特許 7574463 腸管毒素原性大腸菌に対する特異的な死滅能を有する新規なバクテリオファージおよびこれを含む抗菌組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-10-18

(45)【発行日】2024-10-28

(54)【発明の名称】腸管毒素原性大腸菌に対する特異的な死滅能を有する新規なバクテリオファージおよびこれを含む抗菌組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/00 20060101AFI20241021BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20241021BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20241021BHJP

   A61P 31/02 20060101ALI20241021BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20241021BHJP

   A23K 10/16 20160101ALI20241021BHJP

   C02F 1/68 20230101ALI20241021BHJP

   C02F 1/50 20230101ALI20241021BHJP

   C11D 3/48 20060101ALI20241021BHJP

【ＦＩ】

C12N7/00 ZNA

A61P31/04

A61P31/04 171

A61P1/00

A61P31/02

A61K35/76

A23K10/16

C02F1/68 510B

C02F1/68 520Z

C02F1/50 532Z

C02F1/50 510Z

C11D3/48

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2023551250

(86)(22)【出願日】2021-06-15

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-28

(86)【国際出願番号】 KR2021007481

(87)【国際公開番号】W WO2022181891

(87)【国際公開日】2022-09-01

【審査請求日】2023-08-23

(31)【優先権主張番号】10-2021-0024235

(32)【優先日】2021-02-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM12936P

(73)【特許権者】

【識別番号】507406611

【氏名又は名称】シージェイ チェルジェダン コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】110001818

【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ

(72)【発明者】

【氏名】チョン，ジョン・ス

(72)【発明者】

【氏名】キム，ジ・ウン

(72)【発明者】

【氏名】ムン，ジュン・オク

(72)【発明者】

【氏名】チェ，ジョン・ピョ

(72)【発明者】

【氏名】キム，ユ・ジン

(72)【発明者】

【氏名】イ，スン・ウン

(72)【発明者】

【氏名】パク，ジン・ソン

【審査官】松田 芳子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１７－５１８０３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５１２４８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５１５８０２（ＪＰ，Ａ）

【文献】Food Science of Animal Resources，2020年，vol.40，p.746-757

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ ７／００

Ａ６１Ｐ １／００

Ａ６１Ｐ ３１／００

Ａ２３Ｋ １０／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

腸管毒素原性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ＥＴＥＣ）に特異的な死滅能を有し、受託番号ＫＣＣＭ１２９３６Ｐで寄託されたバクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４。

【請求項2】

請求項１に記載のバクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４を有効成分として含む腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患の予防または治療用の組成物。

【請求項3】

前記腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患は、大腸菌症である、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

請求項１に記載のバクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４を有効成分として含む抗生剤。

【請求項5】

請求項１に記載のバクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４を有効成分として含む飼料添加剤。

【請求項6】

請求項５に記載の飼料添加剤を含む飼料。

【請求項7】

請求項１に記載のバクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４を有効成分として含む飲用水添加剤。

【請求項8】

請求項７に記載の飲用水添加剤を含む飲用水。

【請求項9】

請求項１に記載のバクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４を有効成分として含む消毒剤。

【請求項10】

請求項１に記載のバクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４を有効成分として含む洗浄剤。

【請求項11】

請求項１に記載のバクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４または請求項２に記載の組成物をヒトを除いた動物に投与する段階を含む、腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患の予防または治療方法。

【請求項12】

前記腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患は大腸菌症である、請求項１１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、腸管毒素原性大腸菌に対する特異的な死滅能を有する新規なバクテリオファージおよびこれを含む抗菌組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、以下、「Ｅ．ｃｏｌｉ」という）は、腸内細菌と（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属するグラム陰性の短桿菌で、ほ乳動物をはじめとする様々な動物の腸管内に存在する正常細菌叢の一つである。大腸菌は、ほとんど非病原性で日和見感染を引き起こすことができるが、一部の高病原性菌株は、人をはじめとする動物内で様々な腸疾患および敗血症などを引き起こすと知られている。

【0003】

特に、養豚、養鶏、畜牛など家畜の集団飼育に伴い、大腸菌症は家畜飼育農家で最も一般的で問題視される疾患として浮上しており、大腸菌症発病が増加しながら家畜の下痢による成長遅延および斃死など家畜農家に経済的に大きな損失を招いているのが現状である。大腸菌症を予防および治療するために、様々な抗生剤が使用されてきたが、抗生剤の誤用および乱用、または耐性問題や、動物の体内に残留する可能性など問題が浮上しながら現在は世界的に抗生剤の投与に多くの制限を設けいている。

【0004】

それにより、近年、特定の細菌に感染して細菌の成長を抑制する細菌特異ウイルスのバクテリオファージが抗生剤に比べて宿主特異性が強いことから、新たな抗生剤の代替剤として研究されているが、まだその数が絶対的に不足しているのが現状である。

【0005】

したがって、養豚をはじめとする畜産業において重要な問題となっている腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患を予防および治療するために、幅広い溶菌スペクトルを有し、耐酸性および耐熱性に優れ、産業的に活用の可能性が高い新たなバクテリオファージの開発が持続的に求められている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】米国登録特許ＵＳ６，９４２，８５８Ｂ１

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本出願の目的は、腸管毒素原性大腸菌に特異的な死滅能を有し、受託番号ＫＣＣＭ１２９３６Ｐで寄託されたバクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４、これを有効成分として含む腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患の予防または治療用組成物、抗生剤、飼料添加剤、飲用水添加剤、消毒剤、または洗浄剤、または、前記飼料添加剤を含む飼料、または、前記飲用水添加剤を含む飲用水を提供することにある。

【0008】

本出願の他の目的は、前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４またはこれを有効成分として含む腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患の予防または治療用組成物を利用した腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患の予防または治療方法を提供することにある。

【0009】

本出願の別の目的は、前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４、またはこれを有効成分として含む腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患の予防または治療用組成物の腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患の予防剤または治療剤製造のための用途を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本出願で開示されるそれぞれの説明および実施形態はそれぞれの他の説明および実施形態にも適用することができる。即ち、本出願で開示された様々な要素のすべての組み合わせが本出願の範疇に属する。また、下記記述された具体的な記述によって本出願の範疇が制限されることはない。また、当該技術分野の通常の知識を有する者は、通常の実験のみを用いて、本出願に記載された本出願の特定の様態に対する多数の等価物を認知または確認することができる。また、このような等価物は、本出願に含まれることが意図されている。

【0011】

一態様は、腸管毒素原性大腸菌に特異的な死滅能を有し、受託番号ＫＣＣＭ１２９３６Ｐで寄託されたバクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４を提供する。

【0012】

本明細書で使用される用語、「腸管毒素原性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ＥＴＥＣ）」は、病原性大腸菌のうちの一つで、養豚など動物で感染性疾患を引き起こす原因菌に該当する。

【0013】

本明細書で使用される用語、「バクテリオファージ（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）」は、特定の細菌に感染して当該細菌の成長を抑制する細菌特異的ウイルスに、単一あるいは二重鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを遺伝物質として含むウイルスを意味する。

【0014】

他の態様は、前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４を有効成分として含む腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患の予防または治療用組成物を提供する。

【0015】

前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４は、前記の通りである。

【0016】

前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４は、腸管毒素原性大腸菌に特異的な死滅能を有するものであるため、個体に腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患発病前に投与した場合に、個体に流入される腸管毒素原性大腸菌を死滅させ、これによる感染を抑制して腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患を予防することができる。また、腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患が発病した個体に前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４を投与すれば、個体に存在する腸管毒素原性大腸菌を死滅させることで、これによって引き起こされる症状を緩和または消滅させ、腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患を治療することができる。

【0017】

本明細書で使用される用語「予防」は、バクテリオファージまたは組成物の投与によって個体で疾患の発病を抑制または遅延させるすべての行為を意味し、用語「治療」は、バクテリオファージまたは組成物の投与によって個体で疾患の症状が好転、緩和、または消滅するようにするあらゆる行為を意味することができる。

【0018】

前記腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患は、例えば大腸菌症であるが、これに制限されない。

【0019】

本明細書で使用される用語、「大腸菌症（ｃｏｌｉｂａｃｉｌｌｏｓｉｓ）」は、家畜に病原性大腸菌が感染して発生する疾患を意味し、症状としては敗血症、下痢（新生児期下痢および離乳後下痢）、毒血症（浮腫病および脳脊髄血管症）などが現れることがある。これらの中で、敗血症は、生後２～３日以内に新生児期に多く発生する急性の全身感染症であり斃死率が高い。下痢は、１～２週令以内の哺乳期および離乳直後に多発する腸管感染症であり、斃死または発育障害の原因になる。毒血症は、離乳後の８～１２週令の子豚などに主に発生して全身が腫れ、神経症状を示し突然死亡する場合が多い。

【0020】

前記腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患の予防または治療用組成物は、前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４を１×１０^２～１×１０^２０ＰＦＵ／ｍＬまたは１×１０^２～１×１０^２０ＰＦＵ／ｇで含むものであり、例えば、前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４を１×１０^２～１×１０^１２ＰＦＵ／ｍＬまたは１×１０^５～１×１０^１０ＰＦＵ／ｇで含むものである。

【0021】

前記腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患の予防または治療用組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができ、前記担体と共に製剤化されて食品、医薬品、飼料添加剤または飲用水添加剤などで提供することができる。

【0022】

本明細書で使用される用語、「薬学的に許容可能な担体」は、生体を刺激せず、投与化合物の生物学的活性および特性を阻害しない担体または希釈剤などを意味するができる。

【0023】

前記組成物に含まれてもよい担体の種類は、特に制限されず、当該技術分野で通常使用され薬学的に許容可能な担体ならば、どれでも使用することができる。前記担体の非制限的な例としては、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、テキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロールなどが挙げられる。これらは単独で使用することも２種以上を混合して使用することもでき、必要に応じて抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また希釈剤、分散剤、結合剤および潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用製剤、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。

【0024】

前記腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患の予防または治療用組成物は、経口投与または非経口投与により投与することができ、疾患部位への塗布または噴霧する方法も利用することができる。非経口投与の場合、静脈耐投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与または局所投与を利用して投与してもよい。前記組成物の適した塗布、噴霧および投与量は、製剤化方法、投与方式、対象となる動物および患者の年令、体重、性、疾患症状の程度、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感受性のような要因によって多様であり、通常熟練した医師や獣医師は、目的とする治療に効果的な投与量を容易に決定および処方することができる。

【0025】

前記腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患の予防または治療用組成物の経口投与用製剤には、例えば錠剤、トローチ剤、ロゼンジ（ｌｏｚｅｎｇｅ）、水溶性または油性懸濁液、調製粉末または顆粒、エマルジョン、ハードまたはソフトカプセル、シロップまたはエリキシル剤に製剤化することができる。錠剤およびカプセルなどの製剤で製剤化するために、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アミロペクチン、セルロースまたはゼラチンのような結合剤、リン酸二カルシウムのような賦形剤、とうもろこしデンプンまたはさつまいもデンプンのような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリルフマル酸ナトリウムまたはポリエチレングリコールワックスのような潤滑剤を含むことができ、カプセル製剤の場合、前記で言及した物質以外にも脂肪油のような液体担体をさらに含むことができる。

【0026】

前記腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患の予防または治療用組成物の非経口投与用製剤には、皮下注射、静脈注射または筋肉内注射などの注射用形態、座薬注入方式または呼吸器を通して吸入が可能にするエアロゾル剤などスプレー用で製剤化することができる。注射用製剤で製剤化するためには、本発明の組成物を安定化剤または緩衝剤と共に水で混合して溶液または懸濁液で製造し、これをアンプルまたはバイアルの単位投与用で製剤化することができる。エアロゾル剤などのスプレー用で製剤化する場合、水分散された濃縮物または湿潤粉末が分散するように推進剤などが添加剤と共に配合されてもよい。

【0027】

前記腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患の予防または治療用組成物は、保存剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤、凍結保護剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）、または賦形剤などを含むことができる。

【0028】

前記保存剤、安定化剤、または賦形剤は、前記組成物の品質低下（ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ）を減少させるのに十分な有効量で組成物に含まれるものであり得る。

【0029】

本明細書で使用される用語、「品質低下」は、組成物などに含まれるバクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４の菌数減少、活性減少、またはこれらの組み合わせを含むものであり得る。

【0030】

例えば、前記組成物は、組成物の品質低下を減少させるのに十分な有効量の保存剤、安定化剤、または賦形剤を含むことで、自然状態に存在するバクテリオファージとは異なり、組成物内でバクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４がより長い期間生存したり活性が維持されるものであり得る。

【0031】

前記保存剤、安定化剤、または賦形剤は、前記組成物の品質低下を減少さることができるものなら、当業界で通常使用されるものが制限なしに使用される。例えば、前記安定化剤は、アルギン酸塩（ａｌｇｉｎａｔｅ）、アルギン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ）、カゼイン、カゼインナトリウム、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ペクチン、ゼラチン、アラビアガム、キサンタンガム、デキストラン、シクロデキストリンおよびデンプンで構成される群から選択されるいずれか一つ以上であり得る。

【0032】

前記凍結保護剤は、前記組成物が凍結乾燥された状態である時、組成物の品質低下を減少させるのに十分な有効量で組成物に含まれるものであり得る。例えば、凍結乾燥された組成物内で活性が低下したり生存できない自然状態に存在するバクテリオファージとは異なり、前記組成物は、凍結乾燥された状態で組成物の品質低下を減少させるのに十分な有効量の凍結保護剤を含むことで、凍結乾燥された組成物内でもバクテリオファージ活性が維持されたりバクテリオファージが生存できるものであり得る。

【0033】

前記凍結保護剤は、凍結乾燥された状態の組成物の品質低下を減少させるためなら、当業界で通常使用されるものが制限なしに使用される。例えば、前記凍結保護剤は、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ：ＤＭＳＯ）、グルコース、トレハロース、マルトデキストリン、デキストリン、スキムミルクおよびデンプンで構成される群から選択されるいずれか一つ以上であり得る。

【0034】

他の態様は、前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４を有効成分として含む抗生剤を提供する。

【0035】

前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４は、前記の通りである。

【0036】

本明細書使用される用語、「抗生剤」は、菌を殺したり、菌の成長を抑制できる製剤を意味し、防腐剤、殺菌剤および抗菌剤を総称するものであり得る。

【0037】

前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４を有効成分として含む抗生剤は、従来の抗生剤に比べて腸管毒素原性大腸菌に対する特異性が非常に高く、有益菌は殺さず、特定病原菌だけを死滅させることができ、薬物耐性を誘導しないため、従来の抗生剤に比べて製品寿命が延びる効果を示すことができる。

【0038】

前記抗生剤は、当業界で通常使用される製造方法によって製造される。

【0039】

前記抗生剤は、抗生剤の品質低下を減少させるのに十分な有効量の添加剤を含むものであり、前記添加剤は保存剤、安定化剤、賦形剤、または凍結保護剤などであり得る。前記抗生剤は、前記添加剤を含むことで、自然状態に存在するバクテリオファージとは異なり、抗生剤内でバクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４がより長い期間生存したり活性が維持されるものであり得る。前記保存剤、安定化剤、賦形剤、または凍結保護剤は、抗生剤の品質低下を減少させることができるものであれば、当業界で通常使用されるものが制限なしに使用される。

【0040】

他の態様は、前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４を有効成分として含む飼料添加剤を提供する。さらに他の態様は、前記飼料添加剤を含む飼料を提供する。さらに他の態様は、前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４を有効成分として含む飲用水添加剤を提供する。さらに他の態様は、前記飲用水添加剤を含む飲用水を提供する。

【0041】

前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４は、前記の通りである。

【0042】

前記飼料添加剤または飲用水添加剤は、バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４を含む組成物の形態で製造されて飼料または飲用水に混合させたり、前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４を飼料または飲用水製造時直接添加する方式で使用するものであり得る。

【0043】

前記飼料添加剤または飲用水添加剤内に含まれるバクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４は、液体状態または乾燥された固体状態であってもよく、具体的に、乾燥された粉末形態であり得る。前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４の乾燥方法は、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥または凍結乾燥方法であってもよいが、これに制限されない。前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４は、乾燥された粉末形態で飼料添加剤または飲用水添加剤重量の０．０５～１０重量％、具体的に、０．１～２重量％で混合されるものであり得る。

【0044】

前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４を有効成分として含む飼料添加剤または飲用水添加剤は、必要に応じてその他の添加剤を追加的に含むことができる。前記使用可能な添加剤の非制限的な例としては、飼料または飲用水の品質低下を防止するために添加する結合剤、乳化剤、保存剤など；飼料または飲用水の効用増大のために添加するアミノ酸剤、ビタミン剤、酵素剤、生菌剤、香味剤、非タンパク質窒素化合物（ｎｏｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｍｐｏｕｎｄ：ＮＰＮ）、ケイ酸塩剤、緩衝剤、着色剤、抽出剤またはオリゴ糖などがあり、これらは単独で添加されたりまたは２種以上が共に添加されてもよい。

【0045】

前記飼料または飲用水に含まれるバクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４以外の原料は、当業界で通常使用されるものが制限なく使用される。前記飼料の非制限的な例としては、穀物類、根菜類、食品加工副産物類、藻類、繊維質類、製薬副産物類、油脂類、デンプン類、瓜類または穀物副産物類などのような植物性飼料；タンパク質類、無機物類、油脂類、鉱物性類、油脂類、単細胞タンパク質類、動物性プランクトン類または飲食物などのような動物性飼料が挙げられる。これらは単独で使用されたり２種以上を混合して使用されてもよい。

【0046】

前記飼料添加剤は、飼料１００重量部に対して、０．０５～１０重量部、例えば、０．１～２重量部で含まれるものであり得る。前記飲用水添加剤は、飲用水１００重量部に対して、０．０００１～０．０１重量部、例えば、０．００１～０．００５重量部で含まれるものであり得る。

【0047】

前記飼料添加剤、飼料、飲用水添加剤または飲用水は、当業界で通常使用される製造方法によって製造することができる。

【0048】

前記飼料添加剤、飼料、飲用水添加剤または飲用水は、これらの品質低下を減少させるのに十分な有効量の添加剤を含むものであり、前記添加剤は、保存剤、安定化剤、賦形剤、または凍結保護剤などであり得る。前記飼料添加剤、飼料、飲用水添加剤または飲用水は、前記添加剤を含むことで、自然状態に存在するバクテリオファージとは異なり、飼料添加剤、飼料、飲用水添加剤または飲用水内でバクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４がより長い期間生存したり活性が維持されるものであり得る。前記保存剤、安定化剤、賦形剤、または凍結保護剤は、飼料添加剤、飼料、飲用水添加剤または飲用水の品質低下を減少させることができるものであれば、当業界で通常使用されるものが制限なしに使用される。

【0049】

他の態様は、前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４を有効成分として含む消毒剤を提供する。さらに他の態様は、前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４を有効成分として含む洗浄剤を提供する。

【0050】

前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４は、前記の通りである。

【0051】

前記消毒剤または洗浄剤の製剤は、特に制限されず、当業界で通常知られた製剤で製造されて用いることができる。前記消毒剤または洗浄剤は、当業界で通常使用される製造方法によって製造することができる。

【0052】

前記消毒剤は、腸管毒素原性大腸菌を除去するために散布され、動物の活動領域、屠殺場、斃死地域、調理場または調理設備などに散布されるがこれに制限されない。

【0053】

前記洗浄剤は、腸管毒素原性大腸菌に暴露されたまたは暴露される可能性がある動物の皮膚表面または体の各部位などを洗浄する用途に使用することができるが、これに制限されない。

【0054】

前記消毒剤または洗浄剤は、これらの品質低下を減少させるのに十分な有効量の添加剤を含むものであり、前記添加剤は、保存剤、安定化剤、賦形剤、または凍結保護剤などであり得る。前記消毒剤または洗浄剤は、前記添加剤を含むことで、自然状態に存在するバクテリオファージとは異なり、消毒剤または洗浄剤内でバクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４がより長い期間生存したり活性が維持されるものであり得る。前記保存剤、安定化剤、賦形剤、または凍結保護剤は、消毒剤または洗浄剤の品質低下を減少させることができるものであれば、当業界で通常使用されるものが制限なしに使用される。

【0055】

他の態様は、前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４、またはこれを有効成分として含む腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患の予防または治療用組成物をヒトを除いた動物に投与する段階を含む、腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患の予防または治療方法を提供する。

【0056】

前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４、これを有効成分として含む腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患の予防または治療用組成物、および腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患は、前記の通りである。具体的に、前記腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患は例えば大腸菌症であり得る。

【0057】

前記予防または治療方法は具体的に、腸管毒素原性大腸菌に感染したり感染する危険がある、ヒトを除いた動物に前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４、またはこれを有効成分として含む組成物を薬学的に有効な量で投与する段階を含む。前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４またはこれを有効成分として含む組成物は、薬学的製剤の形態で動物に投与されたり、飼料添加剤または飲用水添加剤の形態で動物の飼料または飲用水に混合してこれを摂食させる方法により投与されるものであり得る。

【0058】

前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４またはこれを有効成分として含む組成物の投与経路は、目的組織に到達できる限り経口または非経口の様々な経路を通じて投与され、具体的に、口腔、直腸、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、鼻腔内、吸入などにより通常の方式で投与することができる。

【0059】

前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４またはこれを有効成分として含む組成物の適した１日総使用量は、正しい医学的判断範囲内で処置医によって決定することができ、これは当該技術分野の通常の知識を有する者にとって自明な事項である。

【0060】

特定動物に対する前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４またはこれを有効成分として含む組成物の具体的な薬学的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、当該個体の年令、体重、一般的な健康状態、性別または食餌はもちろん、前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４またはこれを有効成分として含む組成物の投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間などを考慮して決定され、同時または異時に共に使用される薬物その他の組成物の成分などをはじめとする様々な因子および医薬分野でよく知られている類似因子により多様化することができる。

【0061】

前記ヒトを除いた動物は、腸管毒素原性大腸菌に感染することができる動物なら特に制限されない。例えば、前記動物は、鳥類および哺乳類であってもよく、具体的に、鶏、鴨、豚などを含んでもよいが、これに制限されない。

【0062】

他の態様は、前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４、またはこれを有効成分として含む腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患の予防または治療用組成物の腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患の予防剤または治療剤製造のための用途を提供する。

【0063】

前記バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４、これを有効成分として含む腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患の予防または治療用組成物、および腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患は、前記の通りである。具体的に、前記腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患は、例えば大腸菌症であり得る。

【発明の効果】

【0064】

新規なバクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４は、腸管毒素原性大腸菌を特異的に死滅させる効果を有し、耐酸性および耐熱性に優れて、腸管毒素原性大腸菌による感染性疾患の予防または治療用途として、抗生剤、飼料添加剤、飲用水添加剤、飼料、飲用水、消毒剤または洗浄剤などに幅広く活用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0065】

【図1】新規バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４の電子顕微鏡写真である。

【図2】新規バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４のｐＨ安定性を確認した結果グラフである。

【図3】新規バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４の６０℃での安定性を確認した結果グラフである。

【図4】新規バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４の腸管毒素原性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ＥＴＥＣ）菌株に対する溶菌能を確認した結果グラフである。

【図5】新規バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４の腸管毒素原性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ＥＴＥＣ）菌株に対する溶菌能を確認した結果グラフである。

【発明を実施するための形態】

【0066】

以下、本発明につき実施例を通してより詳細に説明する。但し、これらの実施例は一つ以上の具体的な例を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

【0067】

実施例１．腸管毒素原性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ＥＴＥＣ）に対する死滅能を有するバクテリオファージの分離

【0068】

実施例１－１．糞便試料前処理液の製造
韓国ソウル市、京畿道（キョンギド）、忠清道（チュンチョンド）、慶尚道（キョンサンド）地域の農場から養豚、養鶏および畜牛の糞便試料を採取して、各試料２０ｇを８０ｍＬのＰＢＳに希釈して１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上澄み液を０．２μｍフィルターにろ過した後、濾液に１０％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム水溶液を添加して４℃で１２時間保存した。以降、これに１０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ２１３９）を添加して、４℃で１２時間保存した後、濃縮のために１５，０００ｒｐｍで１時間遠心分離して上澄み液を除去した。沈殿物を１０ｍＬのＳＭバッファー５．８ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．５）に溶かした後、０．２μｍフィルターにろ過してその濾液を４℃で保存した。

【0069】

実施例１－２．バクテリオファージ濃縮液作製
韓国ソウル市、京畿道（キョンギド）、忠清道（チュンチョンド）、慶尚道（キョンサンド）地域の家畜農家から収集した糞便試料から分離したＥＴＥＣ菌株および国立獣医科学検疫院から分譲を受けたＥＴＥＣ菌株を２ｍＬのＬＢ培地（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ ｍｅｄｉｕｍ；１０ｇ／Ｌトリプトン（ｔｒｙｐｔｏｎｅ）、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）に接種して３０℃および１８０ｒｐｍで２０時間培養後、５０ｍＬのＬＢ培地に前記ＥＴＥＣ菌株培養液１ｍＬおよび前記実施例１－１で収得した糞便試料前処理液１ｍＬを接種して３０℃および１８０ｒｐｍで２０時間混合培養した。混合培養液を６，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離後、上澄み液を０．２μｍフィルターにろ過して、これに１０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００を添加して、４℃で１２時間保存した。以降、濃縮のために１５，０００ｒｐｍで１時間遠心分離して上澄み液を除去して、沈殿物を１ｍＬのＳＭバッファーに溶かして、０．２μｍフィルターにろ過してその濾液を４℃で保存した。

【0070】

実施例１－３．バクテリオファージのスクリ－ニングおよび分離
前記実施例１－２で作製したバクテリオファージ濃縮液５０μＬを０．７％（ｗ／ｖ）寒天（ＢＤＤＩＦＣＯ，Ｃａｔ．Ｎｏ．４４１６４）５ｍＬ、および前記実施例１－２で使ったのと同じＥＴＥＣ菌株を６００ｎｍで吸光度（Ｏ．Ｄ．）が２になるように振とう培養した培養液５０μＬと混合して、直径１５０ｍｍの平板培地を利用して二重寒天プラークアッセイ（Ｄｏｕｂｌｅ－ｌａｙｅｒ ａｇａｒ ｐｌａｑｕｅ ａｓｓａｙ）を行った。軟寒天に形成された溶菌班を２００μＬチップでパンチングして、０．５ｍＬのＳＭバッファーに入れて溶出した。溶出されたバクテリオファージ含有溶液は、同じ形態の単一溶菌班が形成されるまで二重寒天プラークアッセイ（Ｄｏｕｂｌｅ－ｌａｙｅｒ ａｇａｒ ｐｌａｑｕｅ ａｓｓａｙ）を繰り返して純粋なバクテリオファージを含む溶液を分離した。収得したバクテリオファージ含有溶液を０．２μｍフィルターでろ過して、これに１０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００を添加して、４℃で１２時間保存した。以降、濃縮のために１５，０００ｒｐｍで１時間遠心分離して上澄み液を除去して、沈殿物を１ｍＬのＳＭバッファーに溶かして、０．２μｍフィルターでろ過してその濾液を４℃で保存した。

【0071】

実施例２．分離したバクテリオファージの全ゲノム（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＷＧＳ）分析
Ｃｓ Ｃｌｇｒａｄｉｅｎｔ法およびファージＤＮＡ分離キット（Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ－Ｃｏｒｐ．Ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．４６８００）を利用して前記実施例１－３で純粋分離したバクテリオファージ濃縮液１ｍＬからＤＮＡを抽出した。（株）マクロジェン（Ｍａｃｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）に依頼して全ゲノム分析を行って、Ｄｅ ｎｏｖｏ ａｓｓｅｍｂｌｙソフト（ＳＰＡｄｅｓ ３．１３．０）を使って遺伝子を組み合わせ、オープンリーディングフレーム（Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ：ＯＲＦ）は、ＧｅｎｅＭａｒｋ．ｈｍｍとＮＣＢＩ ＯＲＦ ｆｉｎｄｅｒを使って行った。ＢＬＡＳＴＰ（Ｅ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ＜０．１）とＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ（Ｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ＜０．００５）プログラムを使って各ＯＲＦの機能を命名（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）した。

【0072】

その結果、分離したバクテリオファージは、１７０，６３２ｂｐ、２７６ ＯＲＦ，Ｇ＋Ｃ含有量３９．６％である配列番号１の塩基配列を持つことを確認し、これは従来に報告されたＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ ｐｈａｇｅ ｖＢ_ＥｃｏＭ_ＩＭＥ２８１（ＭＨ０５１９１３．１）と９２％の配列同一性を示したが、すべての断片が１００％一致するバクテリオファージはないことを確認して、前記バクテリオファージは、新規分離されたバクテリオファージであることが分かった。そこで、前記新規なバクテリオファージをバクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４と命名し、２０２１年１月１８日付でブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に寄託して受託番号ＫＣＣＭ１２９３６Ｐが付与された。

【0073】

実施例３．バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４の形態分析

【0074】

高純度のバクテリオファージ溶液を得るために、ＣｓＣｌグラジエント（ｇｒａｄｉｅｎｔ）法を行った。具体的に、密度が１．７、１．５、１．４５または１．３のＳＭバッファーに溶解したＣｓＣｌ溶液を用意して、１５ｍＬ超遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）用チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｚ００９０１ＳＣＡ）に前記ＣｓＣｌ溶液を高密度から低密度に層状になるように２ｍＬずつ分注して、最上端に実施例１－３で収得したバクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４濃縮液２ｍＬを分注した。これを４℃および２５，０００ｒｐｍで２時間遠心分離後、チューブに形成された白いバクテリオファージ層だけをシリンジ（Ｓａｔｏｒｉｕｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１７８２２－Ｋ）に採取した。採取したバクテリオファージ溶液１μＬをｃａｒｂｏｎ－ｃｏａｔｅｄ ｃｏｐｐｅｒ ｇｒｉｄの上に点滴後、２％ウラニルアセテートで１５秒間染色して電子顕微鏡（ＴＥＭ，ＪＥＯＬ ＪＥＭ－１０１，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で形態を観察した。

【0075】

その結果、図１に示したように、バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４は、形態学的に二十面体の頭部と約１００ｎｍ長さの収縮性ある尾部（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ ｔａｉｌ）を持つことが観察され、カウドウイルス目（Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ ｏｒｄｅｒ）、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）に属することが分かった。

【0076】

実施例４．バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４のｐＨ安定性評価

【0077】

バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４が広いｐＨ範囲で安定性があるか確認するために、ｐＨ３、４、７、７．５または１０の溶液（ｐＨ３、４：０．２Ｍ酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）溶液；ｐＨ７、７．５：０．２Ｍリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液；およびｐＨ１０：０．２Ｍトリス（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）溶液）を用意した。各ｐＨ別溶液４５０μＬと２×１０^１０ＰＦＵ／ｍＬのバクテリオファージ溶液５０μＬを混合して４℃で２時間静置後、二重寒天プラークアッセイ（Ｄｏｕｂｌｅ－ｌａｙｅｒ ａｇａｒ ｐｌａｑｕｅ ａｓｓａｙ）を行って力価（ｔｉｔｅｒ）増減を評価した。

【0078】

その結果、図２に示したように、バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４は、ｐＨ３から１０までの範囲で活性を失うことなく安定的しており、優れた耐酸性を有するバクテリオファージであることが分かった。

【0079】

実施例５．バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４の熱安定性評価

【0080】

バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４が高温で安定性があるか確認するために、２×１０^８ＰＦＵ／ｍＬのバクテリオファージ溶液５００μＬを６０℃で０、３、６または２４時間静置後、二重寒天プラークアッセイ（Ｄｏｕｂｌｅ－ｌａｙｅｒ ａｇａｒ ｐｌａｑｕｅ ａｓｓａｙ）を行って力価（ｔｉｔｅｒ）増減を評価した。

【0081】

その結果、図３に示したように、バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４は、６０℃で３時間暴露した時、０時間暴露した対照群対比約３．３ログの活性減少を示し、６時間暴露時対照群対比約４．８ログの活性減少を示した。したがって、バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４は、優れた耐熱性を有するバクテリオファージであることが分かった。

【0082】

実施例６．バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４の溶菌スペクトル（ｓｐｅｃｔｒｕｍ）評価

【0083】

バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４の溶菌スペクトルを評価するために、韓国ソウル市、京畿道（キョンギド）、忠清道（チュンチョンド）、慶尚道（キョンサンド）地域の家畜農家から収集した糞便試料から分離したＥＴＥＣ菌株および国立獣医科学検疫院から分譲を受けたＥＴＥＣ菌株総１０種をそれぞれＬＢ液状培地で培養後、０．７％軟寒天５ｍＬに前記菌株培養物各５０μＬを接種して、ペトリ皿に注ぎプレーティング後、５分間静置した。以降、軟寒天の上に前記実施例１－３で収得したバクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４濃縮液１０μＬを滴加（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）した後３０℃で２０時間静置培養した。培養終了後、軟寒天の上に形成された溶菌班の有無により、バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４の溶菌スペクトルを評価した。

【0084】

【表1】

【0085】

その結果、表１に示したように、試験した１０種のＥＴＥＣ菌株全部において、溶菌班が形成されて、バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４は広スペクトルなＥＴＥＣ菌株に死滅能を有することを確認した。

【0086】

実施例７．バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４の溶菌能評価

【0087】

バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４の溶菌能を評価するために、Ｔｉｍｅ－ｋｉｌｌ ａｓｓａｙを行った。具体的に、韓国、京畿道（キョンギド）地域の養豚農家から収集した糞便試料から分離したＥＴＥＣ－１１菌株を３０℃および１８０ｒｐｍで３時間培養後、６００ｎｍで吸光度（Ｏ．Ｄ．）が０．２になるように希釈して２×１０^８ＣＦＵ／ｍＬの培養液を３０ｍＬずつチューブに入れて各４つのチューブを用意した。バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４の濃縮液を２×１０^９ＰＦＵ／ｍＬで用意し、ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）が０．１、１または１０になるようにＥＴＥＣ菌株培養液が入った各チューブに添加し、対照群としては、バクテリオファージが添加されないＥＴＥＣ菌株培養液を使った。各チューブを３０℃および１８０ｒｐｍで６時間培養しながら、１時間間隔で１ｍＬの培養液を取って６００ｎｍで吸光度を測定した。

【0088】

その結果、図４に示したように、培養後６時間後に対照群は、吸光度が４．０まで増加したのに対して、バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４が添加されたＥＴＥＣ菌株培養液は、ＭＯＩが０．１と最も低い群でも吸光度が０．１で示され、バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４が非常に強い溶菌能を持つことが分かった。

【0089】

また、前記実験過程で、対照群とバクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４がＭＯＩ０．１で添加されたＥＴＥＣ菌株培養液を２４時間培養して、培養液の吸光度を測定したことを除いては、前記記載されたのと同様に追加実験を行った結果、図５に示したように、バクテリオファージＣＪ_Ｅｃｏ_２０－４は、０．１の低いＭＯＩで処理された時にも２４時間まで強力な溶菌活性を示すことを確認した。

【0090】

以上の説明から、本出願が属する技術分野の通常の知識を有する者は、本出願が、その技術思想や必須的特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施することができることを理解できるであろう。これに関連して、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的なものではないと理解されるべきである。本出願の範囲は、前記詳細な説明よりも後述する特許請求の範囲の意味および範囲、そしれその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれると解釈されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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