特許 7572713 １‐メチルニコチンアミドの測定方法及びニコチンアミド－Ｎ－メチル基転移酵素阻害剤のスクリーニング方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-10-16

(45)【発行日】2024-10-24

(54)【発明の名称】１‐メチルニコチンアミドの測定方法及びニコチンアミド－Ｎ－メチル基転移酵素阻害剤のスクリーニング方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/52 20060101AFI20241017BHJP

   C12Q 1/48 20060101ALI20241017BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20241017BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20241017BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20241017BHJP

【ＦＩ】

G01N33/52 C

C12Q1/48

G01N33/50 Z

G01N33/15 Z

C12N15/54 ZNA

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2020174186

(22)【出願日】2020-10-15

(65)【公開番号】P2022065544

(43)【公開日】2022-04-27

【審査請求日】2023-09-25

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和２年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「次世代がん医療創生研究事業」「代謝シグナルによる未分化性制御機構を標的とした新規がん治療法の開発」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】504160781

【氏名又は名称】国立大学法人金沢大学

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】平尾 敦

(72)【発明者】

【氏名】生越 友樹

(72)【発明者】

【氏名】上野 将也

【審査官】草川 貴史

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１６－２１８０７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１５／１８９３２５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１９／００３２１８９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０２０／０７４７７６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】MASAYA Ueno、他１７名，Pillar[6]arene acts as a biosensor for quantitative detection of a vitamin metabolite in crude biological samples ，Communications Chemistry ，2020年12月07日，Vol.3,No.183，https://doi.org/10.1038/s42004-020-00430-w，PMID:36703437

【文献】GUOCAN Yu、他６名，Pillar[6]arene/paraquat molecular recognition in water: high binding strength, pH-responsiveness, and application in controllable self-assembly, controlled release, and treatment of paraquat poisoning，J Am Chem Soc，2012年11月28日，Vol.134,No.47，Page.19489-19497. ， doi: 10.1021/ja3099905. Epub 2012 Nov 15.

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８

Ｃ１２Ｑ １／４８

Ｇ０１Ｎ ３３／１５

Ｃ１２Ｎ １５／５４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

複数の成分を含有する試料に含まれる１‐メチルニコチンアミドを測定する方法であって、
前記試料が、血液、血漿、血清、脳脊髄液、リンパ液、尿、漿液、関節液、眼房水、涙液及び唾液からなる群より選択される生物検体であり、
前記試料と、水溶性ピラー［６］アレーンとを混合し、混合物を得る工程（ただし、ヒト体内において混合物を得る場合を除く）と、
前記混合物の蛍光強度を測定する工程とを含む、
１‐メチルニコチンアミドの測定方法。

【請求項2】

前記生物検体が尿である、請求項１に記載の１‐メチルニコチンアミドの測定方法。

【請求項3】

ニコチンアミド‐Ｎ‐メチル基転移酵素（ＮＮＭＴ）阻害剤のスクリーニング方法であって、
ニコチンアミド存在下で、ＮＮＭＴと、ＮＮＭＴ阻害剤の候補物質とを接触させ、試料を得る工程（ただし、ヒト体内において試料を得る場合を除く）、
前記試料と、水溶性ピラー［６］アレーンとの混合物を得る工程、及び
前記混合物の蛍光強度を測定する工程を含む、ＮＮＭＴ阻害剤のスクリーニング方法。

【請求項4】

前記試料を得る工程が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで行われる、請求項３に記載のＮＮＭＴ阻害剤のスクリーニング方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、１‐メチルニコチンアミドの測定方法及びニコチンアミド－Ｎ－メチル基転移酵素阻害剤のスクリーニング方法に関する。

【背景技術】

【0002】

メタボリックシンドロームは、内臓肥満に、高血圧、脂質異常、高血糖などが合わさった状態のことを意味し、人の健康に深刻な悪影響をもたらすことが知られている。また、メタボリックシンドロームは、心疾患、血管疾患、２型糖尿病、及び様々な癌を発症するリスクと関連していることが知られている。

【0003】

これらの疾患では代謝異常が観察されることが知られていた（例えば非特許文献１参照）。代謝異常に関連する、尿中や、血中の代謝物の濃度を迅速かつ速やかに知ることは、疾患の診断にきわめて重要である。

【0004】

従来から、比較的大きな分子量を有するタンパク質の検出には、様々な特異的抗体が利用されてきた。例えばモノクロナール抗体によるタンパク質の特異的認識を利用し、生物検体中の特定のタンパク質を定量したり、簡単な方法や簡単な装置を用いてタンパク質の細胞内局在を可視化したりすることが従来から行われてきた（例えば非特許文献２参照）。これらの方法は、非常に迅速に実施することができるため、臨床診断及び大規模研究において有効な手法である。

【0005】

一方で、比較的低分子量の代謝物を定量する方法としては、高分解能核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）等が研究室で一般的に用いられている。しかしながら、これらの方法は、高価な装置と熟練したオペレータを必要とする。このため、これらの方法は薬物スクリーニングや大規模研究等のハイスループット解析には適していない。このため、代謝物が比較的低分子量である場合に使用可能な、特定の代謝物を特異的に認識するセンサーの開発が求められている。

【0006】

ところで、１‐メチルニコチンアミド（１‐ＭＮＡ）はビタミンＢ３（ナイアシン（ニコチン酸とニコチンアミドの総称））のアミド体であるニコチンアミドの一次代謝物であり、ニコチンアミド－Ｎ－メチル基転移酵素（ＮＮＭＴ（Ｅ．Ｃ．２．１．１．１））の酵素反応により生成される。ＮＮＭＴは、メチル基供与体として作用するＳ‐アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を用いて、ニコチンアミドのメチル化を触媒し、Ｓ‐アデノシル‐Ｌ‐ホモシステイン（ＳＡＨ）と１‐ＭＮＡを生成する。

【0007】

ニコチンアミドは食品から摂取する以外にも、生体内においてトリプトファンから生合成される。このため、ナイアシン及びトリプトファンの摂取量が不足すると、ペラグラと呼ばれる、ナイアシン欠乏症を引き起こすことが知られている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【文献】Intlekofer, A.M., and Finley, L.W.S. Metabolic signatures of cancer cells and stem cells. Nature Metabolism. (2019). 1, 177-188.

【文献】Ellington, A.A., Kullo, I.J., Bailey, K.R., and Klee, G.G. Antibody-based protein multiplex platforms: technical and operational challenges. Clinical Chemistry. (2010). 56, 186-193.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明者らは、分子量が約１３７と小さいために定量することが困難な１‐メチルニコチンアミドの濃度を速やかに知ることができれば、有用性は極めて高いと考えた。

【0010】

そこで、本開示の目的は、速やかに１‐メチルニコチンアミドの濃度を知ることが可能な、１‐メチルニコチンアミドの測定方法を提供することである。
また、本開示の別の目的は、ニコチンアミド－Ｎ－メチル基転移酵素（ＮＮＭＴ）阻害剤のスクリーニング方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行ったところ、水溶性ピラー［６］アレーンを用いることにより、前記課題を解決することができることを見出し、本開示に至った。

【0012】

本実施形態の態様例は、以下の通りに記載される。

【0013】

（１） 複数の成分を含有する試料に含まれる１‐メチルニコチンアミドを測定する方法であって、前記試料と、水溶性ピラー［６］アレーンとを混合し、混合物を得る工程と、前記混合物の蛍光強度を測定する工程とを含む、１‐メチルニコチンアミドの測定方法。
（２） 前記試料が生物検体である、（１）に記載の１‐メチルニコチンアミドの測定方法。
（３） 前記生物検体が尿である、（２）に記載の１‐メチルニコチンアミドの測定方法。
（４） ニコチンアミド‐Ｎ‐メチル基転移酵素（ＮＮＭＴ）阻害剤のスクリーニング方法であって、ニコチンアミド存在下で、ＮＮＭＴと、ＮＮＭＴ阻害剤の候補物質とを接触させ、試料を得る工程、前記試料と、水溶性ピラー［６］アレーンとの混合物を得る工程、及び前記混合物の蛍光強度を測定する工程を含む、ＮＮＭＴ阻害剤のスクリーニング方法。
（５） 前記試料を得る工程が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで行われる、（４）に記載のＮＮＭＴ阻害剤のスクリーニング方法。

【発明の効果】

【0014】

本開示により、速やかに１‐メチルニコチンアミドの濃度を知ることが可能な、１‐メチルニコチンアミドの測定方法を提供することができる。

【0015】

また、本開示により、ニコチンアミド－Ｎ－メチル基転移酵素（ＮＮＭＴ）阻害剤のスクリーニング方法も提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】１－ＭＮＡ生成量の基質（ニコチンアミド及びＳＡＭ）濃度依存性を評価した図である。

【図2】（ａ）１－ＭＮＡ生成量の酵素反応時間依存性を評価した図であり、（ｂ）ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳから求めた１－ＭＮＡの濃度と、蛍光測定から求めた％阻害の値の相関を示した図である。

【図3】１－ＭＮＡ生成量が６‐メトキシニコチンアミドの濃度に依存して阻害されることを評価した図である。

【図4】（ａ）マウス尿中のＬＣ‐ＭＳ／ＭＳから求めた１‐ＭＮＡの濃度と、蛍光測定から求めた％阻害の値を評価した図であり、（ｂ）ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳから求めた１‐ＭＮＡの濃度と、蛍光測定から求めた％阻害の値の相関を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本実施形態の一態様は、複数の成分を含有する試料に含まれる１‐メチルニコチンアミドを測定する方法であって、前記試料と、水溶性ピラー［６］アレーンとを混合し、混合物を得る工程と、前記混合物の蛍光強度を測定する工程とを含む、１‐メチルニコチンアミドの測定方法である。

【0018】

また、本実施形態の別の一態様は、ニコチンアミド‐Ｎ‐メチル基転移酵素（ＮＮＭＴ）阻害剤のスクリーニング方法であって、ニコチンアミド存在下で、ＮＮＭＴと、ＮＮＭＴ阻害剤の候補物質とを接触させ、試料を得る工程、前記試料と、水溶性ピラー［６］アレーンとの混合物を得る工程、及び前記混合物の蛍光強度を測定する工程を含む、ＮＮＭＴ阻害剤のスクリーニング方法である。

【0019】

本実施形態の一態様に係る１‐メチルニコチンアミドの測定方法では、水溶性ピラー［６］アレーンを用いることにより、ＮＭＲ分光法、ＨＰＬＣ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ等の方法、すなわち高価な装置と熟練したオペレータを必要とする方法で、１‐メチルニコチンアミドの測定を行った場合と、遜色のない精度で、１‐メチルニコチンアミドの濃度を知ることができる。蛍光強度の測定は、簡便な装置を用いて、容易かつ短時間で実施することが可能であるため、ハイスループット解析等様々な状況で本実施形態の一態様に係る１‐メチルニコチンアミドの測定方法を実施することができる。

【0020】

本実施形態の一態様に係るＮＮＭＴ阻害剤のスクリーニング方法では、水溶性ピラー［６］アレーンを用いることにより、混合物の蛍光強度を測定することにより、ＮＮＭＴ阻害剤の候補物質が、どの程度ＮＮＭＴを阻害しているか評価することができる。蛍光強度の測定は、簡便な装置を用いて、容易かつ短時間で実施することが可能であるため、本実施形態の一態様に係るＮＮＭＴ阻害剤のスクリーニング方法は、多くのＮＮＭＴ阻害剤の候補物質が存在する場合であっても、迅速にスクリーニングすることができる。

【0021】

以下、本実施形態について、詳細に説明する。
（水溶性ピラー［６］アレーン）
本実施形態では、水溶性ピラー［６］アレーンが使用される。ピラーアレーンは、ベンゼン環構造やキノイド構造などの六員環構造を２，５位にてメチレン鎖で連結し、環状構造を形成している化合物である。つまり、所定の繰り返し単位が連結した環状化合物である。ピラーアレーンは、Journal of the American Chemical Society ２００８，１３０，５０２２において初めて報告された化合物であり、以後さまざまな報告がされている。

【0022】

水溶性ピラー［６］アレーンは、ピラーアレーンの中でも、水溶性を有する化合物であり、かつ繰り返し単位が６個連結した環状化合物である。

【0023】

水溶性ピラー［６］アレーンとしては、例えば、下記式（１）で表される化合物を用いることができる。

【0024】

【化1】

（式（１）中、Ｘはそれぞれ独立に、水素、ナトリウム、又はアンモニウムである。）

【0025】

式（１）で表される水溶性ピラー［６］アレーンは、水中や水溶液中では、通常Ｘが電離し、アニオンとして存在する。式（１）で表される化合物のＸが電離した状態を式（１’）に示す。なお、本開示では、式（１）で表される水溶性ピラー［６］アレーンをＰ６Ａとも記し、該化合物が電離した状態（式（１’））をＰ６Ａ^－とも記す。水溶性ピラー［６］アレーンを含む混合物では、一部のＸが電離し、一部のＸは電離していない状態でもよく、本開示では、これらを厳密には区別しないものとする。

【0026】

【化2】

【0027】

Ｐ６Ａ^－は、水溶液中で、最大発光波長３３０ｎｍの蛍光を発する。なお、この時の励起波長は、好ましくは２３０ｎｍである。Ｐ６Ａ^－は、繰り返し単位が形成する環状構造中に、１‐メチルニコチンアミドが入りこみ結合すると、前記蛍光が消光する。このため、本実施形態では、Ｐ６Ａ^－の環状構造に化合物が結合していない場合の蛍光強度と比べた際の、蛍光強度の減少幅を、Ｐ６Ａ^－と、１‐メチルニコチンアミドとが結合した量の指標とすることができる。

【0028】

（試料）
本実施形態の一態様に係る１‐メチルニコチンアミドの測定方法における試料は、複数の成分を含有する試料である。なお複数の成分を含有する試料とは、水以外に２以上の成分を含有する試料を意味する。

【0029】

試料としては、例えば生物検体、食品、飼料（ペットフードを含む）、工業的に合成された不純物を含む１‐メチルニコチンアミド等が挙げられる。試料としては、様々な夾雑物を含むため一般に分析が困難な生物検体が好ましい。１‐メチルニコチンアミドの測定方法では、これらの試料に含まれる１‐メチルニコチンアミドの量を測定することができる。試料が固体の場合には、測定を容易に行うため、後述の混合物を得る工程の前に、水に溶かし水溶液として用いてもよい。

【0030】

試料が生物検体である場合には、生物検体は、１‐メチルニコチンアミドを含む可能性のある、生物由来の検体であればよく、特に制限されない。生物検体としては、測定が容易な、体液検体であることが好ましい。生物検体としては例えば、血液（血漿、血清）、脳脊髄液、リンパ液、尿、漿液、関節液、眼房水、涙液、唾液が挙げられる。なお、生物検体は、測定前に不純物を取り除く目的で前処理を行った後に、水溶性ピラー［６］アレーンと混合されてもよい。１‐メチルニコチンアミドは、代謝の過程で尿中に含まれることが知られているため、生物検体としては尿が好ましい。

【0031】

前記前処理としては、例えば生物検体に疎水性分子が含まれる場合には、疎水性分子の除去のためにスピンカラム等のカラムを用いた遠心操作を行うことができる。例えば尿等の生物検体には、トリプトファン等の蛍光を発する代謝物が含まれることがあるため、スピンカラム等のカラムを用いた前処理を行うことが好ましい。また、生物検体にタンパク質が溶解している場合にはタンパク質の除去のためにエタノール沈殿を行うことができる。

【0032】

生物検体は、いかなる生物由来の検体でもよいが、生物としては好ましくは哺乳動物、例えば、ヒト又は非ヒト動物が挙げられる。生物としては、具体的にはヒト、チンパンジー等の霊長類、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等の齧歯類、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の偶蹄目、ウマ等の奇蹄目、ウサギ、イヌ、ネコ等が挙げられる。

【0033】

試料が食品である場合には、食品としては、例えば、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、保健機能食品（例えば、機能性表示食品、特定保健用食品）、特別用途食品（例えば、幼児用食品、妊婦用食品）及びサプリメントが挙げられる。食品には１‐メチルニコチンアミド以外の成分が含まれており、１‐メチルニコチンアミド以外の成分としては、例えば、賦形剤、結合剤、希釈剤、添加剤、増粘剤、安定剤、乳化剤、分散剤、防腐剤、香料、着色剤等が挙げられる。

【0034】

試料が飼料である場合には、１‐メチルニコチンアミド及び前記食品の説明で記載した１‐メチルニコチンアミド以外の成分を含む物が挙げられる。なお、飼料とは、ヒト以外の動物に摂取させることを目的とした餌を意味する。

【0035】

試料が工業的に合成された不純物を含む１‐メチルニコチンアミドである場合には、その製法については、特に制限されない。

【0036】

（１‐メチルニコチンアミドの測定方法）
本実施形態の一態様である１‐メチルニコチンアミドの測定方法は、複数の成分を含有する試料に含まれる１‐メチルニコチンアミドを測定する方法であって、前記試料と、水溶性ピラー［６］アレーンとを混合し、混合物を得る工程と、前記混合物の蛍光強度を測定する工程とを含む。

【0037】

［混合物を得る工程］
１‐メチルニコチンアミドの測定方法における、混合物を得る工程では、前述の試料と、前述の水溶性ピラー［６］アレーンとを混合し、混合物が得られる。

【0038】

混合する試料と、水溶性ピラー［６］アレーンとの量としては、通常は試料中に含まれる１‐メチルニコチンアミドの量に対して、水溶性ピラー［６］アレーンの量が過剰になるように調整される。

【0039】

試料に含まれる１‐メチルニコチンアミドの量が、測定前に大よそ予測可能な場合には、その量に対して、水溶性ピラー［６］アレーンの量が十分過剰になるように、試料と、水溶性ピラー［６］アレーンとを混合すればよい。

【0040】

試料に含まれる１‐メチルニコチンアミドの量が、測定前に予測が困難である場合には、試料と、水溶性ピラー［６］アレーンとを、仮の量で混合し、一度測定を行い後述の％阻害が１００％に近い場合には、水溶性ピラー［６］アレーンの量を増やして再度測定を行い、％阻害が０％に近い場合には、水溶性ピラー［６］アレーンの量を減らして再度測定を行う等、適宜実験条件を調整すればよい。

【0041】

後述の％阻害が、１０～９５％、好ましくは３０～８０％になるように、試料と水溶性ピラー［６］アレーンとの量を調整することが好ましい。なお、複数の試料を同条件で比較する場合には、複数の試料の中で後述の％阻害が最も大きくなるものが、１０～４０％、好ましくは３０～４０％になるように、試料と水溶性ピラー［６］アレーンとの量を調整することが好ましい。これらの数値範囲の上限値及び下限値は、それぞれ任意に組み合わせて好ましい範囲を規定することができる。

【0042】

混合は、試料に対して、水溶性ピラー［６］アレーンを加えてもよく、水溶性ピラー［６］アレーンに対して、試料を加えてもよい。混合の際には、攪拌等を行ってもよい。水溶性ピラー［６］アレーンは、化合物をそのまま用いてもよく、水溶液等の溶液として用いてもよい。なお、容易に蛍光を測定するために、得られる混合物は好ましくは溶液、より好ましくは水溶液として調製される。混合の際には、必要に応じて、水を別途添加してもよい。

【0043】

混合を行う際の温度としては、特に制限はなく、冷却条件下で行ってもよく、室温で行ってもよく、加温条件下で行ってもよいが、好ましくは冷却条件下又は室温で行われる。具体例としては、温度は１６℃～３０℃で行うことが好ましく、２０℃～２５℃で行うことがより好ましい。これらの数値範囲の上限値及び下限値は、それぞれ任意に組み合わせて好ましい範囲を規定することができる。なお、後述の実施例では、温度については室温、２０℃～２５℃の範囲で行った。

【0044】

［蛍光強度を測定する工程］
１‐メチルニコチンアミドの測定方法における、蛍光強度を測定する工程では、前述の混合物を得る工程で得られた混合物の蛍光強度が測定される。
蛍光強度の測定方法としては、分光蛍光光度計等を用いて測定すればよく、特に制限はされない。試料数が多い場合、一つあたりの試料量が少ない場合等は、蛍光測定機能を備えたマルチ検出モードプレートリーダー、例えばＳｐａｒｋ（テカン（TECAN）製）等を用いてもよい。

【0045】

蛍光強度を測定する際の温度としては、特に制限はなく、冷却条件下で行ってもよく、室温で行ってもよく、加温条件下で行ってもよいが、好ましくは冷却条件下又は室温で行われる。具体例としては、温度は１６℃～３０℃で行うことが好ましく、２０℃～２５℃で行うことがより好ましい。これらの数値範囲の上限値及び下限値は、それぞれ任意に組み合わせて好ましい範囲を規定することができる。なお、後述の実施例では、温度については室温２０℃～２５℃の範囲で行った。

【0046】

蛍光強度については、蛍光がどの程度阻害されているか、すなわち、下記式（Ｉ）で表される％阻害で評価することが好ましい。％阻害は、１‐メチルニコチンアミドと結合していない水溶性ピラー［６］アレーンの蛍光強度を初期値（Ｆ０）とし、混合物の蛍光強度をＦとして求めることができる。例えば、尿と、水溶性ピラー［６］アレーンとの混合物の蛍光強度を測定する際には、１‐メチルニコチンアミドを実質的に含まないＮｎｍｔ欠損マウスから採取した尿サンプルと水溶性ピラー［６］アレーンとを混合し、測定対象の混合物と同濃度の水溶性ピラー［６］アレーンを含むサンプルを調製し、該サンプルの蛍光強度をＦ０して採用することにより、％阻害を算出することができる。なお、本開示において１‐メチルニコチンアミドを実質的に含まないとは、例えばＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した際に、１‐メチルニコチンアミドが、検出されないか５０ｎＭ以下で検出されることを意味し、好ましくは検出されないか５ｎＭ以下で検出されることを意味する。

【0047】

％阻害＝［１－（Ｆ／Ｆ０）]×１００ ・・・（Ｉ）
式（Ｉ）においてＦは、混合物の蛍光強度を示す。Ｆ０は混合物と同濃度の水溶性ピラー［６］アレーンを含む１‐メチルニコチンアミドを実質的に含まないサンプルの蛍光強度を示す。

【0048】

本実施形態の一態様である１‐メチルニコチンアミドの測定方法で、得られた％阻害の結果は、後述の実施例で示したように、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで測定した結果と、非常に近似したものであった。

【0049】

ピラー［６］アレーンは、環状構造を有する化合物であり、その環の中に別の化合物（ゲスト化合物）が入りこみ、結合することは従来から知られていた。この結合を形成するか否かは、ピラーアレーンの環の大きさと極性、及びゲスト化合物の大きさと極性等の関係で決まるが、ゲスト化合物の特異性はほとんど研究されていなかった。このため、複数の成分を含有する試料における、ある物質の量をピラーアレーンを利用して測定することは、従来検討されていなかった。特に生物検体は、様々な代謝物等を含むため、多種多様な化合物を含む混合物であり、その中から、特定の成分を特異的に吸着することはできないと考えられていた。また、超分子を用いて生物検体中の特定の分子を特異的に吸着する等の報告は発明者の知る限りなく、このような発想自体が存在しなかった。

【0050】

本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、生物検体、好ましくは尿中の１‐メチルニコチンアミドと、超分子の一種である水溶性ピラー［６］アレーンとが特異的に結合し、蛍光強度を測定することにより、１‐メチルニコチンアミドの量が分かることを見出した。この結果は極めて予想が難しいものであった。

【0051】

また、本実施形態の一態様である１‐メチルニコチンアミドの測定方法は、様々な応用が可能である。

【0052】

例えば、メタボリックシンドロームでは、代謝異常により、ＮＮＭＴの活性が亢進し、ニコチンアミドからの１‐メチルニコチンアミドの生成が増加することがある。このため、本実施形態の一態様である１‐メチルニコチンアミドの測定方法の応用例としては、被検体に１‐メチルニコチンアミドの測定方法を実施する工程と、その結果と対照群の測定値を比較する工程とを有する、メタボリックシンドローム診断補助方法を提供することができる。なお、対照群としては、特に制限はないが、健常者の対照群、メタボリックシンドロームと確定診断されている患者の対照群等の測定値をあらかじめ用意することが好ましい。

【0053】

別の例としては、ペラグラは、ナイアシン及びトリプトファンの摂取量が不足することが原因であると知られている。ナイアシン及びトリプトファンの摂取量が不足すると、その代謝物である１‐メチルニコチンアミドの量も低下すると考えられる。このため、本実施形態の一態様である１‐メチルニコチンアミドの測定方法の応用例としては、被検体に１‐メチルニコチンアミドの測定方法を実施する工程と、その結果と対照群の測定値を比較する工程とを有する、ペラグラ診断補助方法を提供することができる。なお、対照群としては、特に制限はないが、健常者の対照群、ペラグラと確定診断されている患者の対照群等の測定値をあらかじめ用意することが好ましい。

【0054】

また、別の例としては、一部のがんにおいては、がん組織において、１‐メチルニコチンアミド産生量が亢進することが知られている。このため、本実施形態の一態様である１‐メチルニコチンアミドの測定方法の応用例としては、被検体に１‐メチルニコチンアミドの測定方法を実施する工程と、その結果と対照群の測定値を比較する工程とを有する、がん診断補助方法を提供することができる。なお、対照群としては、特に制限はないが、健常者の対照群、がんと確定診断されている患者の対照群等の測定値をあらかじめ用意することが好ましい。

【0055】

生物検体中の１‐メチルニコチンアミドが増減する理由は複数考えられるため、前記応用例は、各応用例単独で、ヒトを診断する方法に該当することはなく、診断補助方法にとどまる。これらの補助方法を検査技師等の医師以外の者が実施し、補助方法により得られた結果を医師に提供し、医師が他の検査結果と組み合わせることにより、患者がある疾患に罹患しているか診断することを可能にする。

【0056】

（ＮＮＭＴ阻害剤のスクリーニング方法）
本実施形態の一態様であるニコチンアミド‐Ｎ‐メチル基転移酵素（ＮＮＭＴ）阻害剤のスクリーニング方法は、ニコチンアミド存在下で、ＮＮＭＴと、ＮＮＭＴ阻害剤の候補物質とを接触させ、試料を得る工程、前記試料と、水溶性ピラー［６］アレーンとの混合物を得る工程、及び前記混合物の蛍光強度を測定する工程を含む。なお、ＮＮＭＴ阻害剤とは、ＮＮＭＴの酵素活性を阻害することが可能な物質であればよく、例えばタンパク質であってもよく、低分子化合物であってもよい。また、ＮＮＭＴ阻害剤の候補物質としては、人工的に合成された物質であってもよく、天然資源から抽出された物質であってもよい。

【0057】

［試料を得る工程］
ＮＮＭＴ阻害剤のスクリーニング方法における、試料を得る工程では、ニコチンアミド存在下で、ＮＮＭＴと、ＮＮＭＴ阻害剤の候補物質とを接触させ、試料が得られる。試料を得る工程は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで行うことができる。なお、ＮＮＭＴとしては、実施例で使用したＧＳＴ‐ＮＮＭＴのような融合タンパク質を用いてもよい。

【0058】

試料を得る工程をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う場合には、例えば、緩衝液中にＮＮＭＴ、ニコチンアミド、Ｓ‐アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）及び、ＮＮＭＴ阻害剤の候補物質を加え、酵素反応を行い、試料を得る方法が挙げられる。

【0059】

試料を得る工程をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う別の例としては、緩衝液、液体培地等の液体媒体中のＮＮＭＴ発現細胞に、ニコチンアミド、Ｓ‐アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）及び、ＮＮＭＴ阻害剤の候補物質に接触させ、前記細胞内での酵素反応を行い、前記液体媒体又は細胞破砕物を試料として得る方法が挙げられる。

【0060】

試料を得る工程をｉｎ ｖｉｖｏで行う場合には、例えば、前記（試料）の項目で記載した生物に、ＮＮＭＴ阻害剤の候補物質を投与し、生物の体内に存在するＮＮＭＴ、ニコチンアミド、Ｓ‐アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）と、ＮＮＭＴ阻害剤の候補物質とを接触させ試料を得る方法が挙げられる。なお、生物にはニコチンアミドの投与を行ってもよく、ＳＡＭの投与を行ってもよい。

【0061】

［混合物を得る工程］
ＮＮＭＴ阻害剤のスクリーニング方法における、混合物を得る工程では、前記試料と、水溶性ピラー［６］アレーンとの混合物が得られる。

【0062】

試料を得る工程を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行った場合には、例えば試料に対して、水溶性ピラー［６］アレーンを加えてもよく、水溶性ピラー［６］アレーンに対して試料を加えてもよい。加える際、又は加えた後には適宜攪拌等を行ってもよい。前記試料を得る工程と、混合物を得る工程との間には、精製工程を含んでいてもよい。また、試料を得る工程において、同時に水溶性ピラー［６］アレーンを加えることにより、試料を得る工程と、混合物を得る工程とを同時に行ってもよい。

【0063】

試料を得る工程を、ｉｎ ｖｉｖｏで行った場合には、例えば試料を、生物の尿等の検体として回収し、検体に対して水溶性ピラー［６］アレーンを加えてもよく、水溶性ピラー［６］アレーンに検体を加えてもよい。加える際、又は加えた後には適宜攪拌等を行ってもよい。前記試料を得る工程と、混合物を得る工程との間には、精製工程を含んでいてもよい。また、試料を得る工程において、経口投与、注射（例えば静脈注射、皮下注射）等の方法により、生物の体内中に水溶性ピラー［６］アレーンを加えることにより、試料を得る工程と、混合物を得る工程とを同時に行ってもよい。なお、水溶性ピラー［６］アレーンを注射により、静脈内に投与した場合には、検体は血液であることが好ましい。

【0064】

混合物を得る工程では、水溶性ピラー［６］アレーンは、化合物をそのまま用いてもよく、水溶液等の溶液として用いてもよい。

【0065】

［蛍光強度を測定する工程］
ＮＮＭＴ阻害剤のスクリーニング方法における、蛍光強度を測定する工程では、前記混合物の蛍光強度を測定する。蛍光強度を測定する工程は、前記１‐メチルニコチンアミドの測定方法における［蛍光強度を測定する工程］と同様の方法で行うことができる。

【0066】

本実施形態の一態様であるＮＮＭＴ阻害剤のスクリーニング方法を行うことにより、あるＮＮＭＴ阻害剤の候補物質の％阻害の結果が優れている場合、すなわち％阻害が高い場合に、このＮＮＭＴ阻害剤の候補物質を、ＮＮＭＴ阻害剤として用いることができる可能性が高い物質として、さらなる研究を行うことができる。ＮＮＭＴ阻害剤のスクリーニング方法としては、より容易に実施可能なｉｎ ｖｉｔｒｏでのスクリーニングを行い、ｉｎ ｖｉｔｒｏで有望な結果が得られた候補物質に対して、ｉｎ ｖｉｖｏでのスクリーニングを行うことが好ましい。

【実施例】

【0067】

以下、実施例を挙げて本実施形態を説明するが、本開示はこれらの例によって限定されるものではない。

【0068】

（水溶性ピラー［６］アレーン（Ｐ６Ａ）の合成）
水溶性ピラー［６］アレーン（Ｐ６Ａ）を、J Am Chem Soc. (2012), 134, 19489-19497.に記載された方法に従って合成した。なお、実施例では水溶性ピラー［６］アレーン（Ｐ６Ａ）は全て水溶液の状態で使用した。

【0069】

なお、水溶性ピラー［６］アレーン（Ｐ６Ａ）は、通常水中、水溶液中で電離した状態で存在するため、電離した状態の水溶性ピラー［６］アレーン（Ｐ６Ａ^－）を式（１’）に示した。

【0070】

【化3】

【0071】

（ＮＮＭＴ発現ベクターの構築）
グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質発現系を用いて、ＮＮＭＴ組換えタンパク質の生成を行った。

【0072】

大腸菌でＧＳＴ‐ＮＮＭＴ融合タンパク質を生産するための発現ベクターを構築するために、ＮＮＭＴタンパク質をコードするＤＮＡ断片を増幅した。

【0073】

まず、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成するために、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ逆転写キット（ＱＩＡＧＥＮ製、ドイツ）を用いて逆転写反応を行った。

【0074】

ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用い、製品のマニュアルに従い、ヒト白血病細胞株Ｋ５６２から全ＲＮＡを単離し、全ＲＮＡ１μｇからｃＤＮＡを合成した。

【0075】

ＮＮＭＴ遺伝子を増幅するために、ＤＮＡ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｅｘ Ｔａｑ；タカラバイオ株式会社製、日本）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。
合成されたｃＤＮＡを、以下に示すようにＰＣＲにおいて鋳型ＤＮＡとして用いた。ＰＣＲプライマーのペアは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（米国）から購入した。

【0076】

センスプライマーは、５’ヌクレオチド配列に由来し、下記配列を有していた。
[5’- GAA TTC CAT GGA ATC AGG CTT CAC CTC CAA-3’]（配列番号１）

【0077】

アンチセンスプライマーは、ヒトＮＮＭＴ遺伝子の３’末端に由来し、下記配列を有していた。
[5’- CTC GAG TCA CAG GGG TCT GCT CAG CTT CCT-3’]（配列番号２）に由来した。

【0078】

なお、クローニングのために、センスプライマーは５’末端にＥｃｏＲＩ制限酵素認識配列（配列番号１の５'末端側６塩基）を含み、アンチセンスプライマーは５’末端にＸｈｏＩ制限酵素認識配列（配列番号２の５'末端側６塩基）を含む。

【0079】

ＰＣＲは、９４℃で２分間の初期変性を行い、続いて９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で１分間を４０サイクル行い、そして７２℃で５分間の最後の伸長ステップを行った。

【0080】

ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片（ＮＮＭＴコード領域）及びｐＧＥＸ‐４Ｔ‐３プラスミド（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製、米国）をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化した。消化後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて、両ＤＮＡを連結し、ｐＧＥＸ‐ＮＮＭＴを構築した。ｐＧＥＸ‐４Ｔ‐３プラスミドはｌａｃオペレータ制御下にＧＳＴ遺伝子を含み、ＧＳＴ遺伝子の下流にＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩサイトを含むマルチクローニングサイトを含む。このため構築された前記ｐＧＥＸ‐ＮＮＭＴは、ｌａｃオペレータ制御下にＧＳＴ遺伝子及びＮＮＭＴ遺伝子を含む。

【0081】

（ＮＮＭＴ組換えタンパク質の精製）
前記コンストラクト（ｐＧＥＸ‐ＮＮＭＴ）を用いて大腸菌（E. coli DH5α (東洋紡株式会社製、日本)）を形質転換した。

【0082】

得られた形質転換体を、アンピシリン(0.1mg/mL)を含むLB培地で、37℃の振とうインキュベーター中で増殖させた。融合タンパク質の発現は、０．１ｍＭイソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（富士フイルム和光純薬株式会社製、日本）を添加して誘導した。

【0083】

ＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ‐ＮＮＭＴ）を、グルタチオンセファロース（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラム（ＧＥ ヘルスケア製、米国）により細菌溶解物から精製した。

【0084】

過剰の還元型グルタチオンを添加することにより、グルタチオンカラムからタンパク質が溶出した。緩衝液からグルタチオンを除去するために、溶出したタンパク質をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に対して透析した。

【0085】

（ＮＮＭＴ組換えタンパク質のゲル電気泳動）
６０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、２％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、１０％のグリセロール、及び５％の２－メルカプトエタノールを含むＳＤＳ試料緩衝液にＧＳＴ‐ＮＮＭＴを溶解し、試料とした。試料を９５℃で５分間加熱し、ポリアクリルアミド勾配（４～２０％）ゲル（富士フイルム和光純薬株式会社製）で電気泳動により分離した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ－２５０を用いて染色し、タンパク質を可視化した。

【0086】

ＧＳＴ‐ＮＮＭＴは単一の主要タンパク質バンドが観察され、純度が十分に高いことが確認された。

【0087】

（無細胞系におけるニコチンアミドのメチル化アッセイ‐１）
ＮＮＭＴによるメチル基転移反応を以下の方法で行った。

【0088】

緩衝液として、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ ８．０）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、３ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴを含むものを用いた。

【0089】

緩衝液に３００μｇ／ｍｌのＧＳＴ‐ＮＮＭＴ、並びに、ニコチンアミド及びＳ‐アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を加えた。ニコチンアミド及びＳ‐アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）は、０～１ｍＭの範囲で、同濃度で加えた。ニコチンアミド及びＳ‐アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の濃度を変えた複数のサンプルを用意した。

【0090】

３７℃で３時間酵素反応を行った。酵素反応後、サンプルチューブに２０倍量のエタノールを加えて、タンパク質を沈殿させた後、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して除去した。

【0091】

エタノール混合物を別のチューブに移し、蒸発させた。すべてのエタノールを蒸発さっせた後、得られたペレットを超純水(メルクミリポア製、アメリカ）で再懸濁し、測定試料を得た。

【0092】

（無細胞系におけるニコチンアミドのメチル化アッセイ‐２）
ＮＮＭＴによるメチル基転移反応を以下の方法で行った。

【0093】

ニコチンアミド及びＳ‐アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の濃度を、それぞれ１ｍＭとし、酵素反応時間を、０分、１分、５分、１０分、２０分、３０分、４０分、又は６０分とした以外は、前述のメチル化アッセイ‐１と同様に行い、測定試料を得た。

【0094】

（ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳによる１‐ＭＮＡの定量）
前記測定試料中に含まれる１‐ＭＮＡを、ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフ質量分析計）を用いて定量した。
１‐ＭＮＡの濃度は、ＬＣ‐ＭＳ‐８０５０トリプル四重極型ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（株式会社島津製作所製、日本）とＬＣ－３０Ａシステム（株式会社島津製作所製）を組み合わせて測定した。

【0095】

クロマトグラフィーは、ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ ａｍｉｄｅカラム（ＩＤ ２．０ｍｍ ×５０ｍｍ；ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、４０℃でステップグラジエント法（流速、０．４ｍＬ／ｍｉｎ）により行った。

【0096】

溶離液としては、0.1％のギ酸を含む水（Ａ）と、0.1％のギ酸を含むアセトニトリル（Ｂ）とを混合したものを、以下のように組成を変えながら使用した。
０～２．０分 １３％Ａ／８７％Ｂ、
２．０～２．５分 １３％Ａ／８７％Ｂ～５０％Ａ／５０％Ｂ、
２．５～４．０分 ５０％Ａ／５０％Ｂ、
４．０～４．５分 ５０％Ａ／５０％Ｂ～１３％Ａ／８７％Ｂ、
４．５～７．０分 １３％Ａ／８７％Ｂ

【0097】

各化合物の分子イオンとプロダクトイオンの質量数は次のとおりであった。
１‐ＭＮＡ（１３７．２→９４．２、ＣＥ －２２．０ Ｖ）、
１‐ＭＮＡ‐ｄ３（トロントリサーチケミカルズ製、カナダ）（１４０．０→９７．２、 ＣＥ －２２．０ Ｖ）。
検出限界は各化合物で１ｎｇ／ｍＬであった。

【0098】

前記無細胞系におけるニコチンアミドのメチル化アッセイ‐１で得られた測定試料より、１‐ＭＮＡ生成量の基質（ニコチンアミド及びＳＡＭ）濃度依存性を評価し、図１左図に示した。

【0099】

前記無細胞系におけるニコチンアミドのメチル化アッセイ‐２で得られた測定試料より、１‐ＭＮＡ生成量の酵素反応時間依存性を評価し、図２ａ左図に示した。

【0100】

（Ｐ６Ａ^－を用いた蛍光測定による１‐ＭＮＡの定量）
５０μＬの前記測定試料に、１５０μＬのＰ６Ａ^－（最終濃度は、水中で２０μＭ）を加え、９６ウェルプレートのウェルに入れた。次いで、Ｓｐａｒｋ（テカン（TECAN）製、スイス）を用いて、直ちに蛍光スペクトルを測定した。

【0101】

Ｐ６Ａ^－は１‐ＭＮＡを細孔中に取り込むと、蛍光（最大発光波長３３０ｎｍ）が消光することが知られている。各測定試料において蛍光がどの程度阻害されているのか、以下の式（Ｉ）により算出した。
％阻害＝［１－（Ｆ／Ｆ０）]×１００ ・・・（Ｉ）
上記式においてＦは、各測定試料の蛍光強度を示す。Ｆ０は酵素反応前（反応時間０分）の蛍光強度を示す。％阻害は、図において％ inhibitionと記す。

【0102】

前記無細胞系におけるニコチンアミドのメチル化アッセイ‐１で得られた測定試料より、１‐ＭＮＡ生成量の基質（ニコチンアミド及びＳＡＭ）濃度依存性を評価し、図１右図に示した。

【0103】

前記無細胞系におけるニコチンアミドのメチル化アッセイ‐２で得られた測定試料より、１‐ＭＮＡ生成量の酵素反応時間依存性を評価し、図２ａ右図に示した。
図２ａに示した、ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳから求めた１‐ＭＮＡの濃度と、蛍光測定から求めた％阻害の値との相関を図２ｂに示す。Ｒ^２が０．９７７１と非常に高く、両者の結果は正確に一致していることが確認された。

【0104】

（無細胞系におけるニコチンアミドのメチル化抑制の観測）
ＮＮＭＴの阻害剤として報告されている６‐メトキシニコチンアミドを用い、６‐メトキシニコチンアミド存在下でのＮＮＭＴによるメチル基転移反応について観測した。

【0105】

緩衝液として、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ ８．０）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、３ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＤＴＴを含むものを用いた。

【0106】

緩衝液に３００μｇ／ｍｌのＧＳＴ‐ＮＮＭＴ、１ｍＭのニコチンアミド、１ｍＭのＳ‐アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）及び６‐メトキシニコチンアミドを加えた。６‐メトキシニコチンアミドは、０～１．２５ｍＭの範囲で加えた。６‐メトキシニコチンアミドの濃度を変えた複数のサンプルを用意した。

【0107】

３７℃で３時間酵素反応を行った。酵素反応後、サンプルチューブに２０倍量のエタノールを加えて、タンパク質を沈殿させた後、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して除去した。

【0108】

エタノール混合物を別のチューブに移し、蒸発させた。すべてのエタノールを蒸発さっせた後、得られたペレットを超純水(メルクミリポア製、アメリカ）で再懸濁し、測定試料を得た。

【0109】

前述の（ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳによる１‐ＭＮＡの定量）及び（Ｐ６Ａ^－を用いた蛍光測定による１‐ＭＮＡの定量）に記載した方法で、１－ＭＮＡの定量を行った。
結果を図３に示す。図３に示したように、ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ（図３左図）、蛍光測定（図３右図）のいずれでも６‐メトキシニコチンアミドの濃度依存的に、１－ＭＮＡ濃度が減少することが示された。この結果より、Ｐ６Ａ^－を用いた蛍光測定が、ＮＮＭＴ阻害剤のスクリーニング方法に使用可能であることが示唆された。

【0110】

（実験動物）
以下の遺伝子組換え動物の作出及びマウスを用いた実験は、金沢大学動物実験委員会（the Committee for Ethical Use of Experimental Animals at Kanazawa University）により承認済である。

【0111】

（Ｎｎｍｔ ＫＯマウスの樹立）
受精卵において、ゲノムＤＮＡからＮｎｍｔ遺伝子のエクソン２のＣＲＩＳＰＲ媒介除去を行った。

【0112】

エクソン２の欠失はオープンリーディングフレームとノックアウト（ＫＯ）遺伝子のフレームシフトを引き起こした。

【0113】

マウスＮｎｍｔを標的とするｇＲＮＡの調製のために、Ｎｎｍｔのイントロン１の３’末端を標的とするｇＲＮＡ＃１（5’‐GGA TTG TGC CAT TTT TGT TG-3'）（配列番号３）とＮｎｍｔのイントロン２の５’末端を標的とするｇＲＮＡ＃２（5’‐TGT ACC ACC AGA GTA CTA TT-3'）（配列番号４）を設計した。ｇＲＮＡを生成するための各ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ＩＤＴ）（米国）によってＡｌｔ－Ｒ ＣＲＩＳＰＲ ｃｒＲＮＡ（製品）として合成された。

【0114】

受精前核期胚は、雄性のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本エスエルシー株式会社）の精子と過剰排卵した雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの卵母細胞を用いて、ヒト卵管液培地（ＨＴＦ；アーク・リソース株式会社、日本）中で体外受精により調製した

【0115】

次に、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、米国）に懸濁したｃｒＲＮＡ（各２μＭ）、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ＩＤＴ、４μＭ）及びＣａｓ９タンパク質（ＩＤＴ、１００ｎｇ／μＬ）の複合体を、エレクトロポレーションにより前核期胚に導入した。

【0116】

エレクトロポレーション後、胚を洗浄し、一晩カリウムシンプレックス最適化培地（ＫＳＯＭ；アーク・リソース株式会社）で一晩培養した。培養で得られた２細胞胚を偽妊娠レシピエントＩＣＲマウス（日本クレア株式会社、日本）に移植した。

【0117】

移植された胚から誕生したマウスをＦ０世代とした。Ｆ０世代のマウスの遺伝子型を、尾部生検により抽出したゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲにより解析した。

【0118】

ゲノム編集領域を含むＤＮＡ断片を増幅するために、プライマー5’-TTT ACC CAC TGA CCG TCT CC-3’（配列番号５）及び5’-GAC CAT CAC TCC AGG CCT TA-3’（配列番号６）、並びに、ＧｏＴａｑ（プロメガ社、米国）を用いて、ジェノタイピングＰＣＲを行った。

【0119】

ＰＣＲは、９５℃で２分間の初期変性を行い、続いて９５℃で３０秒間、５８℃で３０秒間及び７２℃で１分間を３５サイクル行い、そして７２℃で７分間の最後の伸長ステップを行った。

【0120】

ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上で電気泳動し、エチジウムブロミド染色によりＤＮＡを可視化した。

【0121】

ＣＲＩＳＰＲ編集をサンガー配列決定法により検証するために、ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＰＣＲ産物をゲル精製し、ｐＧＥＭ‐Ｔ Ｅａｓｙベクター（プロメガ社）を用いてＴＡクローニングを行った。

【0122】

ゲノム編集されたマウスにおけるＤＮＡ配列を決定するために、サンガー配列決定法でプラスミドＤＮＡが利用された。

【0123】

得られた２匹のファウンダー（Ｆ０）マウスは、３つの対立遺伝子は、２つのｇＲＮＡ、すなわちｇＲＮＡ＃１及びｇＲＮＡ＃２の標的となる部分に隣接する領域を除去する欠失を保有していた。

【0124】

次に、Ｎｎｍｔヘテロ接合性欠失対立遺伝子を保有する１匹の変異マウス（＃２）を野生型マウスと戻し交配し、Ｆ１世代を得て、Ｎｎｍｔ変異対立遺伝子を精製した。戻し交配は、Ｆ０世代の対立遺伝子の不均一性又はモザイク性のために生じたと考えられる表現型変異を除くことを可能にした。

【0125】

３世代の戻し交配と近親交配の後、Ｎｎｍｔヘテロ接合体欠損（Ｈｔ）マウスを交配することにより、Ｎｎｍｔホモ接合体欠損マウス（Ｎｎｍｔ ＫＯマウス）を作製した。

【0126】

（マウス尿中の１‐ＭＮＡの定量）
実験にはＣ５７ＢＬ／６マウス雌を日本エスエルシー株式会社（日本）から購入して使用した。
なお、陰性コントロールとして、前記Ｎｎｍｔ ＫＯマウスを使用した。

【0127】

Ｃ５７ＢＬ／６マウス雌にニコチンアミドを含まない飲料水を自由接種させた。飲料水を２日間与えた後、尿をマウスごとに採取した。採尿のために、各マウスをペトリ皿上に保持し、膀胱付近を穏やかに押して膀胱を刺激し、排尿を促した。なお、この尿を分析した結果を、図４中ではＷｔと表記した。

【0128】

Ｃ５７ＢＬ／６マウス雌に２ｍｇ／ｍＬのニコチンアミドを含む飲料水を自由接種させた。飲料水を２日間与えた後、尿をマウスごとに採取した。採尿のために、各マウスをペトリ皿上に保持し、膀胱付近を穏やかに押して膀胱を刺激し、排尿を促した。なお、この尿を分析した結果を、図４中ではＷｔ＋ＮＡと表記した。

【0129】

Ｎｎｍｔ ＫＯマウスにニコチンアミドを含まない飲料水を自由接種させた。飲料水を２日間与えた後、尿をマウスごとに採取した。採尿のために、各マウスをペトリ皿上に保持し、膀胱付近を穏やかに押して膀胱を刺激し、排尿を促した。なお、この尿を分析した結果を、図４中ではＮｎｍｔ ＫＯと表記した。

【0130】

前述の（ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳによる１‐ＭＮＡの定量）及び（Ｐ６Ａ^－を用いた蛍光測定による１‐ＭＮＡの定量）に記載した方法で、尿中の１－ＭＮＡの定量を行った。マウスの種類ごとに１－ＭＮＡ量を平均し、ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳによる１‐ＭＮＡの定量結果（図４ａ左図）、及びＰ６Ａ^－を用いた蛍光測定による１‐ＭＮＡの定量結果（図４ａ右図）示した。

【0131】

なお、Ｐ６Ａ^－を用いた蛍光測定による１‐ＭＮＡの定量の前に、尿について以下の前処理を行った。
尿試料から疎水性分子を除去するために、シリカモノリスを用いた前処理用スピンカラムであるＭｏｎｏＳｐｉｎ Ｃ１８カラムを用いた。スピンカラムの前処理は、０．２ｍＬのメタノールを用いて５，０００ｒｐｍで１分間、次いで０．２ｍＬのＰＢＳを用いて５，０００ｒｐｍで１分間行った。

【0132】

次に、合計５０μＬの尿サンプルを前処理したカラムに供給し、５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行った。このステップをさらに二回行った。

【0133】

得られたフロースルーをエタノール沈殿法によりさらに精製した後、蛍光測定に用いた。蛍光測定は、精製後の尿５μＬを、１９５μＬのＰ６Ａ^－（最終濃度は、２００μＭ）に添加したものを測定サンプルとして行った。
なお、％阻害の算出におけるＦ０としては、１－ＭＮＡを実質的に含まないＮＮＭＴ欠損マウスの尿とＰ６Ａ^－水溶液（濃度２００μＭ）との混合物の蛍光強度を採用した。

【0134】

図４ａに示した、ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳから求めた１‐ＭＮＡの濃度（図４ａ左図）と、蛍光測定から求めた％阻害の値（図４ａ右図）の相関を図４ｂに示す。Ｒ^２が０．８５７６と非常に高く、両者の結果は正確に一致していることが確認された。

【0135】

上述の実験結果より、本実施形態では、水溶性ピラー［６］アレーンを用いて蛍光強度を測定することにより、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）と同程度の精度で、１‐メチルニコチンアミドの量を、蛍光の阻害率として測定することができることが分かった。蛍光強度の測定はＬＣ－ＭＳ／ＭＳと比べ、簡便な操作で短時間に行うことができるため、本実施形態の有用性は極めて高いことが示唆された。

【0136】

以上、本実施形態を詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限定されるものではなく、本開示の要旨を逸脱しない範囲における設計変更があっても、それらは本開示に含まれるものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

0007572713000001.app