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特許7572374トランケート型フォン・ヴィレブランド因子及び第ＶＩＩＩ因子を共発現するベクター
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-15
(45)【発行日】2024-10-23
(54)【発明の名称】トランケート型フォン・ヴィレブランド因子及び第ＶＩＩＩ因子を共発現するベクター
(51)【国際特許分類】
C12N 15/63 20060101AFI20241016BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241016BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241016BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241016BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241016BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20241016BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241016BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20241016BHJP
【ＦＩ】
C12N15/63 Z ZNA
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/02 C
C12N15/62 Z
C12N15/12
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2021560484
(86)(22)【出願日】2020-03-27
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-07
(86)【国際出願番号】 US2020025475
(87)【国際公開番号】W WO2020205630
(87)【国際公開日】2020-10-08
【審査請求日】2023-03-07
(31)【優先権主張番号】16/373,511
(32)【優先日】2019-04-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】521441249
【氏名又は名称】ベイジン ネオレティックス バイオロジカル テクノロジー カンパニー，リミティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100196977
【弁理士】
【氏名又は名称】上原 路子
(72)【発明者】
【氏名】チー リー
(72)【発明者】
【氏名】ハイロン チャン
【審査官】松田 芳子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１３－５１０５８１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５０３５０９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１０－０８８３３２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５０４６７９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１９－５０６１６６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５１５４８２（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）第１のプロモーターに作動可能に連結された、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ）をコードする第１のポリヌクレオチド配列、及び（ｂ）トランケート型フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）及びトランケート型ｖＷＦのＣ末端に融合した免疫グロブリンＦｃを含み、第２のプロモーターに作動可能に連結された融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む、ベクターであって、
前記トランケート型ｖＷＦは、３３６番目及び３７９番目のアミノ酸残基がシステインでなく、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ベクター。
【請求項2】
前記トランケート型ｖＷＦは、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項3】
（ａ）第１のプロモーターに作動可能に連結された、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子タンパク質（ＦＶＩＩＩ）をコードする第１のポリヌクレオチド配列、及び
（ｂ）トランケート型フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）及びトランケート型ｖＷＦのＣ末端に融合した免疫グロブリンＦｃを含み、第２のプロモーターに作動可能に連結された融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む、ベクターであって、
前記トランケート型ｖＷＦは、１０７７番目及び１０２０番目のアミノ酸残基がシステインでなく、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ベクター。
【請求項4】
前記トランケート型ｖＷＦは、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のベクター。
【請求項5】
前記Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、配列番号６、７、８、９、又は１０のアミノ酸配列又は配列番号６、７、８、９、又は１０のアミノ酸配列と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１又は３に記載のベクター。
【請求項6】
前記Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、配列番号６のアミノ酸配列又は配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項５に記載のベクター。
【請求項7】
前記第１のポリヌクレオチド配列は、第１のシグナル配列をさらに含み、前記第２のポリヌクレオチド配列は、第２のシグナル配列をさらに含む、請求項１又は３に記載のベクター。
【請求項8】
請求項１又は３に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項9】
（ａ）請求項１又は３に記載のベクターを含むプラスミドで細胞をトランスフェクトする工程、（ｂ）ＦＶＩＩＩを分泌する細胞を選択する工程、
（ｃ）前記選択した細胞の上清を収集する工程、及び
（ｄ）前記選択した上清からＦＶＩＩＩを精製する工程、を含む、ＦＶＩＩＩの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、同一ベクター内にトランケート型フォン・ヴィレブランド（von Willebrand）因子（ｖＷＦ）‐Ｆｃ ＤＮＡコンストラクト及びＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ ＤＮＡコンストラクトの両方を含む共発現ベクターに関する。
【0002】
配列表、表、又はコンピュータプログラムへの参照
配列表は、ＥＦＳ‐Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式のテキストファイルとして明細書と共に同時に送信されている。ファイル名「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」で、作成日は２０１９年３月２８日、サイズは１２９キロバイトである。ＥＦＳ‐Ｗｅｂを介して提出された配列表は明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表は、ＥＦＳ‐Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式のテキストファイルとして明細書と共に同時に送信されている。ファイル名「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」で、作成日は２０１９年３月２８日、サイズは１２９キロバイトである。ＥＦＳ‐Ｗｅｂを介して提出された配列表は明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
血液凝固は、凝固カスケードと称される相互依存性の生化学反応の複雑で動的な生物学的経路を介して進行する。この経路には、外因性経路、内因性経路、及び共通経路の３つの経路が含まれる。第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は糖タンパク質であり、血漿中の全長フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）と１：５０の比率で不活性な補因子として循環し、正常な止血を維持するための内因性経路で重要な役割を果たす。全長ＦＶＩＩＩは、重鎖（Ａ１‐Ａ２‐Ｂドメイン）と軽鎖（Ａ３‐Ｃ１‐Ｃ２ドメイン）を含む非共有結合ヘテロ二量体である。傷害に応答して、第ＶＩＩＩ因子の活性化型はｖＷＦから分離し、活性化血小板によって提供される荷電リン脂質膜上で第ＩＸａ因子及び第Ｘ因子との複合体（いわゆるＸａｓｅ複合体）を形成する。Ｘａｓｅ複合体はさらに第Ｖ因子（ＦＶ）を活性化してＦＶａを生成し、ＦＶａは次に、凝固カスケード内の第Ｘａ因子及び他の成分とともにプロトロンビンをトロンビンに活性化して安定した血餅を生成する。
【0004】
血友病Ａは、ＦＶＩＩＩ活性の欠乏を特徴とする先天性Ｘ染色体関連出血性疾患である。ＦＶＩＩＩ活性の低下は、凝固カスケードの正のフィードバックループを阻害し、最終的には持続時間の増加を伴う出血エピソード、広範囲のあざ、自発的な口腔及び鼻出血、関節のこわばり及び慢性的な痛み、並びに重症の場合は内出血及び貧血を引き起こし得る。血友病Ａの最も一般的な治療法は、静脈内投与によるヒト血漿由来又は組換えＦＶＩＩＩのいずれかによる補充療法である。
【0005】
哺乳類細胞における組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）の高生産は困難であることが判明している。このタンパク質の高分子量（約３００ｋＤａ）、必要な翻訳後修飾の複雑さ（例えば、多数のグリコシル化及びチロシン硫酸化部位）、及び発現要素の制限（ｍＲＮＡの不安定性など）により、ｒＦＶＩＩＩの高産生が課題となっている。中央のＢドメインを除去すると、ｒＦＶＩＩＩ産生が大幅に改善されたが、ｒＦＶＩＩＩの商業生産レベルは、通常２０～５０ＩＵ／ｍＬの範囲である。哺乳類細胞における組換えＦＶＩＩＩの低発現レベルに寄与する更なる可能性のある要因には、特異的又は非特異的に、発現細胞膜への結合およびＦＶＩＩＩ不安定性が含まれ得る（Kaufman, 1989, Mol. Cell. Biol., vol. 3, pp. 1233‐1242、米国特許第８，７５９，２９３号）。
【0006】
米国特許第８，７５９，２９３号には、ＦＶＩＩＩの調製方法が開示されている。米国特許第８，７５９，２９３号の図６は、（ｉ）成熟ｖＷＦ又はトランケート型ｖＷＦドメイン‐Ｆｃ融合ポリペプチド及び（ｉｉ）独立したプロモーターからのプロペプチド配列を発現する１番目のプラスミド発現ベクター、並びに（ｉｉｉ）異なる選択マーカーを使用してヒトＦＶＩＩＩを発現する２番目の異なるプラスミド発現ベクターを説明している。１番目と２番目のプラスミドをコトランスフェクトし、選択中の哺乳類細胞に取り込み、（ｉ）ｖＷＦ又はｖＷＦ‐Ｆｃ、（ｉｉ）ｖＷＦプロペプチド、及び（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩを発現する安定した細胞株を作成する。この方法の問題は、選択された各細胞トランスフェクタントが、哺乳類細胞へのＦＶＩＩＩプラスミド及びｖＷＦ‐Ｆｃプラスミドの独立した別々の侵入によって得られることである。選択された細胞は、各プラスミドの比率が異なる場合がある。トランスフェクトしたプラスミドの比率が不明な場合、タンパク質の一貫した発現で確実かつ再現性よく細胞を取得することは困難であり、したがって、発現されたタンパク質の絶対的なレベルは時間とともに変化する。例えば、連続トランスフェクションによって生成された一次細胞トランスフェクタントは、１０コピーのＦＶＩＩＩと３０コピーのｖＷＦ‐Ｆｃとを有する場合がある。ＦＶＩＩＩを超えるｖＷＦ‐Ｆｃの過剰発現は、ＦＶＩＩＩと比較して過剰な量のｖＷＦ‐Ｆｃをもたらし、したがってＦＶＩＩＩの下流精製を困難にする。さらに、２つのプラスミドの比率が時間経過とともに変化する場合、一定数のｖＷＦプラスミドを維持しながら、ＦＶＩＩＩプラスミドの減少により細胞が望ましくなくなる可能性がある。あるプラスミドが別のプラスミドと比較して喪失すると、発現レベルのバランスが崩れる可能性があり、その結果、精製シナリオが困難になる。
【0007】
患者が利用できる組換えＦＶＩＩＩの質及び量を改善する必要がある。ＦＶＩＩＩの発現を改善し、精製後の発現されたＦＶＩＩＩの収率を改善する必要がある。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】図１Ａ～図１Ｃは、ヒトＦＶＩＩＩ及びトランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃ ｃＤＮＡ、場合によっては、変異型のｖＷＦ‐Ｆｃ ｃＤＮＡの両方が同一発現ベクターに並置されてサブクローン化される二重発現ベクターの構築を示す図である。（図１Ａ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にあるＦＶＩＩＩバリアント遺伝子配列及びｖＷＦ‐Ｆｃバリアント遺伝子配列を含む二重発現ベクターの一般的な説明。（図１Ｂ）ＦＶＩＩＩとトランケート型ｖＷＦ（ｖＷＦプロペプチドドメインの有無に関わらず）との共発現及び免疫グロブリンＦｃドメインへの融合（Ｐｒｏ‐Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃにはプロペプチドドメインが含まれるが、Ｄｅｌ‐Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃには含まれない）の説明。（図１Ｃ）ＦＶＩＩＩとトランケート型及び変異型ｖＷＦとの共発現（ＨＧＶＳ番号付け規則に従って完全な野生型ｖＷＦ配列のアミノ酸Ｃ１０９９及びＣ１１４２で、ｖＷＦプロペプチドドメインの有無に関わらず）及びヒトＩｇＧ１由来の免疫グロブリンＦｃドメインへの融合の説明。他のプラスミドエレメントも図示する。
【図2】図２Ａ～図２Ｄは、Ｄ’Ｄ３ドメインとヒトＩｇＧ1のＦｃヒンジドメインとの融合によって作成された、トランケート型のヒトｖＷＦ‐Ｆｃタンパク質の誘導の概略図を示す図である。（図２Ａ）分泌されたフォン・ヴィレブランド因子ポリペプチドのドメイン構造（シグナル配列は示さず）。Ｄ１及びＤ２はｖＷＦプロペプチド配列を表す。Ｄ’Ｄ３には、名目上の第ＶＩＩＩ因子結合部位が含まれる。ＣＫは野生型ｖＷＦの末端二量体化ドメインである。（図２Ｂ１）Ｐｒｏ‐Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃは、プロペプチド（Ｄ１Ｄ２ドメイン）及びＦｃドメインに融合したＤ’Ｄ３ドメインからなるトランケート型ｖＷＦタンパク質である。（図２Ｂ２）この代替形式では、Ｄ１Ｄ２ドメインがｖＷＦから物理的に除去され、Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃ配列のＮ末端のシグナル配列に直接融合して、Ｄｅｌ‐Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃが生じる。（図２Ｃ）Ｄ１Ｄ２の存在の有無に関わらず、成熟したトランケート型生成物のＤ’Ｄ３‐Ｆｃ。（図２Ｄ）野生型Ｄ’Ｄ３ドメインの多量体は、ジスルフィド架橋を介して形成されるが、Ｄ’Ｄ３の二量体化は、Ｃ末端のＦｃ融合ドメインの相互作用によって媒介される。
【図3】図３Ａ～図３Ｄは、アミノ酸位置Ｃ１０９９及びＣ１１４２に変異を有する、トランケート型ヒトｖＷＦ‐Ｆｃタンパク質の概略図を示す図である。（図３Ａ）変異型の分泌されたフォン・ヴィレブランド因子ポリペプチドのドメイン構造（シグナル配列は示さず）。Ｄ１Ｄ２はプロペプチドドメインである。Ｄ’Ｄ３には、名目上の第ＶＩＩＩ因子結合部位が含まれているが、アミノ酸Ｃ１０９９及びＣ１１４２（Ｄ３ドメインの垂直線）での変異が含まれる。（図３Ｂ１）Ｐｒｏ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃは、上記Ｐｒｏ‐Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃと同様であるが、Ｃ１０９９及びＣ１１４２の位置に変異を含む。（図３Ｂ２）この代替形式では、Ｄ１Ｄ２ドメインがｖＷＦから物理的に除去され、Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃ配列（Ｃ１０９９及びＣ１１４２に変異を有する配列）のＮ末端のシグナル配列に直接融合して、Ｄｅｌ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃが生じる。（図３Ｃ）Ｄ１Ｄ２の存在の有無に関わらず、成熟したトランケート型生成物のＤ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃ。（図３Ｄ）野生型Ｄ’Ｄ３ドメインの多量体の形成は、Ｃ１０９９変異及びＣ１１４２変異（アスタリスク）によってブロックされるが、Ｄ’Ｄ３の二量体化は、Ｃ末端のＦｃ融合ドメインの相互作用によって媒介される。
【図4】図４Ａ～図４Ｂは、Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃタンパク質及びＤ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃタンパク質とＦＶＩＩＩとの集合の説明を示す図である。（図４Ａ）Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃ（導入変異なし）は、図３に記載されるように、多量体集合及び二量体化をもたらす。例として、ＦＶＩＩＩへの結合は、多量体化したＤ’Ｄ３‐Ｆｃ分子の２つの部位で示されている。（図４Ｂ）Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃ融合タンパク質は、導入された変異Ｃ１０９９及びＣ１１４２（アスタリスクとして示す）により、多量体ではなく二量体の集合をもたらすと予想される。
【図5】図５Ａ～図５Ｂは、未変異Ｄ’Ｄ３バリアント及び変異Ｄ’Ｄ３バリアントの差異による、ＦＶＩＩＩ／トランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃ複合体の捕捉及び回収の可能性の差異、及び結果として生じる第ＶＩＩＩ因子の第ＶＩＩＩ因子親和性マトリックスを介した精製の結果を示す図である。（図５Ａ）ＦＶＩＩＩに結合する多量体Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃが示されている。ＦＶＩＩＩは、親和性リガンドへの結合相互作用を介して精製マトリックスに結合し、Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃと共にカラムに保持される。このようなカラムから溶出されたＦＶＩＩＩは、おそらくＤ’Ｄ３‐Ｆｃでひどく汚染されているため、［ＦＶＩＩＩ］＜［Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃ］となる。（図５Ｂ）Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃの二量体形態は第ＶＩＩＩ因子に結合することが示されている。多量体化がないため、個々のＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃ複合体は、抗ＦＶＩＩＩ親和性マトリックスに効率的に結合し、［ＦＶＩＩＩ］＞＞［Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃ］であるＦＶＩＩＩの非常に純粋な集団を生成すると予想される。
【図6】図６Ａ～６Ｂは、ＦＶＩＩＩ‐ｖＷＦ‐Ｆｃ複合体の捕捉及び回収における差異、並びに図５と同様に、結果として生じる第ＶＩＩＩ因子のｖＷＦ‐Ｆｃ捕捉マトリックスを介した精製の結果を示す図である。（図６Ａ）ＦＶＩＩＩに結合する多量体Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃが示されている。Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃが豊富に共発現している場合、これによりＦＶＩＩＩの回収率が低下する可能性がある。さらに、Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃの濃度及び近接性が高まるため、アフィニティーカラムからのＦＶＩＩＩの溶出が不十分になる可能性があり、［ＦＶＩＩＩ］＜＜［Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃ］となる。（図６Ｂ）Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃの二量体形態は、ＦＶＩＩＩに結合しすること及び第ＶＩＩＩ因子に結合することが示されている。多量体化がないため、ＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃ複合体は、凝集体を形成することなく抗Ｆｃ親和性マトリックスに結合し、ｖＷＦ‐Ｆｃに１：１の比率で結合するＦＶＩＩＩの濃縮集団を生成すると予想される。
【図7】図７Ａ～図７Ｂは、Ｄｅｌ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃで発現され、アフィニティークロマトグラフィーで精製されたＦＶＩＩＩの純度を示す図である。（図７Ａ）精製によって得られた組換え発現ＦＶＩＩＩのゲルエレクトロフェログラム、及び（図７Ａ）のタンパク質レーンの対応するウエスタンブロット（図７Ｂ）。抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体を使用して、ウエスタンブロットでタンパク質を検出した。レーン１：分子量マーカー（ＭＷ）、レーン２：細胞上清からの出発物質、レーン３：プロテインＡクロマトグラフィー後のフロースルー材料、レーン４：プロテインＡアフィニティーカラムからの０．３Ｍ ＣａＣｌ2溶出画分、レーン５：ＦＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔアフィニティー樹脂カラムからの材料の５０％エチレングリコール溶出、レーン６：市販のタンパク質ＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩ（Xyntha（登録商標））。矢印は、約１７０、９０、及び８０キロダルトン（ｋＤ）に対応する３つの予想されるＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩタンパク質バンドを示している。
【図8】図８は、トランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃ二量体及び多量体の発現を示す図である。Ｐｒｏ‐Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃを含むプロテインＡ精製トランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃバリアント（レーン２）、Ｄｅｌ‐Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃ（レーン３）、Ｐｒｏ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃ（レーン４）、及びＤｅｌ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃ（レーン５）を、非還元ＰＡＧＥによって血漿由来完全長ｖＷＦタンパク質（レーン６）と比較した。レーン２及びレーン３の高分子量バンド（＞１８０ｋＤ、矢印）は、トランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃ多量体を表す。Ｃ１０９９及びＣ１１４２の変異は多量体形成を妨げるため、Ｐｒｏ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃ（レーン４）及びＤｅｌ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃ（レーン５）は二量体のみを形成した（約１６０ｋＤ、矢印）。
【図9】図９は、組換えＦＶＩＩＩタンパク質発現に対するトランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃ融合タンパク質の保護効果を示す図である。野生型Ｐｒｏ‐Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃタンパク質、Ｄｅｌ‐Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃタンパク質、Ｐｒｏ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃタンパク質、及びＤｅｌ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃタンパク質などのトランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃ融合タンパク質、並びに血漿由来ｖＷＦ（ネガティブコントロールタンパク質、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））は、ＦＶＩＩＩを単独発現する細胞に等モル量のバリアント（又はＨＳＡ）を添加することによって試験した。ＦＶＩＩＩ活性は、１段階凝固アッセイを使用して測定し、０～８時間の時間間隔で試料を取り出して試験した。
【発明を実施するための形態】
【0009】
本発明は、ヒト組換え凝固第ＶＩＩＩ因子の精製及び産生における現在の問題の多くに対する解決策、すなわち、単一の選択可能なマーカー遺伝子を用いて、同一発現ベクター上で２つの独立したプロモーターからＦＶＩＩＩ及びトランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃ発現カセットの両方を共発現させることを提供する。発現されたタンパク質の絶対発現レベルは変化し得るが、ＦＶＩＩＩ：ｖＷＦ‐Ｆｃ発現の望ましい１：１の比率が確立され、それによって、精製中にｖＷＦがＦＶＩＩＩを大幅に上回り、ＦＶＩＩＩの回収が問題になる可能性を最小限に抑える。
【0010】
発現遺伝子とそのタンパク質との相対比を制御することに加えて、ＦＶＩＩＩ：ｖＷＦ複合体の回収率を改善する方法が開発された。これは、免疫グロブリンＦｃ領域をヒトｒｅｃ‐ｖＷＦのトランケートされた領域のＣ末端、具体的にはＦＶＩＩＩに結合するＤ’Ｄ３領域（約アミノ酸７７６‐１２４１）に融合することによって行われる。さらに、しかしながら、ｖＷＦ‐Ｆｃドメインは、効率的な処理を促進するためにシグナル配列への直接融合によって作成され、さらに、ＦＶＩＩＩ：ｖＷＦ複合体のより高い比率を促進するために特定の変異で修飾されている。Ｆｃとの融合により、固体マトリックスに固定化されたブドウ球菌由来プロテインＡ、抗Ｆｃ抗体などに結合するＦｃ領域の能力により、細胞上清の大部分からＦＶＩＩＩ‐ｖＷＦ複合体を選択する簡単な方法が提供される。当然、他の方法を使用して同様の結果を得ることも可能であるが、ＦＶＩＩＩ結合に重要なトランケート型ｖＷＦフラグメントの二量体化も促進することから、好ましいＣ末端融合パートナーは免疫グロブリンＦｃである（Chiu et al., 2015, Blood, vol. 126, pp. 935‐938及びYee et al., 2015, Blood, vol. 126, pp. 939‐942）。野生型トランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃの発現に関する潜在的な問題は、トランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃタンパク質が、Ｆｃドメインの二量体化と同様に、Ｄ’Ｄ３ドメインの１又は２つの特定のシステイン残基を介して通常の頭‐頭及び尾‐尾多量体化に関与することである。したがって、組換えｖＷＦ‐Ｆｃポリマーは、５０ポリペプチド単位の長さの長い分子を生成し、共有結合し得る。典型的には、それらは約２０～２５ポリペプチド単位のサイズ範囲内にある。このようなサイズ範囲は、５００万～１０００万ダルトン以上の分子量を表し、特に商業規模でタンパク質を調製するために通常使用される大規模なカラム精製では問題となる。このような複合体のサイズが大きいと、濃縮体や凝集体が生じ、カラムの流れが妨げられ、過度の背圧が生じ、目的タンパク質の回収が困難になることがある。
【0011】
本発明は、Ｄ’Ｄ３ドメインの特定のシステインアミノ酸、具体的には、ｖＷＦポリペプチドのアミノ酸Ｃ１０９９及びＣ１１４２に変異を含めることによって、この問題を解決する。これらのアミノ酸は、Ｄ’Ｄ３二量体間の分子間ジスルフィド架橋を駆動するのに重要であるように見えるが、ＦＶＩＩＩ結合には重要ではないと見られる。そのため、ｖＷＦ‐ＦｃのＤ’Ｄ３ドメインに導入された変異を使用すると、多量体集合が防止され、特に高濃度の発現タンパク質では、Ｄ’Ｄ３ドメインのサイズが単量体又は二量体に制限される。これは、大規模なカラム精製や深層ろ過カラム、アフィニティーカラムなどの目詰まりの防止に理想的であり、ＦＶＩＩＩの回収率と純度が向上する。
【0012】
本発明に開示される追加の改変は、発現及び精製（トランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃをコードする発現カセットからのｖＷＦプロペプチドドメインを含む遺伝子配列の排除）の両方をさらに増強し得る。このプロペプチドは通常、ゴルジ装置での切断およびゴルジ装置からの通過後、ｖＷＦと結合したままであり、フォールディングに役立つ。これは、細胞系での哺乳類ｖＷＦタンパク質の発現に含まれる。しかしながら、哺乳類系で発現する大量のｖＷＦは、哺乳類細胞に存在する（又は不十分に存在する）フューリン／Ｋｅｘ２様プロテアーゼによって非効率的に処理される。結果として、「成熟した」ｖＷＦタンパク質にまだ付着している未処理のプロペプチド、又はトランケート型フラグメントは、形成される可能性のある大きなサイズのｖＷＦ多量体をさらに複雑にし、精製を困難にし得る。
【0013】
本発明は、ｖＷＦ発現カセットからプロペプチド配列を除去し、フューリン／Ｋｅｘ２様タンパク質の必要性を排除することによってこの問題を解決する。成熟ドメインは、そのシグナルペプチドからのプレタンパク質の切断によって直接発現される。ｖＷＦドメインのフォールディングにはプロペプチドが存在しないにもかかわらず、融合したＦｃドメインは、ＦＶＩＩＩに結合するＤ’Ｄ３配列の二量体化を促進するのに十分なフォールディングを提供する。プロペプチド配列の除去は、発現ベクターのカセットサイズをさらに縮小し、哺乳類細胞でのより良い発現を可能にする。
【0014】
本発明は、組換えＦＶＩＩＩのＤＮＡコンストラクト及びその改変された結合パートナータンパク質、すなわち、トランケート型組換えフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、を含む単一のＤＮＡ発現ベクターを使用して、ＦＶＩＩＩの非常に高い発現レベルで、哺乳類細胞において２つのタンパク質を共発現する。
【0015】
それぞれがトランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する４つの異なるトランケート型ｖＷＦ‐ＦｃＤＮＡカセットは、発現プラスミドベクターに挿入され、トランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃコンストラクトは、以下のように定義される。（ａ）Ｐｒｏ‐Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃは、ｖＷＦプロペプチドドメイン（Ｄ１Ｄ２、野生型ｖＷＦ分子のアミノ酸＋１‐７４１）及びＣ末端でヒトＩｇＧ1由来の免疫グロブリンＦｃドメイン（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ０１８５７、アミノ酸１０４‐３３０を含む）と融合したドメインＤ’Ｄ３（野生型ｖＷＦ分子のアミノ酸７４２‐１２４７を含む）を含むコンストラクトを表す。（ｂ）Ｄｅｌ‐Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃは、Ｃ末端でヒトＩｇＧ1（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ０１８５７、アミノ酸１０４‐３３０を含む）の免疫グロブリンＦｃドメインと融合したｖＷＦドメインＤ’Ｄ３（野生型ｖＷＦ分子のアミノ酸７４２‐１２４７を含む）を含むコンストラクトを表し、上記のコンストラクト（ａ）とは対照的に、このコンストラクトではプロペプチドドメイン（Ｄ１Ｄ２）を欠失している。（ｃ）Ｐｒｏ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃは、ｖＷＦプロペプチドドメイン（Ｄ１Ｄ２、野生型ｖＷＦ分子のアミノ酸＋１‐７４１を含む）及び野生型ｖＷＦ分子のアミノ酸であるが完全なｖＷＦ分子（そのシグナル配列を含む、番号付けはＨＧＶＳ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｖａｒｉａｎｔ Ｓｏｃｉｅｔｙ）の番号付け規則に従う）のＣ１０９９及びＣ１１４２に変異を有する、Ｃ末端でヒトＩｇＧ1（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ０１８５７、アミノ酸１０４‐３３０を含む）の免疫グロブリンＦｃドメインと融合したドメインＤ’Ｄ３を含むコンストラクトを表す。（ｄ）Ｄｅｌ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃは、が完全なｖＷＦ分子（そのシグナル配列を含む、番号付けはＨＧＶＳ番号付け規則に従う）のＣ１０９９及びＣ１１４２に変異を有する、Ｃ末端でヒトＩｇＧ1（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ０１８５７、アミノ酸１０４‐３３０を含む）の免疫グロブリンＦｃドメインと融合したｖＷＦドメインＤ’Ｄ３（野生型ｖＷＦ分子のアミノ酸７４２‐１２４７を含む）を含むコンストラクトを表し、上記のコンストラクト（ｃ）とは対照的に、このコンストラクトではプロペプチドドメイン（Ｄ１Ｄ２）を欠失している。
【0016】
ヒト及び非ヒト（例えば、霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ウシ、その他の脊椎動物）由来のｖＷＦポリペプチド及びＦＶＩＩＩポリペプチドは、天然、合成、及び組換えタンパク質を含む、本発明によって企図されている。また、本発明の範囲内にあるのは、野生型タンパク質、又はそれらの変異体、バリアント、及び／又はトランケート型に対応するｖＷＦ及びＦＶＩＩＩポリペプチドである。
【0017】
ヒト野生型ｖＷＦアミノ酸配列及びｖＷＦをコードする核酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００５４３及びＮＭ＿０００５５２によって開示されている。ヒトｖＷＦは、２２アミノ酸のシグナルペプチド及び反復機能ドメインＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＣＫを含む２８１３アミノ酸のポリペプチドであり、アミノ末端からＤ１、Ｄ２、Ｄ’、Ｄ３、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｄ４、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｃ１、Ｃ２、及びＣＫの順序で分布している（図２Ａ）。「成熟した」ｖＷＦサブユニットは、Ｎ末端からＣ末端の順に、ドメインＤ’‐Ｄ３‐Ａ１‐Ａ２‐Ａ３‐Ｄ４‐Ｂ１‐Ｂ２‐Ｂ３‐Ｃ１‐Ｃ２‐ＣＫで構成されている。ドメインＤ１Ｄ２（プロペプチド）は野生型ｖＷＦタンパク質のアミノ酸＋１‐７４１であり、ドメインＤ’Ｄ３は野生型ｖＷＦタンパク質のアミノ酸＋７４２‐１２４７である。（＋はＮ末端でのシグナル配列の除去を指す。すなわち、＋１はシグナル配列のない野生型ｖＷＦタンパク質の最初のアミノ酸である）。Ｄ’Ｄ３ドメインは、ＦＶＩＩＩの結合部位として認識されている。
【0018】
ヒトＦＶＩＩＩは、約３００ｋＤａの一本鎖分子として合成され、構造ドメインＡ１‐Ａ２‐Ｂ‐Ａ３‐Ｃ１‐Ｃ２で構成されている。多くの場合、分泌中にＢドメイン内で切断され、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）に結合したヘテロ二量体として血中を循環する。分子量１７０ｋＤの最小の活性ＦＶＩＩＩは、Ａ１‐Ａ２ドメインを含む１つの９０ｋＤ重鎖からなり、高度にグリコシル化されたＢドメイン（Ｓｅｒ７４１～Ａｒｇ１６４８）の大部分を欠いており、Ａ３‐Ｃ１ドメイン及びＣ２ドメインを含む１つの８０ｋＤ軽鎖である。高分子量の形態と同程度にトロンビンで活性化され得る。ＦＶＩＩＩのＢドメインは、ＦＶＩＩＩの凝固活性に必要ではないが、Ｂドメインを欠失させることにより、ＦＶＩＩＩは、インビトロ又はインビボの機能を損なうことなく、異種系からの発現レベルが大幅に高くなることがわかった。本発明は、Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）‐ＦＶＩＩＩを利用し、ＦＶＩＩＩの２つの鎖は、リンカー（ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ）によって結合されている。ヒトＢＤＤＦＶＩＩＩ配列は、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質アクセッション番号ＡＢＶ９０８６７に示されている。
【0019】
本発明者らは、２つの独立したプロモーター下でＦＶＩＩＩ及びトランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃ遺伝子の両方を共発現させる二重発現カセットを含むＤＮＡベクターを設計した。発現されたタンパク質の絶対発現レベルは変化し得るが、本発明のＤＮＡベクターは、ＦＶＩＩＩとトランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃ発現との一定かつ望ましい１：１の比率を達成し得、これにより、トランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃタンパク質のレベルが、精製中にＦＶＩＩＩタンパク質のレベルを大幅に上回らないことが保証され、したがって、ＦＶＩＩＩの回収が制御される。１つの発現ベクターにおけるＦＶＩＩＩとトランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃの共発現によって産生されるＦＶＩＩＩの発現レベルは、他の既知の方法によって産生されるものよりも有意に高い。
【0020】
本発明は、（ａ）第１のプロモーターに作動可能に連結された、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩタンパク質（ＦＶＩＩＩ）をコードする第１のポリヌクレオチド配列、及び（ｂ）トランケート型フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）及びトランケート型ｖＷＦのＣ末端に融合した免疫グロブリンＦｃを含み、第２のプロモーターに作動可能に連結された融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む、ベクターであって、前記トランケート型ｖＷＦは、配列番号１［Ｄ’／Ｄ３＋変異又はＤｅｌ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ］、配列番号２［Ｄ１／Ｄ２／Ｄ’／Ｄ３＋変異又はＰｒｏ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ］、配列番号３［Ｄ’／Ｄ３又はＤｅｌ‐Ｄ’Ｄ３］、又は配列番号４［Ｄ１／Ｄ２／Ｄ’／Ｄ３又はＰｒｏ‐Ｄ’Ｄ３］のアミノ酸配列又はその９５％のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、前記ベクターに関する。第１のプロモーター及び第２のプロモーターは、同じであっても異なっていてもよい。一実施形態では、第１のプロモーター及び第２のプロモーターは同じであり、例えば、サイトメガロウイルスプロモーターである。
【0021】
本発明のベクターにおいて、第１のポリヌクレオチド配列は、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩ）又はその少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又はは９９％の配列相同性を有するアミノ酸をコードする。アミノ酸の変化は、好ましくは、ＦＶＩＩＩのフォールディング又は結合能力に有意に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換などの小さな変化である。
【0022】
本発明のベクターにおいて、第２のポリヌクレオチド配列は、トランケート型ｖＷＦ及び当該トランケート型ｖＷＦのＣ末端に融合した免疫グロブリンＦｃを含む融合タンパク質、又はその少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸をコードする。アミノ酸の変化は、好ましくは、ｖＷＦのＦＶＩＩＩへの結合活性に有意に影響を及ぼさない、又はｖＷＦの多量体化を引き起こさない保存的アミノ酸置換などの小さな変化である。前記トランケート型ｖＷＦがＤ’Ｄ３＋変異である場合、アミノ酸置換には、アミノ酸残基１０９９又は１１４２（ＨＧＶＳ番号付け規則に従って番号付け）の変化、あるいは同等に、変異を無効にする３３６又は３７９（Ｄ’のＮ末端からカウント）のシステインへの変化は含まれない。前記トランケート型ｖＷＦがＤ１／Ｄ２／Ｄ’／Ｄ３＋変異である場合、アミノ酸置換には、アミノ酸残基１０９９又は１０４２の変化、あるいは同等に、変異を無効にする３３６又は３７９（Ｄ’のＮ末端からカウント）のシステインへの変化は含まれない。
【0023】
精製中のＦＶＩＩＩ‐ｖＷＦ複合体の回収率を改善するため、本発明は、免疫グロブリンＦｃ領域を、ヒト組換えｖＷＦのトランケートされた領域のＣ末端、具体的には、Ｄ’Ｄ３領域（野生型ｖＷＦタンパク質のアミノ酸＋７４２‐１２４７）に融合する。本発明に適した免疫グロブリンＦｃには、プロテインＡまたはプロテインＧまたは他の同様のＦｃ結合マトリックスに高い親和性で結合することができるものが含まれ、鎖間ジスルフィド結合の形成を促進するために少なくともヒンジ領域を含むヒトＩｇＧ、マウスＩｇＧ、又はそれらのフラグメントのＦｃ領域が含まれる。好ましいＦｃは、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４である。例えば、好ましいＦｃ配列は、配列番号５に示され、ヒトＩｇＧ1のアミノ酸１０４‐３３０である。
【0024】
Ｆｃとの融合により、固体マトリックスに固定化されたブドウ球菌由来プロテインＡ、抗Ｆｃ抗体などの結合パートナーに結合するＦｃ領域の能力により、細胞上清の大部分からＦＶＩＩＩ‐ｖＷＦ複合体を選択する簡単な方法が提供される。トランケート型ｖＷＦは二量体化のためのＣＫドメインを欠いているため、ｖＷＦ‐Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ部分は、Ｆｃドメインのシステインを介したトランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃの自己二量体化の手段も提供する。
【0025】
一実施形態では、変異は、トランケート型ヒトｖＷＦに実装され、野生型ｖＷＦと比較してより小さな結合複合体を作成する。これにより、組換えＦＶＩＩＩ‐ｖＷＦ‐Ｆｃ複合体の全体的な精製が強化され、インビトロでの安定性が向上する。分泌中に、ｖＷＦ多量体化は、Ｄ３ドメイン（Ｃ１０９９及びＣ１１４２）のジスルフィド結合を介して形成され、大きな、非常に大きなｖＷＦ分子、通常は２０～２５個のｖＷＦ分子（又は２０～２５量体、最大で５０量体）の多量体の形成に至る。これらのサイズ範囲は、少なくとも５００万～１０００万ダルトンの分子量を表しており、ＦＶＩＩＩの大規模カラム精製では問題となる。これは、このような複合体のサイズが大きいと、濃縮体や凝集体が生じ、カラムの流れが妨げられ、目的のタンパク質の回収が困難又は不可能になる一方で、全体的な純度に影響を与えるおそれがあるためである。アミノ酸Ｃ１０９９及びＣ１１４２（ＨＧＶＳ番号付け）は、Ｄ’Ｄ３ドメイン間の分子間ジスルフィド架橋を駆動するための２つの重要な残基であるが、ＦＶＩＩＩへの結合には重要ではない。ｖＷＦ‐ＦｃのＤ’Ｄ３ドメインのＣ１０９９及びＣ１１４２をＡ１０９９及びＡ１１４２に変換することにより、多量体化が防止され、ＦＶＩＩＩ‐ｖＷＦ複合体からのＦＶＩＩＩの精製とタンパク質の質が劇的に向上する。ドメインＤ’Ｄ３のシステイン変異は、システインの置換が、結果として生じるｖＷＦがＦＶＩＩＩに結合する能力に有意な影響を与えない限り、配列番号１に示すようにアラニンに変更可能であり、あるいはロイシン、グリシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、ヒスチジン、メチオニン、おそらくアルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、トリプトファン、及びチロシンなどであるがプロリンではない他のアミノ酸に変更可能である。
【0026】
一実施形態では、ｖＷＦのプロペプチドドメインは、ｖＷＦ‐Ｆｃをコードする発現カセットからプロペプチドを包含する遺伝子配列を除去することによって欠失される。プロペプチドの機能の１つは、ｖＷＦのＮ末端の多量体化を補助することであり、その後、プロペプチドは血中に放出されるとフューリンによって切断される。ただし、フューリン／Ｋｅｘ‐２様プロテアーゼは細胞内で制限されることが多いため、哺乳類系で大量のｖＷＦが発現されると、フューリン／Ｋｅｘ２様プロテアーゼによって非効率的に処理され、切断されていないプロペプチドがｖＷＦに付着したままとなり得る。これにより、結果として得られるｖＷＦ分子の分子量が大幅に増加し、適切なドメインの関連付けが制限される。ｖＷＦ発現カセットからプロペプチド配列を除去することにより、成熟ドメインはそのシグナルペプチドから直接発現され、ｖＷＦ発現の有意な増加をもたらし、ＦＶＩＩＩ‐ｖＷＦ複合体の形成をもたらす。プロペプチドが存在しないにもかかわらず、融合Ｆｃドメインは、単量体Ｄ’Ｄ３よりもＦＶＩＩＩに対して高い親和性を持つＤ’Ｄ３の二量体化を促進するのに十分なフォールディングを提供する。プロペプチドドメインを排除すると、発現ベクターの遺伝子サイズがさらに小さくなり、タンパク質発現が向上する。
【0027】
本発明のための好ましいＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩポリペプチドは、ヒトＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋタンパク質アクセッション番号ＡＢＶ９０８６７、配列番号６）、合成ブタＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩを含むブタＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋタンパク質アクセッション番号ＡＧＶ７９８５９．１、OBIZUR（登録商標）、配列番号７）、ＧｅｎＢａｎｋヌクレオチドアクセッション番号ＮＭ＿２１４１６７．２に由来する配列であるが、ブタＦＶＩＩＩ完全長Ｂドメイン（配列番号８）を置換するように設計されたヒトＦＶＩＩＩＢドメインに由来する人工の１４アミノ酸リンカーを有するブタＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩバリアント、ＧｅｎＢａｎｋヌクレオチドアクセッション番号Ｕ４９５１７に由来する配列であるが、ブタＦＶＩＩＩ完全長Ｂドメイン（配列番号９）を置換するように設計されたヒトＦＶＩＩＩＢドメインに由来する人工の１４アミノ酸リンカーを有するブタＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩ、及びＧｅｎＢａｎｋヌクレオチドアクセッション番号ＡＦ０４９４８９．１に由来するイヌＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩ配列であるが、ヒトＢドメインに由来し、イヌＦＶＩＩＩ完全長Ｂドメイン（配列番号１０）を置換するように設計された人工の１４アミノ酸リンカーを有する配列、を含む。本明細書では、ブタ及びイヌ（並びにヒトに加えて他の哺乳類のＦＶＩＩＩ）の使用が検討されている。ブタＦＶＩＩＩは現在、後天性血友病Ａの患者の治療として使用されている。ブタ及びイヌのＦＶＩＩＩ分子、又はそれらのハイブリッドは、先天性血友病又は阻害剤を伴う血友病の患者の代替治療として評価及び検討されている。ブタ又はイヌのＦＶＩＩＩをコードする発現カセットを作成することにより、野生型、トランケート型、及び／又は変異型ｖＷＦの存在下で短縮Ｂドメインリンカーを用いて、本発明による大量のＦＶＩＩＩ産物を生成することが可能であり、さらに、そのようなブタ及びイヌのＦＶＩＩＩ、又はそれらのハイブリッドは、より高い触媒活性を有し得る、したがって、治療シナリオにおいて必要とされるＦＶＩＩＩが少量となり得る。
【0028】
本発明は、発現ＦＶＩＩＩ及びトランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃのための組換え発現ベクター、及び発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。任意の適切な発現系が使用され得る。ベクターは、哺乳類、微生物、ウイルス、又は昆虫の遺伝子に由来するものなど、適切な転写または翻訳調節ヌクレオチド配列にそれぞれ作動可能に連結された、ＦＶＩＩＩ及びトランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃタンパク質をコードする第１のＤＮＡ配列及び第２のＤＮＡ配列を含む。調節配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、又はエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、並びに転写及び翻訳の開始及び終了を制御する適切な配列が含まれる。調節配列がコード化ＤＮＡ配列に機能的に関連している場合、ヌクレオチド配列は作動可能に連結されている。したがって、プロモーターヌクレオチド配列がコード化ＤＮＡ配列の転写を制御する場合、プロモーターヌクレオチド配列は、コード化ＤＮＡ配列に作動可能に連結される。通常複製起点によって付与される所望の宿主細胞で複製する能力、及び形質転換体を同定するための選択遺伝子を、発現ベクターにさらに組み込んでもよい。
【0029】
一実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｖＷＦに対して天然であるかそうでない場合もある適切なシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込んでもよい。シグナルペプチド（リーダーペプチド又はシグナル配列としても公知）は、分泌経路に向かう新たに合成されたタンパク質のＮ末端に存在する短いペプチド（通常は１６～３０アミノ酸長）である。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列は、発現されたポリペプチドが最初にシグナルペプチドを含む融合タンパク質として翻訳されるように、第１の配列にインフレームで提供され得る。意図された宿主細胞で機能するシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外分泌を増強する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、細胞からのポリペプチドの分泌時にポリペプチドから切断される。アミノ酸配列に対して天然であるか又は天然ではない適切なシグナルペプチドもまた、本発明において使用され得る。
【0030】
ヒトＦＶＩＩＩタンパク質の分泌を改善するために、第１のポリヌクレオチドは、好ましくは、ＦＶＩＩＩ配列の前にシグナル配列を含む。ＦＶＩＩＩの分泌を促進する任意のシグナル配列が本発明に適している。例えば、シグナル配列は、野生型ヒトＦＶＩＩＩシグナル配列ＭＱＩＥＬＳＴＣＦＦＬＣＬＬＲＦＣＦＳ（配列番号１１）である。
【0031】
ブタＦＶＩＩＩタンパク質の分泌を改善するために、第１のポリヌクレオチドは、好ましくは、ＦＶＩＩＩ配列の前にシグナル配列を含む。ＦＶＩＩＩの分泌を促進する任意のシグナル配列が本発明に適している。例えば、シグナル配列は、野生型ブタＶＦＩＩＩシグナル配列ＭＱＬＥＬＳＴＣＶＦＬＣＬＬＰＬＧＦＳ（配列番号１２）である。
【0032】
イヌＦＶＩＩＩタンパク質の分泌を改善するために、第１のポリヌクレオチドは、好ましくは、ＦＶＩＩＩ配列の前にシグナル配列を含む。ＦＶＩＩＩの分泌を促進する任意のシグナル配列が本発明に適している。例えば、シグナル配列は、野生型イヌＶＦＩＩＩシグナル配列ＭＱＶＥＬＹＴＣＣＦＬＣＬＬＰＦＳＬＳ（配列番号１３）である。
【0033】
トランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃタンパク質の分泌を改善するために、第２のポリヌクレオチドは、好ましくは、ｖＷＦ配列の前にシグナル配列を含む。トランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃの分泌を促進する任意のシグナル配列が本発明に適している。例えば、シグナル配列は、野生型ヒトｖＷＦシグナル配列ＭＩＰＡＲＦＡＧＶＬＬＡＬＡＬＩＬＰＧＴＬＣ（配列番号１４）である。
【0034】
本発明のポリペプチドの共発現に適した宿主細胞には、原核生物、酵母、糸状菌、又は高等真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母、及び哺乳類の細胞宿主で使用するための適切なクローニング及び発現ベクターは、例えば、Pouwels et al. in Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985)に記載されているように周知である。
【0035】
哺乳類の発現に適した真核生物のプロモーターには、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）などのレトロウイルスＬＴＲのプロモーター、及びマウスメタロチオネイン‐Ｉプロモーターなどのメタロチオネインプロモーターが含まれる。
【0036】
いくつかの実施形態において、ベクターコンストラクトは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ‐デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、又は他の方法によって培養宿主細胞に導入され得る。このような方法は、多くの標準的な実験マニュアルに記載されている。
【0037】
哺乳類宿主細胞発現ベクターの転写及び翻訳制御配列は、ウイルスゲノムに由来し得る。本発明に適したプロモーター配列及びエンハンサー配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来し得る。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起源、初期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプライス、並びにポリアデニル化部位を使用して、哺乳類宿主細胞における構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝子要素を提供し得る。ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ウイルスの複製起点も含む可能性のあるフラグメントとしてウイルスゲノムから容易に得られるため、特に有用である。
【0038】
選択可能なマーカーをコードする配列を、ＤＮＡコンストラクトに含めてもよい。哺乳類細胞の選択可能なマーカーは当技術分野で公知であり、これには、グルタミンシンテターゼ、チミジンキナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アスパラギンシンテターゼ、アデノシンデアミナーゼ、メタロチオネイン、及びネオマイシンなどの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
【0039】
本発明は、組換えヒトＦＶＩＩＩ及びその修飾された結合パートナータンパク質、この場合、哺乳類細胞におけるトランケート型組換えヒトフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）の高発現及び精製に関連する４つの主要な改良を含む。すなわち、１）単一の哺乳動物発現ベクター上での独立したプロモーターからのｒｅｃ‐ＦＶＩＩＩ及びトランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃの共発現により、これら２つの分子の最適な発現比の制御を通じて両方のタンパク質の高レベルの発現が得られる。２）野生型形態（多量体）と比較してより小さな（すなわち、単量体、二量体、又は短いオリゴマー）結合複合体を作成することにより、組換えＦＶＩＩＩ‐ｖＷＦ‐Ｆｃ複合体の精製を強化するためのトランケート型ヒトｖＷＦのバリアントへの変異の実装３）変異型フォン・ヴィレブランド分子の実質的な修飾、すなわち、プロペプチド領域の欠失の導入であり、特定の制限的な内因性プロテアーゼによる切断の必要性を排除することにより、その発現を大幅に増加させる。４）細胞培養、インビトロでの保存、及び哺乳類ウイルスの不活化を達成する方法におけるＦＶＩＩＩ分子の安定化。
【0040】
上記の要素の組み合わせにより、ＦＶＩＩＩの発現が大幅に改善され、材料の損失が少なく発現タンパク質の精製が向上し、最終産物において、また潜在的に存在するウイルスの不活化中の溶媒／界面活性剤工程でも、宿主細胞タンパク質が減少する。これらの組み合わされた要素は、患者が利用できる組換えＦＶＩＩＩの質及び量を大幅に改善する。
【0041】
本発明の合成、集合、又はプロセスの全体的な方法は、以下に概説される。ＦＶＩＩＩ及びトランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃ変異体は、哺乳類プロモーターによって駆動され、哺乳類ポリアデニル化シグナルで終結する２つの独立した発現カセットを含む単一の発現ベクターにタンデムで合成及びクローン化される（図１）。トランスフェクトされた細胞は、抗生物質（例えば、ジェネティシン（Geneticin））又は代謝遺伝子（例えば、グルタミンシンテターゼ）産物を使用して選択され、さらに選択され、最適なＦＶＩＩＩ及びｖＷＦ発現について分析される。
【0042】
Ｐｒｏ‐Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃ、Ｐｒｏ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃなどのトランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃバリアント、及び変異の有無に関わらずプロペプチドドメインを特異的に欠く同等の形態、すなわち、Ｄｅｌ‐Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃ及びＤｅｌ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃの作成は、目的のＤＮＡセグメントの遺伝子合成によって行われる。
【0043】
ＦＶＩＩＩ‐ｖＷＦ複合体は、電荷マトリックスへの吸収を含む従来のクロマトグラフィー法によって、及び／又はアフィニティー若しくは疑似アフィニティークロマトグラフィー、例えばプロテインＡクロマトグラフィーによって培地から除去され得る。次に、FVIIISelectクロマトグラフィー樹脂及び選択的洗浄工程を使用して、ＦＶＩＩＩをＦＶＩＩＩ‐ｖＷＦ複合体からさらに精製し、ｖＷＦによる汚染を最小限に抑えたＦＶＩＩＩ分子の濃縮集団を生成する。
【0044】
ＦＶＩＩＩを調製するための全体的な方法は、以下のように要約される。
１）ＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩ及び変異／修飾Ｄ’Ｄ３ｖＷＦ‐Ｆｃ遺伝子カセットを含む共発現プラスミドによる細胞のトランスフェクション。
２）ＦＶＩＩＩを最適に発現する細胞の同定。
３）培地から細胞塊を分離することによる分泌細胞上清の回収。
４）ＦＶＩＩＩ‐ｖＷＦ‐Ｆｃ複合体（例えば、固定化プロテインＡカラム（推奨）、抗ｖＷＦアフィニティーマトリックス、又はイオン交換カラムへの結合）を選択するカラムマトリックスに適用するための所望のバッファーへの回収細胞培地の調製。
５）保持又は溶出されたＦＶＩＩＩを、２番目のカラム（例えば、ラクダ科動物の抗ＦＶＩＩＩ抗体カラム、アフィニティーリガンド、又はその他のアフィニティーマトリックス）でさらに精製して、工程４で除去されなかった残留ｖＷＦ‐Ｆｃ及び細胞タンパク質を除去する。直接（抗ＦＶＩＩＩを介して）又は間接（抗ｖＷＦ又はｖＷＦ‐Ｆｃを介して）結合マトリックスを利用して、必要に応じて、除去の順序を逆にする（工程４及び工程５）ことが可能であることは明らかである。
６）ＦＶＩＩＩは、イオン交換カラムやナノろ過など、必要に応じて追加のクロマトグラフィー工程でさらに精製及び研磨してもよい。
１）ＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩ及び変異／修飾Ｄ’Ｄ３ｖＷＦ‐Ｆｃ遺伝子カセットを含む共発現プラスミドによる細胞のトランスフェクション。
２）ＦＶＩＩＩを最適に発現する細胞の同定。
３）培地から細胞塊を分離することによる分泌細胞上清の回収。
４）ＦＶＩＩＩ‐ｖＷＦ‐Ｆｃ複合体（例えば、固定化プロテインＡカラム（推奨）、抗ｖＷＦアフィニティーマトリックス、又はイオン交換カラムへの結合）を選択するカラムマトリックスに適用するための所望のバッファーへの回収細胞培地の調製。
５）保持又は溶出されたＦＶＩＩＩを、２番目のカラム（例えば、ラクダ科動物の抗ＦＶＩＩＩ抗体カラム、アフィニティーリガンド、又はその他のアフィニティーマトリックス）でさらに精製して、工程４で除去されなかった残留ｖＷＦ‐Ｆｃ及び細胞タンパク質を除去する。直接（抗ＦＶＩＩＩを介して）又は間接（抗ｖＷＦ又はｖＷＦ‐Ｆｃを介して）結合マトリックスを利用して、必要に応じて、除去の順序を逆にする（工程４及び工程５）ことが可能であることは明らかである。
６）ＦＶＩＩＩは、イオン交換カラムやナノろ過など、必要に応じて追加のクロマトグラフィー工程でさらに精製及び研磨してもよい。
【0045】
対応するコード化されたアミノ酸配列の配列識別子を表１に示す。
【0046】
【表1】
【0047】
以下の実施例により、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示することを意図しており、限定的であると解釈されるべきではない。
【実施例】
【0048】
実施例１ トランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃ及びＦＶＩＩＩポリペプチドの共発現ベクターの構築
それぞれがトランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する４つのトランケート型ｖＷＦ‐ＦｃＤＮＡカセットを商業的に合成した（GenScript社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）。４つのトランケート型ｖＷＦ‐ＦｃＤＮＡカセットは次のように定義される。
それぞれがトランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する４つのトランケート型ｖＷＦ‐ＦｃＤＮＡカセットを商業的に合成した（GenScript社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）。４つのトランケート型ｖＷＦ‐ＦｃＤＮＡカセットは次のように定義される。
【0049】
（ａ）Ｐｒｏ‐Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃ（Ｄ１／Ｄ２／Ｄ’／Ｄ３‐Ｆｃ）は、ｖＷＦプロペプチドドメイン（Ｄ１Ｄ２、野生型ｖＷＦ分子のアミノ酸＋１‐７４１、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ＿０００５５２）及びドメインＤ’Ｄ３（野生型ｖＷＦ分子のアミノ酸７４２‐１２４７）を含む、Ｃ末端でヒトＩｇＧ1由来の免疫グロブリンＦｃドメイン（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ０１８５７、アミノ酸１０４‐３３０）と融合したコンストラクトを表す。
【0050】
（ｂ）Ｄｅｌ‐Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃ（Ｄ’／Ｄ３‐Ｆｃ）は、ｖＷＦドメインＤ’Ｄ３を含む、Ｃ末端で免疫グロブリンＦｃドメインと融合したコンストラクトを表し、コンストラクト（ａ）とは対照的に、プロペプチドドメイン（Ｄ１Ｄ２）は欠失している。
【0051】
（ｃ）Ｐｒｏ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃ（Ｄ１／Ｄ２／Ｄ’／Ｄ３＋変異‐Ｆｃ）は、完全なｖＷＦ分子（そのシグナル配列を含む）のＣ１０９９及びＣ１１４２に変異を有することを除いて、（ａ）と同様のコンストラクトを示す。Ｃ１０９９及びＣ１１４２は、ＨＧＶＳの従来から認められている命名規則に基づいている。アミノ酸のカウントは、完全なｖＷＦ分子のシグナル配列から始まるＤ’ドメインからカウントを開始する場合、同等の変異はＣ３３６及びＣ３７９である。
【0052】
（ｄ）Ｄｅｌ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃ（Ｄ’／Ｄ３＋変異）は、完全なｖＷＦ分子（そのシグナル配列を含む、ＨＧＶＳ番号付け規則に従った命名法））のＣ１０９９及びＣ１１４２に変異を有することを除いて、（ｂ）と同様のコンストラクトを示す。
【0053】
ヒトＦＶＩＩＩＢドメイン欠失タンパク質（ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ）をコードするＤＮＡも商業的に合成した（Genewiz社、ニュージャージー州サウス・プレインフィールド）。
【0054】
表１に列挙した各タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、強化された異種発現チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を説明するアルゴリズムを使用してコドン最適化した。各タンパク質のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列もコドン最適化した。
【0055】
プラスミド上のクローニングサイトＢｓｉＷＩおよびＦｓｐＩを介してトランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃ及びＢＤＤ ＦＶＩＩＩのｃＤＮＡをそれぞれＤＮＡプラスミド発現ベクターにサブクローニングした（図１）。ここで、「ＣＭＶ」はサイトメガロウイルスプロモーター配列であり、ＦＶＩＩＩの場合は白い波線、ｖＷＦ‐Ｆｃの場合は黒い波線で表す。「ＦＶＩＩＩ」はＦＶＩＩＩ遺伝子配列（ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ）である。「ｖＷＦ‐Ｆｃ」は、Ｐｒｏ‐Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃ、Ｄｅｌ‐Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃ、Ｐｒｏ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃ、Ｄｅｌ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃなど、各上記ｖＷＦ‐Ｆｃバリアントの一般名である。「ａｍｐＲ」はアンピシリン耐性遺伝子である。「選択可能なマーカー」は、目的のプラスミド（例えば、グルタミンシンテターゼ、Ｇ４１８）を保持する細胞を特異的に単離するための選択可能なマーカーである。「ＳＶ４０ ｏｒｉ」は、複製起点（哺乳類細胞での複製用）を含む哺乳類シミアンウイルスの配列である。「ｆ１ ｏｒｉ」は、複製起点を含むバクテリオファージｆ１の配列である（細菌細胞での複製用）。
【0056】
ｖＷＦフラグメントの二量体化はＦＶＩＩＩとの相互作用にとって重要であるため、ＦｃフラグメントをコードするＤＮＡ配列を、トランケート型ｖＷＦフラグメントのＣ末端に導入して、トランケート型ｖＷＦダイマーの形成を指示した。また、高度に発現された野生型ｖＷＦは、本発明ではトランケートされているという事実にもかかわらず、その広範な多量体化によって凝集体を形成する場合があり、よってＦＶＩＩＩ及び精製を複雑にすることから、アミノ酸位置Ｃ１０９９及びＣ１１４２（シグナル配列を含む、ＨＧＶＳ番号付け規則）又はＣ３３６及びＣ３７９（ｖＷＦ Ｄ’Ｄ３ドメインのＤ’からカウント開始）に、２つの変異を導入した。これらの２つの部位はｖＷＦ多量体形成に関与しているため、これらの部位に変異を導入すると、ｖＷＦ多量体形成が阻止され、精製が簡素化され、現行の方法よりも優れた品質のＦＶＩＩＩが生成される。
【0057】
実施例２ ＣＨＯ哺乳類細胞株におけるヒトＢＤＤＦＶＩＩＩ及びトランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃの共発現
ＣＨＯ細胞をＣＤ‐ＣＨＯ培地（Thermo Fisher Scientific社、マサチューセッツ州ウォルサム）で培養し、エレクトロポレーション用に調製した。細胞をＥ１２５（１２５ｍＬ）シェーカーフラスコ（ＳＦ）に０．３×１０6細胞／ｍＬで播種し、ＣＯ2シェーカーインキュベーターでインキュベートした。細胞密度が１．５～３．０×１０6細胞／ｍＬに達した時点で、３細胞継代目（Ｐ３）で細胞を継代培養し、エレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション実施日に、実施例１の直線化した発現ベクター５μｇを含む１００μＬのトランスフェクション溶液（Nucleofector Kit V Solution、Lonza社、メリーランド州ウォーカーズビル）を使用して、３×１０6細胞を懸濁した（初期対数期）。次に、細胞／ＤＮＡ混合物をNucleofector 2bエレクトロポレーションデバイスのキュベットに移し、プログラムＵ‐２４（Lonza社）を使用してＤＮＡを細胞にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を直ちに予熱したＣＤ‐ＣＨＯ培地（薬剤選択なし）を含む２４ウェルプレートに移し、５％ＣＯ2を含む３７℃の加湿環境でインキュベートした。２４時間インキュベーションした後、エレクトロポレーション後の細胞を、２５μＭ Ｌ‐メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を含むＣＤ‐ＣＨＯ培地で３０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルマイクロプレートに播種し、湿度９５％、５％ＣＯ2、３７℃で２～３週間インキュベートした。トランスフェクトに成功した細胞コロニーは２～３週間のインキュベーション後に見られ、ＦＶＩＩＩ発現細胞は上清の１段階凝固アッセイを使用して選択した。次に、選択した細胞プールを９６ウェルプレートから６ウェルプレートに徐々に拡大し、最終的には懸濁培養用のシェーカーフラスコに拡張した。次に、選択した細胞プールを、０．３細胞／ウェルの細胞密度で限定希釈クローニングに供した。１Ｌ振とうフラスコで１０００ＩＵ／ｍＬを超えるＦＶＩＩＩ発現レベルを、１段階凝固アッセイで測定した。
ＣＨＯ細胞をＣＤ‐ＣＨＯ培地（Thermo Fisher Scientific社、マサチューセッツ州ウォルサム）で培養し、エレクトロポレーション用に調製した。細胞をＥ１２５（１２５ｍＬ）シェーカーフラスコ（ＳＦ）に０．３×１０6細胞／ｍＬで播種し、ＣＯ2シェーカーインキュベーターでインキュベートした。細胞密度が１．５～３．０×１０6細胞／ｍＬに達した時点で、３細胞継代目（Ｐ３）で細胞を継代培養し、エレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション実施日に、実施例１の直線化した発現ベクター５μｇを含む１００μＬのトランスフェクション溶液（Nucleofector Kit V Solution、Lonza社、メリーランド州ウォーカーズビル）を使用して、３×１０6細胞を懸濁した（初期対数期）。次に、細胞／ＤＮＡ混合物をNucleofector 2bエレクトロポレーションデバイスのキュベットに移し、プログラムＵ‐２４（Lonza社）を使用してＤＮＡを細胞にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を直ちに予熱したＣＤ‐ＣＨＯ培地（薬剤選択なし）を含む２４ウェルプレートに移し、５％ＣＯ2を含む３７℃の加湿環境でインキュベートした。２４時間インキュベーションした後、エレクトロポレーション後の細胞を、２５μＭ Ｌ‐メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を含むＣＤ‐ＣＨＯ培地で３０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルマイクロプレートに播種し、湿度９５％、５％ＣＯ2、３７℃で２～３週間インキュベートした。トランスフェクトに成功した細胞コロニーは２～３週間のインキュベーション後に見られ、ＦＶＩＩＩ発現細胞は上清の１段階凝固アッセイを使用して選択した。次に、選択した細胞プールを９６ウェルプレートから６ウェルプレートに徐々に拡大し、最終的には懸濁培養用のシェーカーフラスコに拡張した。次に、選択した細胞プールを、０．３細胞／ウェルの細胞密度で限定希釈クローニングに供した。１Ｌ振とうフラスコで１０００ＩＵ／ｍＬを超えるＦＶＩＩＩ発現レベルを、１段階凝固アッセイで測定した。
【0058】
実施例３ ＦＶＩＩＩタンパク質の発現及び精製
ＦＶＩＩＩ発現細胞プールを得て、ＦＶＩＩＩ発現レベルを流加培養で試験した。ＦＶＩＩＩ変異体及びトランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃ変異体の両方を発現する細胞を、最初にActiPro培地（Hyclone社、ユタ州ソルトレイクシティ）に適合させ、１×１０6／ｍＬの細胞密度で播種した。細胞密度が６×１０6細胞／ｍＬに達した時点で、製造元の推奨に従って、Cell Boost 7a/7bサプリメント（Hyclone社）を１日おきに添加した。細胞密度及びＦＶＩＩＩ活性を定期的にチェックして、細胞増殖及びＦＶＩＩＩ発現をモニターした。１４日後、流加培養を終了し、細胞培養培地を１００×ｇで遠心分離して細胞培養上清を回収し、‐８０℃の冷凍庫に保存した。
ＦＶＩＩＩ発現細胞プールを得て、ＦＶＩＩＩ発現レベルを流加培養で試験した。ＦＶＩＩＩ変異体及びトランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃ変異体の両方を発現する細胞を、最初にActiPro培地（Hyclone社、ユタ州ソルトレイクシティ）に適合させ、１×１０6／ｍＬの細胞密度で播種した。細胞密度が６×１０6細胞／ｍＬに達した時点で、製造元の推奨に従って、Cell Boost 7a/7bサプリメント（Hyclone社）を１日おきに添加した。細胞密度及びＦＶＩＩＩ活性を定期的にチェックして、細胞増殖及びＦＶＩＩＩ発現をモニターした。１４日後、流加培養を終了し、細胞培養培地を１００×ｇで遠心分離して細胞培養上清を回収し、‐８０℃の冷凍庫に保存した。
【0059】
ＦＶＩＩＩ精製では、清澄化した上清をさらに高速遠心分離で処理した後、０．４５μｍフィルターでろ過した。上清を等量の希釈バッファー（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）と混合した。AKTA Pureクロマトグラフィーシステムを使用して、希釈した上清をHiTrap MabSelect PrismAカラムにロードし、カラムを１０カラム容量（ＣＶ）の洗浄バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄した。FVIIISelectアフィニティーリガンドカラム（GE Healthcare社）をプロテインＡカラム出口と直列に接続した。溶出バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．３Ｍ ＣａＣｌ2）をプロテインＡカラムにアプライして、結合したｖＷＦ‐Ｆｃ融合複合体からＦＶＩＩＩを分離した。洗浄後、接続したカラム列を分離し、ＦＶＩＩＩ溶出バッファー（２０ｍＭ ヒスチジン、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、１．５Ｍ ＮａＣｌ、及び５０％エチレングリコール中０．０２％Tween‐80、ｐＨ６．５）を使用してFVIIISelectカラムからＦＶＩＩＩを溶出した。次に、精製したＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩを、０．３％（ｗ／ｖ）スクロース、２．２％（ｗ／ｖ）グリシン、２０ｍＭ ヒスチジン、２２０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＣａＣｌ2、及び０．００８％Tween‐80（ｐＨ６．９）にバッファー交換し、タンパク質の特性評価を行った。
【0060】
【0061】
実施例４ トランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃダイマー及び多量体形態分析
非還元４％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルでの電気泳動分析により、４つの組換えトランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃポリペプチドコンストラクトを二量体又は高分子量複合体（すなわち、多量体）を形成する能力について評価した。電気泳動後、ゲルをクマシーブリリアントブルーで染色した（図８）。結果は、ｖＷＦ‐ＦｃバリアントであるＰｒｏ‐Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃ（レーン２）及びＤｅｌ‐Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃ（レーン３）の両方は、約１６０ｋＤの二量体及び多量体（＞１８０ｋＤ）を形成したが、変異を含むｖＷＦ‐ＦｃバリアントであるＰｒｏ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃ（レーン４）及びＤｅｌ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃ（レーン５）は、多量体形成を阻止する変異であったため、約１６０ｋＤの二量体のみを形成したことを示した。
非還元４％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルでの電気泳動分析により、４つの組換えトランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃポリペプチドコンストラクトを二量体又は高分子量複合体（すなわち、多量体）を形成する能力について評価した。電気泳動後、ゲルをクマシーブリリアントブルーで染色した（図８）。結果は、ｖＷＦ‐ＦｃバリアントであるＰｒｏ‐Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃ（レーン２）及びＤｅｌ‐Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃ（レーン３）の両方は、約１６０ｋＤの二量体及び多量体（＞１８０ｋＤ）を形成したが、変異を含むｖＷＦ‐ＦｃバリアントであるＰｒｏ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃ（レーン４）及びＤｅｌ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃ（レーン５）は、多量体形成を阻止する変異であったため、約１６０ｋＤの二量体のみを形成したことを示した。
【0062】
実施例５ Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）‐ＦＶＩＩＩへのトランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃポリペプチド結合親和性の特性評価
トランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃバリアントのそれぞれに対応する組換えタンパク質コンストラクトをＣＨＯ‐Ｋ１細胞で発現させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して上清からタンパク質を精製した。それぞれのＦＶＩＩＩ結合親和性を特性評価するために、等モル量のｖＷＦ‐ＦｃバリアントをＴＢＳＴバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Tween‐20）で調製し、９６ウェルマイクロプレートに４℃で一晩直接コーティングした。コーティング後、プレートをＴＢＳＴ‐３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）バッファーで室温（ＲＴ）で２時間ブロックし、組換えＦＶＩＩＩ（Prospec Bio社、ニュージャージー州イーストブランズウィック）の濃度を上げながら（０～４０００ｐＭ）室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。平衡化及び洗浄後、結合したＦＶＩＩＩをヒツジ抗ＦＶＩＩＩポリクローナル抗体で検出し、続いてそれ自体が西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヒツジＩｇＧに対する二次抗体で検出した。吸光度測定値からブランク値を差し引いた。アッセイは３連で行った。結合アッセイの分析は、４つ全てのｖＷＦ‐Ｆｃフラグメントが、完全長血漿由来ｖＷＦのＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩへの結合親和性に相当する同様の見かけの親和性定数（約５００ｐＭ）で組換えＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩに結合することを示した（Shiltagh et al., Blood, vol. 123, p. 4143‐4151, 2014）。
トランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃバリアントのそれぞれに対応する組換えタンパク質コンストラクトをＣＨＯ‐Ｋ１細胞で発現させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して上清からタンパク質を精製した。それぞれのＦＶＩＩＩ結合親和性を特性評価するために、等モル量のｖＷＦ‐ＦｃバリアントをＴＢＳＴバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Tween‐20）で調製し、９６ウェルマイクロプレートに４℃で一晩直接コーティングした。コーティング後、プレートをＴＢＳＴ‐３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）バッファーで室温（ＲＴ）で２時間ブロックし、組換えＦＶＩＩＩ（Prospec Bio社、ニュージャージー州イーストブランズウィック）の濃度を上げながら（０～４０００ｐＭ）室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。平衡化及び洗浄後、結合したＦＶＩＩＩをヒツジ抗ＦＶＩＩＩポリクローナル抗体で検出し、続いてそれ自体が西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヒツジＩｇＧに対する二次抗体で検出した。吸光度測定値からブランク値を差し引いた。アッセイは３連で行った。結合アッセイの分析は、４つ全てのｖＷＦ‐Ｆｃフラグメントが、完全長血漿由来ｖＷＦのＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩへの結合親和性に相当する同様の見かけの親和性定数（約５００ｐＭ）で組換えＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩに結合することを示した（Shiltagh et al., Blood, vol. 123, p. 4143‐4151, 2014）。
【0063】
実施例６ ｖＷＦバリアントＤ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃは、ＦＶＩＩＩ精製回収率を改善する
上記のように、成熟した野生型Ｐｒｏ‐Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃ融合タンパク質は、Ｄ３ドメインによって媒介されるＮ末端ジスルフィド結合及びＦｃドメインによって媒介されるＣ末端二量体化を介して、多量体形成、及びおそらくタンパク質凝集をもたらす。このような凝集は、プロテインＡのようなＦｃ親和性マトリックスへのｖＷＦ‐Ｆｃの結合を妨害し、さらに、ＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ‐Ｆｃ複合体からのＦＶＩＩＩ溶出は、凝集体の形成によって損なわれる。アミノ酸Ｃ１０９９及びＣ１１４２に変異を導入することにより、二量体形成が促進される一方で、多量体集合が中断され、均一なｖＷＦ‐Ｆｃ二量体の形成がもたらされる。したがって、プロテインＡマトリックスでのＦＶＩＩＩ捕捉（ＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ‐Ｆｃ複合体の形態で）及びＦＶＩＩＩ溶出（捕捉されたＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ‐Ｆｃ複合体からの）の両方が改善される。
上記のように、成熟した野生型Ｐｒｏ‐Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃ融合タンパク質は、Ｄ３ドメインによって媒介されるＮ末端ジスルフィド結合及びＦｃドメインによって媒介されるＣ末端二量体化を介して、多量体形成、及びおそらくタンパク質凝集をもたらす。このような凝集は、プロテインＡのようなＦｃ親和性マトリックスへのｖＷＦ‐Ｆｃの結合を妨害し、さらに、ＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ‐Ｆｃ複合体からのＦＶＩＩＩ溶出は、凝集体の形成によって損なわれる。アミノ酸Ｃ１０９９及びＣ１１４２に変異を導入することにより、二量体形成が促進される一方で、多量体集合が中断され、均一なｖＷＦ‐Ｆｃ二量体の形成がもたらされる。したがって、プロテインＡマトリックスでのＦＶＩＩＩ捕捉（ＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ‐Ｆｃ複合体の形態で）及びＦＶＩＩＩ溶出（捕捉されたＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ‐Ｆｃ複合体からの）の両方が改善される。
【0064】
ＦＶＩＩＩとＰｒｏ‐Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃ又はＤｅｌ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃのいずれかを共発現するトランスフェクト細胞からの細胞培養培地を、プロテインＡクロマトグラフィーを用いて精製した。ＦＶＩＩＩ‐ｖＷＦ精製回収率を表２にまとめた。結果は、ＦＶＩＩＩがＰｒｏ‐Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃ融合と共発現されるよりもＦＶＩＩＩがＤｅｌ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃと共発現される場合、ＦＶＩＩＩ‐ｖＷＦ精製回収率が著しく高いことを示している（８７％対６４％）。さらに、Ｐｒｏ‐Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃバリアントを使用したＦＶＩＩＩ精製中に、おそらく多数の高分子量多量体が存在するために、高いカラム背圧が一貫して観察された。
【0065】
【表2】
【0066】
実施例７ 組換えトランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃバリアントは、可溶性ＦＶＩＩＩ発現を増強する
ＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩが細胞系で単独で発現される場合、ＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩの９０％が細胞膜に結合することが示唆されるが、この理由は不明である（Kolind et al, J. Biotech., 2011, 151, pp. 357‐362）。この現象は、ＦＶＩＩＩ分子が血漿中のｖＷＦと非共有結合複合体で存在し、循環し、細胞膜とのＦＶＩＩＩ相互作用をブロックしたため、必然的に説明され得る。
ＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩが細胞系で単独で発現される場合、ＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩの９０％が細胞膜に結合することが示唆されるが、この理由は不明である（Kolind et al, J. Biotech., 2011, 151, pp. 357‐362）。この現象は、ＦＶＩＩＩ分子が血漿中のｖＷＦと非共有結合複合体で存在し、循環し、細胞膜とのＦＶＩＩＩ相互作用をブロックしたため、必然的に説明され得る。
【0067】
トランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃ融合タンパク質の共発現が組換えＦＶＩＩＩ発現を増加させることが可能かどうかを試験するために、４つの精製ｖＷＦ‐Ｆｃバリアント（Ｐｒｏ‐Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃタンパク質、Ｐｒｏ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔｓ‐Ｆｃタンパク質、Ｄｅｌ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃタンパク質、及びＤｅｌ‐Ｄ’Ｄ３‐Ｆｃタンパク質）、血漿ｖＷＦ、及びネガティブコントロールタンパク質（ＨＳＡ）をアッセイに含めた。
【0068】
４つのトランケート型組換えｖＷＦ‐Ｆｃバリアントを、ＣＨＯ細胞で発現し、プロテインＡクロマトグラフィーで精製した。ＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩと共発現するトランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃバリアントは、ＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩを細胞結合から保護することにより、細胞培養におけるＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩの収率を増加させ得ることを実証するために、ＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩを単独発現する細胞株の上清に、４つの組換えトランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃバリアントのそれぞれの等量、並びに完全長血漿由来ｖＷＦ（ＦＬ‐ｖＷＦ）を添加した。ネガティブコントロールとしてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を添加した。細胞培養上清のＦＶＩＩＩ活性は、各試料の１段階凝固アッセイを使用して２時間ごとに試験した。結果は、４つ全てのトランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃバリアント、及び血漿由来の完全長ｖＷＦが、細胞培養におけるＦＶＩＩＩ収率を大幅に増加させる可能性があることを示した。予想外に、Ｄｅｌ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃ融合は、ＦＶＩＩＩ発現に対して最も高い効果を示した（図９）。ＦＶＩＩＩを単独発現する細胞又はＨＳＡを添加した細胞培養物は、ＦＶＩＩＩ活性の検出可能な増加を示さなかった。
【0069】
実施例８ トランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃフラグメント（Ｄｅｌ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃ）とヒトＦＶＩＩＩとの共発現は、細胞膜へのＦＶＩＩＩの結合を完全にブロックした
Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、組換えタンパク質の生産中に細胞膜と有意に相互作用し、それによって細胞培養におけるその見かけの発現を低下させることが認識されている。
Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、組換えタンパク質の生産中に細胞膜と有意に相互作用し、それによって細胞培養におけるその見かけの発現を低下させることが認識されている。
【0070】
この観察を確認するために、ヒトＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩを単独発現する細胞からの細胞培養培地を、室温で５分間、０．５Ｍ ＮａＣｌ（塩イオンは、非特異的タンパク質‐表面相互作用を調節するために、荷電タンパク質上に電荷遮蔽／電気二重層を付与する）で処理し、次に遠心分離して上清を回収した。ＦＶＩＩＩ凝固活性は、ＮａＣｌ処理及び未処理の両方の上清に対して１段階凝固アッセイを使用して測定した。結果は、分泌されたＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩの９０％が細胞に結合したことを示した。対照的に、ＦＶＩＩＩがｖＷＦ‐ＦｃバリアントＤｅｌ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃと共発現する場合、ＮａＣｌの添加は細胞培養上清のＦＶＩＩＩ活性を増加させなかった。Ｄｅｌ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃは、細胞膜へのＦＶＩＩＩ結合を完全にブロックし、ほぼ１００％分泌された組換えＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩが細胞培養上清に放出されたことを示唆している。
【0071】
実施例９ 組換えトランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃバリアント（Ｄｅｌ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃ）は、細胞培養におけるＦＶＩＩＩのインビトロ安定性を強化した
文献によると、組換えＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩは、室温（ＲＴ）の細胞培養培地でのインビトロ安定性が低いことが示されている。
文献によると、組換えＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩは、室温（ＲＴ）の細胞培養培地でのインビトロ安定性が低いことが示されている。
【0072】
ｖＷＦとの共発現が細胞培養におけるＦＶＩＩＩの安定性を高める得るかどうかを判断するために、細胞培養で単独で発現するか、Ｄｅｌ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃバリアントと共発現するＦＶＩＩＩの安定性を評価した。ＦＶＩＩＩ又はＦＶＩＩＩ‐Ｄｅｌ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃ複合体のいずれかを含む細胞培養培地の試料を室温で試験し、各試料のＦＶＩＩＩ活性を、時間間隔（０、４、８、及び２４時間）で１段階凝固アッセイを使用して測定した。結果は、予想外に、Ｄｅｌ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃ ｖＷＦバリアントと共発現したＦＶＩＩＩが、室温で少なくとも２４時間、その活性を変化させずに維持し得ることを示した（図１０）。このｖＷＦ‐Ｆｃバリアントとの共発現がなければ、ＦＶＩＩＩは安定せず、その活性のほぼ９０％が２４時間で失われた（図１０）。
【0073】
実施例１０ トランケート型ｖＷＦ‐Ｆｃバリアント（Ｄｅｌ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃ）の共発現は、ウイルス不活化手順中に組換えＦＶＩＩＩを安定化した
組換えＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩを単独発現する細胞培養物、及びＤｅｌ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃ ｖＷＦバリアントと共発現するＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩを含む細胞培養物を、ウイルス不活化試薬（1%Triton X‐100及び０．３％リン酸トリ（ｎ‐ブチル））で２４時間処理した。ＦＶＩＩＩ凝固活性は、各試料について一定の間隔（不活化試薬で処理してから０、４、８、及び２４時間後）で１段階凝固アッセイを使用してモニターした。結果は、ＦＶＩＩＩを単独発現する細胞培養物は、８時間のウイルス不活化処理後にその活性のほぼ９０％を失ったことを示した。対照的に、ＦＶＩＩＩ‐ｖＷＦ‐Ｆｃを発現する細胞培養のＦＶＩＩＩ活性は、同じ期間に約４０％しか失われなかった。結果は、共発現されたｖＷＦ‐Ｆｃバリアントがウイルス不活化プロセス中にＦＶＩＩＩ活性化を実質的に安定化したことを示した（図１１）。これは、Ｄｅｌ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃバリアントがこれらの条件下で非常に安定していることを示している。
組換えＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩを単独発現する細胞培養物、及びＤｅｌ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃ ｖＷＦバリアントと共発現するＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩを含む細胞培養物を、ウイルス不活化試薬（1%Triton X‐100及び０．３％リン酸トリ（ｎ‐ブチル））で２４時間処理した。ＦＶＩＩＩ凝固活性は、各試料について一定の間隔（不活化試薬で処理してから０、４、８、及び２４時間後）で１段階凝固アッセイを使用してモニターした。結果は、ＦＶＩＩＩを単独発現する細胞培養物は、８時間のウイルス不活化処理後にその活性のほぼ９０％を失ったことを示した。対照的に、ＦＶＩＩＩ‐ｖＷＦ‐Ｆｃを発現する細胞培養のＦＶＩＩＩ活性は、同じ期間に約４０％しか失われなかった。結果は、共発現されたｖＷＦ‐Ｆｃバリアントがウイルス不活化プロセス中にＦＶＩＩＩ活性化を実質的に安定化したことを示した（図１１）。これは、Ｄｅｌ‐Ｄ’Ｄ３ｍｕｔ‐Ｆｃバリアントがこれらの条件下で非常に安定していることを示している。
【0074】
本発明、ならびにそれを作成及び使用する方法及びプロセスは、現在、それが関係する当業者が同じものを作成及び使用することを可能にするような完全、明確、簡潔且つ正確な用語で説明されている。前述のことは、本発明の好ましい実施形態を説明し、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲から逸脱することなく、本発明の中で修正を行うことができることを理解されたい。発明とみなされる対象を特に指摘し、明確に主張するために、以下の特許請求の範囲は明細書を結論付ける。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】