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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-18
(45)【発行日】2024-10-28
(54)【発明の名称】ＰＥＤＦ由来短ペプチドを含む組成物およびその使用
(51)【国際特許分類】
A61K 38/16 20060101AFI20241021BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20241021BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20241021BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20241021BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20241021BHJP
A61P 27/04 20060101ALI20241021BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20241021BHJP
【ＦＩ】
A61K38/16
A61K9/06
A61K9/08
A61K38/10
A61P27/02
A61P27/04
C07K14/47 ZNA
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2019540514
(86)(22)【出願日】2017-08-24
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-11-21
(86)【国際出願番号】 US2017048340
(87)【国際公開番号】W WO2018067244
(87)【国際公開日】2018-04-12
【審査請求日】2020-08-20
【審判番号】
【審判請求日】2022-09-30
(31)【優先権主張番号】62/405,522
(32)【優先日】2016-10-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】519124338
【氏名又は名称】ブリム バイオテクノロジー インク
【氏名又は名称原語表記】ＢＲＩＭ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ， ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】８Ｆ， Ｎｏ．１， Ａｌｌｅｙ ３０， Ｌａｎｅ ３５８ Ｒｕｉｇｕａｎｇ Ｒｄ．， Ｎｅｉｈｕ Ｄｉｓｔ． Ｔａｉｐｅｉ， １１４９２ （ＴＷ）
(74)【代理人】
【識別番号】100116850
【弁理士】
【氏名又は名称】廣瀬 隆行
(72)【発明者】
【氏名】リー フランク ウェン－チー
(72)【発明者】
【氏名】リン クァンユィン カレン
(72)【発明者】
【氏名】ツァオ ヨウ－ピン
(72)【発明者】
【氏名】ホ ツォン‐チュアン
【合議体】
【審判長】冨永 みどり
【審判官】岡山 太一郎
【審判官】山村 祥子
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０１８３８３２（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
A61K
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）由来のＰＥＤＦフラグメントおよび製薬上許容される賦形剤を含む、眼疾患を予防および／または治療するための医薬組成物であって、前記ＰＥＤＦフラグメントは、配列番号４のアミノ酸配列を含む２９－４４アミノ酸残基長を有し、
前記眼疾患は、ドライアイ症候群である、
医薬組成物。
【請求項2】
前記ＰＥＤＦフラグメントが、Ｎ末端のアセチル化で修飾されているか、またはＣ末端のアミド化で修飾されている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記ＰＥＤＦフラグメントの濃度が１０～２００μΜである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記組成物が、溶液、軟膏、またはゲルの形態である、請求項２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【0001】
本願は、２０１６年１０月７日出願の米国特許出願第６２／４０５，５２２号の優先権を主張し、その開示は参照によりその全文が本明細書に援用される。
【技術分野】
【0002】
本発明は、ＰＥＤＦ由来短ペプチドならびに眼疾患、特にドライアイ疾患の治療および／または寛解におけるその使用に関する。
【背景技術】
【0003】
ドライアイ疾患または症候群（ＤＥＤまたはＤＥＳ）は、乾性角結膜炎としても公知であって、不快感、視覚障害、および眼表面の損傷の可能性を生じる涙膜不安定性の症状をもたらす複合疾患である。ドライアイは、涙膜の浸透圧の増加および眼表面の炎症を伴う。ドライアイの徴候／症状の重症度はまた、患者によって大きく異なる。軽度の刺激だけを患っている患者もいれば、重度の角膜損傷および視覚障害につながる重大な合併症を経験している患者もいる。
【0004】
ドライアイ疾患（ＤＥＤ）またはドライアイ症候群（ＤＥＳ）は、乾性角結膜炎としても公知であり、涙膜の組成（脂質、水、およびムチン）、眼表面または涙液の産生に影響を及ぼす多因子性眼表面障害である。眼の乾燥、フォージングのような身体感覚（ｆｏｒｇｉｎｇ ｂｏｄｙ ｓｅｎｓａｔｉｏｎ）、刺激および疼痛をもたらす。ＤＥＤは、様々な原因から生じ得、それは涙液の組成のいずれかの産生、または涙膜の安定性に影響を及ぼす（例えば、涙液の急速蒸発）。その上、涙液高浸透圧、涙膜不安定性、眼表面上皮の完全性の不十分な支持もまたドライアイを引き起こし得る。
【0005】
涙液高浸透圧状態は、潜在的に眼上皮細胞の炎症カスケードを損傷および刺激し、結膜杯細胞を含む表面上皮細胞の喪失をもたらし得る。杯細胞の喪失はムチン分泌を減少させ、それは続いて表面上皮への保護の喪失および涙膜の不安定性をもたらし、そして最終的にドライアイ症状ならびに角膜上皮細胞の損傷の発生を導く。この結果として生じる涙膜不安定性は、しばしば炎症の慢性的なサイクルおよび眼表面の損傷をもたらし、それがＤＥＤを引き起こす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
ＤＥＤ患者におけるこの多因子性眼症状の治療には、まだ対処されていない大きな必要性がある。現在、人工涙液、抗炎症薬、および鎮痛薬をはじめとする、ＤＥＤ患者に利用可能な治療選択肢はほんの少ししかない。これらの治療が一部の患者のいくつかの症状を軽減することができるとしても、ＤＥＤに対するより良い治療および予防手段が広く望まれている。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の実施形態は、ドライアイの予防および／または治療のための試薬および方法に関する。
【0008】
本発明の一態様は、対象において眼疾患を治療するための医薬組成物に関する。本発明の一実施形態による医薬組成物は、ペプチドおよび製薬上許容される賦形剤を含み、ペプチドは、配列番号１の配列：Ｓ－Ｘ－Ｘ－Ａ－Ｘ－Ｑ／Ｈ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｉ／Ｖ－Ｉ－Ｘ－Ｒを含み、各Ｘは独立に任意のアミノ酸である。但し、ペプチドは、ヒトおよびマウスＰＤＳＰ配列にそれぞれ対応するＳＬＧＡＥＱＲＴＥＳＩＩＨＲ（配列番号２）またはＳＬＧＡＥＨＲＴＥＳＶＩＨＲ（配列番号３）の配列を含まない。組成物は、溶液、軟膏、またはゲルの形態であってよい。
【0009】
本発明の一部の実施形態によれば、ペプチドは、配列番号６～７５のいずれか１つの配列を含む。本発明の一部の実施形態によれば、ペプチドは、２０、２２、２４、または２９アミノ酸残基長からなる。
【0010】
本発明の一部の実施形態によれば、眼疾患は、角膜損傷関連疾患であり、これはドライアイ症候群（ＤＥＳ）であり得る。
【0011】
本発明の一態様は、眼疾患を治療するための方法に関する。本発明の一実施形態による方法は、上記のペプチドのいずれか１つを含有する組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む。眼疾患は角膜損傷関連疾患であり、これはドライアイ症候群（ＤＥＳ）であり得る。
【0012】
本発明のその他の態様は、以下の説明および同封の図面によって明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1(A)】角膜損傷を評価するために使用される角膜フルオレセイン染色によって明らかにされた、乾燥ストレス誘発性ドライアイにおけるＰＥＤＦ由来短ペプチド（ＰＤＳＰ）の効果を示す図である。Ｃ５７ＢＬ６マウスを、制御された環境チャンバ（ＣＥＣ）に１４日間収容して眼表面の破壊を誘発し（０日目）、その後、ＰＤＳＰまたはビヒクルでさらに５日間処置した（５日目）。
【図1(B)】フェノールレッド糸試験により評価された水性涙液生成量を示す図である。ＮＳ：正常な周囲条件下で収容した非ストレスマウス。ＵＴ：ＣＥＣに１４日間収容した未処置マウス。
【0014】
【図2(A)】脳弓結膜（ｆｏｒｎｉｃｅａｌ ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａ）における杯細胞の過ヨウ素酸シッフ試薬（ＰＡＳ）染色の代表的な画像を示す図である。原倍率×１００。Ｃ５７ＢＬ６マウスをＣＥＣに１４日間収容した後、ＰＤＳＰまたはビヒクルでさらに５日間処置した。
【図2(B)】ＰＡＳ染色陽性細胞の平均数が、ＰＤＳＰ処置後に大幅に増加したことを示す図である。データは、平均±ＳＤとして示される。
【0015】
【図3】乾燥ストレスによって引き起こされる眼表面バリア破壊の予防を実証する、局所適用ＰＤＳＰの結果を示す図である。マウスをＣＥＣに１４日間収容し、ＣＥＣでの収容開始時から１００μＭ ＰＤＳＰを投与した。値を平均±ＳＤとして表す。
【0016】
【図4】局所ＰＤＳＰの適用の乾燥ストレス誘発性眼炎症への効果を示す図である。Ｃ５７ＢＬ６マウスをＣＥＣに１４日間収容し（０日目）、次にＰＤＳＰまたはビヒクルでさらに５日間処置した（５日目）。様々な炎症因子のｍＲＮＡレベルを定量的リアルタイムＰＣＲによって評価した。各群の値を平均±ＳＥとして表す。ＮＳ：非ストレスマウスに対して＊Ｐ＜０．０５。ビヒクル処置群に対して＊＊Ｐ＜０．０５。
【0017】
【図5(A)】ＰＤＳＰの局所適用が、酸化ストレス誘発性脂質過酸化を防ぐことを示す図である。マウスをＣＥＣに１４日間収容し、ＣＥＣでの収容開始時から１００μＭ ＰＤＳＰを投与した。図５（Ａ）は、ドライアイの角膜上皮における酸化ストレスマーカー４－ＨＮＥの代表的な免疫組織化学を示す。
【図5(B)】陽性４－ＨＮＥ細胞の定量分析の結果を示す図である。値を平均±ＳＤとして表す。ビヒクル処置群に対して＊Ｐ＜０．００００２。
【図5(C)】ドライアイの結膜上皮におけるｏ ４－ＨＮＥの代表的な免疫組織化学を示す図である。
【0018】
【図6】ＮａＣｌ処理したウサギ角膜上皮細胞における細胞内ＲＯＳおよびＧＳＨレベルへのＰＤＳＰの効果を示す図である。ウサギ角膜上皮細胞を、１０μＭ ＰＤＳＰまたは対照ペプチド（ＣｏｎＰ、ＰＥＤＦの残基９３－１１０）で２０時間前処理し、その後ＮａＣｌで処理して高浸透圧ストレスを誘導した。さらに２４時間ＮａＣｌ処理した後、細胞をＨ２ＤＣＦＤＡプローブ（Ａ）によるＲＯＳの検出またはＯＰＡプローブ（Ｂ）によるグルタチオン（ＧＳＨ）の検出に供した。未処理細胞（等張性培地中の細胞）に対して＊Ｐ＜０．００２。ＣｏｎｔＰ／ＮａＣｌ処理細胞（高浸透圧培地中の細胞）に対して＃Ｐ＜０．０５。
【0019】
【図7(A)】ＮａＣｌで処理したウサギ角膜上皮細胞におけるＭＭＰ－９ ｍＲＮＡ発現および活性へのＰＤＳＰの効果を示す図である。図７（Ａ）は、定量的リアルタイムＰＣＲによって評価された、ＭＭＰ－９ ｍＲＮＡレベルを示す。各群の値を平均±ＳＥとして表す。未処理細胞に対して＊Ｐ＜０．００５。ＣｏｎｔＰ／ＮａＣｌ処理細胞に対して＃Ｐ＜０．０２。
【図7(B)】ゼラチンザイモグラフィーによって評価されたＭＭＰ－９活性を示す図である。各群の値を平均±ＳＥとして表す。未処理細胞に対して＊Ｐ＜０．０００１。ＣｏｎｔＰ／ＮａＣｌ処理細胞に対して＃Ｐ＜０．０００３。
【0020】
【図8】フルオレセイン染色によって明らかにされた、乾燥誘発性角膜損傷の予防または治療における様々なアラニン置換ペプチドの効果を示す図である。マウスをＣＥＣ環境に１４日間収容してドライアイを誘発し、様々なペプチドを両眼に５日間適用した。５日後、角膜をフルオレセインで染色して表面への損傷を評価した。
【0021】
【図9】フェノールレッド糸法によって明らかにされた、涙液の産生の増強における様々なアラニン置換ペプチドの効果を示す図である。
【0022】
【図10】培養中のＣ２Ｃ１２細胞の細胞生存力への様々なアラニン置換ペプチドの効果を示す図である。細胞生存率をＭＴＴアッセイで評価した。
【0023】
【図11】乾燥ストレス誘発性ドライアイにおけるヒトＰＤＳＰ ２９ｍｅｒおよびｍｏＰＤＳＰ ２９ｍｅｒ変異体の治療効果を示す図である。Ｃ５７ＢＬ６マウスを、制御された環境チャンバ（ＣＥＣ）に１４日間収容して眼表面の破壊を誘発し（０日目）、その後、ペプチドまたはビヒクルによる処置を３日間開始した（３日目）。角膜フルオレセイン染色によって角膜損傷を評価した。３日間異なるペプチドに応答したマウスの平均角膜染色スコア。０日目に対して＊Ｐ＜０．０５。
【0024】
【図12】フェノールレッド糸試験によって評価した、涙液の産生の結果を示す図である。Ｃ５７ＢＬ６マウスを、制御された環境チャンバ（ＣＥＣ）に１４日間収容して眼表面の破壊を誘発し（０日目）、その後、ペプチドまたはビヒクルによる処置を３日間開始した（３日目）。ＮＳ：正常な周囲条件下で収容した非ストレスマウス。０日目に対して＊Ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【0025】
ヒト色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）は、分子量が約５０ｋＤａの４１８アミノ酸を含む分泌タンパク質である。ＰＥＤＦは、多くの生物学的機能を有する多機能性タンパク質である（例えば、米国特許出願公開第２０１０／００４７２１２号参照）。ＰＥＤＦの異なるペプチド領域は、異なる機能を担うことが見出された。例えば、３４ｍｅｒ断片（ＰＥＤＦの残基４４－７７）は血管新生抑制作用を有すると同定され、一方、４４ｍｅｒ断片（ＰＥＤＦの残基７８－１２１）は神経栄養特性を有すると同定されている。
【0026】
米国特許出願公開第２０１０／００４７２１２号は、ＰＥＤＦが幹細胞の自己再生を促進できることを開示している。米国特許第９，０５１，５４７号および米国特許第９，６１７，３１１号は、長さ２０～３９のアミノ酸を有するＰＥＤＦの断片（ＰＥＤＦの残基９３－１２１）は、幹細胞の増殖および創傷治癒、特に、角膜縁上皮幹細胞の増殖を促進することができることを開示している。
【0027】
本発明の実施形態は、ＰＥＤＦに由来する短ペプチド断片およびそれらの変異体に関する。本発明の実施形態は、ドライアイ症候群（ＤＥＳ）の予防および／または治療におけるこれらのペプチドの使用にも関する。
【0028】
ドライアイは、いずれかの眼が十分な涙を産生しない場合、または涙の蒸発が早すぎる場合に起こる。ドライアイの状態がしばらく続くと眼の表面の擦傷の原因となり得る。進行した場合、上皮は例えば扁平上皮化生または杯細胞の喪失などの病理学的変化を受けることがあり、重度の場合、患者は結果として角膜損傷となることがあり、それには角膜表面の肥厚、角膜びらん、点状角膜症、上皮欠損、角膜潰瘍形成、角膜血管新生、角膜瘢痕、角膜菲薄化、さらには角膜穿孔が含まれる。
【0029】
本発明の発明者らは、ＰＥＤＦに由来する特定のペプチド断片が、乾燥に起因する角膜損傷を予防および／または治療することができることを見出した。
【0030】
ドライアイ疾患の動物モデルにおいて、マウスを制御された環境チャンバ（ＣＥＣ）に入れて、前述のようにドライアイを誘発した（Ｂａｒａｂｉｎｏら、２００５）。ＣＥＣに入れたマウスを、２５％未満の相対湿度（ＲＨ）、２０～２２℃の温度、１５Ｌ／分の空気流に１日１２時間曝した。非ストレスマウスは、同じ持続時間の間、通常の環境（ＲＨ＞５０％、空気流なし、温度２１～２３℃）中で保持された。１４日後、非ストレスマウスをビヒクルで処置し、一方、ストレスを与えたマウスを試験ペプチド（例えば、２９ｍｅｒ ＰＤＳＰ）かまたはビヒクル溶液のいずれかで（ビヒクル群）５日間処置した。次に、角膜をフルオレセイン染色によって調べた。
【0031】
図１（Ａ）に示されるように、１４日目に、ストレスを与えない群と試験群の両方において、角膜損傷はフルオレセイン染色から明らかであった。ＰＥＤＦ由来短ペプチド（ＰＤＳＰ、ＰＥＤＦの残基９３－１２１）による５日間の処置の後、角膜表面の損傷は本質的になくなったが、対照群（ビヒクルによる処置）ではなお角膜の損傷が示された。
【0032】
さらに、本発明において、様々な長さをもつＰＤＳＰ（ＰＥＤＦの残基９３から出発する２０～２９アミノ酸）は、ドライアイ疾患の動物モデルにおいて、１０ｕＭ～２００ｕＭの濃度で角膜損傷を修復する能力があることが見出された。
【0033】
図１（Ｂ）は、フェノールレッド糸試験（後の項で詳述）によって明らかにされた涙液産生の結果を示す。図１（Ｂ）において、ＮＳは、非ストレスマウスを表し、ＬＩＴはストレスを与えたマウスおよび未処置マウスを表す。図１（Ｂ）に示されるように、ＰＤＳＰによる処置は、ＵＴおよびビヒクル処置群と比較して、涙液産生を著しく増加させた。
【0034】
ヒトにおいて、前角膜として公知の、眼を覆う涙膜は、３つの異なる層：脂質層（マイボーム腺により分泌）、水層（涙腺により分泌）、および粘膜層（結膜杯細胞より分泌）を有する。ストレス誘発性ドライアイは、これらの構成要素のいずれかまたは全ての産生の低下に起因し得る。
【0035】
ムチン産生の低下は、杯細胞の減少に起因し得る。本発明は、ＰＤＳＰがドライアイによる杯細胞の減少を防ぐことができることを示す。図２（Ａ）は、マウスの眼のピリオド酸（ｐｅｒｉｏｄ ａｃｉｄ）シッフ（ＰＡＳ）試薬染色の結果を示す。手短に言えば、Ｃ５７ＢＬ６マウスをＣＥＣに１４日間収容した後、ＰＤＳＰまたはビヒクルでさらに５日間処置した。ストレスを与えていない眼は、ストレスを与えていない対照（ＮＳ）として含まれる。図２（Ａ）は、ストレスを与えていない眼（ＮＳ）、ビヒクル処理した眼、およびＰＤＳＰ処理した眼の杯細胞の代表的な染色を示す。図２（Ｂ）は、ＰＤＳＰ処理した眼が、未処理のストレスを与えた眼およびビヒクル処理した眼と比較して、より多くの杯細胞（より多くのＰＡＳ陽性細胞）を有することを示す。
【0036】
ドライアイ症候群を逆転または治癒させることができることに加えて、本発明者らは、ＰＤＳＰがドライアイ状態によって引き起こされる損傷を防ぐことができることも見出し、実験では、１００μΜの濃度のＰＤＳＰまたはビヒクル（対照として）をＣ５７ＢＬ６マウスの眼に適用し、その後、マウスを制御された環境チャンバ（湿度が低く空気流がある）内で１４日間保持した。次に、乾燥ストレスによって引き起こされた眼表面バリア破壊を、フルオレセイン染色によって視覚化した。乾燥ストレスによって引き起こされた眼表面バリア破壊を、眼表面の損傷の程度に基づいて０から３までスコア付けした。図３に示されるように、ＰＤＳＰは、ビヒクル処置群と比較して、眼表面の損傷を効果的に予防した。
【0037】
ドライアイは、前角膜涙膜の異常、およびそれに続く付属器、結膜および角膜を含む眼表面全体の炎症性変化と関連している（Ｈｅｓｓｅｎら，“Ｄｒｙ ｅｙｅ：Ａｎ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｏｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｖｉｓ．Ｒｅｓ．，２０１４，９（２）：２４０－２５０参照）。そのため、角膜炎症応答におけるＰＤＳＰの効果を次に調査した。手短に言えば、Ｃ５７ＢＬ６マウスをＣＥＣに１４日間収容した後（０日目）、ＰＤＳＰまたはビヒクルによる処置をさらに５日間実施した（５日目）。次に、炎症因子のｍＲＮＡレベルを定量的リアルタイムＰＣＲによって評価した。
【0038】
図４に示されるように、様々な炎症関連因子、例えば、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、およびＭＣＰ－１（単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１／ＣＣＬ２）は、炎症および組織反応における白血球の動員を制御する重要な炎症性ケモカインである）の発現は、ストレス誘発性ドライアイにおいて増加した（未処置ＵＴ群を参照）。ＰＤＳＰによる処置は、未処置ＵＴ群またはビヒクル処置群と比較して、これらの炎症性因子の発現を大幅に減少させた。従って、ＰＤＳＰはストレス誘発性ドライアイにおいて炎症を効果的に軽減することができる。
【0039】
その上、ドライアイ症候群と酸化ストレスの蓄積との間に関係が存在することが仮定されている（Ｎａｋａｍｕｒａら．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，２００７、４８（４）：１５５２－８参照）。そのため、ＰＤＳＰがドライアイにおいて酸化ストレスを減らすかまたは防ぐことができるかどうかも調査した。
【0040】
この試験のために、マウスをＣＥＣに１４日間収容し、ＰＤＳＰ処置をＣＥＣに収容し始めた時に開始した。次に、酸化ストレス生成物（例えば、４－ヒドロキシ－２－ノネナール、４－ＨＮＥ）の産生を調べた。４－ＨＮＥは、動物組織全体に見られ、脂質過酸化の増加に起因して酸化ストレスの間により多量に見られた。４－ＨＮＥは反応性アルデヒドを含み、それはタンパク質を修飾することができる。４－ＨＮＥ修飾タンパク質は、４－ＨＮＥ部分に特異的な抗体によって検出され得る。
【0041】
図５（Ａ）に示されるように、ストレスを与えられていない眼は最小の４－ＨＮＥを有する。ストレス誘発性ドライアイは、４－ＨＮＥ染色（ビヒクル処置群）を増加させた。対照的に、ストレス誘発性ドライアイのＰＤＳＰ処置により、４－ＨＮＥの産生が著しく低下した。図５（Ｂ）は、陽性４－ＨＮＥ細胞の定量分析の結果を示す。図５（Ｃ）は、ドライアイの結膜上皮における４－ＨＮＥの代表的な免疫組織化学染色を示す。
【0042】
一般に、高い浸透圧（ＨＯＰ）の涙液は眼の炎症および損傷の原因であると考えられている。ＨＯＰは、細胞代謝の副生成物である活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を誘導し得る。ＲＯＳ生成は、円錐角膜患者の角膜線維芽細胞およびドライアイ動物モデルの角膜上皮細胞で増加することが報告されている。この知見は、ＲＯＳがドライアイの角膜損傷に役割を果たし得ることを示唆する。一方、グルタチオン（ＧＳＨ）は、フリーラジカルまたはＲＯＳに対抗し、フリーラジカルまたはＲＯＳによって起こる損傷を軽減させるかまたは防ぐことのできる天然種である。
【0043】
そのため、本発明者らは、ＮａＣｌ処理したウサギ角膜上皮細胞（ＨＯＰ）における細胞内ＲＯＳおよびＧＳＨレベルへのＰＤＳＰの効果を調べた。手短に言えば、ウサギ角膜上皮細胞を１０μΜ ＰＤＳＰまたは陰性対照ペプチド（ＣｏｎＰ）で２０時間前処理し、その後ＮａＣｌで処理して高浸透圧ストレスを誘導した。さらに２４時間ＮａＣｌ処理した後、ＲＯＳ指示薬色素である２’，７’－ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（Ｈ２ＤＣＦＤＡ）プローブを用いて細胞をＲＯＳについて評価した。Ｈ２ＤＣＦＤＡは細胞内に拡散することができ、そこでその酢酸エステル結合が細胞内エステラーゼによって切断されてＲＯＳによって酸化される。このＲＯＳが非蛍光のジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（Ｈ２ＤＣＦＤＡ）を高蛍光性の２’，７’－ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦ）に変換する。
【0044】
図６（Ａ）に示されるように、ＨＯＰでない、ＰＤＳＰ単独は、未処置マウスと比較してＤＣＦ蛍光を増加させなかった。ＨＯＰがＮａＣｌによって誘導される場合、ＰＤＳＰによる前処置は、陰性対照ペプチド（ＣｏｎＰ）による前処置と比較して、ＲＯＳ産生の低下（すなわちより低いＤＣ蛍光）をもたらした。この結果は、ＰＤＳＰがＨＯＰに誘導されるＲＯＳ形成を減少させ得ることを示す。
【0045】
図６（Ｂ）は、異なる処置群における相対ＧＳＨレベルを示す。ＨＯＰストレスがないと、未処置マウスと比較して、ＰＤＳＰ単独がＧＳＨレベルのわずかな増加を誘導したことは興味深い。抗酸化剤であるＧＳＨのレベルのこの増加は、細胞が酸化ストレスによりよく耐えることを可能にする。ＨＯＰ下では、ＰＤＳＰ処置も対照ペプチド（ＣｏｎＰ）による処置と比較してＧＳＨが増加した。これらの結果は、ＰＤＳＰ処置がＲＯＳ産生を最小減に抑え、それと同時にＧＳＨレベルを増加させることを示す。この複合効果は、酸化ストレスまたは高浸透圧ストレスに対して細胞をはるかに耐性にする。
【0046】
ドライアイ症候群（ＤＥＳ）には、涙膜の浸透圧の増加および眼表面の炎症が含まれる。高浸透圧の涙液は、炎症を起こした上皮細胞に高レベルのサイトカインＭＭＰ－９を産生させる炎症カスケードに寄与する。ドライアイにおけるＭＭＰ－９活性の増加は、角膜上皮バリア機能の混乱、角膜上皮の剥離の増加、および角膜表面の不規則性に寄与し得る。（Ｃｈｏｔｉｋａｖａｎｉｃｈら，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９ ｏｎ ｔｈｅ ｏｃｕｌａｒ ｓｕｒｆａｃｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｅａｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，”Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．２００９；５０：３２０３－３２０９）。
【0047】
そのため、本発明者らは、ＮａＣｌ処理したウサギ角膜上皮細胞におけるＭＭＰ－９ ｍＲＮＡの発現および活性へのＰＤＳＰの効果も調べた。手短に言えば、ウサギ角膜上皮細胞を上記のように処理した。図７（Ａ）は、高浸透圧ストレスがないと、ＰＤＳＰ単独では、定量的リアルタイムＰＣＲによって評価して、ＭＭＰ－９ ｍＲＮＡレベルに効果がないことを示す。高浸透圧ストレスは、ＭＭＰ－９ ｍＲＮＡレベルのかなり（約２倍）の増加を誘導した（陰性対照ペプチド、ＣｏｎＰ、続いてＮａＣｌ処理）。比較すると、ＰＤＳＰ処理は、高浸透圧ストレス下でＭＭＰ－９ ｍＲＮＡレベルの増加の大部分を効果的に抑制した（ＰＤＳＰ処理に続いてＮａＣｌ処理）。図７（Ｂ）に示されるように、ＭＭＰ－９ ｍＲＮＡレベルの増加は、ＳＤＳゲルおよび酵素活性で測定した場合のＭＭＰ－９タンパク質の発現と実質的に相関する。
【0048】
上記の結果は、本発明のＰＤＳＰが、ドライアイ疾患（ＤＥＤ）またはドライアイ症候群（ＤＥＳ）を予防および治療することができることを明らかに示す。具体的には、ＤＥＤの予防および治療における本発明のＰＤＳＰの効果には、（１）ドライアイストレスによって誘発される角膜表面への損傷を予防および治癒する；（２）涙液産生を増加させる；（３）結膜杯細胞を維持または保護する；（４）ドライアイ誘発性の炎症を抑制する；（５）酸化ストレス誘発性脂質過酸化を軽減または最小化する；（６）細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）の形成を抑制し、細胞内グルタチオン（ＧＳＨ）レベルを増加させる；および（７）ＭＭＰ－９発現を抑制する、が含まれる。
【0049】
本発明のＰＤＳＰは、ＤＥＤの予防および治療に効果的な薬剤であるので、本発明者らは、アラニンスキャニングによってＰＤＳＰの構造活性相関をさらに調査した。アラニンスキャニング実験では、本発明者らは、ヒトＰＥＤＦ：９３ＳＬＧＡＥＱＲＴＥＳＩＩＨＲＡＬＹＹＤＬＩＳＳＰＤＩＨＧＴ１２１（配列番号４）の残基９３－１２１からの２９ｍｅｒを使用した。２９ｍｅｒ中のアミノ酸の各々を、アラニンで（または、残基がアラニンである場合はグリシンで）置換し、アラニン置換またはグリシン置換変異体の活性を評価した。
【0050】
図８は、眼染色アッセイの例となる結果を示す。これらの試験では、乾燥誘発性の角膜表面損傷（フルオレセイン染色によって評価）を、上記のように、および後の項で実験に基づいて詳述されるように、ＣＥＣにおいて誘発した。これらの結果は、２９ｍｅｒ中の残基１（Ｌ９３Ａ）、４（Ａ９６Ｇ）、６（Ｑ９８Ａ）、１１（Ｉ１０３Ａ）、１２（Ｉ１０４Ａ）、および１４（Ｒ１０６Ａ）でのアラニンまたはグリシン置換がＰＤＳＰ活性のかなりの喪失をもたらしたことを示し、これらの残基がＰＤＳＰ活性に必要不可欠であることを示す。
【0051】
図９は、上記のように実施され、以降の項で詳述される、涙液産生アッセイの例となる結果を示す。図９に示される涙液産生に基づく結果は、図８に示されるフルオレセイン染色に基づく結果と一致する。つまり、２９ｍｅｒ中の残基１（Ｓ９３Ａ）、４（Ａ９６Ｇ）、６（Ｑ９８Ａ）、１１（Ｉ１０３Ａ）、１２（Ｉ１０４Ａ）、および１４（Ｒ１０６Ａ）でのアラニンまたはグリシン置換は、ＰＤＳＰが涙液産生を誘導する能力のかなりの喪失をもたらし、これらの残基がＰＤＳＰ活性に必要不可欠であることを示す。
【0052】
本発明のＰＤＳＰが角膜表面損傷を予防し、細胞内の酸化ストレスを減少させ、そして炎症反応を最小限に抑えることができるという事実は、ＰＤＳＰが一般に細胞生存力を維持する能力を有し得ることを示唆する。このことを細胞培養中の細胞生存力によって試験した。図１０は、Ｃ２Ｃ１２細胞培養を用いるアラニンスキャニング実験の結果を示す。細胞生存力は、染色および細胞数カウントによるか、またはＭＴＴアッセイによって評価し得る。これらの技法は当技術分野で周知である。
【0053】
図１０に示されるように、２９ｍｅｒ中の位置１（Ｓ９３Ａ）、４（Ａ９６Ｇ）、６（Ｑ９８Ａ）、１１（Ｉ１０３Ａ）、１２（Ｉ１０４Ａ）、および１４（Ｒ１０６Ａ）の残基のアラニン（またはグリシン）置換は、これらのペプチドが細胞の生存力を維持／増強する能力を実質的に消失させた。これらのアラニンスキャニング結果は、ドライアイ動物モデルを使用する図８および図９に示される結果と一致する。
【0054】
上の実験はヒトＰＤＳＰ配列（ＰＤＳＰ ２９ｍｅｒ：ＳＬＧＡＥＱＲＴＥＳＩＩＨＲＡＬＹＹＤＬＩＳＳＰＤＩＨＧＴ、配列番号４）で実施したものであるが、本発明者らは、対応するマウス配列（ｍｏＰＤＳＰ ２９ｍｅｒ：ＳＬＧＡＥＨＲＴＥＳＶＩＨＲＡＬＹＹＤＬＩＴＮＰＤＩＨＳＴ、配列番号５）が同程度に機能することを見出した。例えば、図１１は、眼染色によって明らかにされた、ヒト（ＰＤＳＰ ２９ｍｅｒ）とマウス（ｍｏＰＤＳＰ ２９ｍｅｒ）の両方による、乾燥によって誘発された角膜表面損傷からの保護の結果を示す。マウス配列がヒト配列と同様の効果を有することは明らかである。同様に、図１２は、ヒトＰＤＳＰとマウスＰＤＳＰの両方が涙液の産生を同程度まで改善したことを示す。これらの結果は、ＤＥＳを予防および／または治療する能力において、ヒトＰＤＳＰとマウスＰＤＳＰとの間に識別可能な機能的差異がないことを裏付ける。
【0055】
この領域のヒトＰＥＤＦとマウスＰＥＤＦのアミノ酸残基の違いは、２つの相同置換からなる、すなわちヒト配列のＱ－９８はマウス配列のＨ－９８に対応し、ヒト配列のＩ－１０３はマウス配列のＶ－１０３に対応する。そのため、これらの２つの位置（９８および１０３）の必須残基は、対応する残基（９８Ｑ／Ｈおよび１０３Ｉ／Ｖ）で置換されてよい。
【0056】
当業者は、たとえこれらの２つの残基がドライアイの治療および予防に重要であることが見出されているとしても、相同アミノ酸置換が一般に生物活性に著しい影響を及ぼさないことを理解するであろう。さらに、当業者は、非必須位置での同様の相同置換がさらに良好に許容されることを理解するであろう。どのアミノ酸置換が相同とみなされるのかは当技術分野で周知である。一部の例は、（Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｍ）、（Ｑ、Ｎ、Ｈ）、（Ｄ、Ｅ）、（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、（Ｓ、Ｔ、Ｃ）、および（Ｆ、Ｙ、Ｗ）であり、ここで、同じ括弧群内のアミノ酸は、一般にペプチドまたはタンパク質の生物活性にあまり影響を与えずに互いに置換することができる。
【0057】
これらの結果に基づいて、ＤＥＤを予防または治療するためのＰＤＳＰの必須ペプチド配列は以下のように表され得ると結論付けることができる：１Ｓ－２Ｘ－３Ｘ－４Ａ－５Ｘ－６Ｑ／Ｈ－７Ｘ－８Ｘ－９Ｘ－１０Ｘ－１１Ｉ／Ｖ－１２Ｉ－１３Ｘ－１４Ｒ（配列番号１）、この際、各Ｘは非必須残基を意味し、任意のアミノ酸、好ましくは天然アミノ酸であり得る。ヒトＰＤＳＰの対応する配列は、ＳＬＧＡＥＱＲＴＥＳＩＩＨＲ（配列番号２）であり、マウスＰＤＳＰの対応する配列は、ＳＬＧＡＥＨＲＴＥＳＶＩＨＲ（配列番号３）である。
【0058】
当業者は、これらの必須残基を含むペプチドが、ドライアイを予防または治療するために使用され得ることを理解するであろう。そのようなペプチドは、一般にＰＤＳＰ（すなわちＰＥＤＦ由来短ペプチド）と呼ばれ得る。これらのＰＤＳＰの一部の例を、以下の表に例示する。
【表1】
【0059】
当業者は、上の表に列挙されたペプチド配列が説明のためだけのものであり、本発明の範囲から逸脱することなくその他の置換が可能であることを理解するであろう。その上、上記はドライアイ症候群を予防および／または治療する際に効果的である短いまたは最小のペプチドを表し得るが、それよりも長いペプチドも使用されてよい。特に、より長いペプチドは、より好ましい薬物動態学および／または生物学的利用能を提供することができる。
【0060】
より長いペプチドの場合、上記のペプチドのいずれか１つのＮ末端および／またはＣ末端に追加のアミノ酸が含まれていてもよい。追加のアミノ酸は、任意の適した残基、例えば上記ペプチドの領域に隣接するヒトまたはマウスＰＥＤＦの残基などであってよい。より長いペプチドの特定の例としては、２０ｍｅｒ（ＰＥＤＦの残基９３－１１２；配列番号７６）、２２ｍｅｒ（ＰＥＤＦの残基９３－１１４；配列番号７７）、２４ｍｅｒ（ＰＥＤＦの残基９３－１１６；配列番号７８）、および２９ｍｅｒ（ＰＥＤＦの残基９３－１２１；配列番号４）が挙げられ得る。
【0061】
本発明の実施形態は、対象においてドライアイを予防および／または治療するための方法にも関する。本発明の実施形態に従う対象は、ヒトであっても動物であってもよい。本発明の実施形態による方法は、ドライアイの予防を必要とする対象に投与することか、または上記のいずれかから選択されるペプチドを含む組成物を用いる治療のいずれかを含み得る。本発明の実施例によると、組成物は、本発明のペプチド、またはそのようなペプチドの塩を、製薬上許容される担体または賦形剤、例えば蒸留水、生理食塩水、油、またはゲルなどと共に含んでよい。
【0062】
本発明の組成物は、任意の適した剤形、例えば溶液、軟膏、懸濁液、ゲルまたは乳濁液などに製剤されてよく、これらは任意の適した濃度、例えば１０～２００μΜなどで製剤されてよい。当業者は、本発明の成果を用いずに、有効量を送達する適切な濃度でこれらを製剤することができるであろう。これらの剤形は、眼への局所適用またはその他の適した投与経路（例えば、経口または注射）用に製剤されてよい。
【0063】
以下の実験の詳細および実施例によって本発明の実施形態をさらに説明する。当業者は、これらの実験の詳細および実施例が例示のためだけのものであること、および本発明の範囲から逸脱することなくその他の変更および変形が可能であることを理解するであろう。
【0064】
材料および方法
カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）、ピリオド酸（ｐｅｒｉｏｄ ａｃｉｄ）シッフ（ＰＡＳ）試薬およびデキサメタゾンは全てシグマアルドリッチ（米国ミズーリ州セントルイス）から入手した。バランス塩溶液（ＢＳＳ；Ａｌｃｏｎｅ）中のＣＭＣ（１％ ｗ／ｖ）をＰＤＳＰのビヒクルとして使用した。ＰＤＳＰおよび陰性対照ペプチド（ＣｏｎＰ）を合成し、ＮＨ２末端をアセチル化し、安定性のためにＣＯＯＨ末端をアミド化して修飾し、質量分析（純度＞９５％）によって特徴づけてジェンスクリプト（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）で注文した。
カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）、ピリオド酸（ｐｅｒｉｏｄ ａｃｉｄ）シッフ（ＰＡＳ）試薬およびデキサメタゾンは全てシグマアルドリッチ（米国ミズーリ州セントルイス）から入手した。バランス塩溶液（ＢＳＳ；Ａｌｃｏｎｅ）中のＣＭＣ（１％ ｗ／ｖ）をＰＤＳＰのビヒクルとして使用した。ＰＤＳＰおよび陰性対照ペプチド（ＣｏｎＰ）を合成し、ＮＨ２末端をアセチル化し、安定性のためにＣＯＯＨ末端をアミド化して修飾し、質量分析（純度＞９５％）によって特徴づけてジェンスクリプト（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）で注文した。
【0065】
動物
７～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスをこれらの実験に使用した。
実験手順はＭａｃｋａｙ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄによって承認され、ＡＲＶＯ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈに従って実施された。
７～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスをこれらの実験に使用した。
実験手順はＭａｃｋａｙ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄによって承認され、ＡＲＶＯ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈに従って実施された。
【0066】
ドライアイモデル
ドライアイを、前述のようにマウスを制御された環境チャンバ（ＣＥＣ）に入れることによって誘発した（Ｂａｒａｂｉｎｏら、２００５）。手短に言えば、ＣＥＣに入れたマウスを、２５％未満の相対湿度（ＲＨ）、２０～２２℃の温度、および１５Ｌ／分の空気流に１日１２時間曝した。ストレス誘発性ドライアイを有していない非ストレス（ＮＳ）マウスを、同じ持続時間の間、通常の環境（ＲＨ＞５０％、空気流なし、温度２１～２３℃）中で保持した。
ドライアイを、前述のようにマウスを制御された環境チャンバ（ＣＥＣ）に入れることによって誘発した（Ｂａｒａｂｉｎｏら、２００５）。手短に言えば、ＣＥＣに入れたマウスを、２５％未満の相対湿度（ＲＨ）、２０～２２℃の温度、および１５Ｌ／分の空気流に１日１２時間曝した。ストレス誘発性ドライアイを有していない非ストレス（ＮＳ）マウスを、同じ持続時間の間、通常の環境（ＲＨ＞５０％、空気流なし、温度２１～２３℃）中で保持した。
【0067】
角膜フルオレセイン染色および
動物を、ゾレチル（ｚｏｌｅｔｉｌ）（６ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（３ｍｇ／ｋｇ）の混合物の腹腔内注射によって麻酔した。角膜上皮損傷を局所フルオレセインによる染色によって決定した（Ｆｌｕｏｒ－Ｉ－Ｓｔｒｉｐ、Ａｙｅｒｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ペンシルベニア州フィラデルフィア）。角膜フルオレセイン染色をコバルトブルー光下、細隙灯生体顕微鏡で調べ、デジタルカメラで撮影した。角膜の色素染色は以下のように点数化した：点状染色なしの場合はスコア０；角膜の３分の１未満が染色された場合はスコア１；３分の２以下が染色された場合はスコア２；そして３分の２超が染色された場合はスコア３（Ｈｏｒｗａｔｈ－Ｗｉｎｔｅｒ Ｊ ２０１３）。
動物を、ゾレチル（ｚｏｌｅｔｉｌ）（６ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（３ｍｇ／ｋｇ）の混合物の腹腔内注射によって麻酔した。角膜上皮損傷を局所フルオレセインによる染色によって決定した（Ｆｌｕｏｒ－Ｉ－Ｓｔｒｉｐ、Ａｙｅｒｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ペンシルベニア州フィラデルフィア）。角膜フルオレセイン染色をコバルトブルー光下、細隙灯生体顕微鏡で調べ、デジタルカメラで撮影した。角膜の色素染色は以下のように点数化した：点状染色なしの場合はスコア０；角膜の３分の１未満が染色された場合はスコア１；３分の２以下が染色された場合はスコア２；そして３分の２超が染色された場合はスコア３（Ｈｏｒｗａｔｈ－Ｗｉｎｔｅｒ Ｊ ２０１３）。
【0068】
涙液産生の測定
涙液産生をフェノールレッド含浸綿糸で測定した（ゾーンクイック；オアシス、カリフォルニア州グレンドラ）。マウスにおけるこの試験の妥当性は以前述のように実施した（Ｄｕｒｓｕｎら、２００２）。糸を宝石細工人の鉗子で保持し、外側眼角に６０秒間置いた。涙液産生は、涙液によって濡れて赤色になった糸のミリメートルで表される。
涙液産生をフェノールレッド含浸綿糸で測定した（ゾーンクイック；オアシス、カリフォルニア州グレンドラ）。マウスにおけるこの試験の妥当性は以前述のように実施した（Ｄｕｒｓｕｎら、２００２）。糸を宝石細工人の鉗子で保持し、外側眼角に６０秒間置いた。涙液産生は、涙液によって濡れて赤色になった糸のミリメートルで表される。
【0069】
杯細胞のＰＡＳ染色
動物を安楽死させた後、眼を外科的に切除し、１０％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、５μｍの切片に切断した。上下結膜の杯細胞を測定するために過ヨウ素酸シッフ試薬（ＰＡＳ；シグマアルドリッチ）で切片を染色し、デジタルカメラを装備した顕微鏡で調べて撮影した。結膜中のＰＡＳ陽性杯細胞を、各眼から５つの切片で測定した。
動物を安楽死させた後、眼を外科的に切除し、１０％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、５μｍの切片に切断した。上下結膜の杯細胞を測定するために過ヨウ素酸シッフ試薬（ＰＡＳ；シグマアルドリッチ）で切片を染色し、デジタルカメラを装備した顕微鏡で調べて撮影した。結膜中のＰＡＳ陽性杯細胞を、各眼から５つの切片で測定した。
【0070】
ＲＮＡ抽出および定量的リアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞から抽出し、ＲＮアーゼフリーＤＮアーゼＩ（キアゲン、カリフォルニア州サンタクラリタ）で処理してゲノムＤＮＡを取り出し、次にＲＮＡ精製キット（ダイナビーズ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で精製した。ｃＤＮＡの合成をスーパースクリプトＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって実施した。定量的リアルタイムＰＣＲをＧｅｎｅＡｍｐ７７００配列検出系（アプライドバイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティ）で実施した。増幅は、３ｐｍｏｌのプライマー、段階希釈したＲＴ産物およびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲコア試薬（アプライドバイオシステムズ）を含有する総量４０μｌで実行した。特異的ＰＣＲプライマーの配列は、マウスＴＮＦ－α（受入番号：ＮＭ＿０１３６９３）センス、５’－ＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴＴ－３’（配列番号７９）、アンチセンス、５’－ＧＡＧＣＡＧＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＡＴＧＴＡＧ－３’（配列番号８０）；マウスＩＬ－１β（受入番号：ＮＭ００８３６１）センス、５’－ＧＧＴＧＴＧＴＧＡＣＧＴＴＣＣＣＡＴＴＡ－３’（配列番号８１）、アンチセンス、５’－ＡＴＴＧＡＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＴＴＴＣＡＧ－３’（配列番号８２）；マウスＩＬ－６（受入番号：ＮＭ０３１１６８）センス、５’－ＧＴＣＴＧＴＡＧＣＴＣＡＴＴＣＴＧＣＴＣＴＧ－３’（配列番号８３）、アンチセンス、５’－ＧＡＡＧＧＣＡＡＣＴＧＧＡＴＧＧＡＡＧＴ－３’（配列番号８４）；マウスＭＣＰ－１（受入番号：ＮＭ０１１３３３）センス、５’－ＣＴＣＧＧＡＣＴＧＴＧＡＴＧＣＣＴＴＡＡＴ－３’（配列番号８５）、アンチセンス、５’－ＴＧＧＡＴＣＣＡＣＡＣＣＴＴＧＣＡＴＴＴＡ－３’（配列番号８６）；ウサギＭＭＰ－９（受入番号：ＮＭ００１０８２２０３）センス、５’－ＴＧＣＧＡＧＴＴＴＣＣＧＴＴＣＡＴＣＴＴ－３’（配列番号８７）、アンチセンス、５’－ＧＴＡＧＡＧＣＴＴＧＴＣＣＴＴＧＴＣＧＴＡＧ－３’（配列番号８８）であった；ステップサイクルプログラムは、９５℃で１５秒間の変性、および６２℃で１分間のアニーリングおよび伸長、合計４０サイクルに設定した。全ての測定は三重反復で測定された。サイクル閾値（Ｃｔ）は、リアルタイムの蛍光発光がベースライン発光を上回る閾値に達するＰＣＲサイクル数に対応し、ＧｅｎｅＡｍｐ７７００ＳＤＳソフトウェアを用いて分析された。次に、目的のＰＣＲ産物および対照ｍＲＮＡ（ＧＡＰＤＨ）のＣｔ値を用いて試料間のｍＲＮＡの相対量を計算した。
全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞から抽出し、ＲＮアーゼフリーＤＮアーゼＩ（キアゲン、カリフォルニア州サンタクラリタ）で処理してゲノムＤＮＡを取り出し、次にＲＮＡ精製キット（ダイナビーズ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で精製した。ｃＤＮＡの合成をスーパースクリプトＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって実施した。定量的リアルタイムＰＣＲをＧｅｎｅＡｍｐ７７００配列検出系（アプライドバイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティ）で実施した。増幅は、３ｐｍｏｌのプライマー、段階希釈したＲＴ産物およびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲコア試薬（アプライドバイオシステムズ）を含有する総量４０μｌで実行した。特異的ＰＣＲプライマーの配列は、マウスＴＮＦ－α（受入番号：ＮＭ＿０１３６９３）センス、５’－ＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴＴ－３’（配列番号７９）、アンチセンス、５’－ＧＡＧＣＡＧＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＡＴＧＴＡＧ－３’（配列番号８０）；マウスＩＬ－１β（受入番号：ＮＭ００８３６１）センス、５’－ＧＧＴＧＴＧＴＧＡＣＧＴＴＣＣＣＡＴＴＡ－３’（配列番号８１）、アンチセンス、５’－ＡＴＴＧＡＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＴＴＴＣＡＧ－３’（配列番号８２）；マウスＩＬ－６（受入番号：ＮＭ０３１１６８）センス、５’－ＧＴＣＴＧＴＡＧＣＴＣＡＴＴＣＴＧＣＴＣＴＧ－３’（配列番号８３）、アンチセンス、５’－ＧＡＡＧＧＣＡＡＣＴＧＧＡＴＧＧＡＡＧＴ－３’（配列番号８４）；マウスＭＣＰ－１（受入番号：ＮＭ０１１３３３）センス、５’－ＣＴＣＧＧＡＣＴＧＴＧＡＴＧＣＣＴＴＡＡＴ－３’（配列番号８５）、アンチセンス、５’－ＴＧＧＡＴＣＣＡＣＡＣＣＴＴＧＣＡＴＴＴＡ－３’（配列番号８６）；ウサギＭＭＰ－９（受入番号：ＮＭ００１０８２２０３）センス、５’－ＴＧＣＧＡＧＴＴＴＣＣＧＴＴＣＡＴＣＴＴ－３’（配列番号８７）、アンチセンス、５’－ＧＴＡＧＡＧＣＴＴＧＴＣＣＴＴＧＴＣＧＴＡＧ－３’（配列番号８８）であった；ステップサイクルプログラムは、９５℃で１５秒間の変性、および６２℃で１分間のアニーリングおよび伸長、合計４０サイクルに設定した。全ての測定は三重反復で測定された。サイクル閾値（Ｃｔ）は、リアルタイムの蛍光発光がベースライン発光を上回る閾値に達するＰＣＲサイクル数に対応し、ＧｅｎｅＡｍｐ７７００ＳＤＳソフトウェアを用いて分析された。次に、目的のＰＣＲ産物および対照ｍＲＮＡ（ＧＡＰＤＨ）のＣｔ値を用いて試料間のｍＲＮＡの相対量を計算した。
【0071】
免疫組織化学
酸化ストレス誘発性脂質過酸化を、角膜および結膜における４－ヒドロキシ－２－ノネナール（４ＨＮＥ）の免疫組織化学的検出によって評価した。ホルマリン固定パラフィン包埋眼標本をキシレン中で脱パラフィンし、段階的な一連のエタノール濃度で再水和した。スライドを１０％ヤギ血清で６０分間ブロックし、次に４－ＨＮＥに対する一次抗体（１：１００希釈）（ａｂ４６５４５、Ａｂｅａｍ）とともに室温で４時間インキュベートした。続いてスライドを適切なペルオキシダーゼ標識ヤギ免疫グロブリン（１：５００希釈；ケミコン、カリフォルニア州テメクラ）とともに２０分間インキュベートし、次に色素原基質（３，３’－ジアミノベンジジン）とともに２分間インキュベートした後、ヘマトキシリンで対比染色した。
酸化ストレス誘発性脂質過酸化を、角膜および結膜における４－ヒドロキシ－２－ノネナール（４ＨＮＥ）の免疫組織化学的検出によって評価した。ホルマリン固定パラフィン包埋眼標本をキシレン中で脱パラフィンし、段階的な一連のエタノール濃度で再水和した。スライドを１０％ヤギ血清で６０分間ブロックし、次に４－ＨＮＥに対する一次抗体（１：１００希釈）（ａｂ４６５４５、Ａｂｅａｍ）とともに室温で４時間インキュベートした。続いてスライドを適切なペルオキシダーゼ標識ヤギ免疫グロブリン（１：５００希釈；ケミコン、カリフォルニア州テメクラ）とともに２０分間インキュベートし、次に色素原基質（３，３’－ジアミノベンジジン）とともに２分間インキュベートした後、ヘマトキシリンで対比染色した。
【0072】
角膜上皮細胞培養および処理
角膜縁幹細胞を６カ月齢のニュージーランド白ウサギから単離し、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２基礎培地に基づく細胞懸濁培養によって１４日間連続培養して、前述のように（Ｈｏら、２０１３）角膜のような上皮細胞分化を達成した。高浸透圧ストレスに起因するＲＯＳまたはＭＭＰ－９活性を誘導するために、９０ｍＭ ＮａＣｌの添加によって達成された高浸透圧培地（４６３ｍＯｓｍ）中で細胞を一晩インキュベートした。ＤＭＥＭ／Ｆ－１２基礎培地（３０９ｍＯｓｍ）中で培養した細胞を陰性対照として使用した。高浸透圧ストレス誘発性ＲＯＳまたはＭＭＰ－９活性への予防効果を検出するために、ＮａＣｌの処理の前に細胞を１０μＭ ＰＤＳＰで２０時間前処理した。
角膜縁幹細胞を６カ月齢のニュージーランド白ウサギから単離し、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２基礎培地に基づく細胞懸濁培養によって１４日間連続培養して、前述のように（Ｈｏら、２０１３）角膜のような上皮細胞分化を達成した。高浸透圧ストレスに起因するＲＯＳまたはＭＭＰ－９活性を誘導するために、９０ｍＭ ＮａＣｌの添加によって達成された高浸透圧培地（４６３ｍＯｓｍ）中で細胞を一晩インキュベートした。ＤＭＥＭ／Ｆ－１２基礎培地（３０９ｍＯｓｍ）中で培養した細胞を陰性対照として使用した。高浸透圧ストレス誘発性ＲＯＳまたはＭＭＰ－９活性への予防効果を検出するために、ＮａＣｌの処理の前に細胞を１０μＭ ＰＤＳＰで２０時間前処理した。
【0073】
ゼラチンザイモグラフィー
ＭＭＰ－９活性を検出するために、１０μＬの培地を用いて前述の方法（Ｌｉら、２００４）のようにゼラチンザイモグラフィーを実施した。バンド強度を、モデルＧＳ－７００イメージングデンシトメーター（バイオ・ラッドラボラトリーズ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）によるザイモグラフィーで評価し、Ｌａｂ ｗｏｒｋｓ４．０ソフトウェアを用いて分析した。
ＭＭＰ－９活性を検出するために、１０μＬの培地を用いて前述の方法（Ｌｉら、２００４）のようにゼラチンザイモグラフィーを実施した。バンド強度を、モデルＧＳ－７００イメージングデンシトメーター（バイオ・ラッドラボラトリーズ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）によるザイモグラフィーで評価し、Ｌａｂ ｗｏｒｋｓ４．０ソフトウェアを用いて分析した。
【0074】
細胞内ＲＯＳおよびグルタチオン含有量の測定
ＲＯＳによって酸化されると緑色蛍光化合物２’，７’－ジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）を放出する２’，７’－ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（Ｈ２ＤＣＦＤＡ；モレキュラープローブス、オレゴン州ユージーン）を使用して、細胞内ＲＯＳ生成をアッセイした。分光蛍光アッセイによってＲＯＳを検出するために、細胞をＰＢＳで洗浄し、次にＮＰ－４０溶解緩衝液（１０ｍＭトリス－Ｃｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．５％ＮＰ－４０）で溶解し、５μＭ Ｈ２ＤＣＦＤＡを含有するＰＢＳとともに暗所で３７℃で１５分間インキュベートした。蛍光（励起、４８８ｎｍ；発光、５２０ｎｍ）を、Ｓｐｅｃｔｒａ ＭＡＸ ＧＥＭＩＮＩリーダー（モレキュラーデバイス、米国カリフォルニア州サニーベール）で測定した。Ｈ２ＤＣＦＤＡを添加していない対照ウェルからのバックグラウンド蛍光を実験の測定値から減算した。
ＲＯＳによって酸化されると緑色蛍光化合物２’，７’－ジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）を放出する２’，７’－ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（Ｈ２ＤＣＦＤＡ；モレキュラープローブス、オレゴン州ユージーン）を使用して、細胞内ＲＯＳ生成をアッセイした。分光蛍光アッセイによってＲＯＳを検出するために、細胞をＰＢＳで洗浄し、次にＮＰ－４０溶解緩衝液（１０ｍＭトリス－Ｃｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．５％ＮＰ－４０）で溶解し、５μＭ Ｈ２ＤＣＦＤＡを含有するＰＢＳとともに暗所で３７℃で１５分間インキュベートした。蛍光（励起、４８８ｎｍ；発光、５２０ｎｍ）を、Ｓｐｅｃｔｒａ ＭＡＸ ＧＥＭＩＮＩリーダー（モレキュラーデバイス、米国カリフォルニア州サニーベール）で測定した。Ｈ２ＤＣＦＤＡを添加していない対照ウェルからのバックグラウンド蛍光を実験の測定値から減算した。
【0075】
ＧＳＨレベルは、グルタチオンアッセイキット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カリフォルニア州マウンテンビュー）を製造業者の推奨に従って使用して定量した。手短に言えば、過塩素酸処理した細胞溶解物を、ＯＰＡ（ｏ－フタルアルデヒド）プローブおよびＧＳＨ緩衝液とともに室温で４０分間インキュベートした。ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ ＧＥＭＩＮＩ ＸＳ蛍光マイクロプレート分光光度計（モレキュラーデバイス、カリフォルニア州サニーベール）で励起について３４０ｎｍ、発光について４２０ｎｍで蛍光を読み取った。
【0076】
局所ＰＤＳＰ処理は乾燥ストレスにより誘発される眼表面損傷を回復させる
ＰＤＳＰが乾燥ストレス（ＤＳ）誘発性眼表面欠損において治療効果を有するかどうかを決定するために、マウスを制御された環境チャンバ（ＣＥＣ）に１４日間収容して眼表面の崩壊を生じさせた。ＣＥＣで１４日後、本発明者らは最初の実験に蛍光スコアが２を超えるマウスを使用した（図１（Ａ））。その後、同じ乾燥ストレスプロトコールを維持しながらさらに５日間、２５～２００μＭのＰＤＳＰ（３回／日）またはＰＤＳＰビヒクル（ＢＳＳ中１％ＣＭＣ）でドライアイを局所的に処置した。
ＰＤＳＰが乾燥ストレス（ＤＳ）誘発性眼表面欠損において治療効果を有するかどうかを決定するために、マウスを制御された環境チャンバ（ＣＥＣ）に１４日間収容して眼表面の崩壊を生じさせた。ＣＥＣで１４日後、本発明者らは最初の実験に蛍光スコアが２を超えるマウスを使用した（図１（Ａ））。その後、同じ乾燥ストレスプロトコールを維持しながらさらに５日間、２５～２００μＭのＰＤＳＰ（３回／日）またはＰＤＳＰビヒクル（ＢＳＳ中１％ＣＭＣ）でドライアイを局所的に処置した。
【0077】
０日目に、平均涙液量は、綿糸試験によって測定して、非ストレス（ＮＳ）マウスと比較してマウスにおいて有意に低下していた（３．８±０．５ｍｍ対５．４±０．４ｍｍ；図１Ｂ）。マウスをＰＤＳＰで５日間処置した後、ビヒクル群と比較して、眼の涙液産生は有意に増加した（５±０．３対４．５±０．２）。
【0078】
ＰＤＳＰは結膜の杯細胞の量を部分的に回復させる
杯細胞は、主に結膜円蓋の表層上皮に存在し、粘液涙液産生を担う。ＮＳ眼の過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色は、杯細胞が結膜上皮で連続的な均一パターンを示すことを示した（図２Ａ）。しかし、乾燥ストレスの１４日後（０日目）、結膜のＰＡＳ染色は、杯細胞の数がＮＳ群と比較して著しく減少したことを示した（５８±３．１対３８±３．２；図２Ｂ）。点眼薬中のＰＤＳＰまたはビヒクルで５日間処置すると、結膜杯細胞数はビヒクル処置対照と比較してＰＤＳＰ処置した眼において有意に高かった、（４６±３．８対３７±１．１）。まとめると、ＰＤＳＰ処置は杯細胞の数を救った。
杯細胞は、主に結膜円蓋の表層上皮に存在し、粘液涙液産生を担う。ＮＳ眼の過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色は、杯細胞が結膜上皮で連続的な均一パターンを示すことを示した（図２Ａ）。しかし、乾燥ストレスの１４日後（０日目）、結膜のＰＡＳ染色は、杯細胞の数がＮＳ群と比較して著しく減少したことを示した（５８±３．１対３８±３．２；図２Ｂ）。点眼薬中のＰＤＳＰまたはビヒクルで５日間処置すると、結膜杯細胞数はビヒクル処置対照と比較してＰＤＳＰ処置した眼において有意に高かった、（４６±３．８対３７±１．１）。まとめると、ＰＤＳＰ処置は杯細胞の数を救った。
【0079】
局所ＰＤＳＰは乾燥ストレスにより誘発される眼表面損傷を防ぐ
ＰＤＳＰがＤＳ誘発性角膜上皮破壊を抑制することができるかどうか調査するため、本発明者らは１４日の乾燥ストレスプロトコールをマウスに適用し、これらのマウスを１日３回ＰＤＳＰで局所的に処置した。１４日後、角膜上皮の欠損をフルオレセイン色素染色によって評価し（図３）、この結果から角膜フルオレセイン染色スコアが、ＰＤＳＰ処置した眼と比較してビヒクル処置した眼において有意に高いことが明らかになった（１．７±０．３対０．７±０．２）。この結果は、ＰＤＳＰが乾燥ストレスに対する眼表面の予防効果も示し得ることを示す。
ＰＤＳＰがＤＳ誘発性角膜上皮破壊を抑制することができるかどうか調査するため、本発明者らは１４日の乾燥ストレスプロトコールをマウスに適用し、これらのマウスを１日３回ＰＤＳＰで局所的に処置した。１４日後、角膜上皮の欠損をフルオレセイン色素染色によって評価し（図３）、この結果から角膜フルオレセイン染色スコアが、ＰＤＳＰ処置した眼と比較してビヒクル処置した眼において有意に高いことが明らかになった（１．７±０．３対０．７±０．２）。この結果は、ＰＤＳＰが乾燥ストレスに対する眼表面の予防効果も示し得ることを示す。
【0080】
乾燥ストレス動物モデルにおけるヒトおよびマウスＰＤＳＰの機能比較
ヒトおよびマウスのＰＥＤＦの同じ領域がＤＥＤ対象の治療で同程度に機能するかどうかを調査すること。ヒトＰＤＳＰおよびネズミＰＤＳＰの活性を、マウスにおける乾燥ストレス誘発性ドライアイモデルで調べた。ストレス誘発性ドライアイを有するマウスにおいて、ヒトおよびマウスの両方のＰＤＳＰが、乾燥ストレス（図１１）ならびに涙液産生（図１２）によって誘発される眼表面損傷を回復させることができることが示される。
ヒトおよびマウスのＰＥＤＦの同じ領域がＤＥＤ対象の治療で同程度に機能するかどうかを調査すること。ヒトＰＤＳＰおよびネズミＰＤＳＰの活性を、マウスにおける乾燥ストレス誘発性ドライアイモデルで調べた。ストレス誘発性ドライアイを有するマウスにおいて、ヒトおよびマウスの両方のＰＤＳＰが、乾燥ストレス（図１１）ならびに涙液産生（図１２）によって誘発される眼表面損傷を回復させることができることが示される。
【0081】
ＰＤＳＰによる乾燥ストレス誘発性炎症応答の抑制
実験動物の乾燥ストレス誘発ドライアイにおいて炎症が眼表面損傷を増加させ得ることが示唆されている（Ｌｕｏら、２００４；Ｄｅ Ｐａｉｖａら、２００６）。炎症誘発性メディエーターの中で、ＴＮＦ－αまたはインターロイキン－１（ＩＬ－１）遮断薬で前処置されたマウスにおいて乾燥ストレス誘発性ドライアイが改善されたことが報告された［Ｊｉ ＹＷ ２０１３；Ｏｋａｎｏｂｏ Ａ ２０１２］。図４に示されるように、マウスをＣＥＣに１４日間収容した後（０日目に設定；未処置マウス）、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＭＣＰ－１をはじめとする炎症誘発性メディエーターのｍＲＮＡレベルは、非ストレス（ＮＳ）環境に収容されたマウスと比較して、それぞれ３．９倍、２．８倍、２．６倍、および２．４倍有意にアップレギュレートされた。しかし、マウスにおける５日間の局所ＰＤＳＰ処置は、眼のＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＭＣＰ－１のｍＲＮＡ発現を、ビヒクル処置群と比較してそれぞれ２．４倍、１．９倍、２．０倍および１．７倍の倍数で明らかに阻止した。総合すると、本発明者らの結果は、ＰＤＳＰがＤＳ誘発性眼炎症応答を軽減したことを示す。
実験動物の乾燥ストレス誘発ドライアイにおいて炎症が眼表面損傷を増加させ得ることが示唆されている（Ｌｕｏら、２００４；Ｄｅ Ｐａｉｖａら、２００６）。炎症誘発性メディエーターの中で、ＴＮＦ－αまたはインターロイキン－１（ＩＬ－１）遮断薬で前処置されたマウスにおいて乾燥ストレス誘発性ドライアイが改善されたことが報告された［Ｊｉ ＹＷ ２０１３；Ｏｋａｎｏｂｏ Ａ ２０１２］。図４に示されるように、マウスをＣＥＣに１４日間収容した後（０日目に設定；未処置マウス）、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＭＣＰ－１をはじめとする炎症誘発性メディエーターのｍＲＮＡレベルは、非ストレス（ＮＳ）環境に収容されたマウスと比較して、それぞれ３．９倍、２．８倍、２．６倍、および２．４倍有意にアップレギュレートされた。しかし、マウスにおける５日間の局所ＰＤＳＰ処置は、眼のＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＭＣＰ－１のｍＲＮＡ発現を、ビヒクル処置群と比較してそれぞれ２．４倍、１．９倍、２．０倍および１．７倍の倍数で明らかに阻止した。総合すると、本発明者らの結果は、ＰＤＳＰがＤＳ誘発性眼炎症応答を軽減したことを示す。
【0082】
ＰＤＳＰによる脂質過酸化関連眼表面損傷の部分的予防
活性酸素種（ＲＯＳ）の過剰産生に起因する眼表面の酸化的損傷はドライアイの病因に関与している（Ｗａｋａｍａｔｓｕら、２０１３）。本発明者らは、ＰＤＳＰが脂質過酸化関連膜損傷を４－ＨＮＥ免疫組織化学染色を通じて抑制することができるかどうかを調査した。図５Ａに示されるように、角膜上皮の４－ＨＮＥ染色は、マウスをＣＥＣに１４日間収容した後に、上皮翼細胞で核および／または核周囲での局在を示し、以前の報告と一致した（Ｎａｋａｍｕｒａら、２００７）。４－ＨＮＥについて陽性に染色された細胞の数は、ＮＳ、ビヒクルおよびＰＤＳＰ群においてそれぞれ１．９±０．６、２０．１±１．４、および５．３±１．０（図５Ｂ）であった、これはＰＤＳＰが脂質過酸化を防ぐことができることを示す。その上、結膜におけるＤＳ誘発性脂質過酸化も４－ＨＮＥ染色によって評価し、免疫組織化学染色結果は、４－ＨＮＥシグナルがＰＤＳＰ処置を受けた眼よりもビヒクル処理した眼において明らかに強いことを示した、これはＰＤＳＰの抗酸化効果の知見をさらに裏付ける（図５Ｃ）。まとめると、ＰＤＳＰ処置は、眼表面のＤＳ誘導性酸化的損傷を有意に抑制した。
活性酸素種（ＲＯＳ）の過剰産生に起因する眼表面の酸化的損傷はドライアイの病因に関与している（Ｗａｋａｍａｔｓｕら、２０１３）。本発明者らは、ＰＤＳＰが脂質過酸化関連膜損傷を４－ＨＮＥ免疫組織化学染色を通じて抑制することができるかどうかを調査した。図５Ａに示されるように、角膜上皮の４－ＨＮＥ染色は、マウスをＣＥＣに１４日間収容した後に、上皮翼細胞で核および／または核周囲での局在を示し、以前の報告と一致した（Ｎａｋａｍｕｒａら、２００７）。４－ＨＮＥについて陽性に染色された細胞の数は、ＮＳ、ビヒクルおよびＰＤＳＰ群においてそれぞれ１．９±０．６、２０．１±１．４、および５．３±１．０（図５Ｂ）であった、これはＰＤＳＰが脂質過酸化を防ぐことができることを示す。その上、結膜におけるＤＳ誘発性脂質過酸化も４－ＨＮＥ染色によって評価し、免疫組織化学染色結果は、４－ＨＮＥシグナルがＰＤＳＰ処置を受けた眼よりもビヒクル処理した眼において明らかに強いことを示した、これはＰＤＳＰの抗酸化効果の知見をさらに裏付ける（図５Ｃ）。まとめると、ＰＤＳＰ処置は、眼表面のＤＳ誘導性酸化的損傷を有意に抑制した。
【0083】
角膜上皮細胞における高浸透圧ストレス誘発性ＲＯＳの蓄積およびグルタチオン枯渇のＰＤＳＰによる予防
涙液浸透圧の上昇は、ドライアイにおいて炎症および眼表面損傷を誘発する中心的な機構であると考えられている（Ｓｔａｈｌら、２０１２）。ドライアイ診断のための現在のカットオフは、正常な眼の３００～３１０ｍＯｓｍと比較して３１６ ｍＯｓｍである（Ｌｉｕら、２００９）。しかし、角膜上皮細胞の高浸透圧のインビトロ研究、ＲＯＳおよびＭＭＰ－９活性を誘導するために、細胞をより高いレベルの涙液浸透圧（３５０～５００ｍＯｓｍ）に長期間曝すことが必要とされる（Ｌｉ ＤＱ ２００４；Ｌｉ Ｊ ２０１６）。
涙液浸透圧の上昇は、ドライアイにおいて炎症および眼表面損傷を誘発する中心的な機構であると考えられている（Ｓｔａｈｌら、２０１２）。ドライアイ診断のための現在のカットオフは、正常な眼の３００～３１０ｍＯｓｍと比較して３１６ ｍＯｓｍである（Ｌｉｕら、２００９）。しかし、角膜上皮細胞の高浸透圧のインビトロ研究、ＲＯＳおよびＭＭＰ－９活性を誘導するために、細胞をより高いレベルの涙液浸透圧（３５０～５００ｍＯｓｍ）に長期間曝すことが必要とされる（Ｌｉ ＤＱ ２００４；Ｌｉ Ｊ ２０１６）。
【0084】
細胞内ＲＯＳ形成への高浸透圧ストレスの効果を調べるために、ウサギ角膜上皮細胞を、９０ｍＭ ＮａＣｌを添加することによる高浸透圧培地（４６３ｍＯｓＭ）中で２４時間培養した。細胞内ＲＯＳレベルをＨ２ＤＣＦＤＡプローブによって検出し、分光蛍光光度計によってＤＣＦ蛍光の形成を測定した。
【0085】
図６Ａに示されるように、ＤＣＦ蛍光は、張性培地（３０９ｍＯｓｍ）中で培養した細胞と比較して、細胞を高浸透圧培地中で２４時間培養した後に１．６倍増加した。しかし、ＰＤＳＰで前処理したウサギ角膜上皮細胞は、ＮａＣｌ単独で処理した細胞と比較して、１．３倍の倍数でＤＣＦ蛍光レベルの抑制を示した（Ｐ＜０．０４）。対照ペプチド（ＣｏｎｔＰ）前処理はそのような効果を示さなかった。ＮａＣｌ誘発性高浸透圧ストレスはまた、等張環境下の対照細胞と比較して、抗酸化剤であるグルタチオン（ＧＳＨ）のレベルを著しく枯渇させた（図６Ｂ；４６．７±１５．４％対１００±７．０％）が、ＰＤＳＰで再処理した細胞はＧＳＨレベルを７０．５±１１．４％まで有意に増加させた。これらの結果は、ＰＤＳＰが、ＮａＣｌ誘発性高浸透圧ストレス（４６３ｍＯｓＭ）で処理された角膜上皮細胞において、少なくとも部分的にＧＳＨレベルを増強することによって、抗酸化効果を有することを示す。
【0086】
ＰＤＳＰによる角膜上皮細胞における高浸透圧ストレス誘発性ＭＭＰ－９発現の抑制
角膜上皮細胞における高浸透圧ストレス誘発性ＭＭＰ－９発現へのＰＤＳＰの効果を調べるために、細胞をＰＤＳＰまたは対照ペプチド（ＣｏｎＰ）で２０時間前処理し、次に細胞を高浸透圧培地（４６３ｍＯｓＭ）にさらに２４時間曝した。図７Ａに示されるように、ＣｏｎｔＰ／高浸透圧培地で処理した細胞におけるＭＭＰ－９のｍＲＮＡレベルは、等張性培地中で培養した細胞（未処理対照）と比較して、３倍有意にアップレギュレートされた。しかし、ＰＤＳＰ前処理は、ＭＭＰ－９ ｍＲＮＡ発現を２倍の倍数で阻止した。
角膜上皮細胞における高浸透圧ストレス誘発性ＭＭＰ－９発現へのＰＤＳＰの効果を調べるために、細胞をＰＤＳＰまたは対照ペプチド（ＣｏｎＰ）で２０時間前処理し、次に細胞を高浸透圧培地（４６３ｍＯｓＭ）にさらに２４時間曝した。図７Ａに示されるように、ＣｏｎｔＰ／高浸透圧培地で処理した細胞におけるＭＭＰ－９のｍＲＮＡレベルは、等張性培地中で培養した細胞（未処理対照）と比較して、３倍有意にアップレギュレートされた。しかし、ＰＤＳＰ前処理は、ＭＭＰ－９ ｍＲＮＡ発現を２倍の倍数で阻止した。
【0087】
ゼラチンザイモグラフィーも、高浸透圧ストレスが、未処理対照と比較して（ほぼ９０ｋＤａの大きさ；図７Ｂ）、ＭＭＰ－９活性を２．７倍誘導したことを実証した。ザイモグラフィーはさらに、ＰＤＳＰ前処理がＭＭＰ－９活性を３倍阻止したことを示した。これらの結果は、ＰＤＳＰが、高浸透圧ストレスによって誘導されるＭＭＰ－９の発現および活性を抑制することを示す。
【0088】
本発明の実施形態は限られた数の例で説明されている。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、その他の修正形態または変形形態が可能であることを理解するであろう。そのため、保護の範囲は添付の特許請求の範囲によって限定されるべきである。
【図1(A)】
【図1(B)】
【図2(A)】
【図2(B)】
【図3】
【図4】
【図5(A)】
【図5(B)】
【図5(C)】
【図6】
【図7(A)】
【図7(B)】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】