(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-16
(45)【発行日】2024-10-24
(54)【発明の名称】可溶性および免疫反応性のジカウイルスＮＳ１ポリペプチド
(51)【国際特許分類】
C07K 14/18 20060101AFI20241017BHJP
C07K 14/245 20060101ALI20241017BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20241017BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20241017BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20241017BHJP
G01N 33/569 20060101ALI20241017BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20241017BHJP
C12N 15/40 20060101ALN20241017BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20241017BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20241017BHJP
【ＦＩ】
C07K14/18 ZNA
C07K14/245
C07K19/00
C12P21/02 C
G01N33/53 N
G01N33/569 L
C12N15/31
C12N15/40
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2019556931
(86)(22)【出願日】2018-04-23
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-06-18
(86)【国際出願番号】 EP2018060333
(87)【国際公開番号】W WO2018197408
(87)【国際公開日】2018-11-01
【審査請求日】2021-04-06
【審判番号】
【審判請求日】2022-12-16
(31)【優先権主張番号】17168197.6
(32)【優先日】2017-04-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(72)【発明者】
【氏名】ファーツ，エルケ
(72)【発明者】
【氏名】リーデル，アレクサンダー
(72)【発明者】
【氏名】ショルツ，クリスティアン
(72)【発明者】
【氏名】ミュンヒ，ペーター
(72)【発明者】
【氏名】タバレス，グロリア
(72)【発明者】
【氏名】グレック，マリオ
【合議体】
【審判長】上條 肇
【審判官】小金井 悟
【審判官】中村 浩
(56)【参考文献】
【文献】Ｅｕｒｏ Ｓｕｒｖｅｉｌｌ．，２０１６年，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１６，ｐｐ．９－１２
【文献】Ｅｕｒｏ Ｓｕｒｖｅｉｌｌ．，２０１６年，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．５０，ｐｐ．１３－２８
【文献】ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ，２０１７年，Ｖｏｌ．１６，ｐｐ．１３６－１４０
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
分離された生体試料中のジカウイルスに対する抗体を検出するのに適したポリペプチドであって、配列番号１または２から本質的になるジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン特異的アミノ酸配列を含み、ジカウイルスＮＳ１βラダードメイン由来のアミノ酸配列が前記ポリペプチド中に存在しない、ポリペプチド。
【請求項2】
さらなるジカウイルス特異的アミノ酸配列が前記ポリペプチド中に存在しない、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項3】
前記ジカポリペプチドがシャペロンに融合している、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項4】
前記シャペロンが、ＳｌｙＤ、ＳｌｐＡ、ＦｋｐＡおよびＳｋｐからなる群から選択される、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項5】
配列番号２１からなる、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項6】
ジカウイルスに対する抗体を検出するためのイムノアッセイにおいて、前記ジカＮＳ１ポリペプチドが、配列番号５もしくは６のいずれかを含むダニ媒介性脳炎ウイルス由来、および／または配列番号７～１４のいずれかを含むデングウイルス１～４由来、および／または配列番号１５もしくは１６のいずれかを含む西ナイルウイルス由来、および／または配列番号１７もしくは１８のいずれかを含む黄熱ウイルス由来、および／または配列番号１９～２０のいずれかを含む日本脳炎ウイルス由来の構造的に関連する抗原に対して生成される抗体と免疫学的に交差反応しないが、配列番号３に記載の完全長ジカウイルスＮＳ１抗原に対して生成される抗体と免疫学的に反応する、請求項１から５のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項7】
可溶性および免疫反応性のジカウイルスＮＳ１ウイングドメインポリペプチドを産生する方法であって、ａ）請求項１から６のいずれかに記載のポリペプチドをコードする、作動可能に連結された組換えＤＮＡ分子を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養するステップと、
ｂ）前記ジカウイルスＮＳ１ポリペプチドを発現させるステップと、
ｃ）前記ジカウイルスＮＳ１ポリペプチドを精製するステップと
を含む、方法。
【請求項8】
分離された試料中のジカウイルスに特異的な抗体を検出する方法であって、請求項１から６のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項７に記載の方法によって得られるジカウイルスポリペプチドが、前記抗ジカウイルス抗体の捕捉試薬および／または結合パートナーとして使用される、方法。
【請求項9】
分離された試料中のジカウイルスに特異的な抗体を検出する方法であって、ａ）請求項１から６のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項７に記載の方法によって得られるジカウイルスポリペプチドと体液試料を混合することにより免疫反応混合物を形成するステップと、
ｂ）前記ジカウイルスポリペプチドに対する体液試料中に存在する抗体を、前記ジカウイルスポリペプチドと免疫反応させて免疫反応生成物を形成するのに十分な期間、前記免疫反応混合物を維持するステップと、
ｃ）前記免疫反応生成物のいずれかの存在および／または濃度を検出するステップと
を含む、方法。
【請求項10】
検出された抗体がＩｇＧまたはＩｇＭ抗体である、請求項８または９に記載の分離された試料中のジカウイルスに特異的な抗体を検出する方法。
【請求項11】
抗ジカウイルス抗体を検出するためのインビトロ試験における、請求項１から６のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項７に記載の方法によって得られるジカウイルスポリペプチドの使用。
【請求項12】
請求項１から６のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項７に記載の方法によって得られるジカウイルスポリペプチドを含む、抗ジカウイルス抗体を検出するための試薬キット。
【請求項13】
個別の容器にまたは単一の容器ユニットの個別の区画に、少なくともアビジンまたはストレプトアビジンで被覆された微粒子、およびビオチンに共有結合された請求項１から６のいずれかに記載の、または請求項７に記載の方法によって得られるポリペプチドを含む、請求項１２に記載の試薬キット。
【請求項14】
個別の容器にまたは単一の容器ユニットの個別の区画に、少なくともアビジンまたはストレプトアビジンで被覆された微粒子、およびビオチンに共有結合されたμ捕捉結合パートナーを含む、請求項１２に記載の試薬キット。
【請求項15】
特異的結合パートナーとしてウイングドメインとβラダードメインを含むジカウイルスＮＳ１ポリペプチドを使用することによって、少なくとも１つの他の非ジカフラビウイルスに対する抗体を含有することが推定される分離された生体試料中のジカウイルスＮＳ１ウイングドメインに対する抗体を検出する方法であって、非標識形態のジカウイルスのＮＳ１βラダードメインを含むペプチドをクエンチャーとして添加することによって、前記非ジカフラビウイルスに対する交差反応性が除去される、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
ジカウイルスはウイルスのフラビウイルスファミリーに属するアルボウイルス（節足動物媒介ウイルス、すなわち昆虫などの節足動物ベクターによって感染するウイルス）であり、エジプトおよびアジアの蚊の系統であるネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）およびヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）によって伝播される。２０１３年および２０１４年に、フランス領ポリネシアでジカ感染の発生率が高くなり、続いて２０１５年以降中南米で大規模に発生し、２０１６年のブラジルでのオリンピック大会の頃に流行のようなピークに達した。これまでのところ、効果的な医学的処置またはワクチン接種は不十分である。健康な人においては、ジカウイルスによる感染は、通常、症状を引き起こさないか、軽症しか引き起こさない。しかし、妊婦の場合、状況は異なる。ジカウイルスは、妊婦から胎児へと感染する可能性があり、重篤な脳形成異常および小頭症などの欠陥を引き起こすことが疑われている。小頭症（「小さな頭」のギリシャ語に由来する）は、新生児の脳が適切に発達しない症状であり、したがって、その頭部は通常よりもサイズが小さい。成人における感染は、いわゆるギランバレー症候群（末梢神経系を攻撃する免疫系により引き起こされる筋力低下）につながり得る。感染後の効果的な医学的処置は不十分である。適時に支持療法を受けるためには、患者がジカウイルスに感染したかどうかを知ることが大事である。特に、高度に特異的なイムノアッセイが、複数のジカ感染の罹患率が高い地域において非常に必要とされている。もちろん、例えば、過去に他のジカ感染、例えばデング熱または黄熱病などに罹患し、その血清がデング熱および黄熱病ウイルスの主要免疫原に対するポリクローナル抗体によって特徴付けられる個体では最近のジカ感染を確実に診断することは非常に難しい仕事である。
【0002】
したがって、ワクチン接種および薬剤の開発戦略とは別に、高感度で特異的な血清学的診断を開発し、ジカウイルスによる患者の感染を正確に確認または排除する必要がある。２０１６年以来、ジカウイルスＮＳ１抗原に対する抗体を検出するいくつかのＥＬＩＳＡ系イムノアッセイが市販されている（例えば、Ｈｕｚｌｙら、Ｅｕｒｏ Ｓｕｒｖｅｉｌｌ． ２０１６； ２１ （１６） ｐｉｉ＝３０２０３、１～４）。しかし、これらのアッセイは、関連するウイルス、例えばデングウイルス、および西ナイルウイルス、黄熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＦＳＭＥ）または日本脳炎ウイルスのようなフラビウイルス科に属する他のアルボウイルスに対して生成された抗体と交差反応することが疑われている。この交差反応性は、偽陽性結果および患者の免疫状態の誤った解釈をもたらす可能性があり、ジカＮＳ１（非構造抗原）と他のフラビウイルス、例えば西ナイルウイルスおよびデングウイルスの相当物との構造相同性および配列相同性によるものと思われる（Ｈｉｌｇｅｎｆｅｌｄ ２７ Ｏｃｔ ２０１６、Ｅｍｂｏ Ｊ． １～３）。
【0003】
２０１５／２０１６年のブラジルでのジカ流行について報告された発生率および罹患率のデータは、その時に使用されたイムノアッセイの限定された特異性のため過大視バイアスの欠点を有していたと考えられる。罹患率および発生率のデータを評価し流行発生の客観的リスクを評価するためには、明確な診断が必要条件として不可欠である。特異性の不十分な血清学的アッセイは流行の程度を過度に強調するため、当局だけでなく、動揺し不安のある個人によってもパニックに駆られた決断を招く。例えば、ブラジルにおける中絶の数は、真のまたは表向きのジカ流行に対する中間報告後に著しく増加したことが報告されている。
【0004】
西ナイルウイルスおよびデングウイルス由来の完全長グリコシル化ＮＳ１の結晶構造は高解像度で解明されており、異なるドメインとかなり複雑なタンパク質トポロジーが判明している（Ａｋｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０１４； ３４３ （６１７３）： ８８１～８８５）。最近、ジカウイルス非構造タンパク質１（ＮＳ１）のＣ末端断片（アミノ酸残基１７２－３５２）の結晶構造が公開され、ｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ型のダイマーが明らかになり、ＮＳ１のオリゴマーの特徴が確認された（Ｓｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０１６ （２３） ５、 ４５６～４５９）。さらに、完全長ジカウイルスＮＳ１の完全三次元構造がＢｒｏｗｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０１６ （２３） ９、 ８６５～８６８により公開され、ＮＳ１構造がさらに詳細に説明されている。したがって、ＮＳ１は、そのオリゴマーの状態、そのグリコシル化パターンおよびシステイン残基のその豊富な量により、非常に複雑な複合タンパク質であることがわかる。したがって、診断を目的とした専用のジカ抗原に関する刊行物は少なく、ジカ抗原に特有であり、ジカウイルスと関連するフラビウイルスとを明快に識別することができる線状または立体構造のＢ細胞エピトープに関する信頼性のある情報はこれまで利用することができなかった。
【0005】
国際特許出願ＷＯ２０１７／１４４１７３およびＷＯ２０１７／１４４１７３は、３５２アミノ酸の完全長ジカＮＳ１抗原の変異体を開示し、いくつかの必須エピトープを列挙しており、ＮＳ１抗原のＣ末端部分のβラダードメインエピトープ（３２２位から３２６位）が反応性にとって不可欠であると考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
したがって、本発明の根底にある問題は、ジカウイルスに対する抗体を検出する従来の利用可能なイムノアッセイでの限定された特異性である。この問題は、特許請求の範囲に明示した本発明によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン特異的アミノ酸配列およびその変異体を含む、分離された生体試料中のジカウイルスに対する抗体を検出するのに適したポリペプチド、および免疫アッセイにおけるその使用であって、ジカウイルスＮＳ１βラダードメイン由来のアミノ酸配列が前記ポリペプチド中に存在しない、ポリペプチドに関する。一実施形態において、前記ジカウイルスＮＳ１ドメイン特異的アミノ酸配列は、配列番号１または２から本質的になる。別の実施形態において、さらなるジカウイルス特異的アミノ酸配列は、前記ポリペプチド中に存在しない。このポリペプチドは、デングウイルス１～４、西ナイルウイルス、黄熱ウイルスまたは日本脳炎ウイルスのＮＳ１ポリペプチドを含むダニ媒介性脳炎ウイルス由来の構造的に関連する抗原に対して生成される抗体と免疫学的に交差反応しないが、配列番号３に記載の完全長ジカウイルスＮＳ１抗原に対して生成される抗体と免疫学的に反応する。
【0008】
一実施形態において、このポリペプチドは、配列番号５もしくは６のいずれかを含むダニ媒介性脳炎ウイルス由来、および／または配列番号７～１４のいずれかを含むデングウイルス１～４由来、および／または配列番号１５もしくは１６のいずれかを含む西ナイルウイルス由来、および／または配列番号１７もしくは１８のいずれかを含む黄熱ウイルス由来、および／または配列番号１９～２０のいずれかを含む日本脳炎ウイルス由来の構造的に関連する抗原に対して生成される抗体と免疫学的に交差反応しないが、配列番号３に記載の完全長ジカウイルスＮＳ１抗原に対して生成される抗体と免疫学的に反応する。
【0009】
また、可溶性および免疫反応性のジカウイルスＮＳ１ポリペプチドを産生する方法、ならびに抗ジカウイルス抗体の結合パートナーとして上記のジカウイルスＮＳ１ポリペプチドを使用して分離された試料中のジカウイルスに特異的な抗体を検出する方法も開示されている。これらの方法は、ＩｇＧもしくはＩｇＭクラスの抗体、またはその両方を検出する。さらに、抗ジカウイルス抗体を検出するためのインビトロ診断試験における前記ＮＳ１ジカウイルスポリペプチドの使用も開示されている。
【0010】
さらなる態様は、上記で明示したジカウイルスポリペプチドを含む、抗ジカウイルス抗体を検出するための試薬キットである。
別の態様は、特異的結合パートナーとしてβラダードメインの完全配列または部分配列を含むジカウイルスＮＳ１ポリペプチドを使用することによって、少なくとも１つの他の非ジカフラビウイルスに対する抗体を含有することが推定される分離された生体試料中のジカウイルスに対する抗体を検出する方法であって、非標識形態の前記ジカウイルスのＮＳ１βラダードメインを含むポリペプチドを添加することによって、一実施形態においてはクエンチャーとしてβラダードメインを含む前記ポリペプチドを添加することによって、前記非ジカフラビウイルスに対する交差反応性が除去される、方法である。
別の態様は、特異的結合パートナーとしてβラダードメインの完全配列または部分配列を含むジカウイルスＮＳ１ポリペプチドを使用することによって、少なくとも１つの他の非ジカフラビウイルスに対する抗体を含有することが推定される分離された生体試料中のジカウイルスに対する抗体を検出する方法であって、非標識形態の前記ジカウイルスのＮＳ１βラダードメインを含むポリペプチドを添加することによって、一実施形態においてはクエンチャーとしてβラダードメインを含む前記ポリペプチドを添加することによって、前記非ジカフラビウイルスに対する交差反応性が除去される、方法である。
【0011】
開示したアミノ酸配列の説明：
成熟ＮＳ１タンパク質は、３５２個のアミノ酸残基（ＮＳ１、１－３５２）を含む。ＮＳ１タンパク質内で、ウイングドメインは１５１個のアミノ酸残基を含み、ＮＳ１アミノ酸領域３０－１８０にわたる。したがって、ウイングドメイン位置（１－１５１）は、２９アミノ酸位置を加えることによりＮＳ１ナンバリングへと簡単に変わる。逆に、ＮＳ１アミノ酸位置は、２９アミノ酸位置を差し引くことによりウイングドメインナンバリングへと簡単に変わる；ａａ１（ウイング）＝ａａ３０（ＮＳ１）、ａａ２（ウイング）＝ａａ３１（ＮＳ１）、ａａ３（ウイング）＝ａａ３２（ＮＳ１）など。同様に、βラダードメイン位置（１－１６２）は、ＮＳ１位置１９１－３５２がβラダードメインに相当するので、１９０アミノ酸位置を加えることによりＮＳ１ナンバリングへと簡単に変わる。
成熟ＮＳ１タンパク質は、３５２個のアミノ酸残基（ＮＳ１、１－３５２）を含む。ＮＳ１タンパク質内で、ウイングドメインは１５１個のアミノ酸残基を含み、ＮＳ１アミノ酸領域３０－１８０にわたる。したがって、ウイングドメイン位置（１－１５１）は、２９アミノ酸位置を加えることによりＮＳ１ナンバリングへと簡単に変わる。逆に、ＮＳ１アミノ酸位置は、２９アミノ酸位置を差し引くことによりウイングドメインナンバリングへと簡単に変わる；ａａ１（ウイング）＝ａａ３０（ＮＳ１）、ａａ２（ウイング）＝ａａ３１（ＮＳ１）、ａａ３（ウイング）＝ａａ３２（ＮＳ１）など。同様に、βラダードメイン位置（１－１６２）は、ＮＳ１位置１９１－３５２がβラダードメインに相当するので、１９０アミノ酸位置を加えることによりＮＳ１ナンバリングへと簡単に変わる。
【0012】
配列番号１、１７９位のＸ＝ＡまたはＳまたはＣを有するジカウイルスＮＳ１ウイングドメインａａ３０－１８０
DRYKYHPDSP RRLAAAVKQA WEEGICGISS VSRMENIMWK SVEGELNAIL EENGVQLTVV VGSVKNPMWR GPQRLPVPVN ELPHGWKAWG KSYFVRAAKT NNSFVVDGDT LKECPLKHRA WNSFLVEDHG FGVFHTSVWL KVREDYSLEX D
配列番号２、Ｃ５５、Ｃ１４３、Ｃ１７９Ａを有するジカウイルスＮＳ１ウイングドメインａａ３０－１８０
DRYKYHPDSP RRLAAAVKQA WEEGICGISS VSRMENIMWK SVEGELNAIL EENGVQLTVV VGSVKNPMWR GPQRLPVPVN ELPHGWKAWG KSYFVRAAKT NNSFVVDGDT LKECPLKHRA WNSFLVEDHG FGVFHTSVWL KVREDYSLEA D
配列番号３、ジカウイルスＮＳ１の完全長ａａ１－３５２；またこの配列は、ＭＲ ７６６株、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｗ８Ｑ７Ｑ３としても公開されている；完全長ジカ前駆体ポリタンパク質内の対応するナンバリングはａａ７９５－１１４６である
DVGCSVDFSK RETRCGTGVF IYNDVEAWRD RYKYHPDSPR RLAAAVKQAW EEGICGISSV
SRMENIMWKS VEGELNAILE ENGVQLTVVV GSVKNPMWRG PQRLPVPVNG LPHGWKAWGK
SYFVRAAKTN NSFVVDGDTL KECPLKHRAW NSFLVEDHGF GVFHTSVWLK VREDYSLECD
PAVIGTAVKG REAAHSDLGY WIESEKNDTW RLKRAHLIEM KTCEWPKSHT LWTDGVEESD
LIIPKSLAGP LSHHNTREGY RTQVKGPWHS EELEIRFEEC PGTKVHVEET CGTRGPSLRS
TTASGRVIEE WCCRECTMPP LSFRAKDGCW YGMEIRPRKE PESNLVRSMV TA
配列番号４、ジカウイルスＮＳ１ βラダードメインａａ１９１－３５２
REAAHSDLGY WIESEKNDTW RLKRAHLIEM KTCEWPKSHT LWTDGVEESD LIIPKSLAGP
LSHHNTREGY RTQVKGPWHS EELEIRFEEC PGTKVHVEET CGTRGPSLRS TTASGRVIEE
WCCRECTMPP LSFRAKDGCW YGMEIRPRKE PESNLVRSMV TA
配列番号５、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ１４３３６；ヨーロッパ亜型Ｎｅｕｄｏｅｒｆｌ株によるダニ媒介脳炎（ＦＳＭＥ）ウイルスＮＳ１ウイングドメインａａ３０－１８０；Ｘ＝ＡまたはＣまたはＳ
DNYAYYPETP GALASAIKET FEEGSCGVVP QNRLEMAMWR SSVTELNLAL AEGEANLTVV
VDKFDPTDYR GGVPGLLKKG KDIKVSWKSW GHSMIWSIPE APRRFMVGTE GQSECPLERR
KTGVFTVAEF GVGLRTKVFL DFRQEPTHEX D
配列番号６：ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ１４３３６；ヨーロッパ亜型Ｎｅｕｄｏｅｒｆｌ株によるダニ媒介性脳炎（ＦＳＭＥ）ウイルスＮＳ１完全長ａａ７７７－１１２８；３５２アミノ酸
DVGCAVDTER MELRCGEGLV VWREVSEWYD NYAYYPETPG ALASAIKETF EEGSCGVVPQ
NRLEMAMWRS SVTELNLALA EGEANLTVVV DKFDPTDYRG GVPGLLKKGK DIKVSWKSWG
HSMIWSIPEA PRRFMVGTEG QSECPLERRK TGVFTVAEFG VGLRTKVFLD FRQEPTHECD
TGVMGAAVKN GMAIHTDQSL WMRSMKNDTG TYIVELLVTD LRNCSWPASH TIDNADVVDS
ELFLPASLAG PRSWYNRIPG YSEQVKGPWK YTPIRVIREE CPGTTVTINA KCDKRGASVR
STTESGKVIP EWCCRACTMP PVTFRTGTDC WYAMEIRPVH DQGGLVRSMV VA
配列番号７、デングウイルス１型ＮＳ１ウイングドメインａａ３０－１８０；Ｘ＝ＡまたはＣまたはＳ
EQYKFQADSP KRLSAAIGKA WEEGVCGIRS ATRLENIMWK QISNELNHIL LENDMKFTVV VGDVAGILAQ GKKMIRPQPM EHKYSWKSWG KAKIIGADVQ NTTFIIDGPN TPECPDDQRA WNIWEVEDYG FGIFTTNIWL KLRDSYTQVXD
配列番号８、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｗ８ＦＵＶ０によるデングウイルス１型ＮＳ１完全長ａａ７７６－１１２７、３５２アミノ酸
DSGCVINWKG RELKCGSGIF VTNEVHTWTE QYKFQADSPK RLSAAIGKAW EEGVCGIRSA
TRLENIMWKQ ISNELNHILL ENGMKFTVVV GEVNGILAQG KKMIRPQPME HKYSWKSWGK
AKVIGADVQN TTFIIDGPNT PECPDDQRAW NIWEVEDYGF GIFTTNIWLK LRDSYTQVCD
HRLMSAAIKD SKAVHADMGY WIESEKNETW KLARASFIEV KTCIWPKSHT LWSNGVLESE
MIIPKIYGGP ISQHNYRPGY FTQTAGPWHL GKLELDFELC EGTTVVVDEH CGNRGPSLRT
TTVTGKIIHE WCCRSCTLPP LRFKGEDGCW YGMEIRPVKE KEENLVKSMV SA
配列番号９、デングウイルス２型ＮＳ１ウイングドメインａａ３０－１８０；Ｘ＝ＡまたはＣまたはＳ
EQYKFQPESP SKLASAIQKA HEEGICGIRS VTRLENLMWK QITPELNHIL SENEVKLTIM TGDIKGIMQA GKRSLRPQPT ELKYSWKTWG KAKMLSTESH NQTFLIDGPE TAECPNTNRA WNSLEVEDYG FGVFTTNIWL KLKEKQDVFX D
配列番号１０、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ２９９９０、タイ／１６８８１／１９８４株によるデングウイルス２型ＮＳ１完全長ａａ７７６－１１２７、３５２アミノ酸
DSGCVVSWKN KELKCGSGIF ITDNVHTWTE QYKFQPESPS KLASAIQKAH EEGICGIRSV
TRLENLMWKQ ITPELNHILS ENEVKLTIMT GDIKGIMQAG KRSLRPQPTE LKYSWKTWGK
AKMLSTESHN QTFLIDGPET AECPNTNRAW NSLEVEDYGF GVFTTNIWLK LKEKQDVFCD
SKLMSAAIKD NRAVHADMGY WIESALNDTW KIEKASFIEV KNCHWPKSHT LWSNGVLESE
MIIPKNLAGP VSQHNYRPGY HTQITGPWHL GKLEMDFDFC DGTTVVVTED CGNRGPSLRT
TTASGKLITE WCCRSCTLPP LRYRGEDGCW YGMEIRPLKE KEENLVNSLV TA
配列番号１１、デングウイルス３型ＮＳ１ウイングドメインａａ３０－１８０；Ｘ＝ＡまたはＣまたはＳ
EQYKFQADSP KRLATAIAGA WENGVCGIRS TTRMENLLWK QIANELNYIL WENNIKLTVV VGDIIGILEQ GKRTLTPQPM ELKYSWKTWG KAKIVTAETQ NSSFIIDGPN TPECPNASRA WNVWEVEDYG FGVFTTNIWL KLREMYSQLXD
配列番号１２、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｗ８ＦＲＧ８によるデングウイルス３型ＮＳ１完全長ａａ７７４－１１２５、３５２アミノ酸
DMGCVINWKG KELKCGSGIF VTNEVHTWTE QYKFQADSPK RLATAIAGAW ENGVCGIRST
TRMENLLWRQ IANELNYILW ENNIKLTVVV GDIIGILEQG KRTLTPQPME LKYSWKTWGK
AKIVTAETQN SSFIIDGPNT PECPNASRAW NVWEVEDYGF GVFTTNIWLK LREMYSQLCD
HRLMSAAVKD ERAVHADMGY WIESQKNGSW KLEKASLIEV KTCTWPKSHT LWSNGVLESD
MIIPKSLAGP ISQHNYRPGY HTQTAGPWHL GKLELDFNYC EGTTVVITEN CGTRGPSLRT
TTVSGKLIHE WCCRSCTLPP LRYMGEDGCW YGMEIRPINE KEENMVKSLV SA
配列番号１３、デングウイルス４型ＮＳ１ウイングドメインａａ３０－１８０；Ｘ＝ＡまたはＣまたはＳ
EQYKFQPESP ARLASAILNA HKDGVCGIRS TTRLENIMWK QITNELNYVL WEGGHDLTVV AGDVKGVLTK GKRALTPPVN DLKYSWKTWG KAKIFTPEAR NSTFLIDGPD TSECPNERRA WNFFEVEDYG FGMFTTNIWM KFREGSSEVXD
配列番号１４、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｑ５８ＨＴ７、フィリピン／Ｈ２４１／１９５６株によるデングウイルス４型ＮＳ１完全長ａａ７７５－１１２６、３５２アミノ酸
DTGCAVSWSG KELKCGSGIF VIDNVHTWTE QYKFQPESPA RLASAILNAH EDGVCGIRST
TRLENIMWKQ ITNELNYVLW EGGHDLTVVA GDVKGVLSKG KRALAPPVND LKYSWKTWGK
AKIFTPEAKN STFLIDGPDT SECPNERRAW NFLEVEDYGF GMFTTNIWMK FREGSSEVCD
HRLMSAAIKD QKAVHADMGY WIESSKNQTW QIEKASLIEV KTCLWPKTHT LWSNGVLESQ
MLIPKAYAGP FSQHNYRQGY ATQTVGPWHL GKLEIDFGEC PGTTVTIQED CDHRGPSLRT
TTASGKLVTQ WCCRSCTMPP LRFLGEDGCW YGMEIRPLSE KEENMVKSQV SA
配列番号１５、西ナイルウイルスＮＳ１ウイングドメインａａ３０－１８０；Ｘ＝ＡまたはＣまたはＳ
DRYKFYPETP QGLAKIIQKA HAEGVCGLRS VSRLEHQMWE AIKDELNTLL KENGVDLSVV VEKQNGMYKA APKRLAATTE KLEMGWKAWG KSIIFAPELA NNTFVIDGPE TEECPTANRA WNSMEVEDFG FGLTSTRMFL RIRETNTTEXD
配列番号１６、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ０６９３５による西ナイルウイルスＮＳ１完全長ａａ７８８－１１３９、３５２アミノ酸
DTGCAIDIGR QELRCGSGVF IHNDVEAWMD RYKFYPETPQ GLAKIIQKAH AEGVCGLRSV
SRLEHQMWEA IKDELNTLLK ENGVDLSVVV EKQNGMYKAA PKRLAATTEK LEMGWKAWGK
SIIFAPELAN NTFVIDGPET EECPTANRAW NSMEVEDFGF GLTSTRMFLR IRETNTTECD
SKIIGTAVKN NMAVHSDLSY WIESGLNDTW KLERAVLGEV KSCTWPETHT LWGDGVLESD
LIIPITLAGP RSNHNRRPGY KTQNQGPWDE GRVEIDFDYC PGTTVTISDS CEHRGPAART
TTESGKLITD WCCRSCTLPP LRFQTENGCW YGMEIRPTRH DEKTLVQSRV NA
配列番号１７、黄熱ウイルスＮＳ１ウイングドメインａａ３０－１８０；Ｘ＝ＡまたはＣまたはＳ
NKYSYYPEDP VKLASIVKAS FEEGKCGLNS VDSLEHEMWR SRADEINAIF EENEVDISVV
VQDPKNVYQR GTHPFSRIRD GLQYGWKTWG KNLVFSPGRK NGSFIIDGKS RKECPFSNRV
WNSFQIEEFG TGVFTTRVYM DAVFEYTIDX D
配列番号１８、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ０３３１４、１７Ｄワクチン株による黄熱ウイルスＮＳ１完全長ａａ７７９－１１３０、３５２アミノ酸
DQGCAINFGK RELKCGDGIF IFRDSDDWLN KYSYYPEDPV KLASIVKASF EEGKCGLNSV
DSLEHEMWRS RADEINAIFE ENEVDISVVV QDPKNVYQRG THPFSRIRDG LQYGWKTWGK
NLVFSPGRKN GSFIIDGKSR KECPFSNRVW NSFQIEEFGT GVFTTRVYMD AVFEYTIDCD
GSILGAAVNG KKSAHGSPTF WMGSHEVNGT WMIHTLEALD YKECEWPLTH TIGTSVEESE
MFMPRSIGGP VSSHNHIPGY KVQTNGPWMQ VPLEVKREAC PGTSVIIDGN CDGRGKSTRS
TTDSGKVIPE WCCRSCTMPP VSFHGSDGCW YPMEIRPRKT HESHLVRSWV TA
配列番号１９、日本脳炎ウイルスＮＳ１ウイングドメインａａ３０－１８０；Ｘ＝ＡまたはＣまたはＳ
DRYKYLPETP RSLAKIVHKA HKEGVCGVRS VTRLEHQMWE AVRDELNVLL KENAVDLSVV
VNKPVGRYRS APKRLSMTQE KFEMGWKAWG KSILFAPELA NSTFVVDGPE TKECPDEHRA
WNSMQIEDFG FGITSTRVWL KIREESTDEX D
配列番号２０、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｑ９ＹＪ１６による日本脳炎ウイルスＮＳ１完全長ａａ７９５－１１４６、３５２アミノ酸
DTGCAIDITR KEMRCGSGIF VHNDVEAWVD RYKYLPETPR SLAKIVHKAH KEGVCGVRSV
TRLEHQMWEA VRDELNVLLK ENAVDLSVVV NKPVGRYRSA PKRLSMTQEK FEMGWKAWGK
SILFAPELAN STFVVDGPET KECPDEHRAW NSMQIEDFGF GITSTRVWLK IREESTDECD
GAIIGTAVKG HVAVHSDLSY WIESRYNDTW KLERAVFGEV KSCTWPETHT LWGDGVEESE
LIIPHTIAGP KSKHNRREGY KTQNQGPWDE NGIVLDFDYC PGTKVTITED CGKRGPSVRT
TTDSGKLITD WCCRSCSLPP LRFRTENGCW YGMEIRPVRH DEATLVRSQV DA
配列番号２１、タンデムの大腸菌ＳｌｙＤとジカウイルスＮＳ１ウイングドメインａａ３０－１８０の融合タンパク質
MKVAKDLVVS LAYQVRTEDG VLVDESPVSA PLDYLHGHGS LISGLETALE GHEVGDKFDV
AVGANDAYGQ YDENLVQRVP KDVFMGVDEL QVGMRFLAET DQGPVPVEIT AVEDDHVVVD
GNHMLAGQNL KFNVEVVAIR EATEEELAHG HVHGAHDHHH DHDHDGGGSG GGSGGGSGGG
SGGGSGGGKV AKDLVVSLAY QVRTEDGVLV DESPVSAPLD YLHGHGSLIS GLETALEGHE
VGDKFDVAVG ANDAYGQYDE NLVQRVPKDV FMGVDELQVG MRFLAETDQG PVPVEITAVE
DDHVVVDGNH MLAGQNLKFN VEVVAIREAT EEELAHGHVH GAHDHHHDHD HDGGGSGGGS
GGGSGGGSGG GSGGGDRYKY HPDSPRRLAA AVKQAWEEGI CGISSVSRME NIMWKSVEGE
LNAILEENGV QLTVVVGSVK NPMWRGPQRL PVPVNELPHG WKAWGKSYFV RAAKTNNSFV
VDGDTLKECP LKHRAWNSFL VEDHGFGVFH TSVWLKVRED YSLEADLEHH HHHH
配列番号２２、タンデムの大腸菌ＳｌｙＤとジカウイルスＮＳ１βラダードメイン（ａａ１９１－３５２、Ｍｒ７６６株）の融合タンパク質
MKVAKDLVVS LAYQVRTEDG VLVDESPVSA PLDYLHGHGS LISGLETALE GHEVGDKFDV
AVGANDAYGQ YDENLVQRVP KDVFMGVDEL QVGMRFLAET DQGPVPVEIT AVEDDHVVVD
GNHMLAGQNL KFNVEVVAIR EATEEELAHG HVHGAHDHHH DHDHDGGGSG GGSGGGSGGG
SGGGSGGGKV AKDLVVSLAY QVRTEDGVLV DESPVSAPLD YLHGHGSLIS GLETALEGHE
VGDKFDVAVG ANDAYGQYDE NLVQRVPKDV FMGVDELQVG MRFLAETDQG PVPVEITAVE
DDHVVVDGNH MLAGQNLKFN VEVVAIREAT EEELAHGHVH GAHDHHHDHD HDGGGSGGGS
GGGSGGGSGG GSGGGREAAH SDLGYWIESE KNDTWRLKRA HLIEMKTAEW PKSHTLWTDG
VEESDLIIPK SLAGPLSHHN TREGYRTQVK GPWHSEELEI RFEECPGTKV YVEETCGTRG
PSLRSTTASG RVIEEWCCRE CTMPPLSFRA KDGCWYGMEI RPRKEPESNL VRSMVTALEH
HHHHH
配列番号２３、大腸菌ＳｌｙＤとジカウイルスＮＳ１βラダードメイン（ａａ１９１－３５２、Ｍｒ７６６株）の融合タンパク質
MKVAKDLVVS LAYQVRTEDG VLVDESPVSA PLDYLHGHGS LISGLETALE GHEVGDKFDV
AVGANDAYGQ YDENLVQRVP KDVFMGVDEL QVGMRFLAET DQGPVPVEIT AVEDDHVVVD
GNHMLAGQNL KFNVEVVAIR EATEEELAHG HVHGAHDHHH DHDHDGGGSG GGSGGGSGGG
SGGGSGGGRE AAHSDLGYWI ESEKNDTWRL KRAHLIEMKT AEWPKSHTLW TDGVEESDLI
IPKSLAGPLS HHNTREGYRT QVKGPWHSEE LEIRFEECPG TKVYVEETCG TRGPSLRSTT
ASGRVIEEWC CRECTMPPLS FRAKDGCWYG MEIRPRKEPE SNLVRSMVTA LEHHHHHH
DRYKYHPDSP RRLAAAVKQA WEEGICGISS VSRMENIMWK SVEGELNAIL EENGVQLTVV VGSVKNPMWR GPQRLPVPVN ELPHGWKAWG KSYFVRAAKT NNSFVVDGDT LKECPLKHRA WNSFLVEDHG FGVFHTSVWL KVREDYSLEX D
配列番号２、Ｃ５５、Ｃ１４３、Ｃ１７９Ａを有するジカウイルスＮＳ１ウイングドメインａａ３０－１８０
DRYKYHPDSP RRLAAAVKQA WEEGICGISS VSRMENIMWK SVEGELNAIL EENGVQLTVV VGSVKNPMWR GPQRLPVPVN ELPHGWKAWG KSYFVRAAKT NNSFVVDGDT LKECPLKHRA WNSFLVEDHG FGVFHTSVWL KVREDYSLEA D
配列番号３、ジカウイルスＮＳ１の完全長ａａ１－３５２；またこの配列は、ＭＲ ７６６株、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｗ８Ｑ７Ｑ３としても公開されている；完全長ジカ前駆体ポリタンパク質内の対応するナンバリングはａａ７９５－１１４６である
DVGCSVDFSK RETRCGTGVF IYNDVEAWRD RYKYHPDSPR RLAAAVKQAW EEGICGISSV
SRMENIMWKS VEGELNAILE ENGVQLTVVV GSVKNPMWRG PQRLPVPVNG LPHGWKAWGK
SYFVRAAKTN NSFVVDGDTL KECPLKHRAW NSFLVEDHGF GVFHTSVWLK VREDYSLECD
PAVIGTAVKG REAAHSDLGY WIESEKNDTW RLKRAHLIEM KTCEWPKSHT LWTDGVEESD
LIIPKSLAGP LSHHNTREGY RTQVKGPWHS EELEIRFEEC PGTKVHVEET CGTRGPSLRS
TTASGRVIEE WCCRECTMPP LSFRAKDGCW YGMEIRPRKE PESNLVRSMV TA
配列番号４、ジカウイルスＮＳ１ βラダードメインａａ１９１－３５２
REAAHSDLGY WIESEKNDTW RLKRAHLIEM KTCEWPKSHT LWTDGVEESD LIIPKSLAGP
LSHHNTREGY RTQVKGPWHS EELEIRFEEC PGTKVHVEET CGTRGPSLRS TTASGRVIEE
WCCRECTMPP LSFRAKDGCW YGMEIRPRKE PESNLVRSMV TA
配列番号５、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ１４３３６；ヨーロッパ亜型Ｎｅｕｄｏｅｒｆｌ株によるダニ媒介脳炎（ＦＳＭＥ）ウイルスＮＳ１ウイングドメインａａ３０－１８０；Ｘ＝ＡまたはＣまたはＳ
DNYAYYPETP GALASAIKET FEEGSCGVVP QNRLEMAMWR SSVTELNLAL AEGEANLTVV
VDKFDPTDYR GGVPGLLKKG KDIKVSWKSW GHSMIWSIPE APRRFMVGTE GQSECPLERR
KTGVFTVAEF GVGLRTKVFL DFRQEPTHEX D
配列番号６：ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ１４３３６；ヨーロッパ亜型Ｎｅｕｄｏｅｒｆｌ株によるダニ媒介性脳炎（ＦＳＭＥ）ウイルスＮＳ１完全長ａａ７７７－１１２８；３５２アミノ酸
DVGCAVDTER MELRCGEGLV VWREVSEWYD NYAYYPETPG ALASAIKETF EEGSCGVVPQ
NRLEMAMWRS SVTELNLALA EGEANLTVVV DKFDPTDYRG GVPGLLKKGK DIKVSWKSWG
HSMIWSIPEA PRRFMVGTEG QSECPLERRK TGVFTVAEFG VGLRTKVFLD FRQEPTHECD
TGVMGAAVKN GMAIHTDQSL WMRSMKNDTG TYIVELLVTD LRNCSWPASH TIDNADVVDS
ELFLPASLAG PRSWYNRIPG YSEQVKGPWK YTPIRVIREE CPGTTVTINA KCDKRGASVR
STTESGKVIP EWCCRACTMP PVTFRTGTDC WYAMEIRPVH DQGGLVRSMV VA
配列番号７、デングウイルス１型ＮＳ１ウイングドメインａａ３０－１８０；Ｘ＝ＡまたはＣまたはＳ
EQYKFQADSP KRLSAAIGKA WEEGVCGIRS ATRLENIMWK QISNELNHIL LENDMKFTVV VGDVAGILAQ GKKMIRPQPM EHKYSWKSWG KAKIIGADVQ NTTFIIDGPN TPECPDDQRA WNIWEVEDYG FGIFTTNIWL KLRDSYTQVXD
配列番号８、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｗ８ＦＵＶ０によるデングウイルス１型ＮＳ１完全長ａａ７７６－１１２７、３５２アミノ酸
DSGCVINWKG RELKCGSGIF VTNEVHTWTE QYKFQADSPK RLSAAIGKAW EEGVCGIRSA
TRLENIMWKQ ISNELNHILL ENGMKFTVVV GEVNGILAQG KKMIRPQPME HKYSWKSWGK
AKVIGADVQN TTFIIDGPNT PECPDDQRAW NIWEVEDYGF GIFTTNIWLK LRDSYTQVCD
HRLMSAAIKD SKAVHADMGY WIESEKNETW KLARASFIEV KTCIWPKSHT LWSNGVLESE
MIIPKIYGGP ISQHNYRPGY FTQTAGPWHL GKLELDFELC EGTTVVVDEH CGNRGPSLRT
TTVTGKIIHE WCCRSCTLPP LRFKGEDGCW YGMEIRPVKE KEENLVKSMV SA
配列番号９、デングウイルス２型ＮＳ１ウイングドメインａａ３０－１８０；Ｘ＝ＡまたはＣまたはＳ
EQYKFQPESP SKLASAIQKA HEEGICGIRS VTRLENLMWK QITPELNHIL SENEVKLTIM TGDIKGIMQA GKRSLRPQPT ELKYSWKTWG KAKMLSTESH NQTFLIDGPE TAECPNTNRA WNSLEVEDYG FGVFTTNIWL KLKEKQDVFX D
配列番号１０、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ２９９９０、タイ／１６８８１／１９８４株によるデングウイルス２型ＮＳ１完全長ａａ７７６－１１２７、３５２アミノ酸
DSGCVVSWKN KELKCGSGIF ITDNVHTWTE QYKFQPESPS KLASAIQKAH EEGICGIRSV
TRLENLMWKQ ITPELNHILS ENEVKLTIMT GDIKGIMQAG KRSLRPQPTE LKYSWKTWGK
AKMLSTESHN QTFLIDGPET AECPNTNRAW NSLEVEDYGF GVFTTNIWLK LKEKQDVFCD
SKLMSAAIKD NRAVHADMGY WIESALNDTW KIEKASFIEV KNCHWPKSHT LWSNGVLESE
MIIPKNLAGP VSQHNYRPGY HTQITGPWHL GKLEMDFDFC DGTTVVVTED CGNRGPSLRT
TTASGKLITE WCCRSCTLPP LRYRGEDGCW YGMEIRPLKE KEENLVNSLV TA
配列番号１１、デングウイルス３型ＮＳ１ウイングドメインａａ３０－１８０；Ｘ＝ＡまたはＣまたはＳ
EQYKFQADSP KRLATAIAGA WENGVCGIRS TTRMENLLWK QIANELNYIL WENNIKLTVV VGDIIGILEQ GKRTLTPQPM ELKYSWKTWG KAKIVTAETQ NSSFIIDGPN TPECPNASRA WNVWEVEDYG FGVFTTNIWL KLREMYSQLXD
配列番号１２、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｗ８ＦＲＧ８によるデングウイルス３型ＮＳ１完全長ａａ７７４－１１２５、３５２アミノ酸
DMGCVINWKG KELKCGSGIF VTNEVHTWTE QYKFQADSPK RLATAIAGAW ENGVCGIRST
TRMENLLWRQ IANELNYILW ENNIKLTVVV GDIIGILEQG KRTLTPQPME LKYSWKTWGK
AKIVTAETQN SSFIIDGPNT PECPNASRAW NVWEVEDYGF GVFTTNIWLK LREMYSQLCD
HRLMSAAVKD ERAVHADMGY WIESQKNGSW KLEKASLIEV KTCTWPKSHT LWSNGVLESD
MIIPKSLAGP ISQHNYRPGY HTQTAGPWHL GKLELDFNYC EGTTVVITEN CGTRGPSLRT
TTVSGKLIHE WCCRSCTLPP LRYMGEDGCW YGMEIRPINE KEENMVKSLV SA
配列番号１３、デングウイルス４型ＮＳ１ウイングドメインａａ３０－１８０；Ｘ＝ＡまたはＣまたはＳ
EQYKFQPESP ARLASAILNA HKDGVCGIRS TTRLENIMWK QITNELNYVL WEGGHDLTVV AGDVKGVLTK GKRALTPPVN DLKYSWKTWG KAKIFTPEAR NSTFLIDGPD TSECPNERRA WNFFEVEDYG FGMFTTNIWM KFREGSSEVXD
配列番号１４、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｑ５８ＨＴ７、フィリピン／Ｈ２４１／１９５６株によるデングウイルス４型ＮＳ１完全長ａａ７７５－１１２６、３５２アミノ酸
DTGCAVSWSG KELKCGSGIF VIDNVHTWTE QYKFQPESPA RLASAILNAH EDGVCGIRST
TRLENIMWKQ ITNELNYVLW EGGHDLTVVA GDVKGVLSKG KRALAPPVND LKYSWKTWGK
AKIFTPEAKN STFLIDGPDT SECPNERRAW NFLEVEDYGF GMFTTNIWMK FREGSSEVCD
HRLMSAAIKD QKAVHADMGY WIESSKNQTW QIEKASLIEV KTCLWPKTHT LWSNGVLESQ
MLIPKAYAGP FSQHNYRQGY ATQTVGPWHL GKLEIDFGEC PGTTVTIQED CDHRGPSLRT
TTASGKLVTQ WCCRSCTMPP LRFLGEDGCW YGMEIRPLSE KEENMVKSQV SA
配列番号１５、西ナイルウイルスＮＳ１ウイングドメインａａ３０－１８０；Ｘ＝ＡまたはＣまたはＳ
DRYKFYPETP QGLAKIIQKA HAEGVCGLRS VSRLEHQMWE AIKDELNTLL KENGVDLSVV VEKQNGMYKA APKRLAATTE KLEMGWKAWG KSIIFAPELA NNTFVIDGPE TEECPTANRA WNSMEVEDFG FGLTSTRMFL RIRETNTTEXD
配列番号１６、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ０６９３５による西ナイルウイルスＮＳ１完全長ａａ７８８－１１３９、３５２アミノ酸
DTGCAIDIGR QELRCGSGVF IHNDVEAWMD RYKFYPETPQ GLAKIIQKAH AEGVCGLRSV
SRLEHQMWEA IKDELNTLLK ENGVDLSVVV EKQNGMYKAA PKRLAATTEK LEMGWKAWGK
SIIFAPELAN NTFVIDGPET EECPTANRAW NSMEVEDFGF GLTSTRMFLR IRETNTTECD
SKIIGTAVKN NMAVHSDLSY WIESGLNDTW KLERAVLGEV KSCTWPETHT LWGDGVLESD
LIIPITLAGP RSNHNRRPGY KTQNQGPWDE GRVEIDFDYC PGTTVTISDS CEHRGPAART
TTESGKLITD WCCRSCTLPP LRFQTENGCW YGMEIRPTRH DEKTLVQSRV NA
配列番号１７、黄熱ウイルスＮＳ１ウイングドメインａａ３０－１８０；Ｘ＝ＡまたはＣまたはＳ
NKYSYYPEDP VKLASIVKAS FEEGKCGLNS VDSLEHEMWR SRADEINAIF EENEVDISVV
VQDPKNVYQR GTHPFSRIRD GLQYGWKTWG KNLVFSPGRK NGSFIIDGKS RKECPFSNRV
WNSFQIEEFG TGVFTTRVYM DAVFEYTIDX D
配列番号１８、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ０３３１４、１７Ｄワクチン株による黄熱ウイルスＮＳ１完全長ａａ７７９－１１３０、３５２アミノ酸
DQGCAINFGK RELKCGDGIF IFRDSDDWLN KYSYYPEDPV KLASIVKASF EEGKCGLNSV
DSLEHEMWRS RADEINAIFE ENEVDISVVV QDPKNVYQRG THPFSRIRDG LQYGWKTWGK
NLVFSPGRKN GSFIIDGKSR KECPFSNRVW NSFQIEEFGT GVFTTRVYMD AVFEYTIDCD
GSILGAAVNG KKSAHGSPTF WMGSHEVNGT WMIHTLEALD YKECEWPLTH TIGTSVEESE
MFMPRSIGGP VSSHNHIPGY KVQTNGPWMQ VPLEVKREAC PGTSVIIDGN CDGRGKSTRS
TTDSGKVIPE WCCRSCTMPP VSFHGSDGCW YPMEIRPRKT HESHLVRSWV TA
配列番号１９、日本脳炎ウイルスＮＳ１ウイングドメインａａ３０－１８０；Ｘ＝ＡまたはＣまたはＳ
DRYKYLPETP RSLAKIVHKA HKEGVCGVRS VTRLEHQMWE AVRDELNVLL KENAVDLSVV
VNKPVGRYRS APKRLSMTQE KFEMGWKAWG KSILFAPELA NSTFVVDGPE TKECPDEHRA
WNSMQIEDFG FGITSTRVWL KIREESTDEX D
配列番号２０、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｑ９ＹＪ１６による日本脳炎ウイルスＮＳ１完全長ａａ７９５－１１４６、３５２アミノ酸
DTGCAIDITR KEMRCGSGIF VHNDVEAWVD RYKYLPETPR SLAKIVHKAH KEGVCGVRSV
TRLEHQMWEA VRDELNVLLK ENAVDLSVVV NKPVGRYRSA PKRLSMTQEK FEMGWKAWGK
SILFAPELAN STFVVDGPET KECPDEHRAW NSMQIEDFGF GITSTRVWLK IREESTDECD
GAIIGTAVKG HVAVHSDLSY WIESRYNDTW KLERAVFGEV KSCTWPETHT LWGDGVEESE
LIIPHTIAGP KSKHNRREGY KTQNQGPWDE NGIVLDFDYC PGTKVTITED CGKRGPSVRT
TTDSGKLITD WCCRSCSLPP LRFRTENGCW YGMEIRPVRH DEATLVRSQV DA
配列番号２１、タンデムの大腸菌ＳｌｙＤとジカウイルスＮＳ１ウイングドメインａａ３０－１８０の融合タンパク質
MKVAKDLVVS LAYQVRTEDG VLVDESPVSA PLDYLHGHGS LISGLETALE GHEVGDKFDV
AVGANDAYGQ YDENLVQRVP KDVFMGVDEL QVGMRFLAET DQGPVPVEIT AVEDDHVVVD
GNHMLAGQNL KFNVEVVAIR EATEEELAHG HVHGAHDHHH DHDHDGGGSG GGSGGGSGGG
SGGGSGGGKV AKDLVVSLAY QVRTEDGVLV DESPVSAPLD YLHGHGSLIS GLETALEGHE
VGDKFDVAVG ANDAYGQYDE NLVQRVPKDV FMGVDELQVG MRFLAETDQG PVPVEITAVE
DDHVVVDGNH MLAGQNLKFN VEVVAIREAT EEELAHGHVH GAHDHHHDHD HDGGGSGGGS
GGGSGGGSGG GSGGGDRYKY HPDSPRRLAA AVKQAWEEGI CGISSVSRME NIMWKSVEGE
LNAILEENGV QLTVVVGSVK NPMWRGPQRL PVPVNELPHG WKAWGKSYFV RAAKTNNSFV
VDGDTLKECP LKHRAWNSFL VEDHGFGVFH TSVWLKVRED YSLEADLEHH HHHH
配列番号２２、タンデムの大腸菌ＳｌｙＤとジカウイルスＮＳ１βラダードメイン（ａａ１９１－３５２、Ｍｒ７６６株）の融合タンパク質
MKVAKDLVVS LAYQVRTEDG VLVDESPVSA PLDYLHGHGS LISGLETALE GHEVGDKFDV
AVGANDAYGQ YDENLVQRVP KDVFMGVDEL QVGMRFLAET DQGPVPVEIT AVEDDHVVVD
GNHMLAGQNL KFNVEVVAIR EATEEELAHG HVHGAHDHHH DHDHDGGGSG GGSGGGSGGG
SGGGSGGGKV AKDLVVSLAY QVRTEDGVLV DESPVSAPLD YLHGHGSLIS GLETALEGHE
VGDKFDVAVG ANDAYGQYDE NLVQRVPKDV FMGVDELQVG MRFLAETDQG PVPVEITAVE
DDHVVVDGNH MLAGQNLKFN VEVVAIREAT EEELAHGHVH GAHDHHHDHD HDGGGSGGGS
GGGSGGGSGG GSGGGREAAH SDLGYWIESE KNDTWRLKRA HLIEMKTAEW PKSHTLWTDG
VEESDLIIPK SLAGPLSHHN TREGYRTQVK GPWHSEELEI RFEECPGTKV YVEETCGTRG
PSLRSTTASG RVIEEWCCRE CTMPPLSFRA KDGCWYGMEI RPRKEPESNL VRSMVTALEH
HHHHH
配列番号２３、大腸菌ＳｌｙＤとジカウイルスＮＳ１βラダードメイン（ａａ１９１－３５２、Ｍｒ７６６株）の融合タンパク質
MKVAKDLVVS LAYQVRTEDG VLVDESPVSA PLDYLHGHGS LISGLETALE GHEVGDKFDV
AVGANDAYGQ YDENLVQRVP KDVFMGVDEL QVGMRFLAET DQGPVPVEIT AVEDDHVVVD
GNHMLAGQNL KFNVEVVAIR EATEEELAHG HVHGAHDHHH DHDHDGGGSG GGSGGGSGGG
SGGGSGGGRE AAHSDLGYWI ESEKNDTWRL KRAHLIEMKT AEWPKSHTLW TDGVEESDLI
IPKSLAGPLS HHNTREGYRT QVKGPWHSEE LEIRFEECPG TKVYVEETCG TRGPSLRSTT
ASGRVIEEWC CRECTMPPLS FRAKDGCWYG MEIRPRKEPE SNLVRSMVTA LEHHHHHH
【発明を実施するための形態】
【0013】
現在利用可能な抗ジカウイルス抗体を検出するためのＥＬＩＳＡフォーマットイムノアッセイは、免疫反応試薬としてＮＳ１抗原を使用する。しかし、本発明者らは、これらのアッセイには特異性がなく、非常に多くの偽陽性結果に結びつくことを確認した。驚いたことに、さらに以下で説明するようにジカＮＳ１抗原をそのウイングドメインに限定することによって、アッセイの高感度を維持しつつ、誤った反応試料の数を顕著に低減することができる。
【0014】
抗ジカウイルス抗体に陽性である試料を、ジカのＮＳ１抗原の２つの異なる断片を用いて試験した場合、すなわち、いわゆる「ウイング」ドメイン抗原と、いわゆる「βラダー」ドメイン抗原を用いて試験した場合、両抗原が抗ジカ抗体を検出し得ることが明らかとなった。しかし、本発明者らは、ウイングドメイン抗原はデング熱抗体陽性試料と交差反応しないが、ジカＮＳ１βラダードメイン抗原はデング熱抗体陽性試料と交差反応し、偽陽性結果と誤った結論をもたらすことを見出した。抗ジカ陽性血清と関連アルボウイルスのＮＳ１抗原を用いたさらなるブロッキング実験によって、ジカＮＳ１ウイングドメイン抗原シグナルはこれらの関連アルボウイルスＮＳ１抗原によってほとんど消光されないが、ジカＮＳ１βラダードメイン抗原シグナルは有意に消光されることが決定的に示されている。本発明者らは、βラダー抗原は、競合する関連アルボウイルスＮＳ１抗原によって免疫グロブリンへの結合を顕著にブロックされると推論する。したがって、本発明者らは、ジカＮＳ１ウイングドメイン抗原が他のアルボウイルスＮＳ１相同体との免疫学的交差反応性に影響を受けにくいことを明白にすることができた。結果として、ジカウイルス感染をデングウイルス感染と識別する実施形態において、ジカＮＳ１ウイングドメインは、他の（最近または過去の）アルボウイルス感染の存在下で、ジカウイルス感染を診断することができる優れた特異性を有する抗ジカ抗体のイムノアッセイを可能にする。
【0015】
したがって、本発明は、分離されたジカ抗原を含む生体試料中のジカウイルスに対する抗体を検出するのに適したポリペプチドであって、ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン特異的アミノ酸配列を含み、ジカウイルスＮＳ１βラダードメイン由来のアミノ酸配列が前記ポリペプチド中に存在しない、ポリペプチドに関する。一実施形態において、さらなるジカウイルスＮＳ１特異的アミノ酸配列はこのポリペプチド中に存在せず、一実施形態において、さらなるジカウイルス特異的アミノ酸配列は前記ポリペプチド中に存在しない。一実施形態において、前記ジカウイルスＮＳ１ドメイン特異的アミノ酸配列は、配列番号１または２から本質的になり、一実施形態においては配列番号１または２からなる。特に、Ｃ末端のいわゆるβラダードメイン由来のアミノ酸配列は、本発明のポリペプチド中に存在しない。一実施形態において、配列番号４は前記ポリペプチド中に存在しない。
【0016】
一実施形態において、本発明は、抗ジカウイルス抗体を検出するためのイムノアッセイ法における前記ポリペプチドの使用に関する。
用語「ジカウイルス」は、「ジカ」または「ＺＩＫＶ」の短縮形と等しく、これらの頭文字は同じウイルスを意味する。
用語「ジカウイルス」は、「ジカ」または「ＺＩＫＶ」の短縮形と等しく、これらの頭文字は同じウイルスを意味する。
【0017】
用語「ＮＳ１」、「ＮＳ１抗原」、「ＮＳ１ポリペプチド」は同義的に使用され、ウイルス前駆体ポリタンパク質内の非構造的抗原ｎｏ．１を意味し、（別に明示されない限り）完全長抗原ＮＳ１に関する。このタンパク質の構造は、西ナイルウイルスおよびデングウイルス２について、Ａｋｅｙら、前掲で開示されている。ジカＮＳ１については、Ｃ末端ドメイン（アミノ酸残基１７２－３５２）の構造がＳｏｎｇら（前掲）によって開示されており、完全なＮＳ１の三次元構造は、Ｂｒｏｗｎら（前掲）によってさらに詳細に開示されている。ジカＮＳ１配列は、３５２個のアミノ酸を含み、配列番号３に示されている。用語「ＮＳ１ウイング」または「ＮＳ１ウイングドメイン」、「ＮＳ１ウイングの変異体」または「ＮＳ１ウイング領域」とはＮＳ１ポリペプチド内のドメインを意味し、したがって、ＮＳ１の部分配列である。ジカＮＳ１ウイングドメインについては、これは配列番号１および２に例示されている。また、用語「ポリペプチド（単数）」、「ポリペプチド（複数）」、「抗原（単数）」および「抗原（複数）」は、さらに明示のない限り、同義語として理解される。
【0018】
同義語「βラダー」「βラダードメイン」または「ラダーチップ抗原」または「ラダーチップ」、「ラダーチップドメイン」、「ラダーチップポリペプチド」、「ラダーチップ抗原」は、ウイングドメインに隣接するＣ末端に配置されているＮＳ１ドメインを意味する。このドメインは、西ナイルウイルスおよびデングウイルス２について、Ａｋｅｙら、前掲で開示されている。ジカウイルスについては、このＮＳ１ドメインは、Ｓｏｎｇら、前掲、およびＢｒｏｗｎら、前掲によって開示されている。ジカＮＳ１βラダードメインについては、アミノ酸配列が配列番号４に例示されている。
【0019】
これらの定義は、本明細書内のすべてのアルボウイルスに適用することができる。ジカファミリーに属する以下のアルボウイルスは、以下のように短縮され得る：西ナイルウイルス（西ナイル、ＷＮＶ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶまたはＦＳＭＥ）、デングウイルス１～４（デング熱、デング熱の４つのウイルス株：ＤＥＮＶ１～４）、黄熱ウイルス（ＹＦＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）。
【0020】
本発明によれば、ジカウイルスＮＳ１ドメイン特異的アミノ酸配列は、ジカウイルスＮＳ１βラダードメイン由来のアミノ酸配列が前記ポリペプチド中に存在しないアミノ酸配列である。一実施形態において、さらなるジカウイルス特異的アミノ酸配列は、そのようなポリペプチド中に存在しない。例えば、ジカＮＳ１ウイングドメインポリペプチドはウイングドメイン配列のみを含み、一実施形態は配列番号１または２を含む。一実施形態において、配列番号４は前記ポリペプチド配列中に存在しない。別の実施形態において、さらなるジカウイルス特異的アミノ酸配列はこの配列中に存在しない。ＮＳ１βラダードメイン特異的配列の非存在、および一実施形態におけるさらなるジカＮＳ１特異的配列またはさらなるジカ特異的配列の非存在は、他のアルボウイルスに対して生成される抗体との交差反応性を低減または完全に回避する目的をサポートする。
【0021】
しかし、ジカＮＳ１ウイングドメインポリペプチドの変異体も同様に包含される。これらの変異体は、開示されたアミノ酸配列の保存的置換または相同的置換（例えば、アラニンもしくはセリンによるシステインの置換、またはバリンによるイソロイシンの置換、またはその逆など）によって、当業者により容易に作製され得る。またこの文脈における用語「変異体」とは、前記タンパク質に実質的に同等のタンパク質またはタンパク質断片（すなわち、ポリペプチドまたはペプチド）に関する。例えば、１～１０個のアミノ酸、一実施形態においては１～５個のアミノ酸による、一末端または両末端でのＣ末端またはＮ末端トランケーションなどの修飾は、特許請求の範囲のジカＮＳ１ウイングドメイン抗原の範囲内である。特に、変異体は、最も一般的なタンパク質アイソフォームのアミノ酸配列と比較してアミノ酸の交換、欠失、または挿入を示すアイソフォームであってもよい。一実施形態において、そのような実質的に同等のタンパク質は、タンパク質の最も一般的なアイソフォームに対して少なくとも８０％、別の実施形態においては少なくとも８５％または少なくとも９０％、さらに別の実施形態においては少なくとも９５％の配列相同性を有する。また用語「変異体」は、翻訳後修飾タンパク質、例えばグリコシル化タンパク質またはリン酸化タンパク質に関する。本発明によれば、変異体は、インビトロ診断イムノアッセイにおいて免疫反応性が変化しないか、または大部分が維持される限り、ジカＮＳ１ウイングドメイン変異体として分類され、すなわち、変異体は、分離された試料中に存在する抗ジカ抗体を依然として結合し検出することができるが、他のアルボウイルスに対して生成される抗体は検出されないか、検出の程度ははるかに低い。さらに、前記ジカポリペプチドの全体的三次元構造は不変のままであり、その結果、以前に（すなわち野生型で）存在し、抗体への結合にアクセス可能であったエピトープは依然として存在し、変異体にアクセス可能である。
【0022】
また「変異体」は、例えば、タンパク質または抗原への標識または担体部分の共有結合または非共有結合によって修飾されたタンパク質または抗原でもある。可能な標識は、放射性、蛍光性、化学発光性、電気化学発光性、酵素など、例えば、ジゴキシン、ジゴキシゲニンまたはビオチンなどである。これらの標識は、当業者には公知である。
【0023】
配列番号の形態で明示された、提供したポリペプチド配列情報が「（すなわち、前記配列）から本質的になる」という用語で記載されている場合、これは、配列が文字通り列挙されているように存在するが、抗体への免疫学的結合に関してこのポリペプチドの基本的特性に実質的に影響を及ぼさない変異体として存在することができることを意味する。この一例は、このペプチドのＮ末端および／またはＣ末端のごくわずかなアミノ酸の欠失または付加、ならびに同等のアミノ酸の交換、例えば、セリンに対するアラニン、バリンに対するイソロイシン、およびその逆であり得る。
【0024】
本発明のジカＮＳ１ウイングドメイン抗原は、可溶性、安定性、および免疫反応性であり、すなわち、それらは免疫学的アッセイで使用するための抗原として好適である。これは、本発明による抗原が、生理的緩衝液条件下で、例えば、界面活性剤を添加しない周囲温度のリン酸緩衝液系で可溶性であることを意味する。また抗原は、ジカＮＳ１ウイングドメインに特異的な抗体、例えば、分離された試料、例えばヒト血清中に存在する抗ジカ抗体に結合または認識され、結合され得る。
【0025】
一実施形態において、非ジカ特異的リンカーまたはペプチド融合アミノ酸配列のジカＮＳ１ウイングドメインポリペプチドへの付加は、これらの配列が抗ジカウイルス抗体に特異的ではなく、インビトロ診断イムノアッセイを妨げないので可能である。
【0026】
一実施形態において、ジカＮＳ１ウイングドメイン抗原は、シャペロンに融合していてもよい。用語「融合タンパク質」、「融合ポリペプチド」または「融合抗原」とは、ジカＮＳ１ウイングドメインポリペプチドと、融合パートナーの役割を果たすシャペロン由来の少なくとも１つのタンパク質部分を含むタンパク質を意味する。
【0027】
シャペロンは、他のタンパク質のフォールディングおよび構造的完全性の維持をアシストする周知のフォールディングヘルパータンパク質である。フォールディングヘルパーの例は、ＷＯ０３／０００８７７に詳細に開示されている。本発明によれば、ペプチジルプロリルイソメラーゼクラスのシャペロン、例えばＦＫＢＰファミリーのシャペロンは、ジカＮＳ１ウイングドメイン抗原変異体への融合に使用することができる。融合パートナーとして適切なＦＫＢＰシャペロンの例は、ＦｋｐＡ、ＳｌｙＤおよびＳｌｐＡである。ジカＮＳ１ウイング抗原の融合パートナーとして適切なさらなるシャペロンはＳｋｐであって、ＦＫＢＰファミリーに属さない、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のペリプラズム由来の三量体シャペロンである。シャペロンの完全配列を使用することは必ずしも必要ではない。必要とされる能力および機能を依然として保持するシャペロンの機能的断片（いわゆる結合能力のあるモジュールまたはポリペプチド結合モチーフ）も使用することができる（ＷＯ９８／１３４９６を参照）。
【0028】
本発明のさらなる実施形態において、ＦＫＢＰシャペロンの少なくとも１つまたは少なくとも２つのモジュール、例えば、大腸菌ＳｌｙＤ、ＳｌｐＡまたはＦｋｐＡは、ジカＮＳ１ウイングドメイン抗原を発現するための融合部分として使用される。シャペロンＳｋｐは、同様に融合体パートナーとして使用され得る。２つのＦＫＢＰ－シャペロンドメインの融合は、得られる融合ポリペプチドの溶解性に改善をもたらす。融合部分は、ジカＮＳ１ウイングドメイン抗原のＮ末端もしくはＣ末端、または両末端（サンドイッチ様）に位置していてもよい。
【0029】
一実施形態において、ジカＮＳ１ウイングドメイン抗原は、オリゴマーシャペロンに融合している。オリゴマーシャペロンは、二量体、三量体、さらにはそれ以上の多量体を自然に形成するシャペロンであり、その結果、複数の単量体サブユニットが特定の非共有相互作用により十分に定義された機能的四次構造に構築される。それによって、共有結合で融合した抗原が同様に高エピトープ密度にされる。好ましいオリゴマーシャペロンは、ＦｋｐＡおよびＳｋｐである。多量体化抗原は、特にＩｇＭ抗体の検出において有用であり、したがって感染直後の初期免疫応答の検出に有用である。
【0030】
一実施形態において、ジカＮＳ１ウイングドメインポリペプチドは、細菌ＳｌｙＤ、ＳｌｐＡ、ＦｋｐＡまたはＳｋｐの、一実施形態においては、大腸菌ＳｌｙＤ、ＳｉｐＡ、ＦｋｐＡまたはＳｋｐの１つ、２つまたはそれ以上のシャペロン分子に融合している。さらなる実施形態において、ジカＮＳ１ウイングドメインポリペプチドは、配列番号２１からなる。
【0031】
本発明の別の実施形態は、配列番号５もしくは６のいずれかを含むダニ媒介脳炎ウイルス、および／または配列番号７～１４のいずれかを含むデングウイルス１～４、および／または配列番号１５もしくは１６のいずれかを含む西ナイルウイルス、および／または配列番号１７もしくは１８のいずれかを含む黄熱ウイルス、および／または配列番号１９～２０のいずれかを含む日本脳炎ウイルス由来の構造的に関連する抗原に対して生成される抗体と免疫学的に交差反応しないが、配列番号３に記載の完全長ジカウイルスＮＳ１抗原に対して生成される抗体と免疫学的に反応するジカＮＳ１抗原である。さらなる実施形態において、前記ジカＮＳ１抗原は、ジカ特異的配列が配列番号１または２から本質的になるジカＮＳ１ウイングドメイン抗原であり、一実施形態において、配列番号１または２からなる。
【0032】
用語「免疫学的に交差反応しない」とは、望ましくない免疫学的反応性が大幅に低減されたか、または完全に消失したことを意味する。用語「免疫学的な交差反応性」とは、抗原の配列または構造の類似性に起因する免疫グロブリンと免疫原との望ましくない結合を説明するために造語され、免疫原に対して抗体が元来マウントされた。一実施形態において、ジカウイルスＮＳ１ウイングドメインポリペプチドは、完全長のジカウイルスＮＳ１ポリペプチドと比較して、上記の相同のまたは関連の対応するアルボウイルスＮＳ１抗原に対して生成される抗体に対する、または抗体のサブセットに対する免疫学的な反応性が完全に消失または著しく低減されたことを示す。さらに別の実施形態において、ジカウイルスＮＳ１ウイングドメインポリペプチドは、デングウイルスに対して生成される抗体に対して、または抗体のサブセットに対して、一実施形態においてはデングウイルス１、２、３、４型に対して生成される抗体に対して大幅に低減された免疫学的交差反応性を示す。さらなる実施形態において、ジカウイルスＮＳ１ウイングドメインポリペプチドの免疫学的な交差反応性の大幅な低減はまた、黄熱ウイルスに対して生成される抗体または抗体のサブセットにも適用される。
【0033】
また表現「免疫学的に交差反応しない」とは、抗体を検出するための二重抗原サンドイッチフォーマットでのイムノアッセイにおいて、試料抗体（すなわち、分析物抗体）が２つの特異的抗原によって結合されている状況を意味し、１つは固相に結合され、他方は標識を保持しており、試料抗体は両抗原の間に挟まれる。分析物抗体の存在下において、標識した抗原は、－生じる三成分免疫複合体内で－固相に加えられ、シグナルを生成する。この場合、ジカＮＳ１ウイングドメインポリペプチドは標識されており、測定したシグナルは１００％に設定される。並行実験または後続の実験において、同じアッセイは同じ（陽性）試料の別のアリコートで実施され、さらに、標識抗原と競合することが疑われるアミノ酸配列を有する非標識抗原が混合物に添加される。この場合、ＴＢＥＶ、ＤＥＮＶ１－４、ＷＮＶ、ＹＦＶまたはＪＥＶのいずれかの完全長ＮＳ１ポリペプチドが加えられる。別の実施形態において、ＴＢＥＶ、ＤＥＮＶ１－４、ＷＮＶ、ＹＦＶまたはＪＥＶのいずれかのＮＳ１ウイングドメインのみからなる、またはそれのみを含むＮＳ１ポリペプチドが加えられる。測定後に得られたシグナルが少なくとも約７０％のシグナル回復で、一実施形態においては少なくとも８０％のシグナル回復で、一実施形態においては少なくとも８５％のシグナル回復で、一実施形態においては少なくとも９０％のシグナル回復で維持される場合、フラビウイルス（この例においてはジカ）ＮＳ１ポリペプチドは、シグナルの消光を起こしにくい。それは加えた抗原に負かされないので、交差反応性物質に潜在的に抵抗する。例として、そのようなブロッキング実験は、実施例２（表２）で説明されている。
【0034】
一実施形態において、配列番号５もしくは６のいずれかを含むダニ媒介脳炎ウイルス、および／または配列番号７～１４のいずれかを含むデングウイルス１～４、および／または配列番号１５もしくは１６のいずれかを含む西ナイルウイルス、および／または配列番号１７もしくは１８のいずれかを含む黄熱ウイルス、および／または配列番号１９～２０のいずれかを含む日本脳炎ウイルス由来のＮＳ１完全長またはＮＳ１ウイングドメインペプチドが上記のブロッキング実験で加えられる。
【0035】
別の実施形態において、ジカＮＳ１ウイングドメインポリペプチドは、配列番号３に示した完全長ＮＳ１抗原に対して生成される抗体または抗体のサブセットと免疫学的に反応する。これは、上記アッセイのセットアップにおいて、ジカＮＳ１ウイングドメインポリペプチドのシグナルが完全長ジカＮＳ１ポリペプチドの添加時に完全に消光されるはずであることを意味する（１００％）。
【0036】
ジカ関連ウイルスに対する免疫学的な交差反応性を決定する方法は実施例２にさらに記載されている。
ジカＮＳ１ポリペプチド（ウイングドメインおよびβラダードメインの両方）ならびに実施例２のブロッキング実験で適用されるポリペプチドは、当分野で既知の組換えＤＮＡ技術およびタンパク質精製技術によって作製および調製することができる。したがって、本発明の別の態様は、ジカＮＳ１ウイングドメイン抗原、一実施形態においては配列番号１、２または２１に記載の抗原、ならびにさらに上記で定義したその変異体をコードする組換えＤＮＡ分子である。
ジカＮＳ１ポリペプチド（ウイングドメインおよびβラダードメインの両方）ならびに実施例２のブロッキング実験で適用されるポリペプチドは、当分野で既知の組換えＤＮＡ技術およびタンパク質精製技術によって作製および調製することができる。したがって、本発明の別の態様は、ジカＮＳ１ウイングドメイン抗原、一実施形態においては配列番号１、２または２１に記載の抗原、ならびにさらに上記で定義したその変異体をコードする組換えＤＮＡ分子である。
【0037】
用語「組換えＤＮＡ分子」とは、遺伝子工学技術または化学合成によるポリヌクレオチドの単離された断片の人為的操作によって達成されるＤＮＡ配列の２つの別の断片の組合せによって作製される分子を意味する。そのような際に、所望する機能のポリヌクレオチド断片を相互に連結して、所望する機能の組合せを生成することができる。原核生物または下等もしくは高等真核生物の宿主細胞におけるタンパク質発現に関する組換えＤＮＡ技術は、当技術分野では周知である。それらは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）によって開示されている。
【0038】
また本発明による組換えＤＮＡ分子は、ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原と融合部分との間、およびいくつかの融合部分の間に５～１００個のアミノ酸残基のリンカーペプチドをコードする配列を含むこともできる。そのようなリンカー配列は、例えば、タンパク質分解切断部位を有し得る。
【0039】
本発明のさらなる態様は、本発明による作動可能に連結された組換えＤＮＡ分子、すなわちジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原、および任意選択でペプチジルプロリルイソメラーゼシャペロン、例えばＦＫＢＰシャペロンをコードする組換えＤＮＡ分子を含む発現ベクターであり、ここで、ＦＫＢＰシャペロンはＦｋｐＡ、ＳｌｙＤおよびＳｌｐＡから選択される。代替の実施形態において、組換えＤＮＡ分子は、ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原およびＳｋｐを含む融合タンパク質をコードする。本発明による組換えＤＮＡを含む発現ベクターは、無細胞翻訳系においてジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原を発現させるために使用することができ、または当技術分野において周知の方法に従ってジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原を発現するための宿主細胞の形質転換に使用することができる。したがって、本発明の別の態様は、本発明による発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。本発明の一実施形態において、組換えジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原は、大腸菌細胞において産生される。
【0040】
さらなる態様は、可溶性、安定性および免疫反応性のジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原を産生する方法である。前記ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原は、ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原およびシャペロンを含む融合タンパク質として産生することができる。好ましくは、ＳｋｐなどのシャペロンまたはＦＫＢＰシャペロンなどのペプチジルプロリルイソメラーゼクラスのシャペロンが使用される。本発明のさらなる実施形態において、前記ＦＫＢＰシャペロンは、ＳｌｙＤ、ＦｋｐＡおよびＳｌｐＡからなる群から選択される。
【0041】
この方法は、
ａ）ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原をコードする遺伝子を含む上記発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養するステップと、
ｂ）前記ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原をコードする遺伝子を発現させるステップと、
ｃ）前記ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原を精製するステップ
とを含む。
ａ）ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原をコードする遺伝子を含む上記発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養するステップと、
ｂ）前記ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原をコードする遺伝子を発現させるステップと、
ｃ）前記ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原を精製するステップ
とを含む。
【0042】
任意選択で、追加のステップｄ）として、ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原が当技術分野で周知のリフォールディング技術によって可溶性および免疫反応性の構造になるように機能的可溶化を実施する必要がある。
【0043】
さらに別の実施形態は、無細胞インビトロ翻訳系において可溶性、安定性および免疫反応性のジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原を産生する方法である。
本発明のさらなる態様は、分離されたヒト試料中の抗ジカ抗体を検出する方法であって、本発明によるジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原が抗体の結合パートナーとして使用される、方法に関する。したがって、本発明は、分離された試料中のジカウイルスに特異的な抗体を検出する方法であって、ａ）本発明によるジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原と体液試料を混合することにより免疫反応混合物を形成するステップと、ｂ）前記ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原に対する体液試料中に存在する抗体を、前記ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原と免疫反応させて免疫反応生成物を形成するのに十分な期間、前記免疫反応混合物を維持するステップと、ｃ）前記免疫反応生成物のいずれかの存在および／または濃度を検出するステップとを含む、方法を包含する。
本発明のさらなる態様は、分離されたヒト試料中の抗ジカ抗体を検出する方法であって、本発明によるジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原が抗体の結合パートナーとして使用される、方法に関する。したがって、本発明は、分離された試料中のジカウイルスに特異的な抗体を検出する方法であって、ａ）本発明によるジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原と体液試料を混合することにより免疫反応混合物を形成するステップと、ｂ）前記ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原に対する体液試料中に存在する抗体を、前記ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原と免疫反応させて免疫反応生成物を形成するのに十分な期間、前記免疫反応混合物を維持するステップと、ｃ）前記免疫反応生成物のいずれかの存在および／または濃度を検出するステップとを含む、方法を包含する。
【0044】
さらなる態様において、前記方法は、同じイムノアッセイでＩｇＧおよびＩｇＭサブクラスの、または両方のクラスのジカウイルス抗体を検出するのに適している。
抗体を検出するためのイムノアッセイは当技術分野において周知であり、そのようなアッセイを実施する方法および実際の適用および手順も同様である。本発明によるジカＮＳ１抗原は、使用される標識とは無関係に、また検出の様式とは無関係に、抗ジカ抗体を検出するためのアッセイ（例えば、放射性同位体アッセイ、酵素免疫アッセイ、電気化学発光アッセイなど）、またはアッセイ原理（例えば、テストストリップアッセイ、サンドイッチアッセイ、間接試験コンセプトもしくは均質アッセイなど）を改善するために使用することができる。
抗体を検出するためのイムノアッセイは当技術分野において周知であり、そのようなアッセイを実施する方法および実際の適用および手順も同様である。本発明によるジカＮＳ１抗原は、使用される標識とは無関係に、また検出の様式とは無関係に、抗ジカ抗体を検出するためのアッセイ（例えば、放射性同位体アッセイ、酵素免疫アッセイ、電気化学発光アッセイなど）、またはアッセイ原理（例えば、テストストリップアッセイ、サンドイッチアッセイ、間接試験コンセプトもしくは均質アッセイなど）を改善するために使用することができる。
【0045】
本発明の一実施形態において、イムノアッセイは、固相として微粒子を適用する粒子系イムノアッセイである。本明細書で使用される場合の「粒子」とは、物理的特性、例えば体積、質量、または平均サイズなどを有し得る、小さく局在性の物体を意味する。したがって、微粒子は、対称性、球状、本質的に球状もしくは球形の形状、または不規則な非対称の形状もしくは形態であり得る。本発明により想定される粒子のサイズは変動する可能性がある。一実施形態において、使用される微粒子は球状のものであり、例えば、ナノメートルおよびマイクロメートルの範囲の直径を有する微粒子である。一実施形態において、本開示による方法で使用される微粒子は、５０ナノメートル～２０マイクロメートルの直径を有する。さらなる実施形態において、微粒子は１００ｎｍ～１０μｍの間の直径を有する。一実施形態において、本開示による方法で使用される微粒子は、２００ｎｍ～５μｍまたは７５０ｎｍ～５μｍの直径を有する。
【0046】
上記の本明細書で定義した微粒子は、当業者に既知の任意の適切な材料を含むか、またはそれからなっていてもよく、例えば、無機材料または有機材料を含むか、またはそれからなるか、または本質的にそれからなっていてもよい。典型的には、それらは、金属もしくは金属の合金、または有機材料を含むか、またはそれらからなるか、または本質的にそれらからなり、あるいは、含水炭素成分を含むか、またはそれらからなるか、または本質的になっていてもよい。微粒子に想定される材料の例としては、アガロース、ポリスチレン、ラテックス、ポリビニルアルコール、シリカおよび強磁性金属、合金または組成物材料が挙げられる。一実施形態において、微粒子は、磁性または強磁性の金属、合金または組成物である。さらなる実施形態において、材料は特定の特性を有していてもよく、例えば、疎水性または親水性であってもよい。そのような微粒子は、典型的には、水溶液に分散され、単離された微粒子を保ち非特異的クラスター化を回避する小さな負の表面電荷を保持する。
【0047】
本発明の一実施形態において、微粒子は常磁性の微粒子であり、本開示による測定方法におけるそのような粒子の単離は、磁力によって促進される。磁力は、溶液／懸濁液から常磁性粒子または磁性粒子を引き出し、所望によりそれらを保持するように適用され、一方、溶液／懸濁液の液体は除去することができ、粒子は例えば洗浄することができる。
【0048】
専門家には既知のすべての生物学的液体は、抗ジカ抗体の検出のための分離された試料として使用することができる。通常使用される試料は、全血、血清、血漿、尿または唾液のような体液であり、一実施形態においては血清または血漿である。
【0049】
本発明のさらなる実施形態は、いわゆる二重抗原サンドイッチコンセプト（ＤＡＧＳ）に従って実施される、分離された試料中の抗ジカ抗体を検出するためのイムノアッセイである。時には、このアッセイコンセプトは二重抗原架橋コンセプトとも呼ばれるが、その理由は、２つの抗原が抗体分析物によって架橋されるからである。そのようなアッセイにおいては、所定の抗原の少なくとも２つの異なる分子をその２（ＩｇＧ、ＩｇＥ）、４（ＩｇＡ）、または１０（ＩｇＭ）パラトープと結合する抗体の能力が必要とされ、利用される。
【0050】
さらなる詳細において、二重抗原架橋フォーマットによる抗ジカ抗体を測定するためのイムノアッセイは、抗ジカ抗体を含む試料を２つの異なるジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原、すなわち第１の（「固相」または「捕獲」）ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原および第２のジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン（「検出」または「レポーター」）抗原と共にインキュベートすることによって実施され、ここで、前記のそれぞれの抗原は前記抗ジカ抗体に特異的に結合する。第１の抗原は、固相に直接または間接的に結合することができ、通常、生体親和性結合対の一部であるエフェクター基を有する。
【0051】
本発明による方法に適した生体親和性結合対の１つのタイプは、ハプテンおよび抗ハプテン抗体結合対である。ハプテンは、１００～２０００ダルトン、好ましくは１５０～１０００ダルトンの分子量を有する有機分子である。そのような小分子は、それを担体分子に結合することにより免疫原性にすることが可能であり、抗ハプテン抗体は標準的な手順に従って生成することができる。ハプテンは、ステロール、胆汁酸、性ホルモン、コルチコイド、カルデノリド、カルデノリド－グリコシド、ブファジエノリド、ステロイドサポゲニンおよびステロイドアルカロイド、カルデノリドおよびカルデノリド－グリコシドを含む群から選択され得る。これらの物質クラスの代表的なものは、ジゴキシゲニン、ジギトキシゲニン、ジトキシゲニン、ストロファンチジン、ジゴキシン、ジギトキシン、ジトキシン、およびストロファンチンである。別の適切なハプテンは、例えばフルオレセインである。一実施形態において、生体親和性結合対は、ビオチンおよびアビジン／ストレプトアビジンまたはジゴキシンおよび抗ジゴキシンを含む。
【0052】
さらに別の実施形態において、第１の抗原はビオチンに結合され、相補的固相はアビジンまたはストレプトアビジンのいずれかで被覆される。第２の抗原には、この抗原分子に、単独でまたは他の分子との複合体で、特異的な検出能を付与する標識を有する。したがって、免疫反応混合物は、第１の抗原、試料抗体、および第２の抗原を含んで形成される。２つの抗原分子の間に挟まれた分析物抗体からなるこの三元複合体は、免疫複合体または免疫反応生成物と称する。第１の抗原が結合され得る固相は、前記抗原に試料を添加する前、または免疫反応混合物が形成された後のいずれかで添加される。この免疫反応混合物は、体液試料中の前記ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原に対する抗ジカ抗体が前記ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原と免疫反応し、免疫反応生成物を形成するのに十分な期間維持される。次のステップは、液相が固相から単離される単離ステップである。最後に、前記免疫反応生成物のいずれかの存在は、固相もしくは液相またはその両方で検出される。
【0053】
前記ＤＡＧＳイムノアッセイにおいて、「固相抗原」および「検出抗原」の基本構造は本質的に同じである。また、二重抗原架橋アッセイにおいて、免疫学的に交差反応する、類似しているが異なるジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原を使用することも可能である。そのようなアッセイを実施するための必須要件は、関連するエピトープが両方の抗原上に存在することである。本発明によれば、各ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原に同一のまたは異なる融合体を使用することができ（例えば、固相側でジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原に融合したＳｌｙＤ、および例えば検出側でジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン抗原に融合したＦｋｐＡ）、そのような変異体は非特異的結合の問題を顕著に軽減し、したがって偽陽性の結果のリスクを緩和する。
【0054】
さらなる実施形態は、Ｍクラスの抗ジカウイルス抗体（すなわち、イムノグロブリン）を検出する方法である（ＩｇＭ検出）。この方法の実施形態において、試料中に存在する多価ＩｇＭ抗体がジカＮＳ１ウイングドメイン抗原に特異的に結合するように、さらに上記で開示したジカＮＳ１ウイングドメインポリペプチドが適用される。一実施形態において、ジカＮＳ１ウイングドメイン抗原は、抗原を化学的に架橋することにより、またはオリゴマー化分子、例えばオリゴマーシャペロンに、一実施形態においては、ＦｋｐＡまたはＳｋｐに抗原を融合することにより、多量体形態で提供される。別の実施形態において、ジカウイングドメイン抗原は、個々の抗原を相互に隣接して直列に接続することにより、複合形態で存在する。またこれらの個々の抗原部分は、ジカ特異的ではないリンカー分子によって単離され得る。さらなる実施形態において、直列に連結された複数のジカ抗原は、例えば、オリゴマーシャペロンなどのオリゴマー化分子、例えばＦｋｐＡまたはＳｋｐによってさらに多量体化することができる。さらに別の実施形態において、ジカＮＳ１ウイングドメインポリペプチドは、各ポリペプチドが少なくとも二重の形態で存在する多量体形態で使用され、一実施形態において、それは３～１０重で存在する。
【0055】
ジカ抗体のＩｇＭ検出方法のさらなる別の実施形態において、試料中に存在するＩｇＭクラス抗体は、通常、ＩｇＭ分子の特異性とは無関係にヒトＩｇＭ分子のＦｃ部分に特異的に結合する結合パートナーまたは抗体もしくは抗体断片である、いわゆるμ捕獲成分によって固相に結合される。前記μ捕獲成分は、アビジンまたはストレプトアビジンとの生体親和性対の一部であるエフェクター群（例えばビオチン）を保有する。一実施形態において、他の生体親和性対、例えば、上記のジゴキシンおよび抗ジゴキシンまたはハプテンおよび抗ハプテンも使用することができる。一実施形態において、アビジンまたはストレプトアビジンで被覆された固相は、次いでμ捕獲成分を引き付けて結合する。ジカ特異的抗体を特異的に検出するために、記載したようなジカＮＳ１ウイングドメインポリペプチドを標識した形態で使用し、ＩｇＭクラスの抗ジカ抗体を検出する。
【0056】
別の実施形態は、抗ジカウイルス抗体を検出するための、インビトロ診断試験における、一実施形態においては上記で定義したイムノアッセイ法における、上記で詳述したジカＮＳ１ウイングドメインポリペプチドの使用である。
【0057】
さらなる実施形態として、ジカウイルス抗体を検出するためのイムノアッセイ法の最大の合計時間は、１時間未満、すなわち６０分未満であり、一実施形態においては３０分未満、さらなる実施形態においては２０分未満、一実施形態においては１５～３０分の間、一実施形態においては１５～２０分の間である。その時間には、アッセイの実施に必要な試料および試薬のピペッティング、ならびにインキュベーション時間、任意選択の洗浄ステップ、検出ステップ、および結果の最終出力が含まれる。
【0058】
本発明のさらなる主題は、上記で開示したジカＮＳ１ウイングドメインポリペプチドを含むジカウイルスに対する抗体を検出するための試薬キットである。一実施形態において、試薬キットは、個別の容器または単一容器ユニットの個別の区画に、少なくともアビジンまたはストレプトアビジンで被覆された微粒子、および上記で詳述したジカＮＳ１ウイングドメインポリペプチドを含む。別の実施形態において、前記微粒子は、上記でさらに記載したような他の生体親和性対、例えば、ジゴキシンと抗ジゴキシン、ハプテンと抗ハプテンの１つのパートナーで被覆される。一実施形態において、前記ジカＮＳ１ウイングドメインポリペプチドは、ビオチンに共有結合される。一実施形態において、前記ジカＮＳ１ウイングドメインは、他の生体親和性対、例えば、ジゴキシンと抗ジゴキシン、ハプテンと抗ハプテンの第２のパートナーに共有結合される。別の実施形態において、前記ジカＮＳ１ウイングドメインポリペプチドは、検出可能な標識に、一実施形態においては電気化学発光複合体に共有結合される。さらなる実施形態において、化学発光標識、例えばアクリジニウムエステルまたは放射性化合物もしくは蛍光化合物または酵素を標識として適用することができる。さらに別の実施形態において、前記試薬キットは、個別の容器または単一容器ユニットの個別の区画に、少なくともアビジンまたはストレプトアビジンで被覆された微粒子、ビオチンに共有結合した第１のジカＮＳ１ウイングドメインポリペプチド、および検出可能な標識に、例えば電気化学発光ルテニウム錯体または電気化学発光イリジウム錯体に共有結合されている第２のジカＮＳ１ウイングドメインポリペプチドを含む。
【0059】
さらなる実施形態は、個別の容器または単一容器ユニットの個別の区画に、少なくともアビジンまたはストレプトアビジンで被覆された微粒子、およびビオチンに共有結合されたμ捕捉結合パートナーを含む、ＩｇＭクラスの抗ジカ抗体を検出するための試薬キットである。さらなる実施形態において、前記ＩｇＭ検出試薬キットは、検出可能な標識に、一実施形態においては電気化学発光複合体に共有結合されたジカＮＳ１ウイングドメインポリペプチドを含む。
【0060】
用語の単一容器ユニットとは、Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）分析器シリーズのような多くの自動分析器で、特定の分析物の測定に必要とされる試薬が「試薬パック」の形態で提供され、すなわち、分析装置に取り付けられ、目的の分析物の測定に必要とされるすべての主要試薬を異なる区画に含む１つの容器ユニットとして提供される。
【0061】
さらに、上記で定義した試薬キットは、使用説明書とともに、対照および標準溶液、ならびに、当業者によって使用される一般的な添加物、緩衝液、塩、界面活性剤などを含む１つまたは複数の溶液の試薬を含む。
【0062】
さらに別の態様において、本発明は、少なくとも１つの他の非ジカフラビウイルス、例えばデングウイルスに対する抗体を含有することが推定される、分離された生体試料中のジカウイルスに対する抗体を検出する方法に関する。この方法において、βラダードメインの完全配列または部分配列を含むジカウイルスＮＳ１ポリペプチドが特異的結合パートナーとして、すなわちＮＳ１ウイングドメインだけでないとして適用される。このセットアップにおいて、特異的結合パートナーにβラダードメインペプチド配列が存在することから他の非ジカフラビウイルスに対する交差反応性を予想することができる。この干渉を除くために、非ジカ起源の交差反応性抗体が結合され消光されるように、前記ジカウイルスのＮＳ１βラダードメインのみを含むポリペプチドが非標識形態で加えられる。一実施形態において、βラダードメインはクエンチャーとして添加され、さらなる実施形態においては、前記βラダードメインポリペプチドは、配列番号４から本質的になり、一実施形態においては配列番号４からなる。
【0063】
以下の実施形態もまた本発明の一部である。
実施形態
１．分離された生体試料中のジカウイルスに対する抗体を検出するのに適したポリペプチドであって、ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン特異的アミノ酸配列を含み、ジカウイルスＮＳ１βラダードメイン由来のアミノ酸配列が前記ポリペプチド中に存在しない、ポリペプチド。
実施形態
１．分離された生体試料中のジカウイルスに対する抗体を検出するのに適したポリペプチドであって、ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン特異的アミノ酸配列を含み、ジカウイルスＮＳ１βラダードメイン由来のアミノ酸配列が前記ポリペプチド中に存在しない、ポリペプチド。
【0064】
２．さらなるジカウイルス特異的アミノ酸配列が前記ポリペプチド中に存在しない、実施形態１に記載のポリペプチド。
３．前記ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン特異的アミノ酸配列が配列番号１または２から本質的になる、実施形態１または２のいずれかに記載のポリペプチド。
３．前記ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン特異的アミノ酸配列が配列番号１または２から本質的になる、実施形態１または２のいずれかに記載のポリペプチド。
【0065】
４．前記ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン特異的アミノ酸配列が配列番号１または２からなる、実施形態１から３のいずれかに記載のポリペプチド。
５．前記ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン特異的アミノ酸配列がそのＮ末端もしくはＣ末端または両端で１～５個のアミノ酸がトランケートされ得る、実施形態１から４に記載のポリペプチド。
５．前記ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン特異的アミノ酸配列がそのＮ末端もしくはＣ末端または両端で１～５個のアミノ酸がトランケートされ得る、実施形態１から４に記載のポリペプチド。
【0066】
６．前記ジカポリペプチドの免疫反応性が変化しないか、または大部分が維持されるように、一実施形態においては前記ジカポリペプチドの三次元構造が変化しないように、前記ジカウイルスＮＳ１ウイングドメイン特異的アミノ酸配列が保存的アミノ酸置換によって修飾され得る、実施形態１から５に記載のポリペプチド。
【0067】
７．前記ジカポリペプチドがシャペロンに融合している、実施形態１から６のいずれかに記載のポリペプチド。
８．前記シャペロンが、ＳｌｙＤ、ＳｌｐＡ、ＦｋｐＡおよびＳｋｐからなる群から選択される、実施形態１から７のいずれかに記載のポリペプチド。
８．前記シャペロンが、ＳｌｙＤ、ＳｌｐＡ、ＦｋｐＡおよびＳｋｐからなる群から選択される、実施形態１から７のいずれかに記載のポリペプチド。
【0068】
９．配列番号２１から本質的になり、一実施形態において配列番号２１からなる、実施形態８に記載のポリペプチド。
１０．ジカウイルスに対する抗体を検出するためのイムノアッセイにおいて、前記ジカＮＳ１ポリペプチドが、配列番号５もしくは６のいずれかを含むダニ媒介性脳炎ウイルス由来、および／または配列番号７～１４のいずれかを含むデングウイルス１～４由来、および／または配列番号１５もしくは１６のいずれかを含む西ナイルウイルス由来、および／または配列番号１７もしくは１８のいずれかを含む黄熱ウイルス由来、および／または配列番号１９～２０のいずれかを含む日本脳炎ウイルス由来の構造的に関連する抗原に対して生成される抗体と免疫学的に交差反応しないが、配列番号３に記載の完全長ジカウイルスＮＳ１抗原に対して生成される抗体と免疫学的に反応する、実施形態１から９のいずれかに記載のポリペプチド。
１０．ジカウイルスに対する抗体を検出するためのイムノアッセイにおいて、前記ジカＮＳ１ポリペプチドが、配列番号５もしくは６のいずれかを含むダニ媒介性脳炎ウイルス由来、および／または配列番号７～１４のいずれかを含むデングウイルス１～４由来、および／または配列番号１５もしくは１６のいずれかを含む西ナイルウイルス由来、および／または配列番号１７もしくは１８のいずれかを含む黄熱ウイルス由来、および／または配列番号１９～２０のいずれかを含む日本脳炎ウイルス由来の構造的に関連する抗原に対して生成される抗体と免疫学的に交差反応しないが、配列番号３に記載の完全長ジカウイルスＮＳ１抗原に対して生成される抗体と免疫学的に反応する、実施形態１から９のいずれかに記載のポリペプチド。
【0069】
１１．可溶性および免疫反応性のジカウイルスＮＳ１ウイングドメインポリペプチドを産生する方法であって、
ａ）実施形態１から１０のいずれかに記載のジカウイルスＮＳ１ポリペプチドをコードする、作動可能に連結された組換えＤＮＡ分子を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養するステップと、
ｂ）前記ジカウイルスＮＳ１ポリペプチドを発現させるステップと、
ｃ）前記ジカウイルスＮＳ１ポリペプチドを精製するステップと
を含む、方法。
ａ）実施形態１から１０のいずれかに記載のジカウイルスＮＳ１ポリペプチドをコードする、作動可能に連結された組換えＤＮＡ分子を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養するステップと、
ｂ）前記ジカウイルスＮＳ１ポリペプチドを発現させるステップと、
ｃ）前記ジカウイルスＮＳ１ポリペプチドを精製するステップと
を含む、方法。
【0070】
１２．分離された試料中のジカウイルスに特異的な抗体を検出する方法であって、実施形態１から１０のいずれかに記載のジカウイルスポリペプチドまたは実施形態１１に記載の方法によって得られるジカウイルスポリペプチドが、前記抗ジカウイルス抗体の捕捉試薬および／または結合パートナーとして使用される、方法。
【0071】
１３．分離された試料中のジカウイルスに特異的な抗体を検出する方法であって、
ａ）実施形態１から１０のいずれかに記載のジカウイルスポリペプチドまたは実施形態１１に記載の方法によって得られるジカウイルスポリペプチドと体液試料を混合することにより免疫反応混合物を形成するステップと、
ｂ）前記ジカウイルスポリペプチドに対する体液試料中に存在する抗体を、前記ジカウイルスポリペプチドと免疫反応させて免疫反応生成物を形成するのに十分な期間、前記免疫反応混合物を維持するステップと、
ｃ）前記免疫反応生成物のいずれかの存在および／または濃度を検出するステップと
を含む、方法。
ａ）実施形態１から１０のいずれかに記載のジカウイルスポリペプチドまたは実施形態１１に記載の方法によって得られるジカウイルスポリペプチドと体液試料を混合することにより免疫反応混合物を形成するステップと、
ｂ）前記ジカウイルスポリペプチドに対する体液試料中に存在する抗体を、前記ジカウイルスポリペプチドと免疫反応させて免疫反応生成物を形成するのに十分な期間、前記免疫反応混合物を維持するステップと、
ｃ）前記免疫反応生成物のいずれかの存在および／または濃度を検出するステップと
を含む、方法。
【0072】
１４．検出された抗体がＩｇＧ抗体である、実施形態１２または１３のいずれかに記載の分離された試料中のジカウイルスに特異的な抗体を検出する方法。
１５．実施形態１３または１４に記載の分離された試料中のジカウイルスに特異的な抗体を検出する方法であって、前記免疫反応が、
ａ）固相に直接または間接的に結合することができる実施形態１から１０のいずれかに記載の第１のジカウイルスポリペプチドまたは実施形態１１に記載の方法によって得られるポリペプチドであって、生体親和性結合対の一部であるエフェクター基を有する前記第１のジカウイルスポリペプチドと、実施形態１から１０のいずれかに記載の、または実施形態１１に記載の方法によって産生される第２のジカウイルスポリペプチドであって、検出可能な標識を有する前記第２のジカウイルスポリペプチドとを、前記試料に添加するステップであって、
ここで、前記第１および第２のジカウイルスポリペプチドが、前記抗ジカウイルス抗体に特異的に結合する、ステップと、
ｂ）前記第１のジカウイルスポリペプチド、前記試料抗体、および前記第２のジカウイルスポリペプチドを含む免疫反応混合物を形成するステップであって、ここで、前記生体親和性結合対の対応するエフェクター基を有する固相が、免疫反応混合物を形成する前、間または後で添加される、ステップと、
ｃ）体液試料中の前記第１および第２のジカウイルスポリペプチドに対するジカウイルス抗体を、前記第１および第２のジカウイルスポリペプチドと免疫反応させて免疫反応生成物を形成するのに十分な期間、前記免疫反応混合物を維持するステップと、
ｄ）液相を固相から単離するステップと、
ｅ）固相もしくは液相またはその両方における前記免疫反応生成物のいずれかの存在を検出するステップと
を含む二重抗原サンドイッチフォーマットで実施される、方法。
１５．実施形態１３または１４に記載の分離された試料中のジカウイルスに特異的な抗体を検出する方法であって、前記免疫反応が、
ａ）固相に直接または間接的に結合することができる実施形態１から１０のいずれかに記載の第１のジカウイルスポリペプチドまたは実施形態１１に記載の方法によって得られるポリペプチドであって、生体親和性結合対の一部であるエフェクター基を有する前記第１のジカウイルスポリペプチドと、実施形態１から１０のいずれかに記載の、または実施形態１１に記載の方法によって産生される第２のジカウイルスポリペプチドであって、検出可能な標識を有する前記第２のジカウイルスポリペプチドとを、前記試料に添加するステップであって、
ここで、前記第１および第２のジカウイルスポリペプチドが、前記抗ジカウイルス抗体に特異的に結合する、ステップと、
ｂ）前記第１のジカウイルスポリペプチド、前記試料抗体、および前記第２のジカウイルスポリペプチドを含む免疫反応混合物を形成するステップであって、ここで、前記生体親和性結合対の対応するエフェクター基を有する固相が、免疫反応混合物を形成する前、間または後で添加される、ステップと、
ｃ）体液試料中の前記第１および第２のジカウイルスポリペプチドに対するジカウイルス抗体を、前記第１および第２のジカウイルスポリペプチドと免疫反応させて免疫反応生成物を形成するのに十分な期間、前記免疫反応混合物を維持するステップと、
ｄ）液相を固相から単離するステップと、
ｅ）固相もしくは液相またはその両方における前記免疫反応生成物のいずれかの存在を検出するステップと
を含む二重抗原サンドイッチフォーマットで実施される、方法。
【0073】
１６．前記第１のジカウイルスポリペプチドがビオチン部分を有し、前記第２のジカウイルスポリペプチドが電気化学発光部分で標識され、一実施形態においてはルテニウムまたはイリジウム錯体で標識されている、実施形態１５に記載のジカウイルスに特異的な抗体を検出する方法。
【0074】
１７．検出された抗体がＩｇＭ抗体である、実施形態１２または１３のいずれかに記載の分離された試料中のジカウイルスに特異的な抗体を検出する方法。
１８．ジカＮＳ１ウイングドメインポリペプチドが多量体形態で使用され、一実施形態において前記ポリペプチドが少なくとも二重の形態で、一実施形態においては３～１０重で存在する、実施形態１７に記載のＩｇＭクラスのジカウイルスに特異的な抗体を検出する方法。
１８．ジカＮＳ１ウイングドメインポリペプチドが多量体形態で使用され、一実施形態において前記ポリペプチドが少なくとも二重の形態で、一実施形態においては３～１０重で存在する、実施形態１７に記載のＩｇＭクラスのジカウイルスに特異的な抗体を検出する方法。
【0075】
１９．前記の検出された抗体がＩｇＭ抗体であり、前記ＩｇＭ抗体がμ捕捉結合パートナーによって固相上で捕捉される、実施形態１２または１３のいずれかに記載の方法。
２０．実施形態１７から１９のいずれかに記載の分離された試料中のジカウイルスに特異的なＩｇＭ抗体を検出する方法であって、前記免疫反応が、
ａ）固相に直接または間接的に結合することができるμ捕獲結合パートナーであって、生体親和性結合対の一部であるエフェクター基を有するμ捕獲結合パートナーと、実施形態１から１０のいずれかに記載の、または実施形態１１に記載の方法によって産生されるジカウイルスポリペプチドであって、検出可能な標識を有する前記ジカウイルスポリペプチドとを、前記試料に添加するステップであって、
ここで、前記μ捕捉結合パートナーがヒトＩｇＭ抗体のＦｃ部分に特異的に結合し、前記ジカウイルスポリペプチドが前記抗ジカウイルス抗体に特異的に結合する、ステップと、
ｂ）前記μ捕獲結合パートナー、前記試料抗体、および前記ジカウイルスポリペプチドを含む免疫反応混合物を形成するステップであって、ここで、前記生体親和性結合対の対応するエフェクター基を有する固相が、免疫反応混合物を形成する前、間または後で添加される、ステップと、
ｃ）体液試料中の前記ジカウイルスポリペプチドに対するＩｇＭ抗体を、前記ジカウイルスポリペプチドと免疫反応させて免疫反応生成物を形成するのに十分な期間、前記免疫反応混合物を維持するステップと、
ｄ）液相を固相から単離するステップと、
ｅ）固相もしくは液相またはその両方における前記免疫反応生成物のいずれかの存在を検出するステップと
を含む、μ捕獲フォーマットで実施される、方法。
２０．実施形態１７から１９のいずれかに記載の分離された試料中のジカウイルスに特異的なＩｇＭ抗体を検出する方法であって、前記免疫反応が、
ａ）固相に直接または間接的に結合することができるμ捕獲結合パートナーであって、生体親和性結合対の一部であるエフェクター基を有するμ捕獲結合パートナーと、実施形態１から１０のいずれかに記載の、または実施形態１１に記載の方法によって産生されるジカウイルスポリペプチドであって、検出可能な標識を有する前記ジカウイルスポリペプチドとを、前記試料に添加するステップであって、
ここで、前記μ捕捉結合パートナーがヒトＩｇＭ抗体のＦｃ部分に特異的に結合し、前記ジカウイルスポリペプチドが前記抗ジカウイルス抗体に特異的に結合する、ステップと、
ｂ）前記μ捕獲結合パートナー、前記試料抗体、および前記ジカウイルスポリペプチドを含む免疫反応混合物を形成するステップであって、ここで、前記生体親和性結合対の対応するエフェクター基を有する固相が、免疫反応混合物を形成する前、間または後で添加される、ステップと、
ｃ）体液試料中の前記ジカウイルスポリペプチドに対するＩｇＭ抗体を、前記ジカウイルスポリペプチドと免疫反応させて免疫反応生成物を形成するのに十分な期間、前記免疫反応混合物を維持するステップと、
ｄ）液相を固相から単離するステップと、
ｅ）固相もしくは液相またはその両方における前記免疫反応生成物のいずれかの存在を検出するステップと
を含む、μ捕獲フォーマットで実施される、方法。
【0076】
２１．βラダードメイン由来のジカＮＳ１抗原を使用しない、一実施形態においては配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを使用しない、実施形態１２から２０のいずれかに記載の方法。
【0077】
２２．抗ジカウイルス抗体を検出するためのインビトロ診断試験における、実施形態１から１０のいずれかに記載のジカウイルスポリペプチドまたは実施形態１１に記載の方法によって得られるジカウイルスポリペプチドの使用。
【0078】
２３．実施形態１２から２１のいずれかの方法による抗ジカウイルス抗体を検出するためのインビトロ診断試験における、実施形態１から１０のいずれかに記載のジカウイルスポリペプチドまたは実施形態１１に記載の方法によって得られるジカウイルスポリペプチドの使用。
【0079】
２４．実施形態１から１０のいずれかに記載のジカウイルスポリペプチドまたは実施形態１１に記載の方法によって得られるジカウイルスポリペプチドを含む、抗ジカウイルス抗体を検出するための試薬キット。
【0080】
２５．個別の容器にまたは単一の容器ユニットの個別の区画に、少なくともアビジンまたはストレプトアビジンで被覆された微粒子、およびビオチンに共有結合された実施形態１から１０のいずれかに記載の、または実施形態１１に記載の方法によって得られるポリペプチドを含む、実施形態２４に記載の試薬キット。
【0081】
２６．個別の容器にまたは単一の容器ユニットの個別の区画に、少なくともハプテン／抗ハプテンなどの生体親和性対の一つの対で被覆された微粒子、および実施形態１から１０のいずれかに記載の、または実施形態１１に記載の方法によって得られるポリペプチドを含み、ここで前記生体親和性対がハプテン／抗ハプテンであり、一実施形態においてジゴキシン／抗ジゴキシンである、実施形態２４による試薬キット。
【0082】
２７．検出可能な標識を有する実施形態１から１０のいずれかに記載の、または実施形態１１に記載の方法によって得られる第２のポリペプチドをさらに含む、実施形態２４に記載の試薬キット。
【0083】
２８．個別の容器にまたは単一の容器ユニットの個別の区画に、少なくともアビジンまたはストレプトアビジンで被覆された微粒子、およびビオチンに共有結合されたμ捕捉結合パートナーを含む、実施形態２４に記載の試薬キット。
【0084】
２９．前記ジカウイルスポリペプチドが検出可能な標識を有する、実施形態２４に記載の試薬キット。
３０．特異的結合パートナーとしてβラダードメインの完全配列または部分配列を含むジカウイルスＮＳ１ポリペプチドを使用することによって、少なくとも１つの他の非ジカフラビウイルスに対する抗体を含有することが推定される分離された生体試料中のジカウイルスに対する抗体を検出する方法であって、非標識形態の前記ジカウイルスのＮＳ１βラダードメインを含むポリペプチドを添加することによって、一実施形態においては、クエンチャーとしてβラダードメインを含む前記ポリペプチドを添加することによって、前記非ジカフラビウイルスに対する交差反応性が除去される、方法。
３０．特異的結合パートナーとしてβラダードメインの完全配列または部分配列を含むジカウイルスＮＳ１ポリペプチドを使用することによって、少なくとも１つの他の非ジカフラビウイルスに対する抗体を含有することが推定される分離された生体試料中のジカウイルスに対する抗体を検出する方法であって、非標識形態の前記ジカウイルスのＮＳ１βラダードメインを含むポリペプチドを添加することによって、一実施形態においては、クエンチャーとしてβラダードメインを含む前記ポリペプチドを添加することによって、前記非ジカフラビウイルスに対する交差反応性が除去される、方法。
【0085】
３１．ジカウイルスＮＳ１βラダードメインを含む前記の添加されたポリペプチドが配列番号４から本質的になり、一実施形態においては配列番号４からなる、実施形態３０に記載の方法。
【0086】
３２．抗ジカウイルス抗体を検出するためのイムノアッセイにおける干渉を低減する試薬としてのジカウイルスＮＳ１βラダードメインの使用であって、一実施形態においては前記ＮＳ１βラダードメインが配列番号４から本質的になり、一実施形態においては配列番号４からなる、使用。
【0087】
本発明を実施例によりさらに説明する。
【実施例】
【0088】
実施例１：ジカＩｇＧイムノアッセイにおける異なるジカＮＳ１抗原変異体の免疫学的反応性（すなわち抗原性）
ＮＳ１抗原および変異体は、ＷＯ２０１４０５４９９０Ａ１に、またはＳｃｈｏｌｚら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （２００５） ３４５、１２２９～１２４１により開示されているように、本質的にクローン化、発現、精製および標識された。精製および可溶化された遺伝子産物は、続いてビオチンまたは電気化学発光ルテニウム標識に結合させた。
ＮＳ１抗原および変異体は、ＷＯ２０１４０５４９９０Ａ１に、またはＳｃｈｏｌｚら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （２００５） ３４５、１２２９～１２４１により開示されているように、本質的にクローン化、発現、精製および標識された。精製および可溶化された遺伝子産物は、続いてビオチンまたは電気化学発光ルテニウム標識に結合させた。
【0089】
ジカＮＳ１抗原のポリペプチド融合変異体の免疫学的反応性（すなわち抗原性）は、自動化Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）２０１０およびｃｏｂａｓ ｅ ４１１分析器（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）で評価した。Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）は、Ｒｏｃｈｅグループの登録商標である。測定は、二重抗原サンドイッチフォーマットで行った。
【0090】
Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）２０１０およびｃｏｂａｓ ｅ ４１１のシグナル検出は、電気化学発光に基づく。ビオチンコンジュゲート（すなわち捕獲抗原）はストレプトアビジン被覆磁気ビーズ表面に固定化されるが、検出抗原はシグナル部分として複合体化ルテニウムカチオン（酸化還元状態２＋および３＋のスイッチング）を担持する。特異的免疫グロブリン分析物の存在下において、発色性ルテニウム錯体は固相に架橋され、白金電極での励起の後に６２０ｎｍの光を発する。シグナル出力は相対的な光単位である。典型的には、アッセイの合計時間は１８分である。
【0091】
組換えジカＮＳ１抗原融合ポリペプチドは、二重抗原サンドイッチ（ＤＡＧＳ）イムノアッセイフォーマットで評価した。この目的のため、組換えジカＮＳ１抗原をそれぞれビオチンおよびルテニウムコンジュゲート対として使用し、ヒト血清中の抗ジカＮＳ１抗体を検出した。
【0092】
ＮＳ１は、ジカウイルスの免疫優性抗原の１つであり、ＮＳ１抗原の可溶性変異体は、本特許出願で開示されているように、ジカウイルス感染を検出するための非常に貴重なツールである。すべての測定において、化学重合した非標識のＳｌｙＤ－ＳｌｙＤを抗干渉物質として反応バッファー中に大過剰量（約８μｇ／ｍｌ）で補充して、シャペロン融合およびリンカーユニットを介した免疫交差反応を回避した。
【0093】
特に、この研究では、２つのジカＮＳ１変異体、すなわちジカＮＳ１「ウイング」ドメイン（配列番号１および２を参照）、ならびにジカＮＳ１「βラダー」ドメイン（配列番号４を参照）を詳細に調べた。抗ジカＮＳ１ ＩｇＧ分子を検出するため、ＳｌｙＤ－ＳｌｙＤ－ジカＮＳ１－ビオチンおよびＳｌｙＤ－ＳｌｙＤ－ジカＮＳ１－ルテニウムをＲ１（試薬バッファー１）およびＲ２（試薬バッファー２）でそれぞれ使用した。Ｒ１およびＲ２中の抗原コンジュゲートの濃度は、それぞれ５００ｎｇ／ｍｌであった。
【0094】
ジカおよびデング熱のＩｇＧ抗体の両方に陰性であるヒト血清試料、ジカＩｇＧ抗体に陽性であるヒト血清試料、およびデング熱ＩｇＧ抗体に陽性であるヒト血清試料を、Ｈｕｚｌｙら、前掲に開示されたようにして市販の最先端免疫測定法（マイクロタイタープレートにコーティングされた組換えＮＳ１抗原を適用する間接ＥＬＩＳＡ、酵素標識抗ヒトＩｇＧコンジュゲートを添加することによるジカウイルスに対する試料抗体の検出）と比較し、ジカＮＳ１組換え抗原（「ウイング」および「βラダー」）の両方で試験した。
【0095】
この実験において、上記のヒト試料を、前述のＤＡＧＳイムノアッセイのセットアップを使用して評価した。
回避不可能な系固有のシグナルは約５００カウントである。ジカＩｇＧ抗体およびデング熱ＩｇＧ抗体が陰性であるヒト血清試料の低いバックグラウンドシグナルは、それぞれの抗原ルテニウムコンジュゲートの高い溶解性および一般に良性の物理化学特性を示している。疎水性、または一般に言われている「粘着性」の抗原－ルテニウムコンジュゲートは、ビーズ表面と相互に作用し、それによりバックグラウンドシグナルが増加する傾向にある。表１から、本発明者らは、ジカＮＳ１「ウイング」の物理化学的特性が優れていると推論することができる（第１列）。これは、同様にジカＮＳ１「βラダー」にも該当する（データ第２列）。ジカＮＳ１「ウイング」（配列番号２１）がＤＡＧＳフォーマットでビオチン化形態およびルテニル化形態で抗原対として使用される場合、またはジカＮＳ１「βラダー」（配列番号２２）がＤＡＧＳフォーマットのビオチン化形態およびルテニル化形態の抗原対として使用される場合、両抗原対は、陰性ヒト血清で約６００～９００カウントのシグナルバックグラウンドを生じ、抗原コンジュゲートの良好な溶解特性を明白に示す。しかし、一見したところ、ジカＮＳ１「ウイング」およびジカＮＳ１「βラダー」は抗ジカ抗体を検出するそれらの能力は等しいが、表１に示したように、抗デング熱抗体との交差反応性では著しく異なることが明らかになった。ジカＩｇＧ陽性試料で詳しく見てみた場合、本発明者らは、ジカＮＳ１「ウイング」およびジカＮＳ１「βラダー」の両方が、すべてのジカＩｇＧ試料を陽性として（＞２０００カウント）検出することを見出した。重要なことには、ジカＮＳ１「ウイング」はデング熱ＩｇＧ陽性試料と交差反応しないが、それはすべてのデング熱ＩｇＧ試料がジカＮＳ１ウイング抗原で陰性であると確認される（≪２０００カウント）からである。好対照において、ジカＮＳ１「βラダー」は、２０のデング熱ＩｇＧ試料のうち９つの試料を反応性として検出し（＞２０００カウント）検出し、これは程度の顕著な交差反応性を示す。ジカＩｇＧおよびデング熱ＩｇＧの陽性試料と非常に類似した反応性パターンが、Ｈｕｚｌｙら（Ｅｕｒｏ Ｓｕｒｖｅｉｌｌ． ２０１６； ２１（１６）、ｐｉｉ＝３０２０３、１～４）によって開示された市販のジカＩｇＧアッセイで観察されるが、市販のジカＩｇＧアッセイは、デング熱ＩｇＧ陽性試料と顕著な免疫学的交差反応性を有する（すなわち、市販のジカＩｇＧアッセイはかなり多数の偽陽性ジカ結果をもたらす）という難点を有する。結論として、ジカＮＳ１抗原（ジカＮＳ１「ウイング」およびジカＮＳ１「βラダー」）の操作された両変異体は、顕著な物理化学的特性と抗原特性を有する。しかし、ジカＮＳ１「ウイング」抗原は、ジカＩｇＧ抗体に対する優れた特異性を示すとともに、デング熱陽性血清との免疫学的交差反応性を著しく低下させるという点で、βラダードメインより優れている。
回避不可能な系固有のシグナルは約５００カウントである。ジカＩｇＧ抗体およびデング熱ＩｇＧ抗体が陰性であるヒト血清試料の低いバックグラウンドシグナルは、それぞれの抗原ルテニウムコンジュゲートの高い溶解性および一般に良性の物理化学特性を示している。疎水性、または一般に言われている「粘着性」の抗原－ルテニウムコンジュゲートは、ビーズ表面と相互に作用し、それによりバックグラウンドシグナルが増加する傾向にある。表１から、本発明者らは、ジカＮＳ１「ウイング」の物理化学的特性が優れていると推論することができる（第１列）。これは、同様にジカＮＳ１「βラダー」にも該当する（データ第２列）。ジカＮＳ１「ウイング」（配列番号２１）がＤＡＧＳフォーマットでビオチン化形態およびルテニル化形態で抗原対として使用される場合、またはジカＮＳ１「βラダー」（配列番号２２）がＤＡＧＳフォーマットのビオチン化形態およびルテニル化形態の抗原対として使用される場合、両抗原対は、陰性ヒト血清で約６００～９００カウントのシグナルバックグラウンドを生じ、抗原コンジュゲートの良好な溶解特性を明白に示す。しかし、一見したところ、ジカＮＳ１「ウイング」およびジカＮＳ１「βラダー」は抗ジカ抗体を検出するそれらの能力は等しいが、表１に示したように、抗デング熱抗体との交差反応性では著しく異なることが明らかになった。ジカＩｇＧ陽性試料で詳しく見てみた場合、本発明者らは、ジカＮＳ１「ウイング」およびジカＮＳ１「βラダー」の両方が、すべてのジカＩｇＧ試料を陽性として（＞２０００カウント）検出することを見出した。重要なことには、ジカＮＳ１「ウイング」はデング熱ＩｇＧ陽性試料と交差反応しないが、それはすべてのデング熱ＩｇＧ試料がジカＮＳ１ウイング抗原で陰性であると確認される（≪２０００カウント）からである。好対照において、ジカＮＳ１「βラダー」は、２０のデング熱ＩｇＧ試料のうち９つの試料を反応性として検出し（＞２０００カウント）検出し、これは程度の顕著な交差反応性を示す。ジカＩｇＧおよびデング熱ＩｇＧの陽性試料と非常に類似した反応性パターンが、Ｈｕｚｌｙら（Ｅｕｒｏ Ｓｕｒｖｅｉｌｌ． ２０１６； ２１（１６）、ｐｉｉ＝３０２０３、１～４）によって開示された市販のジカＩｇＧアッセイで観察されるが、市販のジカＩｇＧアッセイは、デング熱ＩｇＧ陽性試料と顕著な免疫学的交差反応性を有する（すなわち、市販のジカＩｇＧアッセイはかなり多数の偽陽性ジカ結果をもたらす）という難点を有する。結論として、ジカＮＳ１抗原（ジカＮＳ１「ウイング」およびジカＮＳ１「βラダー」）の操作された両変異体は、顕著な物理化学的特性と抗原特性を有する。しかし、ジカＮＳ１「ウイング」抗原は、ジカＩｇＧ抗体に対する優れた特異性を示すとともに、デング熱陽性血清との免疫学的交差反応性を著しく低下させるという点で、βラダードメインより優れている。
【0096】
したがって、操作された組換えジカＮＳ１「ウイング」ドメインは、Ｈｕｚｌｙら、前掲によって開示されているような市販の最新のジカＩｇＧイムノアッセイ（これは完全長ＮＳ１に基づくと推測される）と比較して、ジカ抗体の特異的定量のための優れたＮＳ１変異体を構成する。
【0097】
表１は、ジカＮＳ１「βラダー」および市販の最新のジカＩｇＧアッセイと比較した場合のジカＮＳ１「ウイング」の優れた特異性（すなわち、抗デング熱抗体との交差反応性の顕著な低下）を示す。
【0098】
【表1-1】
【0099】
【表1-2】
【0100】
実施例２：ジカＮＳ１「βラダー」抗原と比較したジカＮＳ１「ウイング」抗原の超特異性を確証するためのブロッキング実験
ジカＮＳ１抗原のポリペプチド融合変異体の免疫学的反応性（すなわち抗原性）を、実施例１に記載したように自動化Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）２０１０およびｃｏｂａｓ ｅ ４１１アナライザー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）で評価した。
ジカＮＳ１抗原のポリペプチド融合変異体の免疫学的反応性（すなわち抗原性）を、実施例１に記載したように自動化Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）２０１０およびｃｏｂａｓ ｅ ４１１アナライザー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）で評価した。
【0101】
ジカＩｇＧ抗体に陽性の３つのヒト血清試料を、操作したジカＮＳ１組換え抗原（「ウイング」および「βラダー」）の両方で試験した。並行して、ジカＩｇＧ抗体に陽性のこれらのヒト血清試料は、個々に、ＴＢＥＶ（ダニ媒介脳炎ウイルス、ＦＳＭＥ、配列番号６）、またはＤＥＮＶ１～４の１つの抗原（デングウイルス１～４、配列番号８、１０、１２、１４）、またはＷＮＶ（西ナイルウイルス、配列番号１６）、またはＹＦＶ（黄熱ウイルス、配列番号１８）、またはＪＥＶ（日本脳炎ウイルス、配列番号２０）、またはＺＩＫＶ（ジカウイルス、配列番号３）のいずれかの完全長フラビウイルスＮＳ１抗原調製物でスパイクされた（表２ａおよび表２ｂ）。
【0102】
この実験において、上記のヒト試料（スパイクおよび非スパイク）を前述のＤＡＧＳイムノアッセイのセットアップで評価した。
試料は、ブロッキング実験に必要とされる反応性レベル（力価）に予備希釈した。ブロッキング実験用に調製したフラビウイルスＮＳ－１調製物の濃度および試料中の抗体の量が明確なブロッキング結果を得るために合理的な濃度比内であることが必要とされるので、このステップが必要であった。次いで、予備希釈したヒト抗ジカＩｇＧ陽性試料反応性を、ＴＢＥＶ、またはＤＥＮＶ１－４、またはＷＮＶ、またはＹＦＶ、またはＪＥＶまたはＺＩＫＶのいずれかの完全長フラビウイルスＮＳ－１でスパイクした場合の同じ試料で得られたシグナルと比較した。ＴＢＥＶ、ＤＥＮＶ１～４、ＷＮＶ、ＹＦＶ、ＪＥＶおよびＺＩＫＶの異なる完全長ＮＳ－１調製物による競合によってシグナル減少の程度を計算した。ブロッキングのシグナル減少の程度は、完全長ジカＮＳ１で達成される最大ブロッキングに標準化されたが、これは予想通り、両アッセイで（ジカＮＳ１「ウイング」またはジカＮＳ１「βラダー」のいずれを使用することに関係なく）シグナルの最も強い消光を示す。競合する能力の程度は、すべての他の完全長フラビウイルスＮＳ１調製物（ＴＢＥＶ、ＤＥＮＶ１～４、ＷＮＶ、ＹＦＶ、ＪＥＶ）について計算した。ジカＮＳ１「ウイング」抗原に基づくアッセイのシグナルは、非ジカＮＳ１抗原によって消光が弱くなるだけであるが、ジカＮＳ１「βラダー」抗原に基づくアッセイのシグナルは、ＴＢＥＶ、ＤＥＮＶ１～４、およびＪＥＶによって顕著に低減されることは一目したところ明白である。この発見は、ＮＳ１ウイングドメインとＮＳ１βラダードメインがアルボウイルスＮＳ１相同体の中でそれらの構造の独自性が大きく異なることを強く力説するように示している。明らかに、非ジカＮＳ１抗原のウイング部分は、抗ジカ分析物抗体への結合について、操作されたジカウイング抗原と効率的に競合され得ない。反対に、非ジカＮＳ１抗原のβラダー部分は、抗ジカ分析物抗体への結合について、操作されたジカβラダー抗原と完全に効率的に競合され得る。
試料は、ブロッキング実験に必要とされる反応性レベル（力価）に予備希釈した。ブロッキング実験用に調製したフラビウイルスＮＳ－１調製物の濃度および試料中の抗体の量が明確なブロッキング結果を得るために合理的な濃度比内であることが必要とされるので、このステップが必要であった。次いで、予備希釈したヒト抗ジカＩｇＧ陽性試料反応性を、ＴＢＥＶ、またはＤＥＮＶ１－４、またはＷＮＶ、またはＹＦＶ、またはＪＥＶまたはＺＩＫＶのいずれかの完全長フラビウイルスＮＳ－１でスパイクした場合の同じ試料で得られたシグナルと比較した。ＴＢＥＶ、ＤＥＮＶ１～４、ＷＮＶ、ＹＦＶ、ＪＥＶおよびＺＩＫＶの異なる完全長ＮＳ－１調製物による競合によってシグナル減少の程度を計算した。ブロッキングのシグナル減少の程度は、完全長ジカＮＳ１で達成される最大ブロッキングに標準化されたが、これは予想通り、両アッセイで（ジカＮＳ１「ウイング」またはジカＮＳ１「βラダー」のいずれを使用することに関係なく）シグナルの最も強い消光を示す。競合する能力の程度は、すべての他の完全長フラビウイルスＮＳ１調製物（ＴＢＥＶ、ＤＥＮＶ１～４、ＷＮＶ、ＹＦＶ、ＪＥＶ）について計算した。ジカＮＳ１「ウイング」抗原に基づくアッセイのシグナルは、非ジカＮＳ１抗原によって消光が弱くなるだけであるが、ジカＮＳ１「βラダー」抗原に基づくアッセイのシグナルは、ＴＢＥＶ、ＤＥＮＶ１～４、およびＪＥＶによって顕著に低減されることは一目したところ明白である。この発見は、ＮＳ１ウイングドメインとＮＳ１βラダードメインがアルボウイルスＮＳ１相同体の中でそれらの構造の独自性が大きく異なることを強く力説するように示している。明らかに、非ジカＮＳ１抗原のウイング部分は、抗ジカ分析物抗体への結合について、操作されたジカウイング抗原と効率的に競合され得ない。反対に、非ジカＮＳ１抗原のβラダー部分は、抗ジカ分析物抗体への結合について、操作されたジカβラダー抗原と完全に効率的に競合され得る。
【0103】
結論として、これは、ジカＮＳ１「ウイング」抗原に基づくアッセイが、他のアルボウイルス（ＴＢＥＶ、ＤＥＮＶ１～４、ＷＮＶ、ＹＦＶ、ＪＥＶ）のフラビウイルスＮＳ－１調製物と交差反応し得ない（または交差反応性の傾向がない）抗ジカＩｇＧ抗体をほぼ検出することも証明しているので、この実験は実施例１と完全に一致している。反対に、ジカＮＳ１「βラダー」抗原に基づくアッセイは、ＴＢＥＶ、ＤＥＮＶ１～４およびＪＥＶと一部で交差反応し得る（あるいは交差反応性の傾向がある）抗ジカ抗体に結合する（すなわち、それらはＴＢＥＶ、ＤＥＮＶ１～４およびＪＥＶ ＮＳ－１調製物によってブロックされ得る）。言いかえれば、ジカＮＳ１抗原のβラダードメインは、関連アルボウイルスのβラダードメインと有意な構造とおよび配列相同を共有することにより、抗原として使用した場合に、イムノアッセイで偽陽性の結果がもたらされると思われる。反対に、ジカＮＳ１抗原のウイングドメインはかなり特有であると考えられ、また他のアルボウイルス由来のそのＮＳ相当物と構造的な相同性をほとんど共有しないようである。
【0104】
本発明者らのデータは、この原理がジカウイルス感染と他のフラビウイルス感染を区別するだけでなく、他のフラビウイルス感染を相互に区別することにも当てはまることを示す。本発明者らは、ＮＳ１抗原のウイングドメインに対する抗体の特異的な検出が、複数のフラビウイルス感染のバックグラウンドであってもフラビウイルス感染を明確に区別するための優れた手段であると結論づける。本発明者らは、我々の所見が現在の血清学を大幅に改善し、フラビウイルス分野での罹患率および発生率データに関するより適切な見解を得る可能性を有するものと推論する。
【0105】
要約すると、ジカＮＳ１「ウイング」抗原は、ジカＩｇＧに対する優れた超性能の特異性を示し、他のアルボウイルス（ここではフラビウイルスのファミリー）由来のＮＳ１相同体に対して生成される抗体との免疫学的交差反応性を受けにくく、したがって、抗ジカＩｇＧ抗体の特異的試験により一層好適である。
【0106】
【表2】
【0107】
【表3】
【0108】
頭文字の説明：
ＺＩＫＶ＝ジカウイルス
ＤＥＮＶ１＝デングウイルス１型
ＤＥＮＶ２＝デングウイルス２型
ＤＥＮＶ３＝デングウイルス３型
ＤＥＮＶ４＝デングウイルス４型
ＷＮＶ＝西ナイルウイルス
ＪＥＶ＝日本脳炎ウイルス
ＹＦＶ＝黄熱ウイルス
ＴＢＥＶ＝ダニ媒介脳炎ウイルス（＝ＦＳＭＥウイルス）
ＺＩＫＶ＝ジカウイルス
ＤＥＮＶ１＝デングウイルス１型
ＤＥＮＶ２＝デングウイルス２型
ＤＥＮＶ３＝デングウイルス３型
ＤＥＮＶ４＝デングウイルス４型
ＷＮＶ＝西ナイルウイルス
ＪＥＶ＝日本脳炎ウイルス
ＹＦＶ＝黄熱ウイルス
ＴＢＥＶ＝ダニ媒介脳炎ウイルス（＝ＦＳＭＥウイルス）
【配列表】