容体の活性化を含む、方法を提供する。
【0034】
本発明は、セントラルメモリー表現型を有するリンパ球の濃縮及び拡大増殖のためのインビトロ方法であって、対象から得られた試料中のリンパ球又はこのような試料から単離されたリンパ球を拡大増殖することを含み、拡大増殖することがβ／γ二量体ＩＬ－２受容体の活性化を含む、方法を提供する。
【0035】
本発明は、養子細胞移入療法において使用するためのセントラルメモリー表現型を有するリンパ球の濃縮及び拡大増殖のための方法であって、拡大増殖することがβγ二量体ＩＬ－２受容体の活性化を含む、方法を提供する。
【0036】
本発明は、ＡＣＴ療法におけるその使用のために、エクスビボ、インビトロ及びインビボで、Ｔリンパ球上のＩＬ２受容体を介したシグナル伝達を変化させることに依存する。本発明は、リンパ球系細胞のインビボでの移入前に、リンパ球系細胞のインビトロでの活性化及び拡大増殖のために使用される天然のＩＬ２（及びその天然由来シグナル）を、中間親和性ＩＬ－２受容体を介した優先的シグナル伝達を誘導する（ＩＬ２Ｒβγに偏ったＩＬ２シグナルを誘導する）ＩＬ２様代替物で置換することを主に提案する。換言すれば、ＩＬ２様代替物は、ＩＬ２－二量体受容体（ＩＬ２Ｒβγ）と優先的に相互作用し、ＩＬ２－二量体受容体を介してシグナル伝達するように指示される。このような代替物には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：
－中間親和性ＩＬ２Ｒ（ＩＬ２Ｒβγ）を介して優先的に相互作用及びシグナル伝達する可溶性ＩＬ－２変異タンパク質を用いてリンパ球系細胞を培養すること。
－中間親和性ＩＬ２Ｒを介して優先的にシグナル伝達するＩＬ２変異タンパク質を分泌するためのリンパ球系細胞の遺伝子操作。
－リンパ球系細胞を天然のＩＬ－２の存在下で培養するが、
ａ）ＩＬ２－ＩＬ２Ｒα相互作用を遮断する薬剤を添加する、又は
ｂ）ＩＬ２－ＩＬ２Ｒα相互作用を遮断する可溶性タンパク質を分泌するためにリンパ球系細胞を遺伝子操作すること、又は
ｃ）細胞表面におけるＩＬ２Ｒα受容体サブユニット（ＣＤ２５）の発現を減少させるために、リンパ球系細胞を遺伝子操作すること、又は
ｄ）細胞表面における中間親和性ＩＬ－２受容体の発現を増加させるために、リンパ球系細胞を遺伝子操作すること。
－中間親和性ＩＬ２Ｒ（ＩＬ２Ｒβγ）を介して優先的に相互作用及びシグナル伝達する可溶性ＩＬ－２変異タンパク質を用いてリンパ球系細胞を培養すること。
－中間親和性ＩＬ２Ｒを介して優先的にシグナル伝達するＩＬ２変異タンパク質を分泌するためのリンパ球系細胞の遺伝子操作。
－リンパ球系細胞を天然のＩＬ－２の存在下で培養するが、
ａ）ＩＬ２－ＩＬ２Ｒα相互作用を遮断する薬剤を添加する、又は
ｂ）ＩＬ２－ＩＬ２Ｒα相互作用を遮断する可溶性タンパク質を分泌するためにリンパ球系細胞を遺伝子操作すること、又は
ｃ）細胞表面におけるＩＬ２Ｒα受容体サブユニット（ＣＤ２５）の発現を減少させるために、リンパ球系細胞を遺伝子操作すること、又は
ｄ）細胞表面における中間親和性ＩＬ－２受容体の発現を増加させるために、リンパ球系細胞を遺伝子操作すること。
【0037】
本明細書に開示される方法は、インビボで移入された場合に腫瘍制御に非常に有効な、セントラルメモリー表現型を有する活性化されたリンパ球系細胞を生成／拡大増殖させるための戦略を提供する。本発明は、ＡＣＴ療法のための現在の戦略の実質的な改善に相当する。
【0038】
本発明の方法によるリンパ球系細胞の培養は、免疫細胞のインビトロ培養のための適切な培養培地を使用し、適切な環境条件下で行うことができる。リンパ球系細胞の拡大増殖は、他のサイトカイン、例えばＩＬ１２、ＩＬ１７、ＩＬ１５及びＩＬ２１の存在下で行うこともできる。リンパ球系細胞の拡大増殖は、ＡＣＴに関して報告されたプロトコルのいずれにも従うことができる。天然のＩＬ２がこれらのプロトコルにおいて使用される培養段階では、天然のＩＬ２によって提供されるシグナルを置換するために、本明細書に詳細に記載されているＩＬ２様代替物のいずれもが使用される。
【0039】
本方法におけるリンパ球系細胞は、ＣＡＲを発現し、所望の特異性のＴＣＲを発現し、細胞膜中で関心対象の他の受容体を発現し、関心対象の異なるサイトカイン又は可溶性タンパク質を分泌するようにさらに操作された可能性があり、又は可能性がない。
【0040】
方法の対象となるリンパ球系細胞は、以下のいずれでもあり得る：Ｔ細胞の混合物、精製されたＣＤ４又はＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞。リンパ球系細胞は、ＰＢＭＣ、腫瘍排出リンパ節又は腫瘍浸潤物から得ることができるであろう。
【0041】
「ＩＬ２変異タンパク質」、「ｎｏα－変異タンパク質」、「ｎｏα－ＩＬ２－変異タンパク質」、「ＩＬ－２変異タンパク質」、「部分アゴニストＩＬ２」又は「変異体ＩＬ２」という用語は、本明細書で互換的に使用され、変異されたインターロイキン２タンパク質又は改変されたインターロイキン２タンパク質を指し、変異は、β／γ二量体ＩＬ－２受容体の活性化を誘導し、ＩＬ２二量体受容体（ＩＬ２Ｒβγ）と優先的に相互作用し、ＩＬ２Ｒβγに偏ったＩＬ２シグナルを誘導し、ＩＬ２Ｒαに対して低下した親和性を有し、又はβ／γＩＬ２受容体に対してより高い親和性を有する。これらの変異された又は修飾されたＩＬ２変異タンパク質の非限定的な例は、配列１～７である。
【0042】
「リンパ球」又は「リンパ球系細胞」という用語は、本明細書では互換的に使用され、リンパ球、リンパ芽球及び形質細胞を含む、動物の免疫を媒介する任意の細胞を指す。本発明のいくつかの実施形態において、この用語は、抗原に対する可変の細胞表面受容体を有し、適応免疫応答を担う白血球のクラスを指す。リンパ球は、自然免疫応答及び適応免疫応答を媒介することができる。リンパ球は体液性及び細胞性免疫を媒介することができる。
【0043】
本発明において提案される戦略は、がん治療のためのＡＣＴ療法における治療目的のために使用することができる。
【0044】
本発明は、腫瘍を治療することを必要とする対象において腫瘍を治療する方法であって、本明細書中に開示される方法によって得られたセントラルメモリー表現型を有するリンパ球の集団の有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、腫瘍は固形腫瘍（例えば、卵巣腫瘍、黒色腫、肺腫瘍、胃腸腫瘍、乳房腫瘍）である。特定の実施形態において、腫瘍は液性腫瘍（例えば、白血病又はリンパ腫）である。特定の実施形態において、腫瘍は、腫瘍抗原を含む少なくとも１つのペプチドと一致する変異を発現する。特定の実施形態において、対象はヒトである。
【0045】
中間親和性ＩＬ２Ｒ（ＩＬ２Ｒβγ）と優先的に相互作用し、したがって中間親和性ＩＬ２Ｒ（ＩＬ２Ｒβγ）を介してシグナル伝達する、ＩＬ２由来の操作されたサイトカインの使用。
本発明の一実施形態は、ＩＬ２変異タンパク質を使用して、Ｔ細胞活性化及び拡大増殖プロトコルの間に中間親和性二量体ＩＬ２受容体－ＩＬ２Ｒβγ－を介したＩＬ２シグナル伝達を特異的に誘導することに関する。ＩＬ２変異タンパク質には、低下したＩＬ２Ｒα相互作用親和性を有するバリアント、例えば米国特許第９，２０６，２４３号に記載されているもの；増加したＩＬ２Ｒβ相互作用親和性を有するバリアント、例えば、Ｌｅｖｉｎら、２０１２に記載されているスーパーカインＨ９；又は両方の組み合わせを有するバリアント（より少ないＩＬ２Ｒα、より多いＩＬ２Ｒβ相互作用親和性）が含まれるが、これらに限定されない。リンパ球は、特異的ＴＣＲシグナル伝達、ＣＤ３／ＣＤ２８活性化及び／又は他の生存サイトカインと組み合わせたこれらの変異タンパク質で活性化される。このＩＬ２様シグナルは、培養全体にわたって維持することができ、又は培養の特定の段階で使用することができ、優先的には最初の活性化時点の間に提供されるべきである。変異タンパク質は、１ｎｇ／ｍｌ～１ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で使用することができる。
本発明の一実施形態は、ＩＬ２変異タンパク質を使用して、Ｔ細胞活性化及び拡大増殖プロトコルの間に中間親和性二量体ＩＬ２受容体－ＩＬ２Ｒβγ－を介したＩＬ２シグナル伝達を特異的に誘導することに関する。ＩＬ２変異タンパク質には、低下したＩＬ２Ｒα相互作用親和性を有するバリアント、例えば米国特許第９，２０６，２４３号に記載されているもの；増加したＩＬ２Ｒβ相互作用親和性を有するバリアント、例えば、Ｌｅｖｉｎら、２０１２に記載されているスーパーカインＨ９；又は両方の組み合わせを有するバリアント（より少ないＩＬ２Ｒα、より多いＩＬ２Ｒβ相互作用親和性）が含まれるが、これらに限定されない。リンパ球は、特異的ＴＣＲシグナル伝達、ＣＤ３／ＣＤ２８活性化及び／又は他の生存サイトカインと組み合わせたこれらの変異タンパク質で活性化される。このＩＬ２様シグナルは、培養全体にわたって維持することができ、又は培養の特定の段階で使用することができ、優先的には最初の活性化時点の間に提供されるべきである。変異タンパク質は、１ｎｇ／ｍｌ～１ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で使用することができる。
【0046】
リンパ球系細胞の拡大増殖は、ＡＣＴに関して報告されたプロトコルのいずれにも従うことができる。しかし、元のプロトコルにおいて天然のＩＬ２が使用される培養段階では、代わりにＩＬ２変異タンパク質が添加される。例えば、これは、抗体抗ＣＤ３／ＣＤ２８及びＩＬ２変異タンパク質とともに細胞を培養することにのみ基づくプロトコルであり得、又はＩＬ２変異タンパク質をＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ１２及びＩＬ２１などの他のサイトカインと組み合わせることができる。
【0047】
中間親和性ＩＬ２Ｒ（ＩＬ２Ｒβγ）を介して優先的にシグナル伝達するＩＬ２変異タンパク質を分泌させるためにリンパ球系細胞を遺伝子操作する。
本発明の他の実施形態は、本発明で言及されるＩＬ２変異タンパク質のいずれかを分泌するようにリンパ球系細胞を遺伝子改変することに関する。リンパ球系細胞の改変は、ＡＣＴ技術との関連で広く使用されている十分に記載された形質移入又は形質導入方法のいずれをも用いて行うことができる。例えば、これは、変異タンパク質の遺伝子を有する構築物をＴ細胞上に導入するためにゲノム編集技術又はウイルスベクターを使用して達成することができる。構築物は、形質導入有効性を容易に追跡するためのレポータータンパク質及び形質導入された画分を濃縮するための抗生物質耐性遺伝子も含み得る。
本発明の他の実施形態は、本発明で言及されるＩＬ２変異タンパク質のいずれかを分泌するようにリンパ球系細胞を遺伝子改変することに関する。リンパ球系細胞の改変は、ＡＣＴ技術との関連で広く使用されている十分に記載された形質移入又は形質導入方法のいずれをも用いて行うことができる。例えば、これは、変異タンパク質の遺伝子を有する構築物をＴ細胞上に導入するためにゲノム編集技術又はウイルスベクターを使用して達成することができる。構築物は、形質導入有効性を容易に追跡するためのレポータータンパク質及び形質導入された画分を濃縮するための抗生物質耐性遺伝子も含み得る。
【0048】
形質移入／形質導入の効率は高くすべきである。少なくとも、インビトロ拡大増殖中にリンパ球系細胞が自己分泌性のＩＬ２Ｒβγに偏ったＩＬ２シグナルを自己に与えることを許容するのに十分に高い。この特定の手順は、インビボでの移入後にＩＬ２Ｒβγに偏ったＩＬ２シグナルの利用可能性をリンパ球系細胞に与えることができ、細胞の持続性及び抗腫瘍能にさらに寄与する。
【0049】
操作されたリンパ球系細胞の細胞拡大増殖は、ＡＣＴに関連して報告されたプロトコルのいずれにも従うことができるが、培養物に天然のＩＬ２は一切添加しない。例えば、リンパ球系細胞は、特異的ＴＣＲシグナル伝達、ＣＤ３／ＣＤ２８活性化単独で、及び／又はＩＬ７、ＩＬ１５及びＩＬ２１のような生存サイトカインを補充して活性化され得る。
【0050】
ＩＬ２－ＩＬ２Ｒα相互作用を破壊する薬剤をリンパ球系細胞培養物中に添加すること。
本発明の他の実施形態は、天然のＩＬ２がＡＣＴのためのインビトロリンパ球系細胞拡大増殖において使用される間に、ＩＬ２／ＩＬ２Ｒα相互作用を薬理学的に破壊する様々な方法に関する。このような薬剤の添加は、高親和性三量体ＩＬ２ＲへのＩＬ２のアクセスを遮断することによって、天然のＩＬ２のシグナルをＩＬ２Ｒβγに偏ったＩＬ２シグナルに変える。
本発明の他の実施形態は、天然のＩＬ２がＡＣＴのためのインビトロリンパ球系細胞拡大増殖において使用される間に、ＩＬ２／ＩＬ２Ｒα相互作用を薬理学的に破壊する様々な方法に関する。このような薬剤の添加は、高親和性三量体ＩＬ２ＲへのＩＬ２のアクセスを遮断することによって、天然のＩＬ２のシグナルをＩＬ２Ｒβγに偏ったＩＬ２シグナルに変える。
【0051】
活性化／拡大増殖プロトコルは、特異的ＴＣＲシグナル伝達、ＣＤ３／ＣＤ２８活性化及び他の関心対象のサイトカインを組み合わせることができる。薬剤及びＩＬ２は、常に一緒に使用され、同時に培養時に添加されるべきである。得られたＩＬ２Ｒβγに偏ったＩＬ２シグナルは、培養全体にわたって維持することができ、又は培養の特定の段階で使用することができ、優先的には最初の活性化期間の間に提供されるべきである。薬剤は、その遮断能力を強化するために過剰に使用されるべきである。具体的な量は、ＩＬ２のＣＤ２５への結合を遮断する能力を確認しながら、個別的に較正されるべきである。
【0052】
ＩＬ２－ＩＬ２Ｒα相互作用を遮断するために使用される薬剤には、本発明において、ＩＬ２Ｒα又はＩＬ２のいずれかに結合する抗体又は抗体断片；ＩＬ２Ｒα又はＩＬ２のいずれかに結合するペプチド又は化学的に定義された小分子；ＩＬ２Ｒαの可溶性形態（ＣＤ２５）又はその改変されたバリアントが含まれるが、これらに限定されない。
【0053】
ＩＬ２に結合する薬剤の場合には、ＩＬ２に結合する薬剤は、ＩＬ２Ｒβγを介した結合及びシグナル伝達に影響を及ぼすことなく、ＩＬ２Ｒαとの相互作用のみを遮断する能力について検証されるべきである。これらの薬剤は、培養物中のＩＬ２に別々に添加することができるが、所望の複合体の形成を促進するために予めＩＬ２と混合することもできる。
【0054】
この実施形態におけるリンパ球系細胞の拡大増殖は、ＡＣＴに関して報告されたプロトコルのいずれにも従うことができる。しかし、天然のＩＬ２が元のプロトコルで使用される培養段階では、薬剤も添加される。例えば、これは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ ｍＡｂ及びＩＬ２＋遮断剤とともに細胞を培養することのみに基づくプロトコルであり得、又はＩＬ２＋遮断剤をＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ１２及びＩＬ２１などの他のサイトカインと組み合わせることができる。
【0055】
ＩＬ２とＩＬ２Ｒαの間の相互作用を遮断する可溶性タンパク質を分泌するためのリンパ球系細胞の遺伝子操作。
本発明の他の実施形態は、ＩＬ２とＩＬ２Ｒαの間の相互作用を特異的に遮断する可溶性タンパク質を分泌するようにリンパ球系細胞を遺伝子改変することに関する。リンパ球系細胞の改変は、ＡＣＴ技術との関連で広く使用されている十分に記載された形質移入又は形質導入方法のいずれをも用いて行うことができる。例えば、これは、所望のタンパク質の遺伝子を有する構築物をＴ細胞上に導入するためにゲノム編集技術又はウイルスベクターを使用して達成することができる。形質移入／形質導入の効率は高くすべきである。少なくとも、リンパ球系細胞がＩＬ２－ＩＬ２Ｒα相互作用を有意に遮断するのに十分な可溶性タンパク質を産生することを許容するのに十分な高さであり、インビトロ拡大増殖中にＩＬ２Ｒβγに偏ったＩＬ２シグナルをリンパ球系細胞自身に付与する。
本発明の他の実施形態は、ＩＬ２とＩＬ２Ｒαの間の相互作用を特異的に遮断する可溶性タンパク質を分泌するようにリンパ球系細胞を遺伝子改変することに関する。リンパ球系細胞の改変は、ＡＣＴ技術との関連で広く使用されている十分に記載された形質移入又は形質導入方法のいずれをも用いて行うことができる。例えば、これは、所望のタンパク質の遺伝子を有する構築物をＴ細胞上に導入するためにゲノム編集技術又はウイルスベクターを使用して達成することができる。形質移入／形質導入の効率は高くすべきである。少なくとも、リンパ球系細胞がＩＬ２－ＩＬ２Ｒα相互作用を有意に遮断するのに十分な可溶性タンパク質を産生することを許容するのに十分な高さであり、インビトロ拡大増殖中にＩＬ２Ｒβγに偏ったＩＬ２シグナルをリンパ球系細胞自身に付与する。
【0056】
本発明においてＩＬ２－ＩＬ２Ｒα相互作用を遮断するために使用され得るタンパク質には、ＩＬ２Ｒα又はＩＬ２のいずれかに結合する抗体又は抗体断片；可溶性形態のＩＬ２Ｒα（ＣＤ２５）又は任意の改変されたバリアントが含まれるが、これらに限定されない。
【0057】
この実施形態におけるリンパ球系細胞の拡大増殖は、ＡＣＴに関して報告されたプロトコルのいずれにも従うことができる。この場合には、いかなる変形もないが、細胞を操作するために厳密に必要なものである。例えば、抗体抗ＣＤ３／ＣＤ２８及びＩＬ２とともに細胞を培養する際に、又はＩＬ２をＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ１２及びＩＬ２１などの他のサイトカインと組み合わせることができる。
【0058】
リンパ球系細胞を遺伝子操作して、細胞表面におけるＩＬ２Ｒα受容体サブユニット（ＣＤ２５）の発現を減少させること。
本発明の別の実施形態は、細胞表面におけるＩＬ２Ｒαの発現を低下させるためのリンパ球系細胞の遺伝子改変に関する。細胞工学のために、干渉ＲＮＡ、ゲノム編集技術及びノックアウト戦略を含むがこれらに限定されないいくつかの戦略を使用することができる。リンパ球系細胞の改変は、ＡＣＴ技術に関して広く使用されているよく記載された形質移入又は形質導入方法のいずれによっても行うことができる。例えば、リンパ球系細胞上のＣＤ２５発現の低下又は完全な抑制は、ＣＤ２５の遺伝子を標的とするｓｈＲＮＡを有する構築物を細胞上に導入するためにウイルスベクターを使用して達成することができる。
本発明の別の実施形態は、細胞表面におけるＩＬ２Ｒαの発現を低下させるためのリンパ球系細胞の遺伝子改変に関する。細胞工学のために、干渉ＲＮＡ、ゲノム編集技術及びノックアウト戦略を含むがこれらに限定されないいくつかの戦略を使用することができる。リンパ球系細胞の改変は、ＡＣＴ技術に関して広く使用されているよく記載された形質移入又は形質導入方法のいずれによっても行うことができる。例えば、リンパ球系細胞上のＣＤ２５発現の低下又は完全な抑制は、ＣＤ２５の遺伝子を標的とするｓｈＲＮＡを有する構築物を細胞上に導入するためにウイルスベクターを使用して達成することができる。
【0059】
この実施形態におけるリンパ球系細胞の拡大増殖は、ＡＣＴに関して報告されたプロトコルのいずれにも従うことができる。この場合には、いかなる変形もないが、細胞を遺伝子操作するために厳密に必要なものである。例えば、操作された細胞は、抗体抗ＣＤ３／ＣＤ２８及びＩＬ２とともに培養することができ、又はＩＬ２をＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ１２及びＩＬ２１などの他のサイトカインと組み合わせることができる。
【0060】
リンパ球系細胞を遺伝子操作して、細胞表面での中間親和性ＩＬ－２受容体の発現を増加させる
本発明の別の実施形態は、細胞表面上の二量体受容体ＩＬ２Ｒβγの発現を増加させるために、リンパ球系細胞を遺伝子改変することに関する。これは、恒常的発現プロモーター下でＣＤ１２２（ＩＬ２Ｒβ鎖）遺伝子（ｇｅｎ）又はＣＤ１３２（ＩＬ２Ｒγ鎖）遺伝子（ｇｅｎ）を有する構築物をＴ細胞上に導入するためにウイルスベクターを使用して達成することができる。あるいは、この戦略のために、Ｔ細胞は、天然のＣＤ１２２の代わりに増加したＩＬ２親和性を有する変異されたＣＤ１２２（ＩＬ２Ｒβ鎖）を発現するように改変することができる。これは、変異された又は野生型のＣＤ１２２の遺伝子（ｇｅｎ）を有する構築物をリンパ球系細胞上に導入するためにゲノム編集技術又はウイルスベクターを使用して達成することができる。
本発明の別の実施形態は、細胞表面上の二量体受容体ＩＬ２Ｒβγの発現を増加させるために、リンパ球系細胞を遺伝子改変することに関する。これは、恒常的発現プロモーター下でＣＤ１２２（ＩＬ２Ｒβ鎖）遺伝子（ｇｅｎ）又はＣＤ１３２（ＩＬ２Ｒγ鎖）遺伝子（ｇｅｎ）を有する構築物をＴ細胞上に導入するためにウイルスベクターを使用して達成することができる。あるいは、この戦略のために、Ｔ細胞は、天然のＣＤ１２２の代わりに増加したＩＬ２親和性を有する変異されたＣＤ１２２（ＩＬ２Ｒβ鎖）を発現するように改変することができる。これは、変異された又は野生型のＣＤ１２２の遺伝子（ｇｅｎ）を有する構築物をリンパ球系細胞上に導入するためにゲノム編集技術又はウイルスベクターを使用して達成することができる。
【0061】
記載された戦略では、構築物は、形質導入有効性を容易に追跡するためのレポータータンパク質及び形質導入された画分を濃縮するための抗生物質耐性遺伝子（ｇｅｎ）も含有し得る。
【0062】
この実施形態におけるリンパ球系細胞の拡大増殖は、ＡＣＴに関して報告されたプロトコルのいずれにも従うことができる。この場合には、いかなる変形もないが、細胞を遺伝子操作するために厳密に必要なものである。例えば、操作された細胞は、抗体抗ＣＤ３／ＣＤ２８及びＩＬ２とともに培養することができ、又はＩＬ２をＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ１２及びＩＬ２１などの他のサイトカインと組み合わせることができる。
【0063】
治療方法
関連する態様では、腫瘍を治療することを必要とする対象において腫瘍を治療する方法であって、本明細書に開示されている方法によって作製されたリンパ球の集団の有効量を対象に投与することを含む、方法が本明細書に開示される。特定の実施形態では、腫瘍は固形腫瘍である。特定の実施形態では、腫瘍は液性腫瘍（例えば、血液がん）である。
関連する態様では、腫瘍を治療することを必要とする対象において腫瘍を治療する方法であって、本明細書に開示されている方法によって作製されたリンパ球の集団の有効量を対象に投与することを含む、方法が本明細書に開示される。特定の実施形態では、腫瘍は固形腫瘍である。特定の実施形態では、腫瘍は液性腫瘍（例えば、血液がん）である。
【実施例】
【0064】
例１．ＩＬ２Ｒβγを介して優先的にシグナル伝達するＩＬ２変異タンパク質による天然のＩＬ２の置換は、リンパ球の生存性を維持し、セントラルメモリー様表現型を付与する。
ナイーブＯＴ１マウス脾臓からＣＤ８＋Ｔ細胞を単離する。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８でコーティングされたビーズをＴＣＲ刺激として７日間、天然のＩＬ２又はＩＬ２変異タンパク質とともに１０日間使用し、ＩＬ２変異タンパク質は分子免疫学センターにおいて得られ（バッチ１２０１６０２）、米国特許第９，２０６，２４３号の配列番号６に開示されている。２日ごとに培養物を拡大増殖させて密度を１×１０６に保ち、サイトカインを新鮮な培地とともに添加する。多数のＴ細胞の拡大増殖の成功は、両方の培養条件において達成され、細胞数の同様の増加倍数が観察される。図１Ａは、ＩＬ２変異タンパク質を使用した場合、天然のＩＬ２と比較して培養物中の生存率が改善されることを示す（ｐ＜０．０００１）。さらに、メモリー細胞の量及び阻害マーカーの発現をフローサイトメトリーによって測定した。ＩＬ２変異タンパク質を使用した場合、天然のＩＬ２と比較して、セントラルメモリー様表現型（ＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４４＋によって定義される）を有する細胞の有意に高い割合が細胞において観察された（図１Ｂ）。ＰＤ－１、Ｌａｇ－３、Ｔｉｍ－３及びＴｉｇｉｔマーカーの表現型分析は、ＩＬ２－変異タンパク質活性化された細胞が免疫チェックポイントリガンド（ＰＤ－１、Ｌａｇ－３、Ｔｉｍ－３、Ｔｉｇｉｔ）の発現を抑制することを示した（表１）。
【0065】
【表1】
【0066】
【0067】
総合すると、これらの結果は、優先的なＩＬ２Ｒβγ刺激を有するＩＬ２変異タンパク質による天然のＩＬ２の置換が、天然のＩＬ２によって誘導される十分に記載されたエフェクター表現型ではなく、セントラルメモリー表現型を促進することを示している。ＩＬ２変異タンパク質は、インビボ移入のためにより望ましい表現型であるリンパ系再循環（より多くのＣＤ６２Ｌ発現）及び疲弊に対する耐性（より少ないＰＤ１発現）の可能性を天然のＩＬ２よりも多く付与する。
【0068】
例２．ＩＬ２Ｒβγを介して優先的にシグナル伝達するＩＬ２変異タンパク質による天然のＩＬ２の置換は、ＩＬ７及びＩＬ１５を用いる組み合わせ培養プロトコルにおいてセントラルメモリー表現型を促進する。
他の著者らによって以前に記載されたように、ＩＬ７及びＩＬ１５のＩＬ２との組み合わせは、ＩＬ２単独と比較された場合、Ｔ細胞の適応性を改善する（Ｒｅｄｅｋｅｒ ａｎｄ Ａｒｅｎｓ，２０１６，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６（７）：３４５）。本発明者らの実験では、ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞活性化／拡大増殖プロトコルのために、天然のＩＬ２又はＩＬ２変異タンパク質をＩＬ７及びＩＬ１５と培養中で組み合わせた。
他の著者らによって以前に記載されたように、ＩＬ７及びＩＬ１５のＩＬ２との組み合わせは、ＩＬ２単独と比較された場合、Ｔ細胞の適応性を改善する（Ｒｅｄｅｋｅｒ ａｎｄ Ａｒｅｎｓ，２０１６，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６（７）：３４５）。本発明者らの実験では、ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞活性化／拡大増殖プロトコルのために、天然のＩＬ２又はＩＬ２変異タンパク質をＩＬ７及びＩＬ１５と培養中で組み合わせた。
【0069】
この戦略では、例１に記載したのと同じＴＣＲ刺激を使用した。天然のＩＬ２又はＩＬ２変異タンパク質を培養開始時に５日目まで添加し、次いで細胞をＩＬ７／ＩＬ１５中に１０日間維持する。このシナリオでは、両培養条件は、培養中に類似の細胞密度、高い生存率を与え（図３Ａ）、エフェクター細胞よりむしろメモリー細胞の優勢を促進する。しかしながら、ＩＬ２変異タンパク質の使用は、図３Ｂに示されているように、天然のＩＬ２と比較して、培養におけるより高い割合のセントラルメモリー細胞を示した（ｐ＜０．００１５）。
【0070】
同時に、変異タンパク質とともに培養された細胞は、表２に示されているように疲弊マーカーのより少ない発現を示した。
【0071】
【表2】
【0072】
ＩＬ７／ＩＬ１５と組み合わされた天然のＩＬ２及びＩＬ２変異タンパク質の両方について、培養での異なる濃度の評価は、記載された効果が、生存率（図４Ａ）、ＰＤ１発現（図４Ｂ）及びセントラルメモリー様表現型（図４Ｃ）に関して、広範囲の用量において一貫していることを実証する。
【0073】
ＩＬ７及びＩＬ１５との天然のＩＬ２の組み合わせは、天然のＩＬ２単独と比較された場合に培養条件を改善するが、ＩＬ２変異タンパク質単独はＴ細胞生存率を保存する上で及びセントラルメモリー表現型を誘導する上で極めて有効であるので、組み合わせプロトコルを使用する場合において、ＩＬ２変異タンパク質に関しては、改善は観察されない。さらに、ＩＬ２－変異タンパク質単独は、活性化されたＴ細胞に対してセントラルメモリー表現型様を誘導する上で、ＩＬ２、ＩＬ７及びＩＬ１５の組み合わせと同程度に有効である（図５）。
【0074】
例３．ＩＬ２Ｒβγを介して優先的にシグナル伝達するＩＬ２変異タンパク質を産生する遺伝子操作されたＴ細胞は、セントラルメモリー表現型を獲得する。
インビトロ及びインビボの両方において継続的なサイトカイン支持源を生成するために、本発明者らは、Ｔ細胞を遺伝子操作して、中間親和性ＩＬ２受容体を優先的に活性化するＩＬ２変異タンパク質を産生させた。増強された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）及び天然のＩＬ２又はＩＬ２変異タンパク質をコードするレトロウイルス構築物を使用する。形質導入手順は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コーティングされたビーズ及び天然のＩＬ２又はＩＬ２変異タンパク質で、単離された直後のナイーブＯＴ－Ｉ Ｔ細胞を刺激することによって開始される。細胞を加えたレトロネクチンがコーティングされたプレートに、濃縮されたレトロウイルスベクター上清を２４時間及び４８時間で加える。形質導入後、ＩＬ７及びＩＬ１５とともに１０日間、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コーティングされたビーズによるＴＣＲ刺激を７日間維持する。形質導入効率は、ｅＧＦＰ発現によって確認され、両構築物について８０％より高かった（図６Ａ）。分泌された分子をＥＬＩＳＡ（天然のＩＬ２又はＩＬ２変異タンパク質）によって検出した。
インビトロ及びインビボの両方において継続的なサイトカイン支持源を生成するために、本発明者らは、Ｔ細胞を遺伝子操作して、中間親和性ＩＬ２受容体を優先的に活性化するＩＬ２変異タンパク質を産生させた。増強された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）及び天然のＩＬ２又はＩＬ２変異タンパク質をコードするレトロウイルス構築物を使用する。形質導入手順は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コーティングされたビーズ及び天然のＩＬ２又はＩＬ２変異タンパク質で、単離された直後のナイーブＯＴ－Ｉ Ｔ細胞を刺激することによって開始される。細胞を加えたレトロネクチンがコーティングされたプレートに、濃縮されたレトロウイルスベクター上清を２４時間及び４８時間で加える。形質導入後、ＩＬ７及びＩＬ１５とともに１０日間、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コーティングされたビーズによるＴＣＲ刺激を７日間維持する。形質導入効率は、ｅＧＦＰ発現によって確認され、両構築物について８０％より高かった（図６Ａ）。分泌された分子をＥＬＩＳＡ（天然のＩＬ２又はＩＬ２変異タンパク質）によって検出した。
【0075】
ＯＴ１ Ｔ細胞を可溶性ＩＬ２変異タンパク質とともに培養したときに観察された様式と同様の様式で、ＩＬ２変異タンパク質を産生するように操作された細胞は、主にエフェクター細胞である、天然のＩＬ２を産生するように操作された細胞と比較した場合、より高い割合でメモリー表現型を有していた（ｐ＜０．０００１）（図６Ｂ）。また、ＩＬ２－変異タンパク質を産生するように操作された細胞は、天然のＩＬ２を産生するように操作された細胞と比較して、疲弊マーカーの発現がより少なかった（表３）。
【0076】
【表3】
【0077】
総合すると、これらの結果は、ＩＬ２様シグナル伝達が一定かつ持続的である場合、ＩＬ２変異タンパク質によるＩＬ２Ｒβγを介した刺激が、この新しい培養方法によるセントラルメモリー分化を促進するという仮説を確認する。
【0078】
例４．ＣＤ２５発現を下方制御する遺伝子操作は、天然のＩＬ２とともに拡大増殖されたＴ細胞上のセントラルメモリー表現型を促進する。
ＩＬ２α鎖遺伝子（ｇｅｎ）（ＣＤ２５）の発現を遮断する目的で、ｅＧＦＰ及びｉｌ２ｒａを標的とする低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするベクターを使用した。形質導入手順は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コーティングされたビーズ及び天然のＩＬ２で、単離された直後のナイーブＯＴ１ Ｔ細胞を刺激することによって開始される。ｓｈＲＮＡのための３つの異なる構築物を使用し、ＣＤ２５の表面発現に基づいて可変のノックダウン効率を得た。スクランブルｓｈＲＮＡを含有するレンチウイルスによる形質導入を対照として使用する。２回の形質導入の後、天然のＩＬ２（５０Ｕ／ｍｌ）とともに５日間、細胞を培養下に維持する。異なる構築物による形質導入後のＣＤ２５表面発現の減少を、フローサイトメトリーによって評価した（図７Ａ）。より良好なＣＤ２５下方制御が達成されるときに、５日間の天然のＩＬ２刺激後のセントラルメモリー細胞の割合は優れている（図７Ｂ）。
ＩＬ２α鎖遺伝子（ｇｅｎ）（ＣＤ２５）の発現を遮断する目的で、ｅＧＦＰ及びｉｌ２ｒａを標的とする低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするベクターを使用した。形質導入手順は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コーティングされたビーズ及び天然のＩＬ２で、単離された直後のナイーブＯＴ１ Ｔ細胞を刺激することによって開始される。ｓｈＲＮＡのための３つの異なる構築物を使用し、ＣＤ２５の表面発現に基づいて可変のノックダウン効率を得た。スクランブルｓｈＲＮＡを含有するレンチウイルスによる形質導入を対照として使用する。２回の形質導入の後、天然のＩＬ２（５０Ｕ／ｍｌ）とともに５日間、細胞を培養下に維持する。異なる構築物による形質導入後のＣＤ２５表面発現の減少を、フローサイトメトリーによって評価した（図７Ａ）。より良好なＣＤ２５下方制御が達成されるときに、５日間の天然のＩＬ２刺激後のセントラルメモリー細胞の割合は優れている（図７Ｂ）。
【0079】
Ｔ細胞上のＣＤ２５の下方制御は、培養下で天然のＩＬ２を使用して、中間親和性受容体ＩＬ２Ｒβγを優先的に刺激するためのシナリオを提供する。これらの条件下では、ＣＤ８＋Ｔのセントラルメモリー様表現型への分化が促進される。
【0080】
例５．細胞が天然のＩＬ２で刺激されるが、ＣＤ２５相互作用が、培養物に対して同時に加えられた薬剤によって遮断される場合に、セントラルメモリー表現型が得られる。
中間親和性受容体ＩＬ２Ｒβγを介した天然のＩＬ２シグナル伝達を優先的に指示するための別の試みでは、インビトロでのＴ細胞活性化中に天然のＩＬ２とともに薬剤を培養に添加する。薬剤は、遮断効果を保証するために高濃度で添加される。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コーティングされたビーズ、５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ２及び１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２５モノクローナル抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄクローン３Ｃ７）とともに、ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞を培養する。抗ＣＤ２５は０日目から添加され、天然のＩＬ２を加えた新鮮な培地を２日ごとに添加したときに新しくなる。無関係な特異性を有する抗体をアイソタイプ対照として使用する。１０日間の培養後の細胞の表現型決定により、天然のＩＬ２活性化中に抗ＣＤ２５を添加することは、アイソタイプ対照と比較した場合に、細胞生存率（図８Ａ）及びセントラルメモリー様集団（図８Ｂ）を増加させることが明らかとなった（ｐ＜０．０００１）。さらに、ＣＤ２５との天然のＩＬ２の相互作用が抗体で破壊されると、疲弊マーカーの発現の減少が得られる（表４）。
中間親和性受容体ＩＬ２Ｒβγを介した天然のＩＬ２シグナル伝達を優先的に指示するための別の試みでは、インビトロでのＴ細胞活性化中に天然のＩＬ２とともに薬剤を培養に添加する。薬剤は、遮断効果を保証するために高濃度で添加される。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コーティングされたビーズ、５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ２及び１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２５モノクローナル抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄクローン３Ｃ７）とともに、ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞を培養する。抗ＣＤ２５は０日目から添加され、天然のＩＬ２を加えた新鮮な培地を２日ごとに添加したときに新しくなる。無関係な特異性を有する抗体をアイソタイプ対照として使用する。１０日間の培養後の細胞の表現型決定により、天然のＩＬ２活性化中に抗ＣＤ２５を添加することは、アイソタイプ対照と比較した場合に、細胞生存率（図８Ａ）及びセントラルメモリー様集団（図８Ｂ）を増加させることが明らかとなった（ｐ＜０．０００１）。さらに、ＣＤ２５との天然のＩＬ２の相互作用が抗体で破壊されると、疲弊マーカーの発現の減少が得られる（表４）。
【0081】
【表4】
【0082】
総合すると、これらの結果は、ＣＤ２５との相互作用が損なわれることによってＩＬ２Ｒβγを介した天然のＩＬ２シグナル伝達を指示することにより、細胞が、養子細胞療法により適したセントラルメモリー表現型に向けられることを示唆している。
【0083】
例６．二量体受容体ＩＬ２Ｒβγを介して優先的な活性化を受けるＯＴ－Ｉ Ｔ細胞は多機能性であり、効率的なＴ細胞抗原特異的細胞傷害性をインビトロにおいて示す。
ＩＬ２Ｒβγを介して活性化されたセントラルメモリーＴ細胞の機能的能力を評価するために、細胞傷害性アッセイを行った。例１、３に記載されているとおりに活性化されたＯＴ１細胞を同族ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬで１６時間刺激し、フローサイトメトリー解析を行って、グランザイムβの産生量を測定した。ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞の殺滅能力を評価するために、ＯＶＡノミナル抗原を１：１の割合で表面に発現するように形質導入されたＢ１６黒色腫細胞（Ｂ１６－ＯＶＡ）とともにＯＴ－Ｉ Ｔ細胞を共培養した。非形質導入Ｂ１６黒色腫細胞を対照として使用した。ＩｎｃｕＣｙｔｅＣｙｔｏｔｏｘ試薬を添加し、６０時間の間、２時間ごとに殺滅能力を評価した。対照細胞では溶解が観察されなかったため、標的細胞の溶解は抗原特異的であった。
ＩＬ２Ｒβγを介して活性化されたセントラルメモリーＴ細胞の機能的能力を評価するために、細胞傷害性アッセイを行った。例１、３に記載されているとおりに活性化されたＯＴ１細胞を同族ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬで１６時間刺激し、フローサイトメトリー解析を行って、グランザイムβの産生量を測定した。ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞の殺滅能力を評価するために、ＯＶＡノミナル抗原を１：１の割合で表面に発現するように形質導入されたＢ１６黒色腫細胞（Ｂ１６－ＯＶＡ）とともにＯＴ－Ｉ Ｔ細胞を共培養した。非形質導入Ｂ１６黒色腫細胞を対照として使用した。ＩｎｃｕＣｙｔｅＣｙｔｏｔｏｘ試薬を添加し、６０時間の間、２時間ごとに殺滅能力を評価した。対照細胞では溶解が観察されなかったため、標的細胞の溶解は抗原特異的であった。
【0084】
ＩＬ２Ｒβγを介して優先的にシグナル伝達するＩＬ２変異タンパク質で活性化されたＯＴ１細胞は、エクスビボで有効な直接溶解活性を示し、ＩＬ２Ｒβγを介してシグナルが与えられると、細胞が強力な殺滅細胞に分化することを示した。（図９Ａ及び図９Ｂ）
【0085】
例７．二量体受容体ＩＬ２Ｒβγを介して優先的活性化を受けるＴ細胞は、黒色腫モデルにおいてＡＣＴのために使用した場合に、より良好な抗腫瘍活性を示す。
Ｂ１６／ＯＶＡ腫瘍細胞株と合わせたＯＴ１モデルは、最も使用されているモデルの１つであり、ＡＣＴの妥当な前臨床的近似に相当する。Ｃ５７ＢＬ／６レシピエントマウスは、腫瘍細胞接種後０日目及び１０日目に１×１０６個のＯＶＡ発現黒色腫細胞の皮下注射を受けた；マウスに致死量以下の放射線照射（５Ｇｙ）を行った。
群１：処置を受けなかった（対照群）。
群２：天然のＩＬ２で活性化されたＯＴ１ Ｔ細胞を与えられた（例１と同様）。
群３：ＩＬ２－変異タンパク質で活性化されたＯＴ１ Ｔ細胞を与えられた（例１と同様）。
群４：天然のＩＬ２＋ＩＬ７＋ＩＬ１５で活性化されたＯＴ１ Ｔ細胞を与えられた（例２と同様）。
Ｂ１６／ＯＶＡ腫瘍細胞株と合わせたＯＴ１モデルは、最も使用されているモデルの１つであり、ＡＣＴの妥当な前臨床的近似に相当する。Ｃ５７ＢＬ／６レシピエントマウスは、腫瘍細胞接種後０日目及び１０日目に１×１０６個のＯＶＡ発現黒色腫細胞の皮下注射を受けた；マウスに致死量以下の放射線照射（５Ｇｙ）を行った。
群１：処置を受けなかった（対照群）。
群２：天然のＩＬ２で活性化されたＯＴ１ Ｔ細胞を与えられた（例１と同様）。
群３：ＩＬ２－変異タンパク質で活性化されたＯＴ１ Ｔ細胞を与えられた（例１と同様）。
群４：天然のＩＬ２＋ＩＬ７＋ＩＬ１５で活性化されたＯＴ１ Ｔ細胞を与えられた（例２と同様）。
【0086】
図１０に示されているように、ＩＬ２－変異タンパク質で刺激された細胞を用いたＡＣＴは、天然のＩＬ２で活性化された細胞と比較して腫瘍増殖をより良好に制御した。総合すると、これらの結果は、ＩＬ２－変異タンパク質活性化を用いて得られた低疲弊マーカー発現を伴う最初に誘導されたメモリー表現型が、インビボでの腫瘍制御のための有効な組み合わせであったことを示している。
【0087】
例８．ＩＬ２Ｒβγを介して優先的にシグナル伝達するＩＬ２変異タンパク質を分泌するように操作されたＴ細胞は、ＡＣＴのために使用した場合に強固な抗腫瘍活性を示した。
ＡＣＴの有効性を改善するために、本発明者らは、ＩＬ２変異タンパク質を産生するようにＴ細胞を遺伝子操作した。遺伝子（ｇｅｎ）の挿入は、インビトロだけでなくインビボにおいてもＴ細胞上の継続的かつ持続的なＩＬ２変異タンパク質シグナルを可能にする。Ｃ５７ＢＬ／６レシピエントマウスは、腫瘍細胞接種後０日目及び１０日目に１×１０６個のＯＶＡ発現黒色腫細胞の皮下注射を受けた；マウスに致死量以下の放射線照射（５Ｇｙ）を行った。動物を３つの処置群に分け、１１日及び１５日目に、以下のようにＯＴ１マウスからの１×１０６個のＴ細胞の静脈内移入を受けた：
群１：処置を受けなかった（対照）。
群２：天然のＩＬ２＿操作されたＯＴ１ Ｔ細胞を与えられた（例３に記載の形質導入プロトコルのとおりに）
群３：ＩＬ２変異タンパク質＿操作されたＯＴ１ Ｔ細胞を与えられた（例３に記載の形質導入プロトコルのとおりに）。
ＡＣＴの有効性を改善するために、本発明者らは、ＩＬ２変異タンパク質を産生するようにＴ細胞を遺伝子操作した。遺伝子（ｇｅｎ）の挿入は、インビトロだけでなくインビボにおいてもＴ細胞上の継続的かつ持続的なＩＬ２変異タンパク質シグナルを可能にする。Ｃ５７ＢＬ／６レシピエントマウスは、腫瘍細胞接種後０日目及び１０日目に１×１０６個のＯＶＡ発現黒色腫細胞の皮下注射を受けた；マウスに致死量以下の放射線照射（５Ｇｙ）を行った。動物を３つの処置群に分け、１１日及び１５日目に、以下のようにＯＴ１マウスからの１×１０６個のＴ細胞の静脈内移入を受けた：
群１：処置を受けなかった（対照）。
群２：天然のＩＬ２＿操作されたＯＴ１ Ｔ細胞を与えられた（例３に記載の形質導入プロトコルのとおりに）
群３：ＩＬ２変異タンパク質＿操作されたＯＴ１ Ｔ細胞を与えられた（例３に記載の形質導入プロトコルのとおりに）。
【0088】
【0089】
例９．ＩＬ２－変異タンパク質を使用したＴＩＬの生成。
ＡＣＴ療法はＴＩＬを使用して実施することができるので、本発明者らは、ＴＩＬ拡大増殖に対するＩＬ２変異タンパク質の効果を評価した。腫瘍浸潤リンパ球におけるβ／γ二量体ＩＬ２受容体の活性化の役割を研究するために、腫瘍細胞接種後１９～２１日目の間にＣ５７ＢＬ／６マウスからＭＣ３８腫瘍を単離した。腫瘍を機械的に解離させ、ＩＬ２又はＩＬ２－変異タンパク質の存在下で１４～１６日間培養した。本発明者らは、ＩＬ２－変異タンパク質を培養条件で使用した場合に、ＴＩＬの拡大増殖がより高いことを見出した。一貫して、ＩＬ２－変異タンパク質は、Ｋｉ６７マーカーに関してＴＩＬの増殖速度を増加させた（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。さらに、ＩＬ２－変異タンパク質とともにエクスビボで培養されたＴＩＬは、対照と比較して、セントラルメモリー様Ｔ細胞の有意な拡大増殖を示した（図１２Ｃ）。全体として、これらのデータは、ＩＬ２－変異タンパク質が、セントラルメモリー分化表現型を促進するＣＤ８＋ＴＩＬ拡大増殖を誘導することを示す。
ＡＣＴ療法はＴＩＬを使用して実施することができるので、本発明者らは、ＴＩＬ拡大増殖に対するＩＬ２変異タンパク質の効果を評価した。腫瘍浸潤リンパ球におけるβ／γ二量体ＩＬ２受容体の活性化の役割を研究するために、腫瘍細胞接種後１９～２１日目の間にＣ５７ＢＬ／６マウスからＭＣ３８腫瘍を単離した。腫瘍を機械的に解離させ、ＩＬ２又はＩＬ２－変異タンパク質の存在下で１４～１６日間培養した。本発明者らは、ＩＬ２－変異タンパク質を培養条件で使用した場合に、ＴＩＬの拡大増殖がより高いことを見出した。一貫して、ＩＬ２－変異タンパク質は、Ｋｉ６７マーカーに関してＴＩＬの増殖速度を増加させた（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。さらに、ＩＬ２－変異タンパク質とともにエクスビボで培養されたＴＩＬは、対照と比較して、セントラルメモリー様Ｔ細胞の有意な拡大増殖を示した（図１２Ｃ）。全体として、これらのデータは、ＩＬ２－変異タンパク質が、セントラルメモリー分化表現型を促進するＣＤ８＋ＴＩＬ拡大増殖を誘導することを示す。
【0090】
例１０．変異体ＩＬ－２によって拡大増殖されたＴＩＬは多機能性であり、活性化マーカー及び疲弊マーカーの減少を示す。
例９の方法で得られたＴＩＬを、拡大増殖前に機能的及び表現型的に特徴付け、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２抗体の存在下で４時間刺激した。
例９の方法で得られたＴＩＬを、拡大増殖前に機能的及び表現型的に特徴付け、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２抗体の存在下で４時間刺激した。
【0091】
本発明者らは、阻害性受容体ＰＤ－１、Ｌａｇ－３及びＴｉｍ－３が、天然のＩＬ２で拡大増殖されたＴＩＬと比較して、ＩＬ２変異タンパク質で拡大増殖されたＴＩＬにおいて劇的に減少することを見出した（図１３Ａ）。ＴＩＬはそれらの機能性についても分析された。（図１３Ｂ）。まとめると、これらのデータは、ＩＬ２変異タンパク質がＴＩＬを拡大増殖させ、ＴＩＬの機能性を損なうことなく、セントラルメモリー様表現型についてＴＩＬを濃縮する能力を示す。
【0092】
例１１．変異体ＩＬ－２を使用したＴＩＬからのＮＫ細胞の生成。
拡大増殖された総ＴＩＬ中のＮＫ細胞の割合におけるβ／γ二量体ＩＬ２受容体の活性化の役割を研究するために、腫瘍細胞接種後１９～２１日の間にＣ５７ＢＬ／６マウスからＭＣ３８腫瘍を単離した。腫瘍を機械的に解離させ、天然のＩＬ２又はＩＬ２－変異タンパク質の存在下で１４～１６日間培養した。ＩＬ２－変異タンパク質とともにエクスビボで培養されたＴＩＬは、合計からの割合に関して（図１４Ａ）及び絶対数に関して（図１４Ｂ）、天然のＩＬ２と比較してＮＫ細胞の有意な拡大増殖を示した。
本発明には以下の好ましい態様が含まれる。
（１）養子細胞移入療法（Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）において有用なセントラルメモリー表現型を有する、Ｔリンパ球及びＮＫ細胞の分化及び拡大増殖のための方法であって、３つの段階：
ｉ）対象からのリンパ球系細胞の抽出と、
ｉｉ）中間親和性ＩＬ－２受容体（ＩＬ２Ｒβγ）を介した優先的シグナル伝達を誘導しながらの、さらに遺伝子操作された、Ｔリンパ球及びＮＫ細胞のインビトロ拡大増殖及び分化と、
ｉｉｉ）がんを有する対象への活性化された細胞の移入と、
を含む、上記方法。
（２）リンパ球系細胞を拡大増殖しながら中間親和性ＩＬ２受容体（ＩＬ２Ｒβγ）を介した優先的シグナル伝達を誘導するための戦略が、
－中間親和性ＩＬ２Ｒ（ＩＬ２Ｒβγ）と優先的に相互作用し、中間親和性ＩＬ２Ｒ（ＩＬ２Ｒβγ）を介して優先的にシグナル伝達する可溶性ＩＬ－２変異タンパク質とともにリンパ球系細胞を培養すること、
－中間親和性ＩＬ２Ｒと優先的に相互作用し、中間親和性ＩＬ２Ｒを介して優先的にシグナル伝達するＩＬ２変異タンパク質を分泌するようにリンパ球系細胞を遺伝子操作すること、
－天然のＩＬ－２及びＩＬ２－ＩＬ２Ｒα相互作用を遮断する薬剤の存在下で、Ｔリンパ球及びＮＫ細胞を培養すること、
－天然のＩＬ－２の存在下でＴリンパ球及びＮＫ細胞を培養すること、並びにＩＬ２－ＩＬ２Ｒα相互作用を遮断する可溶性タンパク質を分泌するようにこのような細胞を遺伝子操作すること、
－天然のＩＬ－２の存在下でＴリンパ球及びＮＫ細胞を培養すること、並びに細胞表面でのＩＬ２Ｒα受容体サブユニットの発現を減少するようにこのような細胞を遺伝子操作すること、
－天然のＩＬ－２の存在下でＴリンパ球及びＮＫ細胞を培養すること、並びに細胞表面での中間親和性ＩＬ－２受容体の発現を増加するようにこのような細胞を遺伝子操作すること、
を含む群から選択される、（１）に記載の方法。
（３）ＩＬ－２変異タンパク質が、
配列番号１、
列番号２、
配列番号３、
配列番号４、
配列番号５、
配列番号６及び
配列番号７、
を含む群から選択される、（２）に記載の方法。
（４）ＩＬ２－ＩＬ２Ｒα相互作用を遮断する薬剤が、
ＩＬ２Ｒα又はＩＬ２のいずれかに結合する抗体又は抗体断片
ＩＬ２Ｒα又はＩＬ２のいずれかに結合するペプチド又は化学的に定義された小分子、
Ｌ２Ｒαの可溶性形態又はその改変されたバリアントバリアント、
を含む群から選択される、（２）に記載の方法。
（５）段階（ｉｉｉ）が、同じドナーにおいて又は異なるドナーにおいて行われ得る、（１）に記載の方法。
（６）段階ｉｉにおける中間親和性ＩＬ－２受容体によるシグナル伝達が、細胞培養の異なる時点で起こり得る、又はシグナル伝達がインビトロ(ｉｎ ｖｉｔｒｏ)及びインビボ(ｉｎ ｖｉｖｏ)で維持され得る、（２）に記載の方法。
（７）移入された細胞の持続性並びにより高いインビトロ(ｉｎ ｖｉｔｒｏ)及びインビボ(ｉｎ ｖｉｖｏ)抗腫瘍効果を延長するための、（１）～（６）のいずれかに記載の方法。
（８）Ｌ１２、
Ｌ１７、
Ｌ１５及び
ＩＬ２１、
を含む群から選択される他のサイトカインと組み合わせた、（１）～（６）のいずれかに記載の方法。
（９）前記方法の対象となるリンパ球系細胞が、以下のいずれか：Ｔ細胞の混合物；精製されたＣＤ４又はＣＤ８ Ｔ細胞；ＮＫ細胞；ＮＫＴ細胞であり得る、（１）に記載の方法。
（１０）Ｔリンパ球及びＮＫ細胞が、末梢血単核球、腫瘍排出リンパ節又は腫瘍浸潤物のいずれかから、段階ｉにおいて取得されることができる、（１）に記載の方法。
（１１）前記方法におけるリンパ球系細胞が、ＣＡＲを発現し、所望の特異性のＴＣＲを発現し、細胞膜中で関心の対象の他の受容体を発現し、関心の対象の異なるサイトカイン又は可溶性タンパク質を分泌するようにさらに操作され得る、（１）に記載の方法。
（１２）養子細胞移入療法のための、（１）～（１１）のいずれかに記載の方法の使用。
（１３）腫瘍浸潤リンパ球又はキメラ抗原受容体Ｔを得るための、（９）に記載の使用。
（１４）がんの治療のための、（１１）又は（１２）に記載の使用。
（１５）（１）～（６）のいずれかに記載の方法によって得られる細胞。
（１６）セントラルメモリー表現型を有するリンパ球のエクスビボ（ｅx ｖｉｖｏ）での濃縮及び拡大増殖のための方法であって、
ａ．対象からリンパ球の集団を取得することと、
ｂ．β／γ二量体ＩＬ－２受容体を活性化する条件で細胞を培養するリンパ球を拡大増殖することと、
を含む、上記方法。
（１７）工程（ｂ）が、少なくとも１つのＩＬ２変異タンパク質を使用することによって行われる、（１６）に記載の方法。
（１８）工程（ｂ）が、ＩＬ－２受容体の少なくとも１つのサブユニットの発現を調節することによって行われる、（１６）に記載の方法。
（１９）ＩＬ－２受容体のサブユニットがα（ＣＤ２５）、β又はγサブユニットである、（１８）に記載の方法。
（２０）工程（ｂ）が、ＩＬ－２受容体とその同族タンパク質との相互作用を阻害することによって行われる、（１６）に記載の方法。
（２１）ＩＬ－２受容体とその同族タンパク質との相互作用の阻害が、ＩＬ－２受容体のαサブユニットを下方制御することによって、又はβ及びγサブユニットを上方制御することによって起こる、（２０）に記載の方法。
（２２）ＩＬ－２受容体とその同族タンパク質との相互作用の阻害が、抗ＣＤ２５抗体とともに細胞をインキュベートすることによって起こる、（２０）に記載の方法。
（２３）工程（ｂ）が、変異体ＩＬ－２配列の発現及び分泌をコードする核酸でリンパ球を形質導入することによって行われる、（１６）に記載の方法。
（２４）（１６）～（２３）のいずれかによって得られる細胞の組成物。
（２５）がんの治療を必要とする対象においてがんを治療する方法であって、セントラルメモリー表現型を有するリンパ球を投与することを含み、
ａ．対象からリンパ球の集団を取得することと；
ｂ．該リンパ球中でβ／γ二量体ＩＬ－２受容体を活性化することによってリンパ球集団を拡大増殖させることと；
ｃ．治療有効投与量の、工程（ｂ）からのリンパ球を対象に投与することと；
を含む、上記方法。
（２６）β／γ二量体ＩＬ－２受容体を活性化することが、該リンパ球を変異体ＩＬ－２とともにインキュベートすることを含む、（２５）に記載の方法。
（２７）β／γ二量体ＩＬ－２受容体を活性化することが、変異体ＩＬ－２をコードするヌクレオチド配列を該リンパ球中に導入することを含む、（２５）に記載の方法。
（２８）β／γ二量体ＩＬ－２受容体を活性化することが、ＩＬ－２受容体のサブユニットβ／γの発現を上方制御するためのヌクレオチド配列を該リンパ球中に導入することと、野生型ＩＬ－２とともに該リンパ球をインキュベートすることとを含む、（２５）に記載の方法。
（２９）β／γ二量体ＩＬ－２受容体を活性化することが、ＩＬ－２受容体のαサブユニットの発現を下方制御するためのヌクレオチド配列を該リンパ球中に導入することと、野生型ＩＬ－２とともに該リンパ球をインキュベートすることとを含む、（２５）に記載の方法。
（３０）β／γ二量体ＩＬ－２受容体を活性化することが、該リンパ球を野生型ＩＬ－２及び抗ＣＤ２５抗体とともにインキュベートすることを含む、（２５）に記載の方法。
拡大増殖された総ＴＩＬ中のＮＫ細胞の割合におけるβ／γ二量体ＩＬ２受容体の活性化の役割を研究するために、腫瘍細胞接種後１９～２１日の間にＣ５７ＢＬ／６マウスからＭＣ３８腫瘍を単離した。腫瘍を機械的に解離させ、天然のＩＬ２又はＩＬ２－変異タンパク質の存在下で１４～１６日間培養した。ＩＬ２－変異タンパク質とともにエクスビボで培養されたＴＩＬは、合計からの割合に関して（図１４Ａ）及び絶対数に関して（図１４Ｂ）、天然のＩＬ２と比較してＮＫ細胞の有意な拡大増殖を示した。
本発明には以下の好ましい態様が含まれる。
（１）養子細胞移入療法（Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）において有用なセントラルメモリー表現型を有する、Ｔリンパ球及びＮＫ細胞の分化及び拡大増殖のための方法であって、３つの段階：
ｉ）対象からのリンパ球系細胞の抽出と、
ｉｉ）中間親和性ＩＬ－２受容体（ＩＬ２Ｒβγ）を介した優先的シグナル伝達を誘導しながらの、さらに遺伝子操作された、Ｔリンパ球及びＮＫ細胞のインビトロ拡大増殖及び分化と、
ｉｉｉ）がんを有する対象への活性化された細胞の移入と、
を含む、上記方法。
（２）リンパ球系細胞を拡大増殖しながら中間親和性ＩＬ２受容体（ＩＬ２Ｒβγ）を介した優先的シグナル伝達を誘導するための戦略が、
－中間親和性ＩＬ２Ｒ（ＩＬ２Ｒβγ）と優先的に相互作用し、中間親和性ＩＬ２Ｒ（ＩＬ２Ｒβγ）を介して優先的にシグナル伝達する可溶性ＩＬ－２変異タンパク質とともにリンパ球系細胞を培養すること、
－中間親和性ＩＬ２Ｒと優先的に相互作用し、中間親和性ＩＬ２Ｒを介して優先的にシグナル伝達するＩＬ２変異タンパク質を分泌するようにリンパ球系細胞を遺伝子操作すること、
－天然のＩＬ－２及びＩＬ２－ＩＬ２Ｒα相互作用を遮断する薬剤の存在下で、Ｔリンパ球及びＮＫ細胞を培養すること、
－天然のＩＬ－２の存在下でＴリンパ球及びＮＫ細胞を培養すること、並びにＩＬ２－ＩＬ２Ｒα相互作用を遮断する可溶性タンパク質を分泌するようにこのような細胞を遺伝子操作すること、
－天然のＩＬ－２の存在下でＴリンパ球及びＮＫ細胞を培養すること、並びに細胞表面でのＩＬ２Ｒα受容体サブユニットの発現を減少するようにこのような細胞を遺伝子操作すること、
－天然のＩＬ－２の存在下でＴリンパ球及びＮＫ細胞を培養すること、並びに細胞表面での中間親和性ＩＬ－２受容体の発現を増加するようにこのような細胞を遺伝子操作すること、
を含む群から選択される、（１）に記載の方法。
（３）ＩＬ－２変異タンパク質が、
配列番号１、
列番号２、
配列番号３、
配列番号４、
配列番号５、
配列番号６及び
配列番号７、
を含む群から選択される、（２）に記載の方法。
（４）ＩＬ２－ＩＬ２Ｒα相互作用を遮断する薬剤が、
ＩＬ２Ｒα又はＩＬ２のいずれかに結合する抗体又は抗体断片
ＩＬ２Ｒα又はＩＬ２のいずれかに結合するペプチド又は化学的に定義された小分子、
Ｌ２Ｒαの可溶性形態又はその改変されたバリアントバリアント、
を含む群から選択される、（２）に記載の方法。
（５）段階（ｉｉｉ）が、同じドナーにおいて又は異なるドナーにおいて行われ得る、（１）に記載の方法。
（６）段階ｉｉにおける中間親和性ＩＬ－２受容体によるシグナル伝達が、細胞培養の異なる時点で起こり得る、又はシグナル伝達がインビトロ(ｉｎ ｖｉｔｒｏ)及びインビボ(ｉｎ ｖｉｖｏ)で維持され得る、（２）に記載の方法。
（７）移入された細胞の持続性並びにより高いインビトロ(ｉｎ ｖｉｔｒｏ)及びインビボ(ｉｎ ｖｉｖｏ)抗腫瘍効果を延長するための、（１）～（６）のいずれかに記載の方法。
（８）Ｌ１２、
Ｌ１７、
Ｌ１５及び
ＩＬ２１、
を含む群から選択される他のサイトカインと組み合わせた、（１）～（６）のいずれかに記載の方法。
（９）前記方法の対象となるリンパ球系細胞が、以下のいずれか：Ｔ細胞の混合物；精製されたＣＤ４又はＣＤ８ Ｔ細胞；ＮＫ細胞；ＮＫＴ細胞であり得る、（１）に記載の方法。
（１０）Ｔリンパ球及びＮＫ細胞が、末梢血単核球、腫瘍排出リンパ節又は腫瘍浸潤物のいずれかから、段階ｉにおいて取得されることができる、（１）に記載の方法。
（１１）前記方法におけるリンパ球系細胞が、ＣＡＲを発現し、所望の特異性のＴＣＲを発現し、細胞膜中で関心の対象の他の受容体を発現し、関心の対象の異なるサイトカイン又は可溶性タンパク質を分泌するようにさらに操作され得る、（１）に記載の方法。
（１２）養子細胞移入療法のための、（１）～（１１）のいずれかに記載の方法の使用。
（１３）腫瘍浸潤リンパ球又はキメラ抗原受容体Ｔを得るための、（９）に記載の使用。
（１４）がんの治療のための、（１１）又は（１２）に記載の使用。
（１５）（１）～（６）のいずれかに記載の方法によって得られる細胞。
（１６）セントラルメモリー表現型を有するリンパ球のエクスビボ（ｅx ｖｉｖｏ）での濃縮及び拡大増殖のための方法であって、
ａ．対象からリンパ球の集団を取得することと、
ｂ．β／γ二量体ＩＬ－２受容体を活性化する条件で細胞を培養するリンパ球を拡大増殖することと、
を含む、上記方法。
（１７）工程（ｂ）が、少なくとも１つのＩＬ２変異タンパク質を使用することによって行われる、（１６）に記載の方法。
（１８）工程（ｂ）が、ＩＬ－２受容体の少なくとも１つのサブユニットの発現を調節することによって行われる、（１６）に記載の方法。
（１９）ＩＬ－２受容体のサブユニットがα（ＣＤ２５）、β又はγサブユニットである、（１８）に記載の方法。
（２０）工程（ｂ）が、ＩＬ－２受容体とその同族タンパク質との相互作用を阻害することによって行われる、（１６）に記載の方法。
（２１）ＩＬ－２受容体とその同族タンパク質との相互作用の阻害が、ＩＬ－２受容体のαサブユニットを下方制御することによって、又はβ及びγサブユニットを上方制御することによって起こる、（２０）に記載の方法。
（２２）ＩＬ－２受容体とその同族タンパク質との相互作用の阻害が、抗ＣＤ２５抗体とともに細胞をインキュベートすることによって起こる、（２０）に記載の方法。
（２３）工程（ｂ）が、変異体ＩＬ－２配列の発現及び分泌をコードする核酸でリンパ球を形質導入することによって行われる、（１６）に記載の方法。
（２４）（１６）～（２３）のいずれかによって得られる細胞の組成物。
（２５）がんの治療を必要とする対象においてがんを治療する方法であって、セントラルメモリー表現型を有するリンパ球を投与することを含み、
ａ．対象からリンパ球の集団を取得することと；
ｂ．該リンパ球中でβ／γ二量体ＩＬ－２受容体を活性化することによってリンパ球集団を拡大増殖させることと；
ｃ．治療有効投与量の、工程（ｂ）からのリンパ球を対象に投与することと；
を含む、上記方法。
（２６）β／γ二量体ＩＬ－２受容体を活性化することが、該リンパ球を変異体ＩＬ－２とともにインキュベートすることを含む、（２５）に記載の方法。
（２７）β／γ二量体ＩＬ－２受容体を活性化することが、変異体ＩＬ－２をコードするヌクレオチド配列を該リンパ球中に導入することを含む、（２５）に記載の方法。
（２８）β／γ二量体ＩＬ－２受容体を活性化することが、ＩＬ－２受容体のサブユニットβ／γの発現を上方制御するためのヌクレオチド配列を該リンパ球中に導入することと、野生型ＩＬ－２とともに該リンパ球をインキュベートすることとを含む、（２５）に記載の方法。
（２９）β／γ二量体ＩＬ－２受容体を活性化することが、ＩＬ－２受容体のαサブユニットの発現を下方制御するためのヌクレオチド配列を該リンパ球中に導入することと、野生型ＩＬ－２とともに該リンパ球をインキュベートすることとを含む、（２５）に記載の方法。
（３０）β／γ二量体ＩＬ－２受容体を活性化することが、該リンパ球を野生型ＩＬ－２及び抗ＣＤ２５抗体とともにインキュベートすることを含む、（２５）に記載の方法。
【配列表フリーテキスト】
【0093】
配列表１～７ ＜２２３＞ＤＮＡ組換え技術による
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】