特許 7573254 改変フィブロイン架橋体を製造する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-10-17

(45)【発行日】2024-10-25

(54)【発明の名称】改変フィブロイン架橋体を製造する方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/113 20060101AFI20241018BHJP

   C07K 14/435 20060101ALI20241018BHJP

【ＦＩ】

C07K1/113 ZNA

C07K14/435

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2019225765

(22)【出願日】2019-12-13

(65)【公開番号】P2021095346

(43)【公開日】2021-06-24

【審査請求日】2022-11-28

(73)【特許権者】

【識別番号】508113022

【氏名又は名称】Ｓｐｉｂｅｒ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100128381

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 義憲

(74)【代理人】

【識別番号】100211100

【弁理士】

【氏名又は名称】福島 直樹

(72)【発明者】

【氏名】坂田 一樹

(72)【発明者】

【氏名】佐野 明子

(72)【発明者】

【氏名】白川 誠司

(72)【発明者】

【氏名】シャファート オリバー セイエッド

(72)【発明者】

【氏名】クダシェワ アリナ

(72)【発明者】

【氏名】北原 奈緒

【審査官】鳥居 敬司

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１９／１９４２２４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１９／０２２１６３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１９／１９４２４９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２００８－５３０５４０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１２－２１９１００（ＪＰ，Ａ）

【文献】Prion，2008年，2:4，pp.145-153

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １／００－１／３６

Ｃ０７Ｋ １４／００－１４／８２５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

改変フィブロインが分子間で架橋された改変フィブロイン架橋体を製造する方法であって、
前記改変フィブロインに光を照射して、酸化反応によりジスルフィド結合を形成させることで、前記改変フィブロイン架橋体を得る架橋工程を備え、
前記改変フィブロインは、そのアミノ酸配列が天然由来のフィブロインのアミノ酸配列とは異なるフィブロインであり、
前記改変フィブロインがシステイン残基を有し、
前記改変フィブロインのシステイン残基の総数が１以上６以下であり、
前記改変フィブロインが、式１：［（Ａ） _ｎ モチーフ－ＲＥＰ］ _ｍ 、又は式２：［（Ａ） _ｎ モチーフ－ＲＥＰ］ _ｍ －（Ａ） _ｎ モチーフで表されるドメイン配列を含む、方法。
［式１及び式２中、（Ａ） _ｎ モチーフは４～２７アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ） _ｎ モチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上である。ＲＥＰは１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは１０～３００の整数を示す。複数存在する（Ａ） _ｎ モチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。］

【請求項2】

前記架橋工程が、前記改変フィブロインに、光増感剤の存在下で、光を照射することにより行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記光増感剤がケトン類である、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記架橋工程が、前記改変フィブロインと、該改変フィブロインを溶解させる溶媒とを含む改変フィブロイン溶液に光を照射することにより行われる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記溶媒が、ジメチルスルホキシド又はヘキサフルオロ－２－プロパノールである、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記改変フィブロインの分子量が９０ｋＤａ以上である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記改変フィブロインが、改変クモ糸フィブロインである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記ドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、前記ドメイン配列のＮ末端及び／又はＣ末端の近傍に位置するＲＥＰ中に、システイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記ドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中に１以上６以下のシステイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記改変フィブロインが、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にヒスチジンタグ配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記光の波長が３１５～４００ｎｍである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記架橋工程において、前記光を１５分間以上照射する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、改変フィブロイン架橋体を製造する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

タンパク質の耐久性、物性向上等を目的として、タンパク質を分子架橋する方法が広く知られている。具体的には、例えば、糖類等の所定の架橋剤を用いてタンパク質を架橋する方法についての報告がある（例えば、特許文献１）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【文献】特開第２０１８－１５０３６４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

ところで、改変フィブロインには、架橋反応の進行を妨げる複数の構造的要因がある。例えば、改変フィブロインは分子が規則正しく並んだ結晶性の部分と、不規則な構造の非結晶性部分が内在しており、複雑な高次構造を形成している。加えて、改変フィブロインは、イオン結合、静電結合、水素結合等の相互作用に関連する領域を比較的多く持つため、分子が結束する力が比較的強くなっている。これらの構造的要因から、改変フィブロインを分子間で架橋する反応を制御することは困難であった。

【0005】

改変フィブロインの架橋反応では、反応が制御できなくなると、制御の効かない架橋が繰り返されて、溶媒不溶性のゲル状物質が生成する場合があり、結果として、目的とする改変フィブロインの架橋体を効率良く得ることが困難であった。

【0006】

本発明の目的は、ゲル化等の副反応を抑制しながら、改変フィブロインが分子間で架橋された架橋体を効率よく製造する方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］
システイン残基を有する改変フィブロインが分子間で架橋された改変フィブロイン架橋体を製造する方法であって、
前記改変フィブロインに光を照射して、酸化反応によりジスルフィド結合を形成させることで、前記改変フィブロイン架橋体を得る架橋工程を備える、方法。
［２］
前記架橋工程が、前記改変フィブロインに、光増感剤の存在下で、光を照射することにより行われる、［１］に記載の方法。
［３］
前記光増感剤がケトン類である、［２］に記載の方法。
［４］
前記架橋工程が、前記改変フィブロインと、該改変フィブロインを溶解させる溶媒とを含む改変フィブロイン溶液に光を照射することにより行われる、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
前記溶媒が、ジメチルスルホキシド又はヘキサフルオロ－２－プロパノールである、［４］に記載の方法。
［６］
前記改変フィブロインの分子量が９０ｋＤａ以上である、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
前記改変フィブロインが、改変クモ糸フィブロインである、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］
前記改変フィブロインが、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ、又は式２：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフで表されるドメイン配列を含み、
前記ドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、前記ドメイン配列のＮ末端及び／又はＣ末端の近傍に位置するＲＥＰ中に、システイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有する、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［式１及び式２中、（Ａ）_ｎモチーフは４～２７アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）_ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上である。ＲＥＰは１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは１０～３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）_ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。］
［９］
前記改変フィブロインが、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ、又は式２：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフで表されるドメイン配列を含み、
前記ドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中に１以上１６未満のシステイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有する、［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
［式１及び式２中、（Ａ）_ｎモチーフは４～２７アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）_ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上である。ＲＥＰは１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは１０～３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）_ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。］
［１０］
前記改変フィブロインが、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にヒスチジンタグ配列を含む、［１］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］
前記光の波長が３１５～４００ｎｍである、［１］～［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］
前記接触時間が１５分間以上であることを特徴とする［１］～［１１］のいずれかに記載の方法。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、ゲル化等の副反応を抑制しながら、改変フィブロインが分子間で架橋された架橋体を効率よく製造する方法を提供することができる。本発明の製造方法によれば、例えば、ヒスチジン残基等の他のアミノ酸残基を含む改変フィブロインであっても、システイン残基同士を選択的に反応させることが可能である。したがって、本発明の製造方法は、ヒスチジンタグを含む改変フィブロインの架橋に好適に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。

【図2】試験例１におけるＧＰＣによる分子量の測定結果を示すグラフである。

【図3】試験例１におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分子量の測定結果を示すグラフである。

【図4】試験例２におけるＧＰＣによる分子量の測定結果を示すグラフである。

【図5】試験例２におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分子量の測定結果を示すグラフである。

【図6】試験例３におけるＧＰＣによる分子量の測定結果を示すグラフである。

【図7】試験例４におけるＧＰＣによる分子量の測定結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0010】

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

【0011】

〔改変フィブロイン架橋体の製造方法〕
本実施形態に係る製造方法は、システイン残基を有する改変フィブロインに光を照射して、酸化反応によりジスルフィド結合を形成させることで、改変フィブロイン架橋体を得る架橋工程を備える。改変フィブロイン架橋体は、システイン残基を有する改変フィブロインが分子間で架橋されたものである。架橋工程において照射された光によって、システイン残基のチオール基（－ＳＨ基）が活性化され、活性化された－ＳＨ基がジスルフィド結合を形成することによって、システイン残基を有する改変フィブロイン同士を架橋して、改変フィブロイン架橋体が生成する。

【0012】

本実施形態に係る製造方法によれば、システイン残基と、光反応に関与し得る性質をもつアミノ酸残基（例えば、ヒスチジン残基、チロシン残基）とを含む改変フィブロインにおいても、システイン残基を選択的に反応させることができる。そのため、システイン残基を反応ターゲットとした選択的な反応が可能となり。結果として改変フィブロイン架橋体を効率よく得ることができる。

【0013】

グルタルアルデヒド、イソシアネート、カルボジイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド等の架橋剤を使用してタンパク質を架橋する方法では、反応後に、未反応の架橋剤を除去する操作を行う場合があるのに対し、本実施形態に係る製造方法では、光反応を利用するため、例えば、毒性の高い架橋剤を使用する必要がなく、より簡便に架橋体を得ることができるという利点も有する。更に、本実施形態に係る製造方法では、架橋反応の時間をより短縮することができるという利点も有する。

【0014】

＜架橋工程＞
架橋工程では、システイン残基を有する改変フィブロイン（システイン残基含有改変フィブロイン）に光を照射して、酸化反応によりジスルフィド結合を形成させることで、改変フィブロイン架橋体を得る。

【0015】

架橋工程は、架橋反応がより一層促進されやすくなる観点から、システイン残基含有改変フィブロインに、光増感剤の存在下で光を照射することにより行われてもよい。光増感剤を用いることにより、システイン残基におけるチオール基が特異的に活性され、反応をより選択的に進めやすくなる傾向がある。

【0016】

光増感剤は、一般的なものが使用可能であり、特に限定されない。光増感剤は、反応効率をより一層高める観点から、ケトン類であることが好ましい。ケトン類としては、ベンゾフェノン、アントラキノン、カンファキノン、4-(ジメチルアミノ)ベンゾフェノン、チオキサントン誘導体、置換ベンゾイル安息香酸、２，４－ジエチルオキサンテンー９－オン、アントラキノン含有カルボン酸、ブロモメチル―アントラキノン、アントラキノンスルホン酸、ジベンゾスベレノンが挙げられる。

【0017】

架橋工程において使用する光増感剤の量は、システイン残基含有改変フィブロイン１００質量部に対して、０．０５～２０質量部であってよく、０．５～５質量部であってよい。

【0018】

架橋工程において、光を照射する時間（光反応時間）は、１５分間以上であることが好ましく、３０分間以上であることがより好ましく、例えば、１時間以上、５時間以上、１０時間以上、１５時間以上又は１８時間以上であってもよい。光反応時間は、例えば、３０時間以下、又は２５時間以下であってよい。

【0019】

架橋工程において、照射する光の波長は特に制限されないが、紫外線領域である２００～４００ｎｍであることが好ましく、３１５～４００ｎｍであることがより好ましい。

【0020】

架橋反応のスケールは特に制限されないが、工業的な製造の観点から、システイン残基含有改変フィブロインの量は、１０ｍｇ以上であることが好ましく、１００ｍｇ以上であることがより好ましく、５００ｍｇ以上であることがさらに好ましい。

【0021】

架橋工程において、光を照射する際の温度は、特に限定されないが、例えば、２５℃以上、４０℃以上、又は８０℃以上であってよく、２５℃以下、１０℃以下、又は０℃以下であってよい。

【0022】

システイン残基含有改変フィブロインに光を照射する方法としては、例えば、システイン残基含有改変フィブロインそのものを固体の状態で光を照射する方法、システイン残基含有改変フィブロインを溶解している溶媒とを含む改変フィブロイン溶液に光を照射する方法、システイン残基含有改変フィブロインを含むゲルに対して光を照射する方法が挙げられる。

【0023】

一実施形態に係る製造方法において、架橋工程は、例えば、システイン残基含有改変フィブロインと、該システイン残基含有改変フィブロインとを溶解している溶媒とを含む改変フィブロイン溶液に光を照射することにより行われてよい。一実施形態に係る製造方法は、架橋工程の前に、システイン残基含有改変フィブロインを溶媒に溶解して改変フィブロイン溶液を得る溶解工程を更に備えていてよい。

【0024】

改変フィブロイン溶液は、システイン残基含有改変フィブロインとこれを溶解している溶媒（溶解用溶媒）とを含んでいる。改変フィブロイン溶液は、不可避的な含有成分、例えば、タンパク質に含まれている夾雑物等を含むものであってもよい。改変フィブロイン溶液は、上述した光増感剤を更に含んでいてよい。改変フィブロイン溶液は、システイン残基含有改変フィブロインと、光増感剤と、これらを溶解している溶媒とを含むものであってもよい。

【0025】

溶媒としては、水、ヘキサフルオロイソプロパノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ギ酸等が挙げられる。反応後の精製がより容易になりやすい観点、システイン残基含有改変フィブロインを、変性剤を添加することなく、溶解することができ、望まない副反応をより抑制しやすい観点等から、溶媒は、ジメチルスルホキシド、ヘキサフルオロイソプロパノール又はこれらの組み合わせであることが好ましい。工業的な観点、改変フィブロインを溶解しやすい観点、及び沸点が低く、後述する回収工程における減圧乾燥がより容易になる観点から、溶媒はヘキサフルオロイソプロパノールであることが好ましい。

【0026】

溶媒に溶解させるシステイン残基含有改変フィブロインとしては、精製されたシステイン残基含有改変フィブロインを用いてもよく、目的とするシステイン残基含有改変フィブロインを発現した宿主細胞中のシステイン残基含有改変フィブロインを用いてもよい。精製されたシステイン残基含有改変フィブロインは、システイン残基含有改変フィブロインを発現した宿主細胞から精製されたシステイン残基含有改変フィブロインであってよい。宿主細胞中のシステイン残基含有改変フィブロインを目的とするシステイン残基含有改変フィブロインとして溶解させる場合、宿主細胞と溶媒とを接触させて、当該宿主細胞中のシステイン残基含有改変フィブロインを溶媒に溶解させる。宿主細胞は、目的とするシステイン残基含有改変フィブロインを発現したものであればよく、例えば、無傷の細胞であってもよく、破壊処理等の処理を行った後の細胞であってもよい。また、既に簡単な精製処理を行った細胞であってもよい。

【0027】

システイン残基含有改変フィブロインを発現した宿主細胞からシステイン残基含有改変フィブロインを精製する方法としては、特に限定されないが、例えば、公知の方法（例えば、特許第６０７７５７０号公報及び特許第６０７７５６９号公報に記載されている方法）を用いることができる。

【0028】

システイン残基含有改変フィブロインは、例えば、室温で溶解してもよいし、種々の加熱温度に保持して、システイン残基含有改変フィブロインを溶媒に溶解させてもよい。加熱温度の保持時間は、特に限定されないが、１分以上であってよく、工業的生産を考慮すると、１～１２０分が好ましく、５～６０分がより好ましく、１０～３０分がさらに好ましい。加熱温度の保持時間は、例えば、システイン残基含有改変フィブロインが十分に溶解し、かつ夾雑物（目的とするシステイン残基含有改変フィブロイン以外のもの）の溶解が少ない条件で、適宜設定してよい。

【0029】

システイン残基含有改変フィブロインを発現した宿主細胞中のシステイン残基含有改変フィブロインを溶解する場合、溶媒の添加量は、宿主細胞の重量（ｇ）に対する、溶媒（ｍＬ）の比（体積（ｍＬ）／重量（ｇ））として、１～１００倍であってよく、１～５０倍であってよく、１～２５倍であってよく、１～１０倍であってよく、１～５倍であってよい。

【0030】

改変フィブロイン溶液におけるシステイン残基含有改変フィブロインの含有量は、例えば、改変フィブロイン溶液の全質量を基準として、５質量％以上３５質量％以下、又は０．１質量％以上５０質量％以下であってよい。

【0031】

改変フィブロイン架橋体の生成（システイン残基含有改変フィブロインの架橋）はＧＰＣで確認することができる。システイン残基含有改変フィブロインを溶解させた溶液がカラム内を流れていくと、大きな分子は一定時間におけるカラム内での移動距離が短いために早い時間で溶出し、小さな分子はカラム内での移動距離が長くなるために、溶出される時間が遅くなる。上記のように、分子をそれらの大きさによりで分離することで架橋反応の進行を確かめることができる。

【0032】

システイン残基含有改変フィブロインの架橋はＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認することもできる。反応後に得られる反応混合物を分析すると、反応前のシステイン残基含有改変フィブロインの多量体に相当するバンドが確認できる。

【0033】

架橋工程では、改変フィブロイン架橋体を、その他の成分を含む反応混合物として得てもよい。当該反応混合物は、改変フィブロイン架橋体を含む各種成形体の原料としてそのまま用いてもよく、必要により、反応混合物から、その他の成分を分離（除去）してから、成形体の原料として用いてもよい。

【0034】

本実施形態に係る製造方法では、システイン残基を導入する位置、導入するシステイン残基の数等を制御することによって、ゲル化の抑制が容易であり、工業的な改変フィブロイン架橋体の製造に好適に用いることができる。

【0035】

＜回収工程＞
本実施形態に係る製造方法は、改変フィブロイン架橋体を回収する回収工程を更に備えていてよい。例えば、架橋工程において、改変フィブロイン架橋体が、その他の成分を含む反応混合物として得られる場合、回収工程は、反応混合物から、その他の成分（例えば、溶媒、光増感剤）を除去することを含んでいてよい。

【0036】

条件によっては濃縮等を行うことにより、アミノ酸残基（例えば、システイン残基以外のアミノ酸残基）が副反応（例えば、更なる架橋反応）を引き起こす場合があるため、反応混合物から、その他の成分（例えば、光増感剤、溶媒）の一部又は全部を分離することが望ましい。

【0037】

架橋工程が、改変フィブロイン溶液に光を照射することにより行われる場合、架橋工程後に、回収工程として、改変フィブロイン架橋体及び溶媒を含む反応混合物から、溶媒を除去してよい。

【0038】

反応混合物から溶媒を除去する方法としては、例えば、減圧乾燥等の方法により、溶媒を揮発させる方法が挙げられる。

【0039】

溶媒を除去する方法としては、例えば、改変フィブロイン架橋体及び溶媒等のその他の成分を含む反応混合物に、改変フィブロイン架橋体に対する貧溶媒を添加することにより、改変フィブロイン架橋体を沈殿させる方法が挙げられる。貧溶媒の種類は、改変フィブロイン架橋体を溶解しにくい性質があるものであってよく、改変フィブロイン架橋体の種類等に応じて適宜選択してよい。貧溶媒としては、例えば、ヘキサフルオロイソプロパノールを除くアルコール、ケトン、エステル、エーテル、ベンゼン、トルエン類が挙げられる。

【0040】

溶媒を除去する前に、必要に応じて、反応混合物から、不溶物を除去してもよい。反応混合物から、不溶物を除去する方法としては、遠心分離、ドラムフィルター、プレスフィルター等のフィルターろ過等、一般的な方法が挙げられる。フィルターろ過による場合、セライト、珪藻土等のろ過助剤及びプリコート剤等を併用することにより、反応混合物から不溶物をより効率的に除去することができる。

【0041】

改変フィブロイン架橋体は、必要により成形した後に、水等で洗浄することにより、その他の成分（例えば、光増感剤、溶媒）を除去してもよい。

【0042】

（改変フィブロイン）
本実施形態に係る改変フィブロインは、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ、又は式２：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。改変フィブロインは、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列（Ｎ末端配列及びＣ末端配列）が付加されていてもよい。Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、１００残基程度のアミノ酸からなる。

【0043】

本明細書において「改変フィブロイン」とは、そのアミノ酸配列が天然由来のフィブロインのアミノ酸配列とは異なるフィブロインを意味する。本明細書でいう「天然由来のフィブロイン」は、そのアミノ酸配列が自然に存在する昆虫又はクモ類等が産生するフィブロインと同一であるフィブロインを意味する。天然由来のフィブロインもまた、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ、又は式２：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。

【0044】

天然由来のフィブロインとしては、例えば、昆虫又はクモ類が産生するフィブロインが挙げられる。

【0045】

昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ Ｃｙｎｔｈｉａ ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｍｙｌｉｔｔａ）、ムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質、スズメバチ（Ｖｅｓｐａ ｓｉｍｉｌｌｉｍａ ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。

【0046】

昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、ＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））が挙げられる。

【0047】

クモ類が産生するフィブロインとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）等が挙げられる。

【0048】

クモ類が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、ｆｉｂｒｏｉｎ－３（ａｄｆ－３）［Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１０（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５５（塩基配列））、ｆｉｂｒｏｉｎ－４（ａｄｆ－４）［Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１１（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｉｄｒｏｉｎ １［Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０４５０４（アミノ酸配列）、Ｕ３７５２０（塩基配列））、ｍａｊｏｒ ａｎｇｕ１１ａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ １［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ ｈｅｓｐｅｒｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ６８８５６（アミノ酸配列）、ＥＦ５９５２４６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｉｄｒｏｉｎ ２［Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖａｔａ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３２４７２（アミノ酸配列）、ＡＦ４４１２４５（塩基配列））、ｍａｊｏｒ ａｎｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ １［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ００４２８（アミノ酸配列）、ＡＪ９７３１５５（塩基配列））、及びｍａｊｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ ２［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ３２２４９．１（アミノ酸配列）、ＡＭ４９０１６９（塩基配列））、ｍｉｎｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ １［Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５８９．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ２［Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５９１．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ ｃｒｕｅｎｔａｔａ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ３７２７８．１（アミノ酸配列）等が挙げられる。

【0049】

天然由来のフィブロインのより具体的な例としては、更に、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報のうちＤＩＶＩＳＩＯＮとしてＩＮＶを含む配列の中から、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮにｓｐｉｄｒｏｉｎ、ａｍｐｕｌｌａｔｅ、ｆｉｂｒｏｉｎ、「ｓｉｌｋ及びｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」、又は「ｓｉｌｋ及びｐｒｏｔｅｉｎ」がキーワードとして記載されている配列、ＣＤＳから特定のｐｒｏｄｕｃｔの文字列、ＳＯＵＲＣＥからＴＩＳＳＵＥ ＴＹＰＥに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。

【0050】

「改変フィブロイン」は、本発明で特定されるアミノ酸配列を有するものであれば、天然由来のフィブロインに依拠してそのアミノ酸配列を改変したもの（例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列を改変することによりアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、また天然由来のフィブロインに依らず人工的にアミノ酸配列を設計したもの（例えば、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより所望のアミノ酸配列を有するもの）であってもよい。なお、改変フィブロインのアミノ酸配列を改変したものも、そのアミノ酸配列が天然由来のフィブロインのアミノ酸配列とは異なるものであれば、改変フィブロインに含まれる。

【0051】

本明細書において「ドメイン配列」とは、フィブロイン特有の結晶領域（典型的には、アミノ酸配列の（Ａ）_ｎモチーフに相当する。）と非晶領域（典型的には、アミノ酸配列のＲＥＰに相当する。）を生じるアミノ酸配列であり、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ、又は式２：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフで表されるアミノ酸配列を意味する。ここで、（Ａ）_ｎモチーフは４～２７アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）_ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上である。ＲＥＰは１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは１０～３００の整数を示す。ｍは、２０～３００の整数であることが好ましく、３０～３００の整数であることがより好ましい。複数存在する（Ａ）_ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。

【0052】

（Ａ）_ｎモチーフは、（Ａ）_ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上であればよいが、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）_ｎモチーフは、少なくとも７つがアラニン残基のみで構成されることが好ましい。アラニン残基のみで構成されるとは、（Ａ）_ｎモチーフが、（Ａｌａ）_ｋ（Ａｌａはアラニン残基を示し、ｋは４～２７の整数、好ましくは４～２０の整数、より好ましくは４～１６の整数を示す。）で表されるアミノ酸配列を有することを意味する。

【0053】

ＲＥＰは、１０～２００アミノ酸残基から構成される。ＲＥＰを構成するアミノ酸残基の１以上が、グリシン残基、セリン残基、及びアラニン残基からなる群より選択されるアミノ酸残基であってよい。すなわち、ＲＥＰは、グリシン残基、セリン残基、及びアラニン残基からなる群より選択されるアミノ酸残基を含んでいてよい。

【0054】

ＲＥＰを構成するアミノ酸残基の１以上が、疎水性アミノ酸残基であってよい。すなわち、ＲＥＰは、疎水性アミノ酸残基を含んでいることが好ましい。疎水性アミノ酸残基とは、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基を意味する。アミノ酸残基の疎水性指標（ハイドロパシー・インデックス、以下「ＨＩ」とも記す。）については、公知の指標公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ ｉｎｄｅｘ：Ｋｙｔｅ Ｊ，＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ｒ（１９８２）“Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７，ｐｐ．１０５－１３２）を使用する。疎水性アミノ酸残基としては、例えば、イソロイシン（ＨＩ：４．５）、バリン（ＨＩ：４．２）、ロイシン（ＨＩ：３．８）、フェニルアラニン（ＨＩ：２．８）、メチオニン（ＨＩ：１．９）、アラニン（ＨＩ：１．８）が挙げられる。

【0055】

本実施形態に係る改変フィブロインにおいて、ドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中にシステイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有する。

【0056】

ドメイン配列は、ＲＥＰ中のグリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基と隣り合う位置に、システイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していることが好ましく、ＲＥＰ中のグリシン残基と隣り合う位置に、システイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していることがより好ましい。この場合、システイン残基の側鎖の可動範囲が広いため、システイン残基の側鎖に存在するメルカプト基（－ＳＨ）が、分子内又は分子間でジスルフィド結合を形成しやすくなり、物性をより一層向上させることができる。ＲＥＰ中のシステイン残基は、グリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基と、グリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基との間に位置していてよく、セリン残基と、グリシン残基との間に位置していてよい。

【0057】

ドメイン配列は、ＲＥＰ中の疎水性アミノ酸残基と隣り合う位置に、システイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していることが好ましい。この場合、分子間で疎水性アミノ酸残基同士が疎水的相互作用により固定されることで、システイン残基におけるメルカプト基（－ＳＨ）がジスルフィド結合を形成しやすくなり、物性をより一層向上させることができる。ＲＥＰ中のシステイン残基は、疎水性アミノ酸残基の隣に位置していてよく、疎水性アミノ酸残基と、疎水性アミノ酸残基以外のアミノ酸残基との間に、位置していてもよく、疎水性アミノ酸残基と、グリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基との間に位置していてよく、疎水性アミノ酸残基と、グリシン残基との間に位置していてよい。疎水性アミノ酸残基は、イソロイシン残基、バリン残基、ロイシン残基、フェニルアラニン残基、メチオニン残基、及びアラニン残基からなる群より選択される１種であってよい。

【0058】

ドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、ドメイン配列のＮ末端及び／又はＣ末端の近傍に位置するＲＥＰ中に、システイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していてよい。この場合、分子鎖が長くなるため、物性向上が期待できる。本明細書において、ドメイン配列のＮ末端の近傍に位置するＲＥＰとは、ドメイン配列のＮ末端から１～３番目に位置するＲＥＰを意味する。例えば、システイン残基は、ドメイン配列のＮ末端から１～２番目に位置するＲＥＰ中に位置していてよい。本明細書において、ドメイン配列のＣ末端の近傍に位置するＲＥＰとは、ドメイン配列のＣ末端から１～３番目に位置するＲＥＰを意味する。例えば、システイン残基は、ドメイン配列のＣ末端から１～２番目に位置するＲＥＰ中に位置していてよい。システイン残基は、ドメイン配列の最もＮ末端側及び／又は最もＣ末端側に位置するＲＥＰ中に位置していることが好ましい。

【0059】

ドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の中央又は中央近傍にシステイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していてよい。本明細書において、ＲＥＰ中のアミノ酸配列の中央近傍とは、ＲＥＰの中央に位置するアミノ酸残基（中央に位置するアミノ酸残基が２つ存在する場合はＮ末端側のアミノ酸残基）からＮ末端側に向かって１～５番目の位置、又はＲＥＰの中央に位置するアミノ酸残基（中央に位置するアミノ酸残基が２つ存在する場合はＣ末端側のアミノ酸残基）から１～５番目の位置を示す。例えば、システイン残基は、ＲＥＰの中央に位置していてもよく、ＲＥＰの中央に位置するアミノ酸残基からＮ末端側、又はＣ末端側に向かって１～３番目又は１～２番目に位置していてもよい。

【0060】

改変フィブロインは、ＲＥＰのアミノ酸配列中に、ＧＰＧＸＸモチーフ（Ｇはグリシン残基、Ｐはプロリン残基、Ｘはグリシン残基以外のアミノ酸残基を示す。）を含むことが好ましい。ＲＥＰ中にこのモチーフが含まれることにより、改変フィブロインの伸度を向上させることができる。

【0061】

改変フィブロインが、ＲＥＰ中にＧＰＧＸＸモチーフを含む場合、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率は、特に制限されるものではないが、１％以上であってよく、３％以上、５％以上、１０％以上、又は２０％以上であってもよい。この場合、改変フィブロイン繊維の応力がより一層高くなる。ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の上限に特に制限はなく、５０％以下であってよく、３０％以下であってもよい。

【0062】

本明細書において、「ＧＰＧＸＸモチーフ含有率」は、以下の方法により算出される値である。式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ、又は式２：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロインにおいて、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるＧＰＧＸＸモチーフの個数の総数を３倍した数（即ち、ＧＰＧＸＸモチーフ中のＧ及びＰの総数に相当）をｃとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）_ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｄとしたときに、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率はｃ／ｄとして算出される。

【0063】

ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としているのは、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列」（ＲＥＰに相当する配列）には、フィブロインに特徴的な配列と相関性の低い配列が含まれることがあり、ｍが小さい場合（つまり、ドメイン配列が短い場合）、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出結果に影響するので、この影響を排除するためである。なお、ＲＥＰのＣ末端に「ＧＰＧＸＸモチーフ」が位置する場合、「ＸＸ」が例えば「ＡＡ」の場合であっても、「ＧＰＧＸＸモチーフ」として扱う。

【0064】

図１は、フィブロインのドメイン配列を示す模式図である。図１を参照しながらＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出方法を具体的に説明する。まず、図１に示したフィブロインのドメイン配列（「［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフ」タイプである。）では、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図１中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、ｃを算出するためのＧＰＧＸＸモチーフの個数は７であり、ｃは７×３＝２１となる。同様に、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図１中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、当該配列から更に（Ａ）_ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数ｄは５０＋４０＋１０＋２０＋３０＝１５０である。次に、ｃをｄで除すことによって、ｃ／ｄ（％）を算出することができ、図１のフィブロインの場合２１／１５０＝１４．０％となる。

【0065】

改変フィブロインは、ＲＥＰの疎水性度が、－０．８以上であることが好ましく、－０．７以上であることがより好ましく、０以上であることが更に好ましく、０．３以上であることが更により好ましく、０．４以上であることが特に好ましい。ＲＥＰの疎水性度の上限に特に制限はなく、１．０以下であってよく、０．７以下であってもよい。

【0066】

本明細書において、「ＲＥＰの疎水性度」は、以下の方法により算出される値である。式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ、又は式２：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロインにおいて、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図１の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域の各アミノ酸残基の疎水性指標の総和をｅとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）_ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｆとしたときに、ＲＥＰの疎水性度はｅ／ｆとして算出される。ＲＥＰの疎水性度の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。

【0067】

ドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中に１以上１６未満のシステイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していてよい。これにより、システイン残基を介した反応がより一層制御しやすくなり、ゲル化を含む副反応の進行がより一層抑制されやすくなる。したがって、ゲル化を含む副反応を抑制するためにはＲＥＰに挿入したことに相当するシステイン残基の総数は、１以上１６未満であることが好ましい。ＲＥＰ中に挿入したことに相当するシステイン残基の総数は、１以上１２以下、１以上１０以下、１以上８以下、１以上８未満、１以上６以下、１以上４未満、又は２以上４以下であってもよい。ドメイン配列中のＲＥＰ一つあたりのシステイン残基数は、例えば、１～３であってよく、１～２であってよく、１であってよい。

【0068】

本実施形態に係る改変フィブロインのシステイン残基の総数は、１以上１６未満、１以上１２以下、１以上１０以下、１以上８以下、１以上６以下、又は２以上４以下であってもよい。

【0069】

本実施形態に係る改変フィブロインは、上述したＲＥＰ中のシステイン残基に関する改変に加え、天然由来のフィブロインと比較して、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変が更にあってもよい。

【0070】

本実施形態に係る改変フィブロインの分子量は、特に限定されないが、例えば、１０ｋＤａ以上７００ｋＤａ以下であってよい。本実施形態に係る改変フィブロインの分子量は、例えば、１０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、６０ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以上、１５０ｋＤａ以上、２００ｋＤａ以上、３００ｋＤａ以上、又は５００ｋＤａ以上であってよく、６００ｋＤａ以下、５００ｋＤａ以下、４００ｋＤａ以下、３００ｋＤａ以下、又は２００ｋＤａ以下であってよい。分子量が大きくなることで反応に必要とされるエネルギーが増加し活性化エネルギーが大きくなる、複数種類のアミノ酸のうち、特に活性化されたもののみが反応する状況を作ることが期待される。また、強度等機械的物性を得る面でも分子量の高い分子量のフィブロインを用いることがよく、９０ｋＤａ以上、１５０ｋＤａ以上、２００ｋＤａ以上、３００ｋＤａ以上、又は５００ｋＤａ以上が好ましい。

【0071】

改変フィブロインの分子量は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより得られる測定値である。

【0072】

本実施形態に係る改変フィブロインのより具体的な例として、（ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロイン、（ｉｉ）配列番号７、配列番号８、配列番号９、又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロイン、又は（ｉｉｉ）配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む改変フィブロインを挙げるこができる。

【0073】

配列番号１で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１）は、配列番号１１で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１１）に対し、ドメイン配列の最もＮ末端側に位置するＲＥＰに、システイン残基を１カ所挿入したものである。

【0074】

配列番号２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２）は、配列番号１２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１２）に対し、ドメイン配列の最もＮ末端側に位置するＲＥＰに、システイン残基を１カ所挿入したものである。

【0075】

配列番号３で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ３）は、配列番号１２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１２）に対し、ドメイン配列の最もＮ末端側に位置するＲＥＰ及び最もＣ末端側に位置するＲＥＰに、システイン残基をそれぞれ１カ所挿入したものである。

【0076】

配列番号４で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ４）は、配列番号１２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１２）に対し、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側それぞれから１番目及び２番目に位置するＲＥＰ中に、それぞれ１カ所ずつシステイン残基が挿入されたものである。

【0077】

配列番号５で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ５）は、配列番号１２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１２）に対し、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側それぞれから１～４番目に位置するＲＥＰ中に、それぞれ１カ所ずつシステイン残基が挿入されたものである。

【0078】

配列番号６で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ６）は、配列番号１２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１２）に対し、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側それぞれから１～８番目に位置するＲＥＰ中に、それぞれ１カ所ずつシステイン残基が挿入されたものである。

【0079】

配列番号７で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ７）は、配列番号１３で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１３）に対し、ドメイン配列の最もＮ末端側及び最もＣ末端側それぞれに位置するＲＥＰに、システイン残基を１カ所ずつ挿入したものである。

【0080】

配列番号８で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ８）は、配列番号１４で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１４）に対し、ドメイン配列の最もＮ末端側及び最もＣ末端側それぞれに位置するＲＥＰに、システイン残基を１カ所ずつ挿入したものである。

【0081】

配列番号９で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ９）は、配列番号１４で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１４）に対し、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側それぞれから１～４番目に位置するＲＥＰ中に、それぞれ１カ所ずつシステイン残基が挿入されたものである。

【0082】

配列番号１０で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１０）は、配列番号１４で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１４）に対し、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側それぞれから１～８番目に位置するＲＥＰ中に、それぞれ１カ所ずつシステイン残基が挿入されたものである。

【0083】

配列番号２８で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２８）は、配列番号３０で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ３０）に対し、ドメイン配列の最もＣ末端側に位置するＲＥＰに、システイン残基を１カ所挿入したものである。

【0084】

（ｉ）の改変フィブロインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６で示されるアミノ酸配列のみを有するものであってもよい。（ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、又は配列番号１０で示されるアミノ酸配列のみを有するものであってもよい。（ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２８で示されるアミノ酸配列のみを有するものであってもよい。

【0085】

上述の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。

【0086】

タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ｍｅｔａｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による改変フィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号２５又は配列番号２６で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含むアミノ酸配列）が挙げられる。

【0087】

また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。

【0088】

さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に改変フィブロインを精製することができる。

【0089】

さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した改変フィブロインを回収することもできる。

【0090】

タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（ｉｉｉ）配列番号１５（ＰＲＴ１５）、配列番号１６（ＰＲＴ１６）、配列番号１７（ＰＲＴ１７）、配列番号１８（ＰＲＴ１８）、配列番号１９（ＰＲＴ１９）、若しくは配列番号２０（ＰＲＴ２０）で示されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロイン、（ｉｖ）配列番号２１（ＰＲＴ２１）、配列番号２２（ＰＲＴ２２）、配列番号２３（ＰＲＴ２３）、若しくは配列番号２４（ＰＲＴ２４）で示されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロイン、又は（ｖ）配列番号２９（ＰＲＴ２９）で示されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。

【0091】

（ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、又は配列番号２０で示されるアミノ酸配列のみを有するものであってもよい。

【0092】

配列番号１５（ＰＲＴ１５）、配列番号１６（ＰＲＴ１６）、配列番号１７（ＰＲＴ１７）、配列番号１８（ＰＲＴ１８）、配列番号１９（ＰＲＴ１９）、又は配列番号２０（ＰＲＴ２０）で示されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロインのＧＰＧＸＸモチーフ含有率は、それぞれ４０．２％、３９．９％、３９．９％、３９．７％、３９．３％、及び３８．６％であり、いずれも１０％以上である。

【0093】

（ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、若しくは配列番号２４で示されるアミノ酸配列のみを有するものであってもよい。

【0094】

配列番号２１（ＰＲＴ２１）、配列番号２２（ＰＲＴ２２）、配列番号２３（ＰＲＴ２３）、又は配列番号２４（ＰＲＴ２４）で示されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロインのＧＰＧＸＸモチーフ含有率は、それぞれ３９．９％、３９．９％、３９．３％、及び３８．６％であり、いずれも１０％以上である。

【0095】

（ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２９（ＰＲＴ２９）で示されるアミノ酸配列のみを有するものであってよい。配列番号２９（ＰＲＴ２９）で示されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロインのＧＰＧＸＸモチーフ含有率は、３２である。

【0096】

上述の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。

【0097】

〔核酸〕
一実施形態に係る核酸は、上記改変フィブロインをコードする。核酸の具体例として、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、又は配列番号２８で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロイン、又はこれらのアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のいずれか一方若しくは両方に配列番号２５又は配列番号２６で示されるアミノ酸配列（タグ配列）を結合させた改変フィブロイン等をコードする核酸が挙げられる。

【0098】

一実施形態に係る核酸は、上記改変フィブロインをコードする核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ、又は式２：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフで表されるドメイン配列を含む改変フィブロインをコードする核酸である。当該核酸によりコードされる改変フィブロインの上記ドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中にシステイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有する。

【0099】

「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。低ストリンジェントな条件とは、少なくとも８５％以上の同一性が配列間に存在する時のみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、０．５％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣを用い、４２℃でハイブリダイズする条件が挙げられる。中ストリンジェントな条件とは、少なくとも９０％以上の同一性が配列間に存在する時のみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、０．５％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣを用い、５０℃でハイブリダイズする条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、少なくとも９５％以上の同一性が配列間に存在する時のみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、０．５％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣを用い、６０℃でハイブリダイズする条件が挙げられる。

【0100】

〔宿主及び発現ベクター〕
一実施形態に係る発現ベクターは、上記核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する。調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。

【0101】

一実施形態に係る宿主は、上記発現ベクターで形質転換されたものである。宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。

【0102】

発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、一実施形態に係る核酸を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。

【0103】

細菌等の原核生物を宿主として用いる場合は、一実施形態に係る発現ベクターは、原核生物中で自立複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、一実施形態に係る核酸及び転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。

【0104】

原核生物としては、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する微生物を挙げることができる。

【0105】

エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ライフテクノロジーズ社）、エシェリヒア・コリ ＢＬＲ（ＤＥ３）（メルクミリポア社）、エシェリヒア・コリ ＤＨ１、エシェリヒア・コリ ＧＩ６９８、エシェリヒア・コリ ＨＢ１０１、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ Ｋ５（ＡＴＣＣ ２３５０６）、エシェリヒア・コリ ＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリ ＭＣ１０００、エシェリヒア・コリ ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ ４７０７６）、エシェリヒア・コリ Ｎｏ．４９、エシェリヒア・コリ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ ＴＢ１、エシェリヒア・コリ Ｔｕｎｅｒ（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３） （ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ Ｗ１４８５、エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ ＸＬ２－Ｂｌｕｅ等を挙げることができる。

【0106】

ブレビバチルス属に属する微生物として、例えば、ブレビバチルス・アグリ、ブレビバチルス・ボルステレンシス、ブレビバチルス・セントロポラスブレビバチルス・フォルモサス、ブレビバチルス・インボカツス、ブレビバチルス・ラチロスポラス、ブレビバチルス・リムノフィルス、ブレビバチルス・パラブレビス、ブレビバチルス・レウスゼリ、ブレビバチルス・サーモルバー、ブレビバチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ ＢＰ－１２２３）、ブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ（ＦＥＲＭ ＢＰ－２３０８）、ブレビバチルス・ブレビス４７－５（ＦＥＲＭ ＢＰ－１６６４）、ブレビバチルス・ブレビス４７－５Ｑ（ＪＣＭ８９７５）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ－１０８７）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１－Ｓ（ＦＥＲＭ ＢＰ－６６２３）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１－ＯＫ（ＦＥＲＭ ＢＰ－４５７３）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３株（Ｔａｋａｒａ社製）等を挙げることができる。

【0107】

セラチア属に属する微生物として、例えば、セラチア・リクエファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｃｅ）ＡＴＣＣ１４４６０、セラチア・エントモフィラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ）、セラチア・フォンティコーラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）、セラチア・グリメシ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｇｒｉｍｅｓｉｉ）、セラチア・プロテアマキュランス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ）、セラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）、セラチア・プリムシカ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）、セラチア・ルビダエ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｒｕｂｉｄａｅａ）等を挙げることができる。

【0108】

バチルス属に属する微生物として、例えば、バチルス・サチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）等を挙げることができる。

【0109】

ミクロバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ１５３５４等を挙げることができる。

【0110】

ブレビバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１４０２０、ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７）ＡＴＣＣ１３８２６，ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・インマリオフィラム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９）ＡＴＣＣ１３６６５，ＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・ロゼウムＡＴＣＣ１３８２５、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバクテリウム・チオゲニタリスＡＴＣＣ１９２４０、ブレビバクテリウム・アルバムＡＴＣＣ１５１１１、ブレビバクテリウム・セリヌムＡＴＣＣ１５１１２等を挙げることができる。

【0111】

コリネバクテリウム属に属する微生物として、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７１，ＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１４０６７、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・アセトグルタミカムＡＴＣＣ１５８０６、コリネバクテリウム・アルカノリティカムＡＴＣＣ２１５１１、コリネバクテリウム・カルナエＡＴＣＣ１５９９１、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０２０，ＡＴＣＣ１３０３２，ＡＴＣＣ１３０６０、コリネバクテリウム・リリウムＡＴＣＣ１５９９０、コリネバクテリウム・メラセコーラＡＴＣＣ１７９６５、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭＢＰ－１５３９）、コリネバクテリウム・ハーキュリスＡＴＣＣ１３８６８等を挙げることができる。

【0112】

シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物として、例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・ブラシカセラム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｒｕｍ）、シュードモナス・フルバ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｕｌｖａ）、及びシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｄ－０１１０等を挙げることができる。

【0113】

上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，６９，２１１０ （１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３－２４８３９４号公報）、又はＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等を挙げることができる。

【0114】

ブレビバチルス属に属する微生物の形質転換は、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉらの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８３，１５６：１１３０－１１３４）や、Ｔａｋａｇｉらの方法（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，５３：３０９９－３１００）、又はＯｋａｍｏｔｏらの方法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９７，６１：２０２－２０３）により実施することができる。

【0115】

一実施形態に係る核酸を導入するベクター（以下、単に「ベクター」という。）としては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３－２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ－８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（－）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒｓ３０〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０７）より調製〕、ｐＴｒｓ３２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ Ｂ－４００）より調製、特開昭６０－２２１０９１号公報〕、ｐＧＫＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ－６７９８）より調製、特開昭６０－２２１０９１号公報〕、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等を挙げることができる。

【0116】

宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを用いる場合は、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ等を好適なベクターとして挙げることができる。

【0117】

ブレビバチルス属に属する微生物に好適なベクターの具体例として、枯草菌ベクターとして公知であるｐＵＢ１１０、又はｐＨＹ５００（特開平２－３１６８２号公報）、ｐＮＹ７００（特開平４－２７８０９１号公報）、ｐＨＹ４８３１（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８７，１２３９－１２４５）、ｐＮＵ２００（鵜高重三、日本農芸化学会誌１９８７，６１：６６９－６７６）、ｐＮＵ１００（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９８９，３０：７５－８０）、ｐＮＵ２１１（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２，１１２：４８８－４９１）、ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５（特開平７－１７０９８４号公報）、ｐＮＨ３０１（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９２，５８：５２５－５３１）、ｐＮＨ３２６、ｐＮＨ４００（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９５，１７７：７４５－７４９）、ｐＨＴ２１０（特開平６－１３３７８２号公報）、ｐＨＴ１１０Ｒ２Ｌ５（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９４，４２：３５８－３６３）、又は大腸菌とブレビバチルス属に属する微生物とのシャトルベクターであるｐＮＣＯ２（特開２００２－２３８５６９号公報）等を挙げることができる。

【0118】

プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであれば制限されない。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の大腸菌又はファージ等に由来するプロモーターを挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。

【0119】

リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。発現ベクターにおいて、上記核酸の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。

【0120】

真核生物の宿主としては、例えば、酵母、糸状真菌（カビ等）及び昆虫細胞を挙げることができる。

【0121】

酵母としては、例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ヤロウィア属及びハンゼヌラ属等に属する酵母を挙げることができる。より具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クリベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シワニオマイセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ）、シワニオマイセス・オシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・ポリモルファ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）等を挙げることができる。

【0122】

酵母を宿主細胞として用いる場合の発現ベクターは通常、複製起点（宿主における増幅が必要である場合）及び大腸菌中でのベクターの増殖のための選抜マーカー、酵母における組換えタンパク質発現のためのプロモーター及びターミネーター、並びに酵母のための選抜マーカーを含むことが好ましい。

【0123】

発現ベクターが非組込みベクターの場合、さらに自己複製配列（ＡＲＳ）を含むことが好ましい。これにより細胞内における発現ベクターの安定性を向上させることができる（Ｍｙｅｒｓ、Ａ．Ｍ．、ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｇｅｎｅ ４５：２９９－３１０）。

【0124】

酵母を宿主として用いる場合のベクターとしては、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ＹＩｐ、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５、ｐＡ０８０４、ｐＨＩＬ３Ｏｌ、ｐＨＩＬ－Ｓ１、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣＺα、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣＺ Ｂ等を挙げることができる。

【0125】

プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであれば制限されない。例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１ プロモーター、ＣＵＰ １プロモーター、ｐＧＡＰプロモーター、ｐＧＣＷ１４プロモーター、ＡＯＸ１プロモーター、ＭＯＸプロモーター等を挙げることができる。

【0126】

酵母への発現ベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０））、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４））、酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３））、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等を挙げることができる。

【0127】

糸状真菌としては、例えば、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ウスチラーゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ）属、ボトリティス（Ｂｏｔｒｙｔｓ）属、マグナポルサ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）属、ムコア（Ｍｕｃｏｒ）属、メタリチウム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）属、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、及びリゾムコア属に属する菌等を挙げることができる。

【0128】

糸状真菌の具体例として、アクレモニウム・アラバメンゼ（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌａｂａｍｅｎｓｅ）、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アクレアツス（アキュレータス）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・サケ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｋｅ）、アスペルギルス・ゾジエ（ソーヤ）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・テュビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・パラシチクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・フィクム（フィキュウム）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｉｃｕｕｍ）、アスペルギルス・フェニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｈｏｅｉｃｕｓ）、アスペルギルス・フォエチズス（フェチダス）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フラーブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ヤポニクス（ジャポニカス）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・ハージアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｓｅｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、サーモアスクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）、スポロトリクム・セルロフィルム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｐｈｉｌｕｍ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、チラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、ノイロスポラ・クラザ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、フザリウム・オキシスポーラス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｓ）、フザリウム・グラミネルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ペニシリウム・クリゾゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・カマンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）、ペニシリウム・カネセンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）、ペニシリウム・エメルソニ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・グリゼオロゼウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｇｒｉｓｅｏｒｏｓｅｕｍ）、ペニシリウム・パープロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・ロケフォルチ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、マイセリオフトラ・サーモフィルム（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔａｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、ムコア・アンビグス（Ｍｕｃｏｒ ａｍｂｉｇｕｕｓ）、ムコア・シイルシネロイデェス（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、ムコア・フラギリス（Ｍｕｃｏｒ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、ムコア・ヘマリス（Ｍｕｃｏｒ ｈｉｅｍａｌｉｓ）、ムコア・イナエクイスポラス（Ｍｕｃｏｒ ｉｎａｅｑｕｉｓｐｏｒｕｓ）、ムコア・オブロンジエリプティカス（Ｍｕｃｏｒ ｏｂｌｏｎｇｉｅｌｌｉｐｔｉｃｕｓ）、ムコア・ラセモサス（Ｍｕｃｏｒ ｒａｃｅｍｏｓｕｓ）、ムコア・レクルバス（Ｍｕｃｏｒ ｒｅｃｕｒｖｕｓ）、ムコア・サトゥルニナス（Ｍｏｃｏｒ ｓａｔｕｒｎｉｎｕｓ）、ムコア・サブティリススミウス（Ｍｏｃｏｒ ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｍｕｓ）、オガタエア・ポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、リゾムコア・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、リゾムコア・プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、リゾプス・アルヒザス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕｓ）等を挙げることができる。

【0129】

宿主が糸状真菌である場合のプロモーターとしては、解糖系に関する遺伝子、構成的発現に関する遺伝子、加水分解に関する酵素遺伝子等いずれであってもよく、具体的にはａｍｙＢ、ｇｌａＡ、ａｇｄＡ、ｇｌａＢ、ＴＥＦ１、ｘｙｎＦ１ｔａｎｎａｓｅｇｅｎｅ、Ｎｏ．８ＡＮ、ｇｐｄＡ、ｐｇｋＡ、ｅｎｏＡ、ｍｅｌＯ、ｓｏｄＭ、ｃａｔＡ、ｃａｔＢ等を挙げることができる。

【0130】

糸状真菌への発現ベクターの導入は、従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、Ｃｏｈｅｎらの方法（塩化カルシウム法）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法［Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１１（１９７９）］、コンピテント法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６：２０９（１９７１）］、エレクトロポレーション法等が挙げられる。

【0131】

昆虫細胞として、例えば、鱗翅類の昆虫細胞が挙げられ、より具体的には、Ｓｆ９、及びＳｆ２１等のスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来の昆虫細胞、並びに、Ｈｉｇｈ ５等のイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）由来の昆虫細胞等が挙げられる。

【0132】

昆虫細胞を宿主として用いる場合のベクターとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等のバキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２））を挙げることができる。

【0133】

昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、ポリペプチドを発現することができる。すなわち、組換え遺伝子導入ベクター及びバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルス（発現ベクター）を得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）等を挙げることができる。

【0134】

組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターとバキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２－２２７０７５号公報）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７））等を挙げることができる。

【0135】

一実施形態に係る組換えベクターは、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子をさらに含有していることが好ましい。例えば、大腸菌においては、選択マーカー遺伝子としては、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の各種薬剤に対する耐性遺伝子を用いることができる。栄養要求性に関与する遺伝子変異を相補できる劣性の選択マーカーも使用できる。酵母においては、選択マーカー遺伝子として、ジェネティシンに対する耐性遺伝子を用いることができ、栄養要求性に関与する遺伝子変異を相補する遺伝子、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３等の選択マーカーも使用できる。糸状真菌においては、選択マーカー遺伝子として、ｎｉａＤ（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９，１７９５－１７９７（１９９５））、ａｒｇＢ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｔｅｃｈｎｏｌ，６，３８６－３８９，（１９８４）），ｓＣ（Ｇｅｎｅ，８４，３２９－３３４，（１９８９））、ｐｔｒＡ（ＢｉｏｓｃｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，６４，１４１６－１４２１，（２０００））、ｐｙｒＧ（ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，１１２，２８４－２８９，（１９８３）），ａｍｄＳ（Ｇｅｎｅ，２６，２０５－２２１，（１９８３））、オーレオバシジン耐性遺伝子（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，２６１，２９０－２９６，（１９９９））、ベノミル耐性遺伝子（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８３，４８６９－４８７３，（１９８６））及びハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｇｅｎｅ，５７，２１－２６，（１９８７））からなる群より選ばれるマーカー遺伝子、ロイシン要求性相補遺伝子等が挙げられる。また、宿主が栄養要求性変異株の場合には、選択マーカー遺伝子として当該栄養要求性を相補する野生型遺伝子を用いることもできる。

【0136】

一実施形態に係る発現ベクターで形質転換された宿主の選択は、上記核酸に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション及びコロニーハイブリダイゼーション等で行うことができる。当該プローブとしては、上記核酸の配列情報に基づき、ＰＣＲ法によって増幅した部分ＤＮＡ断片をラジオアイソトープ又はジゴキシゲニンで修飾したものを用いることができる。

【0137】

〔改変フィブロインの製造方法〕
本実施形態に係る改変フィブロインは、上記発現ベクターで形質転換された宿主により、上記核酸を発現させる工程を含む方法により、製造することができる。発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。酵母、動物細胞、昆虫細胞により発現させた場合には、糖又は糖鎖が付加されたポリペプチドとして改変フィブロインを得ることができる。

【0138】

本実施形態に係る改変フィブロインは、例えば、上記発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に本実施形態に係る改変フィブロインを生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。上記宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。

【0139】

上記宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、上記宿主の培養培地として、該宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、該宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。

【0140】

炭素源としては、該宿主が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。

【0141】

窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。

【0142】

無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。

【0143】

大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５～４０℃である。培養時間は、通常１６時間～７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０～９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。

【0144】

また、培養中必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。

【0145】

昆虫細胞の培養培地としては、一般に使用されているＴＮＭ－ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、Ｓｆ－９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））等を用いることができる。

【0146】

昆虫細胞の培養は、例えば、培養培地のｐＨ６～７、培養温度２５～３０℃等の条件下で、培養時間１～５日間とすることができる。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。

【0147】

宿主が植物細胞の場合、形質転換された植物細胞をそのまま培養してもよく、また植物の器官に分化させて培養することができる。該植物細胞を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、又はこれらの培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。

【0148】

動物細胞の培養は、例えば、培養培地のｐＨ５～９、培養温度２０～４０℃等の条件下で、培養時間３～６０日間とすることができる。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

【0149】

上記発現ベクターで形質転換された宿主を用いて改変フィブロインを生産する方法としては、該改変フィブロインを宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、及び宿主細胞外膜上に生産させる方法がある。使用する宿主細胞、及び生産させる改変フィブロインの構造を変えることにより、これらの各方法を選択することができる。

【0150】

例えば、改変フィブロインが宿主細胞内又は宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９））、ロウらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０））、又は特開平５－３３６９６３号公報、国際公開第９４／２３０２１号等に記載の方法を準用することにより、改変フィブロインを宿主細胞外に積極的に分泌させるように変更させることができる。すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、改変フィブロインの活性部位を含むポリペプチドにシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、改変フィブロインを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。

【0151】

上記発現ベクターで形質転換された宿主により生産された改変フィブロインは、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法で単離及び精製することができる。例えば、改変フィブロインが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ－７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。

【0152】

上記クロマトグラフィーとしては、フェニル－トヨパール（東ソー）、ＤＥＡＥ－トヨパール（東ソー）、セファデックスＧ－１５０（ファルマシアバイオテク）を用いたカラムクロマトグラフィーが好ましく用いられる。

【0153】

また、改変フィブロインが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として改変フィブロインの不溶体を回収する。回収した改変フィブロインの不溶体は蛋白質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法により改変フィブロインの精製標品を得ることができる。

【0154】

改変フィブロイン、又は改変フィブロインに糖鎖の付加された誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清から改変フィブロイン又はその誘導体を回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。

【0155】

＜改変フィブロイン架橋体の用途＞
改変フィブロイン架橋体は、例えば、各種成形体の原料として用いることができる。改変フィブロイン架橋体を含む成形体は、例えば、改変フィブロイン架橋体を含むタンパク質溶液を成形する工程（成形工程）を含む方法によって製造することができる。当該成形体の形状としては、特に限定されないが、例えば、繊維、フィルム、モールド成形体、ゲル、多孔質体、パーティクル等を挙げることができる。

【0156】

タンパク質溶液は、例えば、改変フィブロイン架橋体を溶媒に溶解することによって得ることができる。溶媒としては、例えば、ギ酸、ジメチルスルホキシド、ヘキサフルオロ－２－プロパノール、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン、水が挙げられる。タンパク質溶液は、例えば、改変フィブロイン架橋体及び溶媒以外の他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば、改変フィブロイン架橋体以外のタンパク質等が挙げられる。

【0157】

タンパク質溶液中の改変フィブロイン架橋体の含有量、及び、タンパク質溶液中のタンパク質の総含有量は、成形体の形状等に応じて、適宜調整されてよい。これらを調整する方法としては、特に限定されないが、例えば、タンパク質溶液の蒸留により溶媒を揮発させることにより、改変フィブロイン架橋体濃度又はタンパク質濃度を高める方法、溶解工程でタンパク質濃度の高いものを使用する方法、又は溶媒の添加量をタンパク質の量に対し、少なくする方法等が挙げられる。

【0158】

改変フィブロイン架橋体を含む成形体が繊維である場合、成形工程は、例えば、タンパク質溶液を紡糸することによって行われてよい。この場合のタンパク質溶液は、紡糸に適した粘度に調整されたものであってよい。紡糸に適した粘度は、一般に４０℃で１０００～５０，０００ｃＰ（センチポイズ）であってよい。粘度は、例えば京都電子工業社製の商品名“ＥＭＳ粘度計”を使用して測定できる。

【0159】

改変フィブロイン架橋体を含む成形体が繊維である場合、必要により、タンパク質溶液中のタンパク質の総含有量（濃度）を、紡糸が可能な濃度及び粘度に調整してよい。タンパク質の総含有量、及び、タンパク質溶液の粘度を調整する方法は特に限定されない。また、紡糸方法としては、湿式紡糸等が挙げられる。紡糸に適した濃度及び粘度に調整されたタンパク質溶液をドープ液として、凝固液に付与すると、タンパク質が凝固する。この際、タンパク質溶液を糸状の液体として凝固液に付与することで、タンパク質が糸状に凝固し、糸（未延伸糸）が形成できる。未延伸糸の形成は、例えば特許第５５８４９３２号公報に記載されている方法に準じて行うことができる。

【0160】

以下、湿式紡糸の例を示すが、紡糸の方法は特に限定されず、湿式紡糸、乾式紡糸、乾湿式紡糸等であってよい。

【0161】

湿式紡糸－延伸
（ａ）湿式紡糸
凝固液は、脱溶媒できる溶液であればよい。凝固液はメタノール、エタノール、２－プロパノール等の炭素数１～５の低級アルコール又はアセトンを使用するのが好ましい。凝固液は、水を含んでいてもよい。凝固液の温度は、紡糸の安定性の観点から、５～３０℃が好ましい。

【0162】

タンパク質溶液を糸状の液体として付与する方法は、特に限定されないが、例えば紡糸用の口金から脱溶媒槽の凝固液に押し出す（吐出する）方法が挙げられる。タンパク質が凝固することにより未延伸糸が得られる。タンパク質溶液を凝固液に押し出す（吐出する）場合の押出し（吐出）速度は、口金の直径及びタンパク質溶液の粘度等に応じて適宜設定できるが、例えば、直径０．１～０．６ｍｍのノズルを有するシリンジポンプの場合、紡糸の安定性の観点から、押し出し（吐出）速度は１ホール当たり、０．２～６．０ｍＬ／ｈであってよく、１ホール当たり、１．４～４．０ｍＬ／ｈであってよい。凝固液を入れる脱溶媒槽（凝固液槽）の長さは特に限定されないが、例えば長さは２００～５００ｍｍであってよい。タンパク質の凝固により形成された未延伸糸の引き取り速度は例えば１～１４ｍ／分、滞留時間は例えば０．０１～０．１５分であってよい。未延伸糸の引き取り速度は、脱溶媒の効率の観点から、１～３ｍ／分であってよい。タンパク質の凝固により形成された未延伸糸は、さらに凝固液において延伸（前延伸）をしてもよいが、凝固液に用いる低級アルコールの蒸発を抑える観点から、凝固液を低温に維持し、未延伸糸の状態で凝固液から引き取ってもよい。

【0163】

（ｂ）延伸
上述する方法で得られた未延伸糸を、さらに延伸する工程を含むこともできる。延伸は一段延伸でもよいし、２段以上の多段延伸でもよい。多段で延伸すると、分子を多段で配向させ、トータル延伸倍率も高くすることができるため、タフネスの高い繊維の製造に適している。

【0164】

改変フィブロイン架橋体を用いて作製する成形体がフィルム（原料フィルム）である場合は、必要により、タンパク質溶液をフィルム化が可能な濃度及び粘度に調整してよい。タンパク質をフィルム化する方法としては、特に限定されないが、タンパク質溶液を溶媒に耐性のある平板に所定の厚さに塗布して、塗膜を形成させ、塗膜から溶媒を除去することで、所定の厚さのフィルムを得る方法等が挙げられる。

【0165】

所定の厚さのフィルムを形成する方法としては、例えばキャスト法が挙げられる。キャスト法によりフィルムを形成する場合には、平板に、タンパク質溶液をドクターコート、ナイフコーター等の冶具を用いて数ミクロン以上の厚さにキャストしてキャスト膜を形成し、その後減圧乾燥又は脱溶媒槽への浸漬により溶媒を脱離することにより原料フィルム（ポリペプチドフィルム）を得ることができる。原料フィルムの形成は、特許第５６７８２８３号公報に記載されている方法に準じて行うことができる。

【0166】

改変フィブロイン架橋体質を用いて作製する成形体がモールド成形体（原料モールド成形体）である場合、原料モールド成形体を形成する方法は、特に限定されない。例えば、改変フィブロイン架橋体を含む乾燥タンパク質粉末を加圧成形機導入した後、ハンドプレス機等を用いて加圧及び加熱を行うことで、乾燥タンパク質粉末が、モールド成形に必要な温度に達し、原料モールド成形体を得ることができる。また、原料モールド成形体の形成は、特許文献（ＷＯ２０１７／０４７５０３号）に記載されている方法に準じて行うことができる。

【0167】

改変フィブロイン架橋体を用いて作製する成形体がゲルである場合、ゲルを形成する方法は、特に限定されない。例えば、改変フィブロイン架橋体を溶解用溶媒に溶解させてタンパク質溶液を得る工程（溶解工程）と、得られたタンパク質溶液中の溶解溶媒を水溶性溶媒に置換する工程（置換工程）とを含む方法によって、改変フィブロイン架橋体を含むゲルを製造することができる。改変フィブロイン架橋体を含むゲルを製造する方法は、溶解工程と置換工程との間に、タンパク質溶液を所定の形状に保持する工程を含んでいてもよいし、置換工程後に、得られたゲルを所定の形状にカットする工程を含んでいてもよい。タンパク質溶液を所定の形状に保持する工程は、例えば、タンパク質溶液を所定の形状の型枠に流し込むことにより行うことができる。ゲルの形成は、例えば、特許第５７８２５８０号に記載されている方法に準じて行うことができる。

【0168】

改変フィブロイン架橋体を用いて作製する成形体が多孔質体である場合、必要により、タンパク質溶液を多孔質化が可能な濃度及び粘度に調整してよい。多孔質体を形成する方法は、特に限定されない。例えば、多孔質化に好適な濃度及び粘度に調整されたタンパク質溶液に発泡剤を適量添加し、溶媒を除去することで原料多孔質体を得る方法、又は特許第５７９６１４７号に記載されている方法に準じて行うこと等が挙げられる。

【0169】

改変フィブロイン架橋体を用いて作製する成形体がパーティクルである場合、パーティクルを形成する方法は、特に限定されない。パーティクルは、例えば、上述したドープ液を用い、ドープ液中の溶媒を水溶性溶媒に置換することによりタンパク質の水溶液を得る工程と、タンパク質の水溶液を乾燥する工程とを含む方法によって得られる。水溶性溶媒は、水を含む溶媒をいい、例えば、水、水溶性緩衝液、生理食塩水等が挙げられる。水溶性溶媒に置換する工程は、ドープ液を透析膜内に入れ、水溶性溶媒中に浸漬し、水溶性溶媒を１回以上入れ替える方法により行われることが好ましい。具体的には、ドープ液を透析膜に入れ、ドープ液の１００倍以上の量の水溶性溶媒（１回分）の中に３時間静置し、この水溶性溶媒入れ替えを計３回以上繰り返すことがより好ましい。透析膜は、タンパク質を透過しないものであればよく、例えばセルロース透析膜等であってよい。水溶性溶媒の置換を繰り返すことにより、ドープ液中に存在していた溶媒の量をゼロに近づけることができる。水溶性溶媒に置換する工程の後半では、透析膜は使用しなくてもよい。タンパク質の水溶液を乾燥する工程は、真空凍結乾燥を用いることが好ましい。真空凍結乾燥時の真空度は、好ましくは２００パスカル（Ｐａ）以下、より好ましくは１５０パスカル以下、更に好ましくは１００パスカル以下である。凍結乾燥後のパーティクルにおける水分率は、好ましくは５．０％以下、より好ましくは３．０％以下である。

【0170】

本実施形態に係る製造方法において、架橋反応を制御することにより、例えば、タンパク質の物性（例えば、タンパク質の耐久性）の程度をコントロールすることができる。

【実施例】

【0171】

以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0172】

〔改変フィブロインの製造〕
（１）発現ベクターの作製
システイン残基を有する改変フィブロインとして、配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（ＰＲＴ１６）、配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（ＰＲＴ２９）、及び配列番号３２で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（ＰＲＴ３２）を設計した。

【0173】

システイン残基を有しない改変フィブロインとして、配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（ＰＲＴ２７）及び配列番号３０で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（ＰＲＴ３０）を設計した。

【0174】

配列番号１６で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１６）は、配列番号２７で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）に対し、ドメイン配列のＲＥＰ中に、システイン残基を１カ所挿入したものである。配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロインのシステイン残基の総数は１である。配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロインの分子量は１００ｋＤａである。

【0175】

配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（ＰＲＴ２９）は、配列番号３０で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ３０）に対し、ドメイン配列の最もＣ末端側に位置するＲＥＰに、システイン残基を１カ所挿入したものである。配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロインのシステイン残基の総数は１である。配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロインの分子量は３００ｋＤａである。

【0176】

配列番号３２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ３２）は、配列番号２７で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）に対し、ドメイン配列のＲＥＰ中に、システイン残基を２カ所挿入したものである。配列番号３２で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロインのシステイン残基の総数は２である。配列番号３２で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロインの分子量は５０ｋＤａである。

【0177】

上述した各アミノ酸配列を有する改変フィブロインをコードする核酸を合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト、終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。この核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ－２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。

【0178】

（２）タンパク質の製造
得られた発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表１）にＯＤ_６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ_６００が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。

【表1】

【0179】

当該シード培養液を５００ｍＬの生産培地（表２）を添加したジャーファーメンターにＯＤ_６００が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにした。

【0180】

【表2】

【0181】

生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、改変フィブロインを発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とする改変フィブロインサイズのバンドの出現により、目的とする改変フィブロインの発現を確認した。

【0182】

（３）タンパク質の精製
ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ社製）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ グアニジン緩衝液（８Ｍ グアニジン塩酸塩、１０ｍＭ リン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収することにより、粉末状の改変フィブロイン（ＰＲＴ１６、ＰＲＴ２９、ＰＲＴ２７、及びＰＲＴ３２）を得た。

【0183】

〔試験例１：改変フィブロイン架橋体の製造１〕
（システイン残基を有する改変フィブロインを用いた反応）
実施例１
システイン残基を有する改変フィブロイン（システイン残基がＲＥＰ中に１つ入ったアミノ酸配列を有する改変フィブロイン）ＰＲＴ１６を２０ｍｇ、ヘキサフルオロイソプロパノール（セントラル硝子株式会社製）を１ｍＬガラス容器内に加え、改変フィブロインＰＲＴ１６を、ヘキサフルオロイソプロパノールに溶解させて、改変フィブロイン溶液を調製した。室温（２５℃）で撹拌しながら、改変フィブロイン溶液に、３６５ｎｍの紫外線を２０時間照射（ＳＰＥＣＴＲＯＬＩＮＥ社製、ＭＯＤＥＬＥＮ－１６０ｌ／Ｊ、１００Ｖ）して反応を行った。溶媒の留去後、減圧乾燥を行うことにより、生成物を得た。これを実施例１の試料として後の分析に使用した。

【0184】

比較例１－１
システイン残基を有する改変フィブロイン（システイン残基がＲＥＰ中に１つ入ったアミノ酸配列を有する改変フィブロイン）ＰＲＴ１６を比較例１－１の試料として後の分析に使用した。

【0185】

（システイン残基を有さない改変フィブロインを用いた反応）
比較例１－２
システイン残基を有さない改変フィブロインＰＲＴ２７を２０ｍｇ用いたこと以外は実施例１と同様にして反応を行った。溶媒の留去後、減圧乾燥を行うことにより、生成物を得た。これを比較例１－２の試料として後の分析に使用した。

【0186】

比較例１－３
システイン残基を有さない改変フィブロインＰＲＴ２７を比較例１－３の試料として後の分析に使用した。

【0187】

（ＧＰＣによる生成物の分子量の確認）
ＧＰＣ（Ｇｅｌ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ）による分子量の測定は、次に示す条件で行った。上記実施例及び比較例で得られた改変フィブロインの乾燥粉末を０．２ｗ／ｖ％となるように溶媒（２ｍＭ トリフルオロ酢酸ナトリウムを含むヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ））に溶解させた。得られた改変フィブロイン溶液を０．４５μｍ孔径のテフロン（登録商標）フィルターで吸引ろ過し、ＧＰＣの試料とした。

【0188】

ＧＰＣによるサイズ排除クロマトグラフィー（Ｆｏｒｔｅ，ワイエムシィ社製）を用いて、試料の分子量分画を行った。条件は以下に示すとおりである。図２に測定結果を示す。
カラム；ＹＭＣ－ＧＰＣ Ｔ１０Ｍ－４０（ポリスチレンゲル，ワイエムシィ社製）
流速：１０ｍＬ／分
キャリア：２ｍＭ トリフルオロ酢酸ナトリウムを含むＨＦＩＰ

【0189】

ＧＰＣ測定により、システイン残基を有する改変フィブロインに光を照射して得たサンプル（実施例１）は、光を照射しなかったサンプル（比較例１－１）と比べて、分子量が増大していることが確認された。一方、システイン残基を有さない改変フィブロインに光を照射して得たサンプル（比較例１－２）では、分子量の増大は確認されず、改変フィブロイン分子の分解が確認された（比較例１－２と、比較例１－３との対比）。

【0190】

（ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる生成物の分子量の確認）
実施例及び比較例のサンプルについて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる生成物の分子量の分析を行った。図３に結果を示す。図３中のレーン１は、標準品（ＳＴＤ）、レーン２は実施例１、レーン３は比較例１－１、レーン４は比較例１－２、レーン５は比較例１－３の結果を示す。

【0191】

システイン残基を有する改変フィブロインＰＲＴ１６に、光を照射して得た生成物（実施例１）については、ＧＰＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析の両方で、システイン残基における硫黄原子同士でのジスルフィド結合形成による分子量増大が確認された。

【0192】

一方、システイン残基を有さない改変フィブロインＰＲＴ２７に、光を照射しても、分子量の増大は起こらなかった（比較例１－２と比較例１－３との比較）。このことから、改変フィブロインの光を用いた分子量増大反応においてはシステイン同士のジスルフィド結合形成が必要であることが明らかとなった。さらに、システインとタグ配列に含まれるヒスチジンが共存する状況でシステインを選択的に反応させられることから、本発明における反応は、産業的に利用可能性のあるタグ配列含有蛋白の架橋に適しているといえる。

【0193】

〔試験例２：光増感剤の存在下における架橋反応〕
配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有する改変フィブロインＰＲＴ１６（システイン残基を有する改変フィブロイン）を２０ｍｇ、２，２－ジメトキシ－２－フェニルアセトフェノンを０．２ｍｇ、ヘキサフルオロイソプロパノール（セントラル硝子株式会社製）を１ｍＬガラス容器内に入れ、改変フィブロイン及び２，２－ジメトキシ－２－フェニルアセトフェノンをヘキサフルオロイソプロパノールに溶解させて、改変フィブロイン溶液を得た。室温（２５℃）で撹拌しながら、改変フィブロイン溶液に３６５ｎｍの紫外線を所定の時間照射（ＳＰＥＣＴＲＯＬＩＮＥ社製、ＭＯＤＥＬ ＥＮ－１６０ｌ／Ｊ、１００Ｖ）して反応を行なった。溶媒の留去後、メタノールによる３回の洗浄（５０ｍＬ×３、富士フィルム和光純薬株式会社製）を行い、２，２－ジメトキシ－２－フェニルアセトフェノンを除去した。更に、減圧乾燥を行う事により、生成物を得た。紫外線を１５分、３０分、４５分、６０分及び９０分照射して得られた試料をそれぞれ実施例２－１、実施例２－２、実施例２－３、実施例２－４及び実施例２－５として、後の分析に用いた。

【0194】

（ＧＰＣによる生成物の分子量の確認）
ＧＰＣによる生成物の分子量の確認は、実施例２－２、実施例２－３、実施例２－４、実施例２－５で得られた生成物を対象として、試験例１と同様の条件で実施した。図４に結果を示す。またＰＲＴ１６を比較例２として用いた。

【0195】

光増感剤の存在下で、光を照射した場合には、光増感剤の存在しない条件と比べて目的の反応が効率よく生成することが確認できた。紫外線照射時間４５分までは照射時間が長くなることで得られる架橋体が増加し、それ以降減少する傾向が見られた。

【0196】

〔ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる生成物の分子量の確認〕
ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分子量の測定を、実施例２－１、実施例２－２、実施例２－３、実施例２－４、実施例２－５で得られた生成物を対象として、試験例１と同様の条件で、実施した。図５に結果を示す。またＰＲＴ１６を比較例２として分析に用いた。図５中のレーン１は標準品（ＳＴＤ）、レーン２は実施例２－１（光照射時間：１５分）、レーン３は実施例２－２（光照射時間：３０分）、レーン４は実施例２－３（光照射時間：４５分）、レーン５は実施例２－４（光照射時間：６０分）、レーン６は実施例２－５（光照射時間：９０分）、レーン７は比較例２（光照射なし）の結果を示す。

【0197】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析でも、分子量の増大が確認された。実施例２－１の結果より、１５分からでも架橋体が得られることがわかる。

【0198】

〔試験例３：改変フィブロイン架橋体の製造２〕
システイン残基を有する改変フィブロインＰＲＴ２９を５００ｍｇ、２，２－ジメトキシ－２－フェニルアセトフェノンを５ｍｇ、ヘキサフルオロイソプロパノール（セントラル硝子株式会社製）を２５ｍＬガラス容器内に加え、改変フィブロイン及び２，２－ジメトキシ－２－フェニルアセトフェノンをヘキサフルオロイソプロパノールに溶解して、改変フィブロイン溶液を得た。室温（２５℃）で撹拌しながら、改変フィブロイン溶液に３６５ｎｍの紫外線を２時間照射（アズワン製、１－５４７９－０３ ハンディー ＵＶランプ 長波長３３６×８２．３×６５ｍｍ ＬＵＶ１６）して反応を行なった。溶媒の留去後、メタノールによる３回の洗浄（５０ｍＬ×３、富士フィルム和光純薬株式会社製）を行い、２，２－ジメトキシ－２－フェニルアセトフェノンを除去した。更に、減圧乾燥を行う事により、生成物を得た。得られた試料を実施例３の試料として後の分析に用いた。また、ＰＲＴ２９を比較例３の試料として後の分析に用いた。

【0199】

上記の結果は光増感剤によって反応性を向上させることで、例えばヒスチジンなど目的とする以外のアミノ酸架橋反応が起こり、選択性低下の可能性が見込まれるところ、逆にシステインの架橋反応の選択性が向上したことを示している。

【0200】

（ＧＰＣによる生成物の分子量の確認）
実施例１で用いた改変フィブロインＰＲＴ１６と配列の異なり、かつ親水性が高い改変フィブロインＰＲＴ２９を用い、また、スケールを大きくした条件においても目的の架橋体が得られた。結果を図６に示す。

【0201】

〔試験例４：改変フィブロイン架橋体の製造３〕
分子内にシステイン残基を２個有する改変フィブロインＰＲＴ３２を２０ｍｇ、２，２－ジメトキシ－２－フェニルアセトフェノンを０．２ｍｇ、ヘキサフルオロイソプロパノール（セントラル硝子株式会社製）を１ｍＬガラス容器内に加え、改変フィブロイン及び２，２－ジメトキシ－２－フェニルアセトフェノンをヘキサフルオロイソプロパノールに溶解させて、改変フィブロイン溶液を得た。室温（２５℃）で撹拌しながら、改変フィブロイン溶液に３６５ｎｍの紫外線を２時間照射（ＳＰＥＣＴＲＯＬＩＮＥ社製、ＭＯＤＥＬ ＥＮ－１６０ｌ／Ｊ、１００Ｖ）して反応を行なった。溶媒の留去後、減圧乾燥を行う事により、生成物を得た。得られた試料を実施例４として後の分析に用いた。
また、反応前のＰＲＴ３２を比較例４の試料として分析に用いた。

【0202】

（ＧＰＣによる生成物の分子量の確認）
ＧＰＣによる生成物の分子量の確認は、試験例１と同様の条件で実施した。図７に結果を示す。

【0203】

１分子内に２つのシステインを有する分子を用いた当該反応においても、タンパク質内のシステインに含まれる硫黄原子同士の反応が進行し、分子量の増大したタンパク質が生成していることが確認できた。

【0204】

同一分子内に２つのシステインを有する分子を用いた当該反応においても、改変フィブロイン内のシステイン残基に含まれる硫黄原子同士の反応が進行し、分子量の増大した改変フィブロイン（改変フィブロイン架橋体）が生成していることが確認できた。

【0205】

〔試験例５：イソシアネートを用いた反応〕
システイン残基を有する改変フィブロイン（システイン残基がＲＥＰ中に１つ入ったアミノ酸配列を有する改変フィブロイン）ＰＲＴ１６と、ヘキサメチレンジイソシアネートとを用い、これらを溶媒（ヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ））存在下で、反応させた。これによりゲル状物質が生成した。

【0206】

（結果）
システイン残基を有する改変フィブロインＰＲＴ１６に、光を照射した条件では、目的とする架橋体が生成し、単離できた。一方、イソシアネートを用いた条件では、ゲル状物質の形成が確認され、収率が大きく低下し、様々な種類の生成物の混合物ができ、単離が困難になることが確認された。また、ＧＰＣでの分析では目的とした架橋体のピークを確認することができなかった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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