特許 7573284 腎障害の予防剤または治療剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-10-17

(45)【発行日】2024-10-25

(54)【発明の名称】腎障害の予防剤または治療剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/26 20060101AFI20241018BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20241018BHJP

   A61K 31/05 20060101ALI20241018BHJP

【ＦＩ】

A61K31/26

A61P13/12

A61K31/05

【請求項の数】 1

(21)【出願番号】P 2021527337

(86)(22)【出願日】2020-01-17

(86)【国際出願番号】 JP2020001598

(87)【国際公開番号】W WO2020255464

(87)【国際公開日】2020-12-24

【審査請求日】2022-08-04

(31)【優先権主張番号】P 2019114970

(32)【優先日】2019-06-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】517139820

【氏名又は名称】特定非営利活動法人日本バイオストレス研究振興アライアンス

(74)【代理人】

【識別番号】110003797

【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】糟野 健司

(72)【発明者】

【氏名】岩野 正之

(72)【発明者】

【氏名】淀井 淳司

【審査官】植原 克典

(56)【参考文献】

【文献】SHOKEIR, A A et al.，Activation of Nrf2 by ischemic preconditioning and sulforaphane in renal ischemia/reperfusion injury，Physiol Res，2015年，Vol.64, No.3，p.313-323

【文献】RYOO, I G et al.，Inhibitory role of the KEAP1-NRF2 pathway in TGFβ1-stimulated renal epithelial transition to fibrob，PLoS One，2014年，Vol.9, No.4，e93265

【文献】GUERRERO-BELTRAN C E et al.，Sulforaphane, a natural constituent of broccoli, prevents cell death and inflammation in nephropathy，J Nutr Biochem，2012年，Vol.23, No.5，p.494-500

【文献】前田 章光，急性腎障害，月刊薬事，2018年，Vol.60, No.4，p.77-81

【文献】NEGRETTE-GUZMAN, M et al.，Sulforaphane attenuates gentamicin-induced nephrotoxicity: role of mitochondrial protection，Evid Based Complement Alternat Med，2013年，Vol.2013，Article ID 135314

【文献】副島 昭典，急性腎不全，日本臨床，2002年，第60巻, 増刊号4，p.636-641

【文献】SHANG, G et al.，Sulforaphane attenuation of experimental diabetic nephropathy involves GSK-3 beta/Fyn/Nrf2 signaling，J Nutr Biochem，2015年，Vol.26，p.596-606

【文献】GUERRERO-BELTRAN C E et al.，Tert-butylhydroquinone pretreatment protects kidney from ischemia-reperfusion injury，J Nephrol，2012年，Vol.25, No.1，p.84-89

【文献】PEREZ-ROJAS J M et al.，Preventive effect of tert-butylhydroquinone on cisplatin-induced nephrotoxicity in rats，Food Chem Toxicol，2011年，Vol.49, No.10，p.2631-2637

【文献】LI, H et al.，Attenuation of glomerular injury in diabetic mice with tert-butylhydroquinone through nuclear factor，Am J Nephrol，2011年，Vol.33, No.4，p.289-297

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ３１／１２２、３１／２６

Ａ６１Ｋ４５／００

Ａ６１Ｐ１３／１２、４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

チオレドキシン誘導剤を有効成分として含有している、急性腎障害から慢性腎臓病への移行を防ぐ治療剤であって、
前記チオレドキシン誘導剤は、スルフォラファン、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロキノン、または、これらの塩であり、
前記チオレドキシン誘導剤により、腎細胞の細胞周期におけるＧ _２ 期からＭ期への進行停止状態が解除され、チオレドキシンが腎細胞から排出されることで生じる慢性腎臓病を治療する、急性腎障害から慢性腎臓病への移行を防ぐ治療剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、腎障害の予防剤または治療剤に関する。

【背景技術】

【0002】

腎障害は、死亡率が高く、かつ、予後不良な疾患である。例えば、重症の急性腎障害（acute kidney injury：ＡＫＩ）では、死亡率が５０％を上回る。

【0003】

急性腎障害から慢性腎臓病へ移行（AKI to CKD transition）すると、当該患者の一部は、透析を受ける必要がある。急性腎障害から慢性腎臓病への移行によって透析が必要になった患者の数は、日本国内の透析患者の数の約１／４（約８万人）に達するとされている。

【0004】

急性腎障害から慢性腎臓病へ移行するメカニズムについては、研究が進められており、腎細胞の細胞周期がＧ２期からＭ期へ進行せずに停止することが、急性腎障害から慢性腎臓病へ移行させるメカニズムの１つであると報告されている（非特許文献１参照）。

【0005】

また、腎障害は、様々に分類され得、腎障害の例として、急性腎障害から慢性腎臓病への移行、カルシニューリンインヒビター腎症、糖尿病性腎臓病、腎硬化症、および、腎移植に伴う腎障害などの虚血あるいは酸化ストレスあるいは腎間質の線維化による腎障害が挙げられる。

【0006】

上述した状況にあって、腎障害の予防剤および治療剤の開発に注目が集まっている。心臓手術に伴う急性腎障害に関しては、現在、ｐ５３の阻害剤（ＱＰＩ－１００２）にて患者を処置する方法の開発が進められており、当該方法に関しては、現在、第ＩＩＩ相治験が実施されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【文献】Li Yang et al., “Epithelial cell cycle arrest in G2/M mediates kidney fibrosis after injury” Nature Medicine, Vol.16, No.5, May 2010, p535-543

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

しかしながら、上述のようなｐ５３の阻害剤を用いる技術は、発癌リスクを増加させるなど、多くの副作用を有している。それ故に、腎障害の新たな予防剤または治療剤の開発が、求められている。

【0009】

本発明の一態様は、腎障害の新たな予防剤または治療剤を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る腎障害の予防剤または治療剤は、チオレドキシン誘導剤を有効成分として含有している。

【0011】

本発明の一態様に係る腎障害の予防剤または治療剤では、上記チオレドキシン誘導剤は、スルフォラファン、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロキノン、または、これらの誘導体もしくは塩である。

【0012】

本発明の一態様に係る腎障害の予防剤または治療剤では、上記腎障害は、初期の慢性腎障害である。

【発明の効果】

【0013】

本発明の一態様によれば、腎障害の新たな予防剤または治療剤を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】本発明の実施例に係るチオレドキシン誘導剤が有する、チオレドキシンのｍＲＮＡの発現増強効果を示すグラフである。

【図2】本発明の実施例に係るチオレドキシン誘導剤が有する、チオレドキシンのタンパク質の発現増強効果を示すグラフである。

【図3】本発明の実施例において、チオレドキシンを強制発現することによる、急性腎障害から慢性腎臓病への移行抑制効果を示す像である。

【図4】本発明の実施例に係るチオレドキシン誘導剤が有する、腎間質の線維化抑制効果を示す像である。

【図5】本発明の実施例に係るチオレドキシン誘導剤が有する、ＣＴＧＦのｍＲＮＡおよびＴＧＦ－βのｍＲＮＡの発現抑制効果を示すグラフである。

【図6】本発明の実施例に係るチオレドキシン誘導剤が有する、血液中の血清クレアチニンの濃度上昇の抑制効果を示すグラフである。

【図7】本発明の実施例に係るチオレドキシン誘導剤が有する、急性腎障害から慢性腎臓病への移行抑制効果、具体的にはリン酸化ヒストンＨ３タンパク質の濃度上昇の抑制効果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態及び実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態及び実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。本明細書中、数値範囲に関して「Ａ～Ｂ」と記載した場合、当該記載は「Ａ以上Ｂ以下」を意図する。

【0016】

〔１．腎障害の予防剤または治療剤〕
本発明の一実施形態に係る腎障害の予防剤または治療剤は、チオレドキシン誘導剤を有効成分として含有している。

【0017】

上記腎障害の具体例としては、急性腎障害（例えば、発症後の急性腎障害）、および、慢性腎障害を挙げることができる。慢性腎障害は、初期の慢性腎障害であることが好ましい。初期の慢性腎障害の具体例としては、例えば、急性腎障害から慢性腎臓病への移行、急性腎障害、カルシニューリンインヒビター腎症、糖尿病性腎臓病、腎硬化症、および、腎移植に伴う腎障害などの虚血あるいは酸化ストレスあるいは腎間質の線維化による腎障害を挙げることができる。

【0018】

本明細書において「予防剤」とは、予防効果をもたらす薬剤を意図する。上記予防効果とは、以下に例示される効果を意図するが、これらに限定されるものではない。

【0019】

（ａ）予防剤を投与しなかった場合と比較して、腎障害に係る１つ以上の症状の発症を防止する、または、発症のリスクを低減する。

【0020】

（ｂ）予防剤を投与しなかった場合と比較して、腎障害に係る１つ以上の症状の再発を防止する、または、再発のリスクを低減する。

【0021】

（ｃ）予防剤を投与しなかった場合と比較して、腎障害に係る１つ以上の症状の兆候が生じることを防止する、または、兆候が生じるリスクを低減する。

【0022】

本明細書において「治療剤」とは、治療効果をもたらす薬剤を意図する。上記治療効果とは、以下に例示される効果を意図するが、これらに限定されるものではない。

【0023】

（ｄ）治療剤を投与しなかった場合と比較して、腎障害に係る１つ以上の症状の重症度を低減する。

【0024】

（ｅ）治療剤を投与しなかった場合と比較して、腎障害に係る１つ以上の症状の重症度の増加、または、症状の進行を防止する。

【0025】

（ｆ）治療剤を投与しなかった場合と比較して、腎障害に係る１つ以上の症状の重症度の増加速度、または、症状の進行速度を低減する。

【0026】

本発明の一実施形態に係る腎障害の予防剤または治療剤は、より具体的に、（ｇ）急性腎障害の予防剤もしくは治療剤、または、（ｈ）慢性腎臓病へ移行する急性腎障害（例えば、慢性腎臓病へ移行する前の急性腎障害、または、慢性腎臓病へ移行中の急性腎障害）の予防剤もしくは治療剤、であってもよい。

【0027】

本実施の形態の腎障害の治療剤は、チオレドキシン誘導剤を有効成分として含有している。チオレドキシン誘導剤は、チオレドキシン（thioredoxin：ＴＲＸ）タンパク質の量を増加させ得るものであればよく、チオレドキシン誘導剤の作用機序は限定されない。例えば、チオレドキシン誘導剤は、チオレドキシンｍＲＮＡの転写量を増加させるものであってもよく、チオレドキシンｍＲＮＡの分解を減少させるものであってもよく、チオレドキシンタンパク質の翻訳量を増加させるものであってもよく、チオレドキシンタンパク質の分解を減少させるものであってもよい。

【0028】

上記チオレドキシン誘導剤は、より具体的に、以下のものであってもよい：
（１）スルフォラファン（1-isothiocyanato-4-（methylsulfinyl）-butane）；
（２）ｔｅｒｔ－ブチルヒドロキノン（2-（1,1-Dimethylethyl）-1,4-benzenediol）；（３）上述した（１）～（２）の誘導体または塩。

【0029】

本明細書において、「誘導体」とは、特定の化合物に対して、当該化合物の分子内の一部が、他の官能基または他の原子と置換されることにより生じる化合物群を意図する。上記他の官能基の例としては、アルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリール基、アリールオキシ基、アリールチオ基、アリールアルキル基、アリールアルコキシ基、アリールアルキルチオ基、アリールアルケニル基、アリールアルキニル基、アリル基、アミノ基、置換アミノ基、シリル基、置換シリル基、シリルオキシ基、置換シリルオキシ基、アリールスルフォニルオキシ基、アルキルスルフォニルオキシ基、ニトロ基などが挙げられる。上記他の原子の例としては、炭素原子、水素原子、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、リン原子、ハロゲン原子などが挙げられる。

【0030】

本明細書において、「塩」とは、医薬品として被験体に投与することが生理学的に許容されうる塩であるならば、限定されない。塩の例としては、アルカリ金属塩（カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩など）、アンモニウム塩、有機塩基塩（トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩など）、有機酸塩（酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、蟻酸塩、トルエンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩など）、無機酸塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、燐酸塩など）を挙げられる。

【0031】

上記チオレドキシン誘導剤は、公知の手法により製造することができる。勿論、市販のチオレドキシン誘導剤を用いることも可能である。

【0032】

本発明の一実施形態に係る腎障害の予防剤または治療剤は、上述した有効成分（チオレドキシン誘導剤）以外の成分を含有していてもよい。有効成分以外の成分は、薬学的に許容され得る成分であればよく、例えば、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、防腐剤、抗酸化剤、高分子量重合体、賦形剤、溶媒、安定化剤などであり得る。

【0033】

上記緩衝剤の例としては、リン酸またはリン酸塩、ホウ酸またはホウ酸塩、クエン酸またはクエン酸塩、酢酸または酢酸塩、炭酸または炭酸塩、酒石酸または酒石酸塩、ε－アミノカプロン酸、トロメタモールなどが挙げられる。上記リン酸塩としては、リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウムなどが挙げられる。上記ホウ酸塩としては、ホウ砂、ホウ酸ナトリウム、ホウ酸カリウムなどが挙げられる。上記クエン酸塩としては、クエン酸ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、クエン酸三ナトリウムなどが挙げられる。上記酢酸塩としては、酢酸ナトリウム、酢酸カリウムなどが挙げられる。上記炭酸塩としては、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどが挙げられる。上記酒石酸塩としては、酒石酸ナトリウム、酒石酸カリウムなどが挙げられる。

【0034】

上記ｐＨ調整剤の例としては、塩酸、リン酸、クエン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどが挙げられる。

【0035】

上記等張化剤の例としては、イオン性等張化剤（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなど）、非イオン性等張化剤（グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、マンニトールなど）が挙げられる。

【0036】

上記防腐剤の例としては、ベンザルコニウム塩化物、ベンザルコニウム臭化物、ベンゼトニウム塩化物、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル、クロロブタノールなどが挙げられる。

【0037】

上記抗酸化剤の例としては、アスコルビン酸、トコフェノール、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、エリソルビン酸ナトリウム、没食子酸プロピル、亜硫酸ナトリウムなどが挙げられる。

【0038】

上記高分子量重合体の例としては、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、アテロコラーゲンなどが挙げられる。

【0039】

上記賦形剤の例としては、乳糖、白糖、Ｄ－マンニトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、デンプン、結晶セルロースなどが挙げる。

【0040】

上記溶媒の例としては、生理的食塩水、アルコールなどが挙げられる。

【0041】

本発明の一実施形態に係る腎障害の予防剤または治療剤に含まれる有効成分の量は、特に限定されない。本発明の一実施形態に係る腎障害の予防剤または治療剤に含まれる有効成分の量は、例えば、薬剤の総重量に対して、０．００１重量％～１００重量％であってもよく、０．０１重量％～１００重量％であってもよく、０．１重量％～１００重量％であってもよく、０．１重量％～９５重量％であってもよく、０．１重量％～９０重量％であってもよく、０．１重量％～８０重量％であってもよく、０．１重量％～７０重量％であってもよく、０．１重量％～６０重量％であってもよく、０．１重量％～５０重量％であってもよく、０．１重量％～４０重量％であってもよく、０．１重量％～３０重量％であってもよく、０．１重量％～２０重量％であってもよく、０．１重量％～１０重量％であってもよい。

【0042】

本発明の一実施形態に係る腎障害の予防剤または治療剤に含まれる有効成分以外の成分の量は、特に限定されない。本発明の一実施形態に係る腎障害の予防剤または治療剤に含まれる有効成分以外の成分の量は、例えば、薬剤の総重量に対して、０重量％～９９．９９９重量％であってもよく、０重量％～９９．９９重量％であってもよく、０重量％～９９．９重量％であってもよく、５重量％～９９．９重量％であってもよく、１０重量％～９９．９重量％であってもよく、２０重量％～９９．９重量％であってもよく、３０重量％～９９．９重量％であってもよく、４０重量％～９９．９重量％であってもよく、５０重量％～９９．９重量％であってもよく、６０重量％～９９．９重量％であってもよく、７０重量％～９９．９重量％であってもよく、８０重量％～９９．９重量％であってもよく、９０重量％～９９．９重量％であってもよい。

【0043】

本発明の一実施形態に係る腎障害の予防剤または治療剤の投与対象は、特に限定されず、ヒトであってもよく、非ヒト動物（例えば、家畜、愛玩動物、および、実験動物）であってもよい。非ヒト動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、および、ラットなどが挙げられる。

【0044】

本発明の一実施形態に係る腎障害の予防剤または治療剤は、任意の投与経路によって投与対象に投与され得る。投与経路の例としては、経口投与、非経口投与、経皮投与、経粘膜投与、経静脈投与、経筋注投与、経皮下注投与が挙げられる。したがって、本発明の一実施形態に係る腎障害の予防剤または治療剤の剤型は、内服薬、外用薬、または、注射剤などであり得る。

【0045】

本発明の一実施形態に係る腎障害の予防剤または治療剤を投与する場合、所望の効果が得られるならば、投与間隔に制限はない。上記投与間隔は、例えば、１時間に１回、６時間に１回、１２時間に１回、１日間に１回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１箇月間に１回、２箇月間に１回、３箇月間に１回、４箇月間に１回、５箇月間に１回、６箇月間に１回、または、１年間に１回であり得る。

【0046】

〔２．その他〕
＜１＞チオレドキシン誘導剤を有効成分として含有している腎障害の予防剤または治療剤を被験体（例えば、ヒト、または、非ヒト動物）に投与する工程を有する、腎障害の予防方法または治療方法。

【0047】

＜２＞上記チオレドキシン誘導剤は、スルフォラファン、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロキノン、または、これらの誘導体もしくは塩である、＜１＞に記載の腎障害の予防方法または治療方法。

【0048】

＜３＞上記腎障害は、初期の慢性腎障害（例えば、急性腎障害から慢性腎臓病への移行、カルシニューリンインヒビター腎症、糖尿病性腎臓病、腎硬化症、および、腎移植に伴う腎障害などの虚血あるいは酸化ストレスあるいは腎間質の線維化による腎障害）である、＜１＞または＜２＞に記載の腎障害の予防方法または治療方法。

【0049】

＜４＞腎障害の予防剤または治療剤の製造のためのチオレドキシン誘導剤の使用。

【0050】

＜５＞上記チオレドキシン誘導剤は、スルフォラファン、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロキノン、または、これらの誘導体もしくは塩である、＜４＞に記載の使用。

【0051】

＜６＞上記腎障害は、初期の慢性腎障害（例えば、急性腎障害から慢性腎臓病への移行、カルシニューリンインヒビター腎症、糖尿病性腎臓病、腎硬化症、および、腎移植に伴う腎障害などの虚血あるいは酸化ストレスあるいは腎間質の線維化による腎障害）である、＜４＞または＜５＞に記載の使用

【実施例】

【0052】

〔１．チオレドキシン誘導剤によるチオレドキシンの発現誘導〕
マウス尿細管細胞を、公知の培地の中で、培養プレート上にて培養した。マウス尿細管細胞が培養プレートの底面を所定の細胞密度にて覆った時点にて、ＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide）に溶解したチオレドキシン誘導剤（具体的には、最終濃度が０．１２５μＭ、または、０．２５μＭになるようにスルフォラファン（ＳＦＮ）、または、最終濃度が５μＭ、または、１０μＭになるようにｔｅｒｔ－ブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ））を、培地に加えた。また、対照試験として、マウス近位尿細管細胞が培養プレートの底面を所定の細胞密度にて覆った時点にて、上述した試験と同量のＤＭＳＯを、培地に加えた。

【0053】

ＤＭＳＯに溶解したチオレドキシン誘導剤、または、ＤＭＳＯを培地に加えた後、マウス尿細管細胞を３７℃にて２４時間培養し、次いで、マウス尿細管細胞を回収した。

【0054】

ＴＯＹＯＢＯ社製のＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標） ＭＦＸ－２００を用いて、マウス尿細管細胞からＴｏｔａｌ ＲＮＡを精製した。次いで、ＴＯＹＯＢＯ社製のＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（登録商標） ｑＰＣＲ ＲＴ ｋｉｔを用いて、当該Ｔｏｔａｌ ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、後述するプローブを用いて、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡに含まれているチオレドキシンのｍＲＮＡ量およびβ－アクチンのｍＲＮＡ量を定量した。

【0055】

チオレドキシンのｍＲＮＡの定量には、プローブとして、Ｓｉｇｍａ－Ａｒｄｒｉｃｈ社製の「ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ ｐｒｏｂｅ ＦＯＲ Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ（ＴＲＸ）」を用いた。一方、β－アクチンのｍＲＮＡ量の定量には、プローブとして、Ｓｉｇｍａ－Ａｒｄｒｉｃｈ社製の「ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ ｐｒｏｂｅ ＦＯＲ β－Ａｃｔｉｎ」を用いた。

【0056】

β－アクチンのｍＲＮＡ量には、変化が無いと考えられる。そこで、β－アクチンのｍＲＮＡ量に基づいて、チオレドキシンのｍＲＮＡ量を補正した。

【0057】

図１に試験結果を示す。図１から明らかなように、スルフォラファンおよびｔｅｒｔ－ブチルヒドロキノンは、共に、チオレドキシンのｍＲＮＡの発現を増強した。また、チオレドキシンのｍＲＮＡの発現増強効果は、スルフォラファンおよびｔｅｒｔ－ブチルヒドロキノンの量に依存していた。

【0058】

〔２．チオレドキシン誘導剤による、Ｉｎ ｖｉｖｏでのチオレドキシンの発現誘導〕
Ｉｎ ｖｉｖｏでのチオレドキシン誘導剤の効果を確認するために、チオレドキシン誘導剤を投与したマウス体内の腎臓における、チオレドキシンのタンパク質を定量化した。なお、当該試験では、虚血再灌流障害を加えたマウスと、虚血再灌流障害を加えなかったマウスと、を用いた。

【0059】

野生型のＣ５７ＢＬ／６マウスの腎動脈にクリップを掛け３０分後に開放することにより、当該マウスに虚血再灌流障害を加えた。その後、急性腎障害から慢性腎臓病への移行を最もよく観察できる１４日間を経過させることにより、急性腎障害から慢性腎臓病への移行を引き起こした。１４日が経過する間、毎日、朝夕、当該マウスの皮下に、チオレドキシン誘導剤（具体的には、スルフォラファン（ＳＦＮ）３０μｇ／１匹／１日、または、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ）１ｍｇ／１匹／１日）を注射した。

【0060】

また、比較対照のため急性腎障害を引き起こさない野生型のＣ５７ＢＬ／６マウス（腎動脈にクリップ掛けを行っていないマウス）を用い、１４日間にわたって、毎日、朝夕、当該マウスの皮下に、チオレドキシン誘導剤（具体的には、スルフォラファン（ＳＦＮ）３０μｇ／１匹／１日、または、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ）１ｍｇ／１匹／１日）を注射した。

【0061】

一方、チオレドキシン誘導剤の対照として、野生型のＣ５７ＢＬ／６マウス（腎動脈にクリップ掛けを行ったマウスおよび腎動脈にクリップ掛けを行っていないマウス）を用い、１４日間にわたって、毎日、朝夕、当該マウスの皮下に、生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）を注射した。

【0062】

１４日間が経過した後に、各マウスから、腎臓、血液、および、尿を採取した。

【0063】

チオレドキシン誘導剤がチオレドキシンのタンパク質の量に与える影響を調べるために、腎臓の組織溶解液をウエスタンブロット法によって解析し、組織溶解液に含まれるチオレドキシンタンパク質を抗チオレドキシン抗体で検出した。検出されたシグナルの強度に基づいて、チオレドキシンのタンパク質を定量化した。なお、β－アクチンを内因性のコントロールとして用い、抗チオレドキシン抗体によって検出されたシグナルの強度を、抗β－アクチン抗体によって検出されたシグナルの強度にて除することによって、データの補正を行った。

【0064】

図２に試験結果を示す。なお、図２において、「Ｎｏｎ－ＡＫＩ」は、虚血再灌流障害を加えなかったマウスの試験結果を示し、「ＡＫＩ－ｔｏ－ＣＫＤ」は、虚血再灌流障害を加えたマウスの試験結果を示す。生理食塩水を注射したマウスでは、チオレドキシンタンパク質の発現量は少なかった。一方、チオレドキシン誘導剤を注射したマウスでは、生理食塩水を注射したマウスと比較して、チオレドキシンタンパク質の発現量が増加していた。

【0065】

虚血再灌流障害を加えたマウスにチオレドキシン誘導剤を注射した場合と、虚血再灌流障害を加えなかったマウスにチオレドキシン誘導剤を注射した場合とを比較すると、虚血再灌流障害を加えたマウスにチオレドキシン誘導剤を注射した場合の方が、虚血再灌流障害を加えなかったマウスにチオレドキシン誘導剤を注射した場合よりも、チオレドキシンタンパク質の発現量が増加していた。

【0066】

〔３．腎臓にてチオレドキシンを強制発現するトランスジェニックマウス、腎障害の発症阻害〕
急性腎障害が発症した後、急性腎障害から慢性腎臓病へ移行（AKI to CKD transition）する。このとき、腎細胞の細胞周期がＧ_２期からＭ期へ進行せずに停止することが、急性腎障害から慢性腎臓病への移行の原因であると考えられている。腎細胞の細胞周期がＧ_２期からＭ期へ進行せずに停止すると、リン酸化されたヒストンＨ３の量が増加することが知られている。このことは、リン酸化されたヒストンＨ３の量の増加が、急性腎障害から慢性腎臓病への移行を検知するためのマーカーとして機能することを示している。

【0067】

本試験では、腎臓にてチオレドキシンを強制発現するトランスジェニックマウスに対して、人工的に急性腎障害を発症させる処置を施した場合、急性腎障害から慢性腎臓病への移行が生じるか否か、確認した。

【0068】

本試験には、論文「Kasuno K, Nakamura H, Ono T, Muso E, Yodoi J. Protective roles of thioredoxin, a redox-regulating protein, in renal ischemia/reperfusion injury. Kidney Int 64: 1273-1282, 2003」に記載の、腎臓にてチオレドキシンを強制発現するトランスジェニックマウスを用いた（ＴＲＸ－Ｔｇ）。一方、対照試験には、野生型のＣ５７ＢＬ／６マウスを用いた（Ｗｔ）。

【0069】

腎虚血再潅流障害（renal ischemia reperfusion injury）によって、急性腎障害のモデルマウスを作製することができる。そこで、上述したマウス（ＴＲＸ－Ｔｇ、および、Ｗｔ）に腎虚血再潅流障害を加え、これによって、上述したマウスに急性腎障害を発症させるための処置を施した。

【0070】

まず、マウスの腎動脈にクリップを掛け３０分後に開放することにより、虚血再灌流障害を引き起こした。虚血再灌流障害を引き起こしてからＧ_２期からＭ期への停止が最もよく観察できた１２時間後に、マウスから腎臓を取り出し、当該腎臓を、抗リン酸化ヒストンＨ３抗体を用いて染色した。一次抗体である抗リン酸化ヒストンＨ３抗体としては、ａｂｃａｍ社製の「Ａｎｔｉ－ＨｉｓｔｏｎＨ３」を用い、二次抗体としては、ヒストファイン シンプルステインを用いた。また、染色法は、一般的な免疫染色法にしたがった。

【0071】

免疫染色法の手順の概略を説明すると、以下のとおりである：
（１）脱パラフィン処理、脱キシレン処理、および、水洗処理、
（２）３％ 過酸化水素水処理（１０分間）、
（３）水洗処理、
（４）抗原賦活化（レンジ強にて５分間、および、レンジ弱にて１０分間）、
（５）冷却処理、および、水洗処理、
（６）ＰＢＳ洗浄処理、
（７）ブロッキング処理（５分間）、
（８）一次抗体処理（１０００倍希釈の一次抗体を用い、４℃にて、一昼夜）、
（９）ＰＢＳ洗浄処理、
（１０）二次抗体処理（３０分間）、
（１１）ＰＢＳ洗浄処理、
（１２）染色処理、
（１３）脱水処理、透徹処理、および、封入処理。

【0072】

図３に試験結果を示す。図３から明らかなように、腎臓にてチオレドキシンを強制発現するトランスジェニックマウスでは、野生型のＣ５７ＢＬ／６マウスと比較して、リン酸化ヒストンＨ３の量が少なかった。このことは、チオレドキシンの強制発現により腎細胞において細胞周期がＧ_２期からＭ期へ進行し、これによって、急性腎障害から慢性腎臓病への移行が抑制されていることを示している。

【0073】

〔４．チオレドキシン誘導剤の投与による、腎障害の発症阻害〕
野生型のＣ５７ＢＬ／６マウスの腎動脈にクリップを掛け３０分後に開放することにより、虚血再灌流障害を加えた。その後、急性腎障害から慢性腎臓病への移行を最もよく観察できる１４日間を経過させることにより、急性腎障害から慢性腎臓病への移行を引き起こした。経過中の１４日間毎日、朝夕、当該マウスの皮下に、チオレドキシン誘導剤（具体的には、スルフォラファン（ＳＦＮ）３０μｇ／１匹／１日、または、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ）１ｍｇ／１匹／１日）を注射した。一方、対照試験では、１４日間にわたって、毎日、朝夕、当該マウスの皮下に、生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）を注射した。虚血再灌流障害を加えてから１４日後に、当該マウスから、腎臓、血液、および、尿を採取した。

【0074】

採取した試料を用いて、以下の＜Ａ＞～＜Ｃ＞に示すように、腎臓の線維化、および、腎臓の機能について試験した。

【0075】

＜Ａ．マッソントリクローム染色＞
腎間質の線維化は、急性腎障害から慢性腎臓病への移行の原因の一つと考えられている。そこで、採取した腎臓を用いて、マッソントリクローム染色にしたがい、腎間質の線維化が生じているか否か確認した。マッソントリクローム染色は、一般的な方法にしたがった。マッソントリクローム染色の手順の概略を説明すると、以下のとおりである：
（１）脱パラフィン処理、脱キシレン処理、および、水洗処理、
（２）第一媒染剤処理（２０分間～３０分間）、
（３）水洗処理、
（４）ワイゲルトの鉄へマトキシリン処理（３分間～２０分間）、
（５）水洗処理、
（６）色だし用の水洗処理（１０分間）、
（７）第二媒染剤処理（３０秒間）、
（８）水洗処理（１分間）、
（９）１％酢酸処理、
（１０）０．７５％オレンジＧ液処理（１分間）、
（１１）１％酢酸処理、
（１２）マッソン染色液処理（２０分間～３０分間）、
（１３）１％酢酸処理、
（１４）２．５％リンタングステン酸液処理（１５分間～３０分間）、
（１５）１％酢酸処理、
（１６）アニリン青処理（３分間～３０分間）、
（１７）１％酢酸処理、
（１８）脱水処理、透徹処理、および、封入処理。

【0076】

図４に試験結果を示す。なお、図４において、「Ｎｏｎ ＡＫＩ」は、虚血再灌流障害を加えなかったマウスの試験結果を示し、「ＡＫＩ－ｔｏ－ＣＫＤ」は、虚血再灌流障害を加えたマウスの試験結果を示す。また像のうち、左側はマッソントリクローム染色を行った腎臓切片の像であり、右側は前記像を閾値一定で青色のみをチャンネル表示した白黒画像である。生理食塩水を注射したマウスでは、虚血再灌流障害を加えることによって、１４日後に腎臓の広い領域にて腎間質の線維化（図４中、マッソントリクローム染色の青色部分、すなわち閾値一定で青色のみをチャンネル表示した白黒画像の黒い部分）が観察された。一方、チオレドキシン誘導剤を注射したマウスでは、生理食塩水を注射したマウスと比較して、虚血再灌流障害を加えたときに１４日後の腎間質の線維化が観察される領域（図４中、マッソントリクローム染色の青色部分、すなわち閾値一定で青色のみをチャンネル表示した白黒画像の黒い部分）が減少していた。

【0077】

＜Ｂ．ＣＴＧＦ（Connective tissue growth factor）およびＴＧＦ－β（Transforming Growth Factor-β）の発現＞
腎間質の線維化は、ＣＴＧＦおよびＴＧＦ－βによって促進されると考えられている。そこで、採取した腎臓を用いて、ＣＴＧＦおよびＴＧＦ－βのｍＲＮＡの発現量を測定した。

【0078】

ＴＯＹＯＢＯ社製のＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標） ＭＦＸ－２００を用いて、採取した腎臓からＴｏｔａｌ ＲＮＡを精製した。次いで、ＴＯＹＯＢＯ社製のＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（登録商標） ｑＰＣＲ ＲＴ ｋｉｔを用いて、当該Ｔｏｔａｌ ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、後述するプローブを用いて、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡに含まれているＣＴＧＦのｍＲＮＡ量、ＴＧＦ－βのｍＲＮＡ量およびβ－アクチンのｍＲＮＡ量を定量した。

【0079】

ＣＴＧＦのｍＲＮＡの定量には、プローブとして、Ｓｉｇｍａ－Ａｒｄｒｉｃｈ社製の「Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＣＴＧＦ）」を用いた。また、ＴＧＦ－βのｍＲＮＡの定量には、プローブとして、同社の「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ－β（ＴＧＦ－β）」を用いた。一方、β－アクチンのｍＲＮＡ量の定量には、プローブとして、Ｓｉｇｍａ－Ａｒｄｒｉｃｈ社製の「ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ ｐｒｏｂｅ ＦＯＲ β－Ａｃｔｉｎ」を用いた。またチオレドキシン誘導剤として、ＳＦＮおよびｔＢＨＱを用いた。

【0080】

β－アクチンのｍＲＮＡ量には、変化が無いと考えられる。そこで、β－アクチンのｍＲＮＡ量に基づいて、ＣＴＧＦおよびＴＧＦ－βのｍＲＮＡ量を補正した。

【0081】

図５に試験結果を示す。図５において、「Ｎｏｎ ＡＫＩ」は、虚血再灌流障害を加えなかったマウスの試験結果を示し、「ＡＫＩ」は、虚血再灌流障害を加えたマウスの試験結果を示す。生理食塩水を注射したマウスでは、虚血再灌流障害を加えることによって、１４日後のＣＴＧＦのｍＲＮＡ量が増加した。一方、チオレドキシン誘導剤を注射したマウスでは、虚血再灌流障害を加えることによって生じる１４日後のＣＴＧＦのｍＲＮＡ量の増加が、抑制された。また、生理食塩水を注射したマウスでは、虚血再灌流障害を加えることによって、１４日後のＴＧＦ－βのｍＲＮＡ量も増加した。一方、チオレドキシン誘導剤を注射したマウスでは、虚血再灌流障害を加えることによって生じる１４日後のＴＧＦ－βのｍＲＮＡ量の増加が、抑制された。

【0082】

＜Ｃ．血清クレアチニンの濃度＞
腎臓の機能が正常であるか否かは、血液中に含まれる血清クレアチニンの濃度に基づいて判定することができる。血清クレアチニンの濃度は慢性腎臓病の診断基準となっている。そこで、採取した尿を用いて、血液中に含まれる血清クレアチニンの濃度を測定した。

【0083】

血清クレアチニンの濃度は、ＴＯＳＨＩＢＡ ＴＢＡ－２０００ＦＲを用い、公知の酵素法にしたがって測定した。

【0084】

図６に試験結果を示す。なお、図６において、「Ｎｏｎ－ＡＫＩ」は、虚血再灌流障害を加えなかったマウスの試験結果を示し、「ＡＫＩ－ｔｏ－ＣＫＤ」は、虚血再灌流障害を加えたマウスの試験結果を示す。生理食塩水を注射したマウスでは、虚血再灌流障害を加えることによって、１４日後の血液中に含まれる血清クレアチニンの濃度が上昇した。一方、チオレドキシン誘導剤を注射したマウスでは、生理食塩水を注射したマウスと比較して、虚血再灌流障害を加えたときに生じる１４日後の血液中に含まれる血清クレアチニンの濃度上昇が抑制された。
＜Ｄ．リン酸化ヒストンの濃度＞
チオレドキシン誘導剤が細胞周期をＧ_２期からＭ期へ進行させ、これによって、急性腎障害から慢性腎臓病への移行が抑制されるかを調べるために、腎臓の組織溶解液をウエスタンブロット法によって解析し、組織溶解液に含まれるリン酸化ヒストンＨ３タンパク質を抗リン酸化ヒストンＨ３抗体で検出した。検出されたシグナルの強度に基づいて、リン酸化ヒストンＨ３のタンパク質を定量化した。なお、β－アクチンを内因性のコントロールとして用い、抗リン酸化ヒストンＨ３抗体によって検出されたシグナルの強度を、抗β－アクチン抗体によって検出されたシグナルの強度にて除することによって、データの補正を行った。

【0085】

図７に試験結果を示す。なお、図７において、「Ｎｏｎ－ＡＫＩ」は、虚血再灌流障害を加えなかったマウスの試験結果を示し、「ＡＫＩ－ｔｏ－ＣＫＤ」は、虚血再灌流障害を加えたマウスの試験結果を示す。生理食塩水を注射したマウスでは、虚血再灌流障害を加えることによって、１４日後の腎臓に含まれるリン酸化ヒストンＨ３の濃度が上昇した。一方、チオレドキシン誘導剤を注射したマウスでは、生理食塩水を注射したマウスと比較して、虚血再灌流障害を加えたときに生じる１４日後の腎臓に含まれるリン酸化ヒストンＨ３の濃度上昇が抑制された。このことは、チオレドキシン誘導剤により腎細胞において細胞周期がＧ_２期からＭ期へ進行し、これによって、急性腎障害から慢性腎臓病への移行が抑制されていることを示している。

【産業上の利用可能性】

【0086】

本発明は、腎障害の予防および治療に利用することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】