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特許7573261抗酸化剤及びその製造方法、医薬組成物及びその製造方法、食品、並びに化粧品
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-17
(45)【発行日】2024-10-25
(54)【発明の名称】抗酸化剤及びその製造方法、医薬組成物及びその製造方法、食品、並びに化粧品
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20241018BHJP
A61P 39/06 20060101ALI20241018BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20241018BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20241018BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20241018BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20241018BHJP
A23L 33/17 20160101ALI20241018BHJP
A61K 8/64 20060101ALI20241018BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20241018BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20241018BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 Y
A61P39/06
A61P1/04
A61P13/12
A61P9/10
A61P31/00
A23L33/17
A61K8/64
A61Q19/00
C07K16/00
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2020127543
(22)【出願日】2020-07-28
(65)【公開番号】P2022024764
(43)【公開日】2022-02-09
【審査請求日】2023-05-25
(73)【特許権者】
【識別番号】304023994
【氏名又は名称】国立大学法人山梨大学
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(74)【代理人】
【識別番号】100107515
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100107733
【弁理士】
【氏名又は名称】流 良広
(74)【代理人】
【識別番号】100115347
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 奈緒子
(72)【発明者】
【氏名】姚 建
【審査官】春田 由香
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５０７２５０（ＪＰ，Ａ）
【文献】Medina-Navarro, R. et al.，Protein antioxidant response to the stress and the relationship between molecular structure and antioxidant function，PloS One，2010年，Vol.5, No.1，e8971，doi:10.1371/journal.pone.0008971
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３９／００－３９／４４
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ０９Ｋ １５／００－１５／３４
Ａ６１Ｋ ８／００－ ８／９９
Ａ６１Ｑ １／００ー９０／００
Ａ２３Ｌ ３３／００－３３／２９
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
重鎖と重鎖との間のジスルフィド結合及び重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合を有さず、重鎖と軽鎖が結合しておらず、チオール基を含有する免疫グロブリンを含むことを特徴とする抗酸化剤。
【請求項2】
前記免疫グロブリンは、前記重鎖内のジスルフィド結合及び前記軽鎖内のジスルフィド結合も有さない請求項１に記載の抗酸化剤。
【請求項3】
重鎖と重鎖との間のジスルフィド結合及び重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合を有さず、重鎖と軽鎖が結合しておらず、チオール基を含有する免疫グロブリンを含み、
大腸炎、虚血性腎障害、及び敗血症からなる群から選択される少なくとも１種の疾患用であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項4】
前記免疫グロブリンは、前記重鎖内のジスルフィド結合及び前記軽鎖内のジスルフィド結合も有さない請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項5】
請求項１から２のいずれかに記載の抗酸化剤を含有することを特徴とする食品。
【請求項6】
請求項１から２のいずれかに記載の抗酸化剤を含有することを特徴とする化粧品。
【請求項7】
免疫グロブリンを還元剤で処理することを含むことを特徴とする抗酸化剤の製造方法。
【請求項8】
免疫グロブリンを還元剤で処理し、重鎖と重鎖との間のジスルフィド結合及び重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合を有さず、重鎖と軽鎖が結合しておらず、チオール基を含有する免疫グロブリンとすることを含む医薬組成物の製造方法であって、
前記医薬組成物が、大腸炎、虚血性腎障害、及び敗血症からなる群から選択される少なくとも１種の疾患用であることを特徴とする医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗酸化作用を有する免疫グロブリンを含む抗酸化剤及びその製造方法、前記免疫グロブリンを含む医薬組成物及びその製造方法、並びに前記抗酸化剤を含む食品及び化粧品に関する。
【背景技術】
【0002】
免疫グロブリンは、すべての哺乳類動物の血清や組織体液中に存在する一群の糖タンパク質であり、免疫反応において重要な役割を果たしている。ヒトの免疫グロブリンには、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥが存在する。すべての免疫グロブリンは基本的には同じ構造を持っており、“Ｙ”字型の４本鎖構造（軽鎖・重鎖の２つのポリペプチド鎖が２本ずつジスルフィド結合を介して単量体を形成、図１Ａ参照）を基本構造としている。前記ＩｇＧはヒト免疫グロブリンの７０～７５％を占め、血漿中における量が最も多い単量体の免疫グロブリンである。
【0003】
免疫グロブリンは、通常は個体の体内で自然に形成される。しかし、何らかの遺伝子疾患や感染症が原因でその作用が働かず、免疫不全状態に陥ることがある。その場合の治療方法の１つとして、免疫グロブリン療法（Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、略称：ＩＶＩＧ；大量免疫グロブリン療法、免疫グロブリン大量点滴静注療法と称することもある）が知られている。前記ＩＶＩＧは、Ｆｃ活性を有するポリクローナルＩｇＧを静脈投与する治療法であり、炎症性疾患や自己免疫疾患など幅広い疾患の治療に使われている（例えば、非特許文献１及び２参照）。免疫グロブリン療法の作用機序は、Ｆｃ受容体を介した機序、補体を介する機序、抗イディオタイプ抗体による自己抗体の制御、炎症性サイトカインの制御などが挙げられている。
近年の研究により、酸化ストレスが炎症反応及び免疫の制御にも深く関与していることが明らかになってきた。また酸化ストレス及び免疫反応は、数多くの病気の発生及び進行に寄与している。そこで前記ＩＶＩＧの治療において、抗酸化作用を加えることで、更なるＩＶＩＧの治療効果を向上させることが考えられる。
近年の研究により、酸化ストレスが炎症反応及び免疫の制御にも深く関与していることが明らかになってきた。また酸化ストレス及び免疫反応は、数多くの病気の発生及び進行に寄与している。そこで前記ＩＶＩＧの治療において、抗酸化作用を加えることで、更なるＩＶＩＧの治療効果を向上させることが考えられる。
【0004】
なお、ＩｇＧに関する技術として、正常人の血清と患者の脳脊髄液から採取したＩｇＧに、還元剤（ジチオトレイトール（ＤＴＴ）等）を使用して、免疫グロブリン軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合を切り離し、質量分析技法を用いて両者のスペクトルを比較し、異常のピークを検出することによって、疾患の有無を判断する技術が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
しかしながら、前記技術は、疾患の有無を判断するものであり、治療に関するものではない。
しかしながら、前記技術は、疾患の有無を判断するものであり、治療に関するものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】国際公開第２０１５／１５４０５２号
【非特許文献】
【0006】
【文献】ＩＶＩＧ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２９， Ｎｏ． １１， ｐｐ． ４９１－４９８， ２０１７
【文献】Ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅ： Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｅｖｉｄｅｎｃｅ． Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｖｏ． １３９， Ｎｏ． ３， ２０１６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、このような要望に応え、現状を打破し、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、従来の免疫グロブリンと比べて優れた治療効果を奏する医薬組成物及びその製造方法、優れた抗酸化作用を有する抗酸化剤及びその製造方法、並びに前記抗酸化剤を含む食品及び化粧品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者は、前記目的を達成するべく鋭意検討を行った結果、還元性化学物質（以下、還元剤と称することがある）で免疫グロブリンを処理し、免疫グロブリン中のジスルフィド結合を、還元活性を有するチオール基に転換し、前記チオール基を有する免疫グロブリン（以下、「還元型免疫グロブリン」と称することがある）が優れた抗酸化活性を有すること、前記還元型免疫グロブリンを個体に投与することで、著しい治療効果が得られることを知見した。
【0009】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 重鎖と重鎖との間のジスルフィド結合及び重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合を有さず、重鎖と軽鎖が結合しておらず、チオール基を含有する免疫グロブリンを含むことを特徴とする抗酸化剤である。
＜２＞ 前記免疫グロブリンは、前記重鎖内のジスルフィド結合及び前記軽鎖内のジスルフィド結合も有さない前記＜１＞に記載の抗酸化剤である。
＜３＞ 重鎖と重鎖との間のジスルフィド結合及び重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合を有さず、重鎖と軽鎖が結合しておらず、チオール基を含有する免疫グロブリンを含むことを特徴とする医薬組成物である。
＜４＞ 前記免疫グロブリンは、前記重鎖内のジスルフィド結合及び前記軽鎖内のジスルフィド結合も有さない前記＜４＞に記載の医薬組成物である。
＜５＞ アルツハイマー型認知症、パーキンソン病、糖尿病合併症、関節リウマチ、免疫不全、自己免疫疾患、急性感染症、虚血性障害、腸炎、及び腎臓疾患からなる群から選択される少なくとも１種の疾患用である前記＜３＞から＜４＞のいずれかに記載の医薬組成物である。
＜６＞ 前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の抗酸化剤を含有することを特徴とする食品である。
＜７＞ 前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の抗酸化剤を含有することを特徴とする化粧品である。
＜８＞ 免疫グロブリンを還元剤で処理することを含むことを特徴とする抗酸化剤の製造方法である。
＜９＞ 免疫グロブリンを還元剤で処理することを含むことを特徴とする医薬組成物の製造方法である。
＜１＞ 重鎖と重鎖との間のジスルフィド結合及び重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合を有さず、重鎖と軽鎖が結合しておらず、チオール基を含有する免疫グロブリンを含むことを特徴とする抗酸化剤である。
＜２＞ 前記免疫グロブリンは、前記重鎖内のジスルフィド結合及び前記軽鎖内のジスルフィド結合も有さない前記＜１＞に記載の抗酸化剤である。
＜３＞ 重鎖と重鎖との間のジスルフィド結合及び重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合を有さず、重鎖と軽鎖が結合しておらず、チオール基を含有する免疫グロブリンを含むことを特徴とする医薬組成物である。
＜４＞ 前記免疫グロブリンは、前記重鎖内のジスルフィド結合及び前記軽鎖内のジスルフィド結合も有さない前記＜４＞に記載の医薬組成物である。
＜５＞ アルツハイマー型認知症、パーキンソン病、糖尿病合併症、関節リウマチ、免疫不全、自己免疫疾患、急性感染症、虚血性障害、腸炎、及び腎臓疾患からなる群から選択される少なくとも１種の疾患用である前記＜３＞から＜４＞のいずれかに記載の医薬組成物である。
＜６＞ 前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の抗酸化剤を含有することを特徴とする食品である。
＜７＞ 前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の抗酸化剤を含有することを特徴とする化粧品である。
＜８＞ 免疫グロブリンを還元剤で処理することを含むことを特徴とする抗酸化剤の製造方法である。
＜９＞ 免疫グロブリンを還元剤で処理することを含むことを特徴とする医薬組成物の製造方法である。
【発明の効果】
【0010】
本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、従来の免疫グロブリンと比べて優れた治療効果を奏する医薬組成物及びその製造方法、優れた抗酸化作用を有する抗酸化剤及びその製造方法、並びに前記抗酸化剤を含む食品及び化粧品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【発明を実施するための形態】
【0012】
（抗酸化剤及びその製造方法）
＜抗酸化剤＞
本発明の抗酸化剤は、重鎖と重鎖との間のジスルフィド結合及び重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合を有さず、重鎖と軽鎖が結合しておらず、チオール基を含有する免疫グロブリンを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
＜抗酸化剤＞
本発明の抗酸化剤は、重鎖と重鎖との間のジスルフィド結合及び重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合を有さず、重鎖と軽鎖が結合しておらず、チオール基を含有する免疫グロブリンを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【0013】
＜＜還元型免疫グロブリン＞＞
前記免疫グロブリンは、重鎖と重鎖との間のジスルフィド結合及び重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合を有さず、重鎖と軽鎖が結合しておらず、チオール基を含有する（以下、「還元型免疫グロブリン」と称することがある。）。
前記免疫グロブリンは、重鎖と重鎖との間のジスルフィド結合及び重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合を有さず、重鎖と軽鎖が結合しておらず、チオール基を含有する（以下、「還元型免疫グロブリン」と称することがある。）。
【0014】
前記還元型免疫グロブリンは、通常の免疫グロブリンが有する重鎖間のジスルフィド結合及び重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合（図１Ａ参照）を有していないため、各重鎖及び各短鎖はそれぞれ単独で存在している。また、ジスルフィド結合を形成していた部分は、フリーのチオール基（スルファニル基、水硫基、スルフヒドリル基と称することもある。）に置き換わっている。
前記還元型免疫グロブリンは、前記重鎖内のジスルフィド結合及び前記軽鎖内のジスルフィド結合も有さないことが好ましい（図１Ｂ参照）。
前記還元型免疫グロブリンは、チオール基の一部がＳＯＨ基となっていてもよい（図１Ｃ参照）が、ＳＯＨ基を有さないことが好ましい。
前記還元型免疫グロブリンは、前記重鎖内のジスルフィド結合及び前記軽鎖内のジスルフィド結合も有さないことが好ましい（図１Ｂ参照）。
前記還元型免疫グロブリンは、チオール基の一部がＳＯＨ基となっていてもよい（図１Ｃ参照）が、ＳＯＨ基を有さないことが好ましい。
【0015】
前記免疫グロブリンの種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、ＩｇＧが好ましい。
【0016】
前記還元型免疫グロブリンの抗酸化剤における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記抗酸化剤は、前記還元型免疫グロブリンのみからなるものであってもよい。
【0017】
＜＜その他の成分＞＞
前記抗酸化剤におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、公知の免疫グロブリン製剤等の医薬品、食品、化粧品などに用いられる成分を剤型などに応じて適宜選択することができ、例えば、非イオン性界面活性剤、糖類、糖アルコール類、多糖類、ポリアクリル酸、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプンなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記その他の成分の抗酸化剤における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記抗酸化剤におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、公知の免疫グロブリン製剤等の医薬品、食品、化粧品などに用いられる成分を剤型などに応じて適宜選択することができ、例えば、非イオン性界面活性剤、糖類、糖アルコール類、多糖類、ポリアクリル酸、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプンなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記その他の成分の抗酸化剤における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0018】
前記抗酸化剤は、単独で使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用してもよい。また、前記抗酸化剤は、他の成分を有効成分とする医薬等に配合された状態で使用してもよい。
【0019】
前記抗酸化剤の使用態様としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口、経皮、経腸、経粘膜、経静脈、経動脈、皮下、筋肉内などが挙げられる。これらは、１種単独で用いてもよいし、２種以上を組み合せて用いてもよい。
【0020】
前記抗酸化剤の剤型としては、特に制限はなく、使用態様などに応じて公知の剤型を適宜選択することができる。前記剤型は、固形状であってもよいし、半固形状であってもよいし、液状であってもよく、例えば、錠剤、顆粒剤、粉剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤、シロップ剤等の経口投与製剤；液剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、噴霧剤、貼付剤、吸入剤、坐剤等の経皮又は経粘膜投与製剤；注射剤等が挙げられる。
前記剤型の抗酸化剤は、公知の方法により製造することができる。
前記剤型の抗酸化剤は、公知の方法により製造することができる。
【0021】
前記抗酸化剤の個体への投与量としては、特に制限はなく、対象とする個体の年齢、体重、疾患の有無などを考慮して適宜選択することができ、例えば、１回の投与量として、０．０５～２０ｇ／ｋｇとするなどが挙げられる。
【0022】
前記抗酸化剤の投与間隔としては、特に制限はなく、対象とする個体の年齢、体重、疾患の有無などを考慮して適宜選択することができる。
【0023】
前記抗酸化剤の対象とする個体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられる。
【0024】
＜抗酸化剤の製造方法＞
本発明の抗酸化剤の製造方法は、免疫グロブリンを還元剤で処理する還元工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
本発明の抗酸化剤の製造方法は、免疫グロブリンを還元剤で処理する還元工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【0025】
＜＜還元工程＞＞
前記抗酸化剤の製造方法における還元工程は、免疫グロブリン（以下、「通常型免疫グロブリン」と称することがある。）を還元剤で処理し、還元型免疫グロブリンを得る工程である。
前記抗酸化剤の製造方法における還元工程は、免疫グロブリン（以下、「通常型免疫グロブリン」と称することがある。）を還元剤で処理し、還元型免疫グロブリンを得る工程である。
【0026】
前記通常型免疫グロブリンは、重鎖間のジスルフィド結合、重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合、重鎖内のジスルフィド結合、及び軽鎖内のジスルフィド結合を有する（図１Ａ参照）。
前記通常型免疫グロブリンは、市販の免疫グロブリン製剤を用いてもよいし、適宜調製したものを用いてもよい。
前記通常型免疫グロブリンは、市販の免疫グロブリン製剤を用いてもよいし、適宜調製したものを用いてもよい。
【0027】
前記還元剤としては、前記通常型免疫グロブリンにおけるジスルフィド結合を切断し、免疫グロブリン中にチオール基を形成させることができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、硫化水素（Ｈ２Ｓ）などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記還元剤は、市販の還元剤を用いてもよいし、適宜調製したものを用いてもよい。
前記還元剤は、市販の還元剤を用いてもよいし、適宜調製したものを用いてもよい。
【0028】
前記還元処理の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記通常型免疫グロブリンを含む溶液に、前記還元剤を添加して反応させる方法などが挙げられる。
前記反応における各成分の量や温度、時間などの条件としては、特に制限はなく、還元の程度などを考慮して、適宜選択することができる。
前記還元処理後の溶液は、必要に応じて、濾過や透析などの精製処理を行ってもよい。
前記反応における各成分の量や温度、時間などの条件としては、特に制限はなく、還元の程度などを考慮して、適宜選択することができる。
前記還元処理後の溶液は、必要に応じて、濾過や透析などの精製処理を行ってもよい。
【0029】
＜＜その他の工程＞＞
前記抗酸化剤の製造方法におけるその他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記還元型免疫グロブリンと、上記したその他の成分とを混合する工程などが挙げられる。
前記抗酸化剤の製造方法におけるその他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記還元型免疫グロブリンと、上記したその他の成分とを混合する工程などが挙げられる。
【0030】
本発明の還元型免疫グロブリンは、優れた抗酸化作用を有する。
【0031】
後述する実施例で示すように、還元型免疫グロブリンは体内で酸化還元反応に寄与する。また、ヒトの血清中には、通常型免疫グロブリンだけではなく、ジスルフィド結合が切断された抗体の単独の鎖が存在することも知られている。
そのため、体内における還元型免疫グロブリンの存在は、体内における酸化還元状況のマーカーとなる。したがって、本発明は、試料中における還元型免疫グロブリンの存在の有無若しくはその量を指標とする、体内における酸化還元状況の評価方法にも関する。
前記評価方法では、試料中における還元型免疫グロブリンが存在しない若しくはその量が少ない場合には、体内が酸化状況にある、即ち、酸化ストレスに曝されている状況であると評価することができる。
前記試料としては、還元型免疫グロブリンの有無若しくはその量を測定することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、体液、血清、粘液、唾液、尿、便などが挙げられる。前記試料の採取方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
前記試料中の還元型免疫グロブリンの測定方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、後述する実施例と同様の方法などが挙げられる。
そのため、体内における還元型免疫グロブリンの存在は、体内における酸化還元状況のマーカーとなる。したがって、本発明は、試料中における還元型免疫グロブリンの存在の有無若しくはその量を指標とする、体内における酸化還元状況の評価方法にも関する。
前記評価方法では、試料中における還元型免疫グロブリンが存在しない若しくはその量が少ない場合には、体内が酸化状況にある、即ち、酸化ストレスに曝されている状況であると評価することができる。
前記試料としては、還元型免疫グロブリンの有無若しくはその量を測定することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、体液、血清、粘液、唾液、尿、便などが挙げられる。前記試料の採取方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
前記試料中の還元型免疫グロブリンの測定方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、後述する実施例と同様の方法などが挙げられる。
【0032】
（医薬組成物及びその製造方法）
＜医薬組成物＞
本発明の医薬組成物は、重鎖と重鎖との間のジスルフィド結合及び重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合を有さず、重鎖と軽鎖が結合しておらず、チオール基を含有する免疫グロブリンを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
＜医薬組成物＞
本発明の医薬組成物は、重鎖と重鎖との間のジスルフィド結合及び重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合を有さず、重鎖と軽鎖が結合しておらず、チオール基を含有する免疫グロブリンを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【0033】
＜＜還元型免疫グロブリン＞＞
前記医薬組成物における免疫グロブリンは、上記した抗酸化剤における還元型免疫グロブリンと同様であり、好ましい態様も同様である。
前記医薬組成物における免疫グロブリンは、上記した抗酸化剤における還元型免疫グロブリンと同様であり、好ましい態様も同様である。
【0034】
＜＜その他の成分＞＞
前記医薬組成物におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した抗酸化剤におけるその他の成分と同様のものなどが挙げられる。
前記医薬組成物におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した抗酸化剤におけるその他の成分と同様のものなどが挙げられる。
【0035】
前記医薬組成物は、単独で使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用してもよい。また、前記医薬組成物は、他の成分を有効成分とする医薬等に配合された状態で使用してもよい。
【0036】
前記医薬組成物の使用態様、剤型、個体への投与量、投与間隔、対象とする個体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した抗酸化剤の使用態様、剤型、個体への投与量、投与間隔、対象とする個体と同様とすることができる。
【0037】
＜医薬組成物の製造方法＞
本発明の医薬組成物の製造方法は、免疫グロブリンを還元剤で処理する還元工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
本発明の医薬組成物の製造方法は、免疫グロブリンを還元剤で処理する還元工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【0038】
＜＜還元工程＞＞
前記医薬組成物の製造方法における還元工程は、通常型免疫グロブリンを還元剤で処理し、還元型免疫グロブリンを得る工程であり、上記した抗酸化剤の製造方法における還元工程と同様であり、好ましい態様も同様である。
前記医薬組成物の製造方法における還元工程は、通常型免疫グロブリンを還元剤で処理し、還元型免疫グロブリンを得る工程であり、上記した抗酸化剤の製造方法における還元工程と同様であり、好ましい態様も同様である。
【0039】
＜＜その他の工程＞＞
前記医薬組成物の製造方法におけるその他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した抗酸化剤の製造方法におけるその他の工程と同様の工程などが挙げられる。
前記医薬組成物の製造方法におけるその他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した抗酸化剤の製造方法におけるその他の工程と同様の工程などが挙げられる。
【0040】
本発明の還元型免疫グロブリンは、投与されると体内の酸化環境下において酸化され、中間体（図１Ｃ参照）を経て、通常型免疫グロブリンと同じ構造を形成する。そのため、本発明の医薬組成物によれば、還元型免疫グロブリンによる抗酸化作用に加えて、通常型免疫グロブリンの機能、例えば、ＩｇＧでは抗原抗体結合、補体活性化、抗体依存性細胞傷害作用、Ｆｃ－受容体を介した免疫調節機構、をも発揮することが可能となり、幅広い疾患に利用可能となる。
【0041】
＜疾患＞
前記医薬組成物が対象とする疾患としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化ストレスに起因する疾患、通常型免疫グロブリンが対象とする疾患、腎臓疾患などが挙げられる。
前記酸化ストレスに起因する疾患としては、例えば、アルツハイマー型認知症、パーキンソン病、糖尿病合併症、関節リウマチなどが挙げられる。
前記通常型免疫グロブリンが対象とする疾患としては、例えば、免疫不全、自己免疫疾患、急性感染症、虚血性障害、腸炎などが挙げられる。
これらの中でも、アルツハイマー型認知症、パーキンソン病、糖尿病合併症、関節リウマチ、免疫不全、自己免疫疾患、急性感染症、虚血性障害、腸炎、腎臓疾患が好適に挙げられる。
前記医薬組成物が対象とする疾患としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化ストレスに起因する疾患、通常型免疫グロブリンが対象とする疾患、腎臓疾患などが挙げられる。
前記酸化ストレスに起因する疾患としては、例えば、アルツハイマー型認知症、パーキンソン病、糖尿病合併症、関節リウマチなどが挙げられる。
前記通常型免疫グロブリンが対象とする疾患としては、例えば、免疫不全、自己免疫疾患、急性感染症、虚血性障害、腸炎などが挙げられる。
これらの中でも、アルツハイマー型認知症、パーキンソン病、糖尿病合併症、関節リウマチ、免疫不全、自己免疫疾患、急性感染症、虚血性障害、腸炎、腎臓疾患が好適に挙げられる。
【0042】
（食品）
本発明の食品は、本発明の抗酸化剤を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
本発明の食品は、本発明の抗酸化剤を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【0043】
＜抗酸化剤＞
前記抗酸化剤は、上記した本発明の抗酸化剤である。
前記抗酸化剤の食品における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記食品は、前記抗酸化剤のみからなるものであってもよい。
前記抗酸化剤は、上記した本発明の抗酸化剤である。
前記抗酸化剤の食品における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記食品は、前記抗酸化剤のみからなるものであってもよい。
【0044】
＜その他の成分＞
前記食品におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した抗酸化剤におけるその他の成分と同様のものなどが挙げられる。
前記その他の成分の食品における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記食品におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した抗酸化剤におけるその他の成分と同様のものなどが挙げられる。
前記その他の成分の食品における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0045】
前記食品の種類としては、特に制限はなく、公知の食品を適宜選択することができる。本発明において、食品は、経口的に摂取できるものであればよく、例えば、一般の飲食品の他、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品、病者用食品などが含まれる。また、飲料も含まれる。上記したように、本発明の食品は、優れた抗酸化作用を有する還元型免疫グロブリンを含むので、抗老化用食品として好適に用いることができる。
【0046】
前記食品の製造方法としては、前記抗酸化剤を含有させることができる限り、特に制限はなく、食品の種類に応じて公知の方法を適宜選択することができる。
【0047】
（化粧品）
本発明の化粧品は、本発明の抗酸化剤を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
本発明の化粧品は、本発明の抗酸化剤を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【0048】
＜抗酸化剤＞
前記抗酸化剤は、上記した本発明の抗酸化剤である。
前記抗酸化剤の化粧品における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記化粧品は、前記抗酸化剤のみからなるものであってもよい。
前記抗酸化剤は、上記した本発明の抗酸化剤である。
前記抗酸化剤の化粧品における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記化粧品は、前記抗酸化剤のみからなるものであってもよい。
【0049】
＜その他の成分＞
前記化粧品におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した抗酸化剤におけるその他の成分と同様のものなどが挙げられる。
前記その他の成分の化粧品における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記化粧品におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した抗酸化剤におけるその他の成分と同様のものなどが挙げられる。
前記その他の成分の化粧品における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0050】
前記化粧品の種類としては、特に制限はなく、公知の化粧品を適宜選択することができ、例えば、乳液、クリーム、化粧水（ローション）、パック、美容液、洗浄剤、メーキャップ化粧品などが挙げられる。上記したように、本発明の化粧品は、優れた抗酸化作用を有する還元型免疫グロブリンを含むので、抗老化用化粧品として好適に用いることができる。
【0051】
前記化粧品の製造方法としては、前記抗酸化剤を含有させることができる限り、特に制限はなく、化粧品の種類に応じて公知の方法を適宜選択することができる。
【実施例】
【0052】
以下、本発明の実施例について詳細に説明するが、本発明は、下記の実施例により限定されるものではない。
【0053】
（実験材料及び方法）
＜免疫グロブリンの調製＞
以下の実験では、３つの免疫グロブリン（ＩｇＧ）のいずれかを使用した。具体的には、動物実験では、静注用免疫グロブリン製剤（ガンマガード静注用２．５ｇ， ｂａｘｔｅｒ， 販売：シャイアー・ジャパン株式会社、１５０５５３６）を用いた。培養細胞実験では、静注用免疫グロブリン製剤とウサギ免疫グロブリン（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＩＲ－ＲＢ－ＧＦ－７１７）を用いた。抗体・補体による細胞死実験では、抗Ｔｈｙ－１モノクローナル抗体（マウスＩｇＧ、新潟大学 河内 裕教授より提供していただいた）を用いた。
＜免疫グロブリンの調製＞
以下の実験では、３つの免疫グロブリン（ＩｇＧ）のいずれかを使用した。具体的には、動物実験では、静注用免疫グロブリン製剤（ガンマガード静注用２．５ｇ， ｂａｘｔｅｒ， 販売：シャイアー・ジャパン株式会社、１５０５５３６）を用いた。培養細胞実験では、静注用免疫グロブリン製剤とウサギ免疫グロブリン（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＩＲ－ＲＢ－ＧＦ－７１７）を用いた。抗体・補体による細胞死実験では、抗Ｔｈｙ－１モノクローナル抗体（マウスＩｇＧ、新潟大学 河内 裕教授より提供していただいた）を用いた。
【0054】
－細胞実験用ＩｇＧの処理－
［材料等］
・ ＩｇＧ ： ウサギ免疫グロブリン、抗Ｔｈｙ－１モノクローナル抗体
・ 濾過装置 ： Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｒｅａ－０．５ｍＬ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ （１０Ｋ）
・ 溶液 ： 減菌ＰＢＳ、Ｄ／Ｆ－１２培養液
［材料等］
・ ＩｇＧ ： ウサギ免疫グロブリン、抗Ｔｈｙ－１モノクローナル抗体
・ 濾過装置 ： Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｒｅａ－０．５ｍＬ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ （１０Ｋ）
・ 溶液 ： 減菌ＰＢＳ、Ｄ／Ｆ－１２培養液
【0055】
［処理］
ＩｇＧをＰＢＳで濃度２ｍｇ／ｍＬに希釈し、以下の（ａ）～（ｅ）のいずれかの処理を行った。
（ａ） コントロールＩｇＧ（通常型ＩｇＧ）
４℃で一晩放置した。
（ｂ） ＤＴＴ－ＩｇＧ（還元型ＩｇＧ）
前記２ｍｇ／ｍＬとしたＩｇＧ溶液に、最終濃度１０ｍＭとなるようにジチオトレイトール（ＤＴＴ）（（＋／－）－Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、富士フイルム和光純薬株式会社、０４５－０８９７４）を加えて反応させ、４℃で一晩放置した。前記ＤＴＴでの処理により、前記抗体中のジスルフィド結合が切断され、フリーのチオール基が形成される。
（ｃ） ＤＴＴ－Ｍａｌ ＩｇＧ
前記（ｂ）と同様にしてＤＴＴ処理したＩｇＧ溶液に、１ｍＭのマレイミド（ＡＬＤＲＩＣＨ、ＳＴＢＧ３１７９Ｖ）を加えて反応させ、４℃で一晩放置した。前記マレイミドでの処理により、還元型ＩｇＧにおけるフリーのチオオール基がブロックされる。
（ｄ） ＤＴＴ＋Ｈ２Ｏ２ ＩｇＧ
前記（ｂ）と同様にしてＤＴＴ処理したＩｇＧ溶液に、１ｍＭのＨ２Ｏ２（富士フイルム和光純薬株式会社、０８４－０７４４１）を加え、４℃で一晩放置した。前記Ｈ２Ｏ２での処理により、還元型ＩｇＧが酸化される。
（ｅ） ＤＴＴ＋Ｄｉａ ＩｇＧ
前記（ｂ）と同様にしてＤＴＴ処理したＩｇＧ溶液に、１ｍＭのジアミド（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｓｃ－２１１２８９）を加え、４℃で一晩放置した。前記ジアミドでの処理により、還元型ＩｇＧが酸化される。
ＩｇＧをＰＢＳで濃度２ｍｇ／ｍＬに希釈し、以下の（ａ）～（ｅ）のいずれかの処理を行った。
（ａ） コントロールＩｇＧ（通常型ＩｇＧ）
４℃で一晩放置した。
（ｂ） ＤＴＴ－ＩｇＧ（還元型ＩｇＧ）
前記２ｍｇ／ｍＬとしたＩｇＧ溶液に、最終濃度１０ｍＭとなるようにジチオトレイトール（ＤＴＴ）（（＋／－）－Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、富士フイルム和光純薬株式会社、０４５－０８９７４）を加えて反応させ、４℃で一晩放置した。前記ＤＴＴでの処理により、前記抗体中のジスルフィド結合が切断され、フリーのチオール基が形成される。
（ｃ） ＤＴＴ－Ｍａｌ ＩｇＧ
前記（ｂ）と同様にしてＤＴＴ処理したＩｇＧ溶液に、１ｍＭのマレイミド（ＡＬＤＲＩＣＨ、ＳＴＢＧ３１７９Ｖ）を加えて反応させ、４℃で一晩放置した。前記マレイミドでの処理により、還元型ＩｇＧにおけるフリーのチオオール基がブロックされる。
（ｄ） ＤＴＴ＋Ｈ２Ｏ２ ＩｇＧ
前記（ｂ）と同様にしてＤＴＴ処理したＩｇＧ溶液に、１ｍＭのＨ２Ｏ２（富士フイルム和光純薬株式会社、０８４－０７４４１）を加え、４℃で一晩放置した。前記Ｈ２Ｏ２での処理により、還元型ＩｇＧが酸化される。
（ｅ） ＤＴＴ＋Ｄｉａ ＩｇＧ
前記（ｂ）と同様にしてＤＴＴ処理したＩｇＧ溶液に、１ｍＭのジアミド（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｓｃ－２１１２８９）を加え、４℃で一晩放置した。前記ジアミドでの処理により、還元型ＩｇＧが酸化される。
【0056】
前記（ａ）～（ｅ）のいずれかの処理を行ったサンプル中の免疫グロブリン以外の化学物質を除くために、濾過処理を行った。サンプル溶液５００μＬを濾過装置に移し、遠心濾過（１４，０００ｇ×３０分間）を６回行った。なお、最後の遠心濾過では、透析液にＤ／Ｆ－１２培養液を用いた。濾過した後、フィルタ上の液体を回収し、タンパク質の濃度を定量したうえで、最終濃度を２ｍｇ／ｍＬに調整し、分注して、－８０℃で保存した。
【0057】
－動物実験用ＩｇＧの処理－
［材料等］
・ ＩｇＧ ： 静注用免疫グロブリン製剤
・ 透析装置 ： Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（７０００ＭＷＣＯ， ３－１２ｍＬ Ｃａｐａｃｉｔｙ； 製品番号 ６６７０７）
・ 溶液 ： 減菌水、生理塩水（０．９％ ＮａＣｌ）
［材料等］
・ ＩｇＧ ： 静注用免疫グロブリン製剤
・ 透析装置 ： Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（７０００ＭＷＣＯ， ３－１２ｍＬ Ｃａｐａｃｉｔｙ； 製品番号 ６６７０７）
・ 溶液 ： 減菌水、生理塩水（０．９％ ＮａＣｌ）
【0058】
［処理］
５００ｍｇのＩｇＧを１０ｍＬの滅菌水で溶解し、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかの処理を行った。
（ａ） コントロールＩｇＧ（通常型ＩｇＧ）
４℃で一晩放置した。
（ｂ） ＤＴＴ－ＩｇＧ（還元型ＩｇＧ）
前記５００ｍｇのＩｇＧを溶解したＩｇＧ溶液に、最終濃度０．１ＭとなるようにＤＴＴを加えて反応させ、４℃で一晩放置した。
（ｃ） ＤＴＴ－Ｍａｌ ＩｇＧ
前記（ｂ）と同様にしてＤＴＴ処理したＩｇＧ溶液に、０．１Ｍのマレイミドを加えて反応させ、４℃で一晩放置した。前記マレイミドでの処理により、還元型ＩｇＧにおけるフリーのチオオール基がブロックされる。
５００ｍｇのＩｇＧを１０ｍＬの滅菌水で溶解し、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかの処理を行った。
（ａ） コントロールＩｇＧ（通常型ＩｇＧ）
４℃で一晩放置した。
（ｂ） ＤＴＴ－ＩｇＧ（還元型ＩｇＧ）
前記５００ｍｇのＩｇＧを溶解したＩｇＧ溶液に、最終濃度０．１ＭとなるようにＤＴＴを加えて反応させ、４℃で一晩放置した。
（ｃ） ＤＴＴ－Ｍａｌ ＩｇＧ
前記（ｂ）と同様にしてＤＴＴ処理したＩｇＧ溶液に、０．１Ｍのマレイミドを加えて反応させ、４℃で一晩放置した。前記マレイミドでの処理により、還元型ＩｇＧにおけるフリーのチオオール基がブロックされる。
【0059】
前記（ａ）～（ｃ）のいずれかの処理を行ったサンプル中の免疫グロブリン以外の化学物質を除くために、透析処理を行った。サンプル溶液を透析カセットに入れ、滅菌水を使って６回透析した（３時間毎に透析液を交換）。なお、最後の透析では、透析液に１Ｌ滅菌生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）を用い、一晩透析した。透析は４℃で行い、完了後にＩｇＧ溶液を回収し、タンパク質の濃度を定量したうえで、５０ｍｇ／ｍＬに調整し、分注して、－８０℃で保存した。
【0060】
（試験の方法）
＜デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発大腸炎モデル＞
雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（１２週齢、平均体重２８ｇ）に、３％ＤＳＳ（富士フイルム和光純薬株式会社、ＭＷ ５，０００）を７日間（ｄａｙ０－７）自由飲水させて大腸炎を誘発させ、炎症経過を観察した。
治療群へは、毎日免疫グロブリン５００ｍｇ／ｋｇ量を強制経口投与した。コントロール群へは、同じ量の生理食塩水を投与した。
＜デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発大腸炎モデル＞
雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（１２週齢、平均体重２８ｇ）に、３％ＤＳＳ（富士フイルム和光純薬株式会社、ＭＷ ５，０００）を７日間（ｄａｙ０－７）自由飲水させて大腸炎を誘発させ、炎症経過を観察した。
治療群へは、毎日免疫グロブリン５００ｍｇ／ｋｇ量を強制経口投与した。コントロール群へは、同じ量の生理食塩水を投与した。
【0061】
－マウスの処理（治療）について－
（ａ）正常コントロール群（正常マウス）
処理なし。
（ｂ）実験コントロール群
ＤＳＳを７日間投与した。また、生理食塩水を毎日強制経口投与した。
（ｃ）免疫グロブリン群
ＤＳＳを７日間投与した。また、毎日免疫グロブリン５００ｍｇ／ｋｇ量を強制経口投与した。
（ａ）正常コントロール群（正常マウス）
処理なし。
（ｂ）実験コントロール群
ＤＳＳを７日間投与した。また、生理食塩水を毎日強制経口投与した。
（ｃ）免疫グロブリン群
ＤＳＳを７日間投与した。また、毎日免疫グロブリン５００ｍｇ／ｋｇ量を強制経口投与した。
【0062】
マウスの体重を測り、便を収集した。
一週間後にマウスを屠殺し、血液、大腸組織を採取し、腸の長さ、酸化及び炎症指標の変化、組織診を行い、腸管の傷害度を評価した。なお、腸組織の酸化ストレス及び細胞傷害の程度の解析は、ウエスタンブロット法により行った。すべてのデータは平均値±標準偏差で示し、比較検定を行った。
一週間後にマウスを屠殺し、血液、大腸組織を採取し、腸の長さ、酸化及び炎症指標の変化、組織診を行い、腸管の傷害度を評価した。なお、腸組織の酸化ストレス及び細胞傷害の程度の解析は、ウエスタンブロット法により行った。すべてのデータは平均値±標準偏差で示し、比較検定を行った。
【0063】
＜腎虚血性再灌流＞
雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（８～１２週齢、平均体重２５～２８ｇ）を用いた。マウスに麻酔をした後、腹部正中切開し、血管クランプを用いて両側の腎動脈を３０分間完全閉塞させた後開放し，腎臓を再潅流した。腎血流再開通を確認し筋肉及び皮膚を絹糸にて縫合し、手術を完了した。
対照は、皮膚切開をした後腹膜にアプローチするシャム（ｓｈａｍ）手術とした（コントロール群）。治療群は、手術１５時間前及び３時間前と、手術８時間後に免疫グロブリン５００ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した。
再灌流２４時間後に各群のマウスについて、麻酔下で採血を行い血清炎症因子（ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、及びＴＮＦ－α）、血清尿素窒素（ＢＵＮ）、及びタンパク質のＳＯＨ基形成を測定した。同時に腎臓を取り出し、ＨＥ染色、腎組織のＳＯＨ基形成、細胞傷害（Ｃｌｅａｖｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ ３）などの指標を検討した。
雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（８～１２週齢、平均体重２５～２８ｇ）を用いた。マウスに麻酔をした後、腹部正中切開し、血管クランプを用いて両側の腎動脈を３０分間完全閉塞させた後開放し，腎臓を再潅流した。腎血流再開通を確認し筋肉及び皮膚を絹糸にて縫合し、手術を完了した。
対照は、皮膚切開をした後腹膜にアプローチするシャム（ｓｈａｍ）手術とした（コントロール群）。治療群は、手術１５時間前及び３時間前と、手術８時間後に免疫グロブリン５００ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した。
再灌流２４時間後に各群のマウスについて、麻酔下で採血を行い血清炎症因子（ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、及びＴＮＦ－α）、血清尿素窒素（ＢＵＮ）、及びタンパク質のＳＯＨ基形成を測定した。同時に腎臓を取り出し、ＨＥ染色、腎組織のＳＯＨ基形成、細胞傷害（Ｃｌｅａｖｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ ３）などの指標を検討した。
【0064】
＜盲腸結紮穿刺誘発性敗血症マウスモデル＞
雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（８～１２週齢、平均体重２５～２８ｇ）を用いた。マウスを麻酔下で腹部正中切開し、上行結腸内容物を、手を用いて盲腸へ移動させ、盲腸を遠位４分の３の位置で結紮した。結紮遠位部に１９Ｇ注射針を用いて２カ所に穿孔させ、腸内容物を少量出させた後に腹腔に還納、閉腹した。Ｓｈａｍコントロールは、結紮及び穿孔をしなかった以外、同じ手順で手術した。
その後も自由摂食とし、治療群は、手術１３時間前及び１時間前と、手術８時間後に免疫グロブリン５００ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した。
手術２４時間後に採血を行い、血清炎症因子（ＩＬ－１β）の測定、及び注射した免疫グロブリンの構造変化を確認した。また、実験の期間におけるマウスの死亡状況を記録した。
雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（８～１２週齢、平均体重２５～２８ｇ）を用いた。マウスを麻酔下で腹部正中切開し、上行結腸内容物を、手を用いて盲腸へ移動させ、盲腸を遠位４分の３の位置で結紮した。結紮遠位部に１９Ｇ注射針を用いて２カ所に穿孔させ、腸内容物を少量出させた後に腹腔に還納、閉腹した。Ｓｈａｍコントロールは、結紮及び穿孔をしなかった以外、同じ手順で手術した。
その後も自由摂食とし、治療群は、手術１３時間前及び１時間前と、手術８時間後に免疫グロブリン５００ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した。
手術２４時間後に採血を行い、血清炎症因子（ＩＬ－１β）の測定、及び注射した免疫グロブリンの構造変化を確認した。また、実験の期間におけるマウスの死亡状況を記録した。
【0065】
＜細胞死に対する免疫グロブリンの作用＞
培養したＨＵＶＥＣ（Ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｖｅｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ： ヒト臍帯静脈内皮細胞）において免疫グロブリンの抗酸化作用を観察した。具体的には、酸化剤である過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）による細胞死に対して、抗酸化物質（ＧＳＨ，ＮＡＣ）及び免疫グロブリンの影響を観察した。
細胞の生存率は、細胞形態、Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ－８を用いたアッセイ、ＬＤＨ放出、及び細胞染色（ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ／Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ染色）により測定した。ＭＡＰキナーゼＰ３８の活性化は、抗Ｐ３８リン酸化抗体（シグマ、Ｎ－８１７７）を用いたウェスタンブロッティングにより検討した。
培養したＨＵＶＥＣ（Ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｖｅｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ： ヒト臍帯静脈内皮細胞）において免疫グロブリンの抗酸化作用を観察した。具体的には、酸化剤である過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）による細胞死に対して、抗酸化物質（ＧＳＨ，ＮＡＣ）及び免疫グロブリンの影響を観察した。
細胞の生存率は、細胞形態、Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ－８を用いたアッセイ、ＬＤＨ放出、及び細胞染色（ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ／Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ染色）により測定した。ＭＡＰキナーゼＰ３８の活性化は、抗Ｐ３８リン酸化抗体（シグマ、Ｎ－８１７７）を用いたウェスタンブロッティングにより検討した。
【0066】
＜抗体活性に対するチオール反応性（Ｔｈｉｏｌ－ｒｅａｃｔｉｖｅ）化学物質の影響＞
培養したマウス腎糸球体メサンギウム細胞を抗Ｔｈｙ－１モノクローナル抗体及びウサギ血清（補体のソース）に暴露させ、抗Ｔｈｙ－１モノクローナル抗体及び補体による細胞死モデルを確立した。
ＧＳＨ、ＤＴＴ、及びＨ２Ｏ２などのチオール反応性物質を用いて、抗Ｔｈｙ－１モノクローナル抗体のジスルフィド結合に影響を与えることにより、抗体活性の変化を観察した。細胞形態の変化、ＬＤＨ放出、及び細胞染色（ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ／Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ染色）により細胞生存状況を観察した。
培養したマウス腎糸球体メサンギウム細胞を抗Ｔｈｙ－１モノクローナル抗体及びウサギ血清（補体のソース）に暴露させ、抗Ｔｈｙ－１モノクローナル抗体及び補体による細胞死モデルを確立した。
ＧＳＨ、ＤＴＴ、及びＨ２Ｏ２などのチオール反応性物質を用いて、抗Ｔｈｙ－１モノクローナル抗体のジスルフィド結合に影響を与えることにより、抗体活性の変化を観察した。細胞形態の変化、ＬＤＨ放出、及び細胞染色（ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ／Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ染色）により細胞生存状況を観察した。
【0067】
＜フリーチオール基（－ＳＨ）の測定＞
１） －ＳｕｌｆｏＢｉｏｔｉｃｓ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｄｏｘ Ｓｔａｔｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｋｉｔ（株式会社 同仁化学研究所）を用いて、タンパク質のチオール基の数を電気泳動法により測定した。マレイミド基を有するＰｒｏｔｅｉｎ－ＳＨｉｆｔｅｒはタンパク質のチオール基と結合し、１分子のＰｒｏｔｅｉｎ－ＳＨｉｆｔｅｒが結合することでラベル化されたタンパク質は分子質量約１５ｋＤａ増加したバンドとして分離・検出される。ラベル化されたタンパク質の電気泳動のバンドが、チオール数に応じてより高分子側にシフトすることが確認された。
２） 蛍光標識マレイミドを用いて、処理した免疫グロブリン内のフリーチオールレベルの変化を解析した。原理としては、免疫グロブリンのチオール基はマレイミドと結合し、その量は、ドットブロットバンドの蛍光強さに反映されている。これによって、タンパク質内のフリーチオールレベルを解析した。
１） －ＳｕｌｆｏＢｉｏｔｉｃｓ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｄｏｘ Ｓｔａｔｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｋｉｔ（株式会社 同仁化学研究所）を用いて、タンパク質のチオール基の数を電気泳動法により測定した。マレイミド基を有するＰｒｏｔｅｉｎ－ＳＨｉｆｔｅｒはタンパク質のチオール基と結合し、１分子のＰｒｏｔｅｉｎ－ＳＨｉｆｔｅｒが結合することでラベル化されたタンパク質は分子質量約１５ｋＤａ増加したバンドとして分離・検出される。ラベル化されたタンパク質の電気泳動のバンドが、チオール数に応じてより高分子側にシフトすることが確認された。
２） 蛍光標識マレイミドを用いて、処理した免疫グロブリン内のフリーチオールレベルの変化を解析した。原理としては、免疫グロブリンのチオール基はマレイミドと結合し、その量は、ドットブロットバンドの蛍光強さに反映されている。これによって、タンパク質内のフリーチオールレベルを解析した。
【0068】
＜免疫グロブリンの構造確認＞
免疫グロブリンの構造確認は、電気泳動後、タンパク質の染色、及びメンブレンへの転写を行い、その後、抗免疫グロブリン抗体を用いて、バントの位置により確認した。通常型ＩｇＧは分子量約１８０ｋＤａの部位で確認され、還元型グロブリンの重鎖は分子量約５５ｋＤａの部位で確認され、還元型グロブリンの軽鎖は分子量約２５ｋＤａで確認される。
免疫グロブリンの構造確認は、電気泳動後、タンパク質の染色、及びメンブレンへの転写を行い、その後、抗免疫グロブリン抗体を用いて、バントの位置により確認した。通常型ＩｇＧは分子量約１８０ｋＤａの部位で確認され、還元型グロブリンの重鎖は分子量約５５ｋＤａの部位で確認され、還元型グロブリンの軽鎖は分子量約２５ｋＤａで確認される。
【0069】
上記した試験における他の試薬や抗体などについて、以下に示す。
・ ＴＣＥＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ４７０６－２Ｇ）
・ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０ Ｃ２ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２０３４４）
・ Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ（Ｃａｙｍａｎ、１４９５３）
・ Ｌ－Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｒｅｄｕｃｅｄ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇ４２５１－５Ｇ）
・ Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＨＲＰ ｌｉｎｋｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃７０７６Ｓ）
・ Ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ＨＲＰ－ｌｉｎｋｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃７０７４Ｓ）
・ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ， ＩｇＡ， ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ） ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１０６６８）
・ Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ） ａｎｔｉｂｏｄｙ， ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＮＯＶＥＸ、Ａ１８９０３）
・ ＴＣＥＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ４７０６－２Ｇ）
・ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０ Ｃ２ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２０３４４）
・ Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ（Ｃａｙｍａｎ、１４９５３）
・ Ｌ－Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｒｅｄｕｃｅｄ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇ４２５１－５Ｇ）
・ Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＨＲＰ ｌｉｎｋｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃７０７６Ｓ）
・ Ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ＨＲＰ－ｌｉｎｋｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃７０７４Ｓ）
・ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ， ＩｇＡ， ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ） ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１０６６８）
・ Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ） ａｎｔｉｂｏｄｙ， ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＮＯＶＥＸ、Ａ１８９０３）
【0070】
【0071】
図２Ａに各ＩｇＧにおけるチオール基（－ＳＨ基）の量を確認した結果を示す。図２Ａ中、左側から順に、通常型抗体（ＩｇＧ）、通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体（ＤＴＴ ＩｇＧ）を示す。
図２Ａに示したように、通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体（還元型抗体）では、フリーのチオール基が多いことが確認された。
図２Ａに示したように、通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体（還元型抗体）では、フリーのチオール基が多いことが確認された。
【0072】
図２Ｂにマウスに注射する前の各ＩｇＧの構造を確認した結果を示す。図２Ｂ中、左側から順に、（１）通常型抗体（ＩｇＧ）、（２）通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体（ＤＴＴ ＩｇＧ）、（３）ブランク、（４）前記（１）をＤＴＴで処理した抗体、（５）前記（２）をＤＴＴで処理した抗体を示す。
図２Ｂに示されたように、通常型抗体をＤＴＴで処理することにより、２本の重鎖、及び２本の軽鎖がそれぞれ結合されていない単独の鎖となることが確認された。
図２Ｂに示されたように、通常型抗体をＤＴＴで処理することにより、２本の重鎖、及び２本の軽鎖がそれぞれ結合されていない単独の鎖となることが確認された。
【0073】
図２Ｃにマウスの体重変化を観察した結果を示す。図２Ｃ中、「ＤＳＳ」は免疫グロブリンを投与しなかった群の結果を示し、「ＤＳＳ＋ＩｇＧ」は通常型抗体を投与した群の結果を示し、「ＤＳＳ＋ＤＴＴ ＩｇＧ」は通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体を投与した群の結果を示す。
図２Ｃに示したように、「ＤＳＳ＋ＤＴＴ ＩｇＧ」群では、ほとんど体重が減らなかった。
図２Ｃに示したように、「ＤＳＳ＋ＤＴＴ ＩｇＧ」群では、ほとんど体重が減らなかった。
【0074】
図２Ｄにマウスの腸の長さを観察した結果を示し、図２Ｅにマウスの腸の長さを測定した結果を示す。図２Ｄ及び図２Ｅ中、「コントロール」は対照群（ＤＳＳ処理なし）の結果を示し、「ＤＳＳ」は免疫グロブリンを投与しなかった群の結果を示し、「ＤＳＳ＋ＩｇＧ」は通常型抗体を投与した群の結果を示し、「ＤＳＳ＋ＤＴＴ ＩｇＧ」は通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体を投与した群の結果を示す。
図２Ｄ及び図２Ｅに示したように、「ＤＳＳ＋ＩｇＧ」群では腸の長さが短くなっているのに対し、「ＤＳＳ＋ＤＴＴ ＩｇＧ」群では、腸の長さがコントロール群と同等であることが確認された。
図２Ｄ及び図２Ｅに示したように、「ＤＳＳ＋ＩｇＧ」群では腸の長さが短くなっているのに対し、「ＤＳＳ＋ＤＴＴ ＩｇＧ」群では、腸の長さがコントロール群と同等であることが確認された。
【0075】
図２Ｆにマウスの腸の病理変化を調べた結果を示す。図２Ｆ中、「コントロール」は対照群（ＤＳＳ処理なし）の結果を示し、「ＤＳＳ」は免疫グロブリンを投与しなかった群の結果を示し、「ＤＳＳ＋ＩｇＧ」は通常型抗体を投与した群の結果を示し、「ＤＳＳ＋ＤＴＴ ＩｇＧ」は通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体を投与した群の結果を示す。
図２Ｆに示したように、「ＤＳＳ＋ＤＴＴ ＩｇＧ」群では、正常コントロール群に近い組織像が観察された。
図２Ｆに示したように、「ＤＳＳ＋ＤＴＴ ＩｇＧ」群では、正常コントロール群に近い組織像が観察された。
【0076】
図２Ｇにマウスの腸上皮細胞の密着結合完全性の保持を調べた結果を示す。図２Ｇ中、「コントロール」は対照群（ＤＳＳ処理なし）の結果を示し、「ＤＳＳ」は免疫グロブリンを投与しなかった群の結果を示し、「ＤＳＳ ＩｇＧ」は通常型抗体を投与した群の結果を示し、「ＤＳＳ ＤＴＴ ＩｇＧ」は通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体を投与した群の結果を示す。
図２Ｇに示したように、「ＤＳＳ ＤＴＴ ＩｇＧ」群では、腸上皮細胞の密着結合完全性（タイトジャンクション）が保持されていることを示すＥ－カドヘリンが、「ＤＳＳ」群及び「ＤＳＳ ＩｇＧ」群よりも発現していることが確認された。
図２Ｇに示したように、「ＤＳＳ ＤＴＴ ＩｇＧ」群では、腸上皮細胞の密着結合完全性（タイトジャンクション）が保持されていることを示すＥ－カドヘリンが、「ＤＳＳ」群及び「ＤＳＳ ＩｇＧ」群よりも発現していることが確認された。
【0077】
図２Ｈ～図２Ｊに酸化ストレスの程度の変化を調べた結果を示す。図２Ｈはマウスの腸、図２Ｉはマウスの３日目の便、図２Ｊはマウスの血清について調べたものであり、各図中、上段は「ＳＯＨの形成」を確認した結果を示し、下段は「膜染色」の結果を示す。また、各図中、「コントロール」は対照群（ＤＳＳ処理なし）の結果を示し、「ＤＳＳ」は免疫グロブリンを投与しなかった群の結果を示し、「ＤＳＳ ＩＶＩＧ」は通常型抗体を投与した群の結果を示し、「ＤＳＳ ＤＴＴ ＩＶＩＧ」は通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体を投与した群の結果を示す。
図２Ｈ～図２Ｊに示したように、「ＤＳＳ ＩＶＩＧ」群では治療効果が限定的であったのに対し、「ＤＳＳ ＤＴＴ ＩＶＩＧ」群では、コントロール群に近く、酸化ストレスがほとんど観測されなくなった。したがって、通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体（還元型免疫グロブリン）は、抗酸化作用を介して腸炎に対する顕著な治療効果を奏することが確認された。
図２Ｈ～図２Ｊに示したように、「ＤＳＳ ＩＶＩＧ」群では治療効果が限定的であったのに対し、「ＤＳＳ ＤＴＴ ＩＶＩＧ」群では、コントロール群に近く、酸化ストレスがほとんど観測されなくなった。したがって、通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体（還元型免疫グロブリン）は、抗酸化作用を介して腸炎に対する顕著な治療効果を奏することが確認された。
【0078】
【0079】
図３Ａに各ＩｇＧにおけるチオール基（－ＳＨ基）の量を確認した結果を示す。図３Ａ中、左側から順に、通常型抗体（ＩｇＧ）、通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体（ＤＴＴ ＩｇＧ）、通常型抗体をＤＴＴで処理した後、更にマレイミドで処理した抗体（ＤＴＴ＋Ｍａｌ ＩｇＧ）を示す。
図３Ａに示したように、通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体では、フリーのチオール基が多いことが確認された。更にマレイミド処理することでフリーのチオール基は完全にブロックされた。
図３Ａに示したように、通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体では、フリーのチオール基が多いことが確認された。更にマレイミド処理することでフリーのチオール基は完全にブロックされた。
【0080】
図３Ｂにマウスに注射する前の各ＩｇＧの構造を確認した結果を示す。図３Ｂ中、左側から順に、（１）通常型抗体（ＩｇＧ）、（２）通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体（ＤＴＴ ＩｇＧ）、（３）通常型抗体をＤＴＴで処理した後、更にマレイミドで処理した抗体（ＤＴＴ＋Ｍａｌ ＩｇＧ）、（４）分子量マーカー、（５）前記（１）をＤＴＴで処理した抗体、（６）前記（２）をＤＴＴで処理した抗体、（７）前記（３）をＤＴＴで処理した抗体を示す。
【0081】
図３Ｃにマウスに注射した後の各ＩｇＧの構造を確認した結果を示す。図３Ｃ中、左側から順に、（１）シャムの血清、（２）コントロールの血清（Ｃｔｒｌ）、（３）通常型抗体を投与したマウスの血清（ＩｇＧ）、（４）通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体を投与したマウスの血清（ＤＴＴ ＩｇＧ）、（５）通常型抗体をＤＴＴで処理した後、更にマレイミドで処理した抗体を投与したマウスの血清（ＤＴＴ＋Ｍａｌ ＩｇＧ）を示す。
【0082】
図３Ｂ及び図３Ｃに示したように、通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体（ＤＴＴ ＩｇＧ）は、マウスに注射する前と後とでその構造が変化し、注射した後に体内での酸化反応によって、もとの構造（通常型抗体の構造）に戻ることが確認された。
【0083】
図３Ｄに、酸化ストレスマーカー（タンパク質のＳＯＨ基形成）、細胞傷害（Ｃｌｅａｖｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ ３の量）を確認した結果を示す。図３Ｄ中、左側から順に、（１）シャム、（２）コントロール（Ｃｔｒｌ）、（３）通常型抗体を投与したマウス（ＩｇＧ）、（４）通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体を投与したマウス（ＤＴＴ ＩｇＧ）、（５）通常型抗体をＤＴＴで処理した後、更にマレイミドで処理した抗体を投与したマウス（ＤＴＴ＋Ｍａｌ ＩｇＧ）を示す。
【0084】
図３Ｅに、血清尿素窒素（ＢＵＮ）を測定した結果を示す。図３Ｅ中、左側から順に、（１）シャム（Ｓｈａｍ）、（２）コントロール（Ｃｔｒｌ）、（３）通常型抗体を投与したマウス（ＩｇＧ）、（４）通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体を投与したマウス（ＤＴＴ ＩｇＧ）、（５）通常型抗体をＤＴＴで処理した後、更にマレイミドで処理した抗体を投与したマウス（ＤＴＴ＋Ｍａｌ ＩｇＧ）を示す。
【0085】
図３Ｆ～図３Ｈに、炎症因子の量を測定した結果を示す。図３ＦはＩＬ－１β、図３ＧはＩＬ－１α、図３ＨはＴＮＦ－αの量を測定した結果を示し、各図中、左側から順に、（１）シャム（Ｓｈａｍ）、（２）コントロール（Ｃｔｒｌ）、（３）通常型抗体を投与したマウス（ＩｇＧ）、（４）通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体を投与したマウス（ＤＴＴ ＩｇＧ）、（５）通常型抗体をＤＴＴで処理した後、更にマレイミドで処理した抗体を投与したマウス（ＤＴＴ＋Ｍａｌ ＩｇＧ）を示す。
【0086】
図３Ｄ～図３Ｈに示したように、通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体（ＤＴＴ ＩｇＧ）を投与した群では、酸化ストレス、細胞障害、腎機能、炎症反応に対して最も優れた治療効果が得られた。また、フリーのチオール基をブロックした、「ＤＴＴ＋Ｍａｌ ＩｇＧ」を投与した群では、「ＤＴＴ ＩｇＧ」を投与した群で確認された効果が認められなかった。
【0087】
【0088】
図４Ａに実験期間中におけるマウスの生存率を測定した結果を示す。図４Ａ中、「Ｃｔｒｌ」はコントロール（治療なし群）、「ＩｇＧ」は通常型抗体を投与した群、「ＤＴＴ ＩｇＧ」は通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体を投与した群、「ＤＴＴ＋Ｍａｌ ＩｇＧ」は通常型抗体をＤＴＴで処理した後、更にマレイミドで処理した抗体を投与した群の結果を示す。
図４Ａに示されたように、通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体を投与した群（ＤＴＴ ＩｇＧ）では、すべてのマウスが生存していた。
図４Ａに示されたように、通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体を投与した群（ＤＴＴ ＩｇＧ）では、すべてのマウスが生存していた。
【0089】
図４Ｂに採血した血清中の炎症因子（ＩＬ－１β）の量を測定した結果を測定した結果を示す。図４Ｂ中、「Ｓｈａｍ」はシャム群、「Ｃｔｒｌ」はコントロール（治療なし群）、「ＩｇＧ」は通常型抗体を投与した群、「ＤＴＴ ＩｇＧ」は通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体を投与した群、「ＤＴＴ＋Ｍａｌ ＩｇＧ」は通常型抗体をＤＴＴで処理した後、更にマレイミドで処理した抗体を投与した群の結果を示す。
図４Ｂに示されたように、各ＩｇＧを投与した群では、血清中の炎症因子の量がコントロールと比べて減っていた。そのため、図４Ａで示した生存率の違いは、通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体が、もともとの通常型ＩｇＧが有する効果に加えて、抗酸化作用も有することによるものと考えられる。
図４Ｂに示されたように、各ＩｇＧを投与した群では、血清中の炎症因子の量がコントロールと比べて減っていた。そのため、図４Ａで示した生存率の違いは、通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体が、もともとの通常型ＩｇＧが有する効果に加えて、抗酸化作用も有することによるものと考えられる。
【0090】
図４Ｃに注射した各ＩｇＧの構造変化を確認した結果を示す。図４Ｃ中、左側から順に、コントロールのマウスの血清（Ｃｔｒｌ）、通常の抗体を投与したマウスの血清（ＩｇＧ）、通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体を投与したマウスの血清（ＤＴＴ ＩｇＧ）、通常型抗体をＤＴＴで処理した後、更にマレイミドで処理した抗体を投与したマウスの血清（ＤＴＴ＋Ｍａｌ ＩｇＧ）を示し、その右側の３レーンは、使用した通常型抗体（ＩｇＧ）、通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体（ＤＴＴ ＩｇＧ）、通常型抗体をＤＴＴで処理した後、更にマレイミドで処理した抗体（ＤＴＴ＋Ｍａｌ ＩｇＧ）を示す。
図４Ｃに示したように、通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体（ＤＴＴ ＩｇＧ）を投与した場合、血清中で構造が変化し、通常型抗体と同じ構造を有していることが確認された。
図４Ｃに示したように、通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体（ＤＴＴ ＩｇＧ）を投与した場合、血清中で構造が変化し、通常型抗体と同じ構造を有していることが確認された。
【0091】
＜酸化ストレスによる内皮細胞の細胞死の阻止＞
＜＜抗酸化剤の保護作用＞＞
内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）への酸化ストレス（Ｈ２Ｏ２）に対する抗酸化剤（グルタチオン（ＧＳＨ）、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ））の抗酸化作用を確認した結果を図５Ａ～図５Ｃに示す。
＜＜抗酸化剤の保護作用＞＞
内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）への酸化ストレス（Ｈ２Ｏ２）に対する抗酸化剤（グルタチオン（ＧＳＨ）、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ））の抗酸化作用を確認した結果を図５Ａ～図５Ｃに示す。
【0092】
図５Ａは、ＧＳＨ、ＮＡＣで処理した細胞の結果を示す図である。図５Ａ中、上段はＨ２Ｏ２無し、下段はＨ２Ｏ２有りの場合の結果を示し、左側から順に、コントロール、ＧＳＨ、ＮＡＣの結果を示す。
図５Ｂは、ＧＳＨ、ＮＡＣで処理した際の細胞生存率を測定した結果を示す図である。図５Ｂ中、左側はＨ２Ｏ２無し、右側はＨ２Ｏ２有りの場合の結果を示し、（１）はコントロール、（２）はＧＳＨ、（３）はＮＡＣの結果を示す。
図５Ｃは、ＧＳＨ、ＮＡＣで処理した際のＰ３８のリン酸化を確認した結果を示す図である。図５Ｃ中、「－」はＨ２Ｏ２無し、「＋」はＨ２Ｏ２有りの場合の結果を示し、「Ｃｔｒｌ」はコントロールを示す。
図５Ａ～図５Ｃに示したように、抗酸化剤を投与することで、酸化ストレスによる内皮細胞の細胞死が抑制できることが確認された。
図５Ｂは、ＧＳＨ、ＮＡＣで処理した際の細胞生存率を測定した結果を示す図である。図５Ｂ中、左側はＨ２Ｏ２無し、右側はＨ２Ｏ２有りの場合の結果を示し、（１）はコントロール、（２）はＧＳＨ、（３）はＮＡＣの結果を示す。
図５Ｃは、ＧＳＨ、ＮＡＣで処理した際のＰ３８のリン酸化を確認した結果を示す図である。図５Ｃ中、「－」はＨ２Ｏ２無し、「＋」はＨ２Ｏ２有りの場合の結果を示し、「Ｃｔｒｌ」はコントロールを示す。
図５Ａ～図５Ｃに示したように、抗酸化剤を投与することで、酸化ストレスによる内皮細胞の細胞死が抑制できることが確認された。
【0093】
【0094】
図５Ｄは、各ＩｇＧで処理した細胞の結果を示す図である。図５Ｄ中、上段はＨ２Ｏ２無し、下段はＨ２Ｏ２有りの場合の結果を示し、左側から順に、コントロール、通常型抗体（ＩｇＧ）、通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体（ＤＴＴ）、通常型抗体をＤＴＴで処理した後、更にマレイミドで処理した抗体（ＤＴＴ＋Ｍａｌ）の結果を示す。
図５Ｅは、各ＩｇＧで処理した際の細胞生存率を測定した結果を示す図である。図５Ｅ中、左側はＨ２Ｏ２無し、右側はＨ２Ｏ２有りの場合の結果を示し、（１）はコントロール、（２）は通常型抗体（ＩｇＧ）、（３）は通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体（ＤＴＴ ＩｇＧ）、（４）は通常型抗体をＤＴＴで処理した後、更にマレイミドで処理した抗体（ＤＴＴ＋Ｍａｌ ＩｇＧ）の結果を示す。
図５Ｆは、各ＩｇＧで処理した際のＰ３８のリン酸化を確認した結果を示す図である。図５Ｆ中、「－」はＨ２Ｏ２無し、「＋」はＨ２Ｏ２有りの場合の結果を示し、「Ｃｔｒｌ」はコントロール、「ＩｇＧ」は通常型抗体、「ＤＴＴ」は通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体、「ＤＴＴ Ｈ２Ｏ２」は通常型抗体をＤＴＴで処理した後、更にＨ２Ｏ２で処理した抗体、「ＤＴＴ Ｍａｌ」は通常型抗体をＤＴＴで処理した後、更にマレイミドで処理した抗体の結果を示す。
図５Ｄ～図５Ｆに示したように、ＤＴＴで処理した抗体を投与することで、上述した抗酸化剤を投与した場合と同様に、酸化ストレスによる内皮細胞の細胞死が抑制されており、ＤＴＴで処理した抗体（還元型免疫グロブリン）が抗酸化作用を有していることが確認された。この抗酸化作用は、フリーのチオール基と関係していた。
図５Ｅは、各ＩｇＧで処理した際の細胞生存率を測定した結果を示す図である。図５Ｅ中、左側はＨ２Ｏ２無し、右側はＨ２Ｏ２有りの場合の結果を示し、（１）はコントロール、（２）は通常型抗体（ＩｇＧ）、（３）は通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体（ＤＴＴ ＩｇＧ）、（４）は通常型抗体をＤＴＴで処理した後、更にマレイミドで処理した抗体（ＤＴＴ＋Ｍａｌ ＩｇＧ）の結果を示す。
図５Ｆは、各ＩｇＧで処理した際のＰ３８のリン酸化を確認した結果を示す図である。図５Ｆ中、「－」はＨ２Ｏ２無し、「＋」はＨ２Ｏ２有りの場合の結果を示し、「Ｃｔｒｌ」はコントロール、「ＩｇＧ」は通常型抗体、「ＤＴＴ」は通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体、「ＤＴＴ Ｈ２Ｏ２」は通常型抗体をＤＴＴで処理した後、更にＨ２Ｏ２で処理した抗体、「ＤＴＴ Ｍａｌ」は通常型抗体をＤＴＴで処理した後、更にマレイミドで処理した抗体の結果を示す。
図５Ｄ～図５Ｆに示したように、ＤＴＴで処理した抗体を投与することで、上述した抗酸化剤を投与した場合と同様に、酸化ストレスによる内皮細胞の細胞死が抑制されており、ＤＴＴで処理した抗体（還元型免疫グロブリン）が抗酸化作用を有していることが確認された。この抗酸化作用は、フリーのチオール基と関係していた。
【0095】
【0096】
図６Ａは、抗体（抗ｔｈｙ－１ ＩｇＧ）の構造を確認した結果を示す図である。図６Ａ中、左側のレーンから順に、通常型抗体（Ｃｔｒｌ）、通常型抗体をＨ２Ｏ２で処理した抗体（Ｈ２Ｏ２）、通常型抗体をジアミドで処理した抗体（Ｄｉａ）、通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体（ＤＴＴ）、通常型抗体をＤＴＴで処理した後、更にＨ２Ｏ２で処理した抗体（ＤＴＴ＋Ｈ２Ｏ２）、通常型抗体をＤＴＴで処理した後、更にジアミドで処理した抗体（ＤＴＴ＋Ｄｉａ）の結果を示す。
図６Ａに示したように、通常型抗体をＤＴＴで処理することにより、抗体中のジスルフィド結合が切断され、重鎖と軽鎖がそれぞれ結合していない状態で存在していることが確認された。また、ＤＴＴ処理の後に酸化剤で処理することで、もとの通常型抗体の構造に戻っていることも確認された。
図６Ａに示したように、通常型抗体をＤＴＴで処理することにより、抗体中のジスルフィド結合が切断され、重鎖と軽鎖がそれぞれ結合していない状態で存在していることが確認された。また、ＤＴＴ処理の後に酸化剤で処理することで、もとの通常型抗体の構造に戻っていることも確認された。
【0097】
図６Ｂは、培養したマウス腎糸球体メサンギウム細胞を各抗ｔｈｙ－１モノクローナル抗体及びウサギ血清に暴露した結果を示す図である。図６Ｂ中、上段はウサギ血清無し、下段はウサギ血清有りの場合の結果を示し、左側から順に、コントロール、通常型抗体（抗ｔｈｙ－１抗体）、通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体（ＤＴＴ）、通常型抗体をＤＴＴで処理した後、更にＨ２Ｏ２で処理した抗体（ＤＴＴ＋Ｈ２Ｏ２）、通常型抗体をＤＴＴで処理した後、更にジアミドで処理した抗体（ＤＴＴ＋Ｄｉａ）の結果を示す。
図６Ｃは、培養したマウス腎糸球体メサンギウム細胞を各抗ｔｈｙ－１モノクローナル抗体及びウサギ血清に暴露した際のＬＤＨ放出を測定した結果を示す図である。図６Ｃ中、左側はウサギ血清無し、右側はウサギ血清有りの場合の結果を示し、（１）はＤ／Ｆ１２の場合、（２）は通常型抗体（α－ｔｈｙ－１）、（３）は通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体（ＤＴＴ α－ｔｈｙ－１）、（４）は通常型抗体をＤＴＴで処理した後、更にＨ２Ｏ２で処理した抗体（ＤＴＴ＋Ｈ２Ｏ２ α－ｔｈｙ－１）、（５）は通常型抗体をＤＴＴで処理した後、更にジアミドで処理した抗体（ＤＴＴ＋Ｄｉａ α－ｔｈｙ－１）の結果を示す。
図６Ｂ及び図６Ｃに示したように、ＤＴＴで処理した抗体では、通常型抗体が有する抗原抗体反応及び補体を介した細胞溶解の機能はなかったが、ＤＴＴ処理の後に酸化剤で処理し、通常型抗体と同じ構造となることで、通常型抗体が有する前記機能を有していることが確認された。
図６Ｃは、培養したマウス腎糸球体メサンギウム細胞を各抗ｔｈｙ－１モノクローナル抗体及びウサギ血清に暴露した際のＬＤＨ放出を測定した結果を示す図である。図６Ｃ中、左側はウサギ血清無し、右側はウサギ血清有りの場合の結果を示し、（１）はＤ／Ｆ１２の場合、（２）は通常型抗体（α－ｔｈｙ－１）、（３）は通常型抗体をＤＴＴで処理した抗体（ＤＴＴ α－ｔｈｙ－１）、（４）は通常型抗体をＤＴＴで処理した後、更にＨ２Ｏ２で処理した抗体（ＤＴＴ＋Ｈ２Ｏ２ α－ｔｈｙ－１）、（５）は通常型抗体をＤＴＴで処理した後、更にジアミドで処理した抗体（ＤＴＴ＋Ｄｉａ α－ｔｈｙ－１）の結果を示す。
図６Ｂ及び図６Ｃに示したように、ＤＴＴで処理した抗体では、通常型抗体が有する抗原抗体反応及び補体を介した細胞溶解の機能はなかったが、ＤＴＴ処理の後に酸化剤で処理し、通常型抗体と同じ構造となることで、通常型抗体が有する前記機能を有していることが確認された。
【0098】
上記したように、本発明の還元型免疫グロブリンは、優れた抗酸化作用を有し、更に、体内環境において酸化されその構造が変化することで、通常型免疫グロブリンが有する作用をも有することが確認された。前記還元型免疫グロブリンは、通常型免疫グロブリンと比べて非常に優れた治療効果を有するので、抗酸化剤、医薬組成物、食品、化粧品などに好適に利用可能である。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図2H】
【図2I】
【図2J】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図3H】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
