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特許7573542インスリンの変動を改善するためのコーヒー生豆ベースの組成物の使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-17
(45)【発行日】2024-10-25
(54)【発明の名称】インスリンの変動を改善するためのコーヒー生豆ベースの組成物の使用
(51)【国際特許分類】
A23L 33/105 20160101AFI20241018BHJP
A23F 5/02 20060101ALI20241018BHJP
A23F 5/24 20060101ALI20241018BHJP
A23F 5/28 20060101ALI20241018BHJP
A61K 36/74 20060101ALI20241018BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20241018BHJP
【ＦＩ】
A23L33/105
A23F5/02
A23F5/24
A23F5/28
A61K36/74
A61P3/10
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2021557009
(86)(22)【出願日】2020-03-27
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-24
(86)【国際出願番号】 EP2020058696
(87)【国際公開番号】W WO2020193752
(87)【国際公開日】2020-10-01
【審査請求日】2023-03-07
(31)【優先権主張番号】19165522.4
(32)【優先日】2019-03-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】590002013
【氏名又は名称】ソシエテ・デ・プロデュイ・ネスレ・エス・アー
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100140453
【弁理士】
【氏名又は名称】戸津 洋介
(72)【発明者】
【氏名】アクティス ゴレッタ， ルーカス
(72)【発明者】
【氏名】チェン， ジャクリーン， ルイリン
(72)【発明者】
【氏名】ベル－リリッド， ラシッド
(72)【発明者】
【氏名】ウィローズ， ロビン
(72)【発明者】
【氏名】クラウス， マリン
(72)【発明者】
【氏名】シャベール， クリスチャン
【審査官】澤田 浩平
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１１－５２０４２９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１８－０３５０７３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００５－３３３９２７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５３３２８０（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１０／０１１２０９８（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ２３Ｌ ３３／１０５
Ａ２３Ｆ ５／０２
Ａ２３Ｆ ５／２４
Ａ２３Ｆ ５／２８
Ａ６１Ｋ ３６／７４
Ａ６１Ｐ ３／１０
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象における食後の血漿インスリンの増加に関連する疾患の処置又は予防に使用するための、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物（ＨＤＧＣＥ）を含むコーヒー生豆ベースの組成物であって、前記対象には、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物が、４０～２００ｍｇ／日の量を有効量として投与される、コーヒー生豆ベースの組成物。
【請求項2】
骨格筋細胞によるグルコースの取り込み速度が、対象において増加する、請求項１に記載の使用のための、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物（ＨＤＧＣＥ）を含むコーヒー生豆ベースの組成物。
【請求項3】
膵臓ベータ細胞のグルコース感受性が、対象において改善される、請求項１に記載の使用のための、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物（ＨＤＧＣＥ）を含むコーヒー生豆ベースの組成物。
【請求項4】
前記疾患が、糖尿病例えば妊娠糖尿病、グルコース代謝異常、高インスリン血症又はインスリン抵抗性からなる群から選択される、請求項１～３に記載の使用のための組成物。
【請求項5】
前記対象が、糖尿病患者又は前糖尿病患者である、請求項１～４に記載の使用のための組成物。
【請求項6】
前記組成物が、液体飲料組成物又は粉末又はスナックバーである、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項7】
コーヒー酸及びフェルラ酸の総含有量が１０～６０ｍｇであり、前記組成物が、熱処理された組成物であり得る、請求項６に記載の使用のための組成物。
【請求項8】
コーヒー酸：フェルラ酸の比が少なくとも２：１よりも大きい、請求項７に記載の使用のための組成物。
【請求項9】
コーヒー酸：フェルラ酸の比が３：１～１０：１の範囲である、請求項８に記載の使用のための組成物。
【請求項10】
前記対象が、ＨＤＧＣＥの投与に加えて、少なくとも２００ｋｃａｌの食事を更に補充される、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項11】
前記対象が、ヒトである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物を調製するための方法であって、（ｉ）コーヒー生豆を、水、蒸気、有機溶媒、超臨界ＣＯ２及び／又はこれらの混合物と接触させることによって、脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物を調製する工程と、
（ｉｉ）任意選択的に、前記脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物を乾燥させる工程と、
（ｉｉｉ）前記得られた脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物を、エステラーゼ酵素と、４～７の範囲のｐＨ及び２０～５０℃の範囲の温度で、１～６時間の範囲のインキュベーション時間にわたり接触させる工程と、
（ｉｖ）前記酵素処理されたコーヒー生豆抽出物を、８０～１２０℃の範囲の温度で１～３０分間加熱して、前記酵素を不活性化させ、前記抽出物を低温殺菌する工程と、
（ｖ）任意選択的に、前記抽出物を乾燥させて、前記エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物（ＨＤＧＣＥ）を得る工程と、
を含む、方法。
【請求項13】
前記乾燥工程（ｉｉ）が、噴霧乾燥又は凍結乾燥である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記エステラーゼ酵素が、１ｍＬの水又は緩衝液中に溶解したコーヒー生豆抽出物２００ｍｇあたり１～２０Ｕの範囲のＷ／Ｗ濃度のクロロゲネートエステラーゼである、請求項１２及び１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、対象における食後の血漿インスリンの増加に関連する疾患の処置又は予防に使用するための、加水分解したクロロゲン酸（ＨＤＧＣＥ）を含むコーヒー生豆ベースの組成物に関し、対象には、ＨＤＧＣＥが、４０～２００ｍｇ／日の範囲の量を有効量として投与される。
【背景技術】
【0002】
全世界において、約２億８０００万人の人々が２型糖尿病であると推定されている。発病率は世界の異なる地域において大きく異なるが、２型糖尿病はほぼ間違いなく、遺伝、栄養、環境、及び生活様式の要因によるものである。米国においては、概算で２１００万人の患者が糖尿病であると診断され、その９０％が２型糖尿病であり、更に８１０万人の人々が診断未確定の糖尿病罹患者であると推定されている。糖尿病は、米国における死因の第７位である。２０１２年に米国において糖尿病にかけられた費用の総額は２４５０億ドルであった。従来では、成人の疾患であると考えられてきた２型糖尿病であるが、小児での診断が増えている。この増加は、食事構成並びに生活習慣の変化に起因する小児の肥満率の上昇と同時に生じている。
【0003】
糖尿病の発症初期（ｅａｒｌｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）は、主に、食事に対するインスリンの応答、すなわち、より具体的には、第１相のインスリン放出が異常なものになり（Ｇｅｒｉｃｈ ＪＥ，２００２，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５１：Ｓ１１７－Ｓ１２１）、長時間にわたる高血糖が不可避となったときに見ることができる。続いて、慢性高血糖によってインスリン要求量が増加し、最終的にはベータ細胞が分泌機能不全となり、膵臓のベータ細胞が枯渇する（Ｐｏｒｔｅ ＤＪ，２００１，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｔａｂ Ｒｅｓ Ｒｅｖ，１７（３）：１８１－１８８）。インスリン分泌の機能不全は、肝臓及び抹消のインスリン作用の機能不全と並行して出現するものと考えられており、空腹時高血中インスリンを誘発するインスリン抵抗性として確認されている。インスリン分泌及びインスリン抵抗性が高まると、両者が協働して血中インスリンを上昇させ、２型糖尿病の発症に好都合な状態となる。結果として、食後インスリン血症の低減、及び適切な応答は、健康な対象又は前糖尿病患者の身体によってインスリンが適切に分泌され、適切に利用されていることの表示となり得る。この食後インスリン血症の低減により、膵臓の機能が保全され、同時にインスリン感受性が改善される。長期的には、食後のインスリン要求量を低減することにより、（１）前糖尿病患者における２型糖尿病発症のリスク、及び（２）２型糖尿病における血糖調節の悪化を低減することができる。
【0004】
Ｍｅｎｇらは、Ｅｖｉｄｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ａｎｄ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ：２０１３，ａｒｔｉｃｌｅｓ ＩＤ ８０１４５７として掲載されたレビュー論文において、グルコース及び脂質の代謝の調節におけるクロロゲン酸の役割について考察している。
【0005】
国際公開第２００９／１３２８８７号は、加水分解されたクロロゲン酸を含むコーヒー飲料を調製するための組成物に関する。
【0006】
米国特許出願公開第２０１５／０２５８０５５号は、コーヒー生豆抽出物を使用してコルチゾール値を調節するための方法に関する。
【0007】
米国特許出願公開第２０１５／０２０９３９９号は、コーヒー生豆抽出物を使用したデヒドロエピアンドロステロンの増強方法に関する。
【0008】
食品業界では、糖尿病患者、糖尿病発症のリスクがある対象、及びグルコース代謝に障害がある対象に提供する栄養学的解決策の更なる改善が依然として必要とされている。
【0009】
本発明の目的は、最新技術を改善し、患者、特に糖尿病患者又は前糖尿病患者における食後のインスリン変動（ｐｒｏｆｉｌｅ）を改善するための、新規のより良い栄養学的解決策を提供することである。
【0010】
本発明の更なる目的は、最新技術を改善し、かつ対象、特に、糖尿病患者又は前糖尿病患者の骨格筋細胞におけるグルコース取り込みを誘導するための、新規のより良い栄養溶液を提供することである。
【0011】
本発明の更なる目的は、最新技術を改善し、対象、特に、糖尿病患者又は前糖尿病患者対象におけるグルコース刺激に対するヒト膵臓ベータ細胞の感受性を改善するための新規のより良い栄養学的解決策を提供することである。
【0012】
本発明の目的は、独立請求項の主題によって達成される。従属請求項は、本発明の着想を更に展開するものである。
【0013】
「インスリン」は、食事に反応して膵臓のβ細胞によって分泌されるホルモンである。インスリンは、生体における炭水化物及び脂肪代謝制御の中核である。
【0014】
インスリン分泌促進性が高い栄養物は、β細胞を慢性的に刺激し、細胞の適応的な肥大及び進行性の調節異常を誘発し、その結果、食後高インスリン血症をもたらす。食後高インスリン血症は体重増加、脂肪沈着、並びにインスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、グルコース不耐性、及び２型糖尿病の発症を促進し得る（Ｋｏｐｐ Ｗ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．２００３，Ｊｕｌ；５２（７）：８４０－８４４）。
【0015】
［発明の概要］
一態様では、本発明は、対象における食後の血漿インスリンの増加に関連する疾患の処置又は予防に使用するための、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物（ＨＤＧＣＥ）を含むコーヒー生豆ベースの組成物に関し、当該対象には、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物が、４０～２００ｍｇ／日の量を有効量として投与される。
一態様では、本発明は、対象における食後の血漿インスリンの増加に関連する疾患の処置又は予防に使用するための、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物（ＨＤＧＣＥ）を含むコーヒー生豆ベースの組成物に関し、当該対象には、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物が、４０～２００ｍｇ／日の量を有効量として投与される。
【0016】
更なる態様では、本発明は、骨格筋におけるグルコース取り込みの増強に使用するための、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物（ＨＤＧＣＥ）を含むコーヒー生豆ベースの組成物に関し、当該対象には、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物が、４０～２００ｍｇ／日の量を有効量として投与される。
【0017】
更なる態様では、本発明は、膵臓ベータ細胞のグルコース感受性の改善に使用するための、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物（ＨＤＧＣＥ）を含むコーヒー生豆ベースの組成物に関し、当該対象には、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物が、４０～２００ｍｇ／日の量を有効量として投与される。
【0018】
本発明の一実施形態では、対象は、ＨＤＧＣＥの投与に加えて、少なくとも２００ｋｃａｌの食事を更に補充される。
【0019】
本発明者らは、驚くべきことに、ＨＤＧＣＥを含む組成物の摂取により、ＨＤＧＣＥを含まない組成物を摂取する対照群と比較して、対象における食後血漿インスリン応答が低減することを見出した。無作為化、二重盲検、クロスオーバー臨床試験の結果を、実施例の項に開示する。過去の研究では、対象の腸に依存するクロロゲン酸を使用して、クロロゲン酸を活性形態に変換してＨＤＧＣＥを模倣することを実証した。標準的な食物負荷後にＨＤＧＣＥを投与すると、無処置と比較して、血液中のインスリン値が有意に減少することが観察された。インスリンの有意な低減（約２０％）は血糖値には影響していないことから、ＨＤＧＣＥはインスリン感受性のみを変化させていることが示唆される。
【0020】
臨床試験において被験者にＨＤＧＣＥを投与した後に検出された血漿中代謝物の、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのグルコース取り込みに対する効果が、分化したマウスＣ２Ｃ１２骨格筋筋管で試験されている。各血漿代謝産物により筋管を処理したところ、対照処置群と比較して、グルコース取り込みにおいて倍率変化の増強が得られた。このデータは、ヒト患者にＤＨＧＣＥ抽出物を投与すると、臨床試験で観察されたインスリンレベルの低減に寄与し得る又はそれを部分的に説明し得る、骨格筋細胞における増強されたグルコース取り込みを誘発する能力を有する、血漿代謝産物の生成が起きることを示唆している。
【0021】
したがって、本発明は、第１の態様では、ＨＤＧＣＥ（加水分解され脱カフェイン処理されたコーヒー生豆抽出物）を少なくとも４０ｍｇ含む組成物を提供する。
【0022】
更なる態様では、本発明は、少なくとも４０ｍｇのＨＤＧＣＥを含む組成物の非治療目的の使用（ｎｏｎ－ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｕｓｅ）に関する。
【0023】
更に別の態様では、本発明は、
コーヒー生豆を水、蒸気、有機溶媒、超臨界ＣＯ２、及び／又はこれらの混合物と接触させることによって、脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物を調製する工程と、
任意選択的に、脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物を乾燥させる（噴霧乾燥又は凍結乾燥）工程と、
得られた脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物を、１ｍＬの水又は緩衝液に溶解したコーヒー生豆抽出物２００ｍｇあたり１～２０Ｕの範囲のＷ／Ｗ濃度のエステラーゼ酵素（クロロゲネートエステラーゼ）と、４～７の範囲のｐＨ、２０～５０℃の範囲の温度で、１～６時間の範囲のインキュベーション時間にわたり接触させる工程と、
上記の酵素処理したコーヒー生豆抽出物を、８０～１２０℃の範囲の温度で１～３０分間加熱して、酵素を不活性化させ、抽出物を低温殺菌する工程と、
任意選択的に、抽出物を乾燥させて、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物（ＨＤＧＣＥ）を得る工程と、を含む、ＨＤＧＣＥを製造するための方法に関する。
コーヒー生豆を水、蒸気、有機溶媒、超臨界ＣＯ２、及び／又はこれらの混合物と接触させることによって、脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物を調製する工程と、
任意選択的に、脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物を乾燥させる（噴霧乾燥又は凍結乾燥）工程と、
得られた脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物を、１ｍＬの水又は緩衝液に溶解したコーヒー生豆抽出物２００ｍｇあたり１～２０Ｕの範囲のＷ／Ｗ濃度のエステラーゼ酵素（クロロゲネートエステラーゼ）と、４～７の範囲のｐＨ、２０～５０℃の範囲の温度で、１～６時間の範囲のインキュベーション時間にわたり接触させる工程と、
上記の酵素処理したコーヒー生豆抽出物を、８０～１２０℃の範囲の温度で１～３０分間加熱して、酵素を不活性化させ、抽出物を低温殺菌する工程と、
任意選択的に、抽出物を乾燥させて、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物（ＨＤＧＣＥ）を得る工程と、を含む、ＨＤＧＣＥを製造するための方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】処置による曲線下面積（ＡＵＣ）、最大濃度（Ｃｍａｘ）、及び最大濃度までの時間（ｔｍａｘ）についての箱ひげ図を示す。
【図2】ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）エステラーゼ活性に対するｐＨの影響を示す。
【図3】ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）エステラーゼ活性に対するｐＨの影響を示す。
【図4】ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）エステラーゼの基質特異性を示している。４－ニトロフェニルブチレート（黒丸）、４－ニトロフェニルアセテート（黒ひし形）、４－ニトロフェニルデカノエート（黒三角）、４－ニトロフェニルテトラデカノエート（黒四角）、４－ニトロフェニルドデカノエート（横棒）。
【図5】時間経過に対応させて、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）エステラーゼ（１６．５Ｕ／ｍＬ）による、脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物（２００ｇ／Ｌ）からの、ＣＱＡｓ（黒丸）、ＦＱＡｓ（黒四角）、及びジ－ＣＱＡｓ（横棒）の変換速度（Ｋｉｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、並びにコーヒー酸（黒三角）及びフェルラ酸（黒ひし形）の形成を示す。反応体積は１ｍＬとした。反応は２連で実施した。
【図6】マウスＣ２Ｃ１２骨格筋筋管におけるグルコース取り込みにおいて、ＨＤＧＣＥ投与後に特定された、個々の血漿代謝産物の効果を示す。値は、対照ウェルに対する倍率変化として示し、２連又は３連の測定によって行われた少なくとも２つの独立した実験の平均である。エラーバーは、範囲又は標準誤差を示す。
【図7】ヒト擬似膵島におけるグルコース刺激によるインスリン分泌に関し、ＨＤＧＣＥ投与後に特定された個々の血漿代謝産物が示す効果を示す。個々のヒト擬似膵島は、ＤＭＳＯ ０．１％、１００ｎＭのＥｘｅｎｄｉｎ－４（陽性対照）又は１μＭの代謝産物のいずれかと組み合わせて、高グルコース溶液（１６．７ｍＭ）に２時間曝露した。効果を、それぞれによるインスリン分泌に関する効果を対照（ＤＭＳＯ ０．１％）と比較した効果（％）として表す。６回の実験の平均（平均±ＳＥＭ）を示している。
【発明を実施するための形態】
【0025】
本発明は、対象における食後の血漿インスリンの増加に関連する疾患の処置又は予防に使用するための、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物（ＨＤＧＣＥ）を含むコーヒー生豆ベースの組成物を含む組成物に関し、当該対象には、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物が、４０～２００ｍｇ／日の量を有効量として投与される。
【0026】
本発明は、更に、対象における骨格筋細胞におけるグルコース取り込みの誘導に使用するためのエステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物（ＨＤＧＣＥ）を含むコーヒー生豆ベースの組成物を含む組成物に関し、当該対象には、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物が、４０～２００ｍｇ／日の量を有効量として投与される。
【0027】
本発明は、更に、対象における膵臓ベータ細胞のグルコース感受性の改善に使用するための、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物（ＨＤＧＣＥ）を含むコーヒー生豆ベースの組成物を含む組成物に関し、当該対象には、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物が、４０～２００ｍｇ／日の量を有効量として投与される。
【0028】
一実施形態では、組成物は液体飲料組成物である。
【0029】
用語「疾患」は、糖尿病、例えば、妊娠糖尿病グルコース代謝異常、高インスリン血症又はインスリン抵抗性からなる群から選択される。一実施形態では、対象は糖尿病患者又は前糖尿病患者である。
【0030】
本発明の一実施形態では、ＨＤＧＣＥ組成物のコーヒー酸及びフェルラ酸の総含有量は１０～６０ｍｇの範囲である。組成物は、熱処理された組成物であってもよい。本発明の別の実施形態では、ＨＤＧＣＥ組成物が有するコーヒー酸：フェルラ酸比は、少なくとも２：１を超える。本発明の別の実施形態では、ＨＤＧＣＥ組成物は、コーヒー酸：フェルラ酸比は、３：１～１０：１の範囲である。
【0031】
用語「機能性食品製品」は、少なくとも４０～２００ｍｇのＨＤＧＣＥを含む飲料又は食品組成物を意味する。食品組成物は、チョコレート又は麦芽ベースの組成物などの粉末形態であり得る。食品組成物はまた、ＨＤＧＣＥを含むシリアルバーなどのスナックでもあり得る。
【0032】
用語「エステラーゼ処理された」は、脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物を、精製されたクロロゲネートエステラーゼ又はこのようなエステラーゼを含有する微生物と共にインキュベーションすることを指す。例えば、クロロゲネートエステラーゼは、米国特許第８，４８１，０２８号、又は、例えば、Ｂｅｌ－Ｒｈｌｉｄ ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｔｒａｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｆｆｅｏｙｌ ｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄｓ ｆｒｏｍ ｇｒｅｅｎ ｃｏｆｆｅｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｂｙ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＣ ５３３（２０１３）：ＡＭＢ ｅｘｐｒｅｓｓ ｖｏｌ ３：２８に記載されている。
【0033】
エステラーゼは、加水分解と呼ばれる水との化学反応によりエステルを酸及びアルコールへと分解する加水分解酵素である。インキュベーション時間は、脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物中に存在するクロロゲン酸全体の少なくとも８０％で加水分解が達成されるよう、酵素の濃度に関連して２０～５０℃の範囲の温度で３０分～６時間とすることができる。一実施形態では、エステラーゼは、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）由来である。
【0034】
用語「脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物／脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物」は、例えば、熱湯により、又は当業者に良く知られている有機溶媒若しくは超臨界ＣＯ２を用いた抽出により脱カフェイン処理されたコーヒー生豆を指す。カフェイン含有量は５％未満であり、２～３％Ｗ／Ｗであり得る。
【0035】
用語「４０～２００ｍｇ／日の量」は、乾燥重量で４０～２００ｍｇの、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物を指し、この量の抽出物は、例えば、水に溶解させることができ、あるいは摂取可能な食品製品に、例えば、シリアル、可溶性コーヒー、チョコレート、若しくは食時を補完するもの（ｆｏｏｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）、例えば、対象による摂取に適したカプセル若しくは錠剤に、組み込むことができる。一実施形態では、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物は、乾燥重量で４０～２００ｍｇの量で水に溶解される。
【0036】
典型的には、食後高インスリン血症は、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、グルコース不耐性、及び２型糖尿病の発症を促進し得る［Ｋｏｐｐ Ｗ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．２００３，Ｊｕｌ；５２（７）：８４０－８４４］。しかしながら、食後に要求されるインスリンを低減させることで、２型糖尿病の血糖管理の悪化を低減することができる他、素因のある対象において２型糖尿病が発症するリスクを低減できる。したがって、好都合なことに、上記したコーヒー生豆ベースの組成物は、糖尿病（例えば、２型糖尿病又は妊娠糖尿病）、グルコース代謝異常、高インスリン血症、又はインスリン抵抗性の処置又は予防に使用される。
【0037】
本発明の一実施形態では、コーヒー生豆ベースの組成物は、糖尿病患者又は前糖尿病患者に使用される。前糖尿病患者は、インスリン抵抗性又はグルコース代謝障害を示している患者であり、後年に糖尿病を発症する、例えば、家族歴、生活習慣、又は遺伝的特徴などの素因がある。インスリン分泌の低減は、長期的には膵臓が疲弊するリスクを低下させることから、前糖尿病の患者又は代謝疾患を有する患者における膵臓の管理にとって有益である。コーヒー生豆ベースの成分、特に、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物を４０～２００ｍｇ／日の量で含む組成物を使用すると、結果として、対象における糖尿病、グルコース代謝障害、高インスリン血症又はインスリン抵抗性のリスク及び／又は発症が低減されることになる。
【0038】
糖尿病、インスリン抵抗性、又はグルコース不耐性の罹患は主として成人において認められる。しかしながら、小児の罹患が増加しており、又は罹患しやすくなっており、若しくはこのような疾患を後年になって発症するリスクを有するようになっている。したがって、有利には、これらの障害の予防及び／又は処置は、若年齢で開始されるべきである。あるいは、ヒトにおいて観察されるのと同様に、糖尿病、高インスリン血症、又はインスリン抵抗性は、動物、特にペットとして飼育される動物においてもますます広がっている。したがって、本発明はまた、ネコ及びイヌにも関連する。
【0039】
本発明により使用するための組成物は、任意の好適なフォーマットであってよく、例えば、組成物は、液体組成物の形態、飲料の形態、例えば、液体飲料、シェイクドリンク、栄養組成物又は置換用流動食の形態であり得る。
【0040】
食品の衛生リスクを管理する重要な方法は、食物病原体又は腐敗生物が潜んでいる可能性のある食用組成物を熱処理することである。このような熱処理の良く知られている例には、例えば食用材料を、７０℃に２分間、又は７５℃に２６秒間、又は８０℃に５秒間加熱する低温殺菌、並びに例えば、食用材料を１３５℃超に少なくとも２秒間加熱する超高温（ＵＨＴ）処理がある。
【0041】
本発明により使用するための組成物は、個体に対し１日あたり乾燥重量で４０ｍｇ～２００ｍｇのＨＤＧＣＥを提供する１日用量で投与することができる。これらの用量は、少なくとも中期間の間、所望の効果を確実に提供するのに十分な１日用量でなくてはならない。
【0042】
本発明により使用するための組成物は、通常の食事の前、食事の一部として、又は通常の食事の終わりに提供され得る。例えば、組成物は、食事の前、食事の一部として、又は食事の終わりに提供することができ、この食事と組み合わせてインスリンの食後反応を低減することによる利益をもたらす。組成物を食事の終わりに、例えばデザートの一部として提供することにより、効果の改善が期待できる。
【0043】
本発明の更なる態様は、食後の血漿インスリン濃度を低減減少させるために、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物を４０～２００ｍｇ／日の量で含むコーヒー生豆ベースの組成物を、非治療的に使用することであり、コーヒー酸及びフェルラ酸の量は、コーヒー酸：フェルラ酸の比が、少なくとも２：１を超える、例えば、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１，８：１、９：１又は１０：１となる量である。
【0044】
エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物を４０～２００ｍｇ／日の量で含むコーヒー生豆ベースの組成物を、対象、例えば、それ以降のある時点で２型糖尿病、インスリン抵抗性、又はグルコース不耐性を発症するリスクがあり得る健康な対象に対して、投与できることも有益である。コーヒー生豆を含む組成物は、本明細書に開示のとおり、摂取後にインスリン値を低下させる。
【0045】
本発明の別の態様は、（ｉ）コーヒー生豆を水、蒸気、有機溶媒、超臨界ＣＯ２、及び／又はこれらの混合物と接触させることによって、脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物を調製する工程と、（ｉｉ）任意選択的に、脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物を乾燥させる工程と、（ｉｉｉ）得られた脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物を、エステラーゼ酵素と、４～７の範囲のｐＨ及び２０～５０℃の範囲の温度で、１～６時間の範囲のインキュベーション時間にわたり接触させる工程と、（ｉｖ）上記の酵素処理されたコーヒー生豆抽出物を、８０～１２０℃の範囲の温度で１～３０分間加熱して、酵素を不活性化させ、抽出物を低温殺菌する工程と、（ｖ）その抽出物を乾燥させて、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物（ＨＤＧＣＥ）を得る工程と、を含む、ＨＤＧＣＥ組成物を形成するための方法を提供する。一実施形態では、乾燥工程（ｉｉ）は、噴霧乾燥又は凍結乾燥である。別の実施形態では、エステラーゼ酵素は、１ｍＬの水又は緩衝液中に溶解したコーヒー生豆抽出物２００ｍｇあたり１～２０Ｕの範囲のＷ／Ｗ濃度のクロロゲネートエステラーゼである。
【0046】
当業者であれば、本明細書に開示される本発明の全ての特徴を自由に組み合わせることができることを理解されたい。特に、組成物の治療的使用について記載された特徴を非治療的使用と組み合わせることができ、逆もまた同様である。更に、本発明の異なる実施形態について記載された特徴を組み合わせてもよい。本発明の更なる利点及び特徴は、図面及び実施例から明らかである。
【実施例】
【0047】
実施例１
ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）（ＮＣＣ ５３３）からのエステラーゼの精製、特性評価及びクローニング
ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の全細胞においてエステラーゼ活性があることが確認された。酵素を精製し、特性評価した。遺伝子にアノテーションを行った（ＬＪ－１２２８、遺伝子＝１１５８６０１ １１５９３４７ 逆転写産物＝アルファ／ベータ加水分解酵素（以下の配列を参照されたい）。次に、この遺伝子を食品グレードの大腸菌において過剰発現させ、ＨＰＬＣによって酵素を精製した（ＨＩＣカラム ＴＳＫゲル フェニル－５ＰＷ、ＮａＰＯ４（５０ｍＭ）ｐＨ７．０＋１ｍＭ ＥＤＴＡ中の１～０ｍｏｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４／Ｌの直線勾配。
流量０．８ｍＬ／分）。
ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）（ＮＣＣ ５３３）からのエステラーゼの精製、特性評価及びクローニング
ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の全細胞においてエステラーゼ活性があることが確認された。酵素を精製し、特性評価した。遺伝子にアノテーションを行った（ＬＪ－１２２８、遺伝子＝１１５８６０１ １１５９３４７ 逆転写産物＝アルファ／ベータ加水分解酵素（以下の配列を参照されたい）。次に、この遺伝子を食品グレードの大腸菌において過剰発現させ、ＨＰＬＣによって酵素を精製した（ＨＩＣカラム ＴＳＫゲル フェニル－５ＰＷ、ＮａＰＯ４（５０ｍＭ）ｐＨ７．０＋１ｍＭ ＥＤＴＡ中の１～０ｍｏｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４／Ｌの直線勾配。
流量０．８ｍＬ／分）。
【0048】
ＤＮＡ配列／ヌクレオチド配列
Ａｔｇｇａｇａｃｔａｃａａｔｔａａａｃｇｔｇａｔｇｇｔｃｔａａａｃｔｔａｃａｔｇｇｔｔｔａｃｔｔｇａａｇｇａａｃｃｇａｔａａｇａｔｔｇａａａａｔｇａｔａｃｇａｔｔｇｃｔａｔｔｔｔａａｔｇｃａｔｇｇｔｔｔｔａａａｇｇｔｇａｔｔｔｇｇｇｔｔａｔｇａｔｇａｃａｇｃａａｇａｔｔｔｔｇｔａｔｇｃｔｃｔｃｔｃｔｃａｃｔａｃｔｔａａａｔｇａｔｃａａｇｇｃｃｔｃｃｃａａｃａａｔｔｃｇｔｔｔｔｇａｃｔｔｔｇａｔｇｇａｔｇｃｇｇａａａａａｇｔｇａｔｇｇｔａａａｔｔｔｇａａｇａｔａｔｇａｃｔｇｔｃｔａｔａｇｃｇａａａｔｃｃｔａｇａｔｇｇｇａｔａａａａａｔａｔｔａｇａｔｔａｔｇｔｔｃｇｔａａｔａｃｔｇｔｔａａｇｇｃａａａａｃａｔａｔｃｔａｔｔｔａｇｔｇｇｇａｃａｃｔｃｃｃａａｇｇｔｇｇａｇｔａｇｔａｇｃｇｔｃａａｔｇｃｔｇｇｃｔｇｇａｔａｔｔａｔｃｇａｇａｔｇｔｔａｔｔｇａａａａａｔｔｇｇｃｔｔｔａｃｔｃｔｃｔｃｃｔｇｃａｇｃａａｃｔｃｔｔａａｇｔｃｔｇａｔｇｃｔｔｔａｇａｔｇｇａｇｔｔｔｇｔｃａｇｇｇｔａｇｔａｃｔｔａｔｇａｔｃｃａａｃｇｃａｔａｔｃｃｃｔｇａａａｃｔｇｔｃａａｔｇｔｔａｇｔｇｇｃｔｔｔｇａａｇｔａｇｇａｇｇａｇｃｔｔａｃｔｔｔａｇａａｃｇｇｃｔｃａａｔｔａｔｔｇｃｃｔａｔｔｔａｔｃａａａｃａｇｃｇｇａａｃａｔｔａｔａａｔａｇｇｇａａａｃｔｔｔａｔｔｇａｔｔｃａｔｇｇｃｔｔａｇｃａｇａｔａａａｇｔｃｇｔｇｔｃａｃｃｔａａｔｇｃｔｔｃａａｇａａａａｔｔｔｃａｔａｃａｃｔｔｔｔｇｃｃｔａａａａｇｔｇａｇｃｔｃｃａｔｔｔａａｔｔｃｃａｇａｔｇａｇｇｇｔｃａｃａｔｇｔｔｔａａｃｇｇａａａａａａｔａｇａｃｃｔｇａａｇｔａｔｔａａａａｔｔａｇｔｔｇｇｔｇａｇｔｔｔｔｔａａｔａａａａｔａａ
アミノ酸配列
１ ｍｅｔｔｉｋｒｄｇｌ ｎｌｈｇｌｌｅｇｔｄ ｋｉｅｎｄｔｉａｉｌ ｍｈｇｆｋｇｄｌｄｙ ｄｄｓｋｉｌｙａｌｓ ｈｙｌｎｄｑｇｌｐｔ
６１ ｉｒｆｄｆｄｇｃｇｋ ｓｄｇｋｆｅｄｍｔｖ ｙｓｅｉｌｄｇｉｋｉ ｌｄｙｖｒｎｔｖｋａ ｋｈｉｙｌｖｇｈｓｑ ｇｇｖｖａｓｍｌａｇ
１２１ ｙｙｒｄｖｉｅｋｌａ ｌｌｓｐａａｔｌｋｓ ｄａｌｄｇｖｃｑｇｓ ｔｙｄｐｔｈｉｐｅｔ ｖｎｖｓｇｆｅｖｇｇ ａｙｆｒｔａｑｌｌｐ
１８１ ｉｙｑｔａｅｈｙｎｒ ｅｔｌｌｉｈｇｌａｄ ｋｖｖｓｐｎａｓｒｋ ｆｈｔｌｌｐｋｓｅｌ ｈｌｉｐｄｅｇｈｍｆ ｎｇｋｎｒｐｅｖｌｋ
２４１ ｌｖｇｅｆｌｉｋ
Ａｔｇｇａｇａｃｔａｃａａｔｔａａａｃｇｔｇａｔｇｇｔｃｔａａａｃｔｔａｃａｔｇｇｔｔｔａｃｔｔｇａａｇｇａａｃｃｇａｔａａｇａｔｔｇａａａａｔｇａｔａｃｇａｔｔｇｃｔａｔｔｔｔａａｔｇｃａｔｇｇｔｔｔｔａａａｇｇｔｇａｔｔｔｇｇｇｔｔａｔｇａｔｇａｃａｇｃａａｇａｔｔｔｔｇｔａｔｇｃｔｃｔｃｔｃｔｃａｃｔａｃｔｔａａａｔｇａｔｃａａｇｇｃｃｔｃｃｃａａｃａａｔｔｃｇｔｔｔｔｇａｃｔｔｔｇａｔｇｇａｔｇｃｇｇａａａａａｇｔｇａｔｇｇｔａａａｔｔｔｇａａｇａｔａｔｇａｃｔｇｔｃｔａｔａｇｃｇａａａｔｃｃｔａｇａｔｇｇｇａｔａａａａａｔａｔｔａｇａｔｔａｔｇｔｔｃｇｔａａｔａｃｔｇｔｔａａｇｇｃａａａａｃａｔａｔｃｔａｔｔｔａｇｔｇｇｇａｃａｃｔｃｃｃａａｇｇｔｇｇａｇｔａｇｔａｇｃｇｔｃａａｔｇｃｔｇｇｃｔｇｇａｔａｔｔａｔｃｇａｇａｔｇｔｔａｔｔｇａａａａａｔｔｇｇｃｔｔｔａｃｔｃｔｃｔｃｃｔｇｃａｇｃａａｃｔｃｔｔａａｇｔｃｔｇａｔｇｃｔｔｔａｇａｔｇｇａｇｔｔｔｇｔｃａｇｇｇｔａｇｔａｃｔｔａｔｇａｔｃｃａａｃｇｃａｔａｔｃｃｃｔｇａａａｃｔｇｔｃａａｔｇｔｔａｇｔｇｇｃｔｔｔｇａａｇｔａｇｇａｇｇａｇｃｔｔａｃｔｔｔａｇａａｃｇｇｃｔｃａａｔｔａｔｔｇｃｃｔａｔｔｔａｔｃａａａｃａｇｃｇｇａａｃａｔｔａｔａａｔａｇｇｇａａａｃｔｔｔａｔｔｇａｔｔｃａｔｇｇｃｔｔａｇｃａｇａｔａａａｇｔｃｇｔｇｔｃａｃｃｔａａｔｇｃｔｔｃａａｇａａａａｔｔｔｃａｔａｃａｃｔｔｔｔｇｃｃｔａａａａｇｔｇａｇｃｔｃｃａｔｔｔａａｔｔｃｃａｇａｔｇａｇｇｇｔｃａｃａｔｇｔｔｔａａｃｇｇａａａａａａｔａｇａｃｃｔｇａａｇｔａｔｔａａａａｔｔａｇｔｔｇｇｔｇａｇｔｔｔｔｔａａｔａａａａｔａａ
アミノ酸配列
１ ｍｅｔｔｉｋｒｄｇｌ ｎｌｈｇｌｌｅｇｔｄ ｋｉｅｎｄｔｉａｉｌ ｍｈｇｆｋｇｄｌｄｙ ｄｄｓｋｉｌｙａｌｓ ｈｙｌｎｄｑｇｌｐｔ
６１ ｉｒｆｄｆｄｇｃｇｋ ｓｄｇｋｆｅｄｍｔｖ ｙｓｅｉｌｄｇｉｋｉ ｌｄｙｖｒｎｔｖｋａ ｋｈｉｙｌｖｇｈｓｑ ｇｇｖｖａｓｍｌａｇ
１２１ ｙｙｒｄｖｉｅｋｌａ ｌｌｓｐａａｔｌｋｓ ｄａｌｄｇｖｃｑｇｓ ｔｙｄｐｔｈｉｐｅｔ ｖｎｖｓｇｆｅｖｇｇ ａｙｆｒｔａｑｌｌｐ
１８１ ｉｙｑｔａｅｈｙｎｒ ｅｔｌｌｉｈｇｌａｄ ｋｖｖｓｐｎａｓｒｋ ｆｈｔｌｌｐｋｓｅｌ ｈｌｉｐｄｅｇｈｍｆ ｎｇｋｎｒｐｅｖｌｋ
２４１ ｌｖｇｅｆｌｉｋ
【0049】
ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）エステラーゼの最適ｐＨの特定
最適ｐＨは、グリシン緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液及び水を使用することによって決定した。５－ＣＱＡを基質として使用した（５０μｍｏｌ／ｍＬ）。図２に見ることができるように、酵素の最適ｐＨは４．０～６．０であった。この反応は、精製したエステラーゼ（０．０１Ｕ／ｍｇ基質）を使用して３７℃で３０分間実施した。
最適ｐＨは、グリシン緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液及び水を使用することによって決定した。５－ＣＱＡを基質として使用した（５０μｍｏｌ／ｍＬ）。図２に見ることができるように、酵素の最適ｐＨは４．０～６．０であった。この反応は、精製したエステラーゼ（０．０１Ｕ／ｍｇ基質）を使用して３７℃で３０分間実施した。
【0050】
ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）のエステラーゼの最適温度の特定
最適温度は、１０℃～９０℃の様々な温度で、基質として５－ＣＱＡ（５０μｍｏｌ／ｍＬ）を使用することによって決定した。図３に見ることができるように、酵素の最適温度は３０℃～４０℃であった。反応は、精製されたエステラーゼ（０．０１Ｕ／ｍｇ基質）を使用してｐＨ５．０で３０分間実施した。
最適温度は、１０℃～９０℃の様々な温度で、基質として５－ＣＱＡ（５０μｍｏｌ／ｍＬ）を使用することによって決定した。図３に見ることができるように、酵素の最適温度は３０℃～４０℃であった。反応は、精製されたエステラーゼ（０．０１Ｕ／ｍｇ基質）を使用してｐＨ５．０で３０分間実施した。
【0051】
基質特異性
様々な４－ニトロフェニル誘導体を使用して、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）のエステラーゼの基質特異性を試験した。図４に見ることができるように、４－ニトロフェニルブチレートが最良の基質である一方で、４－ニトロフェニルドデカノエートの変換は観察されなかった。反応は、ｐＨ６．０のリン酸ナトリウム緩衝液で３７℃で１０分間実施した。基質は０．２ｍＭの濃度で使用し、酵素は基質１ｍｇ当たり０．０１Ｕで使用した。測定は３０秒ごとにモニターした。吸光度は４１０ｎｍに設定した。
様々な４－ニトロフェニル誘導体を使用して、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）のエステラーゼの基質特異性を試験した。図４に見ることができるように、４－ニトロフェニルブチレートが最良の基質である一方で、４－ニトロフェニルドデカノエートの変換は観察されなかった。反応は、ｐＨ６．０のリン酸ナトリウム緩衝液で３７℃で１０分間実施した。基質は０．２ｍＭの濃度で使用し、酵素は基質１ｍｇ当たり０．０１Ｕで使用した。測定は３０秒ごとにモニターした。吸光度は４１０ｎｍに設定した。
【0052】
ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）エステラーゼによる脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物の処理
反応速度論：実験室規模での試験
脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物（２００ｍｇ／ｍＬ）に対して、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）エステラーゼを様々な濃度（１．６５、３．３、４．９５、８．２５及び１６．２５Ｕ／ｍＬ）で使用して反応速度試験を実施した。反応は、ｐＨ４．５及び３７℃で１ｍＬの体積で実施した。結果を以下の表に要約する。各化合物の濃度はｍｇ／ｍＬ単位である。
反応速度論：実験室規模での試験
脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物（２００ｍｇ／ｍＬ）に対して、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）エステラーゼを様々な濃度（１．６５、３．３、４．９５、８．２５及び１６．２５Ｕ／ｍＬ）で使用して反応速度試験を実施した。反応は、ｐＨ４．５及び３７℃で１ｍＬの体積で実施した。結果を以下の表に要約する。各化合物の濃度はｍｇ／ｍＬ単位である。
【0053】
【表1】
【0054】
【表2】
【0055】
【表3】
【0056】
【表4】
【0057】
【表5】
【0058】
時間経過と反応速度との対応
脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物（２００ｍｇ／ｍＬ）に対して、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）エステラーゼを、１６．２５Ｕ／ｍＬの濃度で使用して反応速度試験を実施した。反応は、１ｍＬの反応体積でｐＨ４．５及び３７℃で実施した。反応速度試験は１、２、３及び４時間実施した。各化合物の濃度はｍｇ／ｍＬ単位である。
脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物（２００ｍｇ／ｍＬ）に対して、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）エステラーゼを、１６．２５Ｕ／ｍＬの濃度で使用して反応速度試験を実施した。反応は、１ｍＬの反応体積でｐＨ４．５及び３７℃で実施した。反応速度試験は１、２、３及び４時間実施した。各化合物の濃度はｍｇ／ｍＬ単位である。
【0059】
酵素濃度と反応速度との対応
脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物（２００ｍｇ／ｍＬ）に対して、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）のエステラーゼを様々な濃度（５、１０、１５、２５及び５０μｌ／ｍＬがそれぞれ１．６５、３．３、４．９５、８．２５及び１６．５Ｕ／ｍＬに対応）で使用して反応速度試験を実施した。反応は、１ｍＬの体積でｐＨ４．５及び３７℃で実施した（図５を参照されたい）。反応時間は４時間とした。各化合物の濃度はｍｇ／ｍＬ単位である。
脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物（２００ｍｇ／ｍＬ）に対して、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）のエステラーゼを様々な濃度（５、１０、１５、２５及び５０μｌ／ｍＬがそれぞれ１．６５、３．３、４．９５、８．２５及び１６．５Ｕ／ｍＬに対応）で使用して反応速度試験を実施した。反応は、１ｍＬの体積でｐＨ４．５及び３７℃で実施した（図５を参照されたい）。反応時間は４時間とした。各化合物の濃度はｍｇ／ｍＬ単位である。
【0060】
パイロットプラント試験
脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物の、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）エステラーゼによる処理
脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物（１．７６Ｋｇ）を、撹拌下で水（８．８Ｋｇ）に溶解した。次に、塩酸（ＨＣｌ、０．３６Ｋｇ）を添加してｐＨ４．５に調整した。この溶液に、０．０２４ｋｇの酵素（ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）由来のエストラーゼ）を２回に分けて添加した。すなわち、Ｔ＝０ｈの時点で０．０１６ｋｇの酵素を添加し、及び３時間反応させた後に０．００８ｋｇの酵素を添加した。反応を３７℃で６時間行った。次に、混合物を９８℃で１０分間加熱して、酵素を不活性化した。遠心分離（５０００ｇで２分）及び濾過（０．４５μｍ）後に、混合物を凍結乾燥した。得られた粉末を、臨床試験に使用する飲料の調製に使用した。
脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物の、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）エステラーゼによる処理
脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物（１．７６Ｋｇ）を、撹拌下で水（８．８Ｋｇ）に溶解した。次に、塩酸（ＨＣｌ、０．３６Ｋｇ）を添加してｐＨ４．５に調整した。この溶液に、０．０２４ｋｇの酵素（ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）由来のエストラーゼ）を２回に分けて添加した。すなわち、Ｔ＝０ｈの時点で０．０１６ｋｇの酵素を添加し、及び３時間反応させた後に０．００８ｋｇの酵素を添加した。反応を３７℃で６時間行った。次に、混合物を９８℃で１０分間加熱して、酵素を不活性化した。遠心分離（５０００ｇで２分）及び濾過（０．４５μｍ）後に、混合物を凍結乾燥した。得られた粉末を、臨床試験に使用する飲料の調製に使用した。
【0061】
ＵＰＬＣ分析
試料の分析には、焙煎豆又は生豆のいずれかから抽出された、コーヒー抽出液及びピュア（ｐｕｒｅ）な可溶性コーヒー中のコーヒー酸、クロロゲン酸異性体（５－ＣＱＡ、４－ＣＱＡ、３－ＣＱＡ、４－ＦＱＡ、５－ＦＱＡ、３，４－ジＣＱＡ、３，５－ジＣＱＡ及び４，５－ジＣＱＡ）及びカフェインを定量的に測定することができる方法を使用した。試料を１５℃で５分間遠心分離した（５０００ｇ）。得られた上清１００μＬを９００μＬのメタノール／水（８０：２０）に加え、分析前に０．２μｍで濾過した。分析は、ポンプ、脱気システム、５μＬを超える注入ループを有する試料インジェクタ、フォトダイオードアレイ検出器（波長３２５ｎｍ及び２７５ｎｍ）及び適切なデータソフトウェアを備えたＵＰＬＣで行った。分子の分離は、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｓｈｉｅｌｄ ＲＰ １８カラム、１．７μｍ、２．１ｘ１００ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）で行った。移動相Ａは、０．１％リン酸を添加した５％アセトニトリル水溶液とし、移動相Ｂは、０．１％リン酸を添加した１００％アセトニトリルとした。流量０．４ｍＬ／分、カラム温度３５℃、注入量２μＬとした。
試料の分析には、焙煎豆又は生豆のいずれかから抽出された、コーヒー抽出液及びピュア（ｐｕｒｅ）な可溶性コーヒー中のコーヒー酸、クロロゲン酸異性体（５－ＣＱＡ、４－ＣＱＡ、３－ＣＱＡ、４－ＦＱＡ、５－ＦＱＡ、３，４－ジＣＱＡ、３，５－ジＣＱＡ及び４，５－ジＣＱＡ）及びカフェインを定量的に測定することができる方法を使用した。試料を１５℃で５分間遠心分離した（５０００ｇ）。得られた上清１００μＬを９００μＬのメタノール／水（８０：２０）に加え、分析前に０．２μｍで濾過した。分析は、ポンプ、脱気システム、５μＬを超える注入ループを有する試料インジェクタ、フォトダイオードアレイ検出器（波長３２５ｎｍ及び２７５ｎｍ）及び適切なデータソフトウェアを備えたＵＰＬＣで行った。分子の分離は、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｓｈｉｅｌｄ ＲＰ １８カラム、１．７μｍ、２．１ｘ１００ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）で行った。移動相Ａは、０．１％リン酸を添加した５％アセトニトリル水溶液とし、移動相Ｂは、０．１％リン酸を添加した１００％アセトニトリルとした。流量０．４ｍＬ／分、カラム温度３５℃、注入量２μＬとした。
【0062】
臨床試験
ＨＤＧＣＥを、プラセボ（交差、ランダム化、単一盲検）と比較して、グルコース応答（ＧＲ）及びインスリン応答（ＩＲ）について試験した。合計１２人の被験者が試験に参加した。各被験者は、１０～１４時間一晩絶食した後、２日に分けて午前７時３０分から午後３時の間に研究施設を訪問した。
ＨＤＧＣＥを、プラセボ（交差、ランダム化、単一盲検）と比較して、グルコース応答（ＧＲ）及びインスリン応答（ＩＲ）について試験した。合計１２人の被験者が試験に参加した。各被験者は、１０～１４時間一晩絶食した後、２日に分けて午前７時３０分から午後３時の間に研究施設を訪問した。
【0063】
両日の訪問において以下を行った：
被験者には、試験セッション全体を通して静かに着座した状態を維持させた。被験者は、試験前の２４時間に、喫煙、飲酒、コーヒー（いかなる形態でも）の摂取を行わなかった、又は普段行わない激しい身体活動に一切参加しなかった。被験者（ボランティア）が研究施設に到着したところで、採血のためにカニューレを静脈内に挿入した。空腹状態で５ｍＬの全血を採取した。次に、被験者は標準化された食物負荷試験を受けた。最近では、Ｓｔｒｏｅｖｅら（１３）による栄養調査において、経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）と同様の最適な栄養ストレッサーとして、混合主要栄養素負荷試験の使用が提案されている。食物負荷試験は、研究スタッフが２つの市販製品により準備した。簡潔に述べると、２３７．５ｍＬの栄養飲料と１００ｍＬのホイップクリームとを撹拌し、グラス／ボトルで提供した。被験者には、食物負荷の摂取後、１５分の時間枠内で処置を受けるよう求めた。食物負荷の摂取後、１５分、３０分、４５分、６０分（１時間）、９０分（１．５時間）、１２０分（２時間）、１８０分（３時間）、２４０分（４時間）、３００分（５時間）及び３６０分（６時間）の時点で更なる静脈血試料（３ｍＬ）を採取した。処置の投与の間には最低２日間のウォッシュアウト期間を取った。
被験者には、試験セッション全体を通して静かに着座した状態を維持させた。被験者は、試験前の２４時間に、喫煙、飲酒、コーヒー（いかなる形態でも）の摂取を行わなかった、又は普段行わない激しい身体活動に一切参加しなかった。被験者（ボランティア）が研究施設に到着したところで、採血のためにカニューレを静脈内に挿入した。空腹状態で５ｍＬの全血を採取した。次に、被験者は標準化された食物負荷試験を受けた。最近では、Ｓｔｒｏｅｖｅら（１３）による栄養調査において、経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）と同様の最適な栄養ストレッサーとして、混合主要栄養素負荷試験の使用が提案されている。食物負荷試験は、研究スタッフが２つの市販製品により準備した。簡潔に述べると、２３７．５ｍＬの栄養飲料と１００ｍＬのホイップクリームとを撹拌し、グラス／ボトルで提供した。被験者には、食物負荷の摂取後、１５分の時間枠内で処置を受けるよう求めた。食物負荷の摂取後、１５分、３０分、４５分、６０分（１時間）、９０分（１．５時間）、１２０分（２時間）、１８０分（３時間）、２４０分（４時間）、３００分（５時間）及び３６０分（６時間）の時点で更なる静脈血試料（３ｍＬ）を採取した。処置の投与の間には最低２日間のウォッシュアウト期間を取った。
【0064】
０分、１５分、３０分、４５分、６０分（１時間）、９０分（１．５時間）、１２０分（２時間）、１８０分（３時間）、２４０分（４時間）、３００分（５時間）及び３６０分（６時間）の時点で採取した血液試料を、血糖及びインスリンについて分析した。グルコース及びラクテート分析器である、較正したＹＳＩ ２３００ Ｓｔａｔ Ｐｌｕｓを使用して血糖を分析し、Ｉｎｓｕｌｉｎ（ｈｕｍａｎ）ＡｌｐｈａＬＩＳＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔによってインスリンを測定し、ＥｎＳｐｉｒｅ Ａｌｐｈａ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒによって読み取った。グルコース値及びインスリン値を時間に対してプロットして、曲線下増分面積（Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ Ｃｕｒｖｅ，ＩＡＵＣ）を測定した。
【0065】
統計的考察
全てのデータを対数変換して、モデルにおける残差の正規化を達成した。したがって、全ての処置効果は、幾何平均の比として表される。幾何平均は中央値の推定値である。表２では、モデルベースの処置効果が１未満の場合、推定値（ＡＵＣ又はＣｍａｘ）はプラセボ群の方が高い。比が１より大きい場合、推定値は、コーヒー抽出物群の方が高い。ＡＵＣ及びＣｍａｘは、それぞれ、増分ＡＵＣ及び増分Ｃｍａｘを指す。
全てのデータを対数変換して、モデルにおける残差の正規化を達成した。したがって、全ての処置効果は、幾何平均の比として表される。幾何平均は中央値の推定値である。表２では、モデルベースの処置効果が１未満の場合、推定値（ＡＵＣ又はＣｍａｘ）はプラセボ群の方が高い。比が１より大きい場合、推定値は、コーヒー抽出物群の方が高い。ＡＵＣ及びＣｍａｘは、それぞれ、増分ＡＵＣ及び増分Ｃｍａｘを指す。
【0066】
ｔｍａｘでの処置効果は、ノンパラメトリック統計検定であるウィルコクソンの符号順位検定を使用して推定した。表２に示したｔｍａｘの推定値は、処置群間で中央値の差を推定するホッジス・レーマン推定値である。
インスリン
インスリン
【0067】
【表6】
【0068】
表２：９５％ＣＩでモデルベースで推定される処置効果
ＡＵＣ及びＣｍａｘでは、報告された推定値は、プラセボに対するコーヒー抽出物の幾何平均の比である。ｔｍａｘでは、コーヒー抽出物とプラセボとの間の中央値の差に関する推定値を報告された。
ＡＵＣ及びＣｍａｘでは、報告された推定値は、プラセボに対するコーヒー抽出物の幾何平均の比である。ｔｍａｘでは、コーヒー抽出物とプラセボとの間の中央値の差に関する推定値を報告された。
【0069】
【表7】
【0070】
【表8】
【0071】
【表9】
【0072】
本発明者らによる発見により、１２人の被験者において、栄養学的食物負荷試験後に、ＨＤＧＣＥの単回摂取が血漿中のインスリン濃度を有意に約２０％低下させたことが示された（ｐ＝０．０２）（表１、表２、及び表３を参照されたい）。血漿中グルコース濃度は、加水分解された脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物、又はプラセボの単回摂取の間で、なんら差はなかった（表４）。しかしながら、ｉｎ ｖｉｔｒｏのデータでは、代謝産物が骨格筋細胞のグルコース取り込みを増加させることが示されている。したがって、本発明者らは、加水分解された脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物は、ヒトにおいてインスリン感受性を改善すると結論付けた。結果はまた、ＨＤＧＣＥとプラセボとを比較して、インスリンＡＵＣ（ｍｍｏｌ＊分／Ｌ）（ｐ＝０．０７）においてほぼ統計的に有意な差があることを示した（図１、表２参照）。
【0073】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験：グルコース取り込み
マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞を、２０％ウシ胎児血清（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、５０μＭパルミテート、０．３％ウシ血清アルブミン、並びに１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充してＧｌｕｔａＭＡＸを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（４．５ｇ／Ｌグルコース）で増殖させ、５％二酸化炭素下、３７℃で維持した。細胞を播種し、１％ウマ血清（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、５０μＭパルミテート、０．３％ウシ血清アルブミン、並びに１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充してＧｌｕｔａＭＡＸを添加したＤＭＥＭ （４．５ｇ／Ｌグルコース）中で分化させて筋管を形成した。分化した筋管は、ＧｌｕｔａＭＡＸ、５０μＭパルミテート、０．３％ウシ血清アルブミンを添加した無血清ＤＭＥＭ（４．５ｇ／Ｌグルコース中）において、１０μＭの個々の血漿代謝産物及び０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ジメチルスルホキシドで、５％二酸化炭素と共に３７℃で１８時間、処理した。細胞を、２ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０μＭパルミテート、１０μＭの０．３％ウシ血清アルブミン及び化合物並びに０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ジメチルスルホキシドを添加したｋｒｅｂｓ－ｒｉｎｇｅｒｓ－ｈｅｐｅｓ緩衝液（１４０ｍＭ塩化ナトリウム、４．７ｍＭ塩化カリウム、２．５ｍＭ塩化カルシウム、１．２５ｍＭ硫酸マグネシウム、１．２ｍＭ二水素リン酸カリウム、１０ｍＭの４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－エタンスルホン酸 ｐＨ７．４）に移し、５％二酸化炭素下で３７℃で４時間置いた。次に、［３Ｈ］２－デオキシグルコースを含有する５０μＭの２－デオキシグルコースを、５％二酸化炭素下、３７℃で５分間、細胞に添加した。２５ｍＭのグルコースを添加して反応を停止させた。この筋管を、リン酸緩衝生理食塩水で十分に洗浄し、０．１Ｍ水酸化ナトリウム中で溶解させ、取り込まれていた放射線標識の量を、液体シンチレーション計数によって検出した。取り込まれていた［３Ｈ］２－デオキシグルコースの量の変化を、対照ウェルと比較して求め、倍率変化として示した。十分に知られているＡＭＰＫ活性化因子（本明細書では「ａ１」として示される）による陽性対照処理を、全処理期間にわたって５μＭで実施した。インスリンを１０ｎＭでＫＲＨ緩衝液に添加して４時間置いた。
マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞を、２０％ウシ胎児血清（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、５０μＭパルミテート、０．３％ウシ血清アルブミン、並びに１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充してＧｌｕｔａＭＡＸを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（４．５ｇ／Ｌグルコース）で増殖させ、５％二酸化炭素下、３７℃で維持した。細胞を播種し、１％ウマ血清（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、５０μＭパルミテート、０．３％ウシ血清アルブミン、並びに１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充してＧｌｕｔａＭＡＸを添加したＤＭＥＭ （４．５ｇ／Ｌグルコース）中で分化させて筋管を形成した。分化した筋管は、ＧｌｕｔａＭＡＸ、５０μＭパルミテート、０．３％ウシ血清アルブミンを添加した無血清ＤＭＥＭ（４．５ｇ／Ｌグルコース中）において、１０μＭの個々の血漿代謝産物及び０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ジメチルスルホキシドで、５％二酸化炭素と共に３７℃で１８時間、処理した。細胞を、２ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０μＭパルミテート、１０μＭの０．３％ウシ血清アルブミン及び化合物並びに０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ジメチルスルホキシドを添加したｋｒｅｂｓ－ｒｉｎｇｅｒｓ－ｈｅｐｅｓ緩衝液（１４０ｍＭ塩化ナトリウム、４．７ｍＭ塩化カリウム、２．５ｍＭ塩化カルシウム、１．２５ｍＭ硫酸マグネシウム、１．２ｍＭ二水素リン酸カリウム、１０ｍＭの４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－エタンスルホン酸 ｐＨ７．４）に移し、５％二酸化炭素下で３７℃で４時間置いた。次に、［３Ｈ］２－デオキシグルコースを含有する５０μＭの２－デオキシグルコースを、５％二酸化炭素下、３７℃で５分間、細胞に添加した。２５ｍＭのグルコースを添加して反応を停止させた。この筋管を、リン酸緩衝生理食塩水で十分に洗浄し、０．１Ｍ水酸化ナトリウム中で溶解させ、取り込まれていた放射線標識の量を、液体シンチレーション計数によって検出した。取り込まれていた［３Ｈ］２－デオキシグルコースの量の変化を、対照ウェルと比較して求め、倍率変化として示した。十分に知られているＡＭＰＫ活性化因子（本明細書では「ａ１」として示される）による陽性対照処理を、全処理期間にわたって５μＭで実施した。インスリンを１０ｎＭでＫＲＨ緩衝液に添加して４時間置いた。
【0074】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験：インスリン分泌
３Ｄ ＩｎＳｉｇｈｔ（商標）ヒト膵島マイクロティッシュは、ＩｎＳｐｈｅｒｏ ＡＧ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手した。受領時に、グルコース刺激によるインスリン分泌の測定のため擬似膵島を製造業者の指示に従って処理した。簡単に説明すると、分離している（ｉｓｏｌａｔｅｄ）擬似膵島を注意深く２回洗浄し、１３１ｍＭ ＮａＣｌ、４．８ｍＭ ＫＣｌ、１．３ｍＭ ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２．８ｍＭ グルコース及び０．５％ＢＳＡを含有する改変Ｋｒｅｂｓ－Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液（ＫＲＢ）中で、低グルコースで１時間インキュベートした。この溶液をＬＧＳ（低グルコース溶液、２．８ｍＭ）と呼ぶ。次に、単離した膵島を、ＬＧＳで慎重に洗浄し、最終濃度１μｍの試験物質の存在下、１６．７ｍＭのグルコース、０．５％のＢＳＡを含有する新鮮なＫＲＢ中で２時間インキュベートした。上清及び細胞抽出物［酸エタノール（７０％（ｖ／ｖ）エタノール中１．５％（ｖ／ｖ）ＨＣｌ）により抽出］中のインスリン濃度の測定を、高感度化学発光酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ；ＡｌＰＣＯ，Ｓａｌｅｍ，ＮＨ ０３０７９）を使用して実施した。ヒト膵島を用いた全ての実験は、ヒト研究法における倫理委員会（Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｃｔ）（スイス）によって承認を受けている。
３Ｄ ＩｎＳｉｇｈｔ（商標）ヒト膵島マイクロティッシュは、ＩｎＳｐｈｅｒｏ ＡＧ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手した。受領時に、グルコース刺激によるインスリン分泌の測定のため擬似膵島を製造業者の指示に従って処理した。簡単に説明すると、分離している（ｉｓｏｌａｔｅｄ）擬似膵島を注意深く２回洗浄し、１３１ｍＭ ＮａＣｌ、４．８ｍＭ ＫＣｌ、１．３ｍＭ ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２．８ｍＭ グルコース及び０．５％ＢＳＡを含有する改変Ｋｒｅｂｓ－Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液（ＫＲＢ）中で、低グルコースで１時間インキュベートした。この溶液をＬＧＳ（低グルコース溶液、２．８ｍＭ）と呼ぶ。次に、単離した膵島を、ＬＧＳで慎重に洗浄し、最終濃度１μｍの試験物質の存在下、１６．７ｍＭのグルコース、０．５％のＢＳＡを含有する新鮮なＫＲＢ中で２時間インキュベートした。上清及び細胞抽出物［酸エタノール（７０％（ｖ／ｖ）エタノール中１．５％（ｖ／ｖ）ＨＣｌ）により抽出］中のインスリン濃度の測定を、高感度化学発光酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ；ＡｌＰＣＯ，Ｓａｌｅｍ，ＮＨ ０３０７９）を使用して実施した。ヒト膵島を用いた全ての実験は、ヒト研究法における倫理委員会（Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｃｔ）（スイス）によって承認を受けている。
【0075】
【表10】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】