特許 7574316 ＣＭＰ－Ｎｅｕ５ＡＣの調製のための酵素的方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-10-18

(45)【発行日】2024-10-28

(54)【発明の名称】ＣＭＰ－Ｎｅｕ５ＡＣの調製のための酵素的方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 19/30 20060101AFI20241021BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20241021BHJP

   C12N 9/12 20060101ALI20241021BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20241021BHJP

   C12N 11/00 20060101ALI20241021BHJP

   C12N 9/10 20060101ALI20241021BHJP

   C12N 9/90 20060101ALN20241021BHJP

   C12N 15/61 20060101ALN20241021BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20241021BHJP

【ＦＩ】

C12P19/30 ZNA

C12N9/16 B

C12N9/12

C12N15/55

C12N11/00

C12N9/10

C12N9/90

C12N15/61

C12N15/54

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2022561598

(86)(22)【出願日】2021-04-07

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-25

(86)【国際出願番号】 EP2021059101

(87)【国際公開番号】W WO2021204898

(87)【国際公開日】2021-10-14

【審査請求日】2024-03-01

(31)【優先権主張番号】20168848.8

(32)【優先日】2020-04-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】501497655

【氏名又は名称】マックス プランク ゲゼルシャフト ツゥアー フェデルゥン デル ヴィッセンシャフテン エー フォー

(74)【代理人】

【識別番号】110000578

【氏名又は名称】名古屋国際弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】レクサー トーマス エフ．テー．

(72)【発明者】

【氏名】マホウア レザ

【審査官】上條 のぶよ

(56)【参考文献】

【文献】再公表特許第２００４／００９８３０（ＪＰ，Ａ１）

【文献】特表２０１６－５１９９５２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００２－０８５０８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】Carbogydrate Research，1998年，Vol.306，p.575-578

【文献】Applied Microbiology and Biotechnology，2009年08月26日，Vol.85, No.5，p.1383-1391

【文献】Bioorganic & Medicinal Chemistry，2004年，Vol.12, No.24，p.6427-6435

【文献】Marine Drugs，2003年，Vol.1, No.1，p.34-45

【文献】Applied Microbiology and Biotechnology，2000年，Vol.53, No.1，p.257-261

【文献】J. Am. Chem. Soc.，1988年，Vol.110, No.21，p.7159-7163

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｐ １９／３０

Ｃ１２Ｎ ９／１６

Ｃ１２Ｎ ９／１２

Ｃ１２Ｎ １５／５５

Ｃ１２Ｎ １１／００

Ｃ１２Ｎ ９／１０

Ｃ１２Ｎ ９／９０

Ｃ１２Ｎ １５／６１

Ｃ１２Ｎ １５／５４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法であって、

【化1】

Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ、ＥＣ５．１．３．８）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ、ＥＣ４．１．３．３）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ、ＥＣ２．７．７．４３）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ、ＥＣ２．７．１．４８）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＲＡ６、ＥＣ２．７．４．２２）、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３、ＥＣ２．７．４．１）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
を含み、
ここで
前記ウリジンキナーゼ （ＵＤＫ）は、前記シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える、
生成方法。

【請求項2】

前記酵素のセットは、無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ、ＥＣ３．６．１．１）を更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記酵素のセットは、１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１Ｄ－ＰＰＫ２、ＥＣ２．７．４．１）および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２Ｄ－ＰＰＫ２、ＥＣ２．７．４．１）を更に含む、請求項１または請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記結果的に得られた溶液は、７．０～９．０の範囲のｐＨ値を有する、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンの濃度は、１ｍＭから５０００ｍＭの範囲であり、および／またはピルベートの濃度は、１ｍＭから５０００ｍＭの範囲であり、および／またはシチジンの濃度は、０．１ｍＭから２０００ｍＭの範囲であり、および／またはアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）の濃度は、０．００１ｍＭから１００ｍＭの範囲である、請求項１～請求項４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンと前記シチジンとの比率は、１：１から１００：１の範囲であり、および／または前記結果的に得られた溶液は、０．１ｍＭから２００ｍＭの範囲の濃度を有するＭｇ^２＋を更に含む、請求項１～請求項５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記酵素のそれぞれは、以下のアミノ酸配列を有する：
前記Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
前記Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されるに示されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
前記Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
前記ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
前記ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＲＡ６）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
前記ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
前記無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
前記１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１Ｄ－ＰＰＫ２）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含む、
請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とピルベートとの比率は、１：１から１：５０の範囲であり、
Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とシチジンとの比率は、１：１から１００：１の範囲であり、
アデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）とシチジンとの比率は、１：１から１：１００の範囲であり、および
アデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）とポリホスフェートとの比率は、１：１から１：２００の範囲であり、および／または
Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の濃度は、２０～３０００ｍＭの範囲であり、
ピルベートの濃度は、２０ｍＭから３０００ｍＭの範囲であり、
シチジンの濃度は、１ｍＭから５００ｍＭの範囲であり、
アデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）の濃度は、０．００１から１０ｍＭの範囲であり、および
ポリホスフェートの濃度は、１ｍＭから３０ｍＭの範囲である、
請求項１～請求項７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記酵素のセットは、細胞溶解物または細胞ホモジネートから固体支持体上に直接共固定化される、請求項１～請求項８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記固体支持体は、エポキシド官能基、アミノエポキシド官能基、エチレンジアミン官能基、アミノＣ２官能基、アミノＣ６官能基、アニオン性／アミノＣ６スペーサー官能基、を有するポリマーを含むビーズまたは樹脂から構成される、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

ステップＡ）において、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）は、Ｎ－アセチル－グルコサミンデアセチラーゼ（ＥＣ３．５．１．３３）の存在下でＤ－グルコサミン（ＧｌｃＮ）およびアセテートから別々に、またはインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で生成される、請求項１～請求項１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

Ｎｅｕ５アシル化生体分子の生成方法であって、
ｉ）ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを得るために、請求項１～請求項１１のいずれか１項に記載の方法を行うこと、
ｉｉ）ステップｉ）の後に得られた前記ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを生体分子と反応させること、
を含み、
ここで、前記生体分子は、サッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリカン、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体薬物複合体、炭水化物複合体ワクチン、ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスワクチン、またはフラボノイドであり、シアリルトランスフェラーゼの存在下で、ＣＭＰ基の除去を伴って前記生体分子のヒドロキシル基と共にＯ－グリコシド結合を形成する、
方法。

【請求項13】

前記生体分子は、末端基としてガラクトシド（Ｇａｌ）、ガラクトサミニド（ＧａｌＮ）、Ｎ－アセチルガラクトサミニド（ＧａｌＮＡｃ）、ノイラミニド（Ｎｅｕ）、Ｎ－アセチルノイラミニド（Ｎｅｕ５Ａｃ）、Ｎ－グリコリルノイラミニド、３－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－２－ノヌロソン酸（ＫＤＮ）、およびＮ－アセチルラコサミニド（Ｇａｌ－β－１－３－ＧｌｃＮＡｃ）の部分のいずれかを含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

Ｎ－アシル－グルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ、ＥＣ５．１．３．８）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ、ＥＣ４．１．３．３）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ、ＥＣ２．７．７．４３）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ、ＥＣ２．７．１．４８）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＲＡ６、ＥＣ２．７．４．２２）、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３、ＥＣ２．７．４．１）を含む酵素のセットを含む酵素のセットであって、ここで、前記酵素のセットは、共有結合によってポリマー上に共固定化される、酵素のセット。

【請求項15】

無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）、１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１Ｄ－ＰＰＫ２、ＥＣ２．７．４．１）、および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２Ｄ－ＰＰＫ２、ＥＣ２．７．４．１）を更に含み、および／またはＮ－アセチル－グルコサミンデアセチラーゼ（ＥＣ３．５．１．３３）を更に含む、請求項１４に記載の酵素のセット。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

［発明の分野］
本発明は、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセットを用いて単一反応混合物で、低コストの基質Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ピルベート、シチジン、およびポリホスフェートから、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ、１）を生成する方法に関する。さらに、前記工程は、Ｎｅｕ５アシル化、すなわちシアリル化された生体分子、並びにサッカリド、ペプチド、タンパク質、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリカン、抗体、複合糖質、特に、抗体薬物複合体、および炭水化物複合体ワクチン、またはフラボノイドを含む生体分子、を生成するように適合され得る。

【0002】

［発明の背景］
Ｎ－アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）は、シアル酸であり、並びに細胞の表面および可溶性タンパク質に付着された糖鎖の末端に自然に存在する９－炭素（Ｃ－９）の酸性モノサッカリドである。人体において、Ｎ－アセチルノイラミン酸の最高濃度は、脳において起こり、脳でＮ－アセチルノイラミン酸は、シナプス形成および神経伝達におけるガングリオシド構造の不可欠な部分として関与する。母乳は、遊離オリゴサッカリド、特にガラクトシルセラミドの末端に結合されたシアル酸を高濃度で含む。特定の病状において、例えば神経外胚葉性由来の浸潤性腫瘍などにおいて、Ｎｅｕ５Ａｃは、細胞表面で過剰発現する。

【0003】

特定の細菌株は、細菌の莢膜ポリサッカリドに大量のＮ－アセチルノイラミン酸を含む。例えば、髄膜炎菌血清群Ｂ莢膜ポリサッカリドは、α（２－８）－結合Ｎ－アセチルノイラミン酸の約２００個の反復単位からなるシアル酸の線形ホモポリマーである（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ Ａ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７５，２５０，ｐｐ．１９２６－１９３２）。このホモポリマーは、新生児に髄膜炎を引き起こす病原体である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１の莢膜において、重要な獣医病原体であるパスツレラ ヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）Ａ２において、および、さらに、鼻グレーブス（ｇｒａｖｅｓ）における一般的な非－病原性微生物であるモラクセラ ノン－リクエファシエンス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｎｏｎ－ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）においても存在するため、髄膜炎菌血清群Ｂに限定されない。

【0004】

Ｎ－アセチルノイラミン酸は、遊離して天然に存在することはまれである。Ｎ－アセチルノイラミン酸は、ムチン、糖タンパク質、および糖脂質のオリゴサッカリドの構成要素として、より一般的に存在する。Ｎ－アセチルノイラミン酸は、通常、主にガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミン、および他のシアル酸部分の様々な連結における、外膜および内膜表面上の複雑な炭水化物のオリゴサッカリド鎖の末端の非還元位置を占め、そこでＮ－アセチルノイラミン酸は非常に露出され、機能的に重要である。

【0005】

高等動物および様々な微生物からの細胞は、グルコースから始まる長い経路においてシアル酸を生成する。シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－Ｄ－ノイロサミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）は、多数の生物工学的応用のために重要な基質である。

【0006】

ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃは、ポリシアル酸、糖脂質、および糖タンパク質を含む様々な生体高分子において受容体ヒドロキシル基にシアル酸を結合するシアリルトランスフェラーゼの供与体基質である（Ｔｓｕｊｉ，１９９６）。

【0007】

哺乳類の外細胞表面に存在するシアリル化オリゴサッカリドは、細胞相互作用において重要な役割を果たしており、いくつかの細菌は、宿主の免疫系を回避するために、これらの構造を模倣することができる。シアリル化の経路を詳細に理解して、阻害剤および模倣物の設計および生産を可能にすることは、感染症、および自己免疫疾患、および癌の研究に大きな利益をもたらすだろう。シアリル化は、２つの段階で起こり、第一は、シアル酸を活性化すること、および第二は、活性化されたシアル酸を標的分子に転移することである。活性化ステップは、酵素ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃシンセターゼ（ＣＳＳ、またはＣＮＳ）によって触媒される。

【0008】

ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃは、不安定であり、比較的高価であるので、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃシンセターゼは、シアリル化オリゴサッカリドの予備（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）酵素合成に重要である。ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃシンセターゼは、対応するシアロオリゴサッカリド類似体を合成するために、シアル酸類似体を荷電するためにも使用されることができる。シアル酸活性化は、Ｋｅａｎ（１９９１）によって見直されており、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃシンセターゼは、様々な真核性の、および原核性の供給源から単離されている。いくつかの細菌性病原体は、重要な病原性因子としてシアリル化された莢膜およびリポポリサッカリドを有することが示されており、このことは、シアル酸の生合成の、およびこれらの生物への取り込みの研究の動機になっている。髄膜炎菌は、ＷａｒｒｅｎおよびＢｌａｃｋｌｏｗ（１９６２）によって、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃシンセターゼの優れた供給源であることが示されたが、非病原性の組換え株は、この酵素の生産のスケールアップ、およびシアリル化されたオリゴサッカリドの予備合成における当該適用のために好ましいだろう。ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃシンセターゼをコードする細菌遺伝子は、大腸菌（Ｖａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７）、髄膜炎菌（Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ Ｆｒｏｓｃｈ，１９９２，Ｇａｎｇｕｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、ストレプトコッカス アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｈａｆｔｅｔ ａｌ．，１９９６）およびヘモフィルス デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）（Ｔｕｌｌｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６）からクローン化されている。

【0009】

ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃは、炭水化物ワクチンの生成に、および個別化医療の成長分野、すなわち、薬物送達のための糖ナノ材料の調製に必要である。さらに、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でモノクローナル抗体および他の組換えタンパク質のコア構造を構築するために、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃは、広範囲に必要とされている。

【0010】

したがって、Ｎｅｕ５アシル化、すなわち、シアリル化生体分子を含むことへの高い需要がある。しかしながら、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの高い需要（年あたりトンのオーダーで）にもかかわらず、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの入手可能性は、研究者にとっても非常に制限される。

【0011】

アデノシン５’－モノホスフェート（ＡＭＰ）およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）は、１０ｍＭの濃度で特定のＮ－アセチルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）の活性を、６０％以上阻害することが知られている。既知の方法において、高濃度の例えば、ＣＭＰ、ＣＤＰ、またはＣＴＰなどのシチジルヌクレオチドは、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの酵素合成に直接的に提供される。しかしながら、例えば、ＣＭＰ、ＣＤＰ、およびＣＴＰなどのリン酸化シチジンは、Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）の阻害剤として知られており、ＣＳＳの第２のシチジル結合部位へ結合することを介してＣＳＳがシチジンヌクレオチドによって阻害される（Ｉｇｎａｃｉｏ Ｇ．ＢＲＡＶＯ ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ，２００１，２５８，ｐｐ５６８－５９８．）。

【0012】

非常に低濃度のシチジン５’－モノホスフェート（ＣＭＰ）およびシチジン５’－ジホスフェート（ＣＤＰ）は、特定のＮ－アセチル－ノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）の活性を強力に阻害することが報告される。例えば、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）からのＣＳＳの活性は、０．３ｍＭのＣＭＰによって５７％、およびＣＤＰによって４５％阻害される。ペロフィルス エシューレナッツ（Ｐｅｌｏｐｈｙｌｓ ｅｓｃｈｕｌｅｎｕｔｓ）からのＣＳＳの活性は、１．０ｍＭのＣＭＰによって４３％、１ｍＭのＣＤＰによって４９％阻害される。さらに、高濃度（５ｍＭを超える）のＣＴＰは、チャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）およびドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）からのＣＣＳの活性を阻害する。

【0013】

したがって、高濃度のＣＭＰ、ＣＤＰ、および／またはＣＴＰを直接提供することは、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの酵素的生成にとって技術的に不利であることは明らかである。

【0014】

逆に、シチジンは、高濃度（６０ｍＭを超える）でＣＳＳの活性を阻害しない。さらに、ＡＴＰはＣＣＳの活性化剤として使用することができる（Ｉｇｎａｃｉｏ Ｇ．ＢＲＡＶＯ ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２００１，２５８，ｐｐ５６８－５９８．）。

【0015】

文献に記載されるＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ合成の前述の欠点にもかかわらず、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの一般的な反応における更なる欠点は、出発材料、特にシチジン－５’－モノホスフェート（ＣＭＰ）およびシチジン－５’－トリホスフェート（ＣＴＰ）それぞれは、非常に高価であるので、合成経路は、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃのコストの大きい合成を結果的にもたらす、という事実に基づく。すでに上述されたように、当技術分野において、低コストで容易に入手可能な出発物質からＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを調製するための費用効率が高く、効率的な方法を提供する必要がある。

【0016】

ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの調製のために費用効果が高く、効率的な方法を提供するために、例えば、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ピルベート、シチジン、およびポリホスフェートなどの低コストの基質は、図１Ａに示されるように、多酵素カスケード反応におけるＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの生産に適した出発材料として特定される。

【0017】

本発明の反応カスケードは、（ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）からのＮ－アセチル－Ｄ－マンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）の形成、（ｂ）ＭａｎＮＡｃおよびピルベートからのＮ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸の形成、（ｃ）シチジンおよびアデノシン５’－トリホスフェートからのシチジン５’－モノホスフェート（ＣＭＰ）の形成、（ｄ）ＣＭＰおよびＡＴＰからのシチジン５’－ジホスフェート（ＣＤＰ）の形成、（ｅ）ＣＤＰおよびポリホスフェート（ポリＰ_ｎ）からのシチジン５’－トリホスフェート（ＣＴＰ）の形成、および（ｆ）Ｎｅｕ５ＡｃとＣＴＰでＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃにする反応、を含む。任意に、ＡＤＰのＡＴＰへの変換を助けるために１Ｄ－ＰＰＫ２を添加することによってカスケードを拡張することができる。さらに、ＡＭＰのＡＤＰへのリン酸化を活性化するために、２Ｄ－ＰＰＫ２を追加することによって、カスケードを拡張することができる。さらに、アデノシンホスフェートの頻繁な加水分解を阻害するために、１Ｄ－ＰＰＫ２および２ＤＰＰＫ２を添加することにより、カスケードを拡張することができる。

【0018】

ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ピルベート、シチジン、およびポリホスフェートから、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）の存在下で、直接的に生成することができることが予想された。

【0019】

とりわけ、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）の触媒活性を強く阻害するＣＭＰおよびＣＤＰの濃度を制御するために、ＣＭＰは、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）の存在下でシチジンからインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で生成され、ＣＤＰも、ウリジンモノホスフェート（ＵＭＰ）キナーゼによってＣＭＰからインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で継続的に生成される。

【0020】

驚くべきことに、本発明者らは、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）によって触媒されるシチジンのシチジン５’－モノホスフェート（ＣＭＰ）へのインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）変換が、リン酸化シチジンヌクレオチド、特にＮ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）の触媒活性を阻害するＣＭＰ、およびＣＤＰの濃度を制御することを明らかにしている。さらに、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセットが、固体支持体上に共固定化される場合、多酵素カスケード反応の効率を高める。

【0021】

低コストおよび容易に入手可能な基質から出発して費用効果が高い方法においてＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを生成する効率的な多酵素法に対する長年の必要性がある。

【0022】

したがって、本発明の目的は、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの調製のための費用効果が高い、および効率的な多酵素法を提供することである。
本発明の目的は、独立請求項の教示によって解決される。本発明の更なる有利な特徴、態様、および詳細は、本出願の従属請求項、明細書、図面、および実施例から明らかである。

【0023】

［発明の説明］
したがって、本発明は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法を対象にし、

【0024】

【化1】

Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アセチルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセット、
を提供すること；
Ｂ）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
を含み、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジン５’－モノホスフェート（ＣＭＰ）に変える。

【0025】

本発明の好ましい実施形態は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法を対象にし、

【0026】

【化2】

Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アセチルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセット、
を提供すること；
Ｂ）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
を含み、
ここで、酵素のセット、または酵素のセットの少なくとも三つは、固体支持体上に共固定化され、およびウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジン５’－モノホスフェート（ＣＭＰ）に変える。

【0027】

別の方法として、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）は、Ｎ－アセチル－グルコサミンデアセチラーゼの存在下で、Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮ）およびアセテートから別々に、またはインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で生成される。したがって、いくつかの場合において、追加のステップＡ１）を、以下の通りにステップＡ）の前に別々に行ってもよい：
Ａ１）Ｎ－アセチル－グルコサミンデアセチラーゼの存在下で、Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮ）およびアセテートからＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンを生成する。

【0028】

他の場合において、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）は、Ｎ－アセチル－グルコサミンデアセチラーゼの存在下で、Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮ）およびアセテートからインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で生成される。

【0029】

したがって、本発明は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法を対象にし、

【0030】

【化3】

Ａ’）Ｄ－グルコサミン、アセテート、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アセチルグルコサミンデアセチラーゼ、Ｎ－アシル－グルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アセチルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセット、
を提供すること；
Ｂ’）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
を含み、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジン５’－モノホスフェート（ＣＭＰ）に変える。

【0031】

好ましくは、酵素のセットは固体支持体上に共固定化され、より好ましくは酵素のセットは再利用可能な、機械的に安定な固体支持体上に共固定化されることにより各酵素の活性を増加させる、または各酵素の活性の大部分を保持する。

【0032】

任意に、酵素のセットは、無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）を更に含む。さらに、酵素のセットは、１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１Ｄ－ＰＰＫ２）および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２Ｄ－ＰＰＫ２）を更に含む。無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）、１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１ＤＰＰＫ２）、および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２ＤＰＰＫ２）は、好ましくは、同じ固体支持体上で上記の酵素と共に共固定化もされる。

【0033】

好ましくは、本発明の方法において、ステップＢ）において結果的に得られる溶液は、５．０～１０．０、好ましくは５．５～９．５、より好ましくは６．０～９．０、さらにより好ましくは６．５～９．０、最も好ましくは７．０～９．０、の範囲のｐＨ値を有する。

【0034】

好ましくは、本発明の方法において、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の濃度は、１０ｍＭから３５００ｍＭ、好ましくは２０ｍＭから３０００ｍＭ、より好ましくは１５ｍＭから２５００ｍＭ、さらにより好ましくは２０ｍＭから２０００ｍＭの範囲であり、最も好ましくは２０ｍＭから１０００ｍＭの範囲であり、
および／またはピルベートの濃度は、１０ｍＭから３５００ｍＭ、好ましくは２０ｍＭから３０００ｍＭ、より好ましくは１５ｍＭから２５００ｍＭ、さらにより好ましくは２０ｍＭから２０００ｍＭの範囲であり、最も好ましくは、２０ｍＭから１０００ｍＭの範囲であり、
および／またはシチジンの濃度は、１ｍＭから５０ｍＭ、好ましくは１ｍＭから４０ｍＭ、より好ましくは１ｍＭから３０ｍＭ、さらにより好ましくは１０ｍＭから２０ｍＭの範囲であり、最も好ましくは１ｍＭから１５ｍＭの範囲であり、
および／またはアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）の濃度は、０．００１ｍＭから１０ｍＭ、好ましくは０．００５ｍＭから１０ｍＭ、より好ましくは０．０１ｍＭから１０ｍＭ、さらにより好ましくは０．０５ｍＭから１０ｍＭの範囲であり、最も好ましくは、０．１ｍＭから１０ｍＭの範囲であり、
および／またはポリホスフェートの濃度は、１ｍＭから３０ｍＭ、好ましくは１ｍＭから２５ｍＭ、より好ましくは１ｍＭから２０ｍＭ、さらにより好ましくは１ｍＭから１５ｍＭの範囲であり、最も好ましくは、１ｍＭから１０ｍＭの範囲である。

【0035】

好ましくは、本発明の方法において、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンとシチジンとの比率は、１：１から１００：１の範囲である。
好ましくは、本発明の方法において、結果的に得られる溶液は、０．１ｍＭから５００ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭから２００ｍＭ、より好ましくは１ｍＭから１００ｍＭ、さらにより好ましくは１０ｍＭから１００ｍＭ、最も好ましくは２０ｍＭから５０ｍＭの範囲の濃度で、Ｍｇ^２＋を更に含む。

【0036】

好ましくは、本発明の方法において、各酵素は、以下のアミノ酸配列を有する：
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるアミノ酸配列を含み、
Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されるに示されるアミノ酸配列を含み、
Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されるアミノ酸配列を含み、
ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列を含み、
ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＲＡ６）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されるアミノ酸配列を含み、
ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載されるアミノ酸配列を含み、
無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0037】

特に、固体支持体は、エポキシド官能基、アミノエポキシド官能基、エチレンジアミン官能基、アミノＣ２官能基、アミノＣ６官能基、アニオン性／アミノＣ６スペーサー官能基、を有するポリマーを含むビーズまたは樹脂から構成される。固体支持体は、ナノ粒子を含む多孔性もしくは非多孔性粒子、または０．１Åから１０００００Åの細孔径を有する多孔性ビーズである。

【0038】

好ましくは、酵素のセットは、細胞溶解物または細胞ホモジネートから固体支持体上に直接共固定化される。
本発明はまた、Ｎｅｕ５アシル化された、すなわちシアリル化された生体分子を生成するための方法を指し、
ｉ）ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを得るために上記の方法を行うこと、
ｉｉ）ステップｉ）の後に得られたＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを生体分子と反応させること、を含み、
ここで、生体分子は、サッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリカン、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体薬物複合体、炭水化物複合体ワクチン、またはフラボノイドであり、シアリルトランスフェラーゼの存在下でＣＭＰ基の除去を伴って生体分子のヒドロキシル基とＯ－グリコシド結合を形成する。

【0039】

好ましくは、シアリルトランスフェラーゼは、ベータ－ガラクトサミドアルファ－２，６－シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．１）、アルファ－Ｎ－アセチルガラクトサミニドアルファ－２，６－シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．３）、ベータ－ガラクトシドアルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．９９．４）、Ｎ－アセチルラクトサミニドアルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）、アルファ－Ｎ－アセチル－ノイラミニドアルファ－２，８－シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．８）；およびラクトシルセラミドアルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．９９．９）から選択される。これらの酵素は、グリコシル供与体としてＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを使用する。

【0040】

シアリルトランスフェラーゼは、配列Ｎｅｕ５Ａｃ－α－２，３－Ｇａｌ－β－１，３－ＧａｌＮＡｃ－の合成に関与してもよく、配列Ｎｅｕ５Ａｃ－α－２，３－Ｇａｌ－β－１，３－ＧａｌＮＡｃ－は、ＴｈｒまたはＳｅｒにＯ－結合した糖鎖上で発見され、特定のガングリオシドの末端配列としても発見される。これらの酵素は、グリコシル化中にシアリル転移反応を触媒し、ＩＩ型膜タンパク質である。

【0041】

したがって、好ましくは、生体分子は、末端基としてガラクトシド（Ｇａｌ）、ガラクトサミニド（ＧａｌＮ）、Ｎ－アセチルガラクトサミニド（ＧａｌＮＡｃ）、ノイラミニド（Ｎｅｕ）、Ｎ－アセチルノイラミニド（Ｎｅｕ５Ａｃ）、Ｎ－グリコリルノイラミニド、３－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－２－ノヌロソン酸（ＫＤＮ）、およびＮ－アセチルラコサミニド（Ｇａｌ－β－１－３－ＧｌｃＮＡｃ）から選択されるいずれか一つの部分を含む。

【0042】

より好ましくは、生体分子は、Ｔ－抗原（Ｇａｌ－β－１－３－ＧａｌＮＡｃ－α－１－Ｏ－）またはＴｎ－抗原（ＧａｌＮＡｃ－α－１－Ｏ－）を含む糖ペプチド、糖タンパク質、または抗腫瘍ワクチン；またはＧａｌ－β－１－４－ＧｌｃＮＡｃ－β－１－Ｏ－を含む糖脂質、である。

【0043】

本発明はまた、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェート（ＵＭＰ）キナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセットを対象にし、ここで、酵素のセットは、共有結合を介してポリマー上に固定化または共固定化される。

【0044】

好ましくは、酵素のセットは、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチル－ノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェート（ＵＭＰ）キナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含み、ここで、酵素のセットは、好ましくは、エポキシ基で官能基化されたポリマー上に共固定化される。

【0045】

好ましくは、本発明の酵素のセットは、無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）、１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１Ｄ－ＰＰＫ２）および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２Ｄ－ＰＰＫ２）を更に含む。

【0046】

［発明の詳細な説明］
定義
本明細書で使用される用語「Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ２－エピメラーゼ、ＡＣＥ）」は、以下の通り、Ｎ－アシル－Ｄ－グルコサミンのＮ－アシル－Ｄ－マンノサミンへのエピマー化を触媒する活性ドメインを有する酵素を指す：

【0047】

【化4】

【0048】

したがって、この酵素は、１つの基質、Ｎ－アシル－Ｄ－グルコサミン、および１つの生成物、Ｎ－アシル－Ｄ－マンノサミンを有する。この酵素はイソメラーゼのファミリーに属し、具体的には炭水化物および誘導体に作用するラセマーゼやエピメラーゼのファミリーに属する。

【0049】

Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼは、ＥＣクラス５．１．３．８に属する。Ｎ－アシル－グルコサミン２－エピメラーゼは、次の同義語も有する：Ｎ－アシル－Ｄ－グルコサミン２－エピメラーゼ、アシルグルコサミン２－エピメラーゼ、およびＮ－アセチルグルコサミン２－エピメラーゼ。この酵素は、アミノ糖代謝に関与している。この酵素は、１つの補因子、ＡＴＰを用いる。

【0050】

本明細書で使用される用語「Ｎ－アセチルグルコサミンデアセチラーゼ」は、以下の反応を触媒する活性ドメインを有する酵素を指す：

【0051】

【化5】

【0052】

この酵素反応は可逆的であり、したがって本発明において、Ｎ－アセチルグルコサミンデアセチラーゼは、ＧｌｃＮＡｃの生成に対して平衡を移動することによって、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を生成するために使用される。したがって、本発明において、この酵素は、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンを生成するために、Ｄ－グルコサミンおよびアセテートの２つの基質を使用する。

【0053】

この酵素は加水分解酵素のファミリーに属し、ペプチド結合以外の炭素－窒素結合、特に線形アミドに作用する。Ｎ－アセチルグルコサミンデアセチラーゼは、ＥＣクラスＥＣ３．５．１．３３ に属する。Ｎ－アセチルグルコサミンデアセチラーゼには、次の同義語も有する：Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンアミド加水分解酵素、アセチルアミノデオキシグルコースアセチル加水分解酵素、およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミニルＮ－デアセチラーゼ。

【0054】

本明細書で使用される用語「Ｎ－アセチルノイラミン酸リアーゼ（ＮＡＬ）」は、以下の反応を触媒する活性ドメインを有するポリペプチドを指す：

【0055】

【化6】

【0056】

この酵素反応は可逆的であり、したがって、本発明において、Ｎ－アセチルノイラミナーゼリアーゼを、Ｎｅｕ５Ａｃの生成に対して平衡を移動することによってＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを生成するために使用する。したがって、本発明において、この酵素は、Ｎ－アセチルノイラミネートを生成するために、Ｎ－アセチル－Ｄ－マンノサミンおよびピルベートの２つの基質を使用する。

【0057】

この酵素は、リアーゼ、特に炭素－炭素結合を切断するオキソ－酸－リアーゼのファミリーに属する。Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼは、ＥＣクラスＥＣ４．１．３．３に属する。Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼは、次の同義語も有する：Ｎ－アセチルノイラミネートピルベート－リアーゼ（Ｎ－アセチル－Ｄ－マンノサミン形成）。一般的な使用において他の名前は、Ｎ－アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、アセチルノイラミネートリアーゼ、シアルアルドラーゼ、シアル酸アルドラーゼ、シアレートリアーゼ、Ｎ－アセチルノイラミンアルドラーゼ、ノイラミンアルドラーゼ、Ｎ－アセチルノイラミネートアルドラーゼ、ノイラミン酸アルドラーゼ、Ｎ－アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、ノイラミネートアルドラーゼ、Ｎ－アセチルノイラミンリアーゼ、Ｎ－アセチルノイラミン酸リアーゼ、ＮＰＬ、ＮＡＬａｓｅ、ＮＡＮＡリアーゼ、アセチルノイラミネートピルベートリアーゼ、およびＮ－アセチルノイラミネートピルベートリアーゼ、を含む。この酵素は、アミノ糖代謝に関与する。

【0058】

本明細書において使用される用語「Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）」は、シチジン５’－トリホスフェート（ＣＴＰ）とＮ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸との反応を触媒し、ＣＭＰ－Ｎ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成する活性ドメインを有するポリペプチドを指す。

【0059】

Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼは、次の同義語も有する：ＣＭＰ－シアレートピロホスホリラーゼ、ＣＭＰ－シアレートシンターゼ、シチジン５’－モノホスホシアル酸シンテターゼ、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼ（ＣＮＳ）、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンテターゼ、アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ、ＣＭＰ－Ｎ－アセチルノイラミネートシンテターゼ、ＣＭＰ－Ｎ－アセチルノイラミネートシンターゼ、ＣＭＰ－Ｎ－アセチルノイラミン酸シンターゼ、ＣＭＰ－ＮＡＮＡシンテターゼ、ＣＭＰ－シアレートシンテターゼ、ＣＭＰ－シアルシンテターゼ、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチルノイラミン酸シンテターゼ、シチジン５－モノホスフェートＮ－アセチルノイラミン酸シンテターゼ、シチジンモノホスホシアル酸シンテターゼ、シチジンモノホスホアセチルノイラミンシンテターゼ、シチジンモノホスホシアレートピロホスホリラーゼ、シチジンモノホスホシアレートシンテターゼ、およびアセチルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ。

【0060】

Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼは、ＥＣクラス２．７．７．４３に属する。Ｎ－アシルノイラミン酸シチジルトランスフェラーゼは、次の反応を触媒する：

【0061】

【化7】

【0062】

Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼは、チャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ヘモフィルス デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）、ヘモフィルス インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、ハンガテイクロストリジウム サーモセラム（Ｈｕｎｇａｔｅｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、マンヘイミア ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）、パスツレラ ヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）Ａ２、ペロフィラックス エスクレンタス（Ｐｅｌｏｐｈｙｌａｘ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）、フォトバクテリウム レイオグナシー（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、およびイノシシ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）を含む微生物、マウス、ラット、子牛、およびニジマス（ｒａｉｎｂｏｗ ｔｒｏｕｔ）から得られる。

【0063】

髄膜炎菌ＣＳＳの突然変異体は、次の変異：Ｑ１０４Ａ、Ｒ１６５Ａ、Ｑ１６６Ａ、Ｎ１７５Ａ、Ｙ１７９Ａ、Ｆ１９２Ａ、Ｆ１９３Ａの少なくとも一つを有する。

【0064】

キナーゼは、ホスホトランスフェラーゼのファミリーの一部を形成する酵素である。キナーゼは、高エネルギーのホスフェート供与分子から特定の基質へリン酸基の転移を触媒する酵素である。この工程は、リン酸化として知られており、この工程で基質はリン酸基を獲得し、および高エネルギーのヌクレオチド分子、例えば、アデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）は、リン酸基を供与する。このエステル交換は、リン酸化基質およびＡＤＰを生成する。

【0065】

本明細書で使用される用語「ウリジンキナーゼ」は、以下の通り、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下でウリジンのウリジン５’－モノホスフェートへの反応を触媒する活性ドメインを有するポリペプチドを指す：

【0066】

【化8】

【0067】

したがって、この酵素の二つの基質は、ＡＴＰおよびウリジンであり、一方で、その二つの生成物は、ＡＤＰおよびＵＭＰである。
さらに、ウリジンキナーゼは、以下の通り、アデノシントリホスフェートの存在下で、シチジンのシチジン５’－モノホスフェートへの反応を触媒することができることが明らかになった。

【0068】

【化9】

【0069】

この酵素は、トランスフェラーゼのファミリーに属し、具体的には、受容体としてアルコール基を用いてリン含有基を転移する酵素（ホスホトランスフェラーゼ）である。ウリジンキナーゼは、ＥＣクラス２．７．１．４８に属する。一般的な使用において他の名前は、ピリミジンリボヌクレオシドキナーゼ、ウリジン－シチジンキナーゼ、ウリジンキナーゼ（リン酸化）、およびウリジンホスホキナーゼを含む。この酵素はピリミジン代謝に関与する。

【0070】

本明細書で使用される用語「ウリジンモノホスフェート（ＵＭＰ）キナーゼ」は、アデノシントリホスフェートの存在下でウリジン５’－モノホスフェートのウリジン５’－ジホスフェートへの反応を触媒する活性ドメインを有するポリペプチドを指す。ウリジンモノホスフェートキナーゼは、ＥＣクラス２．７．４．２２に属する。ウリジンモノホスフェートキナーゼは、以下の反応を触媒する：

【0071】

【化10】

【0072】

さらに、ウリジンモノホスフェート（ＵＭＰ）キナーゼは、以下の通り、アデノシントリホスフェートの存在下で、シチジンモノホスフェートのシチジン５’－ジホスフェートへの反応を触媒することができることを明らかにした。

【0073】

【化11】

【0074】

この酵素は、トランスフェラーゼのファミリーに属し、具体的には、受容体としてリン酸基を用いてリン含有基を転移する酵素（ホスホトランスフェラーゼ）である。一般的な使用において他の名前は、ウリジレートキナーゼ、ＵＭＰＫ、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、ＰｙｒＨ、ＵＭＰ－キナーゼ、およびＳｍｂＡを含む。この酵素は、ピリミジン代謝に関与する。

【0075】

本明細書において使用される用語「ポリホスフェート」は、六つ以上のホスフェート（ＰＯ_４）四面体のコーナー共有によって生成されるいくつかのＰ－Ｏ－Ｐ結合を含む任意の塩を指し、長鎖の形成につながる。用語「ポリＰ_ｎ」は同義的に使用され、ここでｎは、リン酸残基の数の平均鎖長を表し、例えば、ポリＰ_２５は、約２５個のリン酸残基を有するポリホスフェートを指し、およびポリＰ_１４は、約１４個のリン酸残基を有するポリホスフェートを指す。

【0076】

本明細書において使用される用語「ポリホスフェートキナーゼ」は、ポリホスフェートキナーゼ活性を有するポリペプチドを指し、すなわち、ポリホスフェートキナーゼは、以下の反応を触媒し：

【0077】

【化12】

【0078】

ここで、Ｎは、例えば、グアノシン、アデノシン、ウリジンなどのヌクレオチドであり、およびＮＭＰはヌクレオシドモノホスフェートであり、ＮＤＰはヌクレオシドジホスフェートであり、およびＮＴＰはヌクレオシドトリホスフェートである。

【0079】

ウリジンの場合、ポリホスフェートキナーゼは以下の反応を触媒する：

【0080】

【化13】

【0081】

ポリホスフェートキナーゼは、ＥＣクラス２．７．４．１に属する。本明細書において記載の本発明の方法で使用されるポリホスフェートキナーゼ酵素の代表例は、ポリホスフェートキナーゼ１（ＰＰＫ１）、ポリホスフェートキナーゼ２（ＰＰＫ２）、２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２Ｄ－ＰＰＫ２）、および１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１Ｄ－ＰＰＫ２）、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含むが、これらに限定されない。

【0082】

本明細書において使用される用語「ピロホスファターゼ」は、ピロホスファターゼ活性を有するポリペプチド、すなわち、以下の反応を触媒するポリペプチドを指し：

【0083】

【化14】

【0084】

ここで、ＰＰｉは、ピロホスフェートを指し、Ｐｉは、ホスフェートを指す。
ピロホスファターゼは、ＥＣクラス３．６．１．１に属する。この文脈において、用語「ジホスファターゼ」は、ジホスフェートからホスフェートへの加水分解を触媒するピロホスファターゼポリペプチドを指す。

【0085】

本明細書において使用される用語「シアリルトランスフェラーゼ」は、オリゴサッカリドおよび複合糖質を含むＮｅｕ５Ａｃの生合成において不可欠な役割を果たすＧＴファミリーの酵素である。一般に、ＳＴによって触媒されるグリコシル化反応において、糖ヌクレオチド供与体は、シチジン５’－モノホスフェートＮｅｕ５Ａｃ（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）であり、受容体は、ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、または他のＮｅｕ５Ａｃ残基によって終結されたオリゴサッカリド、または複合糖質である。ＳＴは、Ｎｅｕ５Ａｃが転移されるグリコシルアクセプターの位置に基づいて分類される。ヒトにおいて、ＳＴ３、ＳＴ６、およびＳＴ８があり、それらは、Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子とアクセプターの３’－、６’－、または８’－ヒドロキシル基それぞれとの間にα－グリコシド結合を形成する。好ましくは、「シアリルトランスフェラーゼ」は、ベータ－ガラクトサミドアルファ－２，６－シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．１）、アルファ－Ｎ－アセチルガラクトサミニドアルファ－２，６－シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．３）、ベータ－ガラクトシドアルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．４）、Ｎ－アセチルラクトサミニドアルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）、アルファ－Ｎ－アセチル－ノイラミニドアルファ－２，８－シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．８）；およびラクトシルセラミドα－２，３－シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．９）から選択される。これらの酵素は、グリコシル供与体としてＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを使用する。

【0086】

本明細書において使用される用語「サッカリド」は、モノサッカリド、ジサッカリド、トリサッカリド、テトラサッカリド、ペンタサッカリド、ヘキササッカリド、ヘプタサッカリド、オクタサッカリド、オリゴサッカリド、グリカンおよびポリサッカリドを指すが、これらに限定されない。

【0087】

サッカリドを、好ましくは、
Ｄ－アラビノース、Ｄ－リキソース、Ｄ－リボース、Ｄ－キシロース、Ｌ－アラビノース、Ｌ－リキソース、Ｌ－リボース、Ｌ－キシロース、Ｄ－リブロース、Ｄ－キシルロース、Ｌ－リブロース、Ｌ－キシルロース、Ｄ－デオキシリボース、Ｌ－デオキシリボース、Ｄ－エリスロース、Ｄ－トレオース、Ｌ－グリセロ－Ｄ－マンノ－ヘプトース、Ｄ－グリセロ－Ｄ－マンノ－ヘプトース、Ｄ－アロース、Ｄ－アルトロース、Ｄ－グルコース、Ｄ－マンノース、Ｄ－グロース、Ｄ－イドース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－タロース、Ｄ－プシコース、Ｄ－フラクトース、Ｄ－ソルボース、Ｄ－タガトース、６－デオキシ－Ｌ－アルトロース、６－デオキシ－Ｄ－タロース、Ｄ－フコース、Ｌ－フコース、Ｄ－ラムノース、Ｌ－ラムノース、Ｄ－キノボース、オリボース、チベロス、アスカリロース、アベクオース、パラトース、ジギトキソース、コリトース、Ｄ－グルコサミン、Ｄ－ガラクトサミン、Ｄ－マンノサミン、Ｄ－アロサミン、ｌ－アルトロサミン、Ｄ－グロサミン、Ｌ－イドサミン、Ｄ－タロサミン、Ｎ－アセチル－ｄ－グルコサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－マンノサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－アロサミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－アルトロサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－グロサミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－イドサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－タロサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－フコサミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－フコサミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－ラムノサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－キノボサミン、Ｄ－グルクロン酸、Ｄ－ガラクツロン酸、Ｄ－マンヌロン酸、Ｄ－アルロン酸、Ｌ－アルトルロン酸、Ｄ－グルロン酸、Ｌ－グルロン酸、Ｌ－イズロン酸、Ｄ－タルロン酸、ノイラミン酸、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｎ－グリコリルノイラミン酸、３－デオキシ－Ｄ－マンノ－オクツロソン酸（ＫＤＯ）、３－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－２－ノヌロソン酸（ＫＤＮ）、アピオース、バシロサミン、テベトース、アコフリオース、シマロース、ムラミン酸、Ｎ－アセチルムラミン酸、Ｎ－グリコリルムラミン酸、３－デオキシ－リキソ－ヘプツロサリン酸、ケトデオキシオクトン酸、およびケトデオキシノノン酸、
から選択される少なくとも一つのモノサッカリド単位を含む。好ましくは、モノサッカリドまたはモノサッカリド単位は、α－、およびβ－Ｄ／Ｌ－炭水化物の以下の群に属する：
α－Ｄ－リボピラノース、α－Ｄ－アラビノピラノース、α－Ｄ－キシロピラノース、α－Ｄ－リキソピラノース、α－Ｄ－アロピラノース、α－Ｄ－アルトロピラノース、α－Ｄ－グルコピラノース、α－Ｄ－マンノピラノース、α－Ｄ－グルコピラノース、α－Ｄ－イドピラノース、α－Ｄ－ガラクトピラノース、α－Ｄ－タロピラノース、α－Ｄ－プシコピラノース、α－Ｄ－フルクトピラノース、α－Ｄ－ソルボピラノース、α－Ｄ－タガトピラノース、α－Ｄ－リボフラノース、α－Ｄ－アラビノフラノース、α－Ｄ－キシロフラノース、α－Ｄ－リキソフラノース、α－Ｄ－アロフラノース、α－Ｄ－アルトロフラノース、α－Ｄ－グルコフラノース、α－Ｄ－マンノフラノース、α－Ｄ－グロフラノース、α－Ｄ－イドフラノース、α－Ｄ－ガラクトフラノース、α－Ｄ－タロフラノース、α－Ｄ－プシコフラノース、α－Ｄ－フラクトフラノース、α－Ｄ－ソルボフラノース、α－Ｄ－タガトフラノース、α－Ｄ－キシルロフラノース、α－Ｄ－リブロフラノース、α－Ｄ－トレオフラノース、α－Ｄ－ラムノピラノース、
α－Ｄ－エリスロフラノース、α－Ｄ－グルコサミン、α－Ｄ－Ｎ－アセチル－グルコサミン、α－Ｄ－グルコピラヌロン酸、α－Ｄ－ガラクトサミン、α－Ｄ－Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、α－Ｄ－マンノサミン、α－Ｄ－Ｎ－アセチル－マンノサミン、α－Ｄ－ノイラミン酸、α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸、α－Ｄ－Ｎ－グリコリルノイラミン酸、α－３－デオキシ－Ｄ－マンノ－オクツロソン酸（ＫＤＯ）、α－３－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－２－ノヌロソン酸（ＫＤＮ）、
β－Ｄ－リボピラノース、β－Ｄ－アラビノピラノース、β－Ｄ－キシロピラノース、β－Ｄ－リキソピラノース、β－Ｄ－アロピラノース、β－Ｄ－アルトロピラノース、β－Ｄ－グルコピラノース、β－Ｄ－マンノピラノース、β－Ｄ－グルコピラノース、β－Ｄ－イドピラノース、β－Ｄ－ガラクトピラノース、β－Ｄ－タロピラノース、β－Ｄ－プシコピラノース、β－Ｄ－フルクトピラノース、β－Ｄ－ソルボピラノース、β－Ｄ－タガトピラノース、β－Ｄ－リボフラノース、β－Ｄ－アラビノフラノース、β－Ｄ－キシロフラノース、β－Ｄ－リキソフラノース、β－Ｄ－ラムノピラノース、β－Ｄ－アロフラノース、β－Ｄ－アルトロフラノース、β－Ｄ－グルコフラノース、β－Ｄ－マンノフラノース、β－Ｄ－グロフラノース、β－Ｄ－イドフラノース、β－Ｄ－ガラクトフラノース、β－Ｄ－タロフラノース、β－Ｄ－プシコフラノース、β－Ｄ－フルクトフラノース、β－Ｄ－ソルボフラノース、β－Ｄ－タガトフラノース、β－Ｄ－キシルロフラノース、β－Ｄ－リブロフラノース、β－Ｄ－トレオフラノース、β－Ｄ－エリスロフラノース、β－Ｄ－グルコサミン、β－Ｄ－Ｎ－アセチル－グルコサミン、β－Ｄ－グルコピラヌロン酸、β－Ｄ－ガラクトサミン、β－Ｄ－Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、β－Ｄ－マンノサミン、β－Ｄ－Ｎ－アセチル－マンノサミン、β－Ｄ－ノイラミン酸、β－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸、β－Ｄ－Ｎ－グリコリルノイラミン酸、β－３－デオキシ－Ｄ－マンノ－オクツロソン酸（ＫＤＯ）、β－３－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－２－ノヌロソン酸（ＫＤＮ）、
α－Ｌ－リボピラノース、α－Ｌ－アラビノピラノース、α－Ｌ－キシロピラノース、α－Ｌ－リキソピラノース、α－Ｌ－アロピラノース、α－Ｌ－アルトロピラノース、α－Ｌ－グルコピラノース、α－Ｌ－マンピラノース、α－Ｌ－グルコピラノース、α－Ｌ－イドピラノース、α－Ｌ－ガラクトピラノース、α－Ｌ－タロピラノース、α－Ｌ－プシコピラノース、α－Ｌ－フルクトピラノース、α－Ｌ－ソルボピラノース、α－Ｌ－タガトピラノース、α－Ｌ－ラムノピラノース、α－Ｌ－リボフラノース、α－Ｌ－アラビノフラノース、α－Ｌ－キシロフラノース、α－Ｌ－リキソフラノース、α－Ｌ－アロフラノース、α－Ｌ－アルトロフラノース、α－Ｌ－グルコフラノース、α－Ｌ－マンノフラノース、α－Ｌ－グロフラノース、α－Ｌ－イドフラノース、α－Ｌ－ガラクトフラノース、α－Ｌ－タロフラノース、α－Ｌ－プシコフラノース、α－Ｌ－フルクトフラノース、α－Ｌ－ソルボフラノース、α－Ｌ－タガトフラノース、α－Ｌ－キシルロフラノース、α－Ｌ－リブロフラノース、α－Ｌ－トレオフラノース、α－Ｌ－エリスロフラノース、α－Ｌ－グルコサミン、α－Ｌ－グルコピラヌロン酸、
β－Ｌ－リボピラノース、β－Ｌ－アラビノピラノース、β－Ｌ－キシロピラノース、β－Ｌ－リキソピラノース、β－Ｌ－アロピラノース、β－Ｌ－アルトロピラノース、β－Ｌ－グルコピラノース、β－Ｌ－マンピラノース、β－Ｌ－グルコピラノース、β－Ｌ－イドピラノース、β－Ｌ－ガラクトピラノース、β－Ｌ－タロピラノース、β－Ｌ－プシコピラノース、β－Ｌ－フルクトピラノース、β－Ｌ－ソルボピラノース、β－Ｌ－タガトピラノース、β－Ｌ－リボフラノース、β－Ｌ－アラビノフラノース、β－Ｌ－キシロフラノース、β－Ｌ－リキソフラノース、β－Ｌ－アロフラノース、β－Ｌ－アルトロフラノース、β－Ｌ－キシロフラノース、β－Ｌ－リキソフラノース、β－Ｌ－アロフラノース、β－Ｌ－アルトロフラノース、β－Ｌ－グルコフラノース、β－Ｌ－マンノフラノース、β－Ｌ－グロフラノース、β－Ｌ－イドフラノース、β－Ｌ－ガラクトフラノース、β－Ｌ－タロフラノース、β－Ｌ－プシコフラノース、β－Ｌ－フラクトフラノース、β－Ｌ－ソルボフラノース、β－Ｌ－タガトフラノース、β－Ｌ－キシルロフラノース、β－Ｌ－リブロフラノース、β－Ｌ－トレオフラノース、β－Ｌ－エリスロフラノース、β－Ｌ－グルコサミン、β－Ｌ－グルコピラヌロン酸、およびβ－Ｌ－ラムノピラノース、を含む、またはからなるα－、およびβ－Ｄ／Ｌ－炭水化物。

【0088】

サッカリドは、アミド、カルボネート、カルバメート、カルボニル、チオカルボニル、カルボキシ、チオカルボキシ、エステル、チオエステル、エーテル、エポキシ、ヒドロキシアルキル、アルキレニル、フェニレン、アルケニル、イミノ、イミド、イソ尿素、チオカルバメート、チオ尿素および／または尿素部分、を有するために更に任意に修飾される。

【0089】

好ましくは、「サッカリド」は、ラクトース、Ｎ－アセチル－ラクトサミン、ラクト－Ｎ－ビオース、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ジフコシルラクトース（ＤｉＦＬ）、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＬＮＴ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰＶ）、を含む母乳オリゴサッカリドである。

【0090】

本明細書で使用される用語「糖ペプチド」は、ペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖に共有結合された炭水化物部分を含むペプチドを指す。炭水化物部分は、側鎖を形成し、およびセリンまたはスレオニン残基のヒドロキシ基へのＯ－グリコシド結合、またはアスパラギン残基のアミド窒素へのＮ－グリコシド結合、のいずれかである。

【0091】

本明細書において使用される用語「糖タンパク質」は、ポリペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖に共有結合された炭水化物部分を含むポリペプチドを指す。炭水化物部分は側鎖を形成し、およびセリンまたはスレオニン残基のヒドロキシ基へのＯ－グリコシド結合、またはアスパラギン残基のアミド窒素へのＮ－グリコシド結合、のいずれかである。

【0092】

本明細書において使用される用語、「糖脂質」、グリコシド結合によって疎水性部分に結合された一つ以上のモノサッカリド部分を含む化合物を指す。糖脂質は、モノグリコシルジアシルグリセロール（ＭＧＤＧ）、ジグリコシルジアシルグリセロール（ＤＧＤＧ）、トリメチル－ベータ－アラニンジアシルグリセロール、およびスルファキノボシルジアシル－グリセロール、からなる。例えば、アシルグリセロール、スフィンゴイド、セラミド（Ｎ－アシルスフィンゴイド）、ステロールなど、様々な可能な骨格分子構造を有する様々な糖脂質クラスが存在する。

【0093】

特に、ガングリオシドは、糖鎖上に一つ以上のＮ－アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）結合されたスフィンゴ糖脂質（セラミドおよびオリゴサッカリド）から構成される分子である。ガングリオシドの種類は、一つのＮ－アセチルノイラミン酸を含むＬＭ１、ＧＭ１、ＧＭ１ｂ、およびＧＭ２；二つのＮ－アセチルノイラミン酸を含むＧＤ１ａ、ＧａｌＮＡｃ－ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ２、およびＧＤ３；三つのＮ－アセチルノイラミン酸を含むＧＴ１ａ、およびＧＴ３；四つのＮ－アセチルノイラミン酸を含むＧＱ１ｂ、を含む。

【0094】

本明細書において使用される用語「タンパク質」は、非グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）タンパク質およびグリコシル化タンパク質を含むポリペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖に共有結合した炭水化物部分を含む、または欠くポリペプチドを指す。

【0095】

本明細書において使用される用語「ペプチド」は、ペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖に共有結合した炭水化物部分を含む、または欠くペプチドを指し、非グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）ペプチドおよびグリコシル化ペプチドを含む。

【0096】

本明細書において使用される用語「バイオコンジュゲート」は、互いに共有結合した少なくとも二つの分子からなる分子構築物を指し、そのうちの少なくとも一つの分子は生体分子、すなわち、一つ以上の典型的な生物学的工程に不可欠である生物に存在する分子である。例示的なバイオコンジュゲートは、担体タンパク質に共有結合した炭水化物抗原、および抗体薬物複合体からなる炭水化物複合体ワクチン、である。

【0097】

本明細書で使用される用語「炭水化物複合体ワクチン」は、免疫原性担体に共有結合した炭水化物抗原を含む複合体を指す。炭水化物抗原は、細菌莢膜サッカリド、ウイルス糖タンパク質のサッカリド、胞子虫または寄生虫のサッカリド抗原、病原菌のサッカリド抗原、または癌細胞に特異的なサッカリド抗原であることができるが、これらに限定されない。免疫原性担体は、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、交差反応物質１９７（ＣＲＭ１９７）、分類不可能なＨ．インフルエンザのタンパク質Ｄ、髄膜炎菌莢膜群Ｂの外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、緑膿菌の外毒素Ａ（ＥＰＡ）、Ｃ．ディフィシレ（ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ（ＣＤＴＡ）、肺炎球菌タンパク質、例えば、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）など、肺炎球菌ヒスチジントライアド（ｔｒｉａｄ）Ｄ（ＰｈｔＤ）、解毒ニューモリシン（ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉ）（ｄＰｌｙ）、およびｓｐｒ９６／２０２１、黄色ブドウ球菌α毒素および志賀毒素１ｂを含む、毒素から選択される担体タンパク質であることができるが、これらに限定されない。

【0098】

本明細書において使用される用語「固体支持体」は、酵素または他の試薬が、直接的に、または固着基を有するリンカーを介して結合または固定化され得る、不溶性の官能基化された材料を指し、酵素が、過剰な試薬、可溶性反応生成物、副生成物、または溶媒から（洗浄、濾過、遠心分離などによって）容易に分離されることを可能にする。固体支持体は、有機ポリマー、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミドなど、並びにそれらの共重合体およびグラフトから構成されることができる。固体支持体はまた、無機物、例えば、ガラス、シリカ、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）、逆相シリカ、または金属、金もしくは白金などであることができる。固体支持体は、磁性粒子から構成することもできる。酵素固定化に適した支持材料の概要については、Ｚｄａｒｔａ ｅｔ ａｌ．を参照する。Ｃａｔａｌｙｓｔｓ ２０１８，８，９２，およびＤａｔｔａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ２０１３ ３：１－９。

【0099】

固体支持体の構成は、ビーズ、モノリス、球体、粒子、粒子床、繊維マット、顆粒、ゲル、膜、中空繊維膜、混合マトリックス膜、または表面の形態であることができる。表面は、平面、実質的に平面、または非平面であることができる。固体支持体は、多孔性または非多孔性であることができ、膨潤または非膨潤特性を有することができる。固体支持体を、ウェル、くぼみ、または他の容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）、容器（ｖｅｓｓｅｌ）、特徴、もしくは位置の形態で構成することができる。

【0100】

したがって、本発明は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法を対象にし、

【0101】

【化15】

Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
を含み、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える。

【0102】

好ましい実施形態において、酵素のセットは、本明細書に開示される固体支持体上に共固定化される。
言い換えると、本発明は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法を対象にし、

【0103】

【化16】

Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた混合物を反応させること、
を含み、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える。

【0104】

本発明の方法において、ＣＭＰ、ＣＤＰ、およびＣＴＰは、インサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンから形成される（以下参照）。好ましくは、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化される。

【0105】

代替表現において、本発明は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法を対象にし、

【0106】

【化17】

Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた混合物を反応させること、
を含み、
ここで、ステップＢ）において、ＣＭＰ、ＣＤＰ、およびＣＴＰは、インサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で形成され、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える。

【0107】

好ましくは、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化される。驚くべきことに、酵素のセットの共固定化は、固定化されていない酵素を用いる工程、および異なる固体支持体上に個別に固定化された酵素を用いる工程と比較して、酵素カスケード反応の効率を強力に向上させる。

【0108】

好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体上に共固定化されることにより、各酵素の活性を増加させる、または各酵素の活性の大部分を保持する。

【0109】

ステップＢ）において、結果的に得られた溶液の反応中に、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセットの存在下で、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、以下のカスケード反応を行う：
（ａ）Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）によって触媒される、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）からのＮ－アセチル－Ｄ－マンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）の形成、
（ｂ）Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）によって触媒される、ＭａｎＮＡｃおよびピルベートからのＮ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）の形成、
（ｃ）ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）によって触媒される、シチジンおよびアデノシン５’－トリホスフェートからのシチジン５’－モノホスフェート（ＣＭＰ）の形成、
（ｄ）ウリジンモノホスフェートキナーゼによって触媒される、シチジン５’－モノホスフェート（ＣＭＰ）およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）からのシチジン５’－ジホスフェート（ＣＤＰ）の形成、
（ｅ）ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）によって触媒される、シチジン５’－ジホスフェート（ＣＤＰ）およびポリホスフェートからのシチジン５’－トリホスフェート（ＣＴＰ）の形成、
（ｅ’）ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）によって触媒される、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）において生成されたアデノシン５’－ジホスフェート（ＡＤＰ）およびポリホスフェートからのアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）の再生、および
（ｆ）Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）によって触媒される、Ｎ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）とシチジン５’－トリホスフェート（ＣＴＰ）との反応によるシチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）の形成。

【0110】

したがって、本発明は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法を指し、

【0111】

【化18】

Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ）
（ａ）Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）によって触媒される、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）からのＮ－アセチル－Ｄ－マンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）の形成、
（ｂ）Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）によって触媒される、ＭａｎＮＡｃおよびピルベートからのＮ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）の形成、
（ｃ）ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）によって触媒される、シチジンおよびアデノシン５’－トリホスフェートからのシチジン５’－モノホスフェート（ＣＭＰ）の形成、
（ｄ）ウリジンモノホスフェートキナーゼによって触媒される、シチジン５’－モノホスフェート（ＣＭＰ）およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）からのシチジン５’－ジホスフェート（ＣＤＰ）の形成、
（ｅ）ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）によって触媒される、シチジン５’－ジホスフェート（ＣＤＰ）およびポリホスフェートからのシチジン５’－トリホスフェート（ＣＴＰ）の形成、
（ｅ’）ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）によって触媒される、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）において生成されたアデノシン５’－ジホスフェート（ＡＤＰ）およびポリホスフェートからのアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）の再生、および
（ｆ）Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）によって触媒される、Ｎ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）とシチジン５’－トリホスフェート（ＣＴＰ）との反応によるシチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）の形成、
によって、
シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化され、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ステップ（ｃ）においてシチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える。

【0112】

Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）による触媒されるＮ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）とシチジン５’－トリホスフェート（ＣＴＰ）との反応において、ピロホスフェート（ＰＰｉ）が副生成物として形成される。しかし、ピロホスフェートは、水溶液中で不安定であり、無機ホスフェート（Ｐｉ）にゆっくりと加水分解するのみである。高濃度のピロホスフェートは、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）の生成に関与するＮ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）の活性を阻害することが知られている。

【0113】

したがって、本発明の一実施形態において、酵素のセットは、無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）を更に含み、本発明は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法を対象にし、

【0114】

【化19】

Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）、および無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
を含み、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える。好ましくは、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化される。

【0115】

ステップＢ）において、結果的に得られた溶液の反応中に、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）、および無機ジホスフェート（ＰＰＡ）、を含む酵素のセットの存在下で、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、以下のカスケード反応を行う：
（ａ）Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）によって触媒される、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）からのＮ－アセチル－Ｄ－マンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）の形成、
（ｂ）Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）によって触媒される、ＭａｎＮＡｃおよびピルベートからのＮ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）の形成、
（ｃ）ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）によって触媒される、シチジンおよびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）からのシチジン５’－モノホスフェート（ＣＭＰ）の形成、
（ｄ）ウリジンモノホスフェートキナーゼによって触媒される、シチジン５’－モノホスフェート（ＣＭＰ）およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）からのシチジン５’－ジホスフェート（ＣＤＰ）の形成、
（ｅ）ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）によって触媒される、シチジン５’－ジホスフェート（ＣＤＰ）およびポリホスフェートからのシチジン５’－トリホスフェート（ＣＴＰ）の形成、
（ｅ’）ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）によって触媒される、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）において生成されたアデノシン５’－ジホスフェート（ＡＤＰ）およびポリホスフェートからのアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）の再生、
（ｆ）Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）によって触媒される、Ｎ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）とシチジン５’－トリホスフェート（ＣＴＰ）との反応によってシチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）の形成、および
（ｇ）無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）によって触媒される、ステップ（ｆ）において生成されたピロホスフェートのホスフェートへの変換。

【0116】

したがって、本発明は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法を対象にし、

【0117】

【化20】

Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）、および無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ）
（ａ）Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）によって触媒される、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）からのＮ－アセチル－Ｄ－マンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）の形成、
（ｂ）Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）によって触媒される、ＭａｎＮＡｃおよびピルベートからのＮ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）の形成、
（ｃ）ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）によって触媒される、シチジンおよびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）からのシチジン５’－モノホスフェート（ＣＭＰ）の形成、
（ｄ）ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＭＰ）によって触媒される、シチジン５’－モノホスフェート（ＣＭＰ）およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）からのシチジン５’－ジホスフェート（ＣＤＰ）の形成、
（ｅ）ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）によって触媒される、シチジン５’－ジホスフェート（ＣＤＰ）およびポリホスフェートからのシチジン５’－トリホスフェート（ＣＴＰ）の形成、
（ｅ’）ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）によって触媒される、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）において生成されたアデノシン５’－ジホスフェート（ＡＤＰ）およびポリホスフェートからのアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）の再生、
（ｆ）Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）によって触媒される、Ｎ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）とシチジン５’－トリホスフェート（ＣＴＰ）との反応によるシチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）の形成、および
（ｇ）無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）によって触媒される、ステップ（ｆ）において生成されたピロホスフェートのホスフェートへの変換、
によって、
シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
を含み、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ステップ（ｃ）において、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える。好ましくは、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化される。

【0118】

ＡＴＰを、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）の活性化剤として使用することができることが知られており（Ｉｇｎａｃｉｏ Ｇ．ＢＲＡＶＯ ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ，２００１，２５８，ｐｐ５６８－５９８．）、逆に、ＡＭＰおよびＡＤＰは、Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）の活性を阻害する。

【0119】

本発明の方法において、アデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）は、ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）によって触媒される、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）において生成されたアデノシン５’－ジホスフェート（ＡＤＰ）およびポリホスフェートから再生される。

【0120】

したがって、更に、酵素のセットは、１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１ＤＰＰＫ２）、および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２ＤＰＰＫ２）をさらに含む。

【0121】

さらに、ＡＭＰからＡＤＰへ、およびＡＤＰからＡＴＰへのリン酸化を活性化するために、１Ｄ－ＰＰＫ２および／または２Ｄ－ＰＰＫ２を添加することにより、カスケードを拡張することができる。さらに、アデノシンホスフェートの頻繁な加水分解を阻害するために、１Ｄ－ＰＰＫ２および２ＤＰＰＫ２を添加することにより、カスケードを拡張することができる。

【0122】

１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１Ｄ－ＰＰＫ２）および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２Ｄ－ＰＰＫ２）も、好ましくは、同じ固体支持体上に上記酵素と共に共固定化される。

【0123】

本明細書に記載される本発明の方法において、ＡＴＰはＡＤＰおよびポリホスフェートから連続的に再生されるため、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５ＮＡｃの生成は、触媒量のＡＴＰを用いて行うことができる。

【0124】

したがって、本発明の一実施形態において、酵素のセットは、無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）をさらに含み、本発明は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法を対象とする。

【0125】

したがって、本発明は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法であって、

【0126】

【化21】

Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）、無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）、１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１Ｄ－ＰＰＫ２）および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２Ｄ－ＰＰＫ２）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
を含み、
ここで
ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える。好ましくは、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化される。

【0127】

言い換えると、本発明は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法を対象にし、

【0128】

【化22】

Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）、無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）、１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１ＤＰＰＫ２）、および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２ＤＰＰＫ２）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ）
（ａ）Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）によって触媒される、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）からのＮ－アセチル－Ｄ－マンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）の形成、
（ｂ）Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）によって触媒される、ＭａｎＮＡｃおよびピルベートからのＮ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）の形成、
（ｃ）ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）によって触媒される、シチジンおよびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）からのシチジン５’－モノホスフェート（ＣＭＰ）の形成、
（ｄ）ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＭＰ）によって触媒される、シチジン５’－モノホスフェート（ＣＭＰ）およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）からのシチジン５’－ジホスフェート（ＣＤＰ）の形成、
（ｅ）ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）によって触媒される、シチジン５’－ジホスフェート（ＣＤＰ）およびポリホスフェートからのシチジン５’－トリホスフェート（ＣＴＰ）の形成、
（ｅ’）ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）によって触媒される、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）において生成されたアデノシン５’－ジホスフェート（ＡＤＰ）およびポリホスフェートからのアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）の再生、
（ｆ）Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）によって触媒される、Ｎ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）とシチジン５’－トリホスフェート（ＣＴＰ）との反応によるシチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）の形成、および
（ｇ）無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）によって触媒される、ステップ（ｆ）において生成されたピロホスフェートのホスフェートへの変換、
（ｈ）１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１ＤＰＰＫ２）および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２ＤＰＰＫ２）によって触媒される、ＡＭＰのＡＤＰへのリン酸化、およびＡＤＰのＡＴＰへのリン酸化
によって、
シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
を含み、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ステップ（ｃ）において、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える。好ましくは、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化される。

【0129】

ポリホスフェートは、本明細書に記載される本発明の方法における唯一のエネルギー担体として機能し、ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を使用するＡＤＰからのＡＴＰの再生においてホスフェート源として使用される。本発明の方法の酵素カスケードに、ＡＤＰからＡＴＰへのリン酸化も触媒する１－ドメインポリホスフェートキナーゼ（１Ｄ－ＰＰＫ）、好ましくは１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１Ｄ－ＰＰＫ２）を添加することによってＡＴＰの再生を高めることができる。さらに、ＡＤＰなどのヌクレオシドホスフェートは、水性媒体中で不安定であり、急速に加水分解する傾向がある。ＡＭＰへの加水分解によるＡＤＰの損失を回避するために、ＡＭＰのＡＤＰへのリン酸化を触媒する２－ドメインポリホスフェートキナーゼ（２Ｄ－ＰＰＫ）、好ましくは２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２Ｄ－ＰＰＫ２）を、１Ｄ－ＰＰＫと共に、または単独で本発明の酵素カスケードに添加することができる。

【0130】

ポリホスフェートは、最初に水性媒体に溶解された金属イオン（例えば、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｆｅ２^＋／３＋、など）と、安定な水溶性錯体を形成することができる。特定のポリホスフェートが特定の金属イオンを隔離する能力は、ポリホスフェートの鎖長を増加することに伴って低下するため、本発明において長鎖ポリホスフェートが好ましい。より好ましくは、少なくとも１４個のホスフェート残基を有するポリホスフェートである。最も好ましくは、少なくとも２５個のホスフェート残基を有するポリホスフェートである。

【0131】

上述のように、本発明の方法におけるカスケードは、Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮ）およびアセテートからＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を別々に、またはインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で生成するために、Ｎ－アセチル－グルコサミンデアセチラーゼを添加することによって拡張することができる。

【0132】

いくつかの実施形態において、ステップＡ）において、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）は、Ｎ－アセチル－グルコサミンデアセチラーゼの存在下で、Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮ）およびアセテートから別々に、またはインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で生成される。

【0133】

ステップＡ）において、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）は、Ｎ－アセチル－グルコサミンデアセチラーゼの存在下で、Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮ）およびアセテートから別々に、またはインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で生成される。

【0134】

したがって、いくつかの場合において、追加のステップＡ１）を、以下の通りにステップＡ）の前に別々に行ってもよい：
Ａ１）Ｎ－アセチル－グルコサミンデアセチラーゼの存在下で、Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮ）およびアセテートからＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンを生成すること。

【0135】

したがって、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを生成するための上述の本発明の方法のいずれかは、ステップＡ）の前に追加のステップＡ１）を含み、ステップＡ）およびステップＢ）が続いて行われる。

【0136】

他の場合において、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）は、Ｎ－アセチル－グルコサミンデアセチラーゼの存在下で、Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮ）およびアセテートからインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で生成される。

【0137】

したがって、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを生成するための上述の本発明の方法のいずれかは、代替ステップＡ’）およびステップＢ’）を含む。とりわけ、ステップＢ’）において、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）は、以下の通り、インサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で形成されるだろう：
（ａ’）Ｎ－アセチル－グルコサミンデアセチラーゼによって触媒されるＤ－グルコサミン（ＧｌｃＮ）およびアセテートからＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の形成。

【0138】

したがって、本発明は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法を対象にし、

【0139】

【化23】

Ａ’）Ｄ－グルコサミン、アセテート、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アセチルグルコサミンデアセチラーゼ、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アセチルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ’）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
を含み、
ここで
ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える。

【0140】

好ましくは、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化され、より好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体上に共固定化されることにより、各酵素の活性を増加させる、または各酵素の活性の大部分を保持する。

【0141】

ステップＢ’）において、結果的に得られた溶液の反応中に、Ｎ－アセチルグルコサミンデアセチラーゼ、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アセチルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセットの存在下で、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、以下のカスケード反応を行う：
（ａ’）Ｎ－アセチル－グルコサミンデアセチラーゼによって触媒される、Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮ）およびアセテートからのＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の形成、
（ａ）Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）によって触媒される、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）からのＮ－アセチル－Ｄ－マンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）の形成、
（ｂ）Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）によって触媒される、ＭａｎＮＡｃおよびピルベートからのＮ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）の形成、
（ｃ）ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）によって触媒される、シチジンおよびアデノシン５’－トリホスフェートからのシチジン５’－モノホスフェート（ＣＭＰ）の形成、
（ｄ）ウリジンモノホスフェートキナーゼによって触媒される、シチジン５’－モノホスフェート（ＣＭＰ）およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）からのシチジン５’－ジホスフェート（ＣＤＰ）の形成、
（ｅ）ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）によって触媒される、シチジン５’－ジホスフェート（ＣＤＰ）およびポリホスフェートからのシチジン５’－トリホスフェート（ＣＴＰ）の形成、
（ｅ’）ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）によって触媒される、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）において生成されたアデノシン５’－ジホスフェート（ＡＤＰ）およびポリホスフェートからのアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）の再生、および
（ｆ）Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）によって触媒される、Ｎ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）とシチジン５’－トリホスフェート（ＣＴＰ）との反応によるシチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）の形成。

【0142】

したがって、本発明は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法を指し、
Ａ’）Ｄ－グルコサミン、アセテート、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アセチル－グルコサミンデアセチラーゼ、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）、を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ’）
（ａ’）Ｎ－アセチル－グルコサミンデアセチラーゼによって触媒される、Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮ）およびアセテートからＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の形成、
（ａ）Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）によって触媒される、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）からのＮ－アセチル－Ｄ－マンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）の形成、
（ｂ）Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）によって触媒される、ＭａｎＮＡｃおよびピルベートからのＮ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）の形成、
（ｃ）ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）によって触媒される、シチジンおよびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）からのシチジン５’－モノホスフェート（ＣＭＰ）の形成、
（ｄ）ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＭＰ）によって触媒される、シチジン５’－モノホスフェート（ＣＭＰ）およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）からのシチジン５’－ジホスフェート（ＣＤＰ）の形成、
（ｅ）ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）によって触媒される、シチジン５’－ジホスフェート（ＣＤＰ）およびポリホスフェートからのシチジン５’－トリホスフェート（ＣＴＰ）の形成、
（ｅ’）ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）によって触媒される、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）において生成されたアデノシン５’－ジホスフェート（ＡＤＰ）およびポリホスフェートからのアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）の再生、および
（ｆ）Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）によって触媒される、Ｎ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）とシチジン５’－トリホスフェート（ＣＴＰ）との反応によってシチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）の形成、
によって、
シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
を含み、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ステップ（ｃ）において、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える。好ましくは、酵素のセットを固体支持体上に共固定化する。

【0143】

好ましくは、酵素のセットは、無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）を更に含み、本発明は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法を対象にし、
Ａ’）Ｄ－グルコサミン、アセテート、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アセチル－グルコサミンデアセチラーゼ、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）、および無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ’）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
を含み、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジン５’－モノホスフェート（ＣＭＰ）に変える。好ましくは、酵素のセットを固体支持体上に共固定化する。

【0144】

言い換えると、
Ａ’）Ｄ－グルコサミン、アセテート、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アセチル－グルコサミンデアセチラーゼ、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）、および無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ’）
（ａ’）Ｎ－アセチル－グルコサミンデアセチラーゼによって触媒される、Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮ）およびアセテートからＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の形成、
（ａ）Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）によって触媒される、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）からのＮ－アセチル－Ｄ－マンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）の形成、
（ｂ）Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）によって触媒される、ＭａｎＮＡｃおよびピルベートからのＮ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）の形成、
（ｃ）ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）によって触媒される、シチジンおよびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）からのシチジン５’－モノホスフェート（ＣＭＰ）の形成、
（ｄ）ウリジンモノホスフェートキナーゼによって触媒される、シチジン５’－モノホスフェート（ＣＭＰ）およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）からのシチジン５’－ジホスフェート（ＣＤＰ）の形成、
（ｅ）ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）によって触媒される、シチジン５’－ジホスフェート（ＣＤＰ）およびポリホスフェートからのシチジン５’－トリホスフェート（ＣＴＰ）の形成、
（ｅ’）ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）によって触媒される、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）において生成されたアデノシン５’－ジホスフェート（ＡＤＰ）およびポリホスフェートからのアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）の再生、および
（ｆ）Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）によって触媒される、Ｎ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）とシチジン５’－トリホスフェート（ＣＴＰ）との反応によるシチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）の形成、
（ｇ）無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）によって触媒される、ステップ（ｆ）において生成されたピロホスフェートのホスフェートへの変換、
によって、
シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、および結果的に得られた溶液を反応させること、
を含む、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法。

【0145】

更に、本発明は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法を対象にし、
Ａ’）Ｄ－グルコサミン、アセテート、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アセチル－グルコサミンデアセチラーゼ、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）、無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）、１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１ＤＰＰＫ２）、および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２ＤＰＰＫ２）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ’）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
を含み、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える。好ましくは、酵素のセットを固体支持体上に共固定化する。

【0146】

言い換えると：
Ａ’）Ｄ－グルコサミン、アセテート、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アセチル－グルコサミンデアセチラーゼ、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）、無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）、１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２、および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２ＤＰＰＫ２）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ’）
（ａ’）Ｎ－アセチル－グルコサミンデアセチラーゼによって触媒される、Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮ）およびアセテートからＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の形成、
（ａ）Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）によって触媒される、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）からのＮ－アセチル－Ｄ－マンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）の形成、
（ｂ）Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）によって触媒される、ＭａｎＮＡｃおよびピルベートからのＮ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）の形成、
（ｃ）ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）によって触媒される、シチジンおよびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）からのシチジン５’－モノホスフェート（ＣＭＰ）の形成、
（ｄ）ウリジンモノホスフェート（ＵＭＰ）キナーゼによって触媒される、シチジン５’－モノホスフェート（ＣＭＰ）およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）からのシチジン５’－ジホスフェート（ＣＤＰ）の形成、
（ｅ）ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）によって触媒される、シチジン５’－ジホスフェート（ＣＤＰ）およびポリホスフェートからのシチジン５’－トリホスフェート（ＣＴＰ）の形成、
（ｅ’）ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）によって触媒される、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）において生成されたアデノシン５’－ジホスフェート（ＡＤＰ）およびポリホスフェートからのアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）の再生、および
（ｆ）Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）によって触媒される、Ｎ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）とシチジン５’－トリホスフェート（ＣＴＰ）との反応によるシチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）の形成、および
（ｇ）無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）によって触媒される、ステップ（ｆ）において生成されたピロホスフェートのホスフェートへの変換、
（ｈ）１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１ＤＰＰＫ２）および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２ＤＰＰＫ２）によって触媒される、ＡＭＰのＡＤＰへのリン酸化、およびＡＤＰのＡＴＰへのリン酸化
によって、
シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、および結果的に得られた溶液を反応させること、
を含む、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ステップ（ｃ）において、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える。好ましくは、酵素のセットを固体支持体上に共固定化する。

【0147】

いくつかの実施形態において、ステップＢ）で結果的に得られた溶液は、５．０～１０．０、好ましくは５．５～９．５、より好ましくは６．０～９．０、更により好ましくは６．５～９．０、最も好ましくは７．０～９．０の範囲のｐＨ値を有する。

【0148】

好ましくは、結果的に得られた溶液は、５．０～１０．０、好ましくは５．５～９．５、より好ましくは６．０～９．０、更により好ましくは６．５～９．０、最も好ましくは７．０～９．０の範囲のｐＨ値を有する緩衝溶液である。

【0149】

緩衝溶液は、少なくとも一つの酸、および少なくとも一つの塩基を含む。好ましくは、少なくとも一つのスルホン酸、クエン酸、［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、２－（ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ）酢酸（ビシン）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（トリシン）、３－［Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）－メチルアミノ］－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）－プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、からなる群から選択される。

【0150】

好ましくは少なくとも一つの塩基は、金属水酸化物、金属炭酸塩、金属重炭酸塩、金属リン酸塩、金属重リン酸塩；より好ましくは、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸一カルシウム、リン酸一カリウム、リン酸一マグネシウム、リン酸二ナトリウム、リン酸カルシウム、およびリン酸カリウム、からなる群から選択される。

【0151】

補因子として適切な濃度のＭｇ^２＋は、ウリジンモノホスフェート（ＵＭＰ）キナーゼの完全な活性化に寄与する。
いくつかの実施形態において、本発明の方法において結果的に得られる溶液は、０．１ｍＭから５００ｍＭ、０．１ｍＭから２００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭから１００ｍＭ、より好ましくは５０ｍＭから１００ｍＭ、最も好ましくは２０ｍＭから５０ｍＭの範囲の濃度でＭｇ^２＋を更に含む。好ましくは、Ｍｇ^２＋の供給源は、臭化マグネシウム、塩化マグネシウム、炭酸マグネシウム、リン酸一マグネシウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、およびそれらの水和物である。

【0152】

任意に、結果的に得られる溶液は、例えば、２－メルカプトエタノールおよびジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの還元剤を更に含む。
反応溶液の反応温度は、酵素カスケード反応の効率に影響を与える。したがって、本発明の方法において、ステップＢ）における最適な反応温度は、２０℃から６５℃、好ましくは２５℃から６０℃、さらに好ましくは２５℃から５５℃、より好ましくは３０℃から５５℃、さらにより好ましくは３５℃から５５℃、および最も好ましくは３４℃から５０℃の範囲である。

【0153】

本発明において、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンの濃度は、１ｍＭから５０００ｍＭ、好ましくは１ｍＭから４０００ｍＭ、より好ましくは２ｍＭから４５００ｍＭ、更により好ましくは５ｍＭから３０００ｍＭ、最も好ましくは１０ｍＭから２０００ｍＭの範囲であり、および／またはピルベートの濃度は、１ｍＭから５０００ｍＭ、好ましくは２ｍＭから４０００ｍＭ、より好ましくは５ｍＭから３０００ｍＭ、更により好ましくは１０ｍＭから３０００ｍＭ、最も好ましくは２０ｍＭから２０００ｍＭの範囲であり、および／またはシチジンの濃度は、０．１ｍＭから２０００ｍＭ、好ましくは１ｍＭから１０００ｍＭ、より好ましくは１ｍＭから５００ｍＭの範囲であり、および／またはアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）の濃度は、０．００１ｍＭから１００ｍＭ、好ましくは０．０１ｍＭから１００ｍＭ、より好ましくは０．１ｍＭから５００ｍＭ、更により好ましくは０．１ｍＭから１００ｍＭ、最も好ましくは０．１ｍＭから４０ｍＭの範囲である：
したがって、本発明は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法に関し、

【0154】

【化24】

Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
を含み、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変え；
ここで、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンの濃度は、１ｍＭから５０００ｍＭの範囲であり、および／またはピルベートの濃度は、１ｍＭから５０００ｍＭの範囲であり、および／またはシチジンの濃度は、０．１ｍＭから２０００ｍＭの範囲であり、および／またはアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）の濃度は、０．００１ｍＭから１００ｍＭの範囲である。好ましくは、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンの濃度は、１ｍＭから２０００ｍＭの範囲であり、および／またはピルベートの濃度は、１ｍＭから２０００ｍＭの範囲であり、および／またはシチジンの濃度は、０．１ｍＭから２０００ｍＭの範囲であり、および／またはアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）の濃度は、０．０１ｍＭから１００ｍＭの範囲である。より好ましくは、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンの濃度は、１ｍＭから２０００ｍＭの範囲であり、ピルベートの濃度は、１ｍＭから２０００ｍＭの範囲であり、シチジンの濃度は、０．１ｍＭから２０００ｍＭの範囲であり、アデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）の濃度は、０．０１ｍＭから１００ｍＭの範囲である。好ましくは、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化される。

【0155】

本発明の方法におけるいくつかの実施形態において、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンの濃度は、１ｍＭから５００ｍＭの範囲であり、および／またはピルベートの濃度は、１ｍＭから５００ｍＭの範囲であり、および／またはシチジンの濃度は、１ｍＭから５００ｍＭの範囲であり、および／またはアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）の濃度は、２ｍＭから４０ｍＭの範囲である。

【0156】

したがって、本発明は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法に関し、

【0157】

【化25】

Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
を含み、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変え、
ここで、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンの濃度は、１ｍＭから５００ｍＭの範囲であり、および／またはピルベートの濃度は、１ｍＭから５００ｍＭの範囲であり、および／またはシチジンの濃度は、１ｍＭから５００ｍＭの範囲であり、および／またはアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）の濃度は、２ｍＭから４０ｍＭの範囲である。好ましくは、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンの濃度は、１ｍＭから５００ｍＭの範囲であり、ピルベートの濃度は、１ｍＭから５００ｍＭの範囲であり、シチジンの濃度は、１ｍＭから５００ｍＭの範囲であり、アデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）の濃度は、２ｍＭから４０ｍＭの範囲である。好ましくは、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化される。

【0158】

好ましくは、本発明の方法において、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とピルベートとの比率は、１：１から１：１００００、１：１から１：５０００、１：１から１：２０００、１：１から１：１０００、または１：１から１：１００の範囲である。ピルベートは、ピルビン酸ナトリウムを指し、または代替としてピルビン酸が適用される。

【0159】

より好ましくは、本発明の方法において、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とピルベートとの比率は、１：１から１：２０、好ましくは１：１から１：１５、より好ましくは１：１から１：１０、更により好ましくは１：１から１：５、最も好ましくは１：１から１：２の範囲である。ピルベートは、ピルビン酸ナトリウムを指し、または代替としてピルビン酸が適用される。

【0160】

好ましくは、本発明の方法において、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とシチジンとの比率は、１：１から１００：１、好ましくは１：１から５０：１、より好ましくは１：１から３０：１、更により好ましくは１：１から２０：１、最も好ましくは１：１から１５：１の範囲である。

【0161】

好ましくは、本発明の方法において、Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮ）とアセテートとの比率は、１：１から１：１００００、１：１から１：５０００、１：１から１：２０００、１：１から１：１０００、または１：１から１：１００の範囲である。アセテートは、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウムを指し、または代替として酢酸が適用される。

【0162】

好ましくは、本発明の方法において、アデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）とシチジンとの比率は、１：１から１：２０００、好ましくは１：２から１：１０００、より好ましくは１：４から１：１０００、最も好ましくは１：１０から１：５００の範囲である。

【0163】

本発明の方法における好ましい実施形態において、
Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とピルベートとの比率は 、１：１から１：５０の範囲であり、
Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とシチジンとの比率は、１：１から１００：１の範囲であり、
アデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）とシチジンとの比率は、１：１から１：１００の範囲であり、
アデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）とポリホスフェートとの比率は、１：１から１：２００の範囲であり、および／または
Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の濃度は、２０ｍＭから３０００ｍＭの範囲であり、
ピルベートの濃度は、２０ｍＭから３０００ｍＭの範囲であり、
シチジンの濃度は、１ｍＭから５０ｍＭの範囲であり、
アデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）の濃度は、０．００１ｍＭから１０ｍＭの範囲であり、
ポリホスフェートの濃度は、１ｍＭから３０ｍＭの範囲である。

【0164】

本明細書に開示される方法における他の好ましい実施形態において、
Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とピルベートとの比率は 、１：１から１：２０の範囲であり、
Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とシチジンとの比率は、１：１から３０：１の範囲であり、
アデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）とシチジンとの比率は、１：１から１：２０の範囲であり、
アデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）とポリホスフェートとの比率は、１：１から１：５０の範囲であり、および／または
Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の濃度は、２０ｍＭから２０００ｍＭの範囲であり、
ピルベートの濃度は、２０ｍＭから２０００ｍＭの範囲であり、
シチジンの濃度は、１ｍＭから２０ｍＭの範囲であり、
アデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）の濃度は、０．００１ｍＭから１０ｍＭの範囲であり、
ポリホスフェートの濃度は、１ｍＭから２０ｍＭの範囲である。

【0165】

本明細書に開示される方法における他の好ましい実施形態において、
Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とピルベートとの比率は、１：１から１：２の範囲であり、
Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とシチジンとの比率は、１：１から１５：１の範囲であり、
アデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）とシチジンとの比率は、１：１から１：１０の範囲であり、
アデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）とポリホスフェートとの比率は、１：１から１：５の範囲であり；および／または
Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の濃度は、２０ｍＭから１０００ｍＭの範囲であり、
ピルベートの濃度は、２０ｍＭから１０００ｍＭの範囲であり、
シチジンの濃度は、１ｍＭから１５ｍＭの範囲であり、
アデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）の濃度は、０．１ｍＭから１０ｍＭの範囲であり、
ポリホスフェートの濃度は、１ｍＭから１０ｍＭの範囲である。

【0166】

本発明における一態様において、本発明は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法に関し、

【0167】

【化26】

Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
を含み、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変え、
ここで、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とピルベートとの比率は、１：１から１：５０の範囲であり、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とシチジンとの比率は、１：１から１００：１の範囲であり、アデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）とシチジンとの比率は、１：１から１：１００の範囲であり、アデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）とポリホスフェートとの比率は、１：１から１：２００の範囲である。好ましくは、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とピルベートとの比率は、１：１から１：２０の範囲であり、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とシチジンとの比率は、１：１から３０：１の範囲であり、アデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）とシチジンとの比率は、１：１から１：２０の範囲であり、アデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）とポリホスフェートとの比率は、１：１から１：５０の範囲である。より好ましくは、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とピルベートとの比率は、１：１から１：２の範囲であり、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とシチジンとの比率は、１：１から１５：１の範囲であり、アデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）とシチジンとの比率は、１：１から１：１０の範囲であり、アデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）とポリホスフェートとの比率は、１：１から１：５の範囲である。好ましくは、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化される。

【0168】

本発明において、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、更に好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％を含む。最も好ましくは、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるのと同じアミノ酸配列を含む。

【0169】

Ｎ－アセチルノイラミン酸リアーゼ（ＮＡＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、更に好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％を含む。最も好ましくは、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されるのと同じアミノ酸配列を含む。

【0170】

Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）は、チャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ヘモフィルス デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）、ヘモフィルス インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、ハンガテイクロストリジウム サーモセラム（Ｈｕｎｇａｔｅｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、マンヘイミア ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）、ペロフィラックス エスクレンタス（Ｐｅｌｏｐｈｙｌａｘ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）、フォトバクテリウム レイオグナシー（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、およびイノシシ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）を含む微生物、マウス、およびニジマス（ｒａｉｎｂｏｗ ｔｒｏｕｔ）から得られる。好ましくは、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼは、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＣＳＳに由来する。任意に、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＣＳＳは、少なくとも一つの以下の変異を有する：Ｑ１０４Ａ、Ｒ１６５Ａ、Ｑ１６６Ａ、Ｎ１７５Ａ、Ｙ１７９Ａ、Ｆ１９２Ａ、およびＦ１９３Ａ。

【0171】

したがって、Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、更に好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％を含む。最も好ましくは、Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されるのと同じアミノ酸配列を含む。

【0172】

ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、更に好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％を含む。最も好ましくは、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるのと同じアミノ酸配列を含む。

【0173】

ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＲＡ６）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、更に好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％を含む。最も好ましくは、ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＲＡ６）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されるのと同じアミノ酸配列を含む。

【0174】

ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、更に好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％を含む。最も好ましくは、ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載されるのと同じアミノ酸配列を含む。

【0175】

無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、更に好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％を含む。最も好ましくは、無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載されるのと同じアミノ酸配列を含む。

【0176】

２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２Ｄ－ＰＰＫ２）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、更に好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％を含む。最も好ましくは、２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２Ｄ－ＰＰＫ２）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載されるのと同じアミノ酸配列を含む。

【0177】

１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１Ｄ－ＰＰＫ２）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、更に好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９８％を含む。最も好ましくは、１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１Ｄ－ＰＰＫ２）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に記載されるのと同じアミノ酸配列を含む。

【0178】

したがって、本発明は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法を対象にし、

【0179】

【化27】

Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
を含み、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変え、
ここで、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＲＡ６）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
好ましくは、
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、
Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、
Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、
ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、
ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＲＡ６）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、
ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、
更に好ましくは、
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、
Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、
Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、
ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、
ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＲＡ６）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、
ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、
より好ましくは、
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、
Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、
Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、
ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、
ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＲＡ６）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、
ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、
更により好ましくは、
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、
Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、
Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、
ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、
ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＲＡ６）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、
ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９８％を含む。

【0180】

一実施形態において、本発明は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法を対象にし、

【0181】

【化28】

Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
を含み、
ここで、ウリジンキナーゼ （ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変え、
ここで、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるアミノ酸配列を含み、
Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されるアミノ酸配列を含み、
Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されるアミノ酸配列を含み、
ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列を含み、
ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＲＡ６）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されるアミノ酸配列を含み、
ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載されるアミノ酸配列を含む。好ましくは、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化される。

【0182】

無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）が更に適用される場合、本発明は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法に関し、

【0183】

【化29】

Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）、および無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
を含み、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変え、
ここで、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるアミノ酸配列を含み、
Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されるアミノ酸配列を含み、
Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されるアミノ酸配列を含み、
ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列を含み、
ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＲＡ６）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されるアミノ酸配列を含み、
ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載されるアミノ酸配列を含み、
無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載されるアミノ酸配列を含む。好ましくは、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化される。

【0184】

本発明の方法における酵素カスケードに、ＡＤＰのＡＴＰへのリン酸化も触媒する１－ドメインポリホスフェートキナーゼ（１Ｄ－ＰＰＫ）、好ましくは、１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１Ｄ－ＰＰＫ２）を添加することによってＡＴＰの再生を高めることができる。さらに、ヌクレオシドホスフェート、例えばＡＤＰなどは、水性媒体中で不安定であり、急速に加水分解する傾向がある。ＡＭＰへの加水分解によるＡＤＰの喪失を避けるために、ＡＭＰのＡＤＰへのリン酸化を触媒する２－ドメインポリホスフェートキナーゼ（２Ｄ－ＰＰＫ）、好ましくは、２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２Ｄ－ＰＰＫ２）を、１Ｄ－ＰＰＫと共に、または単独で本発明の酵素カスケードに添加することができる。

【0185】

無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）、１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１ＤＰＰＫ２）、および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２ＤＰＰＫ２）が更に適用される場合、本発明は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法に関し、

【0186】

【化30】

Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）、無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）、１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１ＤＰＰＫ２）、および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２ＤＰＰＫ２）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
を含み、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変え、
ここで、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるアミノ酸配列を含み、
Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されるアミノ酸配列を含み、
Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されるアミノ酸配列を含み、
ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列を含み、
ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＲＡ６）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されるアミノ酸配列を含み、
ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載されるアミノ酸配列を含み、
無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載されるアミノ酸配列を含み、
２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２ＤＰＰＫ２）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載されるアミノ酸配列を含み、
１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１ＤＰＰＫ２）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に記載されるアミノ酸配列を含む。好ましくは、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化される。

【0187】

好ましくは、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法における反応時間は、０．１時間から４８時間、好ましくは０．２時間から３５時間、より好ましくは０．５時間から３０時間、最も好ましくは１時間から２４時間の範囲である。

【0188】

好ましくは、シチジン５'－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法を実施する間に、結果的に得られた反応溶液を、１０ｒｐｍから５０００ｒｐｍ、好ましくは５０ｒｐｍから２０００ｒｐｍ、より好ましくは１００ｒｐｍから１０００ｒｐｍ、最も好ましくは２００ｒｐｍから５００ｒｐｍの範囲で攪拌する。

【0189】

好ましくは、酵素のセットは、再利用可能な、機械的に安定な固体支持体上に共固定化されることによって、各酵素の活性を増加させる、または各酵素の活性の大部分を保持する。したがって、本発明の方法において、酵素セットを、好ましくは再利用する。

【0190】

任意に、本明細書に記載の方法を行った後、酵素のセットを、還元剤、例えばＤＴＴまたは２－メルカプトエタノールなどを用いて処理して、各酵素の活性を保持する。

【0191】

本発明の更なる態様において、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸の生成方法は、追加のステップＣ）：
Ｃ）ステップＢ）の後に生成されたシチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を、イオン交換クロマトグラフィーまたはナノろ過によって単離すること、
を含む。

【0192】

好ましくは、イオン交換クロマトグラフィーを、ダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）１×８などの陰イオン交換樹脂のホルメート形態を使用することによって行う。カラムを、重炭酸アンモニウムなどの水性重炭酸塩の勾配を用いて溶出した。重炭酸アンモニウムの使用は、非常に酸に不安定なＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの加水分解を防止し、アンモニウム塩として重炭酸アンモニウムを提供した。過剰な重炭酸アンモニウムを、バイオーゲル（Ｂｉｏ－Ｇｅｌ）Ｐ－２などのゲルろ過カラムに通すことによって容易に除去した。

【0193】

したがって、本発明は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法に関し、

【0194】

【化31】

Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
Ｃ）ステップＢ）の後に生成されたシチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を、イオン交換クロマトグラフィーによって単離すること、
を含み、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える。好ましくは、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化される。

【0195】

任意に、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸の生成方法は、追加のステップＣ’）：
Ｃ’）ステップＣ）の後に得られた単離されたシチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を、凍結乾燥によって乾燥すること、
を含む。

【0196】

したがって、本発明は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法に関し、

【0197】

【化32】

Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
Ｃ）ステップＢ）の後に生成されたシチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を、イオン交換クロマトグラフィーによって単離すること；
Ｃ’）ステップＣ）の後に得られた単離されたシチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を、凍結乾燥によって乾燥すること、
を含み、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える。好ましくは、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化される。

【0198】

過剰量の出発材料は、ステップＣ）においても単離され、次の反応サイクルにおいて反応のために直接的に再利用される。好ましくは、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、および／またはシチジンは単離されてもよく、次の反応サイクルにおいて再利用されてもよい。

【0199】

あるいは、Ｎ－アセチル－グルコサミンを、基質Ｄ－グルコサミン、アセテートからインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で形成することができる。この場合において、本発明は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法を対象にし、

【0200】

【化33】

Ａ’）Ｄ－グルコサミン、アセテート、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アセチルグルコサミンデアセチラーゼ、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アセチルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ’）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
Ｃ）ステップＢ’）の後に生成されたシチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を、イオン交換クロマトグラフィーによって単離すること；
を含み、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える。好ましくは、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化される。

【0201】

任意に、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸を生成する方法は、
Ａ’）Ｄ－グルコサミン、アセテート、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アセチルグルコサミンデアセチラーゼ、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アセチルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ’）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
Ｃ）ステップＢ’）の後に生成されたシチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を、イオン交換クロマトグラフィーによって単離すること；
Ｃ’）ステップＣ）の後に得られた単離されたシチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を、凍結乾燥によって乾燥すること、
を含み、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える。好ましくは、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化される。

【0202】

シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）を生成するための本発明の方法は、共固定化された酵素のセットを用いて好ましくは行われる。したがって、本発明はまた、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセットを対象にし、ここで、酵素のセットは、好ましくは固体支持体上に、より好ましくは、エポキシ基を用いて官能基化されたポリマーに、共固定化される。

【0203】

好ましくは、前記酵素のセットは以下を含む：
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＲＡ６）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
ここで、酵素のセットは、固体支持体上に、好ましくは、エポキシ基を用いて官能基化されたポリマーに、共固定化される。

【0204】

より好ましくは、前記酵素のセットは以下を含む：
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるアミノ酸配列を含み、
Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されるアミノ酸配列を含み、
Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されるアミノ酸配列を含み、
ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列を含み、
ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＲＡ６）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されるアミノ酸配列を含み、
ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載されるアミノ酸配列を含み、
ここで、酵素のセットは、固体支持体上に、好ましくは、エポキシ基を用いて官能基化されたポリマーに、共固定化される。

【0205】

任意に、本発明の酵素のセットは、無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）を更に含む。いくつかの実施形態において、酵素のセットは、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）、および無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）を含み、ここで、酵素のセットは、固体支持体上に、好ましくは、エポキシ基を用いて官能基化されたポリマーに、共固定化される。

【0206】

好ましくは、前記酵素のセットは以下を含む：
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＲＡ６）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
ここで、酵素のセットは、固体支持体上に、好ましくは、エポキシ基を用いて官能基化されたポリマーに、共固定化される。

【0207】

好ましくは、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、
Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、
Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、
ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、
ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＲＡ６）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、
ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、
無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、
ここで、酵素のセットは、固体支持体上に、好ましくは、エポキシ基を用いて官能基化されたポリマーに、共固定化される。

【0208】

更に好ましくは、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、
Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、
Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、
ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、
ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＲＡ６）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、
ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、
無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、
ここで、酵素のセットは、固体支持体上に、好ましくは、エポキシ基を用いて官能基化されたポリマーに、共固定化される。

【0209】

より好ましくは、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、
Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、
Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、
ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、
ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＲＡ６）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、
ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、
無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、
ここで、酵素のセットは、固体支持体上に、好ましくは、エポキシ基を用いて官能基化されたポリマーに、共固定化される。

【0210】

更により好ましくは、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、
Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、
Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、
ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、
ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＲＡ６）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、
ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、
無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、
ここで、酵素のセットは、固体支持体上に、好ましくは、エポキシ基を用いて官能基化されたポリマーに、共固定化される。

【0211】

より好ましくは、前記酵素のセットは以下を含む：
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるアミノ酸配列を含み、
Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されるアミノ酸配列を含み、
Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されるアミノ酸配列を含み、
ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列を含み、
ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＲＡ６）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されるアミノ酸配列を含み、
ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載されるアミノ酸配列を含み、
無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載されるアミノ酸配列を含み、
ここで、酵素のセットは、固体支持体上に、好ましくは、エポキシ基を用いて官能基化されたポリマーに、共固定化される。

【0212】

任意に、本発明の酵素のセットは、無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）、１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１Ｄ－ＰＰＫ２）、および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２Ｄ－ＰＰＫ２）を更に含む。いくつかの実施形態において、酵素のセットは、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）、無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）、１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１Ｄ－ＰＰＫ２）、および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２ＤＰＰＫ２）を含み、ここで、酵素のセットは、固体支持体上に、好ましくは、エポキシ基を用いて官能基化されたポリマーに、共固定化される。

【0213】

好ましくは、前記酵素のセットは以下を含む：
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＲＡ６）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２ＤＰＰＫ２）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１Ｄ－ＰＰＫ２）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８０％を含み、
ここで、酵素のセットは、固体支持体上に、好ましくは、エポキシ基を用いて官能基化されたポリマーに、共固定化される。

【0214】

好ましくは、前記酵素のセットは以下を含む：
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、
Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、
Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、
ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、
ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＲＡ６）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、
ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、
無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、
２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２ＤＰＰＫ２）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、
１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１Ｄ－ＰＰＫ２）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に記載されるアミノ酸配列の少なくとも８５％を含み、
ここで、酵素のセットは、固体支持体上に、好ましくは、エポキシ基を用いて官能基化されたポリマーに、共固定化される。

【0215】

更に好ましくは、前記酵素のセットは以下を含む：
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、
Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、
Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、
ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、
ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＲＡ６）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、
ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、
無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、
２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２ＤＰＰＫ２）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、
１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１Ｄ－ＰＰＫ２）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９０％を含み、
ここで、酵素のセットは、固体支持体上に、好ましくは、エポキシ基を用いて官能基化されたポリマーに、共固定化される。

【0216】

より好ましくは、前記酵素のセットは以下を含む：
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、
Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、
Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、
ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、
ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＲＡ６）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、
ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、
無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、
２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２ＤＰＰＫ２）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、
１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１Ｄ－ＰＰＫ２）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９５％を含み、
ここで、酵素のセットは、固体支持体上に、好ましくは、エポキシ基を用いて官能基化されたポリマーに、共固定化される。

【0217】

更により好ましくは、前記酵素のセットは以下を含む：
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、
Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、
Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、
ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、
ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＲＡ６）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、
ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、
無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、
２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２ＤＰＰＫ２）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、
１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１Ｄ－ＰＰＫ２）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に記載されるアミノ酸配列の少なくとも９８％を含み、
ここで、酵素のセットは、固体支持体上に、好ましくは、エポキシ基を用いて官能基化されたポリマーに、共固定化される。

【0218】

最も好ましくは、前記酵素のセットは以下を含む：
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるアミノ酸配列を含み、
Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されるアミノ酸配列を含み、
Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されるアミノ酸配列を含み、
ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列を含み、
ウリジンモノホスフェートキナーゼ（ＵＲＡ６）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載されるアミノ酸配列を含み、
ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載されるアミノ酸配列を含み、
無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載されるアミノ酸配列を含み、
２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２ＤＰＰＫ２）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載されるアミノ酸配列を含み、
１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１Ｄ－ＰＰＫ２）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に記載されるアミノ酸配列を含み、
ここで、酵素のセットは、固体支持体上に、好ましくは、エポキシ基を用いて官能基化されたポリマーに、共固定化される。

【0219】

任意に、上述される酵素の任意のセットは、Ｎ－アセチル－グルコサミンデアセチラーゼを更に含む。
酵素は、酵素の活性、基質特異性、立体選択性および／または他の特性を保持するように固体支持体上に固定化される。適切な固体支持体は、例えば、ビーズ、モノリス、球体、粒子、粒子床、繊維マット、顆粒、ゲル、膜、中空繊維膜、混合マトリックス膜、表面、または他の固相材料などである。

【0220】

驚くべきことに、酵素のセットの共固定化は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）の生産において、非固定化または個別に固定化された酵素と比較して、高い生産性をもたらすことを明らかにしている。したがって、好ましくは、本明細書に記載される本発明の方法において使用される酵素は、固体支持体上に共固定化される。

【0221】

酵素固定化の方法は、当該技術分野においてよく知られている。酵素は、非共有結合、または共有結合、例えば、吸着、共有結合、イオン結合、金属結合、架橋または結晶化など、で結合されることができる。固体支持体（例えば、樹脂、膜、ビーズ、ガラスなど）への酵素の共役および固定化のための様々な方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｙｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００７，４２，８９５；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００７，７６，８４３；Ｋｏｓｚｅｌｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２０１０，６３，３９；Ｔｒｕｐｐｏ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２０１１，１５，１０３３；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第２版，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２００８）；Ｍａｔｅｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，２００２，１８，６２９；および生体共役反応プロトコル：戦略および方法、分子生物学における方法において、Ｃ．Ｍ．Ｎｉｅｍｅｙｅｒ ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００４）、に記載される。

【0222】

本明細書において記載される本発明の方法で使用される酵素、すなわち、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼおよびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）、無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）、１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１ＤＰＰＫ２）、２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２ＤＰＰＫ２）、およびピロホスファターゼは、当業者に周知であり、当業者に周知の任意の方法によって得られることができる。

【0223】

特に、酵素を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌培養物、ウイルスおよびファージ培養物、および真核細胞培養物、を含む微生物培養物から過剰発現、単離、または組換え法によって調製することができる。本明細書に記載の本発明の方法は、実験節に記載の供給源からの酵素に限定されない。したがって、本発明の方法は、一般的なタンパク質発現または単離技術を使用して様々な供給源から得られた上記に挙げた酵素を用いて行うことができる。さらに、酵素の調製を、方法が使用される特定の適用に適合させることは、当業者に周知である。例えば、上記に挙げた酵素を、非動物起源の細菌増殖培地、例えば、大豆由来のトリプトンを含むルリア－ベルターニ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）ブロスなど、を使用することによって大腸菌で発現させることができる。

【0224】

細胞均質化または細胞溶解から得られた酵素含有溶液は、通常、細胞残屑を除去するために遠心分離および濾過され、固体支持体上に酵素を固定化するために直接的に使用されることができる。したがって、更なる精製ステップまたは単離ステップは必要なく、酵素が酵素の活性、基質特異性、立体選択性および／または他の特性を保持するように、粗細胞溶解物または細胞ホモジネートを、固体支持体上に酵素を固定化するために使用することができる。

【0225】

本発明の方法において使用される酵素を固定化するために有用な固体支持体は、ビーズ、モノリス、球体、粒子、粒子床、繊維マット、顆粒、ゲル、膜、中空繊維膜、混合マトリックス膜または表面、を含むが、これらに限定されない。好ましくは、固体支持体はビーズの形態を有する。

【0226】

具体的には、固体支持体は、エポキシド官能基、アミノエポキシド官能基、エチレンジアミン官能基、アミノＣ２官能基、アミノＣ６官能基、アニオン性／アミノＣ６スペーサー官能基、を有するポリマーを含むビーズまたは樹脂から構成される。好ましくは、固体支持体は、０．１Åから１０００００Åの孔径を有する多孔性ビーズから構成される。

【0227】

特に好ましくは、エポキシド官能基を用いて官能化された固体支持体である。更に好ましい固体支持体は、エチレンジアミン官能基、エポキシ官能基を、および更に疎水性基、例えば、ブチル、オクチル、メチル、フェニルなどを用いて官能化された、例えばエポキシド官能基およびブチル官能基、アミノＣ２スペーサー官能基、アミノＣ６スペーサー官能基、または他のアミノスペーサー、例えば、アミノＣ３スペーサー、アミノＣ４スペーサー、アミノＣ５スペーサー、アミノＣ７スペーサーなど、エポキシ官能基、アニオン性／アミノＣ６スペーサー官能基、アニオン性／第三級アミン官能基、アニオン性／第四級アミン官能基、カチオン性／スルホン官能基、カルボン酸エステル官能基、フェニル官能基、オクタデシル官能基、スチレン／メチル官能基を有する固体支持体、マクロ多孔性樹脂、またはビーズを含むが、これらに限定されない。固体支持体は、ポリマー材料、非ポリマー材料、例えば、シリカゲルなどからなってもよい。固体支持体は、ポリメタクリレート、ポリアクリル酸、アクリルポリマー、ポリスチレン、スチレン、スチレン／メタクリレートおよびそれらの混合物を含むが、これらに限定されないポリマー材料からなってもよい。

【0228】

本発明の方法において使用される酵素を固定化するために有用な固体支持体の例は、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、エチレンジアミン官能基を有するポリメタクリレート、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、および更に、疎水性基、例えば、ブチル、オクチル、メチル、フェニルなどを用いて官能基化された、例えば、エポキシド官能基およびブチル官能基を有するポリメタクリレート、アミノＣ２スペーサー官能基を有するポリメタクリレート、アミノＣ６スペーサー官能基を有するポリメタクリレート、エポキシ官能基を有するポリアクリル酸、エポキシ官能基を有するアクリルポリマー、アニオン性／アミノＣ６スペーサー官能基を有するポリアクリル酸、アニオン性／第三級アミン官能基を有するポリアクリル酸、アニオン性／第四級アミン官能基を有するポリスチレン、カチオン性／スルホン官能基を有するポリスチレン基、カルボン酸エステル官能基を有するポリアクリル酸、フェニル官能基を有するポリスチレン、オクタデシル官能基を有するポリメタクリレート、スチレン／メチル官能基を有するポリスチレン、Ｎｉ－ＮＴＡ官能基を有する磁性シリカ粒子、または磁鉄鉱のコアを有する磁性ナノ粒子およびＮｉ－ＮＴＡ官能基を有するデキストランシェルを含むビーズまたは樹脂、マクロ多孔性スチレンもしくはスチレン／メタクリレートのマクロ多孔性樹脂またはビーズ、を含むが、これらに限定されない。原則として、当該技術分野において既知の任意の適切な固体支持体を、本発明の方法において使用することができるが、ＮｉアガロースビーズまたはＮｉ ＮＴＡアガロース樹脂は、上記の理由から好ましくない。本発明の方法において使用される酵素を固定化するために有用な例示的な固体支持体は、セパビーズ／レリザイム（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ／ＲｅｌｉＺｙｍｅ）（レジンディオン社（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ））：ＥＣ－ＥＰ／ＳおよびＥＣ－ＥＰ／Ｍを含むＥＣ－ＥＰ、ＥＰ４０３／Ｍ、ＥＰ４０３／Ｓ ＨＦＡ４０３Ｍ、ＨＦＡ４０３Ｓ、ＨＧ４０３、ＥＰ４００／ＳＳ ＥＣ－ＨＧ、ＥＣ－ＨＦＡ、ＥＣ－ＥＡ／Ｍ、ＥＡ４０３／Ｓ、およびＥＣ－ＨＡ／ＳおよびＥＣ－ＨＡ／Ｍを含むＥＣ－ＨＡ；イムモビーズ（Ｉｍｍｏｂｅａｄｓ）（キラルビジョン社（ＣｈｉｒａｌＶｉｓｉｏｎ））Ｉｍｍ１５０Ｐ、ＩＢ－ＣＯＶ１、ＩＢ－ＣＯＶ２、ＩＢ－ＣＯＶ３、ＩＢ－ＡＮＩ１、ＩＢ－ＡＮＩ２、ＩＢ－ＡＮＩ３、ＩＢ－ＡＮＩ４、ＩＢ－ＣＡＴ１、ＩＢ－ＡＤＳ１、ＩＢ－ＡＤＳ２、ＩＢ－ＡＤＳ３、およびＩＢ－ＡＤＳ４、ＩＢ－ＣＡＴ－１、ＩＢ－ＡＮＩ－１、ＩＢ－ＡＮＩ－２、ＩＢ－ＡＮＩ－３、ＩＢ－ＡＮＩ－４；ユーパージット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）（ローム社（Ｒｏｈｍ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ））、および磁性粒子（マイクロモッド社（ｍｉｃｒｏｍｏｄ ＧｍｂＨ））、ナノ－マグ（Ｎａｎｏ－ｍａｇ）、シキャスター（Ｓｉｃａｓｔａｒ）－６およびシキャスター（Ｓｉｃａｓｔａｒ）－１．５、酵素固定化樹脂ライフテック（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ）（商標）（ピュロライト社（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ））、エポキシメタクリレート、ＥＣＲ８２１５、ＥＣＲ８２１５Ｆ、ＥＣＲ８２１５Ｍ、ＥＣＲ８２０６、ＥＣＲ８２０６Ｆ、ＥＣＲ８２０６Ｍ、ＥＣＲ８２０４、ＥＣＲ８２０４Ｆ、ＥＣＲ８２０４Ｍ、ＥＣＲ８２０９、ＥＣＲ８２０９Ｆ、ＥＣＲ８２０９Ｍ、ＥＣＲ８２８５、ＥＣＲ８２８５Ｆ、ＥＣＲ８２８５Ｍ、アミノＣ２またはＣ６メタクリレート：ＥＣＲ８３０５、ＥＣＲ８３０５Ｆ、ＥＣＲ８３０５Ｍ、ＥＣＲ８３０９、ＥＣＲ８３０９Ｆ、ＥＣＲ８３０９Ｍ、ＥＣＲ８３１５、ＥＣＲ８３１５Ｆ、ＥＣＲ８３１５Ｍ、ＥＣＲ８４０４、ＥＣＲ８４０４Ｆ、ＥＣＲ８４０４Ｍ、ＥＣＴ８４０９、ＥＣＴ８４０９Ｆ、ＥＣＴ８４０９Ｍ、ＥＣＲ８４１５、ＥＣＲ８４１５Ｆ、ＥＣＲ８４１５Ｍ、マクロ多孔性樹脂 ＥＣＲ１０９０、ＥＣＲ１０９１、ＥＣＲ１０９１Ｍ、ＥＣＲ１０６１、ＥＣＲ１０３０、ＥＣＲ１０３０Ｆ、ＥＣＲ８８０６Ｆ、イオン樹脂ＥＣＲ１５０４、ＥＣＲ１５０８、ＥＣＲ１６０４、ＥＣＲ１６４０、および磁性粒子（マイクロモッド社（ｍｉｃｒｏｍｏｄ ＧｍｂＨ））、ナノ－マグ－Ｄ（Ｎａｎｏ－ｍａｇ－Ｄ）およびシキャスター（Ｓｉｃａｓｔａｒ）－Ｍ－ＣＴ、を含むが、これらに限定されない。

【0229】

酵素が固定化された機械的に安定なビーズまたは樹脂をもたらす固体支持体材料は、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの生成のためのビーズまたは樹脂の再使用および／または再利用に関して好ましく、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの生成のための方法における連続工程に関してより好ましい。機械的に安定な固体支持体は、摩耗、機械的応力に対する耐性で特徴付けられ、多数のサイクル、例えば、少なくとも１０サイクル、より好ましくは少なくとも１２サイクル、より好ましくは少なくとも１４サイクル、より好ましくは少なくとも１６サイクル、より好ましくは少なくとも１８サイクル、および最も好ましくは少なくとも２０サイクルなどに適している。固体支持体への共有結合を介する酵素の固定化は、機械的に安定なビーズまたは樹脂を提供することを示すことが可能であり、そのことは、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの生成のために固定化された酵素を有する樹脂またはビーズの再使用および／または再利用に特に適していることを示している。

【0230】

驚くべきことに、例えば、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、エチレンジアミン官能基を有するポリメタクリレート、エポキシド官能基およびブチル官能基を有するポリメタクリレート、エポキシ官能基を有するポリアクリル酸、エポキシ官能基を有するアクリルポリマー、などに限定されない、エポキシド官能基を有するポリマーを含むビーズまたは樹脂を有することで、固定化される酵素の共有結合を可能にし、機械的に頑丈な樹脂またはビーズが得られ得ることを明らかにしている。

【0231】

したがって、固定化された酵素を有するビーズまたは樹脂の形態の再使用可能な、機械的に安定な固体支持体は、粗細胞溶解物または粗細胞ホモジネートからの酵素セットの同時固定化に関して、および共固定化された全ての酵素の活性の大部分を保持する、または共固定化された全ての酵素の活性を増加させることに関して、およびＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの生成のためのビーズまたは樹脂の再使用、および／または再利用に関して、およびＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの生成のための方法における連続工程に関して、好ましい。固体支持体は、とりわけ、摩耗、機械的応力に対する耐性で特徴付けられ、多数のサイクル、例えば、少なくとも１０サイクル、より好ましくは少なくとも１２サイクル、より好ましくは少なくとも１４サイクル、より好ましくは少なくとも１６サイクル、より好ましくは少なくとも１８サイクル、最も好ましくは少なくとも２０サイクルなどに適している。固体支持体への共有結合を介する酵素の固定化は、機械的に頑丈なビーズまたは樹脂を提供することを示すことが可能であり、そのことは、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの生成のために固定化された酵素を有する樹脂またはビーズの再使用および／または再利用に特に適していることを示している。驚くべきことに、エポキシド官能基、アミノエポキシド官能基、エチレンジアミン官能基、またはエポキシド官能基および疎水性基、例えば、ブチル、オクチル、メチル、フェニル、ブチル官能基、を含むビーズまたは樹脂を有することで、固定化される酵素の共有結合を可能にし、頑丈な固体樹脂またはビーズが得られ得ることを明らかになった。

【0232】

エポキシ活性化樹脂またはビーズは、酵素と樹脂またはビーズとの間の多点共有結合を可能にする。好ましくは、樹脂骨格は、０．０１ｎｍから１００００ｎｍまたは０．１Åから１０００００Åの多孔性を有するメタクリレートから構成される。好ましい実施形態において、エポキシ官能基化樹脂またはビーズ、例えばエポキシメタクリレート樹脂またはビーズの多孔性は、３０ｎｍから６０ｎｍであってもよい。好ましい実施形態において、エポキシメタクリレート樹脂またはビーズの多孔性は、４０ｎｍから６０ｎｍであってもよい。好ましい実施形態において、エポキシ官能基化樹脂またはビーズ、例えばエポキシメタクリレート樹脂またはビーズの多孔性は、５０ｎｍから６０ｎｍであってもよい。好ましい実施形態において、エポキシ官能基化樹脂またはビーズ、例えばエポキシメタクリレート樹脂またはビーズの多孔性は、６０ｎｍから１２０ｎｍであってもよい。好ましい実施形態において、エポキシ官能基化樹脂またはビーズ、例えばエポキシメタクリレート樹脂またはビーズの多孔性は、１２０ｎｍから１８０ｎｍであってもよい。エポキシ官能基化樹脂またはビーズ、例えばエポキシメタクリレート樹脂またはビーズは、異なるタンパク質基、例えば、アミノ、チオール、フェノールなどと、好ましくは非常に穏やかなｐＨおよび温度条件下で、非常に安定な共有結合を形成してもよい。樹脂は、好ましくは機械的に安定であり、固定化された酵素を有する樹脂は、攪拌タンクまたはカラム反応器で好ましくは使用され得る。

【0233】

アミノ樹脂、例えば、アミノＣ２官能基化樹脂、またはアミノＣ６官能基化樹脂、またはアミノＣ３、アミノＣ４、アミノＣ５、アミノＣ７などの他のアミノ樹脂は、例えばアミノＣ２メタクリレート樹脂またはアミノＣ６メタクリレート樹脂などであるが、これらに限定されず、例えばグルタルアルデヒドによって事前に活性化されてもよく、その後、酵素の共有結合固定化に使用されてもよい。アルデヒド基と酵素のアミノ基との反応は、多点共有結合をもたらすシッフ塩基を形成する。結合は、ホウ化水素を用いる還元によって達成されてもよい。したがって、可逆的固定化は、架橋ステップによって不可逆的になり得、酵素は、担体上に吸着され、その後、例えばグルタルアルデヒドなどを使用することによって架橋され得る。架橋酵素または架橋酵素は、網のように担体を覆ってもよい。アミノ官能基化樹脂、例えば、アミノＣ２メタクリレート樹脂またはアミノＣ６メタクリレート樹脂などは、好ましくは、３０ｎｍから１８０ｎｍ、または３００Åから１８００Åの範囲の多孔性を有する。好ましい実施形態において、アミノ官能基化樹脂、例えば、アミノＣ２メタクリレート樹脂もしくはビーズ、またはアミノＣ６メタクリレート樹脂もしくはビーズなどの多孔性は、３０ｎｍから６０ｎｍであり得る。好ましい実施形態において、アミノ官能基化樹脂、例えば、アミノＣ２メタクリレート樹脂もしくはビーズ、またはアミノＣ６メタクリレート樹脂もしくはビーズなどの多孔性は、６０ｎｍから１２０ｎｍであり得る。好ましい実施形態において、アミノ官能基化樹脂、例えば、アミノＣ２メタクリレート樹脂もしくはビーズ、またはアミノＣ６メタクリレート樹脂もしくはビーズなどの多孔性は、１２０ｎｍから１８０ｎｍであり得る。

【0234】

不可逆的な固定化の他の方法は、例えば１，２－ジオール官能基化樹脂またはビーズなどのヒドロキシル官能基の活性化である。
したがって、特に好ましくは、エポキシド官能基を有するポリメタクリレートおよびアミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレートを含むビーズまたは樹脂である。好ましくは、エポキシド官能基を有するポリメタクリレートを含むビーズまたは樹脂は親水性である。共有結合性酵素固定化が特に好ましい。好ましい実施形態において、ビーズまたは樹脂は、ブチル基またはオクタデシル基などの非極性基を用いて官能基化されない。好ましい実施形態において、樹脂またはビーズは親水性である。

【0235】

好ましくは、メタクリレートポリマーは、ビーズの形態を有する。好ましくは、ビーズは１５０μｍ～３００μｍの範囲の粒径を有する。好ましくは、メタクリレートポリマーは、６００Å～１２００Åの孔径を有する多孔性である。一実施形態において、メタクリレートポリマーは、３００Å～６００Åの間の孔径を有する低多孔性のものである。一実施形態において、メタクリレートポリマーは、４５０Å～６５０Åの間の孔径を有する低多孔性である。一実施形態において、メタクリレートポリマーは、１２００Å～１８００Åの間の孔径を有する高多孔性である。一実施形態において、メタクリレートポリマーは、ブチル基を用いて更に官能基化される。一実施形態において、メタクリレートポリマーは、疎水性基、例えば、ブチル、メチル、フェニル、オクチルなどを用いて更に官能基化される。

【0236】

好ましくは、固体支持体は、セパビーズ（レジンディオン社（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ））：ＥＣ－ＥＰ、ＥＰ４０３／Ｍ、ＥＰ４０３／Ｓ、ＨＦＡ４０３、ＥＡ４０３、ＨＡ４０３、ＥＣ－ＥＡ／ＭおよびＥＣ－ＨＡ；イムモビーズ（ｉｍｍｏｂｅａｄｓ）（キラルビジョン社（ＣｈｉｒａｌＶｉｓｉｏｎ））ＩＢ－ＣＯＶ１、ＩＢ－ＣＯＶ２、ＩＢ－ＣＯＶ３、ＩＢ－ＡＮＩ１、ＩＢ－ＡＮＩ１、ＩＢ－ＣＡＴ１；ユーパージット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）（登録商標）（ローム社（Ｒｏｈｍ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ））、酵素固定化樹脂（ピュロライト社（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ））：エポキシメタクリレート：ＥＣＲ８２１５、ＥＣＲ８２１５Ｆ、ＥＣＲ８２１５Ｍ、ＥＣＲ８２０６、ＥＣＲ８２０６Ｆ、ＥＣＲ８２０６Ｍ、ＥＣＲ８２０４、ＥＣＲ８２０４Ｆ、ＥＣＲ８２０４Ｍ、ＥＣＲ８２０９、ＥＣＲ８２０９Ｆ、ＥＣＲ８２０９Ｍ、ＥＣＲ８２８５、ＥＣＲ８２８５Ｆ、ＥＣＲ８２８５Ｍ、アミノＣ２またはＣ６メタクリレート：ＥＣＲ８３０５、ＥＣＲ８３０５Ｆ、ＥＣＲ８３０５Ｍ、ＥＣＲ８３０９、ＥＣＲ８３０９Ｆ、ＥＣＲ８３０９Ｍ、ＥＣＲ８３１５、ＥＣＲ８３１５Ｆ、ＥＣＲ８３１５Ｍ、ＥＣＲ８４０４ ＥＣＲ８４０４Ｆ、ＥＣＲ８４０４Ｍ、ＥＣＴ８４０９、ＥＣＴ８４０９Ｆ、ＥＣＴ８４０９Ｍ、ＥＣＲ８４１５、ＥＣＲ８４１５Ｆ、ＥＣＲ８４１５Ｍ、から選択される樹脂またはビーズから構成される。

【0237】

好ましくは、固体支持体は、セパビーズ（レジンディオン社（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ））：ＥＣ－ＥＰ、ＥＰ４０３、ＥＰ４０３／Ｍ、ＥＰ４０３／Ｓ、ＥＣ－ＨＦＡ、ＨＦＡ４０３、ＨＦＡ４０３／Ｍ、ＨＦＡ４０３／Ｓ、イムモビーズ（ｉｍｍｏｂｅａｄｓ）（キラルビジョン社（ＣｈｉｒａｌＶｉｓｉｏｎ））ＩＢ－ＣＯＶ２、ＩＢ－ＣＯＶ３、（ピュロライト社（ｐｕｒｏｌｉｔｅ））ＥＣＲ８２１５、ＥＣＲ８２１５Ｆ、ＥＣＲ８２１５Ｍ、ＥＣＲ８２０４Ｆ、ＥＣＲ８２０４Ｍ、ＥＣＲ８２０４、ＥＣＲ８２０９Ｆ、ＥＣＲ８２０９Ｍ、ＥＣＲ８２０９；ユーパージット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）（登録商標）（ローム社（Ｒｏｈｍ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ））、から選択される樹脂またはビーズから構成される。

【0238】

したがって、本発明は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法を対象にし、

【0239】

【化34】

Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化され、固体支持体は、セパビーズ（レジンディオン社（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ））：ＥＣ－ＥＰ、ＥＰ４０３、ＥＰ４０３／Ｍ、ＥＰ４０３／Ｓ、ＥＣ－ＨＦＡ、ＨＦＡ４０３、ＨＦＡ４０３／Ｍ、ＨＦＡ４０３／Ｓ、イムモビーズ（ｉｍｍｏｂｅａｄｓ）（キラルビジョン社（ＣｈｉｒａｌＶｉｓｉｏｎ））ＩＢ－ＣＯＶ２、ＩＢ－ＣＯＶ３、（ピュロライト社（ｐｕｒｏｌｉｔｅ））ＥＣＲ８２１５、ＥＣＲ８２１５Ｆ、ＥＣＲ８２１５Ｍ、ＥＣＲ８２０４Ｆ、ＥＣＲ８２０４Ｍ、ＥＣＲ８２０４、ＥＣＲ８２０９Ｆ、ＥＣＲ８２０９Ｍ、ＥＣＲ８２０９；ユーパージット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）（登録商標）、から選択される樹脂またはビーズから構成され、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える。

【0240】

したがって、本発明は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法を更に対象にし、

【0241】

【化35】

Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）、および無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化され、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化され、固体支持体は、セパビーズ（レジンディオン社（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ））：ＥＣ－ＥＰ、ＥＰ４０３、ＥＰ４０３／Ｍ、ＥＰ４０３／Ｓ、ＥＣ－ＨＦＡ、ＨＦＡ４０３、ＨＦＡ４０３／Ｍ、ＨＦＡ４０３／Ｓ、イムモビーズ（ｉｍｍｏｂｅａｄｓ）（キラルビジョン社（ＣｈｉｒａｌＶｉｓｉｏｎ））ＩＢ－ＣＯＶ２、ＩＢ－ＣＯＶ３、（ピュロライト社（ｐｕｒｏｌｉｔｅ））ＥＣＲ８２１５、ＥＣＲ８２１５Ｆ、ＥＣＲ８２１５Ｍ、ＥＣＲ８２０４Ｆ、ＥＣＲ８２０４Ｍ、ＥＣＲ８２０４、ＥＣＲ８２０９Ｆ、ＥＣＲ８２０９Ｍ、ＥＣＲ８２０９；ユーパージット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）（ローム社（Ｒｏｈｍ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ））、から選択される樹脂またはビーズから構成され、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える。

【0242】

したがって、本発明は、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）の生成方法を更に対象にし、

【0243】

【化36】

Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、ポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）、無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）、１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１ＤＰＰＫ２）、および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２ＤＰＰＫ２）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
を含み、
ここで、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化され、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化され、固体支持体は、セパビーズ（レジンディオン社（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ））：ＥＣ－ＥＰ、ＥＰ４０３、ＥＰ４０３／Ｍ、ＥＰ４０３／Ｓ、ＥＣ－ＨＦＡ、ＨＦＡ４０３、ＨＦＡ４０３／Ｍ、ＨＦＡ ４０３／Ｓ、イムモビーズ（ｉｍｍｏｂｅａｄｓ）（キラルビジョン社（ＣｈｉｒａｌＶｉｓｉｏｎ））ＩＢ－ＣＯＶ２、ＩＢ－ＣＯＶ３、（ピュロライト社（ｐｕｒｏｌｉｔｅ））ＥＣＲ８２１５、ＥＣＲ８２１５Ｆ、ＥＣＲ８２１５Ｍ、ＥＣＲ８２０４Ｆ、ＥＣＲ８２０４Ｍ、ＥＣＲ８２０４、ＥＣＲ８２０９Ｆ、ＥＣＲ８２０９Ｍ、ＥＣＲ８２０９；ユーパージット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）（ローム社（Ｒｏｈｍ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ））、から選択される樹脂またはビーズから構成され、およびウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える。

【0244】

好ましくは、酵素は、反応器で複数回の実行（ｒｕｎ）またはサイクルで使用され得るエポキシ基を用いて官能基化されたポリマー上に共固定化される。好ましくは、固体支持体上に共固定化された酵素は、少なくとも３サイクル、より好ましくは少なくとも４サイクル、より好ましくは少なくとも５サイクル、より好ましくは少なくとも６サイクル、より好ましくは少なくとも７サイクル、より好ましくは少なくとも８サイクル、より好ましくは少なくとも９サイクル、より好ましくは少なくとも１０サイクル、より好ましくは少なくとも１２サイクル、より好ましくは少なくとも１４サイクル、より好ましくは少なくとも１６サイクル、より好ましくは少なくとも１８サイクル、より好ましくは少なくとも２０サイクル、より好ましくは少なくとも２５サイクル、より好ましくは少なくとも２５サイクル、より好ましくは少なくとも３０サイクル、最も好ましくは少なくとも５０サイクルで使用され得る。好ましくは、酵素は、固体支持体に共固定化され、少なくとも３～１０回、好ましくは５～１２回、より好ましくは７～１４回、より好ましくは９～１６回、更により好ましくは少なくとも１０～２０回の実行（ｒｕｎ）またはサイクルで使用されてもよい。

【0245】

好ましい実施形態において、共固定化された酵素のセットを有するエポキシビーズまたは樹脂は、一般に、３サイクル以上、好ましくは５サイクル以上、好ましくは１０サイクル以上、更に好ましくは２０サイクル以上、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ合成を可能にする。このような多数のサイクルにおけるＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの合成は、工程の有意な改善であり、先行技術においてこれまで報告されていない。

【0246】

本発明の更なる態様は、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセットを対象にし、
ここで、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化され、固体支持体は、セパビーズ（レジンディオン社（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ））：ＥＣ－ＥＰ、ＥＰ４０３、ＥＰ４０３／Ｍ、ＥＰ４０３／Ｓ、ＥＣ－ＨＦＡ、ＨＦＡ４０３、ＨＦＡ４０３／Ｍ、ＨＦＡ４０３／Ｓ、イムモビーズ（ｉｍｍｏｂｅａｄｓ）（キラルビジョン社（ＣｈｉｒａｌＶｉｓｉｏｎ））ＩＢ－ＣＯＶ２、ＩＢ－ＣＯＶ３、（ピュロライト社（ｐｕｒｏｌｉｔｅ））ＥＣＲ８２１５、ＥＣＲ８２１５Ｆ、ＥＣＲ８２１５Ｍ、ＥＣＲ８２０４Ｆ、ＥＣＲ８２０４Ｍ、ＥＣＲ８２０４、ＥＣＲ８２０９Ｆ、ＥＣＲ８２０９Ｍ、ＥＣＲ８２０９；ユーパージット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）（ローム社（Ｒｏｈｍ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ））、から選択される樹脂またはビーズから構成され、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える。

【0247】

本発明の更なる態様は、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）、無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）を含む酵素のセットも対象にし、ここで、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化され、固体支持体は、セパビーズ（レジンディオン社（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ））：ＥＣ－ＥＰ、ＥＰ４０３、ＥＰ４０３／Ｍ、ＥＰ４０３／Ｓ、ＥＣ－ＨＦＡ、ＨＦＡ４０３、ＨＦＡ４０３／Ｍ、ＨＦＡ４０３／Ｓ、イムモビーズ（ｉｍｍｏｂｅａｄｓ）（キラルビジョン社（ＣｈｉｒａｌＶｉｓｉｏｎ））ＩＢ－ＣＯＶ２、ＩＢ－ＣＯＶ３、（ピュロライト社（ｐｕｒｏｌｉｔｅ））ＥＣＲ８２１５、ＥＣＲ８２１５Ｆ、ＥＣＲ８２１５Ｍ、ＥＣＲ８２０４Ｆ、ＥＣＲ８２０４Ｍ、ＥＣＲ８２０４、ＥＣＲ８２０９Ｆ、ＥＣＲ８２０９Ｍ、ＥＣＲ８２０９；ユーパージット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）（ローム社（Ｒｏｈｍ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ））、から選択される樹脂またはビーズから構成され、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える。

【0248】

本発明の更なる態様は、Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）、無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）、１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１ＤＰＰＫ２）、および／または２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２ＤＰＰＫ２）を含む酵素のセットも対象にし、ここで、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化され、固体支持体は、セパビーズ（レジンディオン社（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ））：ＥＣ－ＥＰ、ＥＰ４０３、ＥＰ４０３／Ｍ、ＥＰ４０３／Ｓ、ＥＣ－ＨＦＡ、ＨＦＡ４０３、ＨＦＡ４０３／Ｍ、ＨＦＡ４０３／Ｓ、イムモビーズ（ｉｍｍｏｂｅａｄｓ）（キラルビジョン社（ＣｈｉｒａｌＶｉｓｉｏｎ））ＩＢ－ＣＯＶ２、ＩＢ－ＣＯＶ３、（ピュロライト社（ｐｕｒｏｌｉｔｅ））ＥＣＲ８２１５、ＥＣＲ８２１５Ｆ、ＥＣＲ８２１５Ｍ、ＥＣＲ８２０４Ｆ、ＥＣＲ８２０４Ｍ、ＥＣＲ８２０４、ＥＣＲ８２０９Ｆ、ＥＣＲ８２０９Ｍ、ＥＣＲ８２０９；ユーパージット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）（ローム社（Ｒｏｈｍ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ））、から選択される樹脂またはビーズから構成され、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える。

【0249】

本発明は更に、Ｎｅｕ５アシル化、すなわち、シアリル化された生体分子の生成方法を指し、
ｉ）ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを得るために、上記の方法を行うこと、
ｉｉ）ステップｉ）の後に得られたＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを生体分子と反応させること、
を含み、
ここで、生体分子は、サッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリカン、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体薬物複合体、炭水化物複合体ワクチン、またはフラボノイドであり、シアリルトランスフェラーゼの存在下で、ＣＭＰ基の除去を伴って生体分子のヒドロキシル基と共にＯ－グリコシド結合を形成する。

【0250】

シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９）は、多くの既知の活性を有する酵素を含むグリコシルトランスフェラーゼファミリー２９（ＣＡＺＹ ＧＴ＿２９）に属する。約２０個の異なるシアリルトランスフェラーゼあり、それらが作用する受容体構造、およびそれらが形成する糖結合の型に基づいて区別することができる。例えば、シアリルトランスフェラーゼのグループは、アルファ－２，３結合によりシアル酸をガラクトースに付加し、一方、他のシアリルトランスフェラーゼは、アルファ－２，６結合によりシアル酸をガラクトース（Ｇａｌ）またはＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）に付加する。特異な型のシアリルトランスフェラーゼは、α－２，８結合によりシアル酸を他のシアル酸単位に付加し、ポリシアル酸と呼ばれる構造を形成する。他のグリコシルトランスフェラーゼに関して起こるように、シアリルトランスフェラーゼの発現は、細胞分化および悪性形質転換中に、深刻な修飾を受け、いくつかの場合において、そのような変化は表現型の変化を誘発する。

【0251】

好ましくは、シアリルトランスフェラーゼは、ベータ－ガラクトサミドアルファ－２，６－シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．１）、アルファ－Ｎ－アセチルガラクトサミニドアルファ－２，６－シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．３）、ベータ－ガラクトシドアルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．４）、Ｎ－アセチルラクトサミニドアルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）、アルファ－Ｎ－アセチル－ノイラミニドアルファ－２，８－シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．８）、およびラクトシルセラミドアルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．９）、から選択される。これらの酵素は、グリコシル供与体としてＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを使用する。

【0252】

したがって、本発明は更に、Ｎｅｕ５アシル化、すなわち、シアリル化された生体分子の生成方法を指し、
ｉ）ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを得るために、上記の方法を行うこと、
ｉｉ）ステップｉ）の後に得られたＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを生体分子と反応させること、
を含み、
ここで、生体分子は、サッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリカン、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体薬物複合体、炭水化物複合体ワクチン、ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスワクチン、またはフラボノイドであり、シアリルトランスフェラーゼの存在下で、ＣＭＰ基の除去を伴って生体分子のヒドロキシル基と共にＯ－グリコシド結合を形成し、シアリルトランスフェラーゼは、ベータ－ガラクトサミドアルファ－２，６－シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．１）、アルファ－Ｎ－アセチルガラクトサミニドアルファ－２，６－シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．３）、ベータ－ガラクトシドアルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．４）、Ｎ－アセチルラクトサミニドアルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）、アルファ－Ｎ－アセチル－ノイラミニドアルファ－２，８－シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．８）、およびラクトシルセラミドアルファ－２，３－シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．９）、からなる群から選択される。

【0253】

さらに、いくつかの実施形態において、生体分子は、末端基としてガラクトシド（Ｇａｌ）、ガラクトサミニド（ＧａｌＮ）、Ｎ－アセチルガラクトサミニド（ＧａｌＮＡｃ）、ノイラミニド（Ｎｅｕ）、Ｎ－アセチルノイラミニド（Ｎｅｕ５Ａｃ）、Ｎ－グリコリルノイラミニド、３－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－２－ノヌロソン酸（ＫＤＮ）、およびＮ－アセチルラコサミニド（Ｇａｌ－β－１－３－ＧｌｃＮＡｃ）部分のいずれかを含む。

【0254】

より好ましくは、生体分子は、Ｔ－抗原（Ｇａｌ－β－１－３－ＧａｌＮＡｃ－α－１－Ｏ－）またはＴｎ－抗原（ＧａｌＮＡｃ－α－１－Ｏ－）を含む糖ペプチド、糖タンパク質、または抗腫瘍ワクチン、またはＧａｌ－β－１－４－ＧｌｃＮＡｃ－β－１－Ｏ－を含む糖脂質、である。

【0255】

したがって、本発明は更に、Ｎｅｕ５アシル化、すなわち、シアリル化された生体分子の生成方法を指し、
ｉ）ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを得るために、上記の方法を行うこと、
ｉｉ）ステップｉ）の後に得られたＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを生体分子と反応させること、
を含み、
ここで、生体分子は、サッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリカン、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体薬物複合体、炭水化物複合体ワクチン、ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスワクチン、またはフラボノイドであり、シアリルトランスフェラーゼの存在下で、ＣＭＰ基の除去を伴って生体分子のヒドロキシル基と共にＯ－グリコシド結合を形成し、生体分子は、末端基としてガラクトシド（Ｇａｌ）、ガラクトサミニド（ＧａｌＮ）、Ｎ－アセチルガラクトサミニド（ＧａｌＮＡｃ）、ノイラミニド（Ｎｅｕ）、Ｎ－アセチルノイラミニド（Ｎｅｕ５Ａｃ）、Ｎ－グリコリルノイラミニド、３－デオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－２－ノヌロソン酸（ＫＤＮ）、およびＮ－アセチルラコサミニド（Ｇａｌ－β－１－３－ＧｌｃＮＡｃ）部分のいずれかを含む。

【0256】

ステップｉ）ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを得るために、上記の方法を行うことは、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ，１）を生成する上記の方法の全てを指す

【0257】

【化37】

。

【0258】

したがって、本発明は更に、Ｎｅｕ５アシル化、すなわち、シアリル化された生体分子の生成方法を指し、
ｉ）以下を含む、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを得るために、上記の方法を行うこと：
Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える、および
ｉｉ）ステップｉ）の後に得られたＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを生体分子と反応させること、
を含み、
ここで、生体分子は、サッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリカン、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体薬物複合体、炭水化物複合体ワクチン、ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスワクチン、またはフラボノイドであり、シアリルトランスフェラーゼの存在下で、ＣＭＰ基の除去を伴って生体分子のヒドロキシル基と共にＯ－グリコシド結合を形成する。

【0259】

好ましくは、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化される。
したがって、本発明は更に、Ｎｅｕ５アシル化、すなわち、シアリル化された生体分子の生成方法に関し、
ｉｉ）以下を含む、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを得るために、上記の方法を行うこと：
Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える、および
ｉｉｉ）ステップｉ）の後に得られたＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを生体分子と反応させること、
を含み、
ここで、生体分子は、サッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリカン、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体薬物複合体、炭水化物複合体ワクチン、ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスワクチン、またはフラボノイドであり、シアリルトランスフェラーゼの存在下で、ＣＭＰ基の除去を伴って生体分子のヒドロキシル基と共にＯ－グリコシド結合を形成する。

【0260】

好ましくは、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化される。
好ましくは、本発明は更に、Ｎｅｕ５アシル化、すなわち、シアリル化された生体分子の生成方法に関し、
ｉ）以下を含む、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを得るために上記の方法を行うこと：
Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える、
Ｃ）ステップＢ）の後に生成されたシチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を、イオン交換クロマトグラフィーによって単離すること、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える、および
ｉｉ）ステップｉ）の後に得られたＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを生体分子と反応させること、
を含み、
ここで、生体分子は、サッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリカン、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体薬物複合体、炭水化物複合体ワクチン、ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスワクチン、またはフラボノイドであり、シアリルトランスフェラーゼの存在下で、ＣＭＰ基の除去を伴って生体分子のヒドロキシル基と共にＯ－グリコシド結合を形成する。

【0261】

好ましくは、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化される。
好ましくは、本発明は更に、Ｎｅｕ５アシル化、すなわち、シアリル化された生体分子の生成方法に関し、
ｉ）以下を含む、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを得るために上記の方法を行うこと：
Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
Ｃ）ステップＢ）の後に生成されたシチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を、イオン交換クロマトグラフィーによって単離すること、
Ｃ’）ステップＣ）の後に得られた単離されたシチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を、凍結乾燥によって乾燥すること、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える、および
ｉｉ）ステップｉ）の後に得られたＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを生体分子と反応させること、
を含み、
ここで、生体分子は、サッカリド、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリカン、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体薬物複合体、炭水化物複合体ワクチン、またはフラボノイドであり、シアリルトランスフェラーゼの存在下で、ＣＭＰ基の除去を伴って生体分子のヒドロキシル基と共にＯ－グリコシド結合を形成する。好ましくは、酵素のセットは、固体支持体上に共固定化される。

【0262】

好ましくは、「サッカリド」は、ラクトース、Ｎ－アセチル－ラクトサミン、ラクト－Ｎ－ビオース、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ジフコシルラクトース（ＤｉＦＬ）、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＬＮＴ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰＶ）、を含む母乳オリゴサッカリドである。

【0263】

したがって、本発明は、Ｎｅｕ５アシル化された生体分子の生成方法に関し、
ｉ）ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを得るために、上記の方法を行うこと、
ｉｉ）ステップｉ）の後に得られたＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを生体分子と反応させること、
を含み、
ここで、生体分子は、ラクトース、Ｎ－アセチル－ラクトサミン、ラクト－Ｎ－ビオース、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ジフコシルラクトース（ＤｉＦＬ）、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＬＮＴ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰＶ）、を含む母乳オリゴサッカリドである。

【0264】

好ましくは、本発明は更に、Ｎｅｕ５アシル化、すなわち、シアリル化された生体分子の生成方法に関し、
ｉ）以下を含む、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを得るために上記の方法を行うこと：
Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える、
Ｃ）ステップＢ）の後に生成されたシチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を、イオン交換クロマトグラフィーによって単離すること、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える、および
ｉｉ）ステップｉ）の後に得られたＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを生体分子と反応させること、
を含み、
ここで、生体分子は、ラクトース、Ｎ－アセチル－ラクトサミン、ラクト－Ｎ－ビオース、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ジフコシルラクトース（ＤｉＦＬ）、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＬＮＴ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰＶ）、を含む母乳オリゴサッカリドである。

【0265】

好ましくは、本発明は更に、Ｎｅｕ５アシル化、すなわち、シアリル化された生体分子の生成方法に関し、
ｉ）以下を含む、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを得るために上記の方法を行うこと：
Ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、ピルベート、ポリホスフェート、シチジン、およびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）を含む溶液、並びに
Ｎ－アシルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＡＧＥ）、Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＬ）、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）、ウリジンモノホスフェートキナーゼ、およびポリホスフェートキナーゼ３（ＰＰＫ３）を含む酵素のセット、を提供すること；
Ｂ）シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を生成するために、前記溶液および前記酵素のセットを混合し、結果的に得られた溶液を反応させること、
Ｃ）ステップＢ）の後に生成されたシチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を、イオン交換クロマトグラフィーによって単離すること、
Ｃ’）ステップＣ）の後に得られた単離されたシチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）を、凍結乾燥によって乾燥すること、
ここで、ウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）は、シチジンをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）に変える、および
ｉｉ）ステップｉ）の後に得られたＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを生体分子と反応させること、
を含み、
ここで、生体分子は、ラクトース、Ｎ－アセチル－ラクトサミン、ラクト－Ｎ－ビオース、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ジフコシルラクトース（ＤｉＦＬ）、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＬＮＴ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰＶ）、を含む母乳オリゴサッカリドである。

【0266】

好ましくは、炭水化物複合体ワクチンは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ｂサッカリド、パスツレラ ヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）Ａ２サッカリド、ストレプトコッカス アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）サッカリド、およびヘモフィルス デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）サッカリドから選択されるサッカリドを含む。

【0267】

好ましくは、糖脂質は、ガラクトシルセラミド部分を含むスフィンゴ糖脂質である。特に、Ｎｅｕ５アセチル化糖脂質は、糖鎖上に結合された一つ以上のＮ－アセチルノイラミン酸、Ｎｅｕ５Ａｃを有するガングリオシドである。ガングリオシドの型は、１つのＮ－アセチル－ノイラミン酸を含むＬＭ１、ＧＭ１、ＧＭ１ｂ、およびＧＭ２；２つのＮ－アセチルノイラミン酸を含むＧＤ１ａ、ＧａｌＮＡｃ－ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ２、およびＧＤ３；３つのＮ－アセチル－ノイラミン酸を含むＧＴ１ａ、およびＧＴ３；および４つのＮ－アセチルノイラミン酸を含むＧＱ１ｂ、を含む。

【0268】

好ましくは、治療用タンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質である。好ましくは、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質は抗体である。好ましくは、抗体は、二重特異性モノクローナル抗体および抗体に基づく薬物を含むモノクローナル抗体である。好ましくは、抗体は、完全にＮｅｕ５Ａアシル化されていない。好ましくは、治療用タンパク質は：
３Ｆ８、８Ｈ９、アルシツモマブ（Ａｒｃｉｔｕｍｏｍａｂ）、アスクリンバクマブ（Ａｓｃｒｉｎｖａｃｕｍａｂ）、アセリズマブ（Ａｓｅｌｉｚｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、アチドルトクスマブ（Ａｔｉｄｏｒｔｏｘｕｍａｂ）、アチヌマ（Ａｔｉｎｕｍａ）、アトロリムマブ（Ａｔｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）、アジンツキシズマブ ベドチン（Ａｚｉｎｔｕｘｉｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、バピヌズマブ（Ｂａｐｉｎｅｕｚｕｍａｂ）、バシリキシマブ（Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）、バビツキシマブ（Ｂａｖｉｔｕｘｉｍａｂ）、ＢＣＤ－１００、ベクツモマブ（Ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ベゲロマブ（Ｂｅｇｅｌｏｍａｂ）、ベランタマブ マフォドチン（Ｂｅｌａｎｔａｍａｂ ｍａｆｏｄｏｔｉｎ）、ベリムマブ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、ベマリツズマ（Ｂｅｍａｒｉｔｕｚｕｍａ）、ベンラリズマブ（Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ）、ベルリマトクスマブ（Ｂｅｒｌｉｍａｔｏｘｕｍａｂ）、ベルメキマブ（Ｂｅｒｍｅｋｉｍａｂ）、ベルサンリマブ（Ｂｅｒｓａｎｌｉｍａｂ）、ベルチリムマブ（Ｂｅｒｔｉｌｉｍｕｍａｂ）、ベシレソマブ（Ｂｅｓｉｌｅｓｏｍａｂ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ベズロトクスマブ（Ｂｅｚｌｏｔｏｘｕｍａｂ）、ビシロマブ（Ｂｉｃｉｒｏｍａｂ）、ビマグルマブ（Ｂｉｍａｇｒｕｍａｂ）、ビメキズマブ（Ｂｉｍｅｋｉｚｕｍａｂ）、ビルタミマブ（Ｂｉｒｔａｍｉｍａｂ）、ビバツズマブ メルタンシン（Ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ブレセルマブ（Ｂｌｅｓｅｌｕｍａｂ）、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、ブロンツベトマブ（Ｂｌｏｎｔｕｖｅｔｍａｂ）、ブロソズマブ（Ｂｌｏｓｏｚｕｍａｂ）、ボコシズマブ（Ｂｏｃｏｃｉｚｕｍａｂ）、ブラジクマブ（Ｂｒａｚｉｋｕｍａｂ）、ブレンツクシマブ ベドチイン（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ブリアキヌマブ（Ｂｒｉａｋｉｎｕｍａｂ）、ブロダルマブ（Ｂｒｏｄａｌｕｍａｂ）、ブロルシズマブ（Ｂｒｏｌｕｃｉｚｕｍａｂ）、ブロンチクツズマブ（Ｂｒｏｎｔｉｃｔｕｚｕｍａｂ）、ブロスマブ（Ｂｕｒｏｓｕｍａｂ）、カビラリズマブ（Ｃａｂｉｒａｌｉｚｕｍａｂ）、カミダンルマブ テシリン（Ｃａｍｉｄａｎｌｕｍａｂ ｔｅｓｉｒｉｎｅ）、カムレリズマブ（Ｃａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、カナキヌマブ（Ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ）、カンツズマブ メルタンシン（Ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、カンツズマブ ラブタンシン（Ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、カプラシズマブ（Ｃａｐｌａｃｉｚｕｍａｂ）、カプロマブ ペンデチド（Ｃａｐｒｏｍａｂ ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）、カールマブ（Ｃａｒｌｕｍａｂ）、カロツキシマブ（Ｃａｒｏｔｕｘｉｍａｂ）、カツマキソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）、ｃＢＲ９６－ドキソルビシン免疫抱合体、セデリズマブ（Ｃｅｄｅｌｉｚｕｍａｂ）、セミプリマブ（Ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ）、セルグツズマブ アムナロイキン（Ｃｅｒｇｕｔｕｚｕｍａｂ ａｍｕｎａｌｅｕｋｉｎ）、セルトリズマブ ペゴール（Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、セトレリマブ（Ｃｅｔｒｅｌｉｍａｂ）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、シビサタマブ（Ｃｉｂｉｓａｔａｍａｂ）、シルムツズマブ（Ｃｉｒｍｔｕｚｕｍａｂ）、シタツズマブ ボガトックス（Ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ ｂｏｇａｔｏｘ）、シクスツムマブ（Ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）、クラザキズマブ（Ｃｌａｚａｋｉｚｕｍａｂ）、クレノリキシマブ（Ｃｌｅｎｏｌｉｘｉｍａｂ）、クリバツズマブ テトラキセタン（Ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）、コドリツズマブ（Ｃｏｄｒｉｔｕｚｕｍａｂ）、コフェツズマブ ペリドチン（Ｃｏｆｅｔｕｚｕｍａｂ ｐｅｌｉｄｏｔｉｎ）、コルツキシマブ ラヴタンシン（Ｃｏｌｔｕｘｉｍａｂ ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、コナツムマブ（Ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）、コンシズマブ（Ｃｏｎｃｉｚｕｍａｂ）、コスフロヴィキシマブ（Ｃｏｓｆｒｏｖｉｘｉｍａｂ）、ＣＲ６２６１、クレネズマブ（Ｃｒｅｎｅｚｕｍａｂ）、クリザンリズマブ（Ｃｒｉｚａｎｌｉｚｕｍａｂ）、クロテドゥマブ（Ｃｒｏｔｅｄｕｍａｂ）、クサツズマブ（Ｃｕｓａｔｕｚｕｍａｂ）、ダセツズマブ（Ｄａｃｅｔｕｚｕｍａｂ）、ダクリズマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）、ダロツズマブ（Ｄａｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、ダピロリズマブ ペゴール（Ｄａｐｉｒｏｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、ダラツムマブ（Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ）、デクトレクマブ（Ｄｅｃｔｒｅｋｕｍａｂ）、デムシズマブ（Ｄｅｍｃｉｚｕｍａｂ）、デニンツズマブ マフォドチン（Ｄｅｎｉｎｔｕｚｕｍａｂ ｍａｆｏｄｏｔｉｎ）、デノスマブ（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、デパツキシズマブ マフォドチン（Ｄｅｐａｔｕｘｉｚｕｍａｂ ｍａｆｏｄｏｔｉｎ）、デルロツキシマブ ビオチン（Ｄｅｒｌｏｔｕｘｉｍａｂ ｂｉｏｔｉｎ）、デツモマブ（Ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、デザミズマブ（Ｄｅｚａｍｉｚｕｍａｂ）、ジヌツキシマブ（Ｄｉｎｕｔｕｘｉｍａｂ）、ディリダブマブ（Ｄｉｒｉｄａｖｕｍａｂ）、ドマグロズマブ（Ｄｏｍａｇｒｏｚｕｍａｂ）、ドルリモマブ アリトックス（Ｄｏｒｌｉｍｏｍａｂ ａｒｉｔｏｘ）、ドスターリマ（Ｄｏｓｔａｒｌｉｍａ）、ドロジツマブ（Ｄｒｏｚｉｔｕｍａｂ）、ＤＳ－８２０１、デュリゴツズマブ（Ｄｕｌｉｇｏｔｕｚｕｍａｂ）、デュピルマブ（Ｄｕｐｉｌｕｍａｂ）、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、デュシギツマブ（Ｄｕｓｉｇｉｔｕｍａｂ）、デュボルツキシマブ（Ｄｕｖｏｒｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、エクロメキシマブ（Ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）、エクリズマブ（Ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ）、エドバコマブ（Ｅｄｏｂａｃｏｍａｂ）、エドレコロマブ（Ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）、エファリズマブ（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）、エファングマブ（Ｅｆｕｎｇｕｍａｂ）、エルデルマブ（Ｅｌｄｅｌｕｍａｂ）、エレザヌマブ（Ｅｌｅｚａｎｕｍａｂ）、エルゲムツマブ（Ｅｌｇｅｍｔｕｍａｂ）、エロツズマブ（Ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、エルシリモマブ（Ｅｌｓｉｌｉｍｏｍａｂ）、エマクツズマブ（Ｅｍａｃｔｕｚｕｍａｂ）、エマパルマブ（Ｅｍａｐａｌｕｍａｂ）、エミベツズマブ（Ｅｍｉｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、エミシズマブ（Ｅｍｉｃｉｚｕｍａｂ）、エナポタマブ ベドチン（Ｅｎａｐｏｔａｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、エナバツズマブ（Ｅｎａｖａｔｕｚｕｍａｂ）、エンフォルツマブ ベドチン（Ｅｎｆｏｒｔｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、エンリモマブ ペゴール（Ｅｎｌｉｍｏｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、エノブリツズマブ（Ｅｎｏｂｌｉｔｕｚｕｍａｂ）、エノキズマブ（Ｅｎｏｋｉｚｕｍａｂ）、エノチクマブ（Ｅｎｏｔｉｃｕｍａｂ）、エンシツキジマブ（Ｅｎｓｉｔｕｘｉｍａｂ）、エピツモマブ シツキセタン（Ｅｐｉｔｕｍｏｍａｂ ｃｉｔｕｘｅｔａｎ）、エプラツズマブ（Ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ）、エプチネズマブ（Ｅｐｔｉｎｅｚｕｍａｂ）、エレヌマブ（Ｅｒｅｎｕｍａｂ）、エルリズマブ（Ｅｒｌｉｚｕｍａｂ）、エルツマキソマブ（Ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エタラシズマブ（Ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）、エチギリマブ（Ｅｔｉｇｉｌｉｍａｂ）、エトロリズマブ（Ｅｔｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、エビナクマブ（Ｅｖｉｎａｃｕｍａｂ）、エボロクマブ（Ｅｖｏｌｏｃｕｍａｂ）、エクスビヴィルマブ（Ｅｘｂｉｖｉｒｕｍａｂ）、ファノレソマブ（Ｆａｎｏｌｅｓｏｍａｂ）、ファラリモマブ（Ｆａｒａｌｉｍｏｍａｂ）、ファリシマブ（Ｆａｒｉｃｉｍａｂ）、ファルレツズマブ（Ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）、ファシヌマブ（Ｆａｓｉｎｕｍａｂ）、ＦＢＴＡ０５、フェルヴィズマブ（Ｆｅｌｖｉｚｕｍａｂ）、フェザキヌマブ（Ｆｅｚａｋｉｎｕｍａｂ）、フィバツズマブ（Ｆｉｂａｔｕｚｕｍａｂ）、フィクラツズマブ（Ｆｉｃｌａｔｕｚｕｍａｂ）、フィギツムマブ（Ｆｉｇｉｔｕｍｕｍａｂ）、フィリブマブ（Ｆｉｒｉｖｕｍａｂ）、フランボツマブ（Ｆｌａｎｖｏｔｕｍａｂ）、フレチクマブ（Ｆｌｅｔｉｋｕｍａｂ）、フロテツズマブ（Ｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂ）、フォントリズマブ（Ｆｏｎｔｏｌｉｚｕｍａｂ）、フォラルマブ（Ｆｏｒａｌｕｍａｂ）、フォラビルマブ（Ｆｏｒａｖｉｒｕｍａｂ）、フレマネズマブ（Ｆｒｅｍａｎｅｚｕｍａｂ）、フレソリムマブ（Ｆｒｅｓｏｌｉｍｕｍａｂ）、フロボシマブ（Ｆｒｏｖｏｃｉｍａｂ）、フルネベトマブ（Ｆｒｕｎｅｖｅｔｍａｂ）、フルラヌマブ（Ｆｕｌｒａｎｕｍａｂ）、フツキシマブ（Ｆｕｔｕｘｉｍａｂ）、ガルカネズマブ（Ｇａｌｃａｎｅｚｕｍａｂ）、ガリキシマブ（Ｇａｌｉｘｉｍａｂ）、ガンコタマ（Ｇａｎｃｏｔａｍａ）、ガニツマブ（Ｇａｎｉｔｕｍａｂ）、ガンテネルマブ（Ｇａｎｔｅｎｅｒｕｍａｂ）、ガチポツズマブ（Ｇａｔｉｐｏｔｕｚｕｍａｂ）、ガビリモマブ（Ｇａｖｉｌｉｍｏｍａｂ）、ゲジブマブ（Ｇｅｄｉｖｕｍａｂ）、ゲムツズマブ オゾガミシン（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、ゲヴォキズマブ（Ｇｅｖｏｋｉｚｕｍａｂ）、ギルヴェトマブ（Ｇｉｌｖｅｔｍａｂ）、ギムシルマブ（Ｇｉｍｓｉｌｕｍａｂ）、ギレンツキシマブ（Ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、グレムバツムマブ ベドチン（Ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ゴリムマブ（Ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）、ゴミリキシマブ（Ｇｏｍｉｌｉｘｉｍａｂ）、ゴスラネマブ（Ｇｏｓｕｒａｎｅｍａｂ）、グセルクマブ（Ｇｕｓｅｌｋｕｍａｂ）、イアナルマブ（Ｉａｎａｌｕｍａｂ）、イバリズマブ（Ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ）、ＩＢＩ３０８、イブリツモマブ チウキセタン（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ ｔｉｕｘｅｔａｎ）、イクルクマブ（Ｉｃｒｕｃｕｍａｂ）、イダルシズマブ（Ｉｄａｒｕｃｉｚｕｍａｂ）、イファボツズマブ（Ｉｆａｂｏｔｕｚｕｍａｂ）、イゴボマブ（Ｉｇｏｖｏｍａｂ）、イラダツズマブ ベドチン（Ｉｌａｄａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ＩＭＡＢ３６２、イマルマブ（Ｉｍａｌｕｍａｂ）、イマプレリマブ（Ｉｍａｐｒｅｌｉｍａｂ）、イムチロマブ（Ｉｍｃｉｒｏｍａｂ）、イムガツズマブ（Ｉｍｇａｔｕｚｕｍａｂ）、インクラクマブ（Ｉｎｃｌａｃｕｍａｂ）、インダツキシマブ ラブタンシン（Ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、インダサツマブ ベドチン（Ｉｎｄｕｓａｔｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、イネビリズマブ（Ｉｎｅｂｉｌｉｚｕｍａｂ）、インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、イノリモマブ（Ｉｎｏｌｉｍｏｍａｂ）、イノツズマブ オゾガミシン（Ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、インテツムマブ（Ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）、イオマブ（Ｉｏｍａｂ）－Ｂ、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、イラツムマブ（Ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）、イサツキシマブ（Ｉｓａｔｕｘｉｍａｂ）、イスカリマブ（Ｉｓｃａｌｉｍａｂ）、イスチラツマブ（Ｉｓｔｉｒａｔｕｍａｂ）、イトリズマブ（Ｉｔｏｌｉｚｕｍａｂ）、イキセキズマブ（Ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ）、ケリキシマブ（Ｋｅｌｉｘｉｍａｂ）、ラベツズマブ（Ｌａｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、ラクノツズマブ（Ｌａｃｎｏｔｕｚｕｍａｂ）、ラジラツズマブ ベドチン（Ｌａｄｉｒａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ラムパリズマブ（Ｌａｍｐａｌｉｚｕｍａｂ）、ラナデルマブ（Ｌａｎａｄｅｌｕｍａｂ）、ランドグロズマブ（Ｌａｎｄｏｇｒｏｚｕｍａｂ）、ラプリツキシマブ エマタンシン（Ｌａｐｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、ラルカビキシマブ（Ｌａｒｃａｖｉｘｉｍａｂ）、レブリキズマブ（Ｌｅｂｒｉｋｉｚｕｍａｂ）、レマレソマブ（Ｌｅｍａｌｅｓｏｍａｂ）、レンダリズマブ（Ｌｅｎｄａｌｉｚｕｍａｂ）、レンベルビマブ（Ｌｅｎｖｅｒｖｉｍａｂ）、レンジルマブ（Ｌｅｎｚｉｌｕｍａｂ）、レルデリムマブ（Ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍａｂ）、レロンリマブ（Ｌｅｒｏｎｌｉｍａｂ）、レソファブマブ（Ｌｅｓｏｆａｖｕｍａｂ）、レトリズマブ（Ｌｅｔｏｌｉｚｕｍａｂ）、レキサツムマブ（Ｌｅｘａｔｕｍｕｍａｂ）、リビビルマブ（Ｌｉｂｉｖｉｒｕｍａ
ｂ）、リファスツズマブ ベドチン（Ｌｉｆａｓｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、リゲリズマブ（Ｌｉｇｅｌｉｚｕｍａｂ）、リロトマブ サテトラキセタン（Ｌｉｌｏｔｏｍａｂ ｓａｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）、リンツズマブ（Ｌｉｎｔｕｚｕｍａｂ）、リリルマブ（Ｌｉｒｉｌｕｍａｂ）、ロデルシズマブ（Ｌｏｄｅｌｃｉｚｕｍａｂ）、ロキベトマブ（Ｌｏｋｉｖｅｔｍａｂ）、ロンカスツキシマブ テシリン（Ｌｏｎｃａｓｔｕｘｉｍａｂ ｔｅｓｉｒｉｎｅ）、ロルボツズマブ メルタンシン（Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ロサツキシズマブ ベドチン（Ｌｏｓａｔｕｘｉｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ルカツムマブ（Ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）、ルリズマブ ペゴール（Ｌｕｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、ルミリキシマブＬｕｍｉｌｉｘｉｍａｂ）、ルムレツズマブ（Ｌｕｍｒｅｔｕｚｕｍａｂ）、ルパルツマブ アマドチン（Ｌｕｐａｒｔｕｍａｂ ａｍａｄｏｔｉｎ）、ルチキズマブ（Ｌｕｔｉｋｉｚｕｍａｂ）、マパツムマブ（Ｍａｐａｔｕｍｕｍａｂ）、マルゲツキシマブ（Ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）、マルスタチマ（Ｍａｒｓｔａｃｉｍａ）、マスリモマブ（Ｍａｓｌｉｍｏｍａｂ）、マツズマブ（Ｍａｔｕｚｕｍａｂ）、マブリリムマブ（Ｍａｖｒｉｌｉｍｕｍａｂ）、メポリズマブ（Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ）、メテリムマブ（Ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ）、ミラツズマブ（Ｍｉｌａｔｕｚｕｍａｂ）、ミンレツモマブ（Ｍｉｎｒｅｔｕｍｏｍａｂ）、ミリキズマブ（Ｍｉｒｉｋｉｚｕｍａｂ）、ミルベツキシマブ ソラブタンシン（Ｍｉｒｖｅｔｕｘｉｍａｂ ｓｏｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、ミツモマブ（Ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）、モドツキシマブ（Ｍｏｄｏｔｕｘｉｍａｂ）、モガムリズマブ（Ｍｏｇａｍｕｌｉｚｕｍａｂ）、モナリズマブ（Ｍｏｎａｌｉｚｕｍａｂ）、モロリムマブ（Ｍｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、モスネツズマブ（Ｍｏｓｕｎｅｔｕｚｕｍａｂ）、モタビズマブ（Ｍｏｔａｖｉｚｕｍａｂ）、モキセツモマブ パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ ｐａｓｕｄｏｔｏｘ）、ムロモナブ（Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）－ＣＤ３、ナコロマブ タフェナトックス（Ｎａｃｏｌｏｍａｂ ｔａｆｅｎａｔｏｘ）、ナミルマブ（Ｎａｍｉｌｕｍａｂ）、ナプツモマブ エスタフェナトックス（Ｎａｐｔｕｍｏｍａｂ ｅｓｔａｆｅｎａｔｏｘ）、ナラツキシマブ エマタンシン（Ｎａｒａｔｕｘｉｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、ナルナツマブ（Ｎａｒｎａｔｕｍａｂ）、ナタリズマブ（Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）、ナビシキシズマブ（Ｎａｖｉｃｉｘｉｚｕｍａｂ）、ナビブマブ（Ｎａｖｉｖｕｍａｂ）、ナキシタマブ（Ｎａｘｉｔａｍａｂ）、ネバクマブ（Ｎｅｂａｃｕｍａｂ）、ネシツムマブ（Ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、ネモリズマブ（Ｎｅｍｏｌｉｚｕｍａｂ）、ＮＥＯＤ００１、ネレリモマブ（Ｎｅｒｅｌｉｍｏｍａｂ）、ネスバクマブ（Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ）、ネタキマブ（Ｎｅｔａｋｉｍａｂ）、ニモツズマブ（Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）、ニルセビマブ（Ｎｉｒｓｅｖｉｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ノフェツモマブ メルペンタン（Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ ｍｅｒｐｅｎｔａｎ）、Ｏｂｉｌｔｏｘａｘｉｍａｂ（オビルトキサキシマブ）、オビヌツズマブ（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、オカラツズマブ（Ｏｃａｒａｔｕｚｕｍａｂ）、オクレリズマブ（Ｏｃｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、オヅリモマブ（Ｏｄｕｌｉｍｏｍａｂ）、オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、オララツマブ（Ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）、オレクルマブ（Ｏｌｅｃｌｕｍａｂ）、オレンダリズマブ（Ｏｌｅｎｄａｌｉｚｕｍａｂ）、オロキズマブ（Ｏｌｏｋｉｚｕｍａｂ）、オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）、オムブルタマブ（Ｏｍｂｕｒｔａｍａｂ）、ＯＭＳ７２１、オナルツズマブ（Ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ）、オンツキシズマブ（Ｏｎｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、オンバチリマブ（Ｏｎｖａｔｉｌｉｍａｂ）、オピシヌマブ（Ｏｐｉｃｉｎｕｍａｂ）、オポルツズマブ モナトックス（Ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ ｍｏｎａｔｏｘ）、オレゴボマブ（Ｏｒｅｇｏｖｏｍａｂ）、オルチクマブ（Ｏｒｔｉｃｕｍａｂ）、オテリキシズマブ（Ｏｔｅｌｉｘｉｚｕｍａｂ）、オチリマブ（Ｏｔｉｌｉｍａｂ）、オトレルツズマブ（Ｏｔｌｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、オキセルマブ（Ｏｘｅｌｕｍａｂ）、オザネズマブ（Ｏｚａｎｅｚｕｍａｂ）、オゾラリズマブ（Ｏｚｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）、パジバキシマブ（Ｐａｇｉｂａｘｉｍａｂ）、パリビズマブ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）、パムレブルマブ（Ｐａｍｒｅｖｌｕｍａｂ）、パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、パンコマブ（Ｐａｎｋｏｍａｂ）、パノバクマブ（Ｐａｎｏｂａｃｕｍａｂ）、パルサツズマブ（Ｐａｒｓａｔｕｚｕｍａｂ）、パスコリズマブ（Ｐａｓｃｏｌｉｚｕｍａｂ）、パソツキシズマブ（Ｐａｓｏｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、パテクリズマブ（Ｐａｔｅｃｌｉｚｕｍａｂ）、パトリツマブ（Ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ）、ＰＤＲ００１、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ペムツモマブ（Ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）、ペラキズマブ（Ｐｅｒａｋｉｚｕｍａｂ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、ペキセリズマブ（Ｐｅｘｅｌｉｚｕｍａｂ）、ピジリズマブ（Ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）、ピナツズマブ ベドチン（Ｐｉｎａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ピンツモマブ（Ｐｉｎｔｕｍｏｍａｂ）、プラクルマブ（Ｐｌａｃｕｌｕｍａｂ）、プロザリズマブ（Ｐｌｏｚａｌｉｚｕｍａｂ）、ポガリズマブ（Ｐｏｇａｌｉｚｕｍａｂ）、ポラツズマブ ベドチン（Ｐｏｌａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ポネズマブ（Ｐｏｎｅｚｕｍａｂ）、ポルガビキシマブ（Ｐｏｒｇａｖｉｘｉｍａｂ）、プラシネズマブ（Ｐｒａｓｉｎｅｚｕｍａｂ）、プレザリズマブ（Ｐｒｅｚａｌｉｚｕｍａｂ）、プリリキシマブ（Ｐｒｉｌｉｘｉｍａｂ）、プリトキサキシマブ（Ｐｒｉｔｏｘａｘｉｍａｂ）、プリツムマブ（Ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）、ＰＲＯ１４０、キリズマブ（Ｑｕｉｌｉｚｕｍａｂ）、ラコツモマブ（Ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）、ラドレツマブ（Ｒａｄｒｅｔｕｍａｂ）、ラフィビルマブ（Ｒａｆｉｖｉｒｕｍａｂ）、ラルパンシズマブ（Ｒａｌｐａｎｃｉｚｕｍａｂ）、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、ラネベトマブ（Ｒａｎｅｖｅｔｍａｂ）、ラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）、ラバガリマブ（Ｒａｖａｇａｌｉｍａｂ）、ラブリズマブ（Ｒａｖｕｌｉｚｕｍａｂ）、ラキシバクマブ（Ｒａｘｉｂａｃｕｍａｂ）、ラファネズマブ（Ｒｅｆａｎｅｚｕｍａｂ）、レガビルマブ（Ｒｅｇａｖｉｒｕｍａｂ）、レラトリマブ（Ｒｅｌａｔｌｉｍａｂ）、レムトルマブ（Ｒｅｍｔｏｌｕｍａｂ）、レスリズマブ（Ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ）、リロツムマブ（Ｒｉｌｏｔｕｍｕｍａｂ）、リヌクマブ（Ｒｉｎｕｃｕｍａｂ）、リサンキズマブ（Ｒｉｓａｎｋｉｚｕｍａｂ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、リババズマブ ペゴール（Ｒｉｖａｂａｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、Ｒｍａｂ、ロバツムマブ（Ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）、ロレヅマブ（Ｒｏｌｅｄｕｍａｂ）、ロミルキマブ（Ｒｏｍｉｌｋｉｍａｂ）、ロモソズマブ（Ｒｏｍｏｓｏｚｕｍａｂ）、ロンタリズマブ（Ｒｏｎｔａｌｉｚｕｍａｂ）、ロスマンツズマブ（Ｒｏｓｍａｎｔｕｚｕｍａｂ）、ロバルピツズマブ テシリン（Ｒｏｖａｌｐｉｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｓｉｒｉｎｅ）、ロベリズマブ（Ｒｏｖｅｌｉｚｕｍａｂ）、ロザノリキシズマブ（Ｒｏｚａｎｏｌｉｘｉｚｕｍａｂ）、ルプリズマブ（Ｒｕｐｌｉｚｕｍａｂ）、ＳＡ２３７、サチツズマブ ゴビテカン（Ｓａｃｉｔｕｚｕｍａｂ ｇｏｖｉｔｅｃａｎ）、サマリズマブ（Ｓａｍａｌｉｚｕｍａｂ）、サムロタマブ ベドチン（Ｓａｍｒｏｔａｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、サリルマブ（Ｓａｒｉｌｕｍａｂ）、サトラリズマブ（Ｓａｔｒａｌｉｚｕｍａｂ）、サツモマブ ペンデチド（Ｓａｔｕｍｏｍａｂ ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）、セクキヌマブ（Ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ）、セリクレルマブ（Ｓｅｌｉｃｒｅｌｕｍａｂ）、セリバンツマブ（Ｓｅｒｉｂａｎｔｕｍａｂ）、セトキサキシマブ（Ｓｅｔｏｘａｘｉｍａｂ）、セトルスマブ（Ｓｅｔｒｕｓｕｍａｂ）、セビルマブ（Ｓｅｖｉｒｕｍａｂ）、ＳＧＮ－ＣＤ１９Ａ、ＳＨＰ６４７、シブロツズマブ（Ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、シファリムマブ（Ｓｉｆａｌｉｍｕｍａｂ）、シルツキシマブ（Ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）、シムツズマブ（Ｓｉｍｔｕｚｕｍａｂ）、シプリズマブ（Ｓｉｐｌｉｚｕｍａｂ）、シルトラツマブ ベドチン（Ｓｉｒｔｒａｔｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、シルクマブ（Ｓｉｒｕｋｕｍａｂ）、ソフィツズマブ ベドチン（Ｓｏｆｉｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ソラネズマブ（Ｓｏｌａｎｅｚｕｍａｂ）、ソリトマブ（Ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）、ソネプシズマブ（Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ）、ソンツズマブ（Ｓｏｎｔｕｚｕｍａｂ）、スパルタリズマブ（Ｓｐａｒｔａｌｉｚｕｍａｂ）、スタムルマブ（Ｓｔａｍｕｌｕｍａｂ）、スレソマブ（Ｓｕｌｅｓｏｍａｂ）、スプタブマブ（Ｓｕｐｔａｖｕｍａｂ）、スチムリマブ（Ｓｕｔｉｍｌｉｍａｂ）、スビズマブ（Ｓｕｖｉｚｕｍａｂ）、スブラトクスマブ（Ｓｕｖｒａｔｏｘｕｍａｂ）、タバルマブ（Ｔａｂａｌｕｍａｂ）、タカツズマブ テトラキセタン（Ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）、タドシズマブ（Ｔａｄｏｃｉｚｕｍａｂ）、タラコツズマブ（Ｔａｌａｃｏｔｕｚｕｍａｂ）、タリズマブ（Ｔａｌｉｚｕｍａｂ）、タムツベトマブ（Ｔａｍｔｕｖｅｔｍａｂ）、タネズマブ（Ｔａｎｅｚｕｍａｂ）、タプリツモマブ パプトックス（Ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ ｐａｐｔｏｘ）、タレクスツマブ（Ｔａｒｅｘｔｕｍａｂ）、タボリマブ（Ｔａｖｏｌｉｍａｂ）、テフィバズマブ（Ｔｅｆｉｂａｚｕｍａｂ）、テリモマブ アリトックス（Ｔｅｌｉｍｏｍａｂ ａｒｉｔｏｘ）、テリソツズマブ ベドチン（Ｔｅｌｉｓｏｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、テナツモマブ（Ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）、テネリキシマブ（Ｔｅｎｅｌｉｘｉｍａｂ）、テプリズマブ（Ｔｅｐｌｉｚｕｍａｂ）、テポジタマブ（Ｔｅｐｏｄｉｔａｍａｂ）、テプロツムマブ（Ｔｅｐｒｏｔｕｍｕｍａｂ）、テシドルマブ（Ｔｅｓｉｄｏｌｕｍａｂ）、テツロマブ（Ｔｅｔｕｌｏｍａｂ）、テゼペルマブ（Ｔｅｚｅｐｅｌｕｍａｂ）、ＴＧＮ１４１２、チブリズマブ（Ｔｉｂｕｌｉｚｕｍａｂ）、チガツズマブ（Ｔｉｇａｔｕｚｕｍａｂ）、チルドラキズマブ（Ｔｉｌｄｒａｋｉｚｕｍａｂ）、チミグツズマブ（Ｔｉｍｉｇｕｔｕｚｕｍａｂ）、チモルマブ（Ｔｉｍｏｌｕｍａｂ）、チラゴツマブ（Ｔｉｒａｇｏｔｕｍａｂ）、チスレリズマブ（Ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ）、チソツマブ ベドチン（Ｔｉｓｏｔｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ＴＮＸ－６５０、トシリズマブ（Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、トムゾツキシマブ（Ｔｏｍｕｚｏｔｕｘｉｍａｂ）、トラリズマブ（Ｔｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）、トサトクスマブ（Ｔｏｓａｔｏｘｕｍａｂ）、トシツモマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、トベツマブ（Ｔｏｖｅｔｕｍａｂ）、トラロキヌマブ（Ｔｒａｌｏｋｉｎｕｍａｂ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、トラスツズマブ エムタンシン（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、ＴＲＢＳ０７、トレガリズマブ（Ｔｒｅｇａｌｉｚｕｍａｂ）、トレメリムマブ（Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）、トレボグルマブ（Ｔｒｅｖｏｇｒｕｍａｂ）、ツコツズマブ セルモロイキン（Ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ ｃｅｌｍｏｌｅｕｋｉｎ）、ツビルマブ（Ｔｕｖｉｒｕｍａｂ）、ウブリツキシマブ（Ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）、ウロクプルマブ（Ｕｌｏｃｕｐｌｕｍａｂ）、ウレルマブ（Ｕｒｅｌｕｍａｂ）、ウルトキサズマブ（Ｕｒｔｏｘａｚｕｍａｂ）、ウステキヌマブ（Ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）、ウトミルマブ（Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ）、バダスツキシマブ タリリン（Ｖａｄａｓｔｕｘｉｍａｂ ｔａｌｉｒｉｎｅ）、バナリマブ（Ｖａｎａｌｉｍａｂ）、バンドルツズマブ ベドチン（Ｖａｎｄｏｒｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、バンチク
ツマブ（Ｖａｎｔｉｃｔｕｍａｂ）、バヌシヅマブ（Ｖａｎｕｃｉｚｕｍａｂ）、バパリキシマブ（Ｖａｐａｌｉｘｉｍａｂ）、バリサクマブ（Ｖａｒｉｓａｃｕｍａｂ）、バルリルマブ（Ｖａｒｌｉｌｕｍａｂ）、バテリズマブ（Ｖａｔｅｌｉｚｕｍａｂ）、ベドリズマブ（Ｖｅｄｏｌｉｚｕｍａｂ）、ベルツズマブ（Ｖｅｌｔｕｚｕｍａｂ）、ベパリモマブ（Ｖｅｐａｌｉｍｏｍａｂ）、ベセンクマブ（Ｖｅｓｅｎｃｕｍａｂ）、ビシリズマブ（Ｖｉｓｉｌｉｚｕｍａｂ）、ボバリリズマブ（Ｖｏｂａｒｉｌｉｚｕｍａｂ）、ボロシキシマブ（Ｖｏｌｏｃｉｘｉｍａｂ）、ボンレロリズマブ（Ｖｏｎｌｅｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ボプラテリマブ（Ｖｏｐｒａｔｅｌｉｍａｂ）、ボルセツズマブ マフォドチン（Ｖｏｒｓｅｔｕｚｕｍａｂ ｍａｆｏｄｏｔｉｎ）、ボツムマブ（Ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）、ブナキズマブ（Ｖｕｎａｋｉｚｕｍａｂ）、キセンツズマブ（Ｘｅｎｔｕｚｕｍａｂ）、ＸＭＡＢ－５５７４、ザルツムマブ（Ｚａｌｕｔｕｍｕｍａｂ）、ザノリムマブ（Ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ）、ザツキシマブ（Ｚａｔｕｘｉｍａｂ）、ゼノクツズマブ（Ｚｅｎｏｃｕｔｕｚｕｍａｂ）、ジラリムマブ（Ｚｉｒａｌｉｍｕｍａｂ）、ゾルベツキシマブ（Ｚｏｌｂｅｔｕｘｉｍａｂ）（＝ＩＭＡＢ３６、クラウジキシマブ（Ｃｌａｕｄｉｘｉｍａｂ））、およびゾリモマブ アリトックス（Ｚｏｌｉｍｏｍａｂ ａｒｉｔｏｘ）、
からなる群から選択される。

【0269】

好ましくは、フラボノイドは、フラボン、ファルボノール、バルバノン、ファラバノノール、フラバン、フラバノール、フラバンジオール、およびイソフラボン、イソフラバン、イソフラバンジオール、イソフラベン、およびクメスタン、およびプテロカルパンを含み、より好ましくは、前記フラボノイドは、Ｏ－グリコシル化される。

【0270】

Ｎｅｕ５Ａｃは、潜在的に、ウイルス、並びに以下のウイルスに関連するウイルス様粒子、およびワクチンに移行されることができる。

【0271】

【表1-1】

【0272】

【表1-2】

【0273】

【表1-3】

【0274】

【表1-4】

【0275】

【表1-5】

【0276】

【表1-6】

【0277】

【表1-7】

【0278】

【表1-8】

【0279】

【表1-9】

【0280】

【表1-10】

［図面の説明：］

【図面の簡単な説明】

【0281】

【図1】（Ａ）ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃが、低コストの基質Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ピルベート、ポリホスフェート、およびシチジンから酵素的に合成される多酵素カスケードを示す。反応カスケードは、（ａ）Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）からのＮ－アセチル－Ｄ－マンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）の形成、（ｂ）ＭａｎＮＡｃおよびピルベートからのＮ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）の形成、（ｃ）シチジンおよびアデノシン５’－トリホスフェート（ＡＴＰ）からのシチジン５’－モノホスフェート（ＣＭＰ）の形成、（ｄ）ＣＭＰおよびＡＴＰからのシチジン５’－ジホスフェート（ＣＤＰ）の形成、（ｅ）ＣＤＰおよびポリホスフェート（ポリＰｎ）からのシチジン５’－トリホスフェートの形成、および（ｆ）Ｎｅｕ５ＡｃとＣＴＰとを反応させてＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃにすること、を含む。任意に、ＡＤＰのＡＴＰへの変換を助けるために、１Ｄ－ＰＰＫ２を添加することによって、カスケードを拡張することができる。さらに、ＡＭＰのＡＤＰへのリン酸化を活性化するために、２Ｄ－ＰＰＫ２を添加することによって、カスケードを拡張することができる。さらに、アデノシンホスフェートの頻繁な加水分解を阻害するために、１Ｄ－ＰＰＫ２および２Ｄ－ＰＰＫ２を添加することによって、カスケードを拡張することができる。（Ｂ）ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃが基質Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮ）およびアセテートから酵素的に合成されるマルチ酵素カスケードを示す。このカスケードにおいて、ステップ（ａ’）が、更に追加される。（ａ’）Ｎ－アセチルグルコサミンデアセチラーゼによって触媒される、Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮ）およびアセテートからのＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の形成。

【図2】ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃが低コストの基質Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ピルベート、ポリホスフェート、およびシチジンから酵素的に合成される多酵素カスケードを示す。任意に、Ｎ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）の活性を阻害するピロホスフェートＰＰ_ｉを加水分解するために、無機ジホスファターゼ（ＰＰＡ）を添加することによってカスケードを拡張することができる。

【図3A】ＨＰＡＥＣ－ＵＶクロマトグラムを用いたＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの定量化を示す。Ａ）ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの定量化におけるＨＰＡＥＣ－ＵＶクロマトグラムを示す。ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの濃度曲線は、３０時間後に飽和を示す。Ｂ）４分の反応時間後のＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ（および他の反応物）の定量化のＨＰＡＥＣ－ＵＶクロマトグラムを示す。

【図3B】ＨＰＡＥＣ－ＵＶクロマトグラムを用いたＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの定量化を示す。Ｃ）３０時間の反応時間後のＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ（および他の反応物）の定量化のＨＰＡＥＣ－ＵＶクロマトグラムを示す。

【図4A】酵素の配列リストを示す。（Ａ）トリコルムス バリアビリス（Ｔｒｉｃｈｏｒｍｕｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）由来のＡＧＥファミリーエピメラーゼ／イソメラーゼ；（Ｂ）パスツレラ ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）（株Ｐｍ７０）由来のＮ－アセチルノイラミネートリアーゼ（ＮＡＮＡ）；（Ｃ）髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｂ（株ＭＣ５８）由来のＮ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ（ＣＳＳ）；（Ｄ）大腸菌（株Ｋ１２）由来のウリジンキナーゼ（ＵＤＫ）。

【図4B】酵素の配列リストを示す。（Ｅ）シロイヌナズナ由来のＵＭＰ－ＣＭＰキナーゼ３（ＵＲＡ６）；（Ｆ）ポリホスフェート：ルエゲリア ポメロイ（Ｒｕｅｇｅｒｉａ ｐｏｍｅｒｏｙｉ）（株ＡＴＣＣ ７００８０８／ＤＳＭ１５１７１／ＤＳＳ－３）由来のＮＤＰホスホトランスフェラーゼ３（ＰＰＫ３）；（Ｇ）パスツレラ ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）（株Ｐｍ７０）由来の無機ピロホスファターゼ（ＰＰＡ）；（Ｈ）２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（２Ｄ－ＰＰＫ２）＝ポリホスフェート：緑膿菌（株ＡＴＣＣ１５６９２／ＤＳＭ２２６４４／ＣＩＰ１０４１１６／ＪＣＭ１４８４７／ＬＭＧ１２２２８／１Ｃ／ＰＲＳ１０１／ＰＡＯ１）由来のＡＭＰホスホトランスフェラーゼ。

【図4C】酵素の配列リストを示す。（Ｉ）１－ドメインポリホスフェートキナーゼ２（１Ｄ－ＰＰＫ２）＝ポリホスフェート：緑膿菌（株ＡＴＣＣ１５６９２／ＤＳＭ２２６４４／ＣＩＰ１０４１１６／ＪＣＭ１４８４７／ＬＭＧ１２２２８／１Ｃ／ＰＲＳ１０１／ＰＡＯ１）；ユニプロット（Ｕｎｉｐｒｏｔ）－ＩＤ：Ｑ９Ｉ１５４由来のＡＤＰホスホトランスフェラーゼ。

【図5】過剰発現した酵素を含むバイオマスを混合することから始まり、固体支持体上でのＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの合成反応を実行するまでの、完全なＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃカスケードのワークフロースキームを示す。ワークフローは、酵素固定化のための様々な固体支持体をスクリーニングすることにも適している。

【図6】一晩インキュベーション後に測定された、反応Ｄ１のクロマトグラムを示す。

【図7】一晩のインキュベーション後に測定された、反応Ｄ２のクロマトグラムを示す。

【図8】反応Ｅ：ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの合成のクロマトグラムを示す。ＣＴＰによるＡＧＥの強力な阻害を示す。

【図9】４０時間のインキュベーション後の反応Ｆ１～Ｆ４のクロマトグラムを示す。反応Ｆ１～Ｆ４における反応物の初期濃度を、表１２に記載する。

【図10】実験Ｇにおける経時的な濃度を示す。シチジン、ＧｌｃＮＡｃ、およびピルベートからのＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの酵素的合成を示す。

【図11】ＥＣ－ＥＰ樹脂を固体支持体として使用した場合の、複数のサイクルにおいて共固定化酵素（ＮｍＣＳＳ、ＰＰＫ３、およびＵＲＡ６）を使用する実験ＡでのＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの生成を示す。

【図12】ＩＢＣＯＶ－１樹脂を固体支持体として使用した場合の、複数のサイクルにおいて共固定化酵素（ＮｍＣＳＳ、ＰＰＫ３、およびＵＲＡ６）を使用する実験ＡでのＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの生成を示す。

【図13】ＩＢＣＯＶ－２樹脂を固体支持体として使用した場合の、複数のサイクルにおいて共固定化酵素（ＮｍＣＳＳ、ＰＰＫ３、およびＵＲＡ６）を使用する実験ＡでのＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの生成を示す。

【図14】ＩＢＣＯＶ－３樹脂を固体支持体として使用した場合の、複数のサイクルにおいて共固定化酵素（ＮｍＣＳＳ、ＰＰＫ３、およびＵＲＡ６）を使用する実験ＡでのＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの生成を示す。

【図15】ＥＰ４０３／Ｍ樹脂を固体支持体として使用した場合の、複数のサイクルにおいて共固定化酵素（ＮｍＣＳＳ、ＰＰＫ３、およびＵＲＡ６）を使用する実験ＡでのＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの生成を示す。

【図16】、ユーパージット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）樹脂を固体支持体として使用した場合の、複数のサイクルにおいて共固定化酵素（ＮｍＣＳＳ、ＰＰＫ３、およびＵＲＡ６）を使用する実験ＡでのＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの生成を示す。

【図17】ＥＣＲ８２１５Ｆ樹脂を固体支持体として使用した場合の、複数のサイクルにおいて共固定化酵素（ＮｍＣＳＳ、ＰＰＫ３、およびＵＲＡ６）を使用する実験ＡでのＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの生成を示す。

【図18】ＥＣＲ８２８５Ｆ樹脂を固体支持体として使用した場合の、複数のサイクルにおいて共固定化酵素（ＮｍＣＳＳ、ＰＰＫ３、およびＵＲＡ６）を使用する実験ＡでのＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの生成を示す。

【図19】ＨＦＡ４０３／Ｍ樹脂を固体支持体として使用した場合の、複数のサイクルにおいて共固定化酵素（ＮｍＣＳＳ、ＰＰＫ３、およびＵＲＡ６）を使用する実験ＡでのＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの生成を示す。

【図20】ＥＣＲ８２０９Ｆ樹脂を固体支持体として使用した場合の、複数のサイクルにおいて共固定化酵素（ＮｍＣＳＳ、ＰＰＫ３、およびＵＲＡ６）を使用する実験ＡでのＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの生成を示す。

【図21】ＥＣＲ８２０４Ｆ樹脂を固体支持体として使用した場合の、複数のサイクルにおいて共固定化酵素（ＮｍＣＳＳ、ＰＰＫ３、およびＵＲＡ６）を使用する実験ＡでのＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの生成を示す。

【図22】ＨＦＡ４０３／Ｓ樹脂を固体支持体として使用した場合の、複数のサイクルにおいて共固定化酵素（ＮｍＣＳＳ、ＰＰＫ３、およびＵＲＡ６）を使用する実験ＡでのＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの生成を示す。

【図23】ＨＦＡ／Ｓ樹脂を固体支持体として使用した場合の、複数のサイクルにおいて共固定化酵素（ＮｍＣＳＳ、ＰＰＫ３、およびＵＲＡ６）を使用する実験ＡでのＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの生成を示す。

【図24】４０３／Ｓ樹脂を固体支持体として使用した場合の、複数のサイクルにおいて共固定化酵素（ＮｍＣＳＳ、ＰＰＫ３、およびＵＲＡ６）を使用する実験ＡでのＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの生成を示す。

【図25】ＥＰ４００／ＳＳ樹脂を固体支持体として使用した場合の、複数のサイクルにおいて共固定化酵素（ＮｍＣＳＳ、ＰＰＫ３、およびＵＲＡ６）を使用する実験ＡでのＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの生成を示す。

【図26】ＣＭＰ、Ｎｅｕ５Ａｃ、ポリＰｎ、および触媒量のＡＴＰからのＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの１００ｍＬスケール合成における６．６時間後のＨＰＡＥＣ－ＵＶクロマトグラムを示す。

【図27】Ｎｅｕ５Ａアシル化生成物ＬＳＴｃおよびＤＳＬＮｎＴの質量スペクトルを示す。

【図28】６’－ＳＬの合成：反応終点での反応のＡ．クロマトグラム、およびＢ．ＭＳスペクトルを示す。

【発明を実施するための形態】

【0282】

以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例において開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者によって発見された技術を表し、したがって、実施のための好ましい様式を構成するとみなすことができることを当業者によって理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、多くの変更を、開示された特定の実施形態において行うことができ、更に本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様、または類似の結果を得ることができることを理解すべきである。

【0283】

本発明の様々な態様における更なる修正および代替実施形態は、この明細書を考慮して当業者には明らかであるだろう。したがって、この明細書は、単に例示として解釈されるべきであり、本発明を実施する一般的な方法を当業者に教示することを目的としている。本明細書に示され、記載される本発明の形態は、実施形態の例として解釈されるべきであることが理解されるべきである。全ては、本発明のこの明細書における利益を得た後に、当業者に明らかになるように、要素および材料を、本明細書において示され、記載されたものと置き換えてもよく、部分および工程を逆にしてもよく、本発明の特定の特徴を独立して利用してもよい。以下の特許請求の範囲に記載されるような本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される要素に変更を行ってもよい。

【0284】

［実施例］
略語および頭字語
ＡＧＥ Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンエピメラーゼ／イソメラーゼ
ＡＤＰ アデノシン５’－ジホスフェート
ＡＭＰ アデノシン５’－モノホスフェート
ＡＴＰ アデノシン５’－トリホスフェート
ｄＨ_２Ｏ 脱イオン化水
ＣＭＰ シチジン５’－モノホスフェート
ＣＤＰ シチジン５’－ジホスフェート
ＣＴＰ シチジン５’－トリホスフェート
ＣＳＳ Ｎ－アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ
ＮｍＣＳＳ 髄膜炎菌血清群Ｂ（株ＭＣ５８）のＮ－アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼ
ＮＡＬ Ｎ－アセチルノイラミネートリアーゼ、またはＮ－アセチルノイラミネートピルベートリアーゼ
ＧｌｃＮ Ｄ－グルコサミン
ＧｌｃＮＡｃ Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン
ＭａｎＮＡｃ Ｎ－アセチル－Ｄ－マンノサミン
Ｎｅｕ５Ａｃ Ｎ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸、または５－（アセチルアミノ）－３，５－ジデオキシ－Ｄ－グリセロ－α－Ｄ－ガラクト－非－２－ウロピラノソン酸
ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ シチジン５’－モノホスフェートＮ－アセチル－Ｄ－ノイラミン酸
ＰｏｌｙＰ ポリホスフェート
ＰＰｉ ピロホスフェート
Ｐｉ ホスフェート
ＰＰＫ２ ポリホスフェートキナーゼ２
ＰＰＫ３ ポリホスフェートキナーゼ３
１Ｄ－ＰＰＫ２ １－ドメインポリホスフェートキナーゼ２、ポリホスフェート：ＡＤＰ ホスホトランスフェラーゼ
２Ｄ－ＰＰＫ２ ２－ドメインポリホスフェートキナーゼ２、ポリホスフェート：ＡＭＰ ホスホトランスフェラーゼ
ＵＲＡ６ ウリジンモノホスフェートキナーゼ
ＰＰＡ 無機ピロホスファターゼ
ＰｍＰｐＡ パスツレラムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）無機ピロホスファターゼ

【0285】

化学物質および試薬
特に明記しない限り、全ての化学物質および試薬は、シグマ－アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）およびカルボシンス社（ＣａｒｂｏＳｙｎｔｈ）から得て、入手可能な最高純度のものであった。固体支持体を、レジンディオン社（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ）、キラルビジョン社（ＣｈｉｒａｌＶｉｓｉｏｎ）、ローム社（Ｒｏｈｍ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ）、およびマイクロモッド社（ｍｉｃｒｏｍｏｄ ＧｍｂＨ）から得た。

【0286】

実施例１：酵素の調製
各プラスミドを、大腸菌ＢＬ２１に個別に形質転換し、続いて、選択マーカーを有するＬＢ寒天プレートで培養した。各酵素発現に関して、次のプロトコルに従った。

【0287】

寒天プレートからの単一コロニーを、選択マーカーを有するＬＢ培地中で、３７℃で、一晩インキュベーションした。一晩培養物から播種係数１００を適用し、１ｍＭのＭｇＳＯ_４および選択マーカーを有するＴＢ培地で、３７℃で、最大ＯＤ_６０００．８までインキュベーションすることにより、主培養物を調製した。遺伝子発現を、０．４ｍＭのＩＰＴＧの添加、および１６℃で～２０時間の培養によって誘導した。７，０００×ｇで３０分間遠心分離することによって細胞を採取した。その後、細胞ペレットを、溶解緩衝液に再懸濁した。細胞溶解を、高圧均質化（８００～１０００ｐｓｉ）によって行った。細胞溶解物を、７，０００ｘｇで３０分間遠心分離し、０．８μｍフィルターに通してろ過した。酵素を、ニッケルアフィニティクロマトグラフィーによって精製した（以下のスライドを参照）。

【0288】

【表2-1】

【0289】

【表2-2】

【0290】

酵素精製
透明な細胞溶解物を、ＡＫＴＡシステムのＮｉ－ＮＴＡアフィニティーカラムにロードした。カラムを２０％の溶出緩衝液を用いて洗浄した。酵素を、溶出緩衝液を用いて溶出した。酵素溶液を濃縮し、３ｋＤａアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）フィルターを用いて（イミダゾールを除去するために）透析し、その後、－２０℃で保存緩衝液に保存した。

【0291】

溶解／結合緩衝液（Ａ）、溶出緩衝液（Ｂ）、保存緩衝液（Ｃ）の緩衝液組成

【0292】

【表3】

【0293】

【表4】

【0294】

【表5】

【0295】

プラスミドおよび貯蔵培養物
遺伝子配列を有するプラスミド（カナマイシン耐性を有するｐＥＴ２８ａ）を保持する全ての大腸菌培養物の貯蔵溶液は、以前の研究から入手可能であった［１，２］。貯蔵溶液は、５０％グリセロールを含み、－２０℃に保持された。

【0296】

遺伝子および対応するタンパク質配列を、ユニプロット（ＵｎｉＰｒｏｔ）データベースから得た：ＡＧＥ（ＷＰ＿０１１３２０２７９．１）、ＮＡＬ（Ｑ９ＣＫＢ０）、ＣＳＳ（Ｐ０Ａ０Ｚ７）、ＵＤＫ（Ｐ０Ａ８Ｆ４）、ＵＲＡ６（Ｏ０４９０５）、ＰＰＡ（Ｐ５７９１８）、ＰＰＫ３（Ｑ５ＬＳＮ８）、２ＤＰＰＫ２（Ｑ９ＨＹＦ１）、および１ＤＰＰＫ２（Ｑ９２ＳＡ６）。プラスミドを、商業用供給業者（バイオキャット社（ＢｉｏＣａｔ ＧｍｂＨ））から注文した。

【0297】

【表6】

【0298】

ＰＰＡ（ＰｍＰｐＡ；Ｃ末端ヘキサヒスチジン－タグ（Ｈｉｓ－タグ）を有する酵素）、ＰＰＫ３、およびＵＲＡ６（Ｎ末端Ｈｉｓタグ用）。プラスミドを大腸菌に形質転換後、ＤＮＡを単離し、構築物の精度を遺伝子シーケンシングによって検査した（ユーロフィン ジェノミクス社（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、エーバースバーグ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ）、ドイツ）。
１．Ｍａｈｏｕｒ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，ウリジンジホスフェートＮ－アセチルグルコサミンの合成のための５酵素無細胞カスケードの確立（Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｆｉｖｅ－ｅｎｚｙｍｅ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｃａｓｃａｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｕｒｉｄｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１８．２８３：ｐ．１２０－１２９。
２．Ｒｅｘｅｒ，Ｔ．Ｆ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，脂質結合オリゴサッカリドの酵素的連結のための多酵素カスケードによるＧＤＰ－マンノースのワンポット合成（Ｏｎｅ ｐｏｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＧＤＰ－ｍａｎｎｏｓｅ ｂｙ ａ ｍｕｌｔｉ－ｅｎｚｙｍｅ ｃａｓｃａｄｅ ｆｏｒ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｌｉｐｉｄ－ｌｉｎｋｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１８．１１５（１）：ｐ．１９２－２０５．

【0299】

ワンポットカスケード反応
固定化された酵素は、しばしば、溶液から分離され、再利用されることができる。さらに、固定化された酵素は、より高い活性を示し得、幅広い工程、例えば、充填床反応器での連続合成など、に使用されることができる。さまざまな市販の固体支持体を、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ多酵素カスケードの共固定化に関して試験した。

【0300】

反応
カスケード反応を、１．５ｍＬのセーフロックエッペンドルフバイアル中で１５０μＬの容量で、３５℃、サーモミキサーで、４５０ｒｐｍの振とうで行った。
・全ての酵素は、１つのバイアルに混合された
・反応を、酵素、緩衝液、および反応物を混合することによって開始した
・反応の経時変化をプロファイリングするために、各時点で３μＬの試料を分注し、２９７μＬの冷（４℃）ｄＨ２Ｏを加えることによってクエンチし、陰イオン交換クロマトグラフィーによって遅延なく測定した。

【0301】

測定
ＵＶ（２６０ｎｍ）およびパルスアンペロメトリック検出（ＰＡＤ）を備える高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）を、反応物の濃度を測定するために利用した。分析物の分離および定量化のために、ステップグラジエント溶出法が開発され、実証されたクロマトグラフィー分離を、非多孔性ペリキュラーカラムカルボパック（ＣａｒｂｏＰａｃ）ＰＡ２００（２５０×２ｍｍ）を使用して０．５ｍＬ／分のシステム流量で行った。ＨＰＡＥＣシステム（ＩＣＳ５０００）並びに全てのカラム、構成要素、およびソフトウェアは、サーモサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ウォルサム，ＵＳＡ）から購入した。

【0302】

酵素固定化
最適な固体支持体を予測するための酵素の固定化に関する知識が不十分であるため、最適な固体支持体を見つけることは、常に実験的な試行錯誤することになっていることに注意すべきである。

【0303】

驚くべき発見は、広範囲のエポキシ支持体に共固定化された場合に多酵素カスケードは活性を示したことであった。試験され、活性を示したエポキシ支持体は、支持体マトリックス、粒径、孔径、およびオキシラン含有量において異なった。酵素が疎水性吸着、イオン性相互作用、またはグルタルアルデヒドとの共有結合架橋によって固定化されている他の固体支持体は、ほとんど、またはまったく活性を示さず、このことは、５つの主要な酵素のうち少なくとも一つが、ほとんど活性がないか不活性であることを意味する。さらに、多酵素カスケードは、使用される固体支持体に対するタンパク質における広範囲の異なる比率が使用される場合、エポキシ支持体上で活性であった。ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの合成に関して、酵素をロードされたエポキシ支持体の多くは、支持体に酵素を再固定することなく、２０回を超える反応サイクルで使用されることができる。試験されたエポキシ支持体を、表７に要約する。

【0304】

【表7】

【0305】

実験Ａ
ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ合成（図１参照）において使用される酵素、ＮｍＣＳＳ、ＰＰＫ３、およびＵＲＡ６の共固定化に関して、広範囲の市販の固体支持体（表７参照）を試験し、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの合成に対する固体支持体の影響を評価した。

【0306】

様々な酵素をロードされたビーズで多酵素カスケードを試験するために、所定の質量（表１参照）の各樹脂を追加した。
１００μＬの反応緩衝液（下記参照）を、ビーズに加え、３０℃、および５５０ｒｐｍで２０時間インキュベーションした。その後、上清をＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃに関して分析した。その後、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ濃度を、ＨＰＡＥＣ－ＵＶ／ＰＡＤによって測定した。

【0307】

結果：
驚くべきことに、酵素のセットの共固定化は、酵素の非固定化または酵素の個別に固定化と比較して、シチジン５’－モノホスホ－Ｎ－アセチル－ノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）の生産性において、より高い生産性をもたらすことが明らかになっている。したがって、好ましくは、本明細書に記載の本発明の方法において使用される酵素は、固体支持体上に共固定化される。驚くべきことに、酵素を有するビーズを、１１サイクルより多く使用することができる（図１１～図２５参照）。

【0308】

【表8】

【0309】

実験Ｃ－概念の証明
設計された経路を用いてＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃをワンポット反応で生成することができるかどうかを確認するため、以下の表で詳しく述べられる濃度を用いて反応を行った。反応物の濃度を、経時的に測定した（以下の４分後および３０時間後のクロマトグラムを参照）。以下のクロマトグラムに示されるように、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを生成した。ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの濃度経時変化を、以下に示す。

【0310】

【表9】

【0311】

結果
酵素のセットを用いると、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを、ＧｌｃＮＡｃ、ピルベート、およびシチジンからうまく生成することができることが示された。

【0312】

実験Ｄ－増加した基質濃度
実験Ｄにおいて、２つのカスケード反応（ＰＰＡを有するＤ１、およびＰＰＡを有さないＤ２）を、より高い基質濃度を用いて実施した（初期濃度に関して以下を参照）。一晩インキュベーション後、反応物濃度を、ＨＰＡＥＣ－ＵＶ検出によって測定した。

【0313】

ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを、カスケードを介してうまく合成した。しかしながら、かなりの濃度のＣＭＰ、ＣＤＰ、およびＣＴＰが検出され、低収率を示唆した。

【0314】

【表10】

【0315】

【表11】

【0316】

実験Ｅ－ＣＴＰによるＡＧＥの阻害
文献から分かるように、ＣＴＰはＡＧＥを阻害する。我々は、ＧｌｃＮＡｃおよびＣＴＰからＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの合成を開始する反応において、このことを独自に実証した（下記参照）。基質および酵素の初期濃度を以下の表に示す。

【0317】

一晩の反応において、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃはほとんど検出されず、ＣＴＰによるＡＧＥの阻害が実証された（以下のクロマトグラムを参照）。

【0318】

【化38】

【0319】

【表12】

【0320】

実験Ｆ－収率の増加
ＣＴＰはＡＧＥを阻害し、ＡＴＰはＡＧＥを活性化するということが知られている。しかしながら、初期基質濃度および酵素濃度を調整することによって、収率および生成物濃度を最適化することができる。シチジンを減少させることは、収率を増加させるが、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの最終濃度を減少させる。実験Ｄにおいて、シチジン濃度を増加させる間にシチジン－ＡＴＰ－ポリＰの比率を、一定に保持した１－０．３－０．８）（初期濃度については以下を参照）。

【0321】

図９に示されるように、４０時間のインキュベーション後、反応Ｆ１およびＦ２は、シチジンのＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃへのほぼ完全な変換をもたらした。

【0322】

【表13】

【0323】

実験Ｇ
追加の反応を、経時的に濃度を測定して行った（初期濃度については以下を参照）。反応は、シチジン、ＧｌｃＮＡｃ、およびピルベートのＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃへの変換を示し、シチジンに対して約７５％の収率、および約２５ｍＭ（１６ｇ／Ｌ）のＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ力価を有した。

【0324】

【表14】

【0325】

実施例Ｈ：１００ｍＬスケールでのＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ合成用酵素の同時生成
ＣＭＰ、Ｎｅｕ５Ａｃ、ポリＰ_ｎ、および触媒量のＡＴＰからのＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃの生成のために、３つの酵素すべてが同時に過剰発現する株から１つの単一株を生成した。この研究において使用される遺伝子およびベクターは以下に示される：

【0326】

【表15】

【0327】

２００ｍＬの培養物からのバイオマスを、高圧ホモジナイザーによって、２５ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）－ＨＣｌ（ｐＨ７．１）、４００ＮａＣｌ、および５％グリセロールを含む４０ｍＬの溶解緩衝液で溶解した。遠心分離後、過剰発現した酵素を含む上清を、合成反応を開始するために使用した。１００ｍＬスケールの反応を、スピナーフラスコで行った。反応マトリックスは、１５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、７５ｍＭのＭｇＣｌ_２、５０ｍＭのＣＭＰ、５１ｍＭのＮｅｕ５Ａｃ、５ｍＭのＡＴＰ、１６ｍＭのポリＰ_ｎを含んだ。３７℃、および５０ｒｐｍで６．６時間インキュベーション後、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを最終濃度４５．３ｍＭ（２７．８ｇ／Ｌ）、収率約９０％で生成した。生産性は４．２ｇ／（Ｌ^＊ｈ）であった。反応終了時の反応混合物のクロマトグラムを、図２６に示す。

【0328】

実施例３：カスケードの連結
カスケードは、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃをアクセプター分子に移行するためにシアリルトランスフェラーゼと連結することができる。アクセプター分子は、例えばモノクローナル抗体であることができる。連結のために、可溶性シアリルトランスフェラーゼを添加することができ、シアリルトランスフェラーゼを同じ支持体上に共固定化することができ、および／またはシアリルトランスフェラーゼを追加の支持体に固定化し、その後、反応に添加することができる。

【0329】

実施例４：Ｎｅｕ５アシル化生体分子の生成
Ｎｅｕ５アシル化生体分子の合成は、最初にワンポット多酵素カスケード反応においてＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを生成し、その後、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５ＡｃからＮｅｕ５Ａｃを基質に転移するために、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを生体分子基質およびシアリルトランスフェラーゼと混合することによって促進される。以下の実施例において、生体分子は、ヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）である。

【0330】

方法
全ての実験を、１．５ｍＬエッペンドルフセーフロックチューブで、３７℃で振とうしながら（５５０ｒｐｍ）行った。化合物の同定ために、パルスアンペロメトリック検出（ＰＡＤ）を備える高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）を使用した。ＨＰＡＥＣシステムは、ダイオネクス（Ｄｉｏｎｅｘ）（商標）、カルボパック（ＣａｒｂｏＰａｃ）（商標）ＰＡ２００ガードおよび分析カラム（順番に、サーモサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ）、米国）が装備された。様々な濃度の水酸化ナトリウムおよび酢酸ナトリウムを有する水溶液を溶離液として使用した。

【0331】

質量分析のための試料調製：
試料における質量分析（ＭＳ）を実行する前に、綿の親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を、溶液から塩を除去するために行った。要するに、１５μＬの試料を、８５μＬの１００％アセトニトリル（ＡＣＮ）と混合した。２００μＬピペットチップの約５分の１を綿で満たした。その後、綿を、水を用いて洗浄し、汚染物質を除去した。８５％ＡＣＮを用いて平衡化後、試料を、ピペッティングによって上下にロードし、続いて、８５％ＡＣＮおよび１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて洗浄ステップ（５回）を行った。オリゴサッカリドを、３つのステップで５０μＬの水を用いて綿マトリックスから溶出した（最終容量：１５０μＬ）。

【0332】

質量分析：
ウルトラフレックストレーム（ＵｌｔｒａＦｌｅｘｔｒｅｍｅ）マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）－ＭＳ（ブルカーダルトニクス社（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）、ドイツ）を、ＨＭＯおよび糖ヌクレオチドの分析に使用した。ＨＭＯの分析のために、１０ｍｇ／ｍＬのＴＡ３０（０．１％ＴＦＡを添加された７０％のＨ_２Ｏ、および３０％ＡＣＮからなる溶液中の２ｍＭのＮａＣｌ）と混合された「スーパー（ｓｕｐｅｒ）－ＤＨＢ」（メルク社（Ｍｅｒｃｋ）、ドイツ）を、マトリックスとして使用した。簡潔に、１μＬのマトリックスを、アンカーチップ（ＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐ）３８４ＢＣ ＭＡＬＤＩ標的プレート（ブルカーダルトニクス社（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ））にスポットし、自然乾燥させた。その後、１μＬの試料アリコートを、スポットに加えた。乾燥後、スポットあたり０．２μＬのエタノールを加えて、迅速な、および均一な再結晶化を可能にした。ＨＭＯおよび糖ヌクレオチド分析は、陽イオンおよび陰イオン反射モードでそれぞれ測定された。陽イオンモードの較正は、デキストランラダーを用いて行った。

【0333】

酵素調製：
遺伝子、遺伝子の由来、および使用されたベクターを、表１５に記載する。ＬＯＢＳＴＲ大腸菌（ケラファスト社（Ｋｅｒａｆａｓｔ）、米国）株を、発現宿主として使用した。プラスミドを含む細胞を、１．５ｍＭのＭｇＳＯ_４および選択マーカーを添加されたテリフィックブロス培地で、３７℃で培養した。０．８～１のＯＤで、０．４ｍＭのＩＰＴＧを添加することによって、続いて１６℃（α－２，６－シアリルトランスフェラーゼの場合は１５℃）で、２０時間～２４時間インキュベーションすることによって、遺伝子発現を誘導した。

【0334】

【表16】

【0335】

培養の最後に、細胞を遠心分離（７０００ｘｇ、３０分）によって沈殿させ、および高圧ホモジナイゼーション（８００～１０００ｐｓｇで３～５回通過）によって溶解した。その後、細胞残屑を遠心分離（７０００ｘｇ、４５分間）によって除去し、０．４５μｍの酢酸セルロースフィルターに通して上清をろ過した。酵素の精製のために、一般的なＨｉｓ－ｔａｇ精製法を使用した。結合（溶解）緩衝液は、５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、および１０ｍＭイミダゾールであった。溶出緩衝液は、５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、および２５０ｍＭイミダゾールであった。

【0336】

溶出後、目的の酵素を含む画分を一緒にプールした。緩衝液交換および酵素濃縮を、３ｋＤａアミコンフィルターユニットを使用して行った。酵素を、グリセロールと１：１で混合し、－２０℃で保存した。

【0337】

実施例４－１：シアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオースｃ（ＬＳＴｃ）およびジシアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＤＳＬＮｎＴ）の生成
ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを、前述のカスケードを使用してワンポット多酵素反応で生成した（反応条件については表１６を参照）。その後、後者のアリコート（７０μＬ）を、ＬＮｎＴ、アルカリホスファターゼ（３０ユニット）およびα－２，６－シアリルトランスフェラーゼ（α－２、６－ＳＴ）を含む緩衝（トリス－ＨＣｌ）溶液と混合した。ＬＳＴｃおよびＤＳＬＮｎＴの生成を、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによって確認した（図２７参照）。

【0338】

【化39】

【0339】

【表17】

【0340】

実施例４－２：６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）の生成
ラクトースおよびＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃからの６’－ＳＬの合成のために、生成物としてＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃを含む以前に詳述されたワンポット反応混合物（表１６参照）の７０μＬを、ラクトース（２０ｍＭ）、ＭｎＣｌ_２（２０ｍＭ）、トリス（Ｔｒｉｓ）－ＨＣｌ（１５０ｍＭ－ｐＨ８）、および０．３μｇ／μＬのα－２，６－ＳＴと混合し、２００μＬの最終容量にした。６’－ＳＬの成功した生成を、反応終点での反応混合物におけるＨＰＡＥＣクロマトグラムおよびＭＳ／ＭＳスペクトルによって確認する（図２８参照）。

【0341】

【化40】

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【配列表】

0007574316000001.app