(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-10-18
(45)【発行日】2024-10-28
(54)【発明の名称】単一アッセイを使用した複数の分析物の分析
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20241021BHJP
C40B 40/08 20060101ALI20241021BHJP
C12Q 1/6837 20180101ALI20241021BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20241021BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALN20241021BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 110Z
C40B40/08 ZNA
C12Q1/6837 Z
C12Q1/6844 Z
C12Q1/6876 Z
【請求項の数】
38
(21)【出願番号】P 2021515465
(86)(22)【出願日】2019-11-25
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-09
(86)【国際出願番号】 US2019062945
(87)【国際公開番号】W WO2020112604
(87)【国際公開日】2020-06-04
【審査請求日】2022-11-10
(31)【優先権主張番号】62/773,862
(32)【優先日】2018-11-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】500358711
【氏名又は名称】イルミナ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100107489
【弁理士】
【氏名又は名称】大塩 竹志
(72)【発明者】
【氏名】スティーマーズ， フランク ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】ジャン， ファン
(72)【発明者】
【氏名】ポコロック， ディミトリー ケー．
(72)【発明者】
【氏名】ノーバーグ， スティーブン
【審査官】中野 あい
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５０９１４０（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／０６４６４０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／２１８２２６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】NATURE METHODS，2016年11月，VOL:13, NR:11，PAGE(S):953-958(1-21)，http://dx.doi.org/10.1038/nmeth.4028
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
単一コンパートメントにおいてＲＮＡ及びＤＮＡから同時に生成される核酸ライブラリであって、ｍＲＮＡ分子に由来し、第１のタグを有する核酸を含む第２の鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリと、
ポリＡトランスポゾンを有するトランスポソームを使用して第２のタグ及び３’ポリＡ尾部によりタグメント化されたゲノムＤＮＡに由来する、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）ライブラリと、
を含み、
前記ｃＤＮＡ及びｇＤＮＡライブラリが共コンパートメント化され、同じ環境で調製される、核酸ライブラリ。
【請求項2】
前記ｇＤＮＡライブラリが、タグメンテーション試薬を用いて得られる、請求項１に記載の核酸ライブラリ。
【請求項3】
前記タグメンテーション試薬が、前記３’ポリＡ尾部を前記ｇＤＮＡに結合させる、請求項２に記載の核酸ライブラリ。
【請求項4】
前記第１のタグが前記ｍＲＮＡ分子の逆転写によって前記第２の鎖ｃＤＮＡに結合されることによって、第１の鎖ｃＤＮＡを生成し、その後、タグメンテーションもしくは鋳型スイッチングが行われ、前記３’ポリＡ尾部がタグメンテーションによって前記ｇＤＮＡに結合される、請求項１に記載の核酸ライブラリ。
【請求項5】
前記核酸ライブラリが固体支持体に結合している、請求項１に記載の核酸ライブラリ。
【請求項6】
前記固体支持体が、基質、エッチングされた表面、ウェル、被覆されたウェル、密封されたウェル、アレイ、フローセル装置、マイクロ流体チャネル、ビーズ、磁気ビーズ、カラム、液滴、又は微粒子である、請求項５に記載の核酸ライブラリ。
【請求項7】
前記第１及び第２のタグが基質認識配列を更に含む、請求項１に記載の核酸ライブラリ。
【請求項8】
前記第１のタグの前記基質認識配列が、前記第２のタグの前記基質認識配列と同じである、請求項７に記載の核酸ライブラリ。
【請求項9】
前記第１及び第２のタグが同じである、請求項１に記載の核酸ライブラリ。
【請求項10】
前記核酸ライブラリが、細胞の集団、単一の細胞、細胞核の集団、又は単一の細胞核から作製される、請求項１に記載の核酸ライブラリ。
【請求項11】
前記第１のタグがポリＡタグである、請求項１に記載の核酸ライブラリ。
【請求項12】
前記ｇＤＮＡの前記３’ポリＡ尾部がトランスポザーゼ特異的要素を含む、請求項１に記載の核酸ライブラリ。
【請求項13】
試料からの単一コンパートメントにおいてｇＤＮＡ及びＲＮＡライブラリを同時に調製する方法であって、ｇＤＮＡ及びＲＮＡを含む試料を提供することであって、前記ＲＮＡは３’ポリＡ尾部を含む、提供することと、
タグ付けされたｇＤＮＡを生成するように、ポリＡトランスポゾンを有するトランスポソームを使用して３’ポリＡ尾部でｇＤＮＡをタグメント化することと、
単一コンパートメント中の前記試料を、前記ＲＮＡを捕捉するための第１の共通配列（ＣＳ１）を含む第１のポリＴ捕捉プローブ及び前記タグ付けされたｇＤＮＡを捕捉するための前記ＣＳ１を含む第２のポリＴ捕捉プローブと接触させることであって、前記第１のポリＴ捕捉プローブは第１のバーコードを含み、前記第２のポリＴ捕捉プローブは第２のバーコードを含み、前記第１のバーコード及び前記第２のバーコードが、前記ＲＮＡとｇＤＮＡの共通の供給源を識別する、接触させることと、
前記第１のポリＴ捕捉プローブを前記ＲＮＡに、及び前記第２のポリＴ捕捉プローブを前記タグ付けされたｇＤＮＡにハイブリダイズし、それによって前記タグ付けされたｇＤＮＡと前記ＲＮＡを同時に捕捉することと、
前記ＲＮＡを、ｃＤＮＡに変換させることと、
前記ｃＤＮＡ及び前記タグ付けされたｇＤＮＡをタグメント化して第２の共通配列（ＣＳ２）と分子インデックスを組み込むことと、
ｃＤＮＡライブラリとｇＤＮＡライブラリとを同時に生成することと
を含む、方法。
【請求項14】
前記第１及び第２のポリＴ捕捉プローブが固体支持体上に固定化されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記第１及び第２のポリＴ捕捉プローブが基質認識配列を更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
前記第１のポリＴ捕捉プローブの前記基質認識配列が、前記第２のポリＴ捕捉プローブの前記基質認識配列と同じである、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記試料が、細胞の集団、単一細胞、細胞核の集団、又は細胞核である、請求項１３に記載の方法。
【請求項18】
前記第１のポリＴ捕捉プローブが、前記３’ポリＡ尾部に特異的に結合する捕捉タグを含み、前記第２のポリＴ捕捉プローブが、前記３’ポリＡ尾部に特異的に結合する捕捉タグを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項19】
前記タグ付けされたｇＤＮＡの前記３’ポリＡ尾部が、前記ＲＮＡの前記３’ポリＡ尾部と同じである、請求項１３に記載の方法。
【請求項20】
前記ＲＮＡ及び前記ｇＤＮＡが、ライゲーション、逆転写（ＲＴ）、転位、又は他のインデックス化手段を使用して、前記３’ポリＡ尾部で修飾される、請求項１３に記載の方法。
【請求項21】
前記第１及び第２のバーコードが同じである、請求項１３に記載の方法。
【請求項22】
前記固体支持体が、基質、エッチングされた表面、ウェル、被覆されたウェル、密封されたウェル、アレイ、フローセル装置、マイクロ流体チャネル、ビーズ、磁気ビーズ、カラム、液滴、又は微粒子である、請求項１４に記載の方法。
【請求項23】
ＤＮＡ分析、ＲＮＡ分析、タンパク質分析、タグメンテーション、核酸増幅、核酸配列決定、シーケンシングを使用したトランスポザーゼアクセス可能なクロマチンのアッセイ（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）、連続性保存転位（ＣＰＴ－ｓｅｑ）、単一細胞のコンビナトリアルインデクシングによる配列決定（ＳＣＩ－ｓｅｑ）、又は単一細胞ゲノム増幅、又はこれらの任意の組合せをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項24】
第３のタグでタグ付けされているタンパク質を前記単一コンパートメントにおいて同時に分析することを更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項25】
前記試料が細胞を含み、前記細胞が固定剤で固定されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項26】
前記固定剤が、メタノール若しくはエタノールなどのアルコール、又はパラホルムアルデヒドなどのアルデヒドを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡを含む単一コンパートメントにおいてＲＮＡ及びＤＮＡライブラリを同時に作製する方法であって、ｇＤＮＡ及びＲＮＡを含む試料を提供することであって、前記ＲＮＡは３’ポリＡ尾部を含む、提供することと、
ポリＡトランスポゾンを有するタグ付けされたｇＤＮＡを生成するように、トランスポソームを使用して３’ポリＡ尾部でｇＤＮＡをタグメント化することと、
単一コンパートメントにおいて前記試料を、前記ＲＮＡを捕捉するための第１の共通配列（ＣＳ１）を含む第１のポリＴ捕捉プローブ及び前記タグ付けされたｇＤＮＡを捕捉するための前記ＣＳ１を含む第２のポリＴ捕捉プローブと接触させることであって、前記第１のポリＴ捕捉プローブは第１のバーコードを含み、前記第２のポリＴ捕捉プローブは第２のバーコードを含み、前記第１のバーコード及び前記第２のバーコードが、前記ｇＤＮＡとＲＮＡの共通の供給源を識別する、接触させることと、
前記第１のポリＴ捕捉プローブを前記ＲＮＡに、前記第２のポリＴ捕捉プローブを前記タグ付けされたｇＤＮＡにハイブリダイズし、それによって、前記タグ付けされたｇＤＮＡ及び前記ＲＮＡを同時に捕捉することと、
前記ＲＮＡをｃＤＮＡに変換させることと、
前記ｃＤＮＡ及び前記タグ付けされたｇＤＮＡをタグメント化して第２の共通配列（ＣＳ２）と分子インデックスを組み込むことと
を含む方法。
【請求項28】
前記第１及び第２のポリＴ捕捉プローブが固体支持体上に固定化されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記第１及び第２のポリＴ捕捉プローブが基質認識配列を更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項30】
前記第１のポリＴ捕捉プローブの前記基質認識配列が、前記第２のポリＴ捕捉プローブの前記基質認識配列と同じである、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記試料が、細胞の集団、単一細胞、細胞核の集団、又は細胞核である、請求項２７に記載の方法。
【請求項32】
前記第１のポリＴ捕捉プローブが、前記３’ポリＡ尾部に特異的に結合する捕捉タグを含み、前記第２のポリＴ捕捉プローブが、前記３’ポリＡ尾部に特異的に結合する捕捉タグを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項33】
前記タグ付けされたｇＤＮＡの３’ポリＡ尾部が、前記ＲＮＡの前記３’ポリＡ尾部と同じである、請求項２７に記載の方法。
【請求項34】
前記ＲＮＡ及び前記ｇＤＮＡが、ライゲーション、逆転写（ＲＴ）、転位、又は他のインデックス化手段を使用して、前記３’ポリＡ尾部で修飾される、請求項２７に記載の方法。
【請求項35】
前記第１及び第２のバーコードが同じである、請求項２７に記載の方法。
【請求項36】
前記固体支持体が、基質、エッチングされた表面、ウェル、被覆されたウェル、密封されたウェル、アレイ、フローセル装置、マイクロ流体チャネル、ビーズ、磁気ビーズ、カラム、液滴、又は微粒子である、請求項２８に記載の方法。
【請求項37】
前記試料が細胞を含み、前記細胞が固定剤で固定されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項38】
前記固定剤が、メタノール若しくはエタノールなどのアルコール、又はパラホルムアルデヒドなどのアルデヒドを含む、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書で提供されるシステム、方法、及び組成物は、単一試料中の複数の分析物を同時に分析するためのアッセイに関する。具体的には、本明細書に開示される態様は、単一のアッセイにおいて単一の試料由来のＤＮＡ及びＲＮＡを分析する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
生物学的試料中に存在する特定の核酸配列の検出は、例えば、微生物を同定及び分類する、感染症を診断する、遺伝子異常を検出及び特徴付ける、癌に関連する遺伝的変化を同定する、疾患に対する遺伝的感受性を調べる、並びに様々な種類の治療に対する応答を測定するための方法として使用されてきた。生物学的試料中の特定の核酸配列を検出するための一般的な技術は、核酸配列決定である。
【0003】
全ゲノムシーケンシング、遺伝子型決定、標的リシーケンシング、遺伝子発現、単一細胞ゲノミクス、エピゲノミクス、及び組織試料のタンパク質発現分析は、疾患のバイオマーカを識別し、疾患を正確に診断及び予後判定し、患者のための適切な治療を選択するために非常に重要であり得る。多くの場合、これは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はタンパク質などの関心対象の特定の分析物を別々に分析するための複数のアッセイを必要とする。これらの分析物を別々に及び個々に分析するための様々なアッセイが確立されている。しかしながら、複数の分析物の包括的な分析は時間がかかり、且つ面倒である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
本開示は、単一のアッセイを使用して試料中の複数の分析物を同時に分析するためのシステム、方法、及び組成物に関する。
【0005】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、核酸ライブラリに関する。いくつかの実施形態では、ライブラリは、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリ及びゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）ライブラリを含む。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡライブラリはｍＲＮＡ分子に由来し、第１のバーコードを含む第１のタグを有する核酸を含む。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡライブラリはゲノムＤＮＡに由来し、第２のバーコードを含む第２のタグを有する核酸を含む。いくつかの実施形態では、第１のバーコード及び第２のバーコードは同じであるか又は異なり、第１のバーコード及び第２のバーコードは、ｃＤＮＡライブラリ及びｇＤＮＡライブラリの共通の供給源を識別する。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ及びｇＤＮＡライブラリは、共コンパートメント化され、同じ環境で調製される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ用のタグとＲＮＡ用のタグは同じである。
【0006】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、フローセル装置に関する。いくつかの実施形態では、フローセル装置は、第１のバーコードと第１の基質認識配列を含む、ＲＮＡを捕捉するための第１のプローブ、及び第２のバーコードと第２の基質認識配列を含む、ＤＮＡを捕捉するための第２のプローブを含む。いくつかの実施形態では、第１のバーコード及び第２のバーコードは同じであるか又は異なり、第１のバーコード及び第２のバーコードは、ＲＮＡとＤＮＡの共通の供給源を識別する。いくつかの実施形態では、第１のプローブ及び第２のプローブは、試料由来のＲＮＡ及びＤＮＡを単一コンパートメントにおいて同時に分析するように構成される。第１及び第２の捕捉プローブが固体支持体上に固定化されている、請求項１９に記載の方法。
【0007】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、試料からのＤＮＡ及びＲＮＡを単一コンパートメントにおいて同時に分析する方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む試料を提供することであって、ＲＮＡは第１のタグを含み、ＤＮＡを第２のタグで差別的にタグ付けすることと、単一コンパートメント中の試料を、ＲＮＡを捕捉するための第１の捕捉プローブ及びタグ付けされたＤＮＡを捕捉するための第２の捕捉プローブと接触させることと、第１の捕捉プローブをＲＮＡに、及び第２の捕捉プローブをＤＮＡにハイブリダイズし、それによってＲＮＡとＤＮＡを捕捉することと、及びＤＮＡ及びＲＮＡを分析することと、を含む。いくつかの実施形態では、第１の捕捉プローブは第１のバーコードを含み、第２の捕捉プローブは第２のバーコードを含み、第１のバーコードと第２のバーコードは、ＲＮＡとＤＮＡの共通の供給源を識別する。
【0008】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡを含む核酸ライブラリを単一コンパートメントにおいて同時に作製する方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む試料を提供することであって、ＲＮＡは第１のタグを含み、ＤＮＡを第２のタグで差別的にタグ付けすることと、単一コンパートメントにおいて試料を、ＲＮＡを捕捉するための第１の捕捉プローブ及びタグ付けされたＤＮＡを捕捉するための第２の捕捉プローブと接触させることと、ＲＮＡとＤＮＡをそれぞれ第１と第２のプローブにハイブリダイズすることと、並びにハイブリダイズしたＲＮＡとＤＮＡからｃＤＮＡライブラリ及びｇＤＮＡライブラリを同時に作製することと、を含む。いくつかの実施形態では、第１のプローブは第１のバーコードを含み、第２のプローブは第２のバーコードを含み、第１のバーコード及び第２のバーコードは、ＲＮＡとＤＮＡの共通の供給源を識別する。
【0009】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、試料中のＤＮＡ及びＲＮＡを単一コンパートメントにおいて同時に分析するためのキットに関する。いくつかの実施形態では、キットは、転位試薬並びに第１のタグに相補的な第１のプローブ及び第２のタグに相補的な第２のプローブを含み、第１のプローブ及び第２のプローブは固体支持体上に固定化されており、第１のプローブは第１のバーコードを含み、第２のプローブは第２のバーコードを含み、第１及び第２のバーコードは、ＤＮＡとＲＮＡの共通の供給源を識別する。
【0010】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、単一細胞ＡＴＡＣ－ｓｅｑ解析を実施する方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞又は核の集団を含む試料を提供することと、標的核酸上で連続性保存転位を実施することと、細胞又は核の集団を個々の液滴に分配することであって、単一の細胞又は核は単一の液滴に分配される、標的核酸をインデックス化すること、及びインデックス付き核酸を分析する、分配することを含む。
【0011】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、コンビナトリアルインデクシング（ＣＰＴ－ｓｅｑ）の方法に関する。いくつかの実施形態では、この方法は、細胞又は核の集団を含む試料を提供することであって、標的核酸上で個別にインデックス化された連続性保存転位を実施することと、細胞又は核の集団を個々の液滴に分配すること、複数の細胞又は核は単一の液滴に分配され、単一の液滴内の複数の細胞又は核は固有のインデックスを有する、分配することと、標的核酸をインデックス化することと、及びインデックス付き核酸を分析することと、を含む。
【0012】
本明細書に要約される実施形態のいずれにおいても、分析物は、細胞の集団、単一細胞、細胞核の集団、又は１つの細胞核から得られる。本明細書に要約される実施形態のいずれにおいても、分析物は、分析物が何であるかに依存して、様々な分析を使用して分析される。例えば、分析には、ＤＮＡ分析、ＲＮＡ分析、タンパク質分析、タグメンテーション、核酸増幅、核酸配列決定、核酸ライブラリの作製、シーケンシングを使用したトランスポザーゼアクセス可能なクロマチンのアッセイ（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）、連続性保存転位（ＣＰＴ－ｓｅｑ）、単一細胞のコンビナトリアルインデクシングによる配列決定（ＳＣＩ－ｓｅｑ）、又は単一細胞ゲノム増幅、又はこれらの任意の組合せが含まれる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【0014】
【図2】ＤＮＡ及びＲＮＡに結合するための異なるタグを使用した共アッセイの一実施形態を表示する概略図である。異なるタグは、ＲＮＡ又はＤＮＡを有する単一の細胞又は核に導入されるものとして示されている。単一の細胞又は核は、液滴内に封入されるか、又はプレートのウェル上で分離される。バーコードは、表面上に固定化されるか、又は溶液中に添加され、タグを介してＤＮＡ及びＲＮＡを捕捉する。
【0015】
【図3】ＤＮＡ及びＲＮＡに結合するための同じタグを使用した共アッセイの一実施形態を表示する概略図である。ＤＮＡは、最初に、ポリＡ尾部を含むようにトランスポソームによって断片化される。ＤＮＡ断片及びｍＲＮＡの両方は、表面上又は溶液中に固定化されたバーコードを有するポリＴオリゴヌクレオチドを使用してインデックス化される。ＤＮＡ上で行われる転位反応は、ＤＮＡが内部トランスポゾン特異的配列によってＲＮＡと区別されることを可能にする。
【0016】
【図4】転位によってポリＡトランスポゾンをゲノムＤＮＡに導入するためのプロセスの一実施形態を表示する概略図である。核／細胞は、ポリＴ尾部を有するインデックス付きオリゴヌクレオチドで封入される。インデックス付きオリゴヌクレオチドを転位したｇＤＮＡ断片にハイブリダイズ及びライゲートし、次いでｍＲＮＡとハイブリダイズして第１のｃＤＮＡを作製する。第２のｃＤＮＡの合成後、二本鎖ｃＤＮＡ及びｇＤＮＡを再び転位させて、他方の末端にＰＣＲアダプタを付加する。次いで、断片をＰＣＲによって増幅する。
【0017】
【0018】
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【図10】ＳＣＩ－ｓｅｑなどのコンビナトリアルインデクシングを使用して実施される共アッセイの一実施形態を例示する概略図である。
【0023】
【図11】コンビナトリアル配列決定を使用して共アッセイを実施する方法の一実施形態を例示する概略図である。
【0024】
【図12】配列決定ワークフローの例示的な実施形態を表示し、バーコードが挿入されたビーズプールを示し、例示的なプライマを表示する。
【0025】
【図13】細胞当たりのリード数を表示するグラフを示し、トランスポザーゼの増加が細胞当たりのリード数の増加をもたらすことを示す。
【0026】
【図14】細胞型の混合物に関するＡＴＡＣ－ｓｅｑを使用した単一細胞の感受性を示すグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【0027】
以下の詳細な説明では、添付の図面を参照し、添付の図面は本明細書の一部をなす。図面において、同様の記号は、文脈上特に指示されない限り、典型的には同様の構成要素を特定する。詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲に記載される例示的な実施形態は、限定することを意図するものではない。本明細書に提示される主題の精神又は範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、他の変更を加え得る。本開示の態様は、本明細書に一般的に記載され、図面に例示されるように、多種多様な異なる構成で配置され、置換され、組み合わされ、分離され、及び設計され得ることが容易に理解され、それらのすべてが本明細書で明示的に企図されている。
【0028】
本明細書で提供されるシステム、方法、及び組成物の実施形態は、単一試料中の複数の分析物の同時分析に関する。いくつかの実施形態では、複数の分析物は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。
【0029】
単一の試料から複数の分析物を分析する従来の方法は、個別の試薬の使用、及び、例えば図１Ａに示すように、関心対象の各分析物を単離し、次いで関心対象の各分析物を分析する工程を含む、個別のアッセイを必要とする。したがって、分析物は、時間及び／又は空間ごとに、例えば、異なる時間に又は異なるコンパートメントで別々に分析され得る。例えば、単一の試料由来のＤＮＡ及びＲＮＡの両方を分析することが望ましい場合がある。従来の方法は、別々に、１つのアッセイを使用してＤＮＡを分析し、別のアッセイを使用してＲＮＡを分析するため、時間、コスト、及び資源の消費が増加する。更に、同じ試料にタンパク質などの更なる関心対象の分析物も含まれる場合があり、タンパク質の分析にも別個のアッセイが必要である。
【0030】
核酸ライブラリは、遺伝子産物を決定するため、又は全ゲノム配列決定のために有用である。統合的エピゲノム解析の迅速で高感度な方法である、シーケンシング（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）を使用したトランスポザーゼアクセス可能なクロマチンのアッセイなどによって、エピゲノミクスにおける使用を含む、様々な種類のライブラリ、例えば、逆転写されたＲＮＡ又はゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）ライブラリから作製される相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリが作製され得る。従来、これらのライブラリは個別に独立して作製される。ｃＤＮＡライブラリは、例えば、新規遺伝子の発見を含む多くの用途のため、遺伝子機能を研究するため、ｍＲＮＡ発現を決定するため、又は選択的スプライシングを決定するために有用であり得る。ｇＤＮＡライブラリは、例えば、生物の完全なゲノムを決定すること、調節配列の機能を研究すること、又は遺伝子突然変異を研究することを含む、多くの別個の用途に有用であり得る。本明細書に記載される方法、組成物、及びシステムは、ｃＤＮＡ及びｇＤＮＡライブラリの両方の同時作製を可能にする。
【0031】
本発明の一実施形態は、単一のアッセイを使用して単一の試料中の複数の分析物を分析するためのシステム及び方法であり、関心対象の各分析物は、例えば図１Ｂに示すように、単一コンパートメントにおいて同時に分析される。図１Ｂは、試料中の２つの分析物を表示するが、２つより多い関心対象の分析物が存在する可能性があり、関心対象の各分析物が同時に分析され得ることが理解されるべきである。本明細書に記載されるシステム、方法、及び組成物は、単一の試料中の複数の分析物の同時分析に関する。システム、方法、及び組成物の実施形態は、アッセイの複雑さ、コスト、及び時間を減少させることによって分析効率を改善する。
【0032】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、核酸ライブラリに関する。いくつかの実施形態では、核酸ライブラリは、ｍＲＮＡ分子に由来し、基質及びバーコード配列に結合するように構成された第１のタグを有する核酸を含むｃＤＮＡライブラリ、並びにゲノムＤＮＡに由来し、基質に結合するように構成された第１のタグとは異なる第２のタグを有する核酸を含むｇＤＮＡライブラリを含む。いくつかの実施形態では、核酸ライブラリは、細胞の集団、単一細胞、細胞核の集団、又は１つの細胞核から作製される。いくつかの実施形態では、第１のタグはポリＡタグである。いくつかの実施形態では、第２のタグは、トランスポザーゼ特異的要素を含む。
【0033】
いくつかの実施形態では、本方法は、関心対象の各分析物をタグでタグ付けして、関心対象の各分析物をインデックス化することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、関心対象の各分析物を、タグに相補的なプローブで捕捉することを更に含む。いくつかの実施形態では、本方法は、関心対象の各分析物を分析することを更に含む。
【0034】
いくつかの実施形態では、本方法は、試料からのＤＮＡ及びＲＮＡを同時に分析することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む試料を提供することを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは第１のタグを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、第２のタグでＤＮＡを差別的にタグ付けすることを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、固体支持体を試料と接触させることを含み、固体支持体は、ＲＮＡを捕捉するための第１の固定化プローブと、タグ付きＤＮＡを捕捉するための第２の固定化プローブとを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡを固体支持体上に同時に捕捉することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡを分析することを含む。
【0035】
本明細書で使用される場合、試料は、関心対象の分析物を有する任意の試料を含む。試料は、例えば、全血、血清、間質液、リンパ液、脳脊髄液、痰、尿、便、乳、汗、涙、臍帯、末梢血、骨髄、細胞又は固形組織を含む、関心対象の分析物を有する生物学的試料などの、生物学的試料であり得る。いくつかの実施形態では、試料は、細胞の集団、単一細胞、細胞核の集団、又は１つの細胞核である。試料は、対象から得ることができ、対象からの１つ以上の関心対象の分析物を分析することが望ましい。本明細書で使用される場合、「対象」とは、治療、観察、又は実験の対象である動物を指す。「動物」は、魚、甲殻類、爬虫類、及び特に哺乳動物などの、冷血及び温血脊椎動物及び無脊椎動物を含む。「哺乳動物」には、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、サル、チンパンジー及び類人猿などの霊長動物、並びに特にヒトが含まれるが、これらに限定されない。
【0036】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、関心対象の複数の分析物を同時に分析する方法に関し、関心対象の分析物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、又は他の任意の細胞生体分子、又は関心対象の他の標的分子のうちの１つ以上である。
【0037】
試料は、環境源から得られた流体又は標本であり得る。例えば、環境源から得られる流体又は標本は、食品、農産物、鶏肉、食肉、魚、飲料、乳製品、水（廃水を含む）、池、川、貯水池、水泳用プール、土壌、食品加工及び／又は包装工場、農業用地、水産養殖（水耕食品農場を含む）、医薬品製造工場、動物コロニー施設、又はこれらの任意の組合せから得られる又はそれに由来し得る。いくつかの実施形態では、試料は、細胞培養物又は微生物コロニーから収集される又はそれに由来する流体又は標本である。
【0038】
本明細書で使用される場合、「分析物」、「標的分析物」、「関心対象の分析物」は、互換的に使用され、本明細書に開示される方法及びシステムで測定される分析物を指す。いくつかの実施形態では、分析物は生体分子であり得る。生体分子の非限定的な例には、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）、タンパク質、脂質、及び炭水化物などの高分子が含まれる。特定の例では、分析物は、ホルモン、抗体、成長因子、サイトカイン、酵素、受容体（例えば、神経、ホルモン、栄養素、及び細胞表面受容体）又はそれらのリガンド、癌マーカ（例えば、ＰＳＡ、ＴＮＦ－α）、心筋梗塞のマーカ（例えば、トロポニン、クレアチンキナーゼなど）、毒素、薬物（例えば、中毒薬物）、代謝剤（例えば、ビタミンを含む）などであり得る。タンパク質分析物の非限定的な実施形態には、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質断片、タンパク質複合体、融合タンパク質、組換えタンパク質、リンタンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、オリゴヌクレオチドでタグ付けされたタンパク質などが含まれる。標的分析物は核酸であり得る。
【0039】
標的核酸は、試料中の核酸の平均サイズが、約２ｋｂ、１ｋｂ、５００ｂｐ、４００ｂｐ、２００ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ、それ未満若しくはそれ以上、又は前述のサイズのいずれか２つの間の範囲である試料を含むことができる。いくつかの実施形態では、試料中の核酸の平均サイズは、約２０００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、それ未満若しくはそれ以上、又は上記のサイズのいずれか２つの間の範囲である。
【0040】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、互換的に使用され得、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すことができる。したがって、これらの用語は、一本鎖、二本鎖、又は多重鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを含む。ポリヌクレオチドの例には、遺伝子又は遺伝子断片、全ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、エピゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、調節ＲＮＡ、転写ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、例えばＰＩＷＩ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及び長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、小さなヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、小さな核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小さな核ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）及びウイルスＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、プライマ、又は前述のいずれかの増幅されたコピーが含まれる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチド、及び非天然塩基を有するヌクレオチド、アザプリン又はデアザプリンなどの修飾天然塩基を有するヌクレオチドを含むヌクレオチド類似体を含むことができる。ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；及びチミン（Ｔ）の特定の配列で構成することができる。ウラシル（Ｕ）はまた、例えば、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合に、チミンの天然代替物として存在することができる。ウラシルは、ＤＮＡにも使用することができる。「核酸配列」という用語は、天然及び非天然塩基を含む、ポリヌクレオチド又は任意の核酸分子のアルファベット表示を指すことができる。
【0041】
核酸は、ホスホジエステル結合を含むことができ、例えば、ホスホルアミド、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、Ｏ－メチルホスホロアミダイト及びペプチド核酸の骨格及び結合を含む、他の種類の骨格を含むことができる。核酸は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの任意の組合せ、並びにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンを含む塩基、及びニトロピロール（３－ニトロピロールを含む）及びニトロインドール（５－ニトロインドールを含む）などの塩基類似体の任意の組合せを含むことができる。いくつかの実施形態では、核酸は、少なくとも１つの無差別塩基を含むことができる。無差別塩基は、複数の異なる種類の塩基と塩基対合することができ、例えば、ゲノムＤＮＡ試料などの複雑な核酸試料でのランダムハイブリダイゼーションに使用されるオリゴヌクレオチドプライマ又はインサートに含まれる場合、有用であり得る。無差別塩基の例には、アデニン、チミン、又はシトシンと対合し得るイノシンが含まれる。他の例には、ヒポキサンチン、５－ニトロインドール、非環式５－ニトロインドール、４－ニトロピラゾール、４－ニトロイミダゾール及び３－ニトロピロールが含まれる。少なくとも２種、３種又は４種以上の塩基と塩基対合することができる無差別塩基を使用することができる。
【0042】
本明細書で使用される場合、同時という用語は、同時に又は実質的に同時に起こる作用を指す。したがって、複数の分析物の同時分析は、単一のアッセイにおいて同時に又は実質的に同時に複数の分析物を分析することを指す。同様に、配列決定可能な要素の同時収集又は導出は、同時に又は実質的に同時に配列決定可能な要素を収集又は導出することを指す。
【0043】
本明細書で使用される場合、タグという用語は、関心対象の分析物を後で単離、同定、追跡、又は分析することができるように、関心対象の１つ又は複数の分析物に対する修飾を指す。したがって、タグは、試料中の関心対象の分析物を識別することができる。タグは、例えば、ポリアデニル化（ポリＡ）タグを含み得る。いくつかの実施形態では、タグは、少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも３５ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも４５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、若しくは５０ヌクレオチド以上の長さ、又は前述の長さのいずれか２つの範囲内の長さを有するヌクレオチド配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、タグ付けはタグメンテーションによって実施される。本明細書で使用される場合、「タグメンテーション」は、トランスポゾンが標的核酸を切断し、切断された標的核酸の末端にアダプタ配列を付加するように、標的核酸へのトランスポゾンの挿入を指すことができる。タグ付けの例示的方法は、米国特許第９，１１５，３９６号、同第９，０８０，２１１号、同第９，０４０，２５６号、米国特許出願公開第２０１４／０１９４３２４号に開示されており、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、タグは、関心対象の各分析物について同じであるか又は異なる。例えば、関心対象の各分析物は、同じタグでタグ付けされ得るか、又は異なるタグでタグ付けされ得る。示差的なタグ付けは、例えば、ＤＮＡなどの関心対象の１つの分析物を、タグ付けがＲＮＡなどの関心対象の別の分析物のタグ付けとは異なる又は区別できるようにタグ付けすることを指す。いくつかの実施形態では、タグは各分析物について異なるが、タグの関係は予め知られている。
【0044】
トランスポゾンベースの技術は、例えば、ＮＥＸＴＥＲＡ（商標）ＸＴ及びＦＬＥＸ ＤＮＡ試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）のワークフローに例示されるように、ＤＮＡを断片化するために利用することができ、ゲノムＤＮＡなどの標的核酸が、標的を同時に断片化及びタグ付け（タグメンテーション）するトランスポソーム複合体で処理され、それによって断片の末端に固有のアダプタ配列でタグ付けされた断片化された核酸分子の集団を作製する。
【0045】
転位反応は、１つ以上のトランスポゾンがランダムな部位又はほぼランダムな部位で標的核酸に挿入される反応である。転位反応の構成要素には、トランスポザーゼ（又はインテグラーゼなどの、本明細書に記載の核酸を断片化及びタグ付けすることができる他の酵素）、及びトランスポザーゼ（又は本明細書に記載の他の酵素）に結合する二本鎖トランスポゾン末端配列を含むトランスポゾン要素、及び２つのトランスポゾン末端配列のうちの１つに結合されたアダプタ配列が含まれる。二本鎖トランスポゾン末端配列の一方の鎖は、標的核酸の一方の鎖に転位され、相補的なトランスポゾン末端配列鎖は転位されない（非転位トランスポゾン配列）。アダプタ配列は、必要に応じて又は所望に応じて、１つ以上の機能的配列又は構成要素（例えば、プライマ配列、アンカー配列、ユニバーサル配列、スペーサ領域、又はインデックスタグ配列）を含むことができる。
【0046】
「トランスポソーム複合体」は、少なくとも１つのトランスポザーゼ（又は本明細書に記載の他の酵素）及びトランスポゾン認識配列から構成される。いくつかのそのようなシステムでは、トランスポザーゼは、トランスポゾン認識配列に結合して、転位反応を触媒することができる機能的複合体を形成する。いくつかの態様では、トランスポゾン認識配列は、二本鎖トランスポゾン末端配列である。トランスポザーゼは、標的核酸内のトランスポザーゼ認識部位に結合し、トランスポゾン認識配列を標的核酸に挿入する。いくつかのそのような挿入事象では、トランスポゾン認識配列（又は末端配列）の１つの鎖が標的核酸に転位され、切断事象をもたらす。本開示のトランスポザーゼと共に使用するために容易に適合させることができる例示的な転位手順及びシステムは、例えば、国際公開第１０／０４８６０５号、米国特許出願公開第２０１２／０３０１９２５号、米国特許出願公開第２０１２／１３４７００８７号、又は米国特許出願公開第２０１３／０１４３７７４号に記載されており、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0047】
本明細書で提供される特定の実施形態と共に使用できる例示的なトランスザーゼには、以下のものが含まれる（又は以下のものによってコードされる）：Ｔｎ５トランスポザーゼ（Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９９，２６６，７２９－７３４参照）、スリーピングビューティ（ＳＢ）トランスポザーゼ、ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ）（Ａｇｉｌｅｎｔによって特徴付けられ、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＱＸＴ製品で使用されるトランスポザーゼ）、Ｒ１及びＲ２末端配列を含むＭｕＡトランスポザーゼ及びＭｕトランスポザーゼ認識部位（Ｍｉｚｕｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｃｅｌｌ，３５：７８５，１９８３；Ｓａｖｉｌａｈｔｉ，Ｈ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１４：４８９３，１９９５）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｔｎ５５２（Ｃｏｌｅｇｉｏ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８３：２３８４－８，２００１；Ｋｉｒｂｙ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３：１７３－８６，２００２）、Ｔｙ１（Ｄｅｖｉｎｅ ＆ Ｂｏｅｋｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２：３７６５－７２，１９９４及び国際公開第９５／２３８７５号）、トランスポゾンＴｎ７（Ｃｒａｉｇ，Ｎ．Ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７１：１５１２，１９９６；Ｃｒａｉｇ，Ｎ．Ｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０４：２７－４８，１９９６）、Ｔｎ／Ｏ及びＩＳ１０（Ｋｌｅｃｋｎｅｒ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０４：４９－８２，１９９６）、マリナートランスポザーゼ（Ｌａｍｐｅ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１５：５４７０－９，１９９６）、Ｔｃ１（Ｐｌａｓｔｅｒｋ，Ｒ．Ｈ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０４：１２５－４３，１９９６）、Ｐエレメント（Ｇｌｏｏｒ，Ｇ．Ｂ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６０：９７－１１４，２００４）、Ｔｎ３（Ｉｃｈｉｋａｗａ ＆ Ｏｈｔｓｕｂｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１８８２９－３２，１９９０）、細菌挿入配列（Ｏｈｔｓｕｂｏ ＆ Ｓｅｋｉｎｅ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０４：１－２６，１９９６）、レトロウイルス（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：２５２５－９，１９８９）、並びに酵母のレトロトランスポゾン（Ｂｏｅｋｅ ＆ Ｃｏｒｃｅ（ｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：４０３－３４，１９８９）。更なる例には、ＩＳ５、Ｔｎ１０、Ｔｎ９０３、ＩＳ９１１、及びトランスポゼスファミリー酵素の改変型（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００９）ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．５：ｅ１０００６８９．Ｅｐｕｂ Ｏｃｔ．１６；Ｗｉｌｓｏｎ Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ７１：３３２－５）が含まれ、トランスポザーゼに関して本明細書で引用される参考文献は、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される方法はまた、単一のトランスポザーゼだけでなく、トランスポザーゼの組合せを含み得る。
【0048】
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｎ５、ＭｕＡ，、又はビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）トランスポザーゼ、又はこれらの活性変異体である。他の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼ又はその活性変異体である。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼ（例えば、Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，国際公開第２００１／００９３６３号、米国特許第５，９２５，５４５号、同第５，９６５，４４３号、同第７，０８３，９８０号、及び同第７，６０８，４３４，号、並びにＧｏｒｙｓｈｉｎ ａｎｄ Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：７３６７，１９９８参照）、又はその活性変異体である。いくつかの態様では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１５／１６０８９５号に記載されているＴｎ５トランスポザーゼである。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼは融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼ融合タンパク質は、融合した伸長因子Ｔｓ（Ｔｓｆ）タグを含む。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型配列と比較してアミノ酸５４、５６、及び３７２に突然変異を含む高活性Ｔｎ５トランスポザーゼである。いくつかの実施形態では、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼは融合タンパク質であり、任意で、融合タンパク質は伸長因子Ｔｓ（Ｔｓｆ）である。いくつかの実施形態では、認識部位は、Ｔｎ５型トランスポザーゼ認識部位である（Ｇｏｒｙｓｈｉｎ ａｎｄ Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：７３６７，１９９８）。一実施形態では、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼと複合体を形成するトランスポザーゼ認識部位が使用される（例えば、ＥＺ－Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼは野生型Ｔｎ５トランスポザーゼである。
【0049】
本明細書に記載される方法、組成物、又はシステムの実施形態のいずれにおいても、トランスポゾンは、トランスポゾン末端配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポゾン末端配列はモザイク末端（ＭＥ）配列である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡはタグメンテーションを使用してタグ付けされ、ＤＮＡはタグでタグ付けされ、タグに含まれるのは、ＭＥ配列などのトランスポゾン特異的配列である。したがって、ＤＮＡは、トランスポゾン特異的配列に基づいて試料中のＲＮＡから区別される。
【0050】
本明細書に記載される方法、組成物、又はシステムの実施形態のいずれにおいても、トランスポゾンはアダプタ配列を含む。アダプタ配列は、プライマ配列、アンカー配列、ユニバーサル配列、スペーサ領域、インデックス配列、捕捉配列、バーコード配列、切断配列、配列決定関連配列、及びこれらの組合せからなる群より選択される１つ以上の機能的配列又は構成要素を含み得る。いくつかの実施形態では、アダプタ配列はプライマ配列を含む。他の実施形態では、アダプタ配列は、プライマ配列及びインデックス又はバーコード配列を含む。プライマ配列はまた、ユニバーサル配列であり得る。本開示は、使用することができるアダプタ配列の種類に限定されず、当業者は、ライブラリ作製及び次世代配列決定に使用し得る更なる配列を認識するであろう。ユニバーサル配列は、２つ以上の核酸断片に共通するヌクレオチド配列の領域である。任意で、２つ以上の核酸断片はまた、配列相違の領域を有する。複数の核酸断片の異なるメンバーに存在し得るユニバーサル配列は、ユニバーサル配列に相補的な単一のユニバーサルプライマを使用して、複数の異なる配列の複製又は増幅を可能にすることができる。
【0051】
アダプタには、一本鎖核酸などの核酸が含まれる。アダプタは、約５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、それ未満若しくはそれ以上の長さ、又は前述のサイズのいずれか２つの間の範囲の長さを有する短い核酸を含み得る。
【0052】
実施形態のいずれにおいても、Ａ１４－ＭＥ、ＭＥ、Ｂ１５－ＭＥ、ＭＥ’、Ａ１４，Ｂ１５，及びＭＥを含むアダプタ配列又はトランスポゾン末端配列が以下に提供される：
Ａ１４－ＭＥ：５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’（配列番号１）
Ｂ１５－ＭＥ：５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’（配列番号２）
ＭＥ’：５’－ｐｈｏＳ－ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ－３’（配列番号３）
Ａ１４：５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣ－３’（配列番号４）
Ｂ１５：５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧ－３’（配列番号５）
ＭＥ：ＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ（配列番号６）
Ａ１４－ＭＥ：５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’（配列番号１）
Ｂ１５－ＭＥ：５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’（配列番号２）
ＭＥ’：５’－ｐｈｏＳ－ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ－３’（配列番号３）
Ａ１４：５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣ－３’（配列番号４）
Ｂ１５：５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧ－３’（配列番号５）
ＭＥ：ＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ（配列番号６）
【0053】
いくつかの実施形態では、プライマ配列は、配列決定のためのライブラリを調製するために含まれる。いくつかの実施形態では、プライマ配列は、Ｐ５プライマ配列又はＰ７プライマ配列である。Ｐ５及びＰ７プライマは、様々なＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームでの配列決定のために、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．によって販売されている市販のフローセルの表面で使用される。プライマ配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１／００５９８６５（Ａ１）号に記載されている。５’末端にアルキン末端が存在し得るＰ５及びＰ７プライマの例には、以下のもの及びこれらの誘導体又は類似体が含まれる：
Ｐ５：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧ ＡＵＣＴＡＣＡＣ（配列番号７）
Ｐ７：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧ＊ＡＴ（配列番号８）。
いくつかの実施例では、Ｐ７配列は、Ｇ＊位に修飾グアニン、例えば８－オキソグアニンを含む。他の例では、＊は、Ｇ＊と隣接する３’Ａとの間の結合がホスホロチオエート結合であることを示す。いくつかの例では、Ｐ５及び／又はＰ７プライマは、非天然リンカーを含む。任意で、Ｐ５及びＰ７プライマの一方又は両方は、ポリＴ尾部を含むことができる。ポリＴ尾部は、一般に、上記に示す配列の５’末端、例えば、５’塩基と末端アルキン単位との間に位置するが、場合によっては３’末端に位置し得る。ポリＴ配列は、任意の数のＴヌクレオチド、例えば２～２０個を含むことができる。Ｐ５及びＰ７プライマが例として与えられているが、本明細書に提示される例では、任意の適切なプライマを使用できることが理解されるべきである。Ｐ５及びＰ７プライマ配列を含むプライマ配列を有するインデックス配列は、配列決定のためにライブラリを活性化するためにＰ５及びＰ７を付加するのに役立つ。
Ｐ５：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧ ＡＵＣＴＡＣＡＣ（配列番号７）
Ｐ７：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧ＊ＡＴ（配列番号８）。
いくつかの実施例では、Ｐ７配列は、Ｇ＊位に修飾グアニン、例えば８－オキソグアニンを含む。他の例では、＊は、Ｇ＊と隣接する３’Ａとの間の結合がホスホロチオエート結合であることを示す。いくつかの例では、Ｐ５及び／又はＰ７プライマは、非天然リンカーを含む。任意で、Ｐ５及びＰ７プライマの一方又は両方は、ポリＴ尾部を含むことができる。ポリＴ尾部は、一般に、上記に示す配列の５’末端、例えば、５’塩基と末端アルキン単位との間に位置するが、場合によっては３’末端に位置し得る。ポリＴ配列は、任意の数のＴヌクレオチド、例えば２～２０個を含むことができる。Ｐ５及びＰ７プライマが例として与えられているが、本明細書に提示される例では、任意の適切なプライマを使用できることが理解されるべきである。Ｐ５及びＰ７プライマ配列を含むプライマ配列を有するインデックス配列は、配列決定のためにライブラリを活性化するためにＰ５及びＰ７を付加するのに役立つ。
【0054】
本明細書で使用される場合、プローブという用語は、標的分析物、例えば、標的分析物上のタグに特異的に結合するのに十分な結合特性を有する捕捉分子を指す。例えば、プローブは、標的核酸に特異的にハイブリダイズするのに十分な相補性を有するポリヌクレオチドを含み得る。例えば、プローブは、ポリＡタグに特異的に結合するためのポリＴ配列を含み得る。別の例では、プローブは、抗体又はタンパク質タグを含む。捕捉プローブは、混合物中の他の核酸及び／又は成分から標的核酸を単離するための親和性結合分子として機能することができる。標的核酸はまた、標的配列及び捕捉プローブの両方に特異的にハイブリダイズするのに十分な相補性を有するリンカー、アダプタ、及び他の架橋核酸などの介在分子を介して捕捉プローブによって特異的に結合され得る。
【0055】
いくつかの実施形態では、プローブは、バーコードを更に含む。バーコードは、標的を特定の試料由来であるものとして識別する。例えば、バーコードは、１つ以上の分析物を共通の供給源からのものとして識別するために使用される。１つの分析物を識別するバーコードは、異なる分析物を識別するバーコードと同じであっても異なっていてもよい。バーコード間の関係がわかっている限り、バーコードは、分析物を共通の供給源からのものとして識別するために使用され得る。
【0056】
いくつかの実施形態では、バーコードは、アレイ内のポリヌクレオチドを識別するために使用できる核酸配列を含むことができる。バーコードは、他のバーコードと区別できる固有のヌクレオチド配列を含むことができる。また、バーコードの配列によって、及びまたポリヌクレオチド内のバーコードの位置によって、例えばプライマ結合部位の５’位置によって、ポリヌクレオチド内及び標的核酸内の他のヌクレオチド配列と区別することができる。例えば、いくつかの実施形態では、バーコードの配列は、複数の核酸中に複数回存在してもよい；但し、プライマ結合部位の５’側に位置するバーコードは検出することができる。バーコードは、集団内の複数のバーコード内、並びに／又は分析若しくは検討される複数のポリヌクレオチド及び標的核酸内の固有のヌクレオチド配列であるのに十分な任意の所望配列長であり得る。いくつかの実施形態では、バーコードは、約１～３０ヌクレオチド以上の範囲のポリヌクレオチド内の核酸又は領域である。例えば、バーコードは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチド以上の長さを有することができる。いくつかの実施形態では、バーコードは、３５、４０、４５又は５０ヌクレオチド以上であり得る。いくつかの実施形態では、バーコードは、各バーコードが別のバーコードとは異なるように、あるポリヌクレオチドをアレイ内の別のポリヌクレオチドから区別することができる。いくつかの実施形態では、バーコードは、バーコードのセットがバーコードの別のセットとは異なるように、あるポリヌクレオチドの集団をアレイ内のポリヌクレオチドの別の集団から区別することができる。
【0057】
いくつかの実施形態では、バーコードは、転位を使用して直接挿入される。そのような実施形態では、固体支持体への結合事象は必要ではない。したがって、本明細書で提供される実施形態のいずれにおいても、関心対象の分析物は、固体支持体を用いて又は固体支持体なしで同時に分析される。
【0058】
いくつかの実施形態では、プローブは固体支持体上に固定化され得る。固体支持体には、例えば、エッチングされた表面、ウェル、被覆されたウェル、アレイ、フローセル装置、マイクロ流体チャネル、ビーズ、磁気ビーズ、カラム、液滴、又は微粒子が含まれ得る。そのような実施形態では、関心対象の分析物は、固定化されたプローブによって固体支持体に結合され、固体支持体上で更なる処理又は分析を受ける。いくつかの実施形態では、固定化されたプローブ及び固体支持体は溶液中で使用される。例えば、固定化された支持体はビーズであり得、ビーズに付着されたプローブは、溶液中のＤＮＡ及びＲＮＡなどの関心対象の分析物を捕捉するために溶液に可溶性である。そのような実施形態では、関心対象のタグ付けされた分析物は、溶液中のプローブに結合し、溶液中でバーコード化される。関心対象のバーコード化された分析物は、溶液中で更なる処理若しくは分析を受けるか、又は磁気ビーズの使用を含むプルダウンアッセイを使用してプルダウンされ得る。
【0059】
本明細書で使用されるフローセルという用語は、１つ以上の流体試薬を流すことができる固体表面を含むチャンバを指す。本開示の方法において容易に使用できるフローセル及び関連する流体システム並びに検出プラットフォームの例には、例えば、マイクロ流体装置、微細構造体、マイクロウェル、マイクロタイタプレートなどが含まれ、例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５３－５９（２００８）、国際公開第０４／０１８４９７号、米国特許第７，０５７，０２６号、国際公開第９１／０６６７８号、国際公開第０７／１２３７４４号、米国特許第７，３２９，４９２号、米国特許第７，２１１，４１４号、米国特許第７，３１５，０１９号、米国特許第７，４０５，２８１号、及び米国特許出願第２００８／０１０８０８２号に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【0060】
本明細書で使用される場合、「アレイ」は、異なるマイクロフィーチャが相対位置に従って互いに区別され得るように表面に結合又は付着しているポリヌクレオチドを含むマイクロフィーチャなどの、異なるマイクロフィーチャの集団を指すことができる。アレイの個々のフィーチャは、マイクロフィーチャの単一のコピーを含むことができ、又はマイクロフィーチャの複数のコピーは、アレイの個々のフィーチャにおけるマイクロフィーチャの集団として存在することができる。各フィーチャにおけるマイクロフィーチャの集団は、典型的には均質であり、単一種のマイクロフィーチャを有する。したがって、単一の核酸配列の複数のコピーが１つのフィーチャに、例えば、同じ配列を有する複数の核酸分子上に存在し得る。
【0061】
いくつかの実施形態では、マイクロフィーチャの不均質な集団が１つのフィーチャに存在し得る。いくつかの実施形態では、フィーチャは、単一のマイクロフィーチャ種のみを含むことができる。いくつかの実施形態では、フィーチャは、異なる配列を有する核酸の混合物などの、複数の異なるマイクロフィーチャ種を含むことができる。アレイの隣接するフィーチャは、互いに個別であり得る。フィーチャは、互いに隣接し得るか、又はギャップによって分離することができる。フィーチャが離間している実施形態では、隣接する部位は、例えば、１００μｍ、５０μｍ、１０μｍ、５μｍ、１μｍ、０．５μｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、１ｎｍ、０．５ｎｍ未満の距離、又は前述の距離のいずれか２つの範囲内の任意の距離だけ分離することができる。アレイ上のフィーチャのレイアウトは、隣接するフィーチャ間の中心間距離の観点から理解することもできる。本発明において有用なアレイは、約１００μｍ、５０μｍ、１０μｍ、５μｍ、１μｍ、０．５μｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、１ｎｍ、０．５ｎｍ未満の中心間間隔、又は前述の距離のいずれか２つの範囲内の任意の距離の中心間間隔を有する隣接フィーチャを有することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される距離値は、アレイの隣接するフィーチャ間の平均距離を表すことができる。したがって、例えば、距離がアレイのすべての隣接するフィーチャ間の閾値距離を構成するという特定の記述によって特に指示されない限り、すべての隣接するフィーチャが指定された範囲にある必要はない。実施形態は、様々な密度のフィーチャを有するアレイを含むことができる。特定の実施形態の密度の例示的な範囲には、約１０，０００，０００フィーチャ／ｃｍ２～約２，０００，０００，０００フィーチャ／ｃｍ２；約１００，０００，０００フィーチャ／ｃｍ２～約１，０００，０００，０００フィーチャ／ｃｍ２；約１００，０００フィーチャ／ｃｍ２～約１０，０００，０００フィーチャ／ｃｍ２、約１，０００，０００フィーチャ／ｃｍ２～約５，０００，０００フィーチャ／ｃｍ２；約１０，０００フィーチャ／ｃｍ２～約１００，０００フィーチャ／ｃｍ２；約２０，０００フィーチャ／ｃｍ２～約５０，０００フィーチャ／ｃｍ２；約１，０００フィーチャ／ｃｍ２～約５，０００フィーチャ／ｃｍ２、又は前述の密度のいずれか２つの範囲内の任意の密度が含まれる。
【0062】
本明細書で使用される場合、「表面」は、試薬、ビーズ又は分析物と接触するためにアクセス可能な基質又は支持構造体の一部を指すことができる。表面は、実質的に平坦又は平面であり得る。あるいは、表面は丸みを帯びているか、又は輪郭付けられ得る。表面に含まれ得る例示的な輪郭は、ウェル、くぼみ、柱、隆起部、チャネルなどである。基質又は支持構造体として使用することができる例示的な材料には、改質若しくは官能化ガラスなどのガラス；アクリル、ポリスチレン若しくはスチレンと別の材料とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン若しくはテフロン（登録商標）などのプラスチック；アガロース若しくはセファロースなどの多糖類若しくは架橋多糖類；ナイロン；ニトロセルロース；樹脂；シリコン及び変性シリコンを含むシリカ若しくはシリカベースの材料；カーボンファイバ；金属；無機ガラス；光ファイバ束、又は様々な他のポリマーが含まれる。単一の材料又はいくつかの異なる材料の混合物は、本発明において有用な表面を形成することができる。いくつかの実施形態では、表面はウェルを含む。
【0063】
本明細書で使用される場合、「ビーズ」は、剛性又は半剛性材料で作られた小さな物体を指すことができる。物体は、例えば、球体、楕円形、微小球、又は規則的若しくは不規則な寸法を有するかどうかに関わらず他の認識された粒子形状として特徴付けられる形状を有することができる。ビーズに有用な例示的な材料には、改質若しくは官能化ガラスなどのガラス；アクリル、ポリスチレン若しくはスチレンと別の材料とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン若しくはテフロン（登録商標）などのプラスチック；アガロース若しくはセファロースなどの多糖類若しくは架橋多糖類；ナイロン；ニトロセルロース；樹脂；シリコン及び変性シリコンを含むシリカ若しくはシリカベースの材料；カーボンファイバ；金属；無機ガラス；光ファイバ束、又は様々な他のポリマーが含まれる。例示的なビーズには、制御された細孔ガラスビーズ、常磁性ビーズ、トリアゾル（thoria sol）、セファロースビーズ、ナノ結晶、及び技術分野で公知の他のものが含まれる。ビーズは、生物学的又は非生物学的材料で作製され得る。磁気ビーズは、磁石を使用した磁気ビーズの操作が容易であるため、特に有用である。特定の実施形態で使用されるビーズは、０．１μｍ～１００μｍの直径、幅、又は長さを有することができる。ビーズのサイズは、フィーチャを分析するのに十分な信号を維持しながら、サイズを小さくし、したがって密度を高めるように選択することができる。
【0064】
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」、又はその文法的等価物は、１つ以上のポリヌクレオチドが反応して、少なくとも部分的にはヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって形成される複合体を形成する反応を指すことができる。水素結合は、ワトソン－クリック塩基対合、フーグスティーン結合、又は他の任意の配列特異的方法で生じ得る。複合体は、二本鎖構造を形成する２本の鎖、多重鎖複合体を形成する３本以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、又はこれらの任意の組合せを有することができる。鎖はまた、水素結合に加えて、力によって架橋又は結合され得る。
【0065】
本明細書で使用される場合、「伸長する」、「伸長」、又はそれらの任意の文法的等価物は、ポリメラーゼなどの伸長酵素によるプライマ、ポリヌクレオチド又は他の核酸分子へのｄＮＴＰの付加を指すことができる。例えば、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、得られる伸長プライマは、核酸の配列情報を含む。いくつかの実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼ、又は逆転写酵素を使用して伸長を実施するものとして論じられているが、伸長は、技術分野において周知の任意の他の方法で実施することができる。例えば、伸長は、関心対象の鎖にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドを一緒にライゲートすることによって実施することができる。
【0066】
本明細書で使用される場合、「ライゲーション」又は「ライゲートする」又はそれらの他の文法的等価物は、ホスホジエステル結合による２つのヌクレオチド鎖の結合を指すことができる。ライゲーションは、化学的ライゲーションを含み得る。そのような反応は、リガーゼによって触媒され得る。リガーゼは、ＡＴＰ又は同様の三リン酸の加水分解でこの反応を触媒する酵素のクラスを指す。
【0067】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、単一のアッセイを使用して試料中の複数の分析物を同時に分析することに関し、複数の分析物は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡ及び標的ＲＮＡは、タグ付けによって修飾される。したがって、いくつかの実施形態では、この方法は、試料中のＤＮＡを第１のタグで修飾すること、及び試料中のＲＮＡを第２のタグで修飾することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、修飾されたＤＮＡを第１のタグに相補的な第１のプローブで捕捉すること、及び修飾されたＲＮＡを第２のタグに相補的な第２のプローブで捕捉することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、捕捉されたＤＮＡ及びＲＮＡを分析することを含む。本明細書で使用される場合、「第１のタグ」及び「第２のタグ」という用語は、タグ付け事象の特定のタイミング又は配列を指すものではない。むしろ、この用語は、単に、第１の分析物が、例えば第１のタグと呼ばれる１つのタグを含み、第２の分析物が、例えば第２のタグと呼ばれる別のタグを含むことを記述するために使用される。本明細書に記載される実施形態のいずれにおいても、第１及び第２のタグは、同じであっても異なっていてもよい。バーコードは、分析物を共通の供給源からのものとして識別するが、タグは、分析物を特定の種類、例えばＤＮＡ又はＲＮＡとして識別する。
【0068】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡに加えて、関心対象の更なる分析物を同時に分析すること、例えば、タンパク質を分析することを更に含む。そのような実施形態では、タンパク質などの関心対象の更なる分析物は、更なるタグで修飾される。
【0069】
いくつかの実施形態では、第１及び第２のタグ（又は関連する場合は更なるタグ）は異なる。いくつかの実施形態では、第１及び第２のタグ（又は関連する場合は更なるタグ）は同じである。いくつかの実施形態では、第１及び第２のタグは、基質認識配列を更に含む。基質認識配列は、基質を認識し、それに結合し、それによってタグを固定化する配列である。いくつかの実施形態では、第１のタグの基質認識配列は、第２のタグの基質認識配列と同じである。
【0070】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、図２に示すように、タグメンテーションプロセスを介してタグ付けされる。図２の実施形態では、単離された単一の細胞又は核１５を有するウェルプレート１０が示されている。核１５は、核１５内にＤＮＡ ２０及びｍＲＮＡ ２５を含む。単一の細胞又は核１５は、液滴内に封入され得るか、又は分析のために個々のウェルに分離され得る。ＤＮＡ ２０は、タグ１でタグ付けされていることが示されており、これは、タグメンテーション又は他のタグ付けプロセス、例えば逆転写、ライゲーション、又はＤＮＡをタグ付けするための他の手段を介して誘導され得る。図２の実施形態では、ｍＲＮＡ ２５はタグ２でタグ付けされている。図２はまた、ビーズ又は他の表面であり得る固体支持体４０上に固定化されているプローブ３０、３５を示す。ＤＮＡ ２０に特異的なプローブ３０は、ＤＮＡ ２０上のタグ１に特異的に結合する捕捉要素である、タグ１捕捉要素を含む。ｍＲＮＡ ２５に特異的なプローブ３５は、ｍＲＮＡ ２５上のタグ２に特異的に結合する捕捉要素である、タグ２捕捉要素を含む。各プローブはバーコードも含み、それによって関心対象の分析物、この場合はＤＮＡ及びｍＲＮＡのインデックス化を可能にする。
【0071】
いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部を含むｍＲＮＡはタグ付けされていない。例えば、図３に示す実施形態では、ウェルプレート２００は、ポリＡ尾部２１５を有するｍＲＮＡ ２１０を含むが、そうでなければタグ付けされていない核２０５を有する。図３の実施形態では、ｇＤＮＡ ２２０は、ポリＡ尾部２１５でタグ付けされている。ｇＤＮＡ ２２０のタグ付け後、ｇＤＮＡ ２２０及びｍＲＮＡ ２１０の両方がポリＡ尾部２１５を含む。ｇＤＮＡ ２２０は、例えばタグメンテーションを使用して、ポリＡ尾部２１５でタグ付けされ得る。図３に示すように、ポリＡ尾部２１５を有するｇＤＮＡ ２２０及びポリＡ尾部２１５も有するｍＲＮＡ ２１０は、ポリＴ捕捉要素２３０を含む同じプローブ２２５で捕捉され得る。プローブ２２５は、固体支持体２４０上に固定されている。したがって、ｇＤＮＡ ２２０及びｍＲＮＡ ２１０は、同時に処理され、同じバーコード２３５が割り当てられる。ｇＤＮＡ ２２０は、タグメンテーションプロセス中に組み込まれたトランスポゾン特異的配列に基づいて、ｍＲＮＡ ２１０と区別され得る。この概念は、図４を参照して更に詳細に説明される。
【0072】
図４は、単一試料中のｇＤＮＡ及びｍＲＮＡの両方を同時に分析する例示的な方法を示す。この実施形態では、ポリＡトランスポゾンは、転位によってゲノムＤＮＡに導入される。核／細胞は、ポリＴ尾部を有するインデックス付きプローブで封入される。インデックス付きプローブをハイブリダイズさせ、次に転位されたｇＤＮＡ断片にライゲートし、ｍＲＮＡとハイブリダイズさせる。これは第１のｃＤＮＡを作製する。転位後、ｇＤＮＡは、タグメンテーション特異的配列であるＭＥ配列を含む。第２のｃＤＮＡの合成後、二本鎖ｃＤＮＡ及びｇＤＮＡを再び転位させて、ＰＣＲアダプタを組み込む。次に、ＰＣＲ増幅のために断片を調製する。
【0073】
本明細書で使用される場合、「試薬」という用語は、試料と反応する、相互作用する、試料を希釈する、又は添加するのに有用な作用物質又は２つ以上の作用物質の混合物を表し、溶解、核酸分析、核酸増幅反応、タンパク質分析、タグメンテーション反応、ＡＴＡＣ－ｓｅｑ、ＣＰＴ－ｓｅｑ、又はＳＣＩ－ｓｅｑ反応、又は他のアッセイのための作用物質を含む、本明細書に記載のアッセイで使用される作用物質を含み得る。したがって、試薬には、例えば、緩衝剤、化学物質、酵素、ポリメラーゼ、５０塩基対未満のサイズを有するプライマ、鋳型核酸、ヌクレオチド、標識、色素、又はヌクレアーゼが含まれ得る。いくつかの実施形態では、試薬には、リゾチーム、プロテイナーゼＫ、ランダムヘキサマー、ポリメラーゼ（例えば、Φ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｕポリメラーゼ）、トランスポザーゼ（例えばＴｎ５）、プライマ（例えば、Ｐ５及びＰ７アダプタ配列）、リガーゼ、触媒酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝剤、又は二価カチオンが含まれる。
【0074】
いくつかの実施形態では、試料は単一の細胞を含み、単一の細胞は固定されている。いくつかの実施形態では、細胞は固定剤で固定され得る。本明細書で使用される場合、固定剤は、一般に、細胞を固定することができる作用物質を指す。例えば、固定された細胞は、細胞中のタンパク質複合体、核酸複合体、又はタンパク質－核酸複合体を安定化させることができる。適切な固定剤及び架橋剤には、アルコール又はアルデヒドベースの固定剤、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、エタノールベースの固定剤、メタノールベースの固定剤、アセトン、酢酸、四酸化オスミウム、二クロム酸カリウム、クロム酸、過マンガン酸カリウム、水銀、ピクリン酸塩、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート（ＢＳ３）、３，３’－ジチオビス［スルホスクシンイミジルプロピオネート］（ＤＴＳＳＰ）、エチレングリコールビス［スルホスクシンイミジルスクシネート］（スルホ－ＥＧＳ）、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、ジチオビス［スクシンイミジルプロピオネート］（ＤＳＰ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、エチレングリコールビス［スクシンイミジルスクシネート］（ＥＧＳ）などのアミン反応性ＮＨＳ－エステル架橋剤、ＮＨＳ－ジアジリン、ＮＨＳ－ＬＣ－ジアジリン、ＮＨＳ－ＳＳ－ジアジリン、スルホ－ＮＨＳ－ジアジリン、スルホ－ＮＨＳ－ＬＣ－ジアジリン、及びスルホ－ＮＨＳ－ＳＳ－ジアジリンなどのＮＨＳ－エステル／ジアジリン架橋剤が含まれ得る。いくつかの実施形態では、細胞を固定することは、細胞の内部状態を保持し、それによってその後の分析中又はアッセイの実施中に細胞の改変を防止する。
【0075】
いくつかの実施形態では、試料は、単一細胞、単一核、又は細胞集団若しくは核集団などの核酸源を含み、単一細胞、単一核、細胞集団、又は核集団は、液滴内に封入される。いくつかの実施形態では、細胞は、封入前に固定される。本明細書で使用される場合、液滴は、単一細胞を封入するためのビーズであり、ヒドロゲル組成物からなるヒドロゲルビーズを含み得る。いくつかの実施形態では、液滴は、ヒドロゲル材料の均質な液滴であるか、又はポリマーヒドロゲルシェルを有する中空の液滴である。均質又は中空であるかどうかに関わらず、液滴は、単一細胞を封入することが可能であり得る。本明細書で使用される場合、「ヒドロゲル」という用語は、有機ポリマー（天然又は合成）が共有結合、イオン結合、又は水素結合を介して架橋されて、水分子を捕捉してゲルを形成する三次元開放格子構造体を生成するときに形成される物質を指す。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、生体適合性ヒドロゲルであり得る。本明細書で使用される場合、「生体適合性ヒドロゲル」という用語は、生細胞に対して毒性ではなく、生存能力を維持するために捕捉された細胞への酸素及び栄養素の十分な拡散を可能にするゲルを形成するポリマーを指す。いくつかの実施形態では、ヒドロゲル材料には、アルギン酸塩、アクリルアミド、又はポリ－エチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ－アクリレート、ＰＥＧ－アミン、ＰＥＧ－カルボキシレート、ＰＥＧ－ジチオール、ＰＥＧ－エポキシド、ＰＥＧ－イソシアネート、ＰＥＧ－マレイミド、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリスチレンスルホネート（ＰＳＳ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰＯＮ）、Ｎ，Ｎ’－ビス（アクリロイル）シスタミン、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（ビニルスルホン酸）（ＰＶＳＡ）、ポリ（Ｌ－アスパラギン酸）、ポリ（Ｌ－グルタミン酸）、ポリリジン、寒天、アガロース、ヘパリン、アルギン酸塩硫酸塩、デキストラン硫酸塩、ヒアルロナン、ペクチン、カラギーナン、ゼラチン、キトサン、セルロース、コラーゲン、ビスアクリルアミド、ジアクリレート、ジアリルアミン、トリアリルアミン、ジビニルスルホン、ジエチレングリコールジアリルエーテル、エチレングリコールジアクリレート、ポリメチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、トリメチルプロパントリメタクリレート、エトキシル化トリメチロールトリアクリレート、又はエトキシル化ペンタエリスリトールテトラアクリレート、又はこれらの組合せ若しくは混合物が含まれる。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、アルギネート、アクリルアミド、又はＰＥＧベースの材料である。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、アクリレート－ジチオール、エポキシド－アミン反応化学を有するＰＥＧベースの材料である。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、ＰＥＧ－マレイミド／ジチオール油、ＰＥＧ－エポキシド／アミン油、ＰＥＧ－エポキシド／ＰＥＧ－アミン、又はＰＥＧ－ジチオール／ＰＥＧ－アクリレートを含むポリマーシェルを形成する。いくつかの実施形態では、ヒドロゲル材料は、細胞内生体分子を損傷する可能性があるフリーラジカルの生成を回避するために選択される。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルポリマーは、水などの６０～９０％の流体、及び１０～３０％のポリマーを含む。特定の実施形態では、ヒドロゲルの含水量は、約７０～８０％である。本明細書で使用される場合、「約」又は「およそ」という用語は、数値を修飾する場合、数値に生じ得る変動を指す。例えば、変動は、特定の基質又は成分の製造における違いによって生じ得る。一実施形態では、「約」という用語は、列挙された数値の１％、５％、又は最大１０％以内を意味する。
【0076】
ヒドロゲルは、親水性バイオポリマー又は合成ポリマーを架橋することによって調製され得る。したがって、いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは架橋剤を含み得る。本明細書で使用される場合、「架橋剤」という用語は、適切なベースモノマーと反応したときに三次元ネットワークを形成することができる分子を指す。１つ以上の架橋剤を含み得るヒドロゲルポリマーの例には、ヒアルロナン、キトサン、寒天、ヘパリン、硫酸塩、セルロース、アルギネート（アルギン酸塩硫酸塩を含む）、コラーゲン、デキストラン（デキストラン硫酸塩を含む）、ペクチン、カラギーナン、ポリリジン、ゼラチン（Ａタイプゼラチンを含む）、アガロース、（メタ）アクリレート－オリゴラクチド－ＰＥＯ－オリゴラクチド－（メタ）アクリレート、ＰＥＯ－ＰＰＯ－ＰＥＯコポリマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（メタクリレート）、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ＰＬ（Ｇ）Ａ－ＰＥＯ－ＰＬ（Ｇ）Ａコポリマー、ポリ（エチレンイミン）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－チオール、ＰＥＧ－アクリレート、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－ビス（アクリロイル）シスタミン、ＰＥＧ、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリアクリル酸、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（ビニルスルホン酸）（ＰＶＳＡ）、ポリ（Ｌ－アスパラギン酸）、ポリ（Ｌ－グルタミン酸）、ビスアクリルアミド、ジアクリレート、ジアリルアミン、トリアリルアミン、ジビニルスルホン、ジエチレングリコールジアリルエーテル、エチレングリコールジアクリレート、ポリメチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、トリメチルプロパントリメタクリレート、エトキシル化トリメチロールトリアクリレート、又はエトキシル化ペンタエリスリトールテトラアクリレート、又はこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。したがって、例えば、組合せは、ポリマー及び架橋剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－チオール／ＰＥＧ－アクリレート、アクリルアミド／Ｎ，Ｎ’－ビス（アクリロイル）シスタミン（ＢＡＣｙ）、又はＰＥＧ／ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリマーシェルは、４アームポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。いくつかの実施形態では、４アームポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ＰＥＧ－アクリレート、ＰＥＧ－アミン、ＰＥＧ－カルボキシレート、ＰＥＧ－ジチオール、ＰＥＧ－エポキシド、ＰＥＧ－イソシアネート、及びＰＥＧ－マレイミドからなる群より選択される。
【0077】
いくつかの実施形態では、架橋剤は、瞬時型架橋剤又は遅延型架橋剤である。即時型架橋剤は、ヒドロゲルポリマーを即座に架橋する架橋剤であり、本明細書ではクリックケミストリと称される。即時型架橋剤には、ジチオール油＋ＰＥＧ－マレイミド又はＰＥＧエポキシド＋アミン油が含まれ得る。遅延型架橋剤は、ヒドロゲルポリマーを緩やかに架橋する架橋剤であり、ＰＥＧ－エポキシド＋ＰＥＧ－アミン又はＰＥＧ－ジチオール＋ＰＥＧ－アクリレートを含み得る。遅延型架橋剤は、架橋するのに数時間超かかる場合があり、例えば、架橋するのに２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２時間超を要し得る。本明細書で提供されるいくつかの実施形態では、液滴は、即時型架橋剤によって製剤化され、それによって、遅延型架橋剤と比較して細胞の状態をより良好に維持する。理論に拘束されることを望むものではないが、細胞は、より長い架橋時間の間に細胞内シグナル伝達機構によって生理学的変化を受ける可能性がある。
【0078】
いくつかの実施形態では、架橋剤は、ヒドロゲルポリマーにおいてジスルフィド結合を形成し、それによってヒドロゲルポリマーを連結する。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルポリマーは、細孔（例えば、多孔性ヒドロゲルマトリックス）を有するヒドロゲルマトリックスを形成する。これらの細孔は、液滴内に単一の細胞又はそれから抽出された核酸などの十分に大きな粒子を保持することができるが、試薬などの他の材料が細孔を通過し、それによって液滴に出入りすることを可能にする。いくつかの実施形態では、液滴の細孔径は、ポリマー濃度と架橋剤の濃度との比を変えることによって微調整される。いくつかの実施形態では、ポリマー対架橋剤の比は、３０：１、２５：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、若しくは１：３０であるか、又は前述の比のいずれか２つによって定義される範囲内の比である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプライマ、又は荷電化学基などの更なる機能をポリマーマトリックスに移植して、異なる用途の要件を満たすことができる。
【0079】
本明細書で使用される場合、「多孔度」という用語は、開放空間、例えば、細孔又は他の開口部から構成されるヒドロゲルの体積率（無次元）を意味する。したがって、多孔度は、材料中の空隙を測定し、０～１００％（又は０から１）のパーセンテージとしての、総体積に対する空隙の体積率である。ヒドロゲルの多孔度は、０．５～０．９９、約０．７５～約０．９９、又は約０．８～約０．９５の範囲であり得る。
【0080】
いくつかの実施形態では、液滴は、単一の細胞又はそれから抽出された核酸を保持すると同時に、試薬の十分な拡散を可能にする任意の細孔径を有することができる。本明細書で使用される場合、「細孔径」という用語は、細孔の断面の直径又は有効直径を指す。「細孔径」という用語はまた、複数の細孔の測定値に基づく、細孔の断面の平均直径又は平均有効直径を指すことができる。円形ではない断面の有効直径は、非円形断面と同じ断面積を有する円形断面の直径に等しい。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、ヒドロゲルが水和されたときに膨潤し得る。次いで、細孔径のサイズがヒドロゲルの含水量に応じて変化し得る。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルの細孔は、ヒドロゲル内に封入された細胞を保持するのに十分なサイズの細孔を有することができるが、試薬が通過することを可能にする。いくつかの実施形態では、液滴の内部は水性環境である。いくつかの実施形態では、液滴内に配置された単一の細胞は、液滴のポリマーシェルとの相互作用がなく、及び／又はポリマーシェルと接触しない。いくつかの実施形態では、ポリマーシェルが細胞の周りに形成され、細胞は、受動吸着によって又は標的化された方法で、例えば抗体若しくは他の特異的結合分子に結合されることなどによって、ポリマーシェルが細胞表面にもたらされるためにポリマーシェルと接触する。
【0081】
いくつかの実施形態では、液滴は、単一の細胞を封入するのに十分なサイズである。いくつかの実施形態では、液滴は、約２０μｍ～約２００μｍ、例えば、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００μｍの直径、又は前述の値のいずれか２つによって定義される範囲内の直径を有する。液滴のサイズは、環境要因によって変化し得る。いくつかの実施形態では、液滴は、連続油相から分離され、水相に浸漬されると膨張する。いくつかの実施形態では、液滴の膨張は、封入された細胞内の遺伝物質に関するアッセイを実施する効率を高める。いくつかの実施形態では、液滴の膨張は、ＰＣＲ中に増幅されるインデックス付きインサートのためのより大きな環境を作り出すが、そうでなければ、現在の細胞ベースアッセイでは制限され得る。
【0082】
いくつかの実施形態では、液滴は、ボルテックス支援エマルジョン、マイクロ流体液滴生成、又はバルブベースのマイクロ流体力学などの動的手段によって調製される。いくつかの実施形態では、液滴は均一なサイズ分布で製剤化される。いくつかの実施形態では、液滴のサイズは、マイクロ流体装置のサイズ、１つ以上のチャネルのサイズ、又はマイクロ流体チャネルを通る流速を調節することによって微調整される。いくつかの実施形態では、得られる液滴は、２０～２００μｍの範囲の直径、例えば、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００μｍの直径、又は前述の値のいずれか２つによって定義される範囲内の直径を有する。
【0083】
いくつかの実施形態では、１つ以上の分析物を分析することは、分析物が何であるかに依存して、様々な分析を含み得る。例えば、分析することには、ＤＮＡ分析、ＲＮＡ分析、タンパク質分析、タグメンテーション、核酸増幅、核酸配列決定、核酸ライブラリの作製、シーケンシングを使用したトランスポザーゼアクセス可能なクロマチンのアッセイ（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）、連続性保存転位（ＣＰＴ－ｓｅｑ）、単一細胞のコンビナトリアルインデクシングによる配列決定（ＳＣＩ－ｓｅｑ）、又は単一細胞ゲノム増幅、又はこれらの任意の組合せが含まれる。
【0084】
ＤＮＡ分析とは、ＤＮＡを増幅、配列決定、又は他の方法で分析するために使用される任意の技術を指す。ＤＮＡ増幅は、ＰＣＲ技術又はパイロシーケンシングを使用して達成することができる。ＤＮＡ分析はまた、非標的化非ＰＣＲベースのＤＮＡ配列決定（例えば、メタゲノミクス）技術を含み得る。非限定的な例として、ＤＮＡ分析は、１６Ｓ ｒＤＮＡ（リボソームＤＮＡ）の超可変領域を配列決定すること、及びＤＮＡを介した種の同定のための配列決定を使用することを含み得る。
【0085】
ＲＮＡ分析は、ＲＮＡを増幅、配列決定、又は他の方法で分析するために使用される任意の技術を指す。ＤＮＡを分析するために使用されるのと同じ技術を使用して、ＲＮＡを増幅及び配列決定することができる。ＤＮＡよりも安定でないＲＮＡは、刺激に応答したＤＮＡの翻訳である。したがって、ＲＮＡ分析は、コミュニティの代謝的に活性なメンバーのより正確な画像を提供することができ、試料中の生物のコミュニティ機能についての情報を提供するために使用され得る。更に、ＤＮＡとＲＮＡの両方の同時分析は、ＤＮＡとＲＮＡの両方に関連する調査を効率的に決定するのに有益であり得る。核酸配列決定は、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸分子の配列中のヌクレオチドの順序を決定するための配列決定の使用を指す。
【0086】
本明細書で使用される「配列決定」という用語は、ポリヌクレオチドの少なくとも１０個の連続するヌクレオチドの同定（例えば、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、又は少なくとも２００個以上の連続するヌクレオチドの同定）が得られる方法を指す。
【0087】
「次世代シーケンシング」又は「ハイスループットシーケンシング」又は「ＮＧＳ」という用語は、一般に、大規模並列シグネチャシーケンシング、ハイスループットシーケンシング、ライゲーションによる配列決定（例えばＳＯＬｉＤ）、シーケンシング）、プロトンイオン半導体シーケンシング、ＤＮＡナノボールシーケンシング、単一分子シーケンシング、及びナノポアシーケンシングを含むがこれらに限定されないハイスループットシーケンシング技術を指し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、又はＲｏｃｈｅなどによって現在採用されている合成による並行シーケンシング又はライゲーションによるシーケンシングプラットフォームを指す場合もある。次世代シーケンシング方法は、ナノポアシーケンシング方法、又はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって商業化されたＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術若しくはＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって商業化された単一分子蛍光ベースの方法などの電子検出ベースの方法も含み得る。
【0088】
タンパク質分析は、タンパク質の研究を指し、プロテオーム分析、関心対象のタンパク質の翻訳後修飾の決定、タンパク質発現レベルの決定、又は他のタンパク質若しくは核酸を含む他の分子とのタンパク質相互作用の決定を含み得る。
【0089】
本明細書で使用される場合、「タグメンテーション」という用語は、トランスポゾン末端配列を含むアダプタと複合体化したトランスポザーゼ酵素を含むトランスポソーム複合体によるＤＮＡの修飾を指す。タグメンテーションは、ＤＮＡの断片化及び二重鎖断片の両方の鎖の５’末端へのアダプタのライゲーションを同時にもたらす。トランスポザーゼ酵素を除去するための精製工程に続いて、更なる配列を、例えばＰＣＲ、ライゲーション、又は当業者に公知の他の任意の適切な方法によって、適合断片の末端に付加することができる。
【0090】
シーケンシング（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）を使用したトランスポザーゼアクセス可能なクロマチンのアッセイは、統合的エピゲノム分析の迅速で高感度な方法を指す。ＡＴＡＣ－ｓｅｑは、オープンクロマチン部位を捕捉し、オープンクロマチンのゲノム位置、ＤＮＡ結合タンパク質、個々のヌクレオソーム、及びヌクレオチド分解能を有する調節領域におけるより高次の圧縮の間の相互作用を明らかにする。ヌクレオソームを厳密に回避する、許容できる、又はヌクレオソームと重複する傾向があるＤＮＡ結合因子のクラスが発見されている。ＡＴＡＣ－ｓｅｑを使用して、安静時のヒトＴ細胞の連続的な毎日のエピゲノムを測定し、標準的な採血を介してプロバンドから評価し、健康及び疾患を監視するための臨床的タイムスケールで個人のエピゲノムを読み取る実現可能性を実証した。より具体的には、ＡＴＡＣ－ｓｅｑは、単一細胞からのクロマチンを挿入酵素複合体で処理して、ゲノムＤＮＡのタグ付き断片を生成することによって実施され得る。この工程では、クロマチンは、クロマチンのオープン領域でゲノムＤＮＡを切断し、断片の両端にアダプタを付加するＴｎ５又はＭｕＡなどの挿入酵素を使用してタグメント化される（例えば、同じ反応で断片化及びタグ付けされる）。ＡＴＡＣ－ｓｅｑは、図５Ａに概略するように、開いたクロマチン状態でのみ転位を可能にし、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１３，１０，１２１３－１２１８）に一般的に記載されている。
【0091】
本明細書に記載される方法、組成物、又はシステムの実施形態のいずれにおいても、ＡＴＡＣ－ｓｅｑは、単一の細胞又はバルクで実施され得る。単一細胞ＡＴＡＣ－ｓｅｑは、単一細胞のエピジェネティック解析を可能にし、例えば、単一の細胞又は単一の核を液滴又はビーズ内に封入することによって、コンパートメント内で実施され得る。本明細書で使用される場合、コンパートメントという用語は、反応が起こり得る限られた空間の物理的又は仮想的な名称のいずれかを指す。例えば、コンパートメントは、ビーズ、液滴、ウェル、又は成分が保持され得る、例えば、単一の細胞が実験及び分析に供され得る領域を定義する他の物理的パラメータであり得る。共コンパートメント化という用語は、単一コンパートメント内にあることを指す。例えば、２つの分析物が共コンパートメント化されていると言われる場合、分析物は両方とも同じコンパートメント内にある。共コンパートメント化された反応生成物は、同じコンパートメント内に位置する、又は同じコンパートメント内で調製された（例えば、同じ反応条件下に単一の環境で調製された）生成物を指す。
【0092】
ビーズ又は液滴内への単一の細胞又は単一核の封入は、ビーズ内に単一の細胞又は核を分配することによって実施され得る。封入されると、図５Ｂに概略するように、単一の細胞はＡＴＡＣ－ｓｅｑに供される。単一細胞ＡＴＡＣ－ｓｅｑでは、細胞（又は核）は、個別にコンパートメント化され、タグメント化され、分析され得る。これは、単一の細胞からのすべてのＤＮＡ又はライブラリが単一の液滴に封入されることを確実にするので、連続性保存転位（ＣＰＴ－ｓｅｑ）を可能にする。通常、転位は、アダプタを挿入し、トランスポザーゼの除去後にＤＮＡを断片化する。したがって、断片化は、それによって様々な細胞からのリードを液滴へとスクランブルするため、単一細胞解像度を取得することができなくなる。対照的に、本明細書で提供される方法は、トランスポザーゼがすべての個々のＤＮＡ／ライブラリ断片を一緒に保持することを可能にし、単一細胞からのすべての材料を単一の液滴に移動させることを可能にする。次に、単一液滴中の細胞からのすべての断片は、バーコード化されたプライマを使用したＰＣＲによってインデックス化可能である（液滴にロードされたビーズから）。ＣＰＴ－ｓｅｑは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ａｍｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，２０１４，４６，１３４３－１３４９）に一般的に記載されている。更に、いくつかの実施形態では、単一細胞ＡＴＡＣ－ｓｅｑをコンビナトリアルインデクシングのために使用することができる。コンビナトリアル又はスプリットアンドプールインデクシングを使用して、単一細胞／単一核解像度を維持しながら、同じウェル又は液滴に複数の細胞をロードすることができる。いくつかの実施形態では、インデックスは、試料の識別、実験条件、又は同じ細胞に使用することができる。コンビナトリアルインデクシングは、液滴の利用率及び細胞スループットを増加させるために使用でき、単一の細胞又は核で使用し得る。
【0093】
場合によっては、クロマチンへの望ましい挿入レベル（例えば、開いた領域で平均して５０～２００塩基対ごとに起こる挿入）が得られるように条件を調整し得る。この方法で使用されるクロマチンは、任意の適切な方法によって作製され得る。いくつかの実施形態では、核は、単離され、溶解され得、クロマチンは、例えば、核エンベロープから更に精製され得る。他の実施形態では、クロマチンは、単離された核を反応緩衝液と接触させることによって単離され得る。これらの実施形態では、単離された核は、反応緩衝液（挿入酵素複合体及び他の必要な試薬を含む）と接触したときに溶解することができ、これにより、挿入酵素複合体がクロマチンにアクセスすることが可能になる。これらの実施形態では、本方法は、細胞の集団から核を単離すること、並びに単離された核をトランスポザーゼ及びアダプタと組合せることを含み得、この組合せは、核が溶解して当該クロマチンを放出すること、及びゲノムＤＮＡのアダプタでタグ付けされた断片の生成の両方をもたらす。クロマチンは、他の方法（例えば、ＣｈＩＰ－ＳＥＱ法）と同様に架橋を必要としない。
【0094】
クロマチンが断片化され、タグ付けされてゲノムＤＮＡのタグ付き断片が生成された後、アダプタタグ付き断片の少なくとも一部を配列決定して、複数の配列リードを生成する。断片は、任意の適切な方法を使用して配列決定され得る。例えば、断片は、Ｉｌｌｕｍｉｎａの可逆的ターミネータ法、Ｒｏｃｈｅのパイロシーケンシング法（４５４）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのライゲーションによるシーケンシング（ＳＯＬｉＤプラットフォーム）、又はＬｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔプラットフォームを使用して配列決定され得る。そのような方法の例は、以下の参考文献：Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ２００５ ４３７： ３７６－８０）；Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６ ２４２： ８４－９）；Ｓｈｅｎｄｕｒｅ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００５ ３０９：１７２８－３２）；Ｉｍｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（Ｂｒｉｅｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．２００９ １０：６０９－１８）；Ｆｏｘ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；５５３：７９－１０８）；Ａｐｐｌｅｂｙ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；５１３：１９－３９）及びＭｏｒｏｚｏｖａ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００８ ９２：２５５－６４）に記載されており、これらは、すべての出発生成物、ライブラリ調製のための方法、試薬、及び各工程の最終生成物を含む、方法及び方法の特定の工程の一般的な説明のために、参照により本明細書に組み込まれる。明らかなように、選択された次世代シーケンシングプラットフォームと互換性のある順方向及び逆方向配列決定プライマ部位を、増幅工程中に断片の末端に付加することができる。特定の実施形態では、断片は、断片に付加されたタグにハイブリダイズするＰＣＲプライマを使用して増幅され得、ＰＣＲに使用されるプライマは、特定のシーケンシングプラットフォームと互換性のある５’尾部を有する。ＡＴＡＣ－ｓｅｑを実施する方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３８８２５号に記載されている。
【0095】
本明細書で使用される「クロマチン」という用語は、真核細胞の核に見られるような、タンパク質及びポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ）を含む分子の複合体を指す。クロマチンは、一部は、ヌクレオソーム、ゲノムＤＮＡ、及び一般にゲノムＤＮＡに結合する他のＤＮＡ結合タンパク質（例えば転写因子）を形成するヒストンタンパク質で構成される。
【0096】
連続性保存転位シーケンシング（ＣＰＴ－ｓｅｑ）は、標的核酸に隣接する鋳型核酸断片の会合を維持するためにトランスポザーゼを使用することによって連続性情報を保存しながら配列決定する方法を指す。例えば、ＣＰＴは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸に関して実施され得る。ＣＰＴ核酸は、固有のインデックス又はバーコードを有する相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって捕捉され、固体支持体上に固定化され得る。いくつかの実施形態では、固体支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドは、バーコードに加えて、プライマ結合部位、固有の分子インデックスを更に含み得る。有利には、断片化された核酸の物理的近接性を維持するためのトランスポソームのそのような使用は、同じ元の分子、例えば染色体からの断片化された核酸が、固体支持体上に固定されたオリゴヌクレオチドから同じ固有のバーコード及びインデックス情報を受け取る可能性を高める。これは、固有のバーコードを有する連続的に連結された配列決定ライブラリをもたらす。連続的に連結された配列決定ライブラリを配列決定して、連続配列情報を導き出すことができる。
【0097】
本明細書で使用される場合、「連続性情報」という用語は、共有情報に基づく２つ以上のＤＮＡ断片間の空間的関係を指す。情報の共有態様は、隣接、コンパートメント及び距離の空間的関係に関するものであり得る。これらの関係に関する情報は、ＤＮＡ断片に由来する配列リードの階層的アセンブリ又はマッピングを容易にする。従来のショットガン配列決定に関連して使用される伝統的なアセンブリ又はマッピング方法は、個々の配列リードが由来する２つ以上のＤＮＡ断片間の空間的関係に関する、個々の配列リードの相対的なゲノム起源又は座標を考慮しないため、この連続性情報は、そのようなアセンブリ又はマッピングの効率及び精度を改善する。
【0098】
したがって、本明細書に記載の実施形態によれば、連続性情報を捕捉する方法は、隣接空間関係を決定するための短距離連続性方法、コンパートメントの空間関係を決定するための中距離連続性方法、又は距離の空間関係を決定するための長距離連続性方法によって達成され得る。これらの方法は、ＤＮＡ配列のアセンブリ又はマッピングの精度及び品質を促進し、本明細書に記載されるような任意の配列決定法と共に使用し得る。
【0099】
連続性情報は、個々の配列リードが由来する２つ以上のＤＮＡ断片間の空間的関係に関する、個々の配列リードの相対的なゲノム起源又は座標を含む。いくつかの実施形態では、連続性情報は、非重複配列リードからの配列情報を含む。
【0100】
いくつかの実施形態では、標的核酸配列の連続性情報は、ハプロタイプ情報を示す。いくつかの実施形態では、標的核酸配列の連続性情報は、ゲノム変異体を示す。
【0101】
単一細胞コンビナトリアルインデックス付きシーケンシング（ＳＣＩ－ｓｅｑ）は、体細胞コピー数変異体検出のために数千のローパス単一細胞ライブラリを同時に作製するための配列決定法である。本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、ＳＣＩ－ｓｅｑなどによるコンビナトリアルインデクシングアプローチを使用して、試料中の複数の分析物を同時分析するための方法、組成物、及びシステムに関する。例えば、図１０に示すように、ＳＣＩ－ｓｅｑを使用してＤＮＡとＲＮＡを同時にインデックス化することができる。ＤＮＡ及びＲＮＡの特定のタグの導入後、細胞／核は物理的に複数の群に分けられる。各群について、ＤＮＡを第１のバーコード（図１０のバーコードＩ）で標識し、ＲＮＡを第２のバーコード（図１０のバーコードＪ）で標識する。ＤＮＡ及びＲＮＡの標識化は、同時に又は連続的に行われ得る。次に、群を一緒にプールし、複数の群にランダムに分割し、それを第３のバーコード（図１０のバーコードＫ）で更に標識することができる。プールアンドスプリットプロセスは、インデックス化能力を高めるために複数のラウンドにわたって繰り返すことができる。インデックスの衝突率（異なる細胞／核に対して同じバーコード）は、ラウンド当たりのバーコードの数及び群当たりの細胞／核の数によって制御することができる。バーコードは、逆転写酵素によって、ライゲーションによって、タグメンテーションによって、又はバーコードを導入するための他の手段によって導入することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコンビナトリアルシーケンシング技術は、細胞から核を分離又は単離することを必要としない。
【0102】
図１１は、ライゲーションと伸長によるインデックス化を用いた、ＳＣＩ－ｓｅｑなどによるコンビナトリアルシーケンシングの詳細を更に例示する。タグ１を有するトランスポゾンを、転位によってゲノムＤＮＡに挿入する。バーコードＩ及びタグ２を有するオリゴヌクレオチドを、タグ１ハイブリダイゼーションを介してｇＤＮＡにライゲートする。最初のｃＤＮＡ合成は、バーコードＪとタグ２を有するポリＴオリゴヌクレオチドによって開始され、続いて２番目のｃＤＮＡ合成が行われる。プールアンドスプリットプロセスに続いて、バーコードＫを有するオリゴヌクレオチドを、タグ２領域のｇＤＮＡとｃＤＮＡの両方にハイブリダイズさせ、ギャップ充填ライゲーションによってライゲートする。タグ３は、スプリットアンドプール後の次のラウンドのインデックス化のためのアンカーとして機能することができる。コンビナトリアルインデクシング後、他方の末端のＰＣＲ／ライブラリアダプタを２回目の転位によって付加することができる。
【0103】
本明細書で使用される場合、「単離された」、「単離する」、「精製された」、「精製する」、「精製」という用語、及び本明細書で使用されるそれらの文法的等価物は、特に明記されない限り、試料から、又は材料が単離された供給源（例えば細胞）からの少なくとも１つの汚染物質（タンパク質及び／又は核酸配列など）の量の減少を指す。したがって、精製は、「濃縮」、例えば、試料中の所望のタンパク質及び／又は核酸配列の量の増加をもたらす。
【0104】
核酸の溶解及び単離に続いて、特に単一細胞からの少量のＤＮＡを増幅するために広く使用されている技術である多重置換増幅（ＭＤＡ）などの増幅を実施し得る。いくつかの実施形態では、核酸は、増幅され、配列決定され、又は核酸ライブラリの調製のために使用される。本明細書で使用される場合、核酸又は核酸反応に関して使用される「増幅する」又は「増幅された」、「増幅すること」という用語は、例えば、本発明の実施形態によって、標的核酸などの特定の核酸のコピーを作製するインビトロ方法を指す。核酸を増幅する多くの方法が技術分野において公知であり、増幅反応には、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅反応、ローリングサークル増幅反応、多重アニーリング及びループ化による増幅サイクル（ＭＡＬＢＡＣ）、ＮＡＳＢＡなどの転写媒介増幅法、ループ媒介増幅法（例えば、ループ形成配列を使用した「ＬＡＭＰ」増幅）が含まれる。増幅される核酸は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又は修飾されたＤＮＡ及び／若しくはＲＮＡを含むＤＮＡとＲＮＡの混合物を含む、それらからなる、又はそれらに由来するＤＮＡであり得る。１つ又は複数の核酸分子の増幅から得られる産物（例えば「増幅産物」）は、出発核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその両方であるかどうかに関わらず、ＤＮＡ若しくはＲＮＡのいずれか、又はＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオシド若しくはヌクレオチドの両方の混合物であり得るか、又は修飾されたＤＮＡ若しくはＲＮＡヌクレオシド若しくはヌクレオチドを含むことができる。「コピー」は、必ずしも標的配列に対する完全な配列相補性又は同一性を意味するわけではない。例えば、コピーは、デオキシイノシン又はデオキシウリジンなどのヌクレオチド類似体、意図的な配列改変（標的配列にハイブリダイズ可能であるが相補的ではない配列を含むプライマを介して導入される配列改変など、及び／又は増幅中に起こる配列エラーを含むことができる。
【0105】
捕捉された核酸は、技術分野で公知の任意の適切な増幅方法に従って増幅することができる。本明細書に記載されるか、又は技術分野で一般的に公知の増幅方法のいずれかを、ユニバーサル又は標的特異的プライマと共に利用して、核酸を増幅できることが理解されるであろう。増幅のための適切な方法には、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，００３，３５４，号に記載されているように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）及び核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）が含まれるが、これらに限定されない。上記の増幅方法を使用して、関心対象の１つ以上の核酸を増幅することができる。例えば、マルチプレックスＰＣＲ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡなどを含むＰＣＲを利用して、核酸を増幅することができる。いくつかの実施形態では、関心対象の核酸に特異的に向けられるプライマは、増幅反応に含まれる。
【0106】
核酸の増幅のための他の適切な方法には、オリゴヌクレオチド伸長及びライゲーション、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５－２３２（１９９８））並びにオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）技術（一般に、すべてが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，５８２，４２０号、同第５，１８５，２４３号、同第５，６７９，５２４号及び同第５，５７３，９０７号；欧州特許出願第ＥＰ ０ ３２０ ３０８ Ｂ１号、同第ＥＰ ０ ３３６ ７３１ Ｂ１号、同第ＥＰ ０ ４３９ １８２ Ｂ１号；国際公開第９０／０１０６９号、同第８９／１２６９６号及び同第８９／０９８３５号参照）が含まれ得る。これらの増幅方法は、核酸を増幅するように設計され得ることが理解されるであろう。例えば、いくつかの実施形態では、増幅方法は、関心対象の核酸に特異的に向けられるプライマを含むライゲーションプローブ増幅又はオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）反応を含み得る。いくつかの実施形態では、増幅方法は、関心対象の核酸に特異的に向けられ、ヒドロゲル細孔を通過することができるプライマを含む、プライマ伸長ライゲーション反応を含み得る。関心対象の核酸を増幅するように特別に設計することができるプライマ伸長及びライゲーションプライマの非限定的な例として、増幅は、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，５８２，４２０号及び同第７，６１１，８６９号に例示されるようなＧｏｌｄｅｎＧａｔｅアッセイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）に使用されるプライマを含み得る。
【0107】
いくつかの実施形態では、核酸は、それぞれの内容が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号の開示によって例示されるように、クラスタ増幅法を使用して増幅される。米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号の組み込まれている資料は、固定化された核酸分子のクラスタ又は「コロニー」からなるアレイを形成するために、増幅産物を固体支持体上に固定化することを可能にする核酸増幅の方法を記載する。そのようなアレイ上の各クラスタ又はコロニーは、複数の同一の固定化されたポリヌクレオチド鎖及び複数の同一の固定化された相補的ポリヌクレオチド鎖から形成される。そのように形成されたアレイは、本明細書では一般に「クラスタ化アレイ」と称される。米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号に記載されているような固相増幅反応の生成物は、固定化されたポリポリヌクレオチド鎖と固定化された相補鎖の対をアニーリングすることによって形成されるいわゆる「架橋」構造体であり、両方の鎖は、好ましくは共有結合を介して、５’末端で固体支持体上に固定化されている。クラスタ増幅法は、固定化された核酸鋳型を使用して固定化されたアンプリコンを生成する方法の例である。他の適切な方法を使用して、本明細書で提供される方法に従って生成された固定化されたＤＮＡ断片から固定化されたアンプリコンを生成することもできる。例えば、１つ以上のクラスタ又はコロニーは、増幅プライマの各対の一方又は両方のプライマが固定化されているかどうかに関わらず、固相ＰＣＲによって形成することができる。
【0108】
更なる増幅方法には、等温増幅が含まれる。使用できる代表的な等温増幅法には、例えば、Ｄｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：５２６１－６６（２００２）に例示されるような多重置換増幅（ＭＤＡ）、又は米国特許第６，２１４，５８７号に例示される等温鎖置換核酸増幅が含まれ得るが、これらに限定されず、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本開示で使用できる他の非ＰＣＲベースの方法には、例えば、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｖｉｒｕｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９５、米国特許第５，４５５，１６６号及び同第５，１３０，２３８号並びにＷａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０：１６９１－９６（１９９２）に記載されている鎖置換増幅（ＳＤＡ）、又は、例えば、Ｌａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３：２９４－３０７（２００３）に記載されている超分岐鎖置換増幅が含まれ、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。等温増幅法は、ゲノムＤＮＡのランダムプライマ増幅のために、鎖置換Ｐｈｉ ２９ポリメラーゼ又はＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの大型断片、５’→３’エキソ－と共に使用することができる。これらのポリメラーゼの使用は、それらの高いプロセッシビティ及び鎖置換活性を利用する。高いプロセッシビティは、ポリメラーゼが１０～２０ｋｂの長さの断片を生成することを可能にする。上記のように、クレノウポリメラーゼなどの低いプロセッシビティと鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用して、等温条件下でより小さな断片を生成することができる。増幅反応、条件及び成分の更なる説明は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，６７０，８１０号の開示に詳細に記載されている。いくつかの実施形態では、ランダムヘキサマーを変性ＤＮＡにアニーリングし、続いて触媒酵素Ｐｈｉ ２９の存在下に一定温度で鎖置換合成を行う。これは、ＭＤＡ後の蛍光強度（ＳＹＴＯＸで染色されたＤＮＡ）の増加によって確認されるように、ＤＮＡ増幅をもたらす。独立して、ＮＥＸＴＥＲＡ（登録商標）タグメンテーション及びＰＣＲ後の蛍光強度の実質的な増加によって示されるように、溶解及びクリーンアップ後のＮＥＸＴＥＲＡ（登録商標）ベースのタグメンテーション並びにその後のＰＣＲによるｇＤＮＡ増幅も実施し得る。
【0109】
本開示において有用な別の核酸増幅法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｒｏｔｈｕｅｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１（５）：１３２１－２（１９９３）に記載されているように、定常５’領域の後にランダム３’領域が続く２ドメインプライマの集団を使用するタグ付きＰＣＲである。増幅の最初のラウンドを実施して、ランダムに合成された３’領域からの個々のハイブリダイゼーションに基づいて、熱変性されたＤＮＡでの多数の開始を可能にする。３’領域の性質により、開始部位はゲノム全体にわたってランダムであると考えられる。その後、結合していないプライマを除去し、定常５’領域に相補的なプライマを使用して、更なる複製を行うことができる。
【0110】
いくつかの実施形態では、核酸は、完全に又は部分的に配列される。核酸は、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ナノポアシーケンシングなどを含む直接シーケンシングなどの任意の適切な配列決定法に従って配列決定することができる。
【0111】
１つのシーケンシング方法は、合成によるシーケンシング（ＳＢＳ）である。ＳＢＳでは、核酸鋳型（例えば標的核酸又はそのアンプリコン）に沿った核酸プライマの伸長を監視して、鋳型中のヌクレオチドの配列を決定する。基礎となる化学プロセスは、重合（例えば、ポリメラーゼ酵素によって触媒される）であり得る。特定のポリマーベースのＳＢＳの実施態様では、プライマに付加されるヌクレオチドの順序及び種類の検出を使用して鋳型の配列を決定することができるように、蛍光標識ヌクレオチドを鋳型依存的にプライマに付加する（それによってプライマを伸長させる）。
【0112】
１つ以上の増幅された核酸は、サイクル中に試薬を繰り返し送達することを含むＳＢＳ又は他の検出技術に供することができる。例えば、第１のＳＢＳサイクルを開始するために、１つ以上の標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼなどを、１つ以上の増幅された核酸分子を収容する液滴に流入／通過させることができる。プライマ伸長によって標識ヌクレオチドが組み込まれる部位を検出することができる。任意で、ヌクレオチドは、ヌクレオチドがプライマに付加されると、更なるプライマ伸長を終結する可逆的終結特性を更に含むことができる。例えば、可逆的ターミネータ部分を有するヌクレオチド類似体をプライマに付加して、デブロッキング剤が送達されてその部分を除去するまで、その後の伸長が起こらないようにすることができる。したがって、可逆的終結を使用する実施形態の場合、デブロッキング試薬をフローセルに送達することができる（検出が行われる前又は後に）。洗浄は、様々な送達工程の間に実施することができる。次に、サイクルをｎ回繰り返してプライマをｎ個のヌクレオチドで伸長し、それによって長さｎの配列を検出することができる。本開示の方法によって生成されるアンプリコンと共に使用するために容易に適合させることができる例示的なＳＢＳ手順、流体系及び検出プラットフォームは、例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５３－５９（２００８）、国際公開第０４／０１８４９７号、米国特許第７，０５７，０２６号、国際公開第９１／０６６７８号、国際公開第０７／１２３７４４号、米国特許第７，３２９，４９２号、米国特許第７，２１１，４１４号、米国特許第７，３１５，０１９号、米国特許第７，４０５，２８１号、及び米国特許出願第２００８／０１０８０８２号に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【0113】
パイロシーケンシングなどの、サイクル反応を使用する他の配列決定手順を使用することができる。パイロシーケンシングは、特定のヌクレオチドが新生核酸鎖に取り込まれる際の無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を検出する（Ｒｏｎａｇｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４２（１），８４－９（１９９６）；Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１（１），３－１１（２００１）；Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１（５３７５），３６３（１９９８）；米国特許第６，２１０，８９１号；同第６，２５８，５６８号及び同第６，２７４，３２０号、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。パイロシーケンシングでは、放出されたＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼによってアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に即座に変換されることで検出でき、生成されたＡＴＰのレベルは、ルシフェラーゼ生成光子を介して検出することができる。したがって、配列決定反応は、発光検出システムを介して監視することができる。蛍光ベースの検出システムに使用される励起放射線源は、パイロシーケンシング手順には必要ない。本開示に従って生成されたアンプリコンへのパイロシーケンシングの適用に適合させることができる有用な流体系、検出器、及び手順は、例えばＷＩＰＯ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／５７１１１号、米国特許出願第２００５／０１９１６９８（Ａ１）号、米国特許第７，５９５，８８３号、及び米国特許第７，２４４，５５９号に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【0114】
いくつかの実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを含む方法を利用することができる。例えば、ヌクレオチドの取り込みは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）相互作用を介して、フルオロフォア担持ポリメラーゼとγ－リン酸標識ヌクレオチドとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）相互作用を通して、又はゼロモード導波路（ＺＭＷ）を用いて検出することができる。ＦＲＥＴベースの配列決定のための技術及び試薬は、例えば、Ｌｅｖｅｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９，６８２－６８６（２００３）；Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．３３，１０２６－１０２８（２００８）；Ｋｏｒｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５， １１７６－１１８１（２００８）に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【0115】
いくつかのＳＢＳの実施形態は、ヌクレオチドが伸長産物に組み込まれると放出されるプロトンの検出を含む。例えば、放出されたプロトンの検出に基づく配列決定は、市販されている電気検出器及び関連する技術を使用することができる。そのような配列決定システムの例は、パイロシーケンシング（例えば、Ｒｏｃｈｅの子会社である４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの市販のプラットフォーム）、γ－リン酸標識ヌクレオチドを使用したシーケンシング（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの市販のプラットフォーム）、プロトン検出を使用したシーケンシング（例えば、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ子会社の市販のプラットフォーム）、又は米国特許出願第２００９／００２６０８２（Ａ１）号；同第２００９／０１２７５８９（Ａ１）号；同第２０１０／０１３７１４３（Ａ１）号；若しくは同第２０１０／０２８２６１７（Ａ１）号に記載されている配列決定方法及びシステムであり、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。速度論的排除を使用して標的核酸を増幅するための本明細書に記載の方法は、プロトンを検出するために使用される基質に容易に適用することができる。より具体的には、本明細書に記載の方法を使用して、プロトンを検出するために使用されるアンプリコンのクローン集団を生成することができる。
【0116】
別の配列決定技術は、ナノポアシーケンシングである（例えば、Ｄｅａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，１４７－１５１（２０００）；Ｄｅａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３５：８１７－８２５（２００２）；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．２：６１１－６１５（２００３）参照、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかのナノポアの実施形態では、標的核酸又は標的核酸から除去された個々のヌクレオチドは、ナノポアを通過する。核酸又はヌクレオチドがナノポアを通過するとき、各ヌクレオチド種は、細孔の電気コンダクタンスの変動を測定することによって識別され得る。（米国特許第７，００１，７９２号；Ｓｏｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５３，１９９６－２００１（２００７）；Ｈｅａｌｙ， Ｎａｎｏｍｅｄ．２，４５９－４８１（２００７）；Ｃｏｃｋｒｏｆｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０，８１８－８２０（２００８）参照、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）。
【0117】
本開示による検出に適用することができるアレイベースの発現及び遺伝子型解析のための例示的な方法は、米国特許第７，５８２，４２０号；同第６，８９０，７４１号；同第６，９１３，８８４号若しくは同第６，３５５，４３１号又は米国特許出願第２００５／００５３９８０（Ａ１）号；同第２００９／０１８６３４９（Ａ１）号若しくは同第２００５／０１８１４４０（Ａ１）号に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【0118】
本明細書に記載されるような核酸の単離、増幅、及び配列決定の方法では、様々な試薬が核酸の単離及び調製のために使用される。そのような試薬には、例えば、リゾチーム、プロテイナーゼＫ、ランダムヘキサマー、ポリメラーゼ（例えば、Φ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｕポリメラーゼ）、トランスポザーゼ（例えばＴｎ５）、プライマ（例えば、Ｐ５及びＰ７アダプタ配列）、リガーゼ、触媒酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝剤、又は二価カチオンが含まれ得る。
【0119】
アダプタは、シーケンシングプライマ部位、増幅プライマ部位、及びインデックスを含むことができる。本明細書で使用される場合、「インデックス」は、核酸をタグ付けするため、及び／又は核酸の供給源を識別するための分子識別子及び／又はバーコードとして使用することができるヌクレオチドの配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、インデックスを使用して、単一の核酸、又は核酸の亜集団を識別することができる。いくつかの実施形態では、単一の細胞は、例えば、連続性保存転位（ＣＰＴ－ｓｅｑ）アプローチを用いて、コンビナトリアルインデクシングのために使用され得る。
【0120】
インデックスは、核酸分子の供給源を識別するのに役立ち得る。いくつかの実施形態では、アダプタは、例えば、一方又は両方の末端でアダプタの伸長を妨げるブロッキング基を付加することによって、コンカテマーの形成を防ぐように改変することができる。３’ブロッキング基の例には、３’スペーサＣ３、ジデオキシヌクレオチド、及び基質への付着が含まれる。５’ブロッキング基の例には、脱リン酸化された５’ヌクレオチド、及び基質への付着が含まれる。
【0121】
例示的な方法は、標的核酸の５’末端を脱リン酸化して、その後のライゲーション工程でのコンカテマーの形成を防止すること；第１のアダプタの３’末端がブロックされているリガーゼを使用して、脱リン酸化された標的の３’末端に第１のアダプタを連結すること；ライゲートされた標的の５’末端を再リン酸化すること；第２のアダプタの５’末端が脱リン酸化されている一本鎖リガーゼを使用して、脱リン酸化された標的の５’末端に第２のアダプタをライゲートすることを含む。
【0122】
別の例には、５’エキソヌクレアーゼで核酸を部分消化して、一本鎖３’オーバーハングを有する二本鎖核酸を形成することが含まれる。３’ブロッキング基を含むアダプタを、３’オーバーハングを有する二本鎖核酸の３’末端にライゲートすることができる。ライゲートされたアダプタを有する３’オーバーハングを有する二本鎖核酸を脱ハイブリダイズして、一本鎖核酸を形成することができる。リン酸化されていない５’末端を含むアダプタを、一本鎖核酸の５’末端にライゲートすることができる。
【0123】
核酸の５’ヌクレオチドなどの核酸を脱リン酸化する方法には、核酸をホスファターゼと接触させることが含まれる。ホスファターゼの例には、子ウシ腸ホスファターゼ、エビアルカリホスファターゼ、南極ホスファターゼ、及びＡＰＥＸアルカリホスファターゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）が含まれる。
【0124】
核酸をライゲートする方法には、核酸をリガーゼと接触させることが含まれる。リガーゼの例には、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２、ＲｔｃＢリガーゼ、メタノバクテリウム（Methanobacterium）ＲＮＡリガーゼ、及びＴＳ２１２６ ＲＮＡリガーゼ（ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ）が含まれる。
【0125】
核酸の５’ヌクレオチドなどの核酸をリン酸化する方法には、核酸をキナーゼと接触させることが含まれる。キナーゼの例には、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼが含まれる。
【0126】
本明細書で提供されるシステム及び方法の実施形態は、転位試薬並びに第１のタグに相補的な第１のプローブ及び第２のタグに相補的な第２のプローブを含むキットを含み、第１及び第２のプローブは固体支持体上に固定化されている。いくつかの実施形態では、第１のプローブ及び第２のプローブはバーコードを含む。いくつかの実施形態では、第１のプローブ及び第２のプローブは、ポリＴプローブである。いくつかの実施形態では、固体支持体は、エッチングされた表面、ウェル、アレイ、フローセル装置、マイクロ流体チャネル、ビーズ、磁気ビーズ、カラム、液滴、又は微粒子である。
【実施例】
【0127】
実施例１－バルク細胞由来のＤＮＡ及びＲＮＡライブラリの同時調製
以下の実施例は、バルク細胞の試料中のＤＮＡ及びＲＮＡを同時に分析する実施形態を示す。
以下の実施例は、バルク細胞の試料中のＤＮＡ及びＲＮＡを同時に分析する実施形態を示す。
【0128】
図６Ａに示すように、細胞を入手し、溶解して、細胞核を単離した。全ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、ポリＡトランスポゾンとトランスポソームを使用してタグメント化した。トランスポソームは核に入り、オープンクロマチン（ヒストンに結合されていないｇＤＮＡ）をタグメント化する。
【0129】
タグメンテーション後、ｇＤＮＡとＲＮＡの両方が３’ポリＡ尾部を含んでいた。ｇＤＮＡとＲＮＡの両方を、ｇＤＮＡ及びＲＮＡの３’ポリＡ尾部にハイブリダイズするポリＴ捕捉プローブを使用して捕捉した。捕捉プローブは、試料、細胞の下流増幅と分子インデックス化のため、又は分子の逆多重化のための第１の共通配列（ＣＳ１）を含んでいた。ＲＮＡをＤＮＡに変換するために、逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成のためのプライマとして捕捉プローブを使用した。
【0130】
図６Ｂに示すように、ｇＤＮＡ及び生成されたｃＤＮＡを、カラム精製（ＺＹＭＯ）を使用して核から精製した。シーケンシングを使用したアクセス可能なクロマチン（ＡＴＡＣ）ライブラリの調製は伸長／ライゲーション反応で完了し、ＲＮＡライブラリの調製はｃＤＮＡの第２の鎖の合成で完了した。２回目のラウンドのタグメンテーションを使用して、第２の共通配列（ＣＳ２）及び分子インデックスを組み込んだ。Ｔｎ５を除去するために試料のクリーンアップを実施し、ＣＳ１及びＣＳ２に相補的なプライマを使用したＰＣＲによって最終的なシーケンシングライブラリを作製した。
【0131】
同様の方法を使用して、ビーズ上のＤＮＡ及びＲＮＡを同時に分析した。図７Ａ及び７Ｂに示すように、分析は、試料の取り扱いを改善するため、及び／又は完全長ＲＮＡライブラリを可能にするために実施することができる。図７Ａ及び７Ｂの概略図に示すように、細胞を入手し、溶解して、核を単離した。ｇＤＮＡを、ポリＡトランスポゾン及び共通配列（ＣＳ２）を含む２つのトランスポソームでタグメント化した。トランスポソームは核に入り、オープンクロマチン（ヒストンに結合されていないｇＤＮＡ）をタグメント化する。共通配列（ＣＳ１）を含むポリＴ尾部を有する捕捉プローブを、ＤＮＡライブラリとＲＮＡライブラリの両方のポリＡ尾部にハイブリダイズさせた。ＲＮＡライブラリの調製を完了するために、ハイブリダイゼーションプローブを使用してｃＤＮＡ合成をプライミングした。第２の共通配列（ＣＳ２）を、逆転写酵素の鋳型スイッチング活性及び完全長ＲＮＡの製造を可能にする鋳型スイッチングオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）を使用してＲＮＡライブラリに追加した。試料の取り扱いを改善するために、ビオチン化捕捉プローブを使用して、ＲＮＡ及びＤＮＡライブラリを磁性ストレプトアビジンビーズに結合させた。洗浄、緩衝液交換、及び取り扱いは、ビーズ結合分子に対して容易に実施された。
【0132】
図８は、ＡＴＡＣ及びＲＮＡライブラリ調製の結果を示す。ＡＴＡＣライブラリの断片は、図８でボックスに囲まれた、トランスポゾン特異的配列であるシグネチャＭＥ配列を有する。図９に示すように、ＡＴＡＣ断片は、プロモータ領域の周辺の典型的な濃縮を示し（パネルＡ）、３’計数のためのＲＮＡ断片は、遺伝子の末端周辺のリード蓄積を示す（パネルＢ）。表１及び２は、ＤＮＡとＲＮＡの同時分析のためのＡＴＡＣ－ｓｅｑ及びＲＮＡメトリクスの結果を要約する。
実施例２－単一細胞ＡＴＡＣ－ｓｅｑ
【表1】
【表2】
【0133】
以下の実施例は、コンパートメント内で単一細胞ＡＴＡＣ－ｓｅｑを行う実施形態を示す。
【0134】
図５Ｂに概略するように、クロマチンへの転位を実施した。転位後、単一細胞又は単一核をコンパートメントに、この場合は液滴に分配した。トランスポザーゼは、すべての個々のＤＮＡ／ライブラリ断片を一緒に保持し、それによって単一細胞からのすべての材料を単一の液滴内に封入することを可能にする。単一液滴内の細胞からのすべての断片を、バーコード化されたプライマを使用してＰＣＲによってインデックス化した。
【0135】
単一の細胞が単一の液滴に適切に分配されることを確実にするために、混合したヒト及びマウス細胞をプロセスに供した。試料は、５００，０００個のヒト細胞及び５００，０００個のマウス細胞を含んだ。各アッセイは３４，０００の核を含み、それらをプールして約３００，０００の液滴を含む液滴ＰＣＲの１つのチップを生成した。アッセイは１４０，０００ビーズ（チャネル当たり１１μＬの３２００ビーズ）を含んだ。４サイクルの液滴ＰＣＲを実施し、続いてバルクで１０サイクルを実施した。シーケンシングワークフローの例を図１２に概略しており、これは、バーコードが挿入された配列を提供する。図１３に示すように、Ｔｎ５トランスポザーゼの増加は、収率、感度、及び転写開始部位（ＴＳＳ）の割合を増加させることが観察された。
【0136】
配列リードをマウス又はヒトからのいずれかとして識別するバーコードを読み取り、図１４に概略するように、結果は、リードがマウス又はヒトのいずれかに整列したことを示し、単一の細胞が単一の液滴内に封入されており、それによって単一細胞の分配を可能にし、単一細胞の分析を可能にすることを示す。予想されたように、ＡＴＡＣリードの出力は転写開始部位の周辺に分布していた。
【0137】
本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、「包含する」、「含有する」又は「特徴とする」と同義であり、包括的又は非限定的であり、更なる列挙されていない要素又は方法工程を除外しない。
【0138】
上記の説明は、本発明のいくつかの方法及び材料を開示するこのである。本発明は、方法及び材料の修正、並びに製造方法及び設備の変更を受け入れる余地がある。そのような修正は、本開示又は本明細書に開示される本発明の実施を考慮することで当業者に明らかになるであろう。したがって、本発明は、本明細書に開示される特定の実施形態に限定されることを意図するものではなく、本発明の真の範囲及び精神に含まれるすべての修正及び代替をカバーすることを意図する。
【0139】
公開及び未公開の出願、特許、並びに文献の参照を含むがこれらに限定されない、本明細書で引用されるすべての参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の一部をなす。参照により組み込まれる刊行物及び特許又は特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する範囲で、本明細書は、そのような矛盾する資料に優先する及び／又はより上位にあることを意図する。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】